JP2001519533A

JP2001519533A - 液状乳製品中の分析物を測定するためのアッセイ装置

Info

Publication number: JP2001519533A
Application number: JP2000515181A
Authority: JP
Inventors: デジェレン，ジャック; フレル，ジャン−マリー; グランニエール，ベノワ; ジョリ，ベルナール
Original assignee: ユセベバイオプロダクツ，ソシエテアノニム
Priority date: 1997-10-07
Filing date: 1998-10-06
Publication date: 2001-10-23
Also published as: US20040096356A1; US20020127737A1; WO1999018439A1; RU2206093C2; CN1274423A; AU738143B2; CZ20001059A3; AR013671A1; AU9424898A; DE69830416D1; KR20010024457A; BR9812876A; NO20001817L; TR200000921T2; NO20001817D0; NZ503430A; PT1023603E; EP1023603A1; CA2305774A1; PL339901A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、液状乳製品の毛管泳動により、液状乳製品中の分析物を測定するための試験装置に関し、第１端部及び第２端部を有し、第１端から始まり、連続して、分析する液体を精製するための膜（２）、１または数個の捕獲物質が固定されている膜（３）及び吸収性の膜（４）が固定されている固体支持体（１）を含んでいる。本発明は前記試験装置により液状乳製品中の分析物を検出及び定量化する方法及び前記試験装置を含む試験キットにも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は液状乳製品、たとえば、乳汁中の分析物を測定するためのアッセイ装
置に関する。本発明はこのアッセイ装置に基づいて、乳汁中の分析物の検出及び
定量を可能とする方法及びこのアッセイ装置を含むアッセイキットにも関する。

【０００２】現在では、多数の国の衛生要件は、種々の物質、たとえば、牛を飼養するのに
普通に用いられる、獣医の薬剤及びホルモン、の乳製品における存在の定期的な
監視を必要とする。明らかな医療の理由のために、ヒトの消費を目的とする乳製
品からこれらの物質を回避しなければならない。

【０００３】他の場合には、牛の飼養の実践をできるだけ効率的にするために乳汁中の外因
性物質の存在を検出できるようにする試験を有することが望ましい。特に、乳汁
中のホルモンのレベルの迅速な測定は、再生産のために好ましい様相を速みやか
に確認することを可能とする。

【０００４】さらに他の場合には、種々の動物種の乳汁に由来する乳製品の起源を監視する
ための信頼でき、かつ、実践的な方法が求められる。したがって、他に比較して
特定の種の乳汁特有のタンパク質の存在を同定することを可能とする方法につい
ての探究がある。

【０００５】さらに、生物学的液体中の分析物の検出について、種々の試験が文献において
既知である。これらの試験は一般的に、特異的に分析物またはこの分析物を認識
する、認識剤（レセプターまたは抗体）及び、標識化剤（放射性元素、酵素、蛍
光剤等）、（これらの剤をこの後に検出試薬という）を用いる検出方法を使用す
る。選択した要素に依存して、用語、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラジオ
レセプターアッセイ（ＲＲＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）等が用いられる
。それらの一般的原理においては、これらの試験は、結果を得ることを可能にす
る、上述の２つの要素（検出試薬）の最小限の組み合わせを用い、その結果の値
は、存在する分析物の量の指標である。

【０００６】選択した検出方法に依存して、標識化剤は、二者択一で認識剤または認識化剤
によるその認識に関して、分析物もしくは分析物の類似物質に結合することがで
きることに留意すべきである。認識剤または分析物もしくは分析物の類似物質が
、本質的に標識化剤（たとえば、放射性標識化分析物）を含有する方法もある。

【０００７】乳製品のために、最も広く記載されている分析物検出試験は抗生物質の検出に
関する。実際に乳牛の特定の感染症を治療するために抗生物質を用いることは周
知である。しかしながら、明らかな医療の理由のために、ヒトの消費を意図する乳汁は、
原則として、いかなる微量の抗生物質も含まないようにしなければならない。さ
らに、０．００５I.U.／ml以下のペニシリン濃度は、乳汁由来の製品、たとえば
、チーズ、ヨーグルト等の生産の間に有害な作用を有することがある。

【０００８】多数の状況を想像し得る。第１の場合には、たとえば、ローリーに移す前に、
農場で抗生物質の存在を検出するために、極度に迅速（５分未満）で、かつ、単
純な試験を優先させるだろう。たとえば、治療のため用いた抗生物質が分かって
いる時及び、さらにこの試験が当該抗生物質を法的な標準で検出することを可能
とする時、この種の迅速な試験を用いることも想像することができる。第２の場
合には、迅速性に重きが置かれない時、すべてではないが、ほとんどの抗生物質
を適法な基準で検出することが重要である。

【０００９】この理由は特定の国における法律は全く特殊な品質基準を課する。たとえば、
米国の当局は、６つの下記の抗生物質の濃度が特定の値を超えないことを要求す
る。すなわち、ペニシリン５ppb 、アンピシリン１０ppb 、アモキシリン
１０ppb 、クロキサシリン１０ppb 、セファピリン２０ppb 、セフチオファ
ー５０ppb である。欧州連合も、それとしては、品質基準、ペニシリン４pp
b 、アモキシリン４ppb 、アンピシリン４ppb 、クロキサシリン３０ppb
、ジクロキサシリン３０ppb 、オキサシリン３０ppb 、セファピリン１０
ppb 、セフチオファー１００ppb 、セフキノン２０ppb 、ナフシリン３０
ppb 、セファゾリン５０ppb を課する。

【００１０】したがって、大部分の抗生物質の検出を可能とする試験に近づくことが有利で
ある。さらに酪農産業においては、速度、感度及び扱いやすさのすべての特徴を
有する試験はないので、すべてには及ばなくとも、これらの３つのパラメータの
最も良い組み合わせを可能とする試験が有利であろう。

【００１１】米国特許第４，２３９，８５２号は、乳汁におけるβ−ラクタム環を有する抗
生物質を検出するための微生物学的方法を記載する。この方法によると、抗生物
質に高度に感受性である微生物、特にバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の細胞部分の存在下に
乳汁試料をまずインキュベートし、次に放射性元素または酵素で標識されている
（「標識した」）抗生物質の存在下にインキュベートする。インキュベートは抗
生物質（試料中に存在しているなら）及び標識された抗生物質を細胞部分に結合
させる条件下に行う。

【００１２】インキュベート後、細胞部分を混合物から分離し、次いで洗浄する。続いて、
細胞部分に結合している、標識された抗生物質の量を測定し、標準と比較する。
細胞部分に結合している、標識された抗生物質の量は、分析した乳汁試料中に存
在している抗生物質の濃度に反比例する。

【００１３】この方法は、特に混合物から細胞部分を分離する段階で、かなり繊細な取り扱
いを必要とする。さらに、その最も鋭敏な変形においては、放射性元素（¹⁴Ｃま
たは¹²⁵Ｉ）で標識された抗生物質を用いる。この場合、乳汁中に存在するか、
またはそうでない抗生物質の量の測定は、特殊な計器、たとえば、シンチレーシ
ョンカウンターを必要とする。さらに、非常に少量ですら、放射性生成物を取り
扱うことは、分析を行う人を完全に危険から免れさせるものではない。

【００１４】欧州特許出願第５９３１１２号は、乳汁中の抗生物質の検出を可能にする他の
方法を記載する。この方法は、抗生物質感受性微生物、たとえば、バチルス・サーモフィルスから単離したタンパク質を用いる。このタンパク質をさらに、酵素
、たとえば、ペルオキシダーゼで標識する。

【００１５】試験は次のように進行する。乳汁試料を標識したタンパク質の存在下に管の中
でインキュベートする。インキュベート後、乳汁を関連する抗生物質を壁に固定
した第２の管に移す。第２のインキュベートを行ない、次いで、管の内容物を除
去する。この第２の管の壁を洗浄液（この液自体を除去する）で３回洗浄し、次
いで第２の管中に存在する残余を１片の吸収性の紙に移す。次いで、第２の管に
着色基質を加え、第２の管をもう１度インキュベートし、次いで、発色を遅らせ
る溶液を加える。管の色を抗生物質の標準試料について並行して行なわれる同一
の試験の色と比較する。支持体上に固定された標識されたタンパク質の量と、し
たがって、色の強度は、分析する乳汁試料中に存在する抗生物質の量に反比例す
る。

【００１６】この特許出願の例１に従って、この試験はペニシリンＧを５ppb のオーダーの
濃度まで検出可能とし、アモキシリン（５ppb ) 、アンピシリン（１０ppb ）、
セファピリン（５ppb ）及びセフチオファー（５ppb ）を検出可能にする。

【００１７】しかしながら、この試験は、特に未熟な社員が行うには非常にやっかいである
。全く、この試験は、液体及び残余を１つの容器から他の容器に移す工程及び多
数のすすぎ工程を含む、多数の工程を含む。この試験に必要な工程の数と型を考
えると、信頼できる結果を得ることは、職人の経験的なノウハウにひどく依存す
る。さらに、結果を解釈することは、並行して行なわれる２つの試験を必要とし、
それにより、操作を増加させ、さらに複雑にする。

【００１８】他の型の酵素的方法も開示されており、それは乳汁中の低濃度の抗生物質の測
定を可能とし〔Ｊ．Ｍ．Ｆｒｅｒｅ他「ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＡｇｅｎ
ｔｓａｎｄＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」１８（４），５０６−５１０（１９
８０）及び欧州特許第８５６６７号及び欧州特許第４６８９４６号〕、それは、
特異的な酵素、すなわちアクチノマデュラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）Ｒ３９（以下、「酵素Ｒ３９」という）により生産される、溶解性の細胞外Ｄ−アラニ
ル−Ｄ−アラニンカルボキシペプチダーゼの使用に基づく。酵素Ｒ３９は種々の
ペプチドのＤ−アラニル−Ｄ−アラニン基を加水分解する特異的活性を有し、特
定のチオエステルも加水分解可能である。

【００１９】さらに、酵素Ｒ３９はβ−ラクタム環を有する抗生物質と反応して非常に迅速
に、不活性で、かつ、実質的に不可逆性である、等モル酵素−抗生物質複合体を
生成する。この試験の最も最近の変形（欧州特許第４６８９４６号）では、予め測定され
た容積の調査すべき液体試料と予め測定された量の酵素Ｒ３９とを、前記試料中
に存在し得るβ−ラクタム抗生物質と酵素とを反応させて、不活性で、かつ、実
質的に不可逆性である等モル酵素−抗生物質複合体を形成させる条件下でインキ
ュベートする。

【００２０】続いて、前もって決定した量のチオエステル型基質と第１段階で得られた生成
物とを、第１インキュベートの間に抗生物質と複合体を形成しなかった残余の酵
素Ｒ３９により前記基質を加水分解させる条件下にインキュベートする。

【００２１】次いで、このようにして生成したメルカプトアルカノン酸の量を、メルカプト
アルカノン酸の遊離ＳＨ基との反応により着色を生成可能な試薬の助けを用いる
測色アッセイにより測定する。着色の強度を、既知量の抗生物質を含有する試料
から前もって確定した標準と比較する。定量測定は分光光度計における測定によ
り行なわれる。乳汁の場合には、前もって、試料を透明にする必要があるかもし
れない。

【００２２】明らかに、この試験はより少ない工程を含み、欧州特許出願第５９３１１２号
に記載された試験よりも実施が簡単である。しかしながら、それは、β−ラクタ
ム環を有する抗生物質の検出及び酵素３９で得られる検出限界に制限される。た
かがそれだけのものであるが、この試験は他の抗生物質レセプターと共に用いる
ことはできず、乳汁中の他の分析物を検出するための基礎として直接には用いる
ことができない。

【００２３】現在の試験はいまだに種々の欠点があることを考えれば、出願人の目的は液状
乳製品における検出のための新しい方法を捜すことであり、捜した方法は、好ま
しくは農場での収集の時に、種々の型の分析物を信頼できるように測定すること
を可能とするものであった。したがって、出願人は、いかなる特殊な経験的なノ
ウハウを必要としない、限られた数の簡単な工程において、非常に迅速で信頼で
き、かつ、鋭敏な結果を得ることを可能にする方法を研究した。さらに、出願人
は、容易に可視的に検出でき、さらに計器測定により定量化にかけることができ
る結果を与える方法を研究した。

【００２４】さて、出願は、液状乳製品、特に乳汁における分析物の存在を容易に測定可能
にする新規なアッセイ装置の使用に基づいて、これらの目的を達成することがで
きることを見い出した。

【００２５】したがって、本発明は、乳製品の切線方向の（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ）毛管泳
動により液状乳製品中の分析物の存在を検出することを可能にするアッセイ装置
を提供する。本発明によるアッセイ装置は、第１端部と第２端部を有し、次の膜
、すなわち −分析する液体を精製することを可能にする膜（２）、 −１以上の捕獲物質が固定されている膜（３）及び −吸収性膜、が、第１端部から始まり連続して固定されている固体支持体（１）を含み、アッ
セイ装置の第１端部を分析する乳製品に浸漬した後に、試料の切線方向の毛管泳
動の間に、乳製品中に存在するかもしれない分析物及び実施する方法に従って用
いられる検出試薬がアッセイ装置中を泳動しないようにする、乳製品中に存在す
る物質を膜（２）が保持することができることを特徴とする。

【００２６】本発明の特定の態様によると、本発明によるアッセイ装置がさらに、少なくと
も１種の検出試薬を析出させた膜（５）を有し、この検出試薬は前記乳製品の存
在で迅速に溶解化し得るものである。この特定の態様に従って、膜（５）は膜（
３）の前に位置する。あるいは、それは、たとえば、装置の第１端部における膜
（２）の前、または膜（２）と膜（３）の間、またはそうでなければ膜（２）の
上もしくは下に位置し得る。

【００２７】本発明によるアッセイ装置に存在する異なった膜は、１つのゾーンから他のゾ
ーンへの乳製品の連続的な泳動を保証するように互いにその末端で重なっている
。

【００２８】好ましくは、膜（３）はその基部に近い方の末端が膜（２）の下に、その末梢
部の末端が膜（４）の下に位置するように位置する。膜は任意に接着性プラスチ
ックフィルム（６）に基づいて、互いに接触して固定することができる。この場
合、接着性プラスチックフィルムは、アッセイ装置中の液体の泳動に影響を及ぼ
さないように選択される。

【００２９】接着性プラスチックフィルムでアッセイ装置を被覆するという選択は２つの利
点を有する。すなわち、それは、膜の重なった点での完全な接触を保証し、保護
フィルムを構成する。接着性プラスチックフィルム（６）は、膜（２），（３）
，（４）及び（５）を完全に被覆するかまたは個々の膜を部分的に被覆するかの
いずれかであり得る。好ましくは、接着性プラスチックフィルム（６）は、アッ
セイ装置の膜（２）中の液体のより速みやかな泳動を可能とするために、第１端
部の最初の数ミリメートルを被覆しない。

【００３０】本発明によるアッセイ装置に存在する固体支持体（１）は、ガラス製か、また
はプラスチック製で、好ましくはプラスチック製である。プラスチック製の支持
体の場合、その厚さは一般に０．０５〜１mm、好ましくは０．１〜０．６mmであ
る。膜は接着剤により固体の支持体（１）に固定されている。

【００３１】膜（２）は種々の型であり得る。１方では、それは乳製品に存在するかもしれ
ない分析物及び実施した方法に従って用いられる検出試薬がアッセイ装置中を泳
動することを防止する、乳製品中に存在する、物質を保持することが可能でなけ
ればならない。他方では、それは、分析物及び検出試薬のアッセイ装置中の迅速
な泳動を可能とする一方で、この泳動の間のこれらの分析物と検出試薬の活性を
維持しなければならない。この結果を得ることを可能とする、本発明の膜の非限
定例は、Ｃｙｔｏｓｅｐ１６６３及びＬｅｕｋｏｓｏｒｂＬＫ４（Ｐａｌｌ
ＧｅｌｍａｎＳｃｉｅｎｃｅｓから得られる）、ＧＦ／Ｄ，ＧＦ／ＤＶＡ，
１７ＣＨＲ（Ｗｈａｔｍａｎｎから得られる）及びＧＦ１４１型のガラス繊維（
Ａｌｓｔｒｏｍから得られる）である。

【００３２】好ましく用いられるＬｅｕｋｏｓｏｒｂ膜は不織ポリエステル繊維から製造さ
れ、血液、尿、唾液及び脳脊髄液から得られた臨床試料から白血球を保持するこ
とを意図する。膜を横断する通過による液体のろ過により、白血球の保持は実現
する。

【００３３】出願人は、予想外に、これらの型の膜は、また、本発明によるアッセイ装置に
基づいて、乳製品中の分析物の検出のために非常に重要な機能、すなわち、分析
物及び検出試薬の迅速な泳動を可能とすると同時に、乳製品中に存在し、前記ア
ッセイ装置中の乳製品の切線方向の毛管迅速泳動による検出の試験の適当な機能
化を防げる物質の保持を与えることを発見した。

【００３４】この機能を最良の効果まで実施するために、膜（２）は、乳製品中に存在し、
分析物と検出試薬のアッセイ装置中の泳動を防げる、すべての物質の除去を可能
とするのに十分に長くなければならない。

【００３５】膜（３）は１以上の捕獲物質を固定することを可能としなければならず、膜（
２）の通過後、乳製品の試料の迅速な泳動を可能としなければならない。好まし
くは、膜（３）はポリエステル型の非多孔性支持体上に固定されている。本発明
による適切な膜の非限定例は、高毛管速度を有するニトロセルロース膜、たとえ
ば、Ｈｉ−Ｆｌｏｗ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから得られる）、好ましくは、型Ｓ
ＸまたはＳＴのＨｉ−Ｆｌｏｗ膜である。これらの膜は上記の膜（２）と組み合
わせると最適の結果をもたらす。

【００３６】１以上の捕獲物質を膜（３）に固定する。固定された捕獲物質の型は、もちろ
ん、分析物の検出のために実施する方法に依存する。捕獲物質は、アッセイ装置
を泳動する液体中に存在する少なくとも１種の構成成分、たとえば、検出試薬の
１種、または分析物もしくはこの分析物の類似物質と少なくとも１種の検出試薬
との複合体の生成に起因する生成物または代りに２以上の検出試薬の間の複合体
の生成に起因する生成物を、選択的に固定することが可能である。

【００３７】捕獲物質は検出試薬の１つでもあり得る。捕獲物質は、膜（３）の１部分また
はいくつかの十分に画定された部分、たとえば、ディスクもしくは薄片またはこ
の出願に適当なあらゆる他のデザイン上に濃縮した形で位置している。どのよう
なデザインを選択したとしても、それは結果の明確な読み取りを可能としなけれ
ばならない。

【００３８】寸法に関する限り、膜（３）は、実施される検出方法に従って必要な順序及び
量で用いられるすべての捕獲物質を含有するのに十分に長くなければならない。膜（４）に用いる膜の型は、液体の先行する膜の通過後にそれを吸収または貯
蔵可能であるとすれば、比較的重要ではない。膜（４）は、液体の膜（３）中の
通過後にそれを吸収させるのに十分に大きいばかりでなく、実際的な観点から、
アッセイ装置をより容易に取り扱うことを可能とするのに十分に大きい。

【００３９】任意に、本発明のアッセイ装置は少なくとも１種の検出試薬が析出した膜（５
）を含んでいてよい。膜（５）は、乳製品の流れの通過で、検出試薬（または複
数の試薬）の溶解化及び放出を可能にすると同時に、乳製品の泳動を可能にしな
ければならない。この目的に適切である膜の非限定例は、ガラス繊維樹脂ベース
の膜、たとえば、Ｔ５ＮＭ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから得られる）、Ｆ０７５−
１４膜、Ｆ０７５−１７膜またはＧＦ／Ｃ膜（Ｗｈａｔｍａｎから得られる）、
膜Ｃｙｔｏｓｅｐ１６６３（ＰａｌｌＧｅｌｍａｎＳｃｉｅｎｃｅｓから
得られる）、ポリエステル繊維樹脂−ベース膜、たとえば、Ａｃｃｕｗｉｃｋ膜
（ＰａｌｌＧｅｌｍａｎＳｃｉｅｎｃｅｓから得られる）、３mmセルロース
系紙（Ｗｈａｔｍａｎから得られる）またはＲｅｌｅａｓｅＭａｔｒｉｘＰ
Ｔ−Ｒ２型の他の膜（ＡｄｖａｎｃｅｓＭｉｃｒｏＤｅｖｉｃｅｓから得ら
れる）である。ポリエステル繊維樹脂ベースの膜、たとえば、Ａｃｃｕｗｉｃｋ
膜を用いることが好ましい。膜（５）は、所望の量の検出試薬を支持するのに十
分に長い。

【００４０】本発明によるアッセイ装置は熟練労働者に既知の方法により製造する。たとえ
ば、市販の貼合せ機を用いてカードを製造することができる。用いられる捕獲物
質をカードの組み立て前または後に溶液の形をとって膜（３）上に析出させる。
これらの溶液を、バイオドット（ＢｉｏＤｏｔ）・インコーポレイティドからの
ＢｉｏＪｅｔＱｕａｎｔｉ−３０００Ｘ−Ｙプラットフォーム分配器のよう
な市販の装置を用いて非常に精密に析出させることができる。これらの析出した
溶液をたとえば、カードを熱空気流の下に置くことにより、直ちに蒸発させる。
大規模生産のためには、ロールを製造することも可能である。続いて、所望の捕
獲物質を担持するカード及びロールを細長い片に切断する。これらの細長い片の
各々が本発明のアッセイ装置を構成する。

【００４１】アッセイ装置が膜（５）を含む時、検出試薬を含有する溶液中に単純に膜（５
）を浸漬することにより、カード及びロールの組み立て前にその上に検出試薬を
析出させることができる。代わりに、捕獲物質を膜（３）上に析出させるために
用いた技術と同様な技術により、カードまたはロールの組み立て後に試薬を析出
させることができる。本発明の１変形では、装置を２つの窓を有するプラスチックの箱に置く。水盤
の形の第１の開口は膜（２）の直上に位置して検出すべき液体を収容できる。第
２の窓は、膜（３）上の結果を観察させる開口窓である。この場合にはアッセイ
装置は接着性プラスチックフィルム（６）を含まない。本発明によるアッセイ装置は液状乳製品、特に乳汁中の分析物の存在の検出を
可能とする。

【００４２】結果として、本発明は同様に、本発明によるアッセイ装置及び検出試薬を用い
て、液状乳製品中の分析物を検出する方法を提供し、そして、次のａ）限定した容積の乳製品と本発明によるアッセイ装置とを接触、この接触は
アッセイ装置の第１端部で行なわれ、ｂ）乳製品中に存在するかもしれない分析物と検出試薬を徐々に膜（２）、次
いで膜（３）を通過させ、及び膜（２）及び（３）により停止しない乳製品の構
成成分が膜（４）で終りとなるような、アッセイ装置中の乳製品の毛管現象によ
る切線方向の泳動及びｃ）膜（３）上の固定の測定、工程を含む。

【００４３】本発明による方法は液状乳製品、たとえば、乳汁、ホエイ、撹拌乳等中の分析
物の検出を可能にする。より詳細には本発明は乳汁に存在するかもしれない分析
物、たとえば、獣医の薬品、ホルモンまたはタンパク質の検出に向いている。本発明により用いられる検出試薬は、発明の実施の様式の機能として、数の上
で及び本質的に変化でき、自体実施する検出の方法に基づく。本発明による方法
は少なくとも２種の検出試薬を用いる。第１検出試薬は特異的に分析物を認識可
能な認識試薬であって、以下「同定剤（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）」という。第２
検出試薬は標識化剤であって、以下、「マーカー」という。

【００４４】選択した実施様式に依存して、特定の検出試薬が、膜（３）または膜（５）上
に存在することができることに留意すべきである。検出すべき分析物及び検出及
び用いる検出試薬に依存して、乳製品を本発明によるアッセイ装置と接触させる
工程の前に１以上の検出試薬を加えること並びに検出試薬及び分析物または分析
物の類似物質との複合体の生成を可能にするインキュベート条件下にこの混合物
を維持することが必要であると分るかもしれない。選択した方法に依存して、同
定剤及びマーカーは互に結合できるかまたは単独の物質であることができる。他
方では、複数の同定剤及び／またはマーカーがあってもよい。

【００４５】同定剤は、この分析物またはこの分析物の類似物質を特異的に認識する能力に
基づいて、捜した分析物の型の存在の検出を可能にする。それは、分析物または
分析物の類似物質と選択的に安定で、かつ、本質的に不可逆性の複合体を生成で
きるレセプターか、または分析物もしくは分析物の類似物質と特異的なモノクロ
ーナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよい。抗生物質の検出のために
、同定剤は、特異的ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体または抗生
物質に感受性の微生物から得られたレセプター、たとえば、バチルス種（バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・ズブチリス、バチルス・リヘニホルミス等）、ストレプトコッカス種（ストレプトコッカス・サーモフィルス等）また
はアクチノミセート種（アクチノマデュラＲ３９等）から選択できる。

【００４６】本発明の好ましい態様によると、β−ラクタム環を有する抗生物質に感受性の
レセプターを含む同定剤が用いられ、そのレセプターはバチルス・リヘニホルミスから得られたものであって、たとえば、レセプターＢｌａＲまたはレセプター
ＢｌａＲ−ＣＴＤである。タンパク質ＢｌａＲの単離及びペプチド配列はＹ．Ｚ
ｈｕ他の「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．」１１３７−１１４１（１９９０）に記載
され、レセプターＢｌａＲ−ＣＴＤはＢｌａＲのカルボキシ末端領域で、その単
離及びペプチド、配列は、Ｂ．Ｊｏｒｉｓ他の「ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙｌｅｔｔｅｒｓ」１０７−１１４（１９９０）に記載されている。

【００４７】 β−ラクタム環を有する抗生物質の検出のために本発明によるレセプターＢｌ
ａＲまたはＢｌａＲ−ＣＴＤを用いることは、今日まで用いられてきた認識剤に
対して優れた利点を有する。事実、レセプターＢｌａＲ及びＢｌａＲ−ＣＴＤは
、多数の抗生物質と非常に迅速に複合体化でき、既知の認識剤、たとえば、バチルス・ステアロサーモフィルスから得られたレセプターが必要とするよりも低い
インキュベート温度で複合体化できる。

【００４８】用いる検出試薬の第２の型はマーカーであって、それは、乳製品中の分析物の
存在の可視化及び直接または間接定量化を可能にする。本発明により用い得るマ
ーカーは、粒子状、蛍光性、放射性または酵素的であることができる。粒子状マ
ーカーを選択することが好ましくそれは、少量で存在する時ですら、迅速に検出
できる可視シグナルを与える。非限定例としては、コロイド状金属粒子（プラチ
ナ、金、銀等）、セレン、炭素、硫黄、テルルまたは他のラテックスの着色した
、合成のコロイド状粒子を挙げることができる。直径１〜６０nmのコロイド状金
粒子が特に好ましい。それらは容易に検出可能な強いピンク−赤着色を示す。マーカーは、乳製品の試料中の分析物の存在をその１以上の検出試薬、分析物
または分析物の類似物質との結合に基づいて測定することを可能とする。マーカーと検出試薬との結合は熟練労働者に既知の方法に従って行うことがで
きる。微粒子のマーカーを用いる時、標識化は、粒子上への直接的な吸着または
化学的固定腕、たとえば、ビオチン／アンチビオチン複合体の仲介を介して、間
接的にいずれかによって起こり得る。この結合は、乳製品を本発明によるアッセ
イ装置と接触させる段階の前または乳製品の本発明によるアッセイ装置中の泳動
の間のいずれかで起こる。

【００４９】本発明の１つの特定の態様によると、以後、「対照標準」という、第３の型の
検出試薬が用いられる。これは分析される試料に既知の量で加える物質であって
、膜（３）に固定化された特異的捕獲物質に固着する。対照標準は、その強度が
分析物を定量するための対照標準として役立つバンドを与える。

【００５０】乳製品を本発明のアッセイ装置と接触させることに関する限り（方法の工程ａ
））、それは分析すべき試料がある容器の底に本発明のアッセイ装置を入れるこ
とにより行なう。アッセイ装置を容器に本質的に垂直に、装置の第１端部が混合
物と接触させるように入れる。

【００５１】プラスチックの箱に位置するアッセイ装置を用いる本発明の変形において、箱
を水平に配置し、接触は、膜（２）の上に位置する水盤形の開口中に分析すべき
試料のアリコートを置くことにより行なわれる。

【００５２】泳動工程ｂ）については、本発明によるアッセイ装置を毛管現象により液体を
泳動させる。本発明のアッセイ装置を毛管現象により泳動する液体は最初に膜（
２）に会う。膜（２）は、乳製品中に存在するかもしれない分析物と検出試薬の
アッセイ装置中の泳動を防止する、乳製品中に存在する、物質を保持することを
可能にする。分析物と検出試薬は連続して、１以上の捕獲物質が固定されている
膜（３）中を泳動する。

【００５３】本発明の特定の態様によると、膜（３）中の液体の泳動経路の端に位置して、
先行する捕獲物質により停止しなかったすべてのマーカーを固定することができ
る捕獲物質を用いる。この捕獲物質は、先行する捕獲物質により与えられなかっ
た定量的情報の完全な補足を可能とする。

【００５４】膜（３）上の固定の測定（方法の工程ｃ））は、このゾーンにおけるマーカー
の存在を単純に測定することにより行なわれる。この測定は簡単な方法で視覚的
に可能である。しかしながら、観測されたシグナルの強度の正確な測定を望むな
ら、観測されたシグナルの強度を測定可能な計器を用いることができる。対照標
準を用いる時、観測されたシグナルの強度の測定のための内部対照標準を与える
特異的な捕獲物質により固定される。得られた結果の解釈は、実施した検出方法、すなわち用いられた検出試薬及び
捕獲物質に依存する。

【００５５】以前に文献に記載された、乳汁中の分析物を検出する方法に関して、本発明に
よる方法は次の利点がある。第１に、この方法は非常に迅速で、かつ、実施が極
度に簡単である。すなわち、特殊な経験的なノウハウを必要としない本質的に２
つの容易な操作工程を含む。続いて、結果の定性的及び定量的評価は即時であり
、追加の操作、たとえば、検出が着色剤及び／または酵素的マーカーにより行な
われる時に必要な操作を必要としない。さらに、この方法は異なった型の分析物
の検出に直接に応用できる。最後に、対照標準を用いる態様においては、１以上
の対照標準試験を行なう必要なしに結果を直接に定量及び解釈できる。

【００５６】本発明は本発明によるアッセイ装置を含む、乳製品中の分析物の検出のための
アッセイキットも提供する。適当なら、本発明のアッセイキットは、乳製品をア
ッセイ装置と接触させる前に試料に添加するための検出試薬も含む。

【００５７】次の例は、本発明の種々の面及び態様を、しかしながら、発明の範囲を限定す
ることなく説明する。例１．アッセイ装置の製造、一般的な手順１．１．膜カードの組み立て３００×７６．２mmのサイズのカードを、まず最初に次の方法に従って、クラ
ムシェル貼合せ機型の貼合せ機（ＢｉｏＤｏｔ，Ｉｎｃ．から得られる）を用い
て組み立てる。

【００５８】３００×７６．２mmの、型ＡｒＣａｒｅ８５６５（ＡｄｈｅｓｉｖｅＲｅ
ｓｅａｒｃｈから得られる）の長方形のプラスチック支持体を切り出す（固体支
持体（１））。続いて、３００×２０mmの長方形のＬｅｕｋｏｓｏｒｂＬＫ４
膜（ＰａｌｌＧｅｌｍａｎＳｃｉｅｎｃｅｓから得られる）（膜（２））、
３００×２５mmの、長方形のＨｉ−ＦｌｏｗＳＸ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから
得られる）（膜（３））、３００×４０mmの長方形の３mmセルロース膜（Ｗｈａ
ｔｍａｎから得られる）（膜（４））及び３００×０．８mmの長方形のＡｃｃｕ
ｗｉｃｋ膜（ＰａｌｌＧｅｌｍａｎＳｃｉｅｎｃｅｓから得られる）（膜（
５））を切り出す。

【００５９】連続して、膜（２）及び（４）、次いで（５）、次いで（３）を貼合せ機の下
の方のモールドの特定の位置に置く。接着剤で覆われた固体支持体（１）を、接
着剤面を空気に暴露して、それとしては装置のカバー中に、保持する。下の方の
モールドに置いた膜を貼合せ機を閉じることにより接着性の支持体と接触させる
。膜を真空ポンプからの空気の吸引により正確に決まった場所に置く。真空が破
れた時、固体支持体（１）とその上に固定された膜（２），（３），（４）及び
（５）からなるカードを回収した。

【００６０】１．２．膜（３）への捕獲物質の析出膜（３）への捕獲物質の析出は例１．１．による組み立ての前または後に行な
われる。捕獲物質を含有する水溶液を調製する。それを例１．１．で調製した膜カード
の膜（３）に、ＢｉｏＤｏｔ，Ｉｎｃ．からのＢｉｏＪｅｔＸ−Ｙプラットフ
ォームＱｕａｎｔｉ３０００分配器により、析出させる。析出した溶液を、カード全体を６０℃の熱脈打ち空気流の下に１分間置くこと
により直ちに蒸発させる。

【００６１】１．３．膜（５）への標識化物質の析出ａ）例１．１．による組み立ての前標識化物質を含有する水溶液を調製する。膜（５）をこの溶液に浸漬する。続
いて排水し、次に０．５×１０⁵Pa（０．５バール）の真空下、室温で１夜乾燥
する。ｂ）例１．１．による組み立て後例１．２．に記載された、捕獲物質の析出のための手順が続く。

【００６２】１．４．接着性プラスチックフィルム（６）を置くこと。部分的なカバーのための３００×２０mm及びすべての膜のカバーのための３０
０×７１．２mmの長方形の型ＡｒＣａｒｅ７７５９の接着性フィルム（Ａｄｈ
ｅｓｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈから得られる）を切り出す。例１．１．により得られたカードを貼合せ機の下の方のモールドに入れ、接着
性フィルムを接着性面を空気に暴露して貼合せ機のカバー中に入れる。装置が閉
じる時、接着性のプラスチックフィルムは膜カードと接触する。

【００６３】１．５．細長い片への切断組み立て後に得られたカードをギロチン型装置の助けまたは回転装置（Ｂｉｏ
Ｄｏｔ，ＫｉｎｅｍａｔｉｃまたはＡｋｚｏから得られる）の助けで細長い片に
切断する。末端の細長い片を除去すると、他の細長い片は直ぐに用いられる。それらを保存するために、アッセイ装置を不透明な密封した容器中に乾燥剤（
Ｓｉｌｇｅｌａｃ、フランス）の存在下に入れる。

【００６４】１．６．プラスチックケース中の提示２つの開口を有するプラスチックの箱にアッセイ装置を入れる。水盤の形をし
ている第１の開口を膜（２）の直上に位置させ、分析すべき液体の受け取りを可
能にする。第２の開口は窓開口で、膜（３）上の結果を可視化させる。

【００６５】例２．酵素Ｒ３９を用いる乳汁中のβ−ラクタム環を有する抗生物質の検出２．１．同定剤この例において用いられる同定剤は、Ｊ．−Ｍ．Ｆｒｅｒｅ他の「Ａｎｔｉｍ
ｉｃｒｏｂｉａｌＡｇｅｎｔｓａｎｄＣｈｅｍｏ−ｔｈｅｒａｐｙ」１８
（４），５０６−５１０（１９８０）に記載された手順により得られた、ＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａＲ３９により生産された、溶解性細胞外Ｄ−アラニル−Ｄ
−アラニンカルボキシペプチダーゼである。

【００６６】２．２．同定剤とマーカーとの結合２．２．１．同定剤のビオチン化１mg／mlの濃度の酵素Ｒ３９の水溶液２５０μｌを５００mlのＨＮＭ緩衝液（
Ｈｅｐｅｓ１０mM、pH８、ＮａＣｌ１０mM、ＭｇＣｌ₂ ５mM) に対して２
４時間透析する。この酵素Ｒ３９の透析溶液に対して、次いで、２mlの重炭酸塩
緩衝液（０．１Ｍ重炭酸ナトリウム、pH９）及び２５０μｌの５mg／mlの濃度
を有するＮ−ヒドロキシスクシンイミド６−（ビオチンアミド）カプロン酸エ
ステルの無水ＤＭＦ溶液を加える。

【００６７】この溶液を、室温で光を遠ざけて、回転軸上の管について２回転／分の速度で
３時間、ＬＡＢＩＮＣＯ撹拌機（ＶＥＬ、ベルギーから得られる）中で、静かに
撹拌する。このようにして得られた溶液をＨＮＭ緩衝液（Ｈｅｐｅｓ１００mM
、pH８、ＮａＣｌ１００mM、ＭｇＣｌ₂ ５０mM) に対して２４時間透析する
。このようにして、ビオチン化酵素Ｒ３９の溶液を得て、それをＨＮＭ−ＢＳＡ
緩衝液（Ｈｅｐｅｓ５００mM、pH８、ＮａＣｌ５００mM、ＭｇＣｌ₂ ２５
０mM、ＢＳＡ１０mg／ml）で１mlの緩衝液当り１００μｇの酵素Ｒ３９の濃度
まで希釈する。この溶液を−２０℃で貯蔵する。

【００６８】２．２．２．マーカーマーカーとして、０．１％のナトリウムアジドで安定化された、pH７．２の２
mMのテトラホウ酸水溶液中の懸濁液の形で、直径４０nmの金の粒子上に析出させ
たヤギアンチ−ビオチン抗体を用いる〔ＢｒｉｔｉｓｈＢｉｏｃｅｌｌから
得られる（Ｒｅｆ．ＧＡＢ４０）〕。５２０nmでのこれらの懸濁液の光学密度は
約１０で、タンパク質濃度は約２４μｇ／mlである。

【００６９】２．２．３．ビオチン化同定剤とマーカーとの結合迅速試験用溶液Ａ例２．２．１．で調製したビオチン化酵素Ｒ３９溶液をＨＮＭ−ＢＳＡ緩衝液
（Ｈｅｐｅｓ５００mM、pH８、ＮａＣｌ５００mM、ＭｇＣｌ₂ ２５０mM、
ＢＳＡ１０mg／ml）で２５倍に希釈する。室温で、１７．５容量部のこの希釈
ビオチン化酵素Ｒ３９溶液、９．２７容量部の酵素Ｒ３９を標識するために用い
る金粒子懸濁液及び６容量部の対照標準金粒子懸濁液を混合する（例２．３．参
照）。感受性試験用溶液Ｂ例２．２．１．で調製したビオチン化酵素Ｒ３９溶液をＨＮＭ−ＢＳＡ緩衝液
（Ｈｅｐｅｓ５００mM、pH８、ＮａＣｌ５００mM、ＭｇＣｌ₂ ２５０mM、
ＢＳＡ１０mg／ml）で５０倍に希釈する。室温で、１７．５容量部のこの希釈
ビオチン化酵素Ｒ３９溶液、９．２７容量部の酵素Ｒ３９を標識するために用い
られる金粒子懸濁液及び６容量部の対照標準金粒子懸濁液を混合する（例２．３
．参照）。

【００７０】２．３．対照標準対照標準として、ヤギアンチ−ウサギ免疫グロブリン抗体を析出させた、金
の４０nm粒子を用いる。これらの粒子は、ＢｒｉｔｉｓｈＢｉｏｃｅｌｌ（Ｒ
ｅｆ．ＧＡＲ４０）から、０．１％のナトリウムアジドで安定化した、pH７．２
の２mMのテトラホウ酸ナトリウム水溶液中の懸濁液の形で得られる。５２０nmで
のこれらの懸濁液の光学密度は約３で、タンパク質濃度は約６μｇ／mlである。

【００７１】２．４．捕獲物質２．４．１．第１捕獲物質炭酸ナトリウム緩衝液（１００mM、pH９）中に、２１３mgのヒトγ−グロブリ
ン（Ｇ４３８６，Ｓｉｇｍａ）及び８．６mgの２−イミノ−チオラン塩酸塩（Ａ
ｌｄｒｉｃｈ３３０５６−６）を含有する８mlの溶液を２５℃で１時間インキ
ュベートする。さらに、炭酸ナトリウム緩衝液（１００mM、pH９）中に、１１９．８mgのセフ
ァロスポリンＣ及び５４mgの４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１
−カルボン酸スルホスクシンイミジル（ｓＳＭＣＣ，２２３２２Ｐｉｅｒｃｅ
）を含有する２０mlの溶液を２５℃で１時間インキュベートする。

【００７２】次いで、上記で調製した２つの溶液を混合する。得られる溶液のpHを３mlのＮ
ａＨ₂ＰＯ₄ ５００mMを加えることにより７．１に調整し、この溶液を２５℃
で２時間インキュベートする。インキュベート後に得られた混合物を１ｌのリン
酸ナトリウム緩衝液（１０mM、pH７．５）に対して３回透析する。得られた溶液
を０．２２μｍフィルターでろ過し、次いでアリコートに分割し、用いるまで−
２０℃で凍結する。

【００７３】使用時に、アリコートを融解し、膜に析出させる前に食品着色剤をそれらに加
え、析出の正確な位置及び微量物の品質をいかなる瞬間にでも示すようにする。第１捕獲物質は、試料中に存在する抗生物質に関して過剰に存在する遊離マー
カーと結合する同定剤を固定することを可能にする。

【００７４】２．４．２．第２捕獲物質第２捕獲物質について、１０mMリン酸ナトリウム、pH７．５において、０．５
mg／mlの免疫グロブリン濃度で、ヒトγグロブリン５mg／ml緩衝液を有するウサ
ギ免疫グロブリン溶液（ＳｉｇｍａＩ５００６）を用いる。この第２捕獲物
質は、液体がアッセイ装置を泳動する時に対照標準を停止させる。

【００７５】２．５．アッセイ装置例１．１．に記載の手順に従って組み立てた、膜（２），（３）及び（４）を
含有するアッセイ装置を用いる。これらの装置の膜（３）は、基部の側に例２．
４．１．に記載の捕獲物質を、そして、末端側に例２．４．２．に記載の捕獲物
質を担持する。捕獲物質を例１．２．に記載の手順に従って析出させた。

【００７６】２．５．１．試験１−迅速試験ペニシリンＧを、それぞれ、０、２、４、５、６、８及び１０ppb 含有する、
乳汁の７つの試料を調製する。次いで、これらの溶液の各々を次のように分析す
る。２００μｌの乳汁試料及び３２．８μｌの例２．２．３．で調製した溶液Ａの
アリコートを採取し、エッペンドルフ管に入れる。この混合物を４７℃で３分間
インキュベートする。次いでアッセイ装置を、アッセイ装置の第１端部が混合物
と接触するようにエッペンドルフ管に垂直に入れる。混合物を、アッセンブリを
４７℃で２分間インキュベートしながら、アッセイ装置中を泳動させる。

【００７７】下表１は、試験した７つの試料について得られた結果を示す。０〜１０の範囲
の強度値を検出したバンドに対して与え、値１０は最も強いバンドに与え、値０
は最も強度の小さいバンドに与える。この目盛で、値６を対照標準に与える。第
１検出バンドに認められるシグナルの強度は、試料中に存在するペニシリンＧの
量に反比例する。表１ペニシリンＧ強度（ppb ）第１バンド第２バンド０１０６２８６４５６５３６６２６８１６１００６この例において、第１バンドが、対照標準のバンドよりも低い強度を有する時
、試験は陽性と考えられる。表１に示された結果は、この試験は５分で、乳汁試
料中のペニシリンＧを４ppb まで検出可能とすることを示す。

【００７８】２．５．２．試験２−感受性試験ペニシリンＧを、それぞれ、０、２、２．５、３、４及び５ppb 含有する、乳
汁の６つの試料を調製する。次いで、これらの溶液の各々を次のように分析する
。２００μｌの乳汁試料及び３２．８μｌの例２．２．３．で調製した溶液Ｂの
アリコートを採取し、エッペンドルフ管に入れる。この混合物を４７℃で５分間
インキュベートする。次いでアッセイ装置を、アッセイ装置の第１端部が混合物
と接触するようにエッペンドルフ管に垂直に入れる。混合物を、アッセンブリを
４７℃で２分間インキュベートしながら、アッセイ装置中を泳動させる。

【００７９】下表２は、試験した７つの試料について得られた結果を示す。０〜１０の範囲
の強度値を検出したバンドに対して与え、値１０は最も強いバンドに与え、値０
は最も強度の小さいバンドに与える。この目盛で、値６を対照標準に与える。第
１検出バンドに認められるシグナルの強度は、試料中に存在するペニシリンＧの
量に反比例する。

【００８０】表２ペニシリンＧ強度（ppb ）第１バンド第２バンド０１０６２７６２．５５６３４６４１６５０６この例において、第１バンドが、対照標準のバンドよりも低い強度を有する時
、試験は陽性と考えられる。表２に示された結果は、この試験は７分で乳汁試料
中のペニシリンＧを２．５ppb まで検出可能とすることを示す。

【００８１】例３．ＢｌａＲを用いる乳汁中のβ−ラクタム環を有する抗生物質の測定この例は、保健当局より監視されるβ−ラクタム環を有する抗生物質の乳汁中
における検出を説明する。この例に記載する試験は、標識化剤として役立つ、金
のビーズと結合するレセプターＢｌａＲ−ＣＴＤを用い、膜が固定されている固
体支持体を含むアッセイ装置の形である、支持体を用いる。

【００８２】３．１．ＢｌａＲ−ＣＴＤ（同定剤）と金のビーズ（マーカー）との結合３．１．１．ＢｌａＲ−ＣＴＤのビオチン化６．６mg／mlの濃度の認識剤ＢｌａＲ−ＣＴＤの溶液３．７９mlをリン酸ナト
リウム緩衝液２０mM、pH７中に取り上げる。次いで、このＢｌａＲ−ＣＴＤの溶
液に、４１．７１mlの重炭酸塩緩衝液（０．１Ｍ重炭酸ナトリウム、pH９）及
び２．２３mg／mlの同様な重炭酸塩緩衝液を含有するＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミド６−（ビオチンアミド）カプロン酸エステルの溶液２mlを加える。この溶液
を周囲温度で、光を遠ざけて、回転軸上の管について、２回転／分の速度で２時
間、ＬＡＢＩＮＣＯ撹拌機（ＶＥＬ、ベルギーから得られる）上で静かに撹拌す
る。

【００８３】２．５mlのＴｒｉｓ緩衝液、１Ｍ、pH８の溶液を反応混合物と同じ条件下に３
０分間インキュベートする。このようにして得られた溶液をＨＮＭ緩衝液（Ｈｅ
ｐｅｓ１００mM、pH８、ＮａＣｌ１００mM、ＭｇＣｌ₂ ５０mM) に対して
２４時間透析する。このようにして、ビオチン化ＢｌａＲ−ＣＴＤの溶液を得て
、それをＨＮＭ−ＢＳＡ緩衝液（Ｈｅｐｅｓ５００mM、pH８、ＮａＣｌ５０
０mM、ＭｇＣｌ₂ ２５０mM、ＢＳＡ１０mg／ml）で１mlの緩衝液当り２５０
μｇのＢｌａＲ−ＣＴＤの濃度まで希釈する。この溶液を−２０℃で貯蔵する。

【００８４】３．１．２．標識化剤標識化剤として、０．１％のナトリウムアジドで安定化した、pH７．２の２mM
のテトラホウ酸水溶液中の懸濁液の形で、直径４０nmの金の粒子上に析出させた
ヤギアンチ−ビオチン抗体〔ＢｒｉｔｉｓｈＢｉｏｃｅｌｌから得られる（
Ｒｅｆ．ＧＡＢ４０）〕を用いる。５２０nmでのこれらの懸濁液の光学密度は約
１０で、タンパク質濃度は約２４μｇ／mlである。

【００８５】３．１．３．ビオチン化ＢｌａＲ−ＣＴＤと金のビーズとの結合例３．１．１．で調製したビオチン化ＢｌａＲ−ＣＴＤ溶液をＨＮＭ−ＢＳＡ
緩衝液（Ｈｅｐｅｓ５００mM、pH８、ＮａＣｌ５００mM、ＭｇＣｌ₂ ２５
０mM、ＢＳＡ１０mg／ml）で１１４．７倍に希釈する。室温で、２２．５容量
部のこの希釈ビオチン化ＢｌａＲ−ＣＴＤ溶液、７．５容量部のＨＮＭ−ＢＳＡ
緩衝液、９．２７容量部のビオチン化ＢｌａＲ−ＣＴＤを標識するために用いる
金粒子懸濁液及び６容量部の対照標準金粒子懸濁液を混合する（下記例３．１．
４．参照）。

【００８６】３．１．４．独立した対照標準この試験において、試料中に存在する抗生物質の迅速な定量化を可能とする強
度のバンドを供給する対照標準物質も用いる。この目的のために、ヤギアンチ−ウサギ免疫グロブリン抗体を析出させた４
０nmの金の粒子を用いる。これらの粒子は、ＢｒｉｔｉｓｈＢｉｏｃｅｌｌ（
Ｒｅｆ．ＧＡＲ４０）から、０．１％のナトリウムアジドで安定化した、pH７．
２の２mMのテトラホウ酸ナトリウム水溶液中の懸濁液の形で得られる。５２０nm
でのこれらの懸濁液の光学密度は約３で、タンパク質濃度は約６μｇ／mlである
。

【００８７】３．２．捕獲物質３．２．１．第１捕獲物質−対照標準抗生物質炭酸ナトリウム緩衝液（１００mM、pH９）中に、２１３mgのヒトγ−グロブリ
ン（Ｇ４３８６，Ｓｉｇｍａ）及び８．６mgの２−イミノ−チオラン塩酸塩（Ａ
ｌｄｒｉｃｈ３３０５６−６）を含有する８mlの溶液を２５℃で１時間インキ
ュベートする。さらに、炭酸ナトリウム緩衝液（１００mM、pH９）中に、１１９．８mgのセフ
ァロスポリンＣ及び５４mgの４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１
−カルボン酸スルホスクシンイミジル（ｓＳＭＣＣ，２２３２２Ｐｉｅｒｃｅ
）を含有する２０mlの溶液を２５℃で１時間インキュベートする。次いで、上記で調製された２つの溶液を混合する。得られる溶液のpHを３mlの
ＮａＨ₂ＰＯ₄ ５００mMを加えることにより７．１に調整し、この溶液を２５
℃で２時間インキュベートする。インキュベート後に得られた混合物を１リット
ルのリン酸ナトリウム緩衝液（１０mM、pH７．５）に対して３回透析する。得ら
れた溶液を０．２２μｍフィルターでろ過し、次いでアリコートに分割し、用い
るまで−２０℃で凍結する。

【００８８】使用時に、アリコートを融解し、膜に析出させる前に食品着色剤をそれらに加
え、析出の正確な位置及び微量物の品質をいかなる瞬間にでも示すようにする。第１捕獲物質は、試料中に存在する抗生物質の量に関して過剰に存在する金の
ビーズと結合するＢｌａＲ−ＣＴＤを固定することを可能にする。３．２．２．第２捕獲物質−独立した対照標準を固定することが可能な物質第２捕獲物質について、１０mMリン酸ナトリウム、pH７．５において、０．５
mg／mlの免疫グロブリン濃度で、ヒトγグロブリン５mg／ml緩衝液を有するウサ
ギ免疫グロブリン溶液（ＳｉｇｍａＩ５００６）を、用いる。この第２捕獲
物質は、液体がアッセイ装置を泳動する時に独立した対照標準を停止させる。

【００８９】３．３．アッセイ装置例１．１．に記載の手順に従って組み立てた、膜（２），（３）及び（４）を
含有するアッセイ装置を用いる。これらの装置の膜（３）は、基部の側に例３．
２．１．に記載の捕獲物質を、そして、末端側に例３．２．２．に記載の捕獲物
質を担持する。捕獲物質を例１．２．に記載の手順に従って析出させた。

【００９０】３．４．乳汁中の抗生物質の測定３．４．１．３分間試験−迅速試験ペニシリンＧを、それぞれ、０、１、２、３、４、５及び６ppb 含有する、新
鮮な乳汁の７つの試料を調製する。次いで、これらの溶液の各々を次のように分
析する。２００μｌの乳汁試料及び４５．２７μｌの例３．１．３．で調製した溶液の
アリコートを採取し、ガラスのフラスコに入れる。この混合物を４７℃で１分間
インキュベートする。次いでアッセイ装置を取り、そして、アッセイ装置の第１
端部が混合物と接触するようにガラスのフラスコに垂直に第２端部がガラスのフ
ラスコの壁に残るように入れる。混合物を、アッセンブリを４７℃で２分間イン
キュベートしながら、アッセイ装置中を泳動させる。

【００９１】下表１は、試験した７つの試料について得られた結果を示す。０〜１０の範囲
の強度値を検出したバンドに対して与え、値１０は最も強いバンドに与え、値０
は最も強度の小さいバンドに与える。この目盛で、値６を対照標準に与える。第
１検出バンドに認められるシグナルの強度は、試料中に存在するペニシリンＧの
量に反比例する。表１ペニシリンＧ強度（ppb ）第１バンド第２バンド０１０６１９６２９６３４６４０６５０６６０６

【００９２】この例において、第１バンドが、第２バンドよりも低い強度を有する時、試験
は陽性と考えられる。表１に示された結果は、この試験は３分間で乳汁試料中の
４ppb 未満のペニシリンＧを検出可能にさせることを示している。アッセイを同じ条件下に他のβ−ラクタム環抗生物質にも行った。３分間で行
なわれるこの試験は、乳汁試料中のアモキシリンを５ppb まで、アンピシリンを
５ppb まで、クロキサシリンを１０ppb 未満で、ジクロキサシリンを２０ppb 未
満で、オキサシリンを２０ppb 未満で及びセファピリンを２０ppb まで検出可能
にする。

【００９３】１．３．２．５分間試験クロキサシリンを、それぞれ、０、２、４、６、８及び１０ppb 含有する、新
鮮な乳汁の６つの試料を調製する。次いで、これらの溶液の各々を次のように分
析する。２００μｌの乳汁試料及び４５．２７μｌの例３．１．３．で調製した溶液の
アリコートを採取し、ガラスのフラスコに入れる。この混合物を４７℃で３分間
インキュベートする。アッセイ装置を取り、アッセイ装置の第１端部が混合物と
接触するようにガラスのフラスコに垂直に、第２端部がガラスのフラスコの壁の
上に残るように入れる。混合物を、アッセンブリを４７℃で２分間インキュベー
トしながら、アッセイ装置中を泳動させる。

【００９４】下表２は、試験した６つの試料について得られた結果を示す。０〜１０の範囲
の強度値を検出したバンドに対して与え、値１０は最も強いバンドに与え、値０
は最も強度の小さいバンドに与える。この目盛で、値６を対照標準に与える。第
１バンドに認められるシグナルの強度は、試料中に存在するクロキサシリンの量
に反比例する。表２クロキサシリン強度（ppb ）第１バンド第２バンド０１０６２６６４５６６３６８３６１０３６

【００９５】この例において、第１バンドが、第２バンドよりも低い強度を有する時、試験
は陽性と考えられる。表２に示された結果は５分間で乳汁試料中の４ppb のクロ
キサリンまでを検出可能にする。アッセイを同じ条件下で他のβ−ラクタム環抗生物質にも行った。５分間で行
なわれるこの試験は、乳汁試料中のペニシリンＧを３ppb まで、アモキシリンを
４ppb まで、アンピシリンを４ppb まで、ジクロキサシリンを８ppb まで、オキ
サシリンを８ppb まで、セファピリンを１６ppb まで、セフチオファーを１００
ppb まで、セフキノンを２０ppb 未満で、ナフシリンを２０ppb まで及びセファ
ゾリンを６０ppb まで検出を可能とする。この試験は乳汁ローリーがサイロにその内容物に移す前の分類試験として特に
適切である。

【００９６】１．３．３．９分間試験セファピリンを、それぞれ、０、４、６、８、１０及び１２ppb 含有する、新
鮮な乳汁の６つの試料を調製する。次いで、これらの溶液の各々を次のように分
析する。２００μｌの乳汁試料及び４５．２７μｌの例３．１．３．で調製した溶液の
アリコートを採取し、ガラスのフラスコに入れる。この混合物を４７℃で７分間
インキュベートする。アッセイ装置を取り、アッセイ装置の第１端部が混合物と
接触するようにガラスのフラスコに垂直に、第２端部がガラスのフラスコの壁の
上に残るように入れる。混合物を、アッセンブリを４７℃で２分間インキュベー
トしながら、アッセイ装置中を泳動させる。

【００９７】下表３は、試験した６つの試料について得られた結果を示す。０〜１０の範囲
の強度値を検出したバンドに対して与え、値１０は最も強いバンドに与え、値０
は最も強度の小さいバンドに与える。この目盛で、値６を対照標準に与える。第
１バンドに認められるシグナルの強度は、試料中に存在するセファピリンの量に
反比例する。表３セファピリン強度（ppb ）第１バンド第２バンド０１０６４６６６５６８４６１０３６１２３６

【００９８】この例において、第１バンドが、第２バンドよりも低い強度を有する時、試験
は陽性と考えられる。表３に示された結果は、この試験は９分間で、乳汁試料中
の６ppb までのセファピリンの検出を可能にする。

【００９９】アッセイは、同じ条件下で他のβ−ラクタム環抗生物質にも行った。９分間で
行なわれるこの試験は、乳汁試料中のペニシリンＧを３ppb まで、アモキシリン
を４ppb まで、アンピシリンを４ppb まで、クロキサシリンを４ppb まで、ジク
ロキサリンを８ppb まで、オキサシリンを８ppb まで、セフチオファーを８０pp
b まで、セフキノンを２０ppb 未満で、ナフシリンを２０ppb まで及びセファゾ
リンを４５ppb まで検出可能にする。９分間で行なわれるこの試験は、したがって、ヨーロッパ当局により現在監視
されているすべての抗生物質の検出を可能にし、そして、これらの当局により負
わされた法的限度までの検出を可能とする。

【０１００】１．３．４．２０分間試験セフチオファーを、それぞれ、０、２０、３０、４０、５０及び６０ppb 含有
する、新鮮な乳汁の６つの試料を調製する。次いで、これらの溶液の各々を次の
ように分析する。２００μｌの乳汁試料及び４５．２７μｌの例３．１．３．で調製した溶液の
アリコートを採取し、ガラスのフラスコに入れる。この混合物を４７℃で１８分
間インキュベートする。アッセイ装置を取り、アッセイ装置の第１端部が混合物
と接触し、第２端部がガラスのフラスコの壁に残るように垂直に入れる。混合物
をアッセンブリを４７℃で２分間インキュベートしながらアッセイ装置中を泳動
させる。

【０１０１】下表４は、試験した６つの試料について得られた結果を示す。０〜１０の範囲
の強度値を検出したバンドに対して与え、値１０は最も強いバンドに与え、値０
は最も強度の小さいバンドに与える。この目盛で、値６を対照標準に与える。第
１検出バンドに認められるシグナルの強度は、試料中に存在するセフチオファー
の量に反比例する。表４セフチオファー強度（ppb ）第１バンド第２バンド０１０６２０６６３０５６４０４６５０３６６０３６

【０１０２】この例において、第１バンドが、第２バンドよりも低い強度を有する時、試験
は陽性と考えられる。表４に示された結果はこの試験が２０分間で乳汁試料中の
３０ppb までのセフチオファーの検出を可能にする。したがって、この２０分間試験は最近、ヨーロッパ及びアメリカの当局により
監視されるすべての抗生物質を１回の試験で検出可能にし、これらの当局により
課された法的限度まで検出可能にする。例４．プラスチックケース中のアッセイ装置の使用例１．６．に記載したアッセイ装置を用いる。この例においては、試料とアッ
セイ装置と接触させることは、この目的のために設けられた水盤形開口中にイン
キュベートした混合物を置くことにより行なう。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のアッセイ装置の例を図示する。

【図１ａ】正面図を示す。

【図１ｂ】縦断面図を示す。

【図２】本発明のアッセイ装置の例を図示する。正面図を示す。

【図３】本発明のアッセイ装置の例を図示する。正面図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者グランニエール，ベノワベルギー国，ベ−4130 エスヌー，ケドゥラリジャンス 33 (72)発明者ジョリ，ベルナールベルギー国，ベ−4900 スパ，シュマンデムートン 66

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】液状乳製品の切線方向の毛管泳動による前記乳製品中の分析
物の存在の検出を可能にするアッセイ装置であって、第１端部と第２端部を有し、次の膜、 −分析した液体を精製することを可能にする膜（２）、 −１以上の捕獲物質が固定されている膜（３）及び −吸収性の膜（４）が、第１端部から始まり連続して固定されている固体支持体（１）を含み、アッ
セイ装置の第１端部を分析する乳製品中に浸漬した後に、試料の切線方向の毛管
泳動の間に、乳製品中に存在するかもしれない分析物及び実施する方法にしたが
って用いられる検出試薬がアッセイ装置中を泳動しないようにする、乳製品に存
在する物質を膜（２）が保持することができることを特徴とする装置。
【請求項２】前記膜（２）がロイコソーブ（Ｌｅｕｋｏｓｏｒｂ）膜であ
ることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】少なくとも１種の検出試薬を析出させた膜（５）を更に有し
、前記膜（５）は膜（３）の前に位置していることを特徴とする請求項１または
２に記載の装置。
【請求項４】前記膜が接着性プラスチックフィルム（６）により完全また
は部分的に被覆されていることを特徴とする請求項１〜３に記載のアッセイ装置
。
【請求項５】前記プラスチックフィルム（６）がアッセイ装置の最初の数
ミリメートルを被覆していないことを特徴とする請求項４に記載のアッセイ装置
。
【請求項６】アッセイ装置が前記膜（２）の上方に水盤の形の開口及び前
記膜（３）の上方に窓開口を有するプラスチックの箱の内に位置していることを
特徴とする請求項１〜４に記載のアッセイ装置。
【請求項７】請求項１〜６のいずれか１項に記載のアッセイ装置を用いて
、液状乳製品中の分析物を検出する方法であって、次の工程、ａ）定められた容積の乳製品と本発明によるアッセイ装置との接触、この接触
はアッセイ装置の第１端部で行なわれ、ｂ）乳製品中に存在するかもしれない分析物と検出試薬を、徐々に、膜（２）
、次いで膜（３）を通過させ、膜（２）及び（３）により停止しない乳製品の構
成成分が膜（４）で終りとなるような、アッセイ装置の乳製品の毛管現象による
切線方向の泳動、及びｃ）膜（３）上の固定の測定を含む方法。
【請求項８】前記検出試薬が、前記分析物またはこの分析物の類似物質を
特異的に認識可能な少なくとも１種の物質及び少なくとも１種の標識化剤を含む
ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】前記分析物またはこの分析物の類似物質を特異的に認識可能
な少なくとも１種の物質を少なくとも１種の標識化剤と反応させることを特徴と
する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】前記標識化剤が、蛍光性、粒子状、放射性、発光性または
酵素的であることを特徴とする請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】少なくとも１種の検出剤を工程ａ）の前に加えることを特
徴とする請求項７〜１０に記載の方法。
【請求項１２】工程ａ）の前に調製された混合物を、少なくとも１種の前
記検出試薬が前記分析物またはこの分析物の類似物質と安定で、かつ、本質的に
不可逆的な複合物を形成することを可能にするインキュベート条件下に維持する
ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】前記検出試薬がさらに少なくとも１種の対照標準物質を含
むことを特徴とする請求項８〜１０に記載の方法。
【請求項１４】前記分析物が、テトラサイクリン類、たとえば、テトラサ
イクリン、オキシテトラサイクリンまたはクロルテトラサイクリンであることを
特徴とする請求項７〜１３に記載の方法。
【請求項１５】前記分析物が、第１に液状乳製品の外因性タンパク質、た
とえば、外来タンパク質であるか、または、第２に、乳製品の内因性タンパク質
、たとえば、ホルモン、たとえば、プロゲステロンまたは成長ホルモンであるこ
とを特徴とする請求項７〜１３に記載の方法。
【請求項１６】前記分析物がβ−ラクタム環である抗生物質であることを
特徴とする請求項７〜１３に記載の方法。
【請求項１７】前記分析物を、ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）、ア
ンピシリン、アモキシリン、カルベニシリン、メチシリン、クロキサシリン、６
−ＡＰＡ、モノラクタム、アズトレオナム、メシリナム、セファレキシン、セフ
ァログリシン、セファロリジン、ニトロセフィン、セファトキシム、デフロキシ
ム、セフチオファー、セファピリン、７−ＡＣＡからなる群から選択することを
特徴とする請求項７〜１３に記載の方法。
【請求項１８】前記分析物または前記分析物の類似物質を特異的に認識可
能な物質を、前記分析物または前記分析物の類似物質と安定で、かつ、本質的に
不可逆性の複合体を形成可能なレセプター及び前記分析物または前記分析物の類
似物質に特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体から選択するこ
とを特徴とする請求項８〜１７に記載の方法。
【請求項１９】前記分析物または前記分析物の類似物質を特異的に認識可
能な物質が、抗生物質感受性微生物から得られたレセプター、たとえば、バチルス種、ストレプトコッカス種またはアクチノミセテス種から得られたレセプター
であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】前記分析物または前記分析物の類似物質を特異的に認識可
能な物質が、バチルス・リヘニホルミスから得られた、β−ラクタム環を有する
抗生物質に感受性のレセプターであることを特徴とする請求項１８または１９に
記載の方法。
【請求項２１】 β−ラクタム環を有する抗生物質に感受性で、かつ、バチルス・リヘニホルミスから得られたレセプターがレセプターＢｌａＲまたはレセ
プターＢｌａＲ−ＣＴＤであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】カードを、接着剤で被覆した固体支持体（１）と膜から貼
合せ機により製造し、捕獲溶液を膜（３）上に析出させ、次いで、カードを、細
長い片に切断し、これらの細長い片の各々がアッセイ装置を構成することを特徴
とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のアッセイ装置を製造する方法。
【請求項２３】請求項１〜６に記載のアッセイ装置を含むアッセイキット
。