CZ301093B6

CZ301093B6 - Zpusob detekce analytu v tekutém mlécném produktu a testovací zarízení k provádení zpusobu

Info

Publication number: CZ301093B6
Application number: CZ20001059A
Authority: CZ
Inventors: Degelaen@Jacques; Frere@Jean-Marie; Granier@Benoit; Joris@Bernard
Original assignee: Neogen Corporation (Michigan Corporation)
Priority date: 1997-10-07
Filing date: 1998-10-06
Publication date: 2009-11-04
Also published as: US20040096356A1; US20020127737A1; WO1999018439A1; RU2206093C2; CN1274423A; AU738143B2; CZ20001059A3; AR013671A1; AU9424898A; DE69830416D1; KR20010024457A; BR9812876A; NO20001817L; TR200000921T2; NO20001817D0; NZ503430A; PT1023603E; EP1023603A1; CA2305774A1; PL339901A1

Abstract

Testovací zarízení, které dovoluje detekovat prítomnost zkoumaných látek v tekutém mlécném produktu na základe kapilární tecné migrace uvedeného mlécného produktu, zahrnuje pevný nosic (1), který má první okraj a druhý okraj, na kterém jsou pripevneny, postupujíce postupne od prvního okraje, membrána (2) z netkaných polyesterových vláken dovolující purifikaci analyzované kapaliny, membrána (3), na které jsou imobilizovány jedna nebo více záchytných látek, a absorpcní membrána (4). Rešení se také týká zpusobu detekce analytu v tekutém mlécném produktu tímto testovacím zarízení.

Description

Vynález se týká testovacího zařízení pro provádění analýzy v tekutém mléčném produktu jako je mléko. Vynález se také týká způsobu provádění detekce a kvantitativního určování látek v mléku použitím uvedeného testovacího zařízení a testovací soupravy, obsahující uvedené testovací zářilo zení.

Dosavadní stav techniky

V současné době zdravotní předpisy mnoha zemí vyžadují pravidelnou kontrolu přítomnosti různých látek v mléčných produktech, jako jsou veterinární léky a hormony, běžně používané při chovu dobytka. Ze zřejmých lékařských důvodů se tyto produkty nesmí vyskytovat v mléčných produktech určených pro lidskou spotřebu.

V jiných případech je žádoucí mít k dispozici testy dovolující detekci endogenních látek v mléku pro optimalizaci způsobů chovu dobytka. Konkrétně rychlé určení úrovní hormonů v mléku dovoluje snadno identifikovat období vhodná pro reprodukci.

Ještě v dalších případech je potřeba praktických a spolehlivých způsobů kontroly původu mléč25 ných produktů získaných z mléka různých zvířecích druhů. Je proto potřeba způsobů, které dovolují identifikací přítomnosti proteinů v mléce, které jsou charakteristické pro jisté druhy ve srovnání s jinými druhy,

Z literatury jsou známy různé druhy testů pro analýzu biologických tekutin. Tyto testy obecně používají způsoby detekce, které jsou založeny na rozpoznávacím činidlu (receptory nebo protilátky), které specificky rozpoznávají hledanou látku nebo její analog a na značkovacím činidlu (radioaktivní prvek, enzym, fluorescenční činidlo a podobně), které jsou dále označovány jako detekční činidla. V závislosti na zvoleném způsobu se mluví o radioimunologickém testu (RIA), radioreceptorovém testu (RRA), enzymovém imunologickém testu (EIA) a podobně. Ve svém obecném principu tyto testy využívají minimální kombinací dvou výše uvedených prvků (detekčních Činidel), která umožní získat výsledek, jehož hodnota indikuje množství zkoumané látky, které je přítomno.

Je vhodné poznamenat, že v závislosti na použitém způsobu detekce může být označující činidlo spojeno buď s rozpoznávacím činidlem nebo s testovanou látkou nebo s látkou, která je analogická testované látce z hlediska rozpoznávání použitým rozpoznávacím činidlem. Existují také testovací způsoby, ve kterých rozpoznávací Činidlo nebo testovaná látka nebo látka analogická testované látce obsahují v sobě označovací Činidlo (například radioaktivně označená testovaná látka).

U mléčných produktů se nejčastěji popisované testy týkají detekce antibiotik. Je totiž dobře známo, že antibiotika pěstitelé používají pro léčbu jistých infekčních onemocnění dobytka.

Ze zřejmých lékařských důvodů mléko určené k lidské spotřebě musí v principu být prosté všech so antibiotik. Mimo jiné koncentrace penicilinu 0,005 U/ml nebo méně může mít Škodlivé důsledky v průběhu výroby produktů odvozených z mléka, jako je sýr, jogurt a podobně.

Může být předvídána řada situací. Například v prvním případě pro detekci přítomnosti antibiotik na farmě před převedením do kamionu, bude mít prioritu extrémně rychlý (méně než 5 minut) a jednoduchý test. Použití rychlého testu může být také vhodné jestliže například antibiotikum,

-1Cl 301093 B6 které bylo použito pro ošetření je známé a jestliže dále uvedený test dovoluje detekci uvažovaného antibiotika podle zákonné normy. V opačném případě, pokud na rychlost není dáván důraz, je důležité detekovat většinu nebo všechna antibiotika v zákonných normách.

Zákonné úpravy některých zemí stanoví přesně stanovené kvalitativní normy. Například americké úřady vyžadují, aby koncentrace šesti dále uvedených antibiotik v mléku nepřekračovaly přesně určené hodnoty: penicilín, 5*10“⁹; ampicilin, 10-ΚΓ⁹; amoxicilin, 10-10 , cloxacilin, 10*10“⁹; cefapirin, 20· KT⁹; ceftiofur, 50-10 ⁹. Evropské společenství také stanoví normy kvality: penicilín 4-10“⁹; amoxicilin 4-10'⁹; ampicilin 4-10^ cloxacilin 30* 10“⁹; dicloxacilin 304 O'⁹; oxacilin 30-10'⁹; cefapirin 10-10'⁹; ceftiofur 100-10 ⁹; cefchinon 20-1O⁹; nafcilin 30-10’⁹; cefazolin 50-10'⁹.

Může proto být užitečné mít k dispozici test, kteiý dovoluje detekci většiny antibiotik. Kromě toho v mlékárenském průmyslu může být užitečné mít k dispozici test, který má všechny vlast15 nosti rychlosti, citlivosti a jednoduchosti, test, který dovoluje vázat tyto tri parametry co nejlepším způsobem a to i pokud nejsou úplně pokryty.

Vynález US 4.239.852 popisuje mikrobiologický způsob detekce antibiotik s β-laktamovým jádrem v mléku. Podle tohoto způsobu se vzorek mléka inkubuje na jedné straně v přítomnosti částí buněk mikroorganismu, který je velmi citlivý na antibiotika, obzvláště Bacillus stearothermophilus a na druhé straně v přítomnosti antibiotika označeného radioaktivním prvkem nebo enzymem. Inkubace se provádí za podmínek dovolujících, aby antibiotika, popřípadě přítomná ve vzorku a označené antibiotikum se vázaly k částem buněk.

Po ukončení inkubace se částí buněk oddělí ze směsi a potom promývají. Potom se množství označených antibiotik vázaných na části buněk určí a porovnává se standardem. Množství označených antibiotik, vázaných ke zbytkům buněk je nepřímo úměrné koncentraci antibiotik, přítomných ve vzorku analyzovaného mléka.

Tento způsob vyžaduje relativně jemné manipulace, zejména během separace částí buněk ze směsi. Mimoto ve své nejcitlivější verzi tento způsob používá antibiotikum označené radioaktivním prvkem ( ⁴C nebo ¹²⁹I). V tomto případě určení množství antibiotika, které je popřípadě přítomno v mléku vyžaduje použití speciálního přístroje, jako je například scintilační počítač. Kromě toho manipulace s radioaktivními produkty, a to i v případě použití velmi malých množ35 ství, není zcela prostá nebezpečí pro osobu, která provádí analýzu.

Evropská přihláška vynálezu 593.112 popisuje jiný způsob, dovolující detekci antibiotik v mléku. Tento způsob používá protein izolovaný z mikroorganismu citlivého na antibiotika, jako je například Bacillus stearothermophilus. Tento protein se kromě jiného označí enzymem jako je peroxi40 dáza.

Test postupuje následujícím způsobem: vzorek mléka se inkubuje ve zkumavce v přítomnosti označeného proteinu; po inkubaci se mléko přenese do druhé zkumavky, na jejíchž stěnách bylo imobilizováno referenční antibiotikum; provede se druhá inkubace, potom se odstraní obsah zku45 mavky; stěny druhé zkumavky se třikrát promývají promývacím roztokem, který se také odstraní. Potom se rezidua, přítomná na stěnách druhé zkumavky přenesou na savý papír; dále se do druhé zkumavky přidá barevný substrát, který se znovu inkubuje, potom se přidá roztok, který zastaví vývin barvy; zabarvení zkumavky se porovná se zabarvením, kterého bylo dosaženo v paralelně prováděném identickém testu na standardním vzorku antibiotika. Množství označeného proteinu, [mobilizovaném na nosiči, tedy také intenzita zabarvení, je nepřímo úměrné množství antibiotika, přítomného v analyzovaném vzorku mléka.

Podle příkladu 1 předložené přihlášky vynálezu tento test dovoluje detekovat penicilín G až do koncentrací, které jsou řádu 5Ί0⁹ a dovoluje detekci amoxicilinu (5-10“⁹), ampicilinu (10Ί0“⁹), cefapirinu (5-10~⁹) a ceftioťuru (5' 10 ⁹).

Nicméně test je značně náročný na provádění, obzvláště nekvalifikovaným personálem. Tento test totiž zahrnuje množství etap, v to počítaje etapy přelévání kapaliny a reziduí a několik etap promývání.

Vzhledem k počtu a povaze etap požadovaných v tomto testu je získání spolehlivého výsledku závislé silně na schopnostech osoby, který test provádí.

Mimo to interpretace výsledku si vyžaduje provedení dvou souběžných testů, což ještě více náso10 bí a komplikuje operace.

Jsou také známy další typy enzymatických způsobů, které umožňují určení slabých koncentrací antibiotik v mléku (J. M. FRERE a kol., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18(4), 506510 (1980), a také vynálezy EP 85.667 a EP 468.946), které jsou založeny na použití specifické15 ho enzymu, totiž exobuněčné rozpustné D-alanyl-D-alanin-carboxypeptidázy, kterou produkuje Actinomadura R39 (dále označovaná jako „enzym R39“). Enzym R39 má specifickou aktivitu hydrolýzy skupin D-alanyl-D-alanin u různých peptidů a je také schopný hydrolyzovat konkrétní thioestery.

Kromě jiného enzym R39 reaguje s antibiotiky s p-laktamovým jádrem za velmi rychlého vytvoření equimolámího komplexu enzym-antibiotikum, který je neaktivní a v zásadě ireverzibilní.

V nejnovější verzi tohoto testu (EP 468 946) se určený objem vzorku kapaliny určení k testování inkubuje s určeným množstvím enzymu R39 za podmínek, které dovolují, aby β-laktamové anti25 biotikum, které je popřípadě přítomno ve vzorku, reagovalo s enzymem pro vytvoření ekvimolárního komplexu enzym-antibiotikum, který je neaktivní a v zásadě ireverzibilní.

Potom se určené množství substrátu typu thioesteru inkubuje s produktem získaným v první etapě za podmínek, dovolujících hydrolýzu substrátu reziduálním enzymem R39, který dosud nekom30 plexoval s antibiotikem během první inkubace. Množství takto vytvořené kyseliny merkaptoalkanové se potom určí kolorimetrickou metodou pomocí reaktantů, který je schopný vytvářet zabarvení s volnou skupinou SH kyseliny merkaptoalkanové. Intenzita zabarvení se porovnává s etanolem, kteiý byl předem vytvořen ze vzorků obsahujících známá množství antibiotik. Kvantitativní určení může být provedeno měřením pomocí spektrofotometrie; v případě mléka může být nutné provést nejprve zprůhlednění vzorku.

Je zřejmé, že tento test zahrnuje méně etap a je jednodušší k provádění než test popsaný v přihlášce vynálezu EP 593 112. Nicméně tento test je omezen na detekci antibiotik s p-laktamovým kruhem a u těchto antibiotik navíc do prahu dostupné detekce pomoct enzymu R39. Jako takový tento test nemůže být používán s dalšími receptory antibiotik a nemůže přímo sloužit jako základ pro detekci dalších druhů látek v mléku.

Jelikož současné testy vykazují ještě další nevýhody, přihlašovatelé si stanovili jako cíl hledat nové způsoby detekce látek v tekutých mléčných produktech, přičemž hledané způsoby by měly dovolovat spolehlivé určení různých druhů zkoumaných látek, výhodně v okamžiku odběru na farmě. Přihlašovatelé tedy hledali způsob, který by dovoloval velmi rychle získat spolehlivé a citlivé výsledky po provedení omezeného počtu jednoduchých kroků, které by nevyžadovaly obzvláštní dovednosti v provádění experimentů. Kromě toho přihlašovatelé hledali způsob, který by dával výsledky snadno zjistitelné vizuálně a dovolovaly mimoto provádět kvantitativní analý50 zu pomocí měření přístroji.

Přihlašovatelé nyní zjistili, že tohoto cíle je možno dosáhnout díky použití nového testovacího zařízení, které dovoluje snadno zjišťovat přítomnost zkoumaných látek v tekutých mléčných produktech, konkrétně v mléce,

Ί

Podstata vynálezu

Vynález se týká testovacího zařízení, které dovoluje detekovat přítomnost zkoumaných látek v tekutých mléčných produktech na základě kapilární tečné migrace uvedeného mléčného pro5 duktu. Testovací zařízení podle předloženého vynálezu zahrnuje pevný nosič (1), který má první okraj a druhý okraj, na kterém jsou připevněny, postupujíce od prvního konce, membrána (2), umožňující analyzované kapaliny;

membrána (3), na které jsou imobilizovány jedna nebo více záchytných látek; a absorpční membrána (4), ío přičemž membrána (2) je schopná zadržovat látky, přítomné v mléčném produktu, která zabraňují migrací zkoumaných látek, popřípadě přítomných v mléčném produktu a detekčních reagentů použitých v prováděném způsobu, testovacím zařízením, a to během kapilární tečné migrace vzorku po navlhčení prvního konce testovacího zařízení v analyzovaném mléčném produktu.

V konkrétním provedení předloženého vynálezu testovací zařízení podle předloženého vynálezu obsahuje dále membránu (5), na které je nanesen alespoňjeden detekční reagent a tento detekční reagent je schopen se rychle rozpouštět v přítomnosti uvedeného mléčného produktu. V tomto konkrétním provedení membrána (5) musí být umístěna před membránou (3). Může být umístěna například buď před membránou (2) na prvním konci zařízení a nebo mezi membránou (2) a membránou (3) nebo také pod nebo nad membránou (2).

Různé membrány použité v testovacím zařízení podle předloženého vynálezu se překrývají na svých koncích tak, aby zajišťovaly kontinuální migraci mléčného produktu z jedné oblasti do druhé. Výhodně je membrána (3) umístěna tak, aby její blízký okraj byl umístěn pod membránou (2) a její vzdálený okraj byl umístěn pod membránou (4), Membrány mohou být popřípadě udržovány v kontaktu jedna s druhou díky adhezivní plastové fólii (6). V tomto případě se adhezivní plastová fólie volí tak, aby neovlivňovala migraci kapaliny testovacím zařízením.

Možnost zakrýt testovací zařízení adhezivní plastovou fólií přináší dvě výhody: zajišťuje doko30 nalý kontakt membrán v místě překrývání a představuje ochranu zařízení. Adhezivní plastová fólie (6) může buď úplně zakrývat membrány (2), (3), (4) a (5) nebo částečně zakrývat jednotlivé membrány. Výhodně adhezivní plastová fólie (6) nezakrývá prvních několik milimetrů prvního konce, tak aby byla umožněna rychlejší migrace kapaliny membránou (2) testovacího zařízení.

Pevný nosič (1) přítomný v testovacím zařízení podle předloženého vynálezu je vyroben ze skla nebo plastu, výhodně z plastu. V případě nosiče z plastu je jeho tloušťka obecně v rozmezí od 0,05 do 1 mm, s výhodou od 0,1 do 0,6 mm. Membrány jsou připevněny na pevném nosiči (1) přilepením.

Membrána (2) může být různých typů. Na jedné straně musí být schopna zadržovat látky přítomné v mléčném produktu, které zabraňují migraci zkoumaných látek, popřípadě přítomných v mléčném produktu a detekčních reagentů použitých v prováděném způsobu, testovacím zařízením. Na druhé straně musí dovolovat rychlou migraci zkoumaných látek a detekčních reagentů testovacím zařízením, přičemž musí zachovávat aktivitu těchto zkoumaných látek a detekčních reagentů během uvedené migrace. Neomezující příklady membrán, dovolujících získat tyto výsledky jsou Cytosep 1663 a Leukosorb LK4 (dodávané společností Pall Gelman Sciences), GF/D, GF/DVA, 17CHR (dodávané společností Whatmann) a skleněná vlákna typu GF141 (dodávaná společností Alstrom).

so Výhodně používaná membrána Leukosorb je membrána vyráběná z netkaných polyesterových vláken, určená na zadržování leukocytů z klinických vzorků krve, moči, slin a cerebrospinální tekutiny. K zadržování leukocytů dochází filtrací tekutiny při jejím transversálním prostupu membránou.

Přihlašovatelé neočekávaně zjistili, že tento typ membrán také dovoluje zajistit funkci, která je velmi důležitá pro detekci hledaných látek v mléčném produktu pomocí testovacího zařízení podle předloženého vynálezu, totiž zadržování látek přítomných v mléčných produktech, které zabraňují dobrému průběhu testu detekce, prováděného kapilární tečnou migrací mléčného pro5 duktu na uvedeném testovacím zařízení, přičemž současně dovoluje rychlou migraci hledaných látek a detekčních reagentů.

K tomu aby mohla fungovat tímto optimálním způsobem, membrána (2) musí být dostatečně dlouhá, aby dovolila eliminaci všech látek přítomných v mléčných produktech, které zabraňují io rychlé migraci hledaných látek a detekčních reagentů testovacím zařízením.

Membrána (3) musí dovolovat imobilizaci jedné nebo více záchytných látek a musí dovolovat rychlou migraci vzorku mléčného produktu po průchodem membránou (2). S výhodou je membrána (3) vytvořena na neporézním nosiči typu polyesteru. Neomezující příklady vhodných is membrán podle předloženého vynálezu jsou nitrocelulózové membrány se zvýšenou kapilární rychlostí jako jsou membrány Hi-Flow (dodávané společností Míllipore), výhodně membrány

Hi-Flow typu SX nebo ST. Tyto membrány dávají optimální výsledek spolu s membránami (2), které byly popsány výše.

Jedna nebo více záchytných látek se imobilizuje na membráně (3). Typ imobilizované záchytné látky závisí pochopitelně na způsobu použitém pro detekci hledaných látek; záchytné látky jsou schopné imobilizovat selektivně alespoň jednu složku přítomnou v tekutině, migrující na testovacím zařízením, jako je například jeden z detekčních reagentů nebo produkt vzniklý vytvořením komplexu mezi hledanou látkou nebo látkou analogickou této hledané látce a alespoň jedním detekčním reagentem nebo také produkt vzniklý vytvořením komplexu více detekčních reagentů. Záchytná látka může také být jedním z detekčních reagentů. Záchytné látky se umístí koncentrovaným způsobem na přesně definované jedné části nebo více částech membrány (3), jako jsou tenké kruhy nebo pásy nebo jakýkoliv jiný motiv vhodný pro danou aplikaci. Ať je zvolený motiv jakýkoli, musí umožňovat zřetelné odečtení výsledku.

Co se týče rozměrů, membrána (3) musí mít dostatečnou délku k tomu, aby obsahovala všechny použité záchytné látky a to v pořadí a v množství požadovaném použitým způsobem detekce.

Typ membrány, použitý pro membránu (4) není příliš důležitý, dokud je tato membrána schopna absorbovat a uchovávat kapalinu po jejím průchodu předchozími membránami. Membrána (4) má dostatečně velkou velikost k absorpci kapaliny po jejím průchodu membránou (3), ale také z praktického hlediska takovou, aby dovolovala snadnější uchopení testovacího zařízení.

Testovací zařízení podle předloženého vynálezu může také popřípadě zahrnovat membránu (5), na které je nanesen alespoň jeden detekční reagent. Membrána (5) musí dovolovat migraci mléčného produktu a přitom dovolovat solubilizaci a uvolňování detekční reagent (nebo detekčních reagentů) během průchodu proudu mléčného produktu. Neomezující příklady membrán, které mohou být vyhovující k tomuto účelu jsou: membrány na bázi pryskyřic ve skelných vláknech jako jsou membrány T5NM (dodávané společností Míllipore), membrány F075-14 nebo F01545 17 nebo GF/C (dodávané společností Whatman), membrána Cytosep 1663 (dodávaná společností

Pall Gelman Sciences), membrány na bázi pryskyřic v polyesterových vláknech jako jsou membrány Accuwick (dodávané společností Pall Gelman Sciences), celulózový papír 3 mm (dodávaný společností Whatman) nebo nakonec membrány typu Release Matrix PT-R2 (dodávané společností Advances Micro Devices). Výhodně se používají membrány na bázi pryskyřic v polyesterových vláknech, jako jsou membrány Accuwick. Membrána (5) má délku dostatečnou pro požadované množství detekčního reagentů.

Testovací zařízení podle předloženého vynálezu jsou vyráběna způsoby známými odborníkům. Je možné například připravit desky pomocí komerčně dostupných laminačních zařízení. Použité záchytné látky se nanášejí na membránu (3) ve formě roztoků, před nebo po sestavení karet.

Nanášení těchto roztoků může být prováděno velice přesnými způsoby s použitím komerčně dostupných zařízení, jako je například Dispenser X-Y Platform Biojet Quanti-3000 společnosti

Bio Dot, lne. Tyto nanesené roztoky se okamžitě odpaří, například umístěním karty do proudu teplého vzduchu. Pro výrobu ve velkém měřítku je možno také připravovat role. Nakonec se karty a role nesoucí požadované záchytné látky nastříhaj i na pásky a každý z těchto pásků představuje testovací zařízení podle předloženého vynálezu.

Pokud testovací zařízení zahrnuje membránu (5), detekční reagent nebo reagenty mohou být naneseny před sestavením karet nebo rolí prostým ponořením membrány (5) do roztoku obsah υιό jícího detekční reagent nebo reagenty. Alternativně mohou být naneseny po sestavení karet nebo rolí způsoby analogickými způsobům použitým pro nanášení záchytných látek na membránu (3).

V alternativním provedení předloženého vynálezu, se zařízení umístí do plastového obalu, který má dva otvory: první s okraji ve tvaru misky, se nachází přímo nad membránou (2) a dovoluje příjem kapaliny, určené k analýze; druhý je okénko, které umožňuje vizualizaci výsledků na membráně (3). V tomto případě testovací zařízení neobsahuje adhezivní plastovou fólii (6).

Testovací zařízení podle předloženého vynálezu dovoluje detekovat přítomnost hledaných látek v tekutém mléčném produktu, obzvláště v mléku.

Z uvedených důvodů se předložený vynález také týká způsobu detekce látek v tekutém mléčném produktu, používajícího testovací zařízení podle předloženého vynálezu a detekční reagenty, který sestává z následujících kroků:

a) uvedení určeného objemu mléčného produktu do kontaktu s testovacím zařízením podle předloženého vynálezu, přičemž k tomuto kontaktu dochází na prvním konci testovacího zařízení,

b) tečná migrace mléčného produktu na testovacím zařízení na základě kapilarity taková, že hledané látky a detekční reagenty, kteréjsou popřípadě přítomné v mléčném produktu procházejí postupně membránou (2), potom membránou (3) tak, že složky mléčného produktu, so které nejsou zastaveny membránami (2) a (3) skončí v membráně (4), a

c) určení fixace na membráně (3).

Způsob podle předloženého vynálezu dovoluje detekovat hledané látky v tekutém mléčném produktu, například mléce, syrovátce, podmáslí apod. Předložený vynález se týká obzvláště detekce látek jako jsou veterinární léčiva, hormony nebo proteiny, o kterých se předpokládá, že jsou přítomny v mléku.

Detekční reagenty použité ve způsobu podle předloženého vynálezu mohou být použity v různém počtu a mít odlišnou povahu v závislosti na způsobu provedení předloženého vynálezu, který vychází z použité detekční metody. Způsob podle předloženého vynálezu používá alespoň dva detekční reagenty. První detekční reagent je rozpoznávací činidlo, které specificky rozpoznává hledanou látku a bude nadále nazýván „identifikační činidlo“. Druhý detekční reagent je činidlo, používané pro označení a bude nadále nazýván „označovací činidlo“. Je třeba podotknout, že v závislosti na zvoleném způsobu provedení mohou být jisté detekční reagenty presentovány na membráně (3) nebo na membráně (S). V závislosti na povaze látky, kteráje určována, a na použitých detekčních reagentech se může stát, že je nutno přidat jeden nebo více dalších detekčních reagentů před krokem uvedení mléčného produktu do kontaktu s testovacím zařízením podle předloženého vynálezu a udržovat směs v podmínkách inkubace, které dovolují vytvoření komplexu detekčních reagentů a hledané látky nebo látky analogické hledané látce. V závislosti na so použitém způsobu mohou být identifikační činidlo a označovací činidlo spojeny nebo mohou představovat tutéž látku.

Na druhé straně může být použito více identifikačních činidel a/nebo označovacích činidel.

Identifikační činidlo dovoluje detekci přítomnosti typu hledané látky díky svojí schopnosti rozpoznávat specificky tuto hledanou látku nebo látku analogickou této hledané látce. Může se jednat o receptor schopný vytvářet selektivně stabilní a v zásadě ireverzibilní komplex s hledanou látkou nebo o monoklonální nebo polyklonální protilátky specifické k hledané látce nebo látce analogické hledané látce. Pro detekci antibiotik může být identifikační činidlo zvoleno ze souboru, zahrnujícího specifické monoklonální nebo polyklonální protilátky nebo receptory získané z mikroorganismů citlivých na antibiotika, jako jsou receptory získané z druhů Bacillus (Bacillus stearothermophílus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, ...) Streptococcus (Streptococcus thermophilus,...), Actinomycetes (Actinomadura R39,...).

Ve výhodném provedení předloženého vynálezu se používá identifikační činidlo, které zahrnuje receptor citlivý na antibiotika s β-laktamovým kruhem získaný z Bacillus licheniformis, jako je například receptor BlaR nebo receptor BlaR-<TD. Izolace a peptidová sekvenace proteinu BlaR jsou popsány v Y. ZHU a kol., J. Bacteriol., 1137-1141 (1990); receptor BlaR-CTD je karboxy15 terminální oblast BlaR, jehož izolace a peptidová sekvence jsou popsány v B. JORIS a kol., FEMS Microbiology Letters, 107-114 (1990).

Použití receptorů BlaR nebo BlaR-CTD podle předloženého vynálezu pro detekci antibiotik s βlaktamovým kruhem přináší významné výhody ve srovnání s rozpoznávacími činidly používa20 nými do současné doby. Receptory BlaR a BlaR-CTD jsou totiž schopny komplexovat velmi rychle s velkým množstvím antibiotik a to při teplotách inkubace nižších než jsou teploty nutné pro známá rozpoznávací činidla, jako jsou například receptory získané z Bacillus stearothermophilus.

Druhý typ použitého detekčního reagentu je označovací činidlo, které dovoluje vizualizaci a přímou nebo nepřímou kvantifikaci přítomnosti hledané látky v mléčném produktu. Označovací činidla, použitelná ve způsobu podle předloženého vynálezu mohou být částicová, fluorescenční, radioaktivní, luminescenční nebo enzymatická. Konkrétní označovací činidlo se výhodně zvolí tak, aby poskytovalo snadno detekovatelný vizuální signál, dokonce i pokud je přítomno v malém množství. Jako neomezující příklady je možno uvést kovové koloidní částice (platina, zlato, stříbro a podobně), koloidní částice selenu, uhlíku, síry, teluru nebo dále obarvené syntetické latexové koloidní částice. Obzvláště výhodné jsou koloidní částice zlata o průměru částic v rozmezí od 1 do 60 nm; tyto částice poskytují silné růžovo-červené zabarvení, které je snadno detekovatelné.

Označovací činidlo dovoluje určit přítomnost hledané látky ve vzorku mléčného produktu díky své vazbě najeden nebo více detekčních reagentu, hledaných látek nebo látek analogických hledané látce.

Vazba mezi označovacím činidlem a detekčním reagentem může být dosažena způsoby známými odborníkům v oboru. Pokud se používá částicové označovací činidlo, k označování může docházet buď přímou adsorpcí na částicích, nebo nepřímo na základě chemického zakotvení, jako je například komplex biotin/anti-biotik. K této vazbě může dojít buď v etapě uvedené mléčného produktu do kontaktu s testovacím zařízením podle předloženého vynálezu nebo během migrace mléčného produktu na testovacím zařízení podle předloženého vynálezu.

V konkrétním provedení předloženého vynálezu se používá třetí typ detekčního reagentu, dále označovaný jako „referenční činidlo“. Jedná se o látku, přidanou ve známém množství do analyzovaného vzorku, která se fixuje na specifickou záchytnou látku imobilizovanou na membráně (3). Referenční činidlo vytváří pruh, jehož intenzita slouží jako reference pro kvantifikaci hledané látky.

Ke kontaktu mléčného produktu s testovacím zařízením podle předloženého vynálezu (etapa a) způsobu podle předloženého vynálezu) dochází umístěním testovacího zařízení podle předloženého vynálezu do recipientu, najehož dně se nachází analyzovaný vzorek. Testovací zařízení se vloží v zásadě vertikálně do nádoby, tak aby první okraj zařízení byl v kontaktu se směsí.

rt

V provedení vynálezu, vc kterém se používá testovací zařízení uložené v plastovém obalu, se testovací zařízení vloží horizontálně a uvedení do kontaktu se provádí nanesením alikvotu analyzovaného vzorku do otvoru s okraji ve tvar misky, který se nachází nad membránou (2).

Pro provedení kroku migrace b) se kapalina ponechá migrovat prostřednictvím kapilarity na testovacím zařízení podle předloženého vynálezu. Kapalina, která migruje prostřednictvím kapilarity na testovacím zařízení podle předloženého vynálezu se setká nejprve s membránou (2), která umožňuje zadržet látky, které se nachází v mléčném produktu a které zabraňují migraci hledané látky nebo látek, které jsou popřípadě přítomny v mléčném produktu a detekčních reagentů na io testovacím zařízení. Hledané látky a detekční reagenty migrují potom na membráně (3), na které je i mobilizována jedna nebo více záchytných látek. Záchytné látky selektivně imobilizují alespoň jednu složku, která se nachází v analyzované kapalině. V konkrétním provedení předloženého vynálezu se používá záchytná látka umístěná na konec dráhy migrace kapaliny na membráně (3), která je schopná fixovat všechna označovací činidla, která nebyla zastavena předcházejícími záchytnými látkami. Tato záchytná látka dovoluje kompletovat kvantitativní informace, pocházející od předcházejících záchytných látek.

Určení fixace na membráně (3) (etapa c) způsobu podle předloženého vynálezu) se provádí jednoduše určením přítomnosti označovacích činidel v této oblasti. Toto určení je možné snadno vizuálním způsobem. Nicméně pokud je požadováno získání přesných hodnot intenzity pozorovaných signálů, je možno použít zařízení, které umožňuje přesné stanovení intenzity pozorovaných signálů. Pokud se používá referenčního činidla, je toto fixováno specifickou záchytnou látkou, která dává vnitrní referenci pro měření intenzity pozorovaných signálů.

Interpretace získaného výsledku závisí na použitém způsobu detekce, to jest na použitých detekčních reagentech a záchytných látkách.

Ve srovnání se způsoby detekce látek v mléku, které byly dříve popsány v literatuře má způsob podle předloženého vynálezu následující výhody. Především je tento způsob velmi rychlý a extrémně jednoduchý pro provádění: v zásadě sestává ze dvou etap jednoduché manipulace, které nevyžadují žádných zvláštních experimentálních dovedností. Poté následující kvalitativní a kvantitativní zhodnocení výsledku je okamžité a nevyžaduje dodatečné zvláštní operace, jako jsou operace, které jsou nutné pokud se detekce provádí enzymatickými barvivý a/nebo označovacími činidly. Mimoto je způsob přímo použitelný pro detekci různých typů hledaných látek.

Nakonec, v provedení, které používá referenční činidlo, je výsledek přímo interpretovatelný a kvantifikovatelný, aniž by bylo třeba používat jeden nebo více referenčních testů.

Předložený vynález se týká také testovací soupravy pro detekci látek v mléčných produktech, která zahrnuje testovací zařízení podle předloženého vynálezu. V případě potřeby testovací sou40 prava podle předloženého vynálezu může také obsahovat detekční reagenty, které se přidávají do vzorku před jeho uvedením mléčného produktu do kontaktu s testovacím zařízením.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázky 1 až 3 ilustrují příklady testovacích zařízení podle předloženého vynálezu, přičemž obrázky la, 2 a 3 představují pohled zpředu a obrázek lb představuje pohled v podélném řezu.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady ilustrují různé předměty a způsoby provedení předloženého vynálezu, aniž by jeho rozsah jakýmkoli způsobem omezovaly.

Příklad 1. Výroba testovacího zařízení. Obecné způsoby provedení.

1.1. Sestavení membránových karet.

Karty o velikosti 300 x 76,2 mm se napřed sestaví použitím laminačního zařízení typu Chlamshell Lamínator (dodávané společností Bio Dot, lne.) postupujíce následujícím způsobem:

Vyřízne se obdélník z plastového nosiče typu ArCare 8565 (dodávaného společností Adhesive Research) o rozměrech 300 x 76,2 mm (pevný nosič (1)). Potom se vyřízne obdélník membrány ío Leukosorb LK4 (dodávané společností Pall Gelman Sciences) o rozměrech 300 x 20 mm (membrána (2)), obdélník membrány Hi-Flow SX (dodávané společností Millipore) o rozměrech 300 x mm (membrána (3)), obdélník membrány z celulózy 3 mm (dodávané společností Whatmann) o rozměrech 300 x 40 mm (membrána (4)) a obdélník membrány Accuwick (dodávané společností Pall Gelman Sciences) o rozměrech 300 x 0,8 mm (membrána (5)).

Membrány (2) a (4), potom (5) a potom (3) se postupně uloží na specifické místo spodní formy laminačního zařízení. Pevný nosič (1) pokrytý lepidlem je sám o sobě uchováván vpříklopu tohoto zařízení. Lepivá strana nosiče je vystavena na vzduchu. Membrány uložené v spodní formě se uvedou do kontaktu s lepivým nosičem uzavřením laminačního zařízení; membrány se udržují přesně na svých místech pomocí podtlaku vytvářeného vývěvou. Po přerušení vytváření podtlaku se vyjme karta, tvořená pevným nosičem (1), na kterém jsou připevněny membrány (2), (3), (4) a (5).

1.2. Nanesení záchytných látek na membránu (3).

Nanesení záchytných látek na membránu (3) se provádí před nebo po provedení sestavení karty podle příkladu 1.1.

Připraví se vodný roztok, obsahující záchytnou látku. Roztok se nanese na membránu (3) mem30 bránové karty, připravené v příkladu 1.1. prostřednictvím nanášecího zařízení typu X-Y Platform Biojet Quanti-3000 společnosti Bio Dot, lne.

Nanesené roztoky se okamžitě odpaří umístěním souboru karty na několik minut do proudu vzduchu o teplotě 60 °C.

1.3. Nanesení označovací látky na membránu (5).

a) Před sestavením podle příkladu 1.1.

Připraví se vodný roztok obsahující označovací látku. Membrána (5) se vnoří do tohoto roztoku.

Potom se membrána odkape, a potom suší při teplotě okolí za podtlaku 0,5 baru.

b) Po sestavení podle příkladu 1.1.

Postupuje se způsobem, který byl popsán v příkladu 1.2. pro nanášení záchytných látek.

1.4. Připevnění adhezivní plastové fólie (6).

Vystřihne se obdélník adhezivní fólie typu ArCare 7759 (dodávané společností Adhesive Research) o rozměrech 300 x 20 m pro částečné zakrytí nebo a 300 x 71,2 mm pro zakrytí všech membrán.

Karta získaná v příkladu 1.1 se umístí do spodní formy laminačního zařízení a adhezivní fólie se umístí do příklopu laminačního zařízení, přičemž lepivá strana je vystavena do vzduchu. Adhezivní plastová fólie se uvede do kontaktu s membránovou kartou po uzavření zařízení.

n

I. 5. Vystřižení pásků.

Karty získané výše popsaným sestavením se nastříhají na pásky pomocí zařízení typu guilotiny nebo pomocí rotačního zařízení (dodávané společností Bio Doot, Kinematic nebo Akzo). Pásky vzniklé z konců karet jsou vyhozeny, ostatní pásky jsou připraveny k použití.

Pro uchovávání se testovací zařízení podle předloženého vynálezu umístí do neprůhledné a hermeticky uzavřené nádoby v přítomnosti vysušovacího činidla (Silgelac, Francie).

ίο 1.6. Uložení do plastového obalu.

Testovací zařízení se umístí do plastového obalu, který má dva otvory: první, s okraji ve tvaru misky, se nachází přímo nad membránou (2) a dovoluje přijímat kapalinu určenou k analýze; druhým je okénko, které dovoluje vizuální odečítání výsledků na membráně (3).

Příklad 2. Detekce antibiotik s β-laktamovým kruhem v mléku pomocí enzymu R39.

2.1. Identifikační činidlo.

Identifikační Činidlo použité v tomto příkladu je rozpustná exobuněčná D-alanyl-D-alanin-karboxypeptidáza produkovaná organismem Actinomadura R39, získaná způsobem, který popsali

J. -M. FRERE a kol., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18(4), 506-510 (1980).

2.2. Vazba identifikačního činidla na označovací činidlo.

2.2.1. Biotinylace identifikačního činidla.

250 μί vodného roztoku enzymu R39 o koncentraci 1 mg/ml se dialyzuje po 24 hodin proti

5 00 ml pufru HNM (Hepes 10 mM, pH 8, NaCl 10 mM, MgCl₂ 5 mM), Do tohoto roztoku dialyzovaného enzymu R39 se potom přidají 2 ml hydrogenuhličitanového pufru (0,1 M hydrogenuhličitanu sodného, pH 9) a 250 μί roztoku N-hydroxy-sukcinimidového esteru kyseliny 6-(biotinamido)kapronové 5 mg/ml v bezvodém DMF. Tento roztok se jemně míchá ve válcovém míchači s rotační osou typu LABINCO (dodávaný společností VEL, Belgie) rychlostí 2 otáčky za minutu po dobu 3 hodin při teplotě okolí a chráněný před světlem. Takto získaný roztok se potom dialyzuje proti pufru HNM (Hepes 100 mM; pH 8, NaCl 100 mM, MgCl₂ 50 mM) po dobu 24 hodin. Tímto způsobem se získá roztok biotinylovaného enzymu R39, který se zředí v pufru HNM-BSA (Hepes 500 mM; pH 8, NaCl 500 mM, MgCl₂ 250 mM, BSA 10 mg/ml) až do dosažení koncentrace 100 pg enzymu R39 na ml pufru. Tento roztok se uchovává při teplotě -20 °C.

2.2.2. Označovací činidlo.

Jako označovací činidlo se používají částice zlata, které mají průměr 40 nm, na které byly naneseny kozí protilátky proti biotinu ve formě suspenze ve vodném roztoku tetraboritanu sodného

2 mM při pH 7,2, stabilizované nitridem sodným 0,1% (dodáváno společností BRITISH

BIOCELL (Ref. GAB40). Optická hustota této suspenze při 520 nm je zhruba 10 a koncentrace proteinu je zhruba 24 pg/ml.

2.2.3. Vazba biotinylovaného identifikačního činidla k označovacímu činidlu.

Roztok A pro rychlý test

Roztok biotinylovaného enzymu R39, připraveného v příkladu 2.2.1. se zředí 25 násobně pufrem

HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCl 500 mM, MgCl₂ 250 mM, BSA 10 mg/ml). Při teplotě okolí se smíchá 17,5 objemových částí tohoto zředěného roztoku biotinylovaného enzymu R39,

9,27 objemových částí suspenze částic zlata, sloužících jako označovač enzymu R39 a objemových částí suspenze referenčních částic zlata (viz příklad 2.3).

Roztok B pro citlivý test

Roztok biotinylovaného enzymu R39, připraveného v příkladu 2.2.1. se zředí 50 násobně pufrem HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCl 500 mM, MgCl₂ 250 mM, BSA 10 mg/ml). Při teplotě okolí se smíchá 17,5 objemových částí tohoto zředěného roztoku biotinylovaného enzymu R39, 9,27 objemových částí suspenze částic zlata, sloužících jako označovač enzymu R39 a io 6 objemových částí suspenze referenčních Částic zlata (viz příklad 2.3).

2.3. Referenční činidlo

Jako referenční činidlo se použijí částice zlata o průměru 40 nm na které byly naneseny kozí 15 protilátky proti králičímu imunogiobulinu. Tyto částice jsou dodávány společností BRITISH

BIOCELL (Ref. GAR40) ve formě suspenzí ve vodném roztoku tetraboritanu sodného 2 mM při pH 7,2, stabilizované nitridem sodným 0,1%. Optická hustota této suspenze při 520 nm je zhruba 3 a koncentrace proteinu je zhruba 6 pg/ml.

2.4. Záchytné látky.

2.4.1. První záchytná látka.

ml roztoku obsahujícího 213 mg lidského gamaglobulinu (G4386, Sigma) a 8,6 mg hydro25 chloridu 2-iminothiolanu (Aldrich, 33056-6) v pufru uhličitanu sodného (100 mM, pH9) se inkubují po jednu hodinu při teplotě 25 °C.

Odděleně se inkubuje po jednu hodinu při teplotě 25 °C 20 ml roztoku obsahujícího 119,8 mg cefalosporinu-C a 54 mg sulfosukcinimidyl 4-{N-maIeimÍdomethyl)cykiohexan-l-karboxylátu (sSMCC, 22322 Pierce) v pufru uhličitanu sodného (100 mM, pH 9).

Dva roztoky, které byly připraveny dříve se potom smíchají. pH vzniklého roztoku se upraví na 7,1 přidáním 3 ml NaH₂PO₄ 500 mM a inkubuje se po dvě hodiny při teplotě 25 °C. Směs získaná po inkubaci se dialyzuje třikrát proti 1 litru pufru fosforečnanu sodného (10 mM, pH 7,5).

Vzniklý roztok se filtruje na filtru 0,22 pm, potom se alikvotuje a zmrazí při teplotě -20 °C až do použití.

Při použití se alikvoty rozmrazí a přidá se potravinářské barvivo před uskutečněním nanesení na membrána aby byla v každém okamžiku zaručena přesná poloha nanesení a kvalita stopy.

První záchytná látka dovoluje fixaci identifikačních Činidel vázaných na volná označovací činidla přítomná v přebytku vzhledem k množství antibiotik přítomných ve vzorku.

2.4.2. Druhá záchytná látka.

Jako druhá záchytná látka se používá roztok králičího imunogiobulinu (Sigma I 5006) v koncentraci 0,5 mg/ml imunogiobulinu v pufru fosforečnanu sodného 10 mM, pH 7,5, lidský gammaglobulin 5 mg/ml. Tato druhá záchytná látka zachytává referenční činidlo během migrace kapaliny na testovacím zařízení.

2.5. Testovací zařízení.

Používá se testovací zařízení, obsahující membrány (2), (3) a (4), sestavené způsobem, který byl popsán v příkladu 1.1. Membrána (3) tohoto zařízení nese na blízkém konci záchytnou látku popsanou v příkladu 2.4.1. a na vzdáleném konci záchytnou látku popsanou v příkladu 2.4.2.

Záchytné látky jsou naneseny způsobem, který byl popsán v příkladu 1.2.

2.5.1. Test 1 - Rychlý test

Připraví se sedm vzorků mléka, které obsahují postupně 0; 2; 4; 5; 6; 8 a 10-10“⁹ penicilinu G. Každý z těchto roztoků je potom analyzován následujícím způsobem.

Odebere se alikvot 200 μΐ vzorku mléka a 32,8 μΐ roztoku A připraveného v příkladu 2.2.3, které io se umístí do Eppendorfovy trubice. Tato směs se inkubuje po 3 minuty při teplotě 47 °C. Potom se testovací zařízení umístí vertikálně do Eppendorfovy trubice tak, aby byl první konec testovacího zařízení v kontaktu se směsí. Směs se ponechá migrovat testovacím zařízením a soubor se nechá inkubovat po 2 minuty při teplotě 47 °C.

Níže uvedená Tabulka 1 udává výsledky získané pro 7 vzorků, které byly testovány. Detekovaným pruhům byla přiřazena intenzita v rozmezí od 0 do 10, přičemž hodnota 10 znamená nejintenzivnější pruh a hodnota 0 znamená nejméně intenzivní pruh. V této stupnici byla hodnota 6 přiřazena referenčnímu pruhu. Intenzita signálu pozorovaného v prvním detekčním pruhu je nepřímo úměrná množství penicilinu G, který je přítomen ve vzorku.

Tabulka 1

Penicilín G	Intenzita
(x IO’⁹)	1. pruh	2. pruh
0	10	6
2	8	6
4	5	6
5	3	6
6	2	6
8	1	6
10	0	6

V tomto příkladu pokud byl první pruh méně intenzivní než referenční pruh, byl test považován za pozitivní. Výsledky uvedené v Tabulce 1 ukazují, že test dovoluje detekovat do 5 minut až do koncentrace 4-10 ⁹ penicilinu G ve vzorku mléka.

2.5.2. Test 2 - Citlivý test.

Bylo připraveno šest vzorků mléka obsahujících postupně koncentrace 0; 2; 2,5; 3; 4 a 510“⁹penicilinu G. Každý z těchto roztoků byl potom analyzován následujícím způsobem:

Odebere se alikvot 200 μΐ vzorku mléka a 32,8 μΙ roztoku B připraveného v příkladu 2.2.3, které se umístí do Eppendorfovy trubice. Tato směs se inkubuje po 5 minut při teplotě 47 °C. Potom se testovací zařízení umístí vertikálně do Eppendorfovy trubice tak, aby první konec testovací zařízení byl v kontaktu se směsí. Směs se ponechá migrovat na testovacím zařízení za inkubace souboru po 2 minuty při teplotě 47 °C.

Tabulka 2 uvedená níže udává výsledky získané pro 7 vzorků, které byly testovány. Detekova50 ným pruhům byla přiřazena intenzita v rozmezí od 0 do 10, přičemž hodnota 10 znamená nej intenzivnější pruh a hodnota 0 znamená nejméně intenzivní pruh. V této stupnici byla hodnota 6 přiřazena referenčnímu pruhu. Intenzita signálu pozorovaného v prvním detekčním pruhu je nepřímo úměrná množství penicilinu G, který je přítomen ve vzorku.

Tabulka 2

Penicilín G	Intenzita
(x io^-9)	1. pruh 2
0	10
2	7
2,5	5
3	4
4	1
5	0

V tomto příkladu pokud byl první pruh méně intenzivní než referenční pruh, byl test považován za pozitivní. Výsledky uvedené v Tabulce 2 ukazují, že test dovoluje detekovat do 7 minut až do koncentrace 2,5T0”⁹ penicilinu G ve vzorku mléka.

Příklad 3. Určení antibiotik s β-laktamovým jádrem v mléku pomocí BlaR.

Tento příklad ilustruje detekci antibiotik s β-laktamovým jádrem, které jsou kontrolovány hygie20 nickými úřady, v mléku. Test popsaný v tomto příkladu používá receptor BlaR-CTD vázaný na kuličky zlata, které slouží jako označovací činidlo a používá nosič, vytvořený ve formě testovacího zařízení zahrnujícího pevný nosič, na kterém jsou připevněny membrány.

3.1. Vazba BlaR-CTD (identifikační činidlo) na kuličky zlata (označovací činidlo).

3.1.1. Biotinylace BlaR-CTD.

3,79 ml vodného roztoku rozpoznávacího činidla BlaR-CTD o koncentraci 6,6 mg/ml se vyjme pufrem fosforečnanu sodného 20 mM pH 1. Do tohoto roztoku BlaR-CTD se potom přidá

41,71 ml hydrogenuhličitanového pufru (0,1 M hydrogenuhličitanu sodného, pH 9) a 2 ml roztoku N-hydroxy-sukcinimidového esteru kyseliny 6-(biotinamido)kapronové 2,23 mg/ml také v hydrogenuhličitanovém pufru. Tento roztok se jemně míchá ve válcovém míchači s rotační osou typu LABINCO (dodávaný společnosti VEL, Belgie) iychlostí 2 otáčky za minutu po dobu 2 hodin při teplotě okolí a chráněný před světlem. 2,5 ml roztoku pufru Tris 1 M pH 8 se inku35 buje s reakční směsí za stejných podmínek po 30 minut. Takto získaný roztok se potom dialyzuje proti pufru HNM (Hepes 100 mM; pH 8, NaCI 100 mM, MgCl₂ 50 mM) po dobu 24 hodin. Tímto způsobem se získá roztok biotinylovaného BlaR-CTD, který se zředí v pufru HNM-BSA (Hepes 500 mM; pH 8, NaCI 500 mM, MgCl₂ 250 mM, BSA 10 mg/ml) až do dosažení koncentrace 250 pg BlaR-CTD na ml pufru. Tento roztok se uchovává při teplotě

-20 °C,

3.1.2. Označovací činidlo.

Jako označovací činidlo se používají částice zlata, které mají průměr 40 nm, na které byly nane45 seny kozí protilátky proti biotinu ve formě suspenze ve vodném roztoku tetraborítanu sodného 2mM při pH 7,2, stabilizované nitridem sodným 0,1% (dodáváno společností BRITISH BIOCELL (Ref. GAB40). Optická hustota této suspenze při 520 nm je zhruba 10 a koncentrace proteinu je zhruba 24 pg/ml.

so 3.1.3. Vazba biotinylovaného BlaR-CTD na kuličky zlata.

Roztok biotinylovaného BlaR-CTD, připraveného v příkladu 3.1.1. se zředí 114,7 násobně pufrem HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCI 500 mM, MgCl₂250mM, BSA 10 mg/ml). Při teplotě okolí se smíchá 22,5 objemových částí tohoto zředěného roztoku biotinylovaného BlaR55 CTD, 7,5 objemových částí pufru HNM-BSA, 9,27 objemových částí suspenze částic zlata, slou

Cl 301093 B6 žících jako označovač biotinylovaného BlaR-CTD a 6 objemových částí suspenze referenčních částic zlata (viz příklad 3.1.4 uvedený dále).

3.1.4. Nezávislé referenční činidlo

Jako referenční činidlo se použije také referenční látka, která vytváří pruh, jehož intenzita dovoluje rychlé stanovení množství antibiotik, přítomných ve vzorku. Pro tento účel se použijí částice zlata o průměru 40 nm na které byly naneseny kozí protilátky proti králičímu imunoglobulinu. Tyto částice jsou dodávány společností BRITISH BIOCELL (Ref. GAR40) ve formě suspenzí ve io vodném roztoku tetraboritanu sodného 2 mM při pH 7,2, stabilizované nitridem sodným 0,1%.

Optická hustota této suspenze při 520 nm je zhruba 3 a koncentrace proteinu je zhruba 6 μg/ml.

3.2. Záchytné látky

3.2.1. První záchytná látka - referenční antibiotikum.

ml roztoku obsahujícího 213 mg lidského gamaglobulinu (G4386, Sigma) a 8,6 mg hydrochloridu 2-iminothiolanu (Aldrich, 33056-6) v pufru uhličitanu sodného (100 mM, pH 9) se inkubují po jednu hodinu při teplotě 25 °C.

Odděleně se inkubuje po jednu hodinu při teplotě 25 °C 20 ml roztoku obsahujícího 119,8 mg cefalosporinu-C a 54 mg sulfosukcinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyklohexan-l-karboxylátu (sSMCC, 22322 Pierce) v pufru uhličitanu sodného (100 mM, pH 9).

Dva roztoky, které byly připraveny dříve se potom smíchají. pH vzniklého roztoku se upraví na

7,1 přidáním 3 ml NaH₂PO4 500 mM a inkubuje se po dvě hodiny při teplotě 25 °C. Směs získaná po inkubaci se dialyzuje třikrát proti 1 litru pufru fosforečnanu sodného (10 mM, pH 7,5). Vzniklý roztok se filtruje na filtru 0,22 pm, potom se alikvotuje a zmrazí při teplotě -20 °C až do použití.

První záchytná látka dovoluje fixaci BlaR-CTD vázaného na kuličky zlata, přítomné v přebytku 35 vzhledem k množství antibiotik přítomných ve vzorku.

3.2.2. Druhá záchytná látka - látka schopná fixovat nezávislé referenční činidlo.

Jako druhá záchytná látka se používá roztok králičího imunoglobulinu (Sigma I 5006) 40 v koncentraci 0,5 mg/ml imunoglobulinu v pufru fosforečnanu sodného 10 mM, pH 7,5, lidský gammaglobulin 5 mg/ml. Tato druhá záchytná látka zachytává referenční činidlo během migrace kapaliny na testovacím zařízení,

3.3 Testovací zařízení.

Používá se testovací zařízení, obsahující membrány (2), (3) a (4), sestavené způsobem, který byl popsán v příkladu 1.1. Membrána (3) tohoto zařízení nese na blízkém konci záchytnou látku popsanou v příkladu 3.2. a na vzdáleném konci záchytnou látku popsanou v příkladu 3.2.2. Záchytné látky jsou naneseny způsobem, který byl popsán v příkladu 1.2.

3.4. Určení antibiotik v mléku.

3.4,1. Test ve 3 minutách - Rychlý test

Připraví se sedm vzorků mléka, které obsahují postupně koncentrace 0; 1; 2; 3; 4; 5 a 610⁹ penicilinu G. Každý z těchto roztoků je potom analyzován následujícím způsobem:

Odebere se alikvot 200 μΐ vzorku mléka a 45,27 μΐ roztoku připraveného v příkladu 3.1.3, které se umístí do skleněné baňky. Testovací zařízení se umístí vertikálně do baňky tak, aby byl první konec testovacího zařízení v kontaktu se směsí a aby druhý konec spočíval na stěně skleněné baňky. Směs se ponechá migrovat testovacím zařízením a soubor se nechá inkubovat po 2 minuty při teplotě 47 °C.

ío Níže uvedená Tabulka 1 udává výsledky získané pro 7 vzorků, které byly testovány. Detekovaným pruhům byla přiřazena intenzita v rozmezí od 0 do 10, přičemž hodnota 10 znamená nejintenzivnější pruh a hodnota 0 znamená nejméně intenzivní pruh. V této stupnici byla hodnota 6 přiřazena referenčnímu pruhu. Intenzita signálu pozorovaného v prvním detekčním pruhu je nepřímo úměrná množství penicilinu G, který je přítomen ve vzorku.

Tabulka 1

Penicilín G	Intenzita
(x 10⁹)	1. pruh	2. pruh
0	10	6
l	9	6
2	9	6
3	4	6
4	0	6
5	0	6

V tomto příkladu pokud byl první pruh méně intenzivní než referenční pruh, byl test považován za pozitivní. Výsledky uvedené v Tabulce 1 ukazují, že test dovoluje detekovat za 5 minut méně než 410⁹ penicilinu G ve vzorku mléka.

Testy byly také prováděny s dalšími antibiotiky s β-laktamovým jádrem za stejných podmínek. Tento test, trvající 3 minuty dovoluje detekovat amoxicilin až do koncentrace 510 ⁹, ampicilin až do 5Ί0⁹, cloxacilin méně než 1010“⁹, dicloxacilin méně než 20T0⁹, oxacilin méně než 2010“⁹ a cefapirin až do 20* 10^-9 ve vzorku mléka.

1.3.2. Test v 5 minutách

Bylo připraveno šest vzorků mléka obsahujících postupně koncentrace 0; 2; 4; 6; 8 a 10Ί0~⁹ cloxacilinu. Každý z těchto roztoků byl potom analyzován následujícím způsobem:

Odebere se alikvot 200 μΐ vzorku mléka a 45,27 μΐ roztoku připraveného v příkladu 3.1.3, které se umístí do skleněné baňky. Směs se inkubuje po 3 minuty při teplotě 47 °C. Testovací zařízení se umístí vertikálně do skleněné baňky tak, aby byl první konec testovacího zařízení v kontaktu se směsí a aby druhý konec spočíval na stěně skleněné baňky. Směs se ponechá migrovat testovacím zařízením a soubor se nechá inkubovat po 2 minuty při teplotě 47 °C.

Níže uvedená Tabulka 2 udává výsledky získané pro 6 vzorků, které byly testovány. Detekovaným pruhům byla přiřazena intenzita v rozmezí od 0 do 10, přičemž hodnota 10 znamená nejin50 tenzivnější pruh a hodnota 0 znamená nejméně intenzivní pruh. V této stupnici byla hodnota 6 přirazena referenčnímu pruhu. Intenzita signálu pozorovaného v prvním detekčním pruhu je nepřímo úměrná množství cloxacilinu, který je přítomen ve vzorku.

Tabulka 2

Penicilín G	Intenzita
(x ÍO“⁹)	1. pruh	2. pruh
0	10	6
2	6	6
4	5	6
6	3	6
8	3	6
10	3	6

V tomto příkladu pokud byl první pruh méně intenzivní než druhý pruh, byl test považován za pozitivní. Výsledky uvedené v Tabulce 2 ukazují, že test dovoluje detekovat za 5 minut méně než

4 10 ⁹ cloxacilinu ve vzorku mléka.

Testy byly také prováděny s dalšími antibiotiky s β-laktamovým jádrem za stejných podmínek. Tento test, trvající 5 minut dovoluje detekovat penicilín G až do koncentrace 3-10'⁹, amoxiciiin až do 4Ί0'⁹, ampicilin až do 410 ⁹, dicloxacilin až do 810⁹, oxacilin až do 8-10“⁹, cefapirin až do 16-10'⁹, ceftiofur až do 100-10^-9, cefchinon méně než 20‘ 10'⁹, nafcilin až do 20· 10^-9 a cefazolin až do 60-10“⁹ ve vzorku mléka.

Tento test je obzvláště vhodný jako test před vypouštěním kamionů mléka do nádrží.

1,3,3. Test v 9 minutách

Bylo připraveno 6 vzorků čerstvého mléka obsahujících postupně koncentrace 0; 4; 6; 8; 10 a 12-10⁹ cefapirinu. Každý z těchto roztoků byl potom analyzován následujícím způsobem.

Odebere se alikvot 200 μΐ vzorku mléka a 45,27 μΐ roztoku připraveného v příkladu 3,1.3, které se umístí do skleněné baňky. Směs se inkubuje po 7 minut při teplotě 47 °C, Testovací zařízení se umístí vertikálně do skleněné baňky tak, aby byl první konec testovacího zařízení v kontaktu se směsí a aby druhý konec spočíval na stěně skleněné baňky. Směs se ponechá migrovat testovacím zařízením a soubor se nechá inkubovat po 2 minuty při teplotě 47 °C.

Níže uvedená Tabulka 3 udává výsledky získané pro 6 vzorků, které byly testovány. Detekovaným pruhům byla přirazena intenzita v rozmezí od 0 do 10, přičemž hodnota 10 znamená nej intenzivnější pruh a hodnota 0 znamená nejméně intenzivní pruh. V této stupnici byla hodnota 6 přiřazena referenčnímu pruhu. Intenzita signálu pozorovaného v prvním detekčním pruhu je nepřímo úměrná množství cefapirinu, kterýje přítomen ve vzorku.

Tabulka 3

Penicilín G	Intenzita
(x ÍO ⁹)	1. pruh	2. pruh
0	10	6
4	6	6
6	5	6
8	4	6
10	3	6
12	3	6

V tomto příkladu pokud byl první pruh méně intenzivní než druhý pruh, byl test považován za pozitivní. Výsledky uvedené v Tabulce 3 ukazují, že test dovoluje detekovat za 9 minut až do

6-10’⁹ cefapirinu ve vzorku mléka.

Testy byly také prováděny s dalšími antibiotiky s β-laktamovým jádrem za stejných podmínek. Tento test, trvající 9 minut dovoluje detekovat penicilín G až do koncentrace 310^-9, amoxicilin až do 4*10⁹, ampicilin až do 4Ί0 , cloxacilin až do 4-10⁹, dicloxacilin méně než 8·1(Γ⁹, oxacilin méně než 810”⁹, ceftiofur až do 80-10”⁹, cefchinon méně než 20· 10“⁹, nafcilin méně než 2010“⁹ a cefazolin až do 4510’⁹ ve vzorku mléka.

io

Tento test, prováděný za 9 minut tedy dovoluje detekovat všechna antibiotika kontrolovaná v současné době evropskými úřady a to až do zákonných limitů, stanovených těmito úřady.

1.3.4. Test ve 20 minutách

Bylo připraveno šest vzorků čerstvého mléka obsahujících postupně koncentrace 0; 20; 30; 40; 50 a 60-10^-9 ceftiofuru. Každý z těchto roztoků byl potom analyzován následujícím způsobem:

Odebere se alikvot 200 μΐ vzorku mléka a 45,27 μΐ roztoku připraveného v příkladu 3.1.3, které se umístí do skleněné baňky. Směs se inkubuje po 18 minut při teplotě 47 °C. Testovací zařízení se umístí vertikálně do skleněné baňky tak, aby byl první konec testovacího zařízení v kontaktu se směsí a aby druhý konec spočíval na stěně skleněné baňky. Směs se ponechá migrovat testovacím zařízením a soubor se nechá inkubovat po 2 minuty při teplotě 47 °C.

Níže uvedená Tabulka 4 udává výsledky získané pro 6 vzorků, které byly testovány. Detekovaným pruhům byla přiřazena intenzita v rozmezí od 0 do 10, přičemž hodnota 10 znamená nej intenzivnější pruh a hodnota 0 znamená nejméně intenzivní pruh. V této stupnici byla hodnota 6 přiřazena referenčnímu pruhu. Intenzita signálu pozorovaného v prvním detekčním pruhu je nepřímo úměrná množství ceftiofuru, kterýje přítomen ve vzorku.

Tabulka 4

Penicilín G		Intenzita
(x io-⁹)	1. pruh	2. pruh
0	10	6
20	6	6
30	5	6
40	4	6
50	3	6
60	3	6

V tomto příkladu pokud byl první pruh méně intenzivní než druhý pruh, byl test považován za pozitivní. Výsledky uvedené v Tabulce 4 ukazují, že test dovoluje detekovat za 20 minut až do

3 0 1 0“⁹ cefapirinu ve vzorku mléka. Tento test ve 20 minutách tedy dovoluje detekovat v jediném testu všechna antibiotika kontrolovaná v současné době evropskými a americkými úřady a to až do zákonných limitů, stanovených těmito úřady.

Příklad 4. Použití testovacího zařízení v plastovém obalu. Používá se testovací zařízení, které bylo popsáno v příkladu 1.6. V tomto případě se uvedení vzorku do kontaktu s testovacím zařízením provádí nanesením inkubované směsi otvorem ve tvaru misky, která byla k tomuto účelu vytvořena.

Claims

1. Způsob detekce analytu v tekutém mléčném produktu testovacím zařízením, které zahrnuje pevný nosič (1), který má první okraj a druhý okraj, na kterém jsou připevněny, postupujíce od prvního okraje, membrána (2), umožňující purifikaci analyzované kapaliny; io membrána (3), na které jsou imobilizovány jedna nebo více záchytných látek; a absorpční membrána (4), vyznačující se tím, že zahrnuje následuj ící kroky:

uvedení analyzovaného mléčného produktu do kontaktu s detekčním činidlem, schopným specificky rozpoznávat analyt nebo látku analogickou analytu;

15 inkubaci směsí za inkubačních podmínek, které dovolují vytvoření stabilního a v zásadě ireverzibilního komplexu mezi analytem, který je přítomen v tekutém mléčném produktu, a detekčním činidlem;

umístění směsi na první okraj testovacího zařízení;

umožnění tečné kapilární migrace tekutiny testovacím zařízením; a

20 detekci analytu v tekutém mléčném produktu určením množství detekčního činidla komplexovaného s analytem a fixovaného na membráně (3).

2. Způsob podle nároku 1, ve kterém detekční činidlo navíc obsahuje alespoň jednu referenční substanci.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, ve kterém analytem je tetracyklin,

4. Způsob podle nároku 1 nebo 2, ve kterém analytem je buď exogenní protein tekutého mléčného produktu nebo endogenní protein mléčného produktu.

5. Způsob podle nároku 4, ve kterém analytem je hormon.

6. Způsob podle nároku 1 nebo 2, ve kterém analytem je antibiotikum s β-laktamovým kruhem.

7. Způsob podle nároku 1 nebo 2, ve kterém analyt je zvolen ze souboru zahrnujícího benzylpenicílin, penicilín G, ampicilin, amoxicilin, karbenicilin, methylcilin, cloxacilin, 6-APA, monolaktam, aztreonam, mecillinam, cefalexin, cefaloglycin, cefaloridin, nitrocefin, cefatoxim, cefuroxim, ceftiofur, cefapyrin, 7-ACA.

8. Způsob podle nároků 1 až 7, ve kterém detekční činidlo, schopné specificky rozpoznávat analyt nebo látku analogickou tomuto analytu, je zvoleno ze souboru zahrnujícího receptoiy schopné vytvoření stabilního a v zásadě ireverzibilního komplexu s analytem nebo látku analogickou tomuto analytu a monoklonální nebo polyklonální protilátky specifické pro analyt nebo

45 látku analogickou tomuto analytu.

9. Způsob podle nároku 8, ve kterém detekčním činidlem schopným specificky rozpoznávat analyt nebo látku analogickou tomuto analytu je receptor získaný z mikroorganismu citlivého na antibiotika, jako jsou receptory získané z organismů druhů Bacillus, Streptococus nebo

50 Actinomycetes,

10. Testovací zařízení umožňující detekování přítomnosti zkoumaných látek v tekutém mléčném produktu způsobem podle kteréhokoli z nároků 1 až 9 na základě kapilární tečné migrace uvedeného mléčného produktu, kde zařízení zahrnuje pevný nosič (1), který má první okraj a druhý okraj, na kterém jsou připevněny, postupujíce od prvního okraje,

5 membrána (2), umožňující purifikaci analyzované kapaliny;

membrána (3), na které jsou imobilizovány jedna nebo více záchytných látek; a absorpční membrána (4), vyznačující se tím, že membrána (2) je vytvořena z netkaných polyesterových vláken a je schopná zadržovat látky přítomné v mléčném produktu, které zabraňují migraci zkoumaných ío látek, popřípadě přítomných v mléčném produktu, a detekčních činidel, použitých v prováděném způsobu, testovacím zařízením, a to během kapilární tečné migrace vzorku po navlhčení prvního okraje testovacího zařízení analyzovaným mléčným produktem.

11. Testovací zařízení podle nároku 10, vyznačující se tím, že membrána (3) je is z nitrocelulózy.

12. Testovací zařízení podle nároku 10, vyznačující se tím, že membrána (4) je z celulózy,

20

13. Testovací zařízení podle nároků 10 az 12, vyznačující se tím, že obsahuje další membránu (5), na kterou bylo naneseno alespoň jedno detekční činidlo, přičemž membrána (5) je umístěna před membránou (3).

14. Testovací zařízení podle jakéhokoliv nároku 10ažl3, vyznačující se tím, že

25 membrány jsou úplně nebo částečně zakiyty adhezivní plastovou fólií (6).

15. Testovací zařízení podle nároku 14, vyznačující se tím, že plastová fólie (6) nezakrývá okraje nosiče (1).

30 16. Testovací zařízení podle jakéhokoliv nároku 10 až 13, vyznačující se tím, že je umístěno do plastového obalu, který obsahuje jeden otvor s okraji ve tvaru misky nad membránou (2) a jedno okénko nad membránou (3).