CN103897046A - β-内酰胺类抗生素残留检测的受体分析法与试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于兽药残留分析领域，具体涉及一种β-内酰胺类抗生素残留检测的受体分析方法与试剂盒及应用。本发明的试剂盒含可同时检测15种β-内酰胺类药物残留的受体蛋白。本发明的受体蛋白BlaR-CTD是由大肠杆菌(Escherichia coli)BlaRC所表达，包含受体蛋白BlaR-CTD的大肠杆菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2013173。本发明还公开了受体蛋白、酶标药物的制备方法和受体分析方法。本发明的试剂盒可同时检测青霉素类和头孢菌素类药物，拓宽了现有技术的检测对象，具有简便、快速、灵敏和准确等突出优点。

Description

β-内酰胺类抗生素残留检测的受体分析法与试剂盒

技术领域

本发明属于兽药残留分析、基因工程和受体分析技术领域。具体涉及一种能识别β-内酰胺类抗生素残留的受体蛋白的制备、同时检测15种β-内酰胺类抗生素残留的受体分析法的建立及试剂盒研制。 

背景技术

分子结构中含有β-内酰胺环的一类药物称为β-内酰胺类抗生素，主要包括青霉素类和头孢菌素类。低廉而有效的杀菌效果使它成为目前使用最广泛的一类兽药。此类药物不仅可以用来治疗动物细菌感染性疾病，同时还可以作为促生长饲料添加剂使用。 

由于未按照休药期规定使用兽用β-内酰胺类抗生素或者将人用β-内酰胺类抗生素使用在动物上，导致其在畜产品中残留严重。通过研究证实，即使是低剂量的此类药物在动物食品中残留，长期接触也可能使对其敏感的人群发生过敏反应，严重者会发生过敏性休克甚至死亡。制定相应的措施对抗生素残留进行监控和管制刻不容缓。为了保障各国利益及食品安全，各国对β-内酰胺类抗生素在动物性食品中的残留制定了最高残留限量(MRL)。 

目前β-内酰胺类抗生素残留的检测方法主要分为理化分析法、微生物法、免疫分析法及受体分析法。理化分析法主要用于确证，亦可用于筛选，但需要昂贵的仪器作为检测的保证，且其前处理程序较复杂并不适合大量检测。后面三种方法主要用于筛选，其中微生物法成本低廉、操作简便，但其精确度、准确度还无法适应目前抗生素残留检测的需要；免疫分析方法灵敏度高、特异性强，但它不能同时检测青霉素类和头孢菌素类药物；受体分析法可以同时识别青霉素类和头孢菌素类药物，可实现多残留检测。此外，β-内酰胺环容易发生水解而失活，而MRL标准中规定的残留物为有活性的残留物，受体能特异性地检测到活性组分。因此，对于快速准确筛选β-内酰胺类抗生素在动物组织中的残留，受体分析方法更具优势。 

目前已有一些文献和专利报道了β-内酰胺类抗生素的受体分析法。例如，美国专利(专利号4762782)利用枯草芽孢杆菌PBP2a蛋白建立了β-内酰胺类抗生素的受体分析法，但该方法需要用到抗体，操作过程复杂。基于肺炎链球菌PBP2x蛋白所建立的受体检测方法已有数项报道，这些方法有的需要用到昂贵的生物传感器(Cacciatore et al.，Analytica Chimica Acta，vol520，2004，pp105-115)，有的需要用到抗体(Lamar and Petz，Analytica Chimica Acta，586，2007，pp296-303)，且能识别的β-内酰胺类药物种类不多，尚不能满足需要。地衣芽孢杆菌BlaR蛋白是一种β-内酰胺酶调控蛋白，其C端区域即BlaR-CTD位于细胞膜外，能特异性的识 别β-内酰胺类抗生素(Joris et al.，FEMS Microbiology Letters，vol.70，1990，pp107-114)。美国专利(专利号6524804B2)在大肠杆菌中重组表达获得地衣芽孢杆菌749的BlaR-CTD受体蛋白，来检测食品中残留的β-内酰胺类抗生素。此专利共设计了4种检测生物液体中的β-内酰胺类抗生素的方式：第一种为生物素标记的BlaR-CTD的胶体金试纸条方法，这种方法能检测牛奶中10种β-内酰胺类药物，且检测限均低于欧盟规定的MRL，但不能进行定量分析；第二种方式是利用融合蛋白BlaR-CTD-β内酰胺酶，可以检测青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、氯唑西林、头孢匹林和头孢噻呋这6种药物，但青霉素、氨苄西林、阿莫西林的检测限高于欧盟规定的MRL；第三种方式是用碱性磷酸酶和过氧化物酶分别标记BlaR-CTD的酶标板方法，这种方法检可以测青霉素、氯唑西林、头孢噻呋这3种药物；第四种方法同样以酶来标记受体蛋白的试管方法，这种方法可检测青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、氯唑西林、头孢匹林和头孢噻呋，其中前三种低于美国规定的MRL但高于欧盟规定MRL。纵观上述方法，建立一种能同时检测多种β-内酰胺类药物、其检测限须要低于欧盟规定的MRL且组织样品处理和操作步骤简单的受体分析方法非常有必要。基于该方法建立的试剂盒在检测动物源性食品中的β-内酰胺类药物残留中具有广阔的应用前景。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，制备一种能识别多种β-内酰胺类抗生素的受体蛋白。 

本发明的第二个目的是利用该受体蛋白，建立一种能用于组织样品中多种β-内酰胺类抗生素残留检测的受体分析法，该方法的组织样品前处理过程简单，涵盖的组织样品范围广(包括牛奶、牛肉和鸡肉)，操作简便快捷。 

本发明的第三个目的是在组织样品中的β-内酰胺类药物种类已知时，可以对其进行定量分析。 

本发明的第四个目的是该受体蛋白在β-内酰胺类抗生素残留检测试剂盒中的应用。 

本发明的第五个目的是本发明制备的试剂盒在β-内酰胺类抗生素残留检测中的应用。 

本发明通过以下技术方案实现： 

为了实现本发明的任务，发明人克隆了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)保藏号ATCC14580的BlaR蛋白的C端区域(BlaR-CTD)的基因，构建相应的原核表达质粒pET-28a-BlaR-CTD，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达该受体蛋白的大肠杆菌(Escherichia coli)BlaRC，于2013年5月6日将该菌株送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2013173，然后诱导受体蛋白BlaR-CTD的重组表达。 

具体地，本发明通过以下技术方案实现： 

申请人制备得到一种β-内酰胺类抗生素残留检测试剂盒，其核心在于该试剂盒的固相载体包被有受体蛋白BlaR-CTD，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。 

进一步，上述试剂盒，还包含包含下列组分： 

(1)由受体蛋白BlaR-CTD包被的固相载体，即酶标板； 

(2)头孢喹肟标准溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、4μg/L、8μg/L； 

(3)辣根过氧化物酶标记氨苄西林的储存液； 

(4)10×磷酸盐缓冲液，用下列方法制备得到：NaCl80.0g，KH₂PO₄2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O29.0g，KCl2.0g，加去离子800mL充分溶解，调节pH值至7.4，补充去离子水定容至1000mL； 

(5)10×洗涤液，用下列方法制备得到：NaCl80.0g，KH₂PO₄2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O29.0g，KCl2.0g，Tween205mL，加去离子水约800mL，补充去离子水定容至1000mL； 

(6)底物A液，用下列方法制备得到：准确称取四甲基联苯胺160mg，加入10mL二甲基乙酰胺，搅拌完全溶解； 

(7)底物B液，用下列方法制备得到：准确称取柠檬酸13.70g、柠檬酸三钠10.14g和过氧化氢脲282.00mg，用少量超纯水溶解，定容至1000mL； 

(8)终止液，用下列方法制备得到：准确量取浓硫酸100mL，缓慢滴加到800mL超纯水中； 

使用时，将10×磷酸盐缓冲液和10×洗涤液分别用去离子水稀释十倍得到样品稀释液和洗涤液，将辣根过氧化物酶标记氨苄西林的储存液用磷酸盐缓冲液稀释300倍得到酶标药物工作液，将底物A液和底物B液按体积比为1∶10混匀得到底物混合液。 

申请人提供了一种同时检测β-内酰胺类抗生素残留的受体分析方法，包括下列步骤： 

(1)以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)保藏号ATCC14580的基因组为模板，利用PCR扩增得到受体蛋白BlaR-CTD的基因片段，将该基因片段插入到表达载体pET-28a中，得到重组表达质粒pET-28a-BlaR-CTD； 

(2)将步骤(1)所述的重组表达质粒pET-28a-BlaR-CTD转化大肠杆菌BL21(DE3)得到重组的大肠杆菌(Escherichia coli)BlaRC，进一步诱导表达得到受体蛋白BlaR-CTD，对该受体蛋白进行亲和纯化； 

(3)采用碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)法合成酶标药物，即辣根过氧化物酶标记的氨苄西林HRP-AMP； 

(4)用步骤(2)所述的受体蛋白BlaR-CTD包被固相载体，即酶标板； 

(5)将待测样品用弱碱性的磷酸盐缓冲液提取，离心取上清为待测物； 

(6)对步骤(5)所述的待测物进行受体分析检测。 

其中： 

步骤(1)中受体蛋白BlaR-CTD的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示； 

步骤(2)所述的重组的大肠杆菌(Escherichia coli)BlaRC于2013年5月6日送交中国.武汉.武汉大学中 国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2013173； 

步骤(5)中磷酸盐缓冲液按如下步骤制得：NaCl8.0g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KCl0.2g，加去离子水800mL充分溶解，调节pH值至7.4，补充去离子水定容至1000mL。 

本发明的主要优点是： 

1、本发明的受体能够识别15种β-内酰胺类药物，而现有文献和专利报道尚不能识别如此多种β-内酰胺类药物； 

2、本发明建立的受体分析可以检测牛奶中规定了残留限量的11种β-内酰胺类药物的残留情况，检测限均在欧盟规定的MRL以下； 

3、本发明还可以用来检测牛肉和鸡肉中的β-内酰胺类药物残留，适用范围广； 

4、本发明在组织样品中的β-内酰胺类药物种类已知时，还可以对其进行定量分析； 

5、本发明涉及的样品处理方法简便，易操作，准确度和精密度好。 

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的BlaR-CTD蛋白的基因片段的核苷酸序列，序列长度为765bp。 

图1为本发明的技术路线图。 

图2为重组表达质粒pET-28a-BlaR-CTD的图谱。 

图3为本发明其中一个实施例的SDS-PAGE图，显示了受体蛋白BlaR-CTD表达和纯化的SDS-PAGE图。图中：泳道1为大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a空载体诱导全菌蛋白，泳道2、3分别为大肠杆菌BlaRC诱导全菌蛋白和纯化后的重组蛋白。M为蛋白质分子量标准。 

图4为本发明其中一个实施例的紫外扫描图谱，显示了辣根过氧化物酶标记的氨苄西林(HRP-AMP)的紫外吸收特征。 

图5为本发明的受体蛋白与头孢喹肟标准品的受体分析法的反应曲线，其中X轴为头孢喹肟标准品溶液浓度的对数值，Y轴为对头孢喹肟标准品溶液的光密度值除以零孔光密度值(B/B₀)。 

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。 

实施例1受体蛋白的制备 

提取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)保藏号ATCC14580(购于中国江苏省无锡市江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心，为商业菌株和公开使用的菌株)的基因组，用引物 5′-cgcGGATCCATGCAAAGAGATACGCACTT-3′和5′-ccgCTCGAGTTATCGGGAAGCGGATGG-3′进行PCR扩增(PCR扩增的方法为常用方法，参见：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，北京，科学出版社，2002版)目的蛋白BlaR-CTD的基因。将该基因片段用限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶切，插入到表达载体pET-28a的BamH I-Xho I多克隆位点中，通过构建得到重组表达载体pET-28a-BlaR-CTD，将该重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达该受体蛋白的重组大肠杆菌BlaRC。 

将过夜培养的重组大肠杆菌BlaRC的液体培养物以体积比为1∶100的接种量加入到LB液体培养基(含终浓度为50μg/mL的卡那霉素)中，在37℃和250r/min的振荡培养箱中培养到菌液的OD₆₀₀值为0.6-1.0(对数生长期)，加入1mmol/L的IPTG，18℃下200r/min低温诱导12h。离心收集菌体，用预冷的磷酸盐缓冲液(NaCl8.0g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KCl0.2g，加去离子约800mL充分溶解，调节pH值至7.4，加去离子水定容至1000mL)洗涤两次后，经过压力破碎或者超声破碎得到含有目的蛋白的上清液。利用亲和层析纯化技术，在咪唑洗脱浓度为100mmol/L时重组受体蛋白纯度最高。收集1L的菌液可以纯化得到受体蛋白BlaR-CTD约20mg。经过透析除去咪唑，蛋白纯度能达到95％以上。 

实施例2辣根过氧化物酶标记氨苄西林的制备 

称取4.40mg辣根过氧化物酶(HRP)，溶于1mL的pH7.4的磷酸盐缓冲液中，倒入含有磁性粒子的棕色瓶中。称取2.40mg的碳化二亚胺(EDC)溶于500μL的磷酸盐缓冲液中，混匀后逐滴加入到棕色瓶中。随后称取1.80mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于500μL的磷酸盐缓冲液中，逐滴加入到棕色瓶中，在4℃条件下避光搅拌2h。以上反应液标记为A液。称取6.18mg的氨苄西林钠(AMP)，溶于1mL的磷酸盐缓冲液中，标记为B液。随后将B液缓缓的加入A液中，4℃条件下避光搅拌5h。 

反应完成后，将上述反应液加入到透析袋中，在4℃置于磷酸盐缓冲液中透析3～4d。分别测定氨苄西林钠，辣根过氧化物酶和反应合成物的紫外全波长图谱，得到各物质的最大吸收波长，以此鉴定是否偶联成功。透析后的反应液加入等体积的甘油，置-20℃保存。 

实施例3β-内酰胺类抗生素多残留受体分析方法的建立 

3.1试剂的配制(本实施例使用的试剂除另注明外均采用以下方法配置) 

磷酸盐缓冲液(PBS)：NaCl8.0g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KCl0.2g，加去离子约800mL充分溶解，调节pH值至7.4，加去离子水定容至1000mL。 

洗涤液(PBST)：NaCl8.0g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KCl0.2g，Tween200.5mL，加去离子水约800mL，调节pH值至7.4，加去离子水定容至1000mL。 

碳酸盐缓冲液(CBS)：NaCO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加去离子水约800mL，调节pH值至9.6，加去离子水定容至1000mL。 

BSA封闭液：准确称取牛血清白蛋白10g，加入1000mL的磷酸盐缓冲液，搅拌混匀至蛋白完全溶解。 

OVA封闭液：准确称取卵清白蛋白10g，加入1000mL的磷酸盐缓冲液，搅拌混匀至蛋白完全溶解。 

底物A液：准确称取四甲基联苯胺(TMB)160mg，加入10mL二甲基乙酰胺(DMF)，搅拌至完全溶解。 

底物B液：准确称取柠檬酸13.70g、柠檬酸三钠10.14g和过氧化氢脲282.00mg，超纯水溶解，定容至1000mL。 

底物混合液：准确量取底物B液10mL，加入100μL底物A液，混匀，现配现用。 

终止液：准确量取浓硫酸100mL，缓慢滴加到800mL超纯水中。 

3.2包被原浓度的确定 

采用方阵滴定法初步选择包被的蛋白浓度。选择标准以OD₄₅₀值位于2.0附近，且相邻两孔OD值有较大变化的包被原浓度和对应的酶标药物稀释度为最佳组合。微量分光光度计测定蛋白浓度为0.5mg/mL，以该蛋白溶液为母液，以碳酸盐缓冲液配置不同浓度的蛋白，每孔100μL，置于4℃包被12h。甩出包被液，每孔加250μL洗涤液，静置2min后，尽量甩掉孔内的液体，并在吸水纱布上拍干；如此重复洗涤3次，拍干。每孔加入250μL封闭液，放入37℃湿盒中孵育2h。甩出孔内封闭液后，用洗涤液洗涤3次，拍干。每孔加入50μL的磷酸盐缓冲液，加入50μL不同浓度的倍比稀释的酶标药物HRP-AMP，最终每孔的体积100μL，混匀。37℃湿盒孵育1h。甩尽孔内液体后，洗涤液洗涤3次，拍干。加底物混合液100μL/孔，37℃湿盒中孵育15min。每孔加50μL终止液，用酶标仪测定OD₄₅₀值。方阵滴定法结果如表1所示。 

以OD₄₅₀值在2.0左右，且相邻孔间差异较大时的最大稀释倍数作为受体蛋白效价，并以蛋白和酶标药物的使用量最少为原则，故可供选择的最优组合为蛋白稀释400倍，酶标药物稀释300倍。 

表1受体蛋白的方阵滴定 

3.3包被液的确定 

分别用磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液稀释受体蛋白到最佳稀释度，充分混匀后，每孔加入100μL于4℃ 包被12h。后续操作同3.2的方法进行试验，测定OD₄₅₀值，并设置空白对照组。由表2所示，随着酶标药物稀释度的增大，OD值逐渐降低；当酶标药物稀释度一定时，磷酸盐缓冲液的OD值高于碳酸盐缓冲液的OD值，表明磷酸盐缓冲液作为包被液效果优于碳酸盐缓冲液。 

表2包被液的优化 

3.4封闭条件的确定 

封闭液的优化：使用磷酸盐缓冲液稀释受体蛋白，置于4℃包被12h后，分别加入1％的OVA和BSA封闭液进行封闭，设置阴性对照孔，每孔250μL，37℃湿盒中孵育2h。按照3.2的方法进行试验，检测OD₄₅₀值。如表3所示，酶标药物稀释度达到2400时，OD值最接近2.0左右。分别与空白对照组相比，使用BSA和OVA封闭液的OD₄₅₀比值[OD₄₅₀(样品组)/OD₄₅₀(阴性对照组)]分别为19.22和16.55，表明BSA封闭液的封闭效果优于OVA封闭液。 

表3封闭液的优化 

封闭方式的优化：使用磷酸盐缓冲液将受体蛋白稀释到最佳浓度，分别放入37℃封闭2h和4℃封闭12h，并设置阴性对照孔。封闭后按照3.2进行后续操作，检测OD₄₅₀值。酶标药物稀释度为1200时，不同封闭方式的OD₄₅₀值见表4所示。4℃封闭12h的OD值明显高于37℃封闭2h时的OD值，说明采用前者的封闭效果更好。 

表4封闭方式的优化 

3.5反应时间的确定 

加入酶标药物后，置于37℃湿盒中分别反应15min、30min、45min、60min和75min，然后按照3.2方法进行操作，检测OD₄₅₀值。结果显示，15min到45min区段内，随着反应时间的增加OD₄₅₀值呈现增加的趋势。当时间继续增加，开始呈现下降趋势。因而可以判定在45min时反应已经达到最大的反应效率，由此选用45min为最佳反应时间。 

3.6标准曲线的建立 

按照上述优化的受体分析方法建立标准曲线，将头孢喹肟标准品溶液用磷酸盐缓冲液倍比稀释成0μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、4μg/L和8μg/L，各浓度重复5孔，共重复5批。以各浓度的对数值为横坐标，抑制率(B/B₀)为纵坐标绘制标准曲线。回归方程和相关系数分别为：y＝-0.5462x+0.6546(R＝0.9950)，计算出IC₅₀值为2.04±0.40μg/L(n＝5)，其线性范围为0.5～8μg/L。 

3.7交叉反应试验 

将各种β-内酰胺类药物的标准品溶液用磷酸盐缓冲液配置成系列浓度，按上述优化的条件进行受体分析法，计算IC₅₀值，并以头孢喹肟标准品的交叉反应率为100％，利用公式1计算受体蛋白BlaR-CTD对各药物的交叉反应率，结果如表5所示。本方法可以检测头孢喹肟等15种β-内酰胺类药物和一种代谢产物(头孢噻呋代谢物)。 

公式1：交叉反应率(％)＝IC₅₀(头孢喹肟)/IC₅₀(其他药物)×100％ 

表5受体蛋白BlaR-CTD对β-内酰胺类药物的交叉反应率 

实施例4β-内酰胺类抗生素多残留受体检测试剂盒的组装 

4.1本发明试剂盒由下述部分组成： 

1)包被有受体蛋白BlaR-CTD(其制备方法见实施例1和《发明内容》)的固相载体(或称酶标板)； 

2)头孢喹肟标准溶液6瓶，其浓度分别为0μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、4μg/L、8μg/L； 

3)辣根过氧化物酶标记氨苄西林的储存液； 

4)10×磷酸盐缓冲液：NaCl80.0g，KH₂PO₄2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O29.0g，KCl2.0g，加去离子约800mL充分溶解，调节pH值至7.4，补充去离子水定容至1000mL； 

5)10×洗涤液：NaCl80.0g，KH₂PO₄2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O29.0g，KCl2.0g，Tween205mL，加去离子水约800mL，补充去离子水定容至1000mL； 

6)底物A液：准确称取四甲基联苯胺(TMB)160mg，加入10mL二甲基乙酰胺(DMF)，搅拌完全溶解； 

7)底物B液：准确称取柠檬酸13.70g、柠檬酸三钠10.14g和过氧化氢脲282.00mg，用少量超纯水溶解，并用超纯水定容至1000mL； 

8)终止液：准确量取浓硫酸100mL，缓慢滴加到800mL超纯水中。 

4.2酶标板的制备 

用磷酸盐缓冲液将受体蛋白BlaR-CTD稀释400倍，每孔加入100μL，4℃过夜包被，甩尽包被液，每孔加入250μL洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔加入BSA封闭液，4℃孵育12h，倒掉孔内液体，洗涤液洗涤3次，甩尽拍干，用锡箔纸真空密封保存。 

实施例5本发明的受体检测试剂盒的测定程序 

5.1试剂的配置 

1)样品稀释液：将试剂盒中提供的10×磷酸盐缓冲液用去离子水稀释10倍后使用； 

2)洗涤液：将试剂盒中提供的10×洗涤液用去离子水稀释10倍后使用； 

3)酶标药物工作液：将试剂盒中提供的辣根过氧化物酶标记氨苄西林的储存液用磷酸盐缓冲液稀释300倍后使用； 

4)底物混合液：根据每次所需用量，将配置的底物A液和底物B液按体积比为1∶10混匀，现配现用。 

5.2组织样品的前处理 

1)牛奶样品的前处理 

准确称取新鲜的全脂牛奶样品1.00±0.02g置于10mL离心管中，加入样品稀释液2mL使样品稀释10倍，取混合溶液用于分析。 

2)肌肉样品的前处理 

准确称取组织均质物(牛肉或鸡肉)2.00±0.02g置于50mL离心管中，加入样品稀释液充分混合后，于4000r/min离心10min，取上清液稀释100倍，取混合溶液用于分析。 

5.3测定步骤 

1)加样：向酶标板微孔中加入头孢喹肟系列浓度标准液或样品溶液50μL，然后加入酶标药物工作液50μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育45min； 

2)洗涤：倒出孔中的液体，每孔加入洗涤液250μL，洗涤3次并拍干； 

3)加底物：每孔中加入底物混合液100μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育15min； 

4)加终止液：每孔中加入终止液50μL； 

5)测定：用酶标仪在450nm处测定每孔的光密度值(OD值)。 

5.4结果判断 

标准曲线： 

以所测定的标准品OD值除以“零”孔OD值(B/B₀)为纵坐标，头孢喹肟浓度的对数值为横坐标作为标准曲线，并进行线性回归，给出回归方程。 

牛奶中药物浓度计算： 

计算样品的抑制率(样品的OD值除以“零”孔OD值)，代入标准曲线的回归方程中，并乘以稀释系数10，并计算出牛奶中头孢喹肟浓度(C_cefq，μg/kg)，按照公式2折算成相关药物浓度(C_β-lactam，μg/kg)。 

肌肉中药物浓度计算： 

计算样品的抑制率(样品的OD值除以“零”孔OD值)，代入标准曲线的回归方程中，并乘以稀释系数100，并计算出肌肉中头孢喹肟浓度(C_cefq，μg/kg)，按照公式2折算成相关药物浓度(C_β-lactam，μg/kg)。 

公式2：C_β-lactam＝C_cefq/交叉反应率 

实施例6本发明试剂盒的灵敏度、精密度、准确度、重复性试验 

6.1本发明试剂盒的灵敏度试验 

以标准曲线的IC₅₀值和组织的最低检测限(LOD)作为本发明检测试剂盒的灵敏度指标。将头孢喹肟标准品溶液稀释成系列浓度0μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、4μg/L和8μg/L，各浓度重复5孔，共重复5批，取5次测定的IC₅₀值平均值。LOD通过以下步骤确定，测定20份空白牛奶样品和肌肉组织的OD值，根据标准曲线的回归方程中计算出相应的头孢喹肟浓度，然后计算头孢喹肟浓度的平均值

和标准差(SD)。根据公式

计算得到组织中的最低检测限。本发明的IC₅₀值为2.04±0.40μg/L，头孢喹肟在牛奶的最低检测限为2.10μg/L，在牛肉和鸡肉的最低检测限分别为30.68μg/L和31.13μg/L。 

6.2本发明试剂盒的精密度试验 

将头孢喹肟标准品稀释成0μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、4μg/L和8μg/L6个浓度，每浓度5个复孔，按照受体分析方法重复测定5次，对应的OD值分别代入到标准曲线的回归方程中计算出各浓度头孢喹肟标准品溶液的测定值，计算板内和板间变异系数。结果如表6所示。 

表6标准曲线的板内与板间变异系数 

6.3本发明试剂盒的准确度、重复性试验 

取空白组织样品(牛奶、牛肉和鸡肉)，分别向其中添加各类β-内酰胺类药物的高、中、低三个浓度，每个浓度分别设置5个重复，重复测定3次。按照公式3计算回收率，考核试剂盒的准确度；计算批内和批间变异系数，考核试剂盒的重复性。准确度和重复性结果见表7、表8、表9所示，回收率绝大多数在60％～120％之间，批间变异系数绝大多数在30％以内，表明该试剂盒具有可靠的准确度，批内和批间变异系数小，重复性好。 

公式3：回收率(％)＝实测浓度/添加浓度×100％ 

表7β-内酰胺类药物在牛奶样品中的添加回收率和变异系数 

表8β-内酰胺类药物在牛肉样品中的添加回收率和变异系数 

表9β-内酰胺类药物在鸡肉样品中的添加回收率和变异系数 

Claims (6)

1.一种能够识别β-内酰胺类抗生素的受体蛋白BlaR-CTD，其特征在于，该受体蛋白BlaR-CTD克隆在表达质粒pET-28a-BlaR-CTD中，表达受体蛋白BlaR-CTD的大肠杆菌(Escherichia coli)BlaRC保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2013173，所述的受体蛋白BlaR-CTD的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.一种β-内酰胺类抗生素残留检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的固相载体包被有如权利要求1所述的受体蛋白BlaR-CTD。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征包含下列组分：

(1)由权利要求1所述的受体蛋白BlaR-CTD包被的固相载体，即酶标板；

(2)头孢喹肟标准溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、4μg/L、8μg/L；

(3)辣根过氧化物酶标记氨苄西林的储存液；

(4)10×磷酸盐缓冲液，用下列方法制备得到：NaCl80.0g，KH₂PO₄2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O29.0g，KCl2.0g，加去离子800mL充分溶解，调节pH值至7.4，补充去离子水定容至1000mL；

(5)10×洗涤液，用下列方法制备得到：NaCl80.0g，KH₂PO₄2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O29.0g，KCl2.0g，Tween205mL，加去离子水约800mL，补充去离子水定容至1000mL；

(6)底物A液，用下列方法制备得到：准确称取四甲基联苯胺160mg，加入10mL二甲基乙酰胺，搅拌完全溶解；

(7)底物B液，用下列方法制备得到：准确称取柠檬酸13.70g、柠檬酸三钠10.14g和过氧化氢脲282.00mg，用少量超纯水溶解，定容至1000mL；

(8)终止液，用下列方法制备得到：准确量取浓硫酸100mL，缓慢滴加到800mL超纯水中；

使用时，将10×磷酸盐缓冲液和10×洗涤液分别用去离子水稀释十倍得到样品稀释液和洗涤液，将辣根过氧化物酶标记氨苄西林的储存液用磷酸盐缓冲液稀释300倍得到酶标药物工作液，将底物A液和底物B液按体积比为1∶10混匀得到底物混合液。

4.一种同时检测β-内酰胺类抗生素残留的受体分析方法，其特征包括下列步骤：

(1)以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC14580的基因组为模板，利用PCR扩增得到受体蛋白BlaR-CTD的基因片段，将该基因片段插入到表达载体pET-28a中，得到重组表达质粒pET-28a-BlaR-CTD；

(2)将步骤(1)所述的重组表达质粒pET-28a-BlaR-CTD转化大肠杆菌BL21(DE3)得到重组的大肠杆菌(Escherichia coli)BlaRC，进一步诱导表达得到受体蛋白BlaR-CTD，对该受体蛋白进行亲和纯化；

(3)采用碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)法合成酶标药物，即辣根过氧化物酶标记的氨苄西林HRP-AMP；

(4)用步骤(2)所述的受体蛋白BlaR-CTD包被固相载体，即酶标板；

(5)将待测样品用弱碱性的磷酸盐缓冲液提取，离心取上清为待测物；

(6)对步骤(5)所述的待测物进行受体分析检测。

其中：

步骤(1)中受体蛋白BlaR-CTD的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

步骤(2)所述的重组的大肠杆菌(Escherichia coli)BlaRC保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2013173；

步骤(5)中磷酸盐缓冲液，按如下步骤制得：NaCl8.0g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KCl0.2g，加去离子水800mL充分溶解，调节pH值至7.4，补充去离子水定容至1000mL。

5.权利要求1所述的受体蛋白BlaR-CTD在制备同时检测β-内酰胺类抗生素的受体分析试剂盒中的应用。

6.权利要求2或3所述的试剂盒在β-内酰胺类抗生素残留检测中的应用。

Images