CZ20001059A3 - Testovací zařízení pro provádění analýzy v tekutém mléčném produktu - Google Patents

Testovací zařízení pro provádění analýzy v tekutém mléčném produktu Download PDF

Info

Publication number
CZ20001059A3
CZ20001059A3 CZ20001059A CZ20001059A CZ20001059A3 CZ 20001059 A3 CZ20001059 A3 CZ 20001059A3 CZ 20001059 A CZ20001059 A CZ 20001059A CZ 20001059 A CZ20001059 A CZ 20001059A CZ 20001059 A3 CZ20001059 A3 CZ 20001059A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
test
membrane
ppb
substance
detection
Prior art date
Application number
CZ20001059A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ301093B6 (cs
Inventor
Jacques Degelaen
Jean-Marie Frere
Benoit Granier
Bernard Joris
Original Assignee
Ucb Bioproducts, S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25663116&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ20001059(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from BE9700807A external-priority patent/BE1011487A3/fr
Priority claimed from BE9800485A external-priority patent/BE1012049A6/fr
Application filed by Ucb Bioproducts, S. A. filed Critical Ucb Bioproducts, S. A.
Publication of CZ20001059A3 publication Critical patent/CZ20001059A3/cs
Publication of CZ301093B6 publication Critical patent/CZ301093B6/cs

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow

Description

Oblast techniky
Vynález se týká testovacího zařízení pro provádění analýzy v tekutém mléčném produktu jako je mléko. Vynález se také týká způsobu provádění detekce a kvantitativního určování látek v mléku použitím uvedeného testovací zařízení a testovací soupravy, obsahující uvedené testovací zařízení.
Dosavadní stav techniky
V současné době zdravotní předpisy mnoha zemí vyžadují pravidelnou kontrolu přítomností různých látek v mléčných produktech, jako jsou veterinární léky a hormony, běžně používané při chovu dobytka. Ze zřejmých lékařských důvodů se tyto produkty nesmí vyskytovat v mléčných produktech určených pro lidskou spotřebu.
V jiných případech je žádoucí mít k disposici testy dovolující detekci endogenních látek v mléku pro optimalizaci způsobů chovu dobytka. Konkrétně rychlé určení úrovní hormonů v mléku dovoluje snadno identifikovat období vhodná pro reprodukci.
Ještě v dalších případech je potřeba praktických a spolehlivých způsobů kontroly původu mléčných produktů získaných z mléka různých zvířecích druhů. Je proto potřeba způsobů, které dovolují identifikaci přítomnosti proteinů v
- 2 • · · ···· · · • · · fl · fl ···· ··· ·· · fl* mléce, které jsou charakteristické pro jisté druhy ve srovnání s jinými druhy.
Z literatury jsou známy různé druhy testů pro analýzu biologických tekutin. Tyto testy obecně používají způsoby detekce, které jsou založeny na rozpoznávacím činidlu (receptory nebo protilátky), které specificky rozpoznávají hledanou látku nebo její analog a na značkovacím činidlu (radioaktivní prvek, enzym, fluorescenční činidlo a podobně), které jsou dále označovány jako detekční činidla. V závislosti na zvoleném způsobu se mluví o radioimunologickém testu (RIA), radioreceptorovém testu (RRA), enzymovém imunologickém testu (EIA) a podobně. Ve svém obecném principu tyto testy využívají minimální kombinaci dvou výše uvedených prvků (detekčních činidel), která umožní získat výsledek, jehož hodnota indikuje množství zkoumané látky, které je přítomno.
Je vhodné poznamenat, že v závislosti na použitém způsobu detekce může být označující činidlo spojeno buď s rozpoznávacím činidlem nebo s testovanou látkou nebo s látkou, která je analogická testované látce z hlediska rozpoznávání použitým rozpoznávacím činidlem. Existují také testovací způsoby, ve kterých rozpoznávací činidlo nebo testovaná látka nebo látka analogická testované látce obsahují v sobě označovací činidlo (například radioaktivně označená testovaná látka).
U mléčných produktů se nejčastěji popisované testy týkají detekce antibiotik. Je totiž dobře známo, že antibiotika pěstitelé používají pro léčbu jistých infekčních onemocnění
4
- 3 •a·· 444 dobytka,
Ze zřejmých lékařských důvodů mléko určené k lidské spotřebě musí v principu být prosté všech antibiotik. Mimo jiné koncentrace penicilinu 0, 005 U/ml nebo méně může mít škodlivé důsledky v průběhu výroby produktů odvozených z mléka, jako je sýr, jogurt a podobně.
Může být předvídána řada situací. Například v prvním případě pro detekci přítomnosti antibiotik na farmě před převedením do kamionu, bude mít prioritu extrémně rychlý (méně než 5 minut) a jednoduchý test. Použití rychlého testu může být také vhodné jestliže například antibiotikum, které bylo použito pro ošetření je známé a jestliže dále uvedený test dovoluje detekci uvažovaného antibiotika podle zákonné normy. V opačném případě, pokud na rychlost není dáván důraz, je důležité detekovat většinu nebo všechna antibiotika v zákonných normách.
Zákonné úpravy některých zemí stanoví přesně stanovené kvalitativní normy. Například americké úřady vyžadují, aby koncentrace šesti dále uvedených antibiotik v mléku nepřekračovaly přesně určené hodnoty: penicilín, 5 ppb; ampicilin, 10 ppb; amoxicilin, 10 ppb; cloxacilin, 10 ppb; cefapirin, 20 ppb; ceftíofur, 50 ppb. Evropské společenství / také stanoví normy kvality: penicilín 4 ppb; amoxicilin 4 ppb; ampicilin 4 ppb; cloxacilin 30 ppb; dicloxacilin 30 ppb; oxacilin 30 ppb; cefapirin 10 ppb; ceftíofur 100 ppb: cefchinon 20 ppb; nafcilin 30 ppb; cefazolin 50 ppb.
Může proto být užitečné mít k disposici test, který • «
- 4 ·««· φ*· φ φ φφ • φφφ* · · dovoluje detekci většiny antibiotik. Kromě toho v mlékárenském průmyslu může být užitečné mít k disposici test, který má všechny vlastnosti rychlosti, citlivosti a jednoduchosti, test, který dovoluje vázat tyto tři parametry co nej lepším způsobem a to i pokud nejsou úplně pokryty.
Vynález US 4.239.852 popisuje mikrobiologický způsob detekce antibiotik s β-laktamovým jádrem v mléku. Podle tohoto způsobu se vzorek mléka inkubuje na jedné straně v přítomnosti částí buněk mikroorganismu, který je velmi citlivý na antibiotika, obzvláště Bacillus stearothermophilus a na druhé straně v přítomnosti antibiotika označeného radioaktivním prvkem nebo enzymem. Inkubace se provádí za podmínek dovolujících, aby antibiotika, popřípadě přítomná ve vzorku a označené antibiotikum se vázaly k částem buněk.
Po ukončení inkubace se části buněk oddělí ze směsi a potom promývají. Potom se množství označených antibiotik vázaných na části buněk určí a porovnává se standardem. Množství označených antibiotik, vázaných ke zbytkům buněk je nepřímo úměrné koncentraci antibiotik, přítomných ve vzorku analyzovaného mléka.
Tento způsob vyžaduje relativně jemné manipulace, zejména během separace částí buněk ze směsi. Mimoto ve své nejcitlivější verzi tento způsob používá antibiotikum označené radioaktivním prvkem (14C nebo 125I) . V tomto případě určení množství antibiotika, které je popřípadě přítomno v mléku vyžaduje použití speciálního přístroje,
- 5 «*·« ··« • · · ···· · · · · · ...... · ·· · *· ·· jako je například scíntilační počítač. Kromě toho manipulace s radioaktivními produkty, a to i v případě použití velmi malých množství, není zcela prostá nebezpečí pro osobu, která provádí analýzu.
Evropská přihláška vynálezu 593.112 popisuje jiný způsob, dovolující detekci antibiotik v mléku. Tento způsob používá protein izolovaný z mikroorganismu citlivého na antibiotika, jako je například Bacillus stearothermophilus. Tento protein se kromě jiného označí enzymem jako je peroxidáza.
Test postupuje následujícím způsobem: vzorek mléka se inkubuje ve zkumavce v přítomnosti označeného proteinu; po inkubaci se mléko přenese do druhé zkumavky, na jejíchž stěnách bylo imobilizováno referenční antibiotikum; provede se druhá inkubace, potom se odstraní obsah zkumavky; stěny druhé zkumavky se třikrát promývají promývacím roztokem, který se také odstraní, Potom se rezidua, přítomná na stěnách druhé zkumavky přenesou na savý papír; dále se do druhé zkumavky přidá barevný substrát, který se znovu inkubuje, potom se přidá roztok, který zastaví vývin barvy; zabarvení zkumavky se porovná se zabarvením, kterého bylo dosaženo v paralelně prováděném identickém testu na standardním vzorku antibiotika. Množství označeného proteinu, imobilízovaném na nosiči, tedy také intenzita zabarvení, je nepřímo úměrné množství antibiotika, přítomného v analyzovaném vzorku mléka.
Podle příkladu 1 této přihlášky vynálezu tento test dovoluje detekovat penicilín G až do koncentrací řádu 5 ppb • «
- 6 a dovoluje detekci amoxicílinu (5 ppb), ampicilinu (10 ppb) , cefapirinu (5 ppb) a ceftiofuru (5 ppb).
Nicméně test je značně náročný na prováděni, obzvláště nekvalifikovaným personálem. Tento test totiž zahrnuje množství etap, v to počítaje etapy přelévání kapaliny a reziduí a několik etap promývání.
Vzhledem k počtu a povaze etap požadovaných v tomto testu je získání spolehlivého výsledku závislé silně na schopnostech osoby, který test provádí.
Mimo to interpretace výsledku si vyžaduje provedení dvou souběžných testů, což ještě více násobí a komplikuje operace.
Jsou také známy další typy enzymatických způsobů, které umožňují určení slabých koncentrací antibiotik v mlčku (J.M. FRERE a kol., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18(4), 506-510 (1980), a také vynálezy EP 85.667 a EP 468.946), které jsou založeny na použití specifického enzymu, totiž exobuněčné rozpustné D-alanyl-D-alanincarboxypeptidázy, kterou produkuje Actinomadura R39 (dále označovaná jako „enzym R39). Enzym R39 má specifickou aktivitu hydrolýzy skupin D-aianyl-D-alanin u různých peptidů a je také schopný hydrolyzovat konkrétní thioestery.
Kromě jiného enzym R39 reaguje s antibiotiky s β-laktamovým jádrem za velmi rychlého vytvoření equimolárního komplexu enzym-antibiotikum, který je neaktivní a v zásadě • a··· * * • ··· ** · «· ireverzibilní.
V nejnovější verzi tohoto testu (EP 468.946} se určený objem vzorku kapaliny určení k testování inkubuje s určeným množstvím enzymu R39 za podmínek, které dovolují, aby βlaktamové antibiotikum, které je popřípadě přítomno ve vzorku, reagovalo s enzymem pro vytvoření ekvimolárního komplexu enzym-antibiotikum, který je neaktivní a v zásadě ireverzibilní.
Potom se určené množství substrátu typu thioesteru inkubuje s produktem získaným v první etapě za podmínek, dovolujících hydrolýzu substrátu reziduálním enzymem R39, který dosud nekomplexoval s antibiotikem během první inkubace. Množství takto vytvořené kyseliny merkaptoalkanové se potom určí kolorimetrickou metodou pomocí reaktantu, který je schopný vytvářet zabarvení s volnou skupinou SH kyseliny merkaptoalkanové. Intenzita zabarvení se porovnává s etalonem, který byl předem vytvořen ze vzorků obsahujících známá množství antibiotik. Kvantitativní určení může být provedeno měřením pomocí spektrofotometrie; v případě mléka může být nutné provést nejprve zprůhlednění vzorku.
Je zřejmé, že tento test zahrnuje méně etap a je jednodušší k provádění než test popsaný v přihlášce vynálezu EP 593.112. Nicméně tento test je omezen na detekci antibiotik s β-laktamovým jádrem a u těchto antibiotik navíc do prahu dostupné detekce pomocí enzymu R39. Jako takový tento test nemůže být používán s dalšími receptory antibiotik a nemůže přímo sloužit jako základ pro detekci dalších druhů látek v v ·
- 8 • ···· · · » · · · · * • · · » ·*· · · mléku.
Jelikož současné testy vykazují ještě další nevýhody, přihlašovatelé si stanovili jako cíl hledat nové způsoby detekce látek v tekutých mléčných produktech, přičemž hledané způsoby by měly dovolovat spolehlivé určení různých druhů zkoumaných látek, výhodně v okamžiku odběru na farmě. Přihlašovatelé tedy hledali způsob, který by dovoloval velmi rychle získat spolehlivé a citlivé výsledky po provedení omezeného počtu jednoduchých kroků, které by nevyžadovaly obzvláštní dovednosti v provádění experimentů. Kromě toho přihlašovatelé hledali způsob, který by dával výsledky snadno zjistitelné vizuálně a dovolovaly mimoto provádět kvantitativní analýzu pomocí měření přístroji.
Přihlašovatelé nyní zjistili, že tohoto cíle je možno dosáhnout díky použití nového testovací zařízení, které dovoluje snadno zjišťovat přítomnost zkoumaných látek v tekutých mléčných produktech, konkrétně v mléce.
Podstata vynálezu
Vynález se týká testovacího zařízení, které dovoluje detekovat přítomnost zkoumaných látek v tekutých mléčných produktech na základě kapilární tečné migrace uvedeného mléčného produktu. Testovací zařízení podle předloženého vynálezu zahrnuje pevný nosič (1), který má první konec a druhý konec, na kterém jsou připevněny, postupujíce postupně od prvního konce, membrána (2) dovolující purifikaci analyzované kapaliny, φ
Φ*Φ· φφφ φφφ φφ · membrána (3) na které jsou imobilizovány jedna nebo více záchytných látek, a absorbční membrána (4), přičemž membrána (2) je schopná zadržovat látky, přítomné v mléčném produktu, která zabraňují migraci zkoumaných látek, popřípadě přítomných v mléčném produktu a detekčních reagentů použitých v prováděném způsobu, testovacím zařízením, a to během kapilární tečné migrace vzorku po navlhčení prvního konce testovacího zařízení v analyzovaném mléčném produktu.
V konkrétním provedení předloženého vynálezu testovací zařízení podle předloženého vynálezu obsahuje dále membránu (5) na které je nanesen alespoň jeden detekční reagent a tento detekční reagent je schopen se rychle rozpouštět v přítomností uvedeného mléčného produktu. V tomto konkrétním provedení membrána (5) musí být umístěna před membránou (3) . Může být umístěna například buď před membránou (2) na prvním konci zařízení a nebo mezi membránou (2) a membránou (3) nebo také pod nebo nad membránou (2).
Různé membrány použité v testovacím zařízení podle předloženého vynálezu se překrývají na svých koncích tak, aby zajišťovaly kontinuální migraci mléčného produktu z jedné oblasti do druhé. Výhodně je membrána (3) umístěna tak, aby její blízký konec byl umístěn pod membránou (2) a její vzdálený konec byl umístěn pod membránou (4). Membrány mohou být popřípadě udržovány v kontaktu jedna s druhou díky adhezivní plastové fólii (6). V tomto případě se adhezivní plastová fólie volí tak, aby neovlivňovala migraci kapaliny testovacím zařízením.
-10• · · tf··· ··* *· • * » « • · · tf···
Možnost zakrýt testovací zařízení adhezivní plastovou fólií přináší dvě výhody: zajišťuje dokonalý kontakt membrán v místě překrývání a představuje ochranu zařízení. Adhezivní plastová fólie (6) může buď úplně zakrývat membrány (2), (3) , (4} a (5) nebo částečně zakrývat jednotlivé membrány. Výhodně adhezivní plastová fólie (6) nezakrývá prvních několik milimetrů prvního konce, tak aby byla umožněna rychlejší migrace kapaliny membránou (2) testovacího zařízení. „
Obrázky 1 až 3 ilustrují příklady testovacích zařízení podle předloženého vynálezu. Obrázky la, 2 a 3 představují pohled zpředu a Obrázek lb představuje pohled v podélném řezu. Pevný nosič (1) přítomný v testovacím zařízení podle předloženého vynálezu je vyroben ze skla nebo plastu, výhodně z plastu. V případě nosiče z plastu je jeho tloušťka obecně v rozmezí od 0,05 do 1 mm, s výhodou od 0,1 do 0,6 mm. Membrány jsou připevněny na pevném nosiči (1) přilepením.
Membrána (2) může být různých typů. Na jedné straně musí být schopna zadržovat látky přítomné v mléčném produktu, které zabraňují migraci zkoumaných látek, popřípadě přítomných v mléčném produktu a detekčních reagentů použitých v prováděném způsobu, testovacím zařízením. Na druhé straně musí dovolovat rychlou migraci zkoumaných látek a detekčních reagentů testovacím zařízením, přičemž musí zachovávat aktivitu těchto zkoumaných látek a detekčních reagentů během uvedené migrace. Neomezující příklady membrán, dovolujících získat tyto výsledky jsou
-11000 0 * * V 0 *
0 0· ···· • 0 9 9
09· 09 0 ·♦ *
0 0 ·
0« 0*
Cytosep 1663 a Leukosorb LK4 (dodavane společnosti Pall Gelman Sciences), GF/D, GF/DVA, 17CHR (dodávané společností Whatmann) a skleněná vlákna typu GF141 (dodávaná společností Alstrom).
Výhodně používaná membrána netkaných polyesterových leukocytů z klinických cerebrospinální tekutiny, filtrací tekutiny při membránou.
Leukosorb je membrána vyráběná z vláken, určená na zadržování vzorků krve, moči, slin a K zadržování leukocytů dochází jejím transverálním průstupu
Přihlašovatelé neočekávaně zjistili, že tento typ membrán také dovoluje zajistit funkci, která je velmi důležitá pro detekci hledaných látek v mléčném produktu pomocí testovacího zařízení podle předloženého vynálezu, totiž zadržování látek přítomných v mléčných produktech, které zabraňují dobrému průběhu testu detekce, prováděného kapilární tečnou migrací mléčného produktu na uvedeném testovacím zařízení, přičemž současně dovoluje rychlou migraci hledaných látek a detekčních reagentů.
K tomu aby mohla fungovat tímto optimálním 2působem, membrána (2) musí být dostatečně dlouhá, aby dovolila eliminaci všech látek přítomných v mléčných produktech, které zabraňují rychlé migraci hledaných látek a detekčních reagentů testovacím zařízením.
Membrána (3) musí dovolovat imobilizaci jedné nebo více záchytných látek a musí dovolovat rychlou migraci vzorku mléčného produktu po průchodem membránou (2). S výhodou je
-120000 * · · · · »
0 0 0 ···* · · • 0 0 · *
0·· ·« ♦ * · » «0 ·
0 « membrána (3) vytvořena na neporézním nosiči typu polyesteru. Neomezující příklady vhodných membrán podle předloženého vynálezu jsou nitrocelulózové membrány se zvýšenou kapilární rychlostí jako jsou membrány Hi-Flow (dodávané společností Millipore), výhodně membrány Hi-Flow typu SX nebo ST. Tyto membrány dávají optimální výsledek spolu s membránami (2), které byly popsány výše.
Jedna nebo více záchytných látek se imobilizuje na membráně (3) . Typ imobilizované záchytné látky závisí pochopitelně na způsobu použitému pro detekci hledaných látek; záchytné látky jsou schopné imobilizovat selektivně alespoň jednu složku přítomnou v tekutině, migrující na testovacím zařízením, jako je například jeden z detekčních reagentů nebo produkt vzniklý vytvořením komplexu mezi hledanou látkou nebo látkou analogickou této hledané látce a alespoň jedním detekčním reagentem nebo také produkt vzniklý vytvořením komplexu více detekčních octěny una látka může také být jedním z detekčních reagentů. Záchytné látky se umístí koncentrovaným způsobem na přesně definované jedné části nebo více částech membrány (3), jako jsou tenké kruhy nebo pásy nebo jakýkoli jiný motiv vhodný pro danou aplikaci. Ať je zvolený motiv jakýkoli, musí umožňovat zřetelné odečtení výsledku.
Co se týče rozměrů, membrána (3) musí mít dostatečnou délku k tomu, aby obsahovala všechny použité záchytné látky a to v pořadí a v množství požadovaném použitým způsobem detekce.
Typ membrány, použitý pro membránu (4} není příliš
-13důležitý, dokud je tato membrána schopna absorbovat a uchovávat kapalinu po jejím průchodu předchozími membránami. Membrána (4) má dostatečně velkou velikost k absorbci kapaliny po jejím průchodu membránou (3), ale také z praktického hlediska takovou, aby dovolovala snadnější uchopení testovacího zařízení.
Testovací zařízení podle předloženého vynálezu může také popřípadě zahrnovat membránu (5), na které je nanesen alespoň jeden detekční reagent. Membrána (5) musí dovolovat migraci mléčného produktu a přitom dovolovat solubilizaci a uvolňování detekční reagent (nebo detekčních reagentů) během průchodu proudu mléčného produktu. Neomezující příklady membrán, které mohou být vyhovující k tomuto účelu jsou: membrány na bází pryskyřic ve skelných vláknech jako jsou membrány T5NM (dodávané společností Millipore), membrány F075-14 nebo F015-17 nebo GF/C (dodávané společností Whatman) , memhrána Cytosep 1653 (dodávaná společností Pall Gelman Sciences), membrány na bázi pryskyřic v polyesterových vláknech jako jsou membrány Accuwick (dodávané společností Pall Gelman Sciences), celulózový papír 3 mm (dodávaný společností Whatman) nebo nakonec membrány typu Release Matrix PT-R2 (dodávané společností Advances Micro Devices). Výhodně se používají membrány na bázi pryskyřic v polyesterových vláknech, jako jsou membrány Accuwick. Membrána (5) má délku dostatečnou pro požadované množství detekčního reagentů.
Testovací zařízení podle předloženého vynálezu jsou vyráběna způsoby známými odborníkům. Je možné například připravit desky pomocí komerčně dostupných laminačních
-14zařízení. Použité záchytné látky se nanášejí na membránu (3) ve formě roztoků, před nebo po sestavení karet. Nanášení těchto roztoků může být prováděno velice přesnými způsoby s použitím komerčně dostupných zařízení, jako je například Dispenser X-Y Platform Biojet Quanti-3000 společnosti Bio Dot, lne. Tyto nanesené roztoky se okamžitě odpaří, například umístěním karty do proudu teplého vzduchu. Pro výrobu ve velkém měřítku je možno také připravovat role. Nakonec se karty a role nesoucí požadované záchytné látky nastříhají na pásky a každý z těchto pásků představuje testovací zařízení podle předloženého vynálezu.
Pokud testovací zařízení zahrnuje membránu (5), detekční reagent nebo reagenty mohou být naneseny před sestavením karet nebo rolí prostým ponořením membrány (5) do roztoku obsahujícího detekční reagent nebo reagenty. Alternativně mohou být naneseny po sestavení karet nebo rolí způsoby analogickými způsobům použitým pro nanášení záchytných látek na membránu (3) .
V alternativním provedení předloženého vynálezu, se zařízení umístí do plastového obalu, který má dva otvory: první ve tvaru misky, se nachází přímo nad membránou (2) a dovoluje příjem kapaliny, určené k analýze; druhý je okénko, které umožňuje vizualizaci výsledků na membráně (3). V tomto případě testovací zařízení neobsahuje adhesivní plastovou fólii (6).
Testovací zařízení podle předloženého vynálezu dovoluje detekovat přítomnost hledaných látek v tekutém mléčném
-15produktu, obzvláště v mléku.
Z uvedených důvodů se předložený vynález také týká způsobu detekce látek v tekutém mléčném produktu, používajícího testovací zařízení podle předloženého vynálezu a detekční reagenty, který sestává z následujících kroků:
a) uvedení určeného objemu mléčného produktu do kontaktu s testovacím zařízením podle předloženého vynálezu, přičemž k tomuto kontaktu dochází na prvním konci testovacího zařízení,
b) tečná migrace mléčného produktu na testovacím zařízení na základě kapilarity taková, že hledané látky a detekční reagenty, které jsou popřípadě přítomné v mléčném produktu procházejí postupně membránou (2) , potom membránou (3) tak, že složky mléčného produktu, které nejsou zastaveny membránami (2) a (3) skončí v membráně (4), a
c) určení fixace na membráně (3).
Způsob podle předloženého vynálezu dovoluje detektovat hledané látky v tekutém mléčném produktu, například mléce, syrovátce, podmáslí, . . . Předložený vynález se týká obzvláště detekce látek jako jsou veterinární léčiva, hormony nebo proteiny, o kterých se předpokládá, že jsou přítomny v mléku.
Detekční reagenty použité ve způsobu podle předloženého vynálezu mohou být použity v různém počtu a mít odlišnou povahu v závislosti na způsobu provedení předloženého vynálezu, který vychází z použité detekční metody. Způsob podle předloženého vynálezu používá alespoň dva detekční *
4
-164 ···· •
*44 w » 4 4 4 4 4 *
4·· · * · • 44 · * 4 4 · • 4 ·· reagenty. První detekční reagent je rozpoznávací činidlo, které specificky rozpoznává hledanou látku a bude nadále nazýván „identifikační činidlo. Druhý detekční reagent je činidlo, používané pro označení a bude nadále nazýván „označovací činidlo. Je třeba podotknout, že v závislosti na zvoleném způsobu provedení mohou být jisté detekční reagenty presentovány na membráně (3) nebo na membráně (S). V závislosti na povaze látky, která je určována, a na použitých detekčních reagentech se může stát, že je nutno přidat jeden nebo více dalších detekčních reagentů před krokem uvedení mléčného produktu do kontaktu s testovacím zařízením podle předloženého vynálezu a udržovat směs v podmínkách inkubace, které dovolují vytvoření komplexu detekčních reagentů a hledané látky nebo látky analogické hledané látce. V závislosti na použitém způsobu mohou být identifikační činidlo a označovací činidlo spojeny nebo mohou představovat tutéž látku.
Na druhé straně může být použito více identifikačních činidel a/nebo označovacích činidel.
Identifikačních činidlo dovoluje detekci přítomnosti typu hledané látky díky svojí schopnosti rozpoznávat specificky tuto hledanou látku nebo látku analogickou této hledané látce. Může se jednat o receptor schopný vytvářet selektivně stabilní a v zásadě ireverzibilní komplex s hledanou látkou nebo o monoklonální nebo polyklonální protilátky specifické k hledané látce nebo látce analogické hledané látce. Pro detekci antibiotik může být identifikační činidlo zvoleno ze souboru, zahrnujícího specifické monoklonální nebo polyklonální protilátky nebo
-17receptory získané z mikroorganismů citlivých na antibiotika, jako jsou receptory získané z druhů Bacillus (Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, ...) Streptococcus (Streptococcus thermophilus, ...), Actinomycetes (Actinomadura R39, .
Ve výhodném provedení předloženého vynálezu se používá identifikační činidlo, které zahrnuje receptor citlivý na antibiotika s β-laktamovým jádrem získaný z Bacillus licheniformis, jako je například receptor BlaR nebo receptor BlaR-CTD. Izolace a peptidová sekvenace proteinu BlaR jsou popsány v Y. ZHU a kol., J. Bacteriol., 1137-1141 (1990); receptor BlaR-CTD je karboxy-terminální oblast BlaR, jehož izolace a peptidová sekvenace jsou popsány v B. JORIS a kol., FEMS Microbiology Letters, 107-114 (1990).
Použití receptorů BlaR nebo BlaR-CTD podle předloženého vynálezu pro detekci antibiotik s β-laktamovým jádrem přináší významné výhody ve srovnání s rozpoznávacími činidly používanými do současné doby. Receptory BlaR a BlaR-CTD jsou totiž schopny komplexovat velmi rychle s velkým množstvím antibiotik a to při teplotách inkubace nižších než jsou teploty nutné pro známá rozpoznávací činidla, jako jsou například receptory získané z Bacillus stearothermophilus.
Druhý typ použitého detekčního reagentu je označovací činidlo, které dovoluje vizualizaci a přímou nebo nepřímou kvantifikaci přítomnosti hledané látky v mléčném produktu. Označovací činidla, použitelná ve způsobu podle
-18fl··· fl ··· » · · · · fl flflfl fl ·· · fl · ···· · fl flfl · flfl · · · · fl • fl fl flfl flfl předloženého vynálezu mohou být částicová, fluorescenční, radioaktivní, luminescenční nebo enzymatická. Konkrétní označovací činidlo se výhodně zvolí tak, aby poskytovalo snadno detekovatelný vizuální signál, dokonce i pokud je přítomno v malém množství. Jako neomezující příklady je možno uvést kovové koloidální částice (platina, zlato, stříbro a podobně), koloidální částice selenu, uhlíku, síry, teluru nebo dále obarvené syntetické latexové koloidální částice. Obzvláště výhodné jsou koloidální částice zlata o průměru částic v rozmezí od 1 do 60 nm: tyto částice poskytují silné růžovo-červené zabarvení, které je snadno detekovatelné.
Označovací činidlo dovoluje určit přítomnost hledané látky ve vzorku mléčného produktu díky své vazbě na jeden nebo více detekčních reagentů, hledaných látek nebo látek analogických hledané látce.
Vazba mezi označovacím činidlem a detekčním reagentem může být dosažena způsoby známými odborníkům v oboru. Pokud se používá částicové označovací činidlo, k označování může docházet buď přímou adsorpcí na částicích, nebo nepřímo na základě chemického zakotvení, jako je například komplex biotin/antí-biotin. K této vazbě může dojít buď v etapě uvedení mléčného produktu do kontaktu s testovacím zařízením podle předloženého vynálezu nebo během migrace mléčného produktu na testovacím zařízení podle předloženého vynálezu.
V konkrétním provedení předloženého vynálezu se používá třetí typ detekční reagentů, dále označovaný jako
-19tttttttt tttt* • * · * • · · tttt»· • · · ·· * • · · · tttt tttt * • tttt tt • tt tttt „referenční činidlo. Jedná se o látku, přidanou ve známém množství do analyzovaného vzorku, která se fixuje na specifickou záchytnou látku imobilizovanou na membráně (3). Referenční činidlo vytváří pruh, jehož intenzita slouží jako reference pro kvantifikaci hledané látky.
Ke kontaktu mléčného produktu s testovacím zařízením podle předloženého vynálezu (etapa a) způsobu podle předloženého vynálezu) dochází umístěním testovacího zařízení podle předloženého vynálezu do recipientu, na jehož dně se nachází analyzovaný vzorek. Testovací zařízení se vloží v zásadě vertikálně do nádoby, tak aby první konec zařízení byl v kontaktu se směsí.
V provedení vynálezu, ve kterém se používá testovací zařízení uložené v plastovém obalu, se testovací zařízení vloží horizontálně a uvedení do kontaktu se provádí nanesením alikvotu analyzovaného vzorku do otvoru vp formě misky, který se nachází nad membránou (2).
Pro provedení kroku migrace b) e kapalina ponechá migrovat prostřednictvím kapilarity na testovacím zařízení podle předloženého vynálezu. Kapalina, která migruje prostřednictvím kapilarity na testovacím zařízení podle předloženého vynálezu se setká nejprve s membránou (2) , která umožňuje zadržet látky, které se nachází v mléčném produktu a které zabraňují migrace hledané látky nebo látek, které jsou popřípadě přítomny v mléčném produktu a detekčních reagentů na testovacím zařízení. Hledané látky a detekčních reagenty migrují potom na membráně (3), na které je imobilizována jedna nebo více záchytných látek. Záchytné
-20látky selektivně imobilizují alespoň jednu složku, která se nachází v analyzované kapalině. V konkrétním provedení předloženého vynálezu se používá záchytná látka umístěná na konec dráhy migrace kapaliny na membráně (3), která je schopná fixovat všechna označovací činidla, která nebyla zastavena předcházejícími záchytnými látkami. Tato záchytná látka dovoluje kompletovat kvantitativní informace, pocházející od předcházejících záchytných látek.
Určení fixace na membráně (3) (etapa c) způsobu podle předloženého vynálezu) se provádí jednoduše určením přítomnosti označovacích činidel v této oblasti. Toto určení je možné snadno vizuálním způsobem. Nicméně pokud je požadováno získání přesných hodnot intenzity pozorovaných signálů, je možno použít zařízení, které umožňuje přesné stanovení intenzity pozorovaných signálů. Pokud se používá referenčního činidla, je toto fixováno specifickou záchytnou látkou, která dává vnitřní referenci pro měření intenzity pozorovaných signálů.
Interpretace získaného výsledku závisí na použitém způsobu detekce, to jest na použitých detekčních reagentech a záchytných látkách.
Ve srovnání se způsoby detekce látek v mléku, které byly dříve popsány v literatuře má způsob podle předloženého vynálezu následující výhody. Především je tento způsob velmi rychlý a extrémně jednoduchý pro provádění: v zásadě sestává ze dvou etap jednoduché manipulace, které nevyžadují žádných zvláštních experimentálních dovedností. Poté následující kvalitativní a kvantitativní zhodnocení
-21. .. « « v · ' * * · *«« · · · · • · » · « ···· · * · · · * · ··· · · * * ·»»» ··· ·· · »· *· výsledku je okamžité a nevyžaduje dodatečné zvláštní operace, jako jsou operace, které jsou nutné pokud se detekce provádí enzymatickými barvivý a/nebo označovacími činidly. Mimoto je způsob přímo použitelný pro detekci různých typů hledaných látek. Nakonec, v provedení, které používá referenční činidlo, je výsledek přímo interpretovatelný a kvantifikovatelný, aniž by bylo třeba používat jeden nebo více referenčních testů.
Předložený vynález se týká také testovací soupravy pro detekci látek v mléčných produktech, která zahrnuje testovací zařízení podle předloženého vynálezu. V případě potřeby testovací souprava podle předloženého vynálezu může také obsahovat detekční reagenty, které se přidávají do vzorku před jeho uvedením mléčného produktu do kontaktu s testovacím zařízením.
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady ilustrují různé předměty a způsoby provedení předloženého vynálezu, aniž by jeho rozsah jakýmkoli způsobem omezovaly.
Příklad 1. Výroba testovacího zařízení. Obecné způsoby provedení.
1.1. Sestavení membránových karet.
Karty o velikosti 300 x 76,2 mm se napřed sestaví použitím laminačního zařízení typu Chlarnshell Laminator (dodávané společností Bio Dot, lne.) postupujíce následujícím
-22·· . i · · «·· • : ·: :··:· ·: ϊ: :
*··· ··· ·· * ·· ·· způsobem:
Vyřízne se obdélník z plastového nosiče typu ArCare 8565 (dodávaného společností Adhesive Research) o rozměrech 300 x 76,2 mm (pevný nosič (1)). Potom se vyřízne obdélník membrány Leukosorb LK4 (dodávané společností Pall Gelman Sciences) o rozměrech 300 x 20 mm (membrána (2)), obdélník membrány Hi-Flow SX (dodávané společností Míllipore) o rozměrech 300 x 25 mm (membrána (3)), obdélník membrány z celulózy 3 mm (dodávané společností Whatmann) o rozměrech 300 x 40 mm (membrána (4)) a obdélník membrány Accuwick (dodávané společností Pall Gelman Sciences) o rozměrech 300 x 0,8 mm (membrána (5)).
Membrány (2) a (4), potom (5) a potom (3) se postupně uloží na specifické místo spodní formy laminačního zařízení. Pevný nosič (1) pokrytý lepidlem je sám o sobě uchováván v příklopu tohoto zařízení. Lepivá strana nosiče je vystavena na vzduchu. Membrány uložené v spodní formě se uvedou do kontaktu s lepivým nosičem uzavřením laminačního zařízení; membrány se udržuji přesně na svých místech pomocí podtlaku vytvářeného vývěvou. Po přerušení vytváření podtlaku se vyjme karta, tvořená pevným nosičem (1), na kterém jsou připevněny membrány (2), (3), (4) a (5).
1.2. Nanesení záchytných látek na membránu (3).
Nanesení záchytných látek na membránu (3) se provádí před nebo po provedení sestavení karty podle příkladu 1.1.
Připraví se vodný roztok, obsahující záchytnou látku.
-234444 4 • 4 4 4 4 · « 4 • 4 9 4 4 a 4 4 4
44 ······ «4 « • 44 4 4444
44 4 44 >4
Roztok se nanese na membránu (3) membránové karty, připravené v příkladu 1.1. prostřednictvím nanášecího zařízení typu X-Y Platform Biojet Quanti-3000 společnosti Bio Dot, lne.
Nanesené roztoky se okamžitě odpaří umístěním souboru karty na několik minut do proudu vzduchu o teplotě 60 °C.
1.3. Nanesení označovací látky na membránu (5).
a) Před sestavením podle příkladu 1.1.
Připraví se vodný roztok obsahující označovací látku. Membrána (5) se vnoří do tohoto roztoku. Potom se membrána odkape, a potom suší pří teplotě okolí za podtlaku 0,5 baru.
b) Po sestavení podle příkladu 1.1.
Postupuje se způsobem, který byl popsán v příkladu 1.2. pro nanášení záchytných látek.
1.4. Připevnění adhezivní plastové fólie (6).
Vystřihne se obdélník adhezivní fólie typu ArCare 7759 (dodávané společností Adhesive Research) o rozměrech 300 x mm pro částečné zakrytí nebo a 300 x 71,2 mm pro zakrytí všech membrán.
Karta získaná v příkladu 1.1 se umístí do spodní formy laminačního zařízení a adhezivní fólie se umístí do příklopu laminačního zařízení, přičemž lepivá strana je vystavena do vzduchu. Adhezivní plastová fólie se uvede do kontaktu s membránovou kartou po uzavření zařízení.
• · φ · φ
-24• ·Φ« φφφ φφφ · • φφφφ φ φ • φ · φ ♦* φφ
1.5. Vystřižení pásků.
Karty získané výše popsaným sestavením se nastříhají na pásky pomocí zařízení typu guilotiny nebo pomocí rotačního zařízení (dodávané společností Bio Dot, Kinematic nebo Akzo). Pásky vzniklé z konců karet jsou vyhozeny, ostatní pásky jsou připraveny k použití.
Pro uchovávání se testovací zařízení podle předloženého vynálezu umístí do neprůhledné a hermeticky uzavřené nádoby v přítomností vysušovacího činidla (Silgelac, Francie).
1.6. Uložení do plastového obalu.
Testovací zařízení se umístí do plastového obalu, který má dva otvory: první, ve tvaru misky, se nachází přímo nad membránou (2) a dovoluje přijímat kapalinu určenou k analýze; druhým je okénko, které dovoluje vizuální odečítání výsledků na membráně (3).
Příklad 2. Detekce antibiotik s β-laktamovým jádrem v mléku pomocí enzymu R39.
2.1. Identifikační činidlo.
Identifikační činidlo použité v tomto příkladu je rozpustná exobuněčná D-alanyl-D-alanin-karboxypeptidáza produkovaná organismem Actinomadura R39, získaná způsobem, který popsali J.-M. FRERE a kol., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18(4), 506- 510 (1980).
• flfl « *···· · ·
-25• ••fl ·«· fl • · « · * • fl <
• · 1 • fl flfl
2.2. Vazba identifikačního činidla na označovací činidlo.
2.2.1. Biotínylace identifikačního činidla.
250 μΐ vodného roztoku enzymu R39 o koncentraci 1 mg/ml se díalyzuje po 24 hodin proti 500 ml pufru HNM (Hepes 10 mM, pH 8, NaCl 10 mM, MgCl2 dialyzovaného enzymu R39 hydrogenuhličitanového pufru mM). Do tohoto roztoku se potom přidají 2 ml (0,1 M hydrogenuhličitanu sodného, pH 9) a 250 μΐ roztoku N-hydroxy-sukcinimidového esteru kyseliny 6-(biotinamido)kapronové 5 mg/ml v bezvodém DMF. Tento roztok se jemně míchá ve válcovém míchači s rotační osou typu LABINCO (dodávaný společností VEL, Belgie) rychlostí 2 otáčky za minutu po dobu 3 hodin při teplotě okolí a chráněný před světlem. Takto získaný roztok se potom dialyzuje proti pufru HNM (Hepes 100 mM; pH 8, NaCl 100 mM, MgCl2 50 mM) po dobu 24 hodin. Tímto způsobem se získá roztok biotinylovaněho enzymu R3S, který se zředí v pufru HNM-BSA (Hepes 500 mM; pH 8, NaCl 500 mM, MgCl2 250 mM, BSA 10 mg/ml) až do dosažení koncentrace 100 μς enzymu R39 na ml pufru. Tento roztok se uchovává při teplotě -20 °C.
2.2.2. Označovací činidlo.
Jako označovací činidlo se používají částice zlata, které mají průměr 40 nm, na které byly naneseny kozí protilátky proti biotinu ve formě suspenze ve vodném roztoku tetraboritanu sodného 2 mM při pH 7,2, stabilizované nitridem sodným 0,1% (dodáváno společností BRITISH BIOCELL (Ref. GAB40) . Optická hustota této suspenze pří 520 nm je « ···· • ·
-26«··« ·*· • · · · • · · · ·· ·· zhruba 10 a koncentrace proteinu je zhruba 24 gg/ml.
2.2.3. Vazba biotinylovaného identifikačního činidla k označovacímu činidlu.
Roztok A pro rychlý test
Roztok biotinylovaného enzymu R39f připraveného v příkladu
2.2.1. se zředí 25 násobně pufrem HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCl 500 mM, MgCl2 250 mM, ΒΞΑ 10 mg/ml) . Při teplotě okolí se smíchá 17,5 objemových částí tohoto zředěného roztoku biotinylovaného enzymu R39, 9,27 objemových částí suspenze částic zlata, sloužících jako označovač enzymu R39 a 6 objemových částí suspenze referenčních částic zlata (viz příklad 2.3).
Roztok B pro citlivý test
Roztok biotinylovaného enzymu R39, připraveného v příkladu
2.2.1. se zředí 50 násobně pufrem HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCl 500 mM, MgCl2 250 mM, BSA 10 mg/ml) . Při teplotě okolí se smíchá 17,5 objemových částí tohoto zředěného roztoku biotinylovaného enzymu R39, 9,27 objemových částí suspenze částic zlata, sloužících jako označovač enzymu R39 a 6 objemových částí suspenze referenčních částic zlata (viz příklad 2.3).
2.3. Referenční činidlo
Jako referenční činidlo se použijí částice zlata o průměru nm na které byly naneseny kozí protilátky proti t * ··♦· ···· * - — * λ. * * * a a · *
• · ···· ··· w » w • * «· • · « * ··
částice j sou dodávány
GAR40) ve formě suspenzí
králičímu imunoglobulinu. Tyto společností BRITISH BIOCELL (Ref. ve vodném roztoku tetraboritanu sodného 2 mM při pH 7,2, stabilizované nitridem sodným 0,1%. Optická hustota této suspenze při 520 nm je zhruba 3 a koncentrace proteinu je zhruba 6 pg/ml.
2.4. Záchytné látky.
2.4.1. První záchytná látka.
ml· roztoku obsahujícího 213 mg lidského gamaglobulinu (G4386, Sigma) a 8,6 mg hydrochloridu 2-iminothiolanu (Aldrich, 33056-6) v pufru uhličitanu sodného (100 mM, pH 9) se inkubují po jednu hodinu při teplotě 25 °C.
Odděleně se inkubuje po jednu hodinu při teplotě 25 °C 20 ml roztoku obsahujícího 119,8 mg cefalosporinu-C a 54 mg sulfosukcinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyklohexan-1karboxylátu (sSMCC, 22322 Pierce) v pufru uhličitanu sodného (100 mM, pH 9).
Dva roztoky, které byly připraveny dříve se potom smíchají. pH vzniklého roztoku se upraví na 7,1 přidáním 3 ml NaH2PO4 500 mM a inkubuje se po dvě hodiny při teplotě 25 °C. Směs získaná po inkubaci se dialyzuje třikrát proti 1 litru pufru fosforečnanu sodného (10 mM, pH 7,5). Vzniklý roztok se filtruje na filtru 0,22 pm, potom se alikvotuje a zmrazí při teplotě -20 °C až do použití.
Při použití se alikvoty rozmrazí a přidá se potravinářské
-28♦»·· 000 · · * 0 0 0000
0 0
0
0 0 *
0 0 0
0 0 0
00 barvivo před uskutečněním nanesení na membrána aby byla v každém okamžiku zaručena přesná poloha nanesení a kvalita stopy.
První záchytná látka dovoluje fixaci identifikačních činidel vázaných na volná označovací činidla přítomná v přebytku vzhledem k množství antibiotik přítomných ve vzorku.
2.4.2. Druhá záchytná látka.
Jako druhá záchytná látka se používá roztok králičího imunoglobulinů (Sigma I 5006) v koncentraci 0,5 mg/ml immunoglobulinu v pufru fosforečnanu sodného 10 mM, pH 7,5, lidský gammaglobulin 5 mg/ml. Tato druhá záchytná látka zachytává referenční činidlo během migrace kapaliny na testovacím zařízení.
2.5. Testovací zařízení.
Používá se testovací zařízení, obsahující membrány (2), (3) a (4), sestavené způsobem, který byl popsán v příkladu 1.1. Membrána (3) tohoto zařízení nese na blízkém konci záchytnou látku popsanou v příkladu 2.4.1. a na vzdáleném konci záchytnou látku popsanou v příkladu 2.4.2. Záchytné látky jsou naneseny způsobem, který byl popsán v příkladu
1.2.
2.5.1. Test 1 - Rychlý test
Připraví se sedm vzorků mléka, které obsahují postupně 0;
• · · · * · ···· • · · *· ·
-29···· ·· • · · * • * * · ·· ·
2; 4; 5; 6; 8 a 10 ppb penicilinu G. Každý z těchto roztoků je potom analyzován následujícím způsobem.
Odebere se alíkvot 200 μΐ vzorku mléka a 32,8 μΐ roztoku A připraveného v příkladu 2.2.3, které se umístí do Eppendorfovy trubice. Tato směs se inkubuje po 3 minuty při teplotě 47 °C. Potom se testovací zařízení umístí vertikálně do Eppendorfovy trubice tak, aby byl první konec testovacího zařízení v kontaktu se směsí. Směs se ponechá migrovat testovacím zařízením a soubor se nechá inkubovat po 2 minuty při teplotě 47 °C.
Níže uvedená Tabulka 1 udává výsledky získané pro 7 vzorků, které byly testovány. Detekovaným pruhům byla přiřazena intenzita v rozmezí od 0 do 10, přičemž hodnota 10 znamená nejintenzivnější pruh a hodnota 0 znamená nejméně intenzivní pruh. V této stupnici byla hodnota 6 přiřazena referenčnímu pruhu. Intenzita signálu pozorovaného v prvním detekčním pruhu je nepřímo úměrná množství penicilínu G, který je přítomen ve vzorku.
Tabulka 1
Penicilín G Intenzita
(PPb) 1. pruh 2
0 10 6
2 8 6
4 5 6
5 3 6
6 2 6
8 1 6
10 0 6
-30• * 4 4·· 4 4 · 4
4 4 * 4 4444 4 4 4 4 4
4 444 4444
4444 444 44 4 44 4·
V tomto příkladu pokud byl první pruh méně intenzivní než referenční pruh, byl test považován za pozitivní. Výsledky uvedené v Tabulce 1 ukazují, že test dovoluje detekovat do 5 minut až do 4 ppb penicilinu G ve vzorku mléka.
2.5.2. Test 2 - Citlivý test.
Bylo připraveno šest vzorků mléka obsahujících postupně 0; 2; 2,5; 3; 4 a 5 ppb penicilinu G. Každý z těchto roztoků byl potom analyzován následujícím způsobem:
Odebere se alikvot 200 μΐ vzorku mléka a 32,8 μΐ roztoku B připraveného v příklad 2.2.3, které se umístí do Eppendorfovy trubice. Tato směs se inkubuje po 5 minut při teplotě '47 °C. Potom se testovací zařízení umístí vertikálně do Eppendorfovy trubice tak, aby první konec testovací zařízení byl v kontaktu se směsí. Směs se ponechá migrovat na testovacím zařízení za inkubace souboru po 2 minuty při teplotě 47 °C.
Tabulka 2 uvedená níže udává výsledky získané pro 7 vzorků, které byly testovány. Detekovaným pruhům byla přiřazena intenzita v rozmezí od 0 do 10, přičemž hodnota 10 znamená nejintenzivnější pruh a hodnota 0 znamená nejméně intenzivní pruh. V této stupnici byla hodnota 6 přiřazena referenčnímu pruhu. Intenzita signálu pozorovaného v prvním detekčním pruhu je nepřímo úměrná množství penicilinu G, který je přítomen ve vzorku.
-31* » · ·» · * · · · • · » * »·«· · · · · • « · · · ···· ··· ··· ·· « ·· ··
Tabulka 2
Penicilín G (ppb)
O
2,5
Intenzita
1. pruh 10
O
2. pruh
V tomto příkladu pokud byl první pruh méně intenzivní než referenční pruh, byl test považován za pozitivní. Výsledky uvedené v Tabulce 2 ukazují, že test dovoluje detekovat do 7 minut až do 2,5 ppb penicilinu G ve vzorku mléka.
Příklad 3. Určení antibiotik .<? β-laktamovým jádrem v mléku pomocí BlaR.
Tento příklad ilustruje detekci antibiotik s β-laktamovým jádrem, které jsou kontrolovány hygienickými úřady, v mléku. Test popsaný v tomto příkladu používá receptor BlaRCTD vázaný na kuličky zlata, které slouží jako označovací činidlo a používá nosič, vytvořený ve formě testovacího zařízení zahrnujícího pevný nosič, na kterém jsou připevněny membrány.
3.1. Vazba BlaR-CTD (identifikační činidlo) na kuličky zlata (označovací činidlo).
4 • 4 ·
* ·
-3244
44*4 ♦·» * · 4 · • · 4 4444 • 4 4 • 4 ·
3.1.1. Biotinylace BlaR-CTD.
3,79 ml vodného roztoku rozpoznávacího činidla BlaR-CTD o koncentraci 6,6 mg/ml se vyjme pufrem fosforečnanu sodného 20 mM pH 1. Do tohoto roztoku BlaR-CTD se potom přidá 41,71 ml hydrogenuhličitanového pufru (0,1 M hydrogenuhličitanu sodného, pH 9) a 2 ml roztoku N-hydroxy-sukcinimidového esteru kyseliny 6-(biotinamido)kapronové 2,23 mg/ml také v hydrogenuhličitanovém pufru. Tento roztok se jemně míchá ve válcovém míchači s rotační osou typu LABINCO (dodávaný společností VEL, Belgie) rychlostí 2 otáčky za minutu po dobu 2 hodin při teplotě okolí a chráněný před světlem. 2,5 ml roztoku pufru Tris 1 M pH 8 se inkubuje s reakční směsí za stejných podmínek po 30 minut. Takto získaný roztok se potom dialyzuje proti pufru HNM (Hepes 100 mM; pH 8, NaCl 100 mM, MgCl2 50 mM) po dobu 24 hodin. Tímto způsobem se získá roztok biotinylovaného BlaR-CTD, který se zředí v pufru HNM-BSA (Hepes 500 mM; pH 8, NaCl 500 mM, MqCl? 250 mM, BSA 10 mg/ml) až do dosažení koncentrace 250 pg BlaRCTD na ml pufru. Tento roztok se uchovává při teplotě -20 °C.
3.1.2. Označovací činidlo.
Jako označovací činidlo se používají částice zlata, které mají průměr 40 nm, na které byly naneseny kozí protilátky proti biotinu ve formě suspenze ve vodném roztoku tetraboritanu sodného 2 mM při pH 7,2, stabilizované nitridem sodným 0,1% (dodáváno společností BRITISH BIOCELL (Ref. GAB40). Optická hustota této suspenze při 520 nm je zhruba 10 a koncentrace proteinu je zhruba 24 pg/ml.
-33• « · · · » * · * · * · · « · ···» · · ·» * • · ·♦· «··· ··*· ··» *« · ·· ♦·
3.1.3. Vazba biotinylovaného BlaR-CTD na kuličky zlata.
Roztok biotinylovaného BlaR-CTD, připraveného v příkladu
3.1.1, se zředí 114,7 násobně pufrem HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCl 500 mM, MgCl2 250 mM, BSA 10 mg/ml). Při teplotě okolí se smíchá 22,5 objemových částí tohoto zředěného roztoku biotinylovaného BlaR-CTD, 7,5 objemových částí pufru HNM-BSA, 9,27 objemových částí suspenze částic zlata, sloužících jako označovač biotinylovaného BlaR-CTD a 6 objemových částí suspenze referenčních částic zlata (viz příklad 3.1.4 uvedený dále).
3.1.4. Nezávislé referenční činidlo
Jako referenční činidlo se použije také referenční látka, která vytváří pruh, jehož intenzita dovoluje rychlé stanovení množství antibiotik, přítomných ve vzorku. Pro tento účel se použijí částice zlata o průměru 40 nm na které byly naneseny kozí protilátky proti králičímu imunoglobulinu. Tyto částice jsou dodávány společností BRITISH BIOCELL (Ref. GAR40) ve formě suspenzí ve vodném roztoku tetraborítanu sodného 2 mM při pH 7,2, stabilizované nitridem sodným 0,1%. Optická hustota této suspenze při 520 nm je zhruba 3 a koncentrace proteinu je zhruba 6 pg/ml.
3.2. Záchytné látky
3.2.1. První záchytná látka - referenční antibiotikum.
ml roztoku obsahujícího 213 mg lidského gamaglobulinu
-34ϊ · » »· » ϊ ♦ ♦ * » · · · · ···· · · · · * • · · » · ···· ·«·· ··· ·« · ·· ·· (G4386, Sigma) a 8,6 mg hydrochloridu 2-iminothiolanu (Aldrich, 33056-6) v pufru uhličitanu sodného (100 mM, pH 9) se inkubuji po jednu hodinu při teplotě 25 °C.
Odděleně se inkubuje po jednu hodinu při teplotě 25 °C 20 ml roztoku obsahujícího 119,8 mg cefalosporinu-C a 54 mg sulfosukcinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyklohexan-1karboxylátu (sSMCC, 22322 Pierce) v pufru uhličitanu sodného (100 mM, pH 9).
Dva roztoky, které byly připraveny dříve se potom smíchají. pH vzniklého roztoku se upraví na 7,1 přidáním 3 ml NaH2PO4 500 mM a inkubuje se po dvě hodiny při teplotě 25 °C. Směs získaná po inkubaci se dialyzuje třikrát proti 1 litru pufru fosforečnanu sodného (10 mM, pH 7,5). Vzniklý roztok se filtruje na filtru 0,22 pm, potom se alikvotuje a zmrazí při teplotě -20 °C až do použití.
Při použití se alikvoty rozmrazí a přidá se potravinářské barvivo před uskutečněním nanesení na membrána aby byla v každém okamžiku zaručena přesná poloha nanesení a kvalita stopy.
První záchytná látka dovoluje fixaci BlaR-CTD vázaného na kuličky zlata, přítomné v přebytku vzhledem k množství antibiotik přítomných ve vzorku.
3.2.2. Druhá záchytná látka - látka schopná fixovat nezávislé referenční činidlo.
Jako druhá záchytná látka se používá roztok králičího
-35« · · · · · · · · · • · « « «···· · · *· · a « «tttt ···· ···· «·· ·· · tt· ·· imunoglobulinu (Sigma I 5006) v koncentraci 0,5 mg/ml immunoglobulinu v pufru fosforečnanu sodného 10 mM, pH 7,5, lidský gammaglobulin 5 mg/ml. Tato druhá záchytná látka zachytává referenční činidlo během migrace kapaliny na testovacím zařízení.
3.3 Testovací zařízení.
Používá se testovací zařízení, obsahující membrány (2), (3) a (4), sestavené způsobem, který byl popsán v příkladu 1.1. Membrána (3) tohoto zařízení nese na blízkém konci záchytnou látku popsanou v příkladu 3.2. a na vzdáleném konci záchytnou látku popsanou v příkladu 3.2.2. Záchytné látky jsou naneseny způsobem, který byl popsán v příkladu
1.2.
3.4. Určení antibiotik v mléku.
3.4.1. Test ve 3 minutách - Rychlý test
Připraví se sedm vzorků mléka, které obsahují postupně 0:l;2;3;4;5 a 6 ppb penicilinu G. Každý z těchto roztoků je potom analyzován následujícím způsobem:
Odebere se alikvot 200 μΐ vzorku mléka a 45,27 μΐ roztoku připraveného v příkladu 3.1.3, které se umístí do skleněné baňky. Testovací zařízení se umístí vertikálně do baňky tak, aby byl první konec testovacího zařízení v kontaktu se směsí a aby druhý konec spočíval na stěně skleněné baňky. Směs se ponechá migrovat testovacím zařízením a soubor se nechá inkubovat po 2 minuty při teplotě 47 °C.
-36• · »··· ··* • fc • fcfc • · fcfc · • fc • · • fc
Níže uvedená Tabulka 1 udává výsledky získané pro 7 vzorků, které byly testovány. Detekovaným pruhům byla přiřazena intenzita v rozmezí od 0 do 10, přičemž hodnota 10 znamená nej intenzivnější pruh a hodnota 0 znamená nejméně intenzivní pruh. V této stupnici byla hodnota 6 přiřazena referenčnímu pruhu. Intenzita signálu pozorovaného v prvním detekčním pruhu je nepřímo úměrná množství penicilinu G, který je přítomen ve vzorku.
Tabulka 1
Penicilín G (ppb)
Intenzita
1. pruh 2
6
6
6
6
6
6 pruh
V tomto příkladu pokud byl první pruh méně intenzivní než referenční pruh, byl test považován za pozitivní. Výsledky uvedené v Tabulce 1 ukazují, že test dovoluje detekovat za 5 minut méně než 4 ppb penicilinu G ve vzorku mléka.
Testy byly také prováděny s dalšími antibiotiky s βlaktamovým jádrem za stejných podmínek. Tento test, trvající 3 minuty dovoluje detekovat amoxicilin až do 5 ppb, ampicilin až do 5 ppb, cloxacilin méně než 10 ppb, dicloxacilin méně než 20 ppb, oxacilin méně než 20 ppb a cefapirin až do 20 ppb ve vzorku mléka.
• · ·
-37·«·· ···
1.3.2. Test v 5 minutách
Bylo připraveno šest vzorků mléka obsahujících postupně 0; 2; 4; 6; 8 a 10 ppb cloxacilinu. Každý z těchto roztoků byl potom analyzován následujícím způsobem:
Odebere se alikvot 200 μΐ vzorku mléka a 45,27 μΐ roztoku připraveného v příkladu 3.1.3, které se umístí do skleněné baňky. Směs se inkubuje po 3 minuty při teplotě 47 °C. Testovací zařízení se umístí vertikálně do skleněné baňky tak, aby byl první konec testovacího zařízení v kontaktu se směsí a aby druhý konec spočíval na stěně skleněné baňky. Směs se ponechá migrovat testovacím zařízením a soubor se nechá inkubovat po 2 minuty při teplotě 47 °C.
Níže uvedená Tabulka 2 udává výsledky získané pro 6 vzorků, které byly testovány. Detekovaným pruhům byla přiřazena intenzita v rozmezí od Q do 10, přičemž hodnota 10 znamená nejintenzivnější pruh a hodnota 0 znamená nejméně intenzivní pruh. V této stupnici byla hodnota 6 přiřazena referenčnímu pruhu. Intenzita signálu pozorovaného v prvním detekčním pruhu je nepřímo úměrná množství cloxacilinu, který je přítomen ve vzorku.
-38- I » · · · • « · · ····· • · · · · ·««« ··· ·· * Φ • · • • <
Cloxacilin Tabulka 2 Intenzita
(ppb) 1. pruh 2. pruh
0 10 6
2 6 6
4 5 6
6 3 6
8 3 6
10 3 6
V tomto příkladu pokud byl první pruh méně intenzivní než
druhý pruh, byl test považován za pozitivní. Výsledky
uvedené v Tabulce 2 ukazují, že test dovoluje detekovat za 5 minut méně než 4 ppb cloxacilinu ve vzorku mléka.
Testy byly také prováděny s dalšími antibiotiky s βlaktamovým jádrem za stejných podmínek. Tento test, trvající 5 minut dovoluje detekovat penicilín G až do 3 ppb, amoxicilin až do 4 ppb, ampicilin až do 4 ppb, dicloxacilin až do 8 ppb, oxacilin až do 8 ppb, cefapirin až do 16 ppb, ceftiofur až do 100 ppb, cefchinon méně než 20 ppb, nafcilin až do 20 ppb a cefazolin až do 60 ppb ve vzorku mléka.
Tento test je obzvláště vhodný jako test před vypouštěním kamionů mléka do nádrží.
1.3.3. Test v 9 minutách
Bylo připraveno 6 vzorků čerstvého mléka obsahujících
« ♦
-39• · •φφ* φφφ postupně 0; 4; 6; 8; 10 a 12 ppb cefapirinu. Každý z těchto roztoků byl potom analyzován následujícím způsobem.
Odebere se alikvot 200 μΐ vzorku mléka a 45,27 μΐ roztoku připraveného v příkladu 3.1.3, které se umístí do skleněné baňky. Směs se inkubuje po 7 minut při teplotě 47 °C. Testovací zařízení se umístí vertikálně do skleněné baňky tak, aby byl první konec testovacího zařízení v kontaktu se směsí a aby druhý konec spočíval na stěně skleněné baňky. Směs se ponechá migrovat testovacím zařízením a soubor se nechá inkubovat po 2 minuty při teplotě 47 °C.
Níže uvedená Tabulka 3 udává výsledky získané pro 6 vzorků, které byly testovány. Detekovaným pruhům byla přiřazena intenzita v rozmezí od 0 do 10, přičemž hodnota 10 znamená nej intenzivnější pruh a hodnota 0 znamená nejméně intenzivní pruh. V této stupnici byla hodnota 6 přiřazena referenčnímu pruhu. Intenzita signálu pozorovaného v prvním detekčním pruhu je nepřímo úměrná množství cefapirinu, který je přítomen ve vzorku.
Tabulka 3
Cefapirin (ppb)
Intenzita
1. pruh
2. pruh
-40V tomto příkladu pokud byl první pruh méně intenzivní než druhý pruh, byl test považován za pozitivní. Výsledky uvedené v Tabulce 3 ukazují, že test dovoluje detekovat za 9 minut až do 6 ppb cefapirinu ve vzorku mléka.
Testy byly také prováděny s dalšími antibiotiky s βlaktamovým jádrem za stejných podmínek. Tento test, trvající 9 minut dovoluje detekovat penicilín G až do 3 ppb, amoxicilín - až do 4 ppb, ampicilin až do 4 ppb, cloxacilin až do 4 ppb, dicloxacilin méně než 8 ppb, oxacilin méně než 8 ppb, ceftiofur až do 80 ppb, cefchinon méně než 20 ppb, nafcilin méně než 20 ppb a cefazolín až do 45 ppb ve vzorku mléka.
Tento test, prováděný za 9 minut tedy dovoluje detekovat všechna antibiotika kontrolovaná v současné době evropskými úřady a to až do zákonných limitů, stanovených těmito úřady.
1.3.4. Test ve 20 minutách
Bylo připraveno šest vzorků čerstvého mléka obsahujících postupně 0; 20; 30; 40; 50 a 60 ppb ceftiofuru. Každý z těchto roztoků byl potom analyzován následujícím způsobem;
Odebere se alikvot 200 μΐ vzorku mléka a 45,27 μΐ roztoku připraveného v příkladu 3.1.3, které se umístí do skleněné baňky. Směs se inkubuje po 18 minut při teplotě 47 °C. Testovací zařízení se umístí vertikálně do skleněné baňky tak, aby byl první konec testovacího zařízení v kontaktu se směsí a aby druhý konec spočíval na stěně skleněné baňky.
-41Směs se ponechá migrovat testovacím zařízením a soubor se nechá inkubovat po 2 minuty při teplotě 47 °C.
Níže uvedená Tabulka 4 udává výsledky získané pro 6 vzorků, které byly testovány. Detekovaným pruhům byla přiřazena intenzita v rozmezí od 0 do 10, přičemž hodnota 10 znamená nejintenzivnější pruh a hodnota 0 znamená nejméně intenzivní pruh. V této stupnici byla hodnota 6 přiřazena referenčnímu pruhu. Intenzita signálu pozorovaného v prvním detekčním pruhu je nepřímo úměrná množství ceftiofuru, který je přítomen ve vzorku.
Tabulka 4
Ceftiofur (ppb)
Intenzita
1. pruh 10
2. pruh 6 6 6 6 6 6
V tomto příkladu pokud byl první pruh méně intenzivní než druhý pruh, byl test považován za pozitivní. Výsledky uvedené v Tabulce 4 ukazují, že test dovoluje detekovat za 20 minut až do 30 ppb ceftiofuru ve vzorku mléka.
Tento test ve 20 minutách tedy dovoluje detekovat v jediném testu všechna antibiotika kontrolovaná v současné době evropskými a americkými úřady a to až do zákonných limitů, stanovených těmito úřady.
«00
00·« • 0 •
Φ
00»
-420 · ·
0 0 • 0 0 « *
Příklad 4. Použití testovacího zařízení v plastovém obalu. Používá se testovací zařízení, které bylo popsáno v příkladu 1.6. V tomto případě se uvedení vzorku do kontaktu s testovacím zařízením provádí nanesením inkubované směsi otvorem ve tvaru misky, která byla k tomuto účelu vytvořena.
Zastupuje:
Dr. Otakar Švorčík r
JUDr. Otakar Švorčík advokát
120 00 Praha 2, Hálkova 2

Claims (22)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Testovací zařízení, dovolující detekovat přítomnost zkoumaných látek v tekutém mléčném produktu na základě kapilární tečné migrace uvedeného mléčného produktu, které zahrnuje pevný nosič (1) , který má první konec a druhý konec, na kterém jsou připevněny, postupujíce postupně od prvního konce, membrána (2) dovolující purifikaci analyzované kapaliny, membrána (3) na které jsou imobilizovány jedna nebo více záchytných látek, a absorbční membrána (4), vyznačující se tím, že membrána (2) je schopná zadržovat látky, přítomné v mléčném produktu, která zabraňují migraci zkoumaných látek, popřípadě přítomných v mléčném produktu a detekčních reagentů použitých v prováděném způsobu, testovacím zařízením, a to během kapilární tečné migrace vzorku po navlhčení prvního konce testovacího zařízení v analyzovaném mléčném produktu.
  2. 2. Testovací zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že membrána (2) je membrána Leukosorb.
  3. 3. Testovací zařízení podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že obsahuje další membránu (5) na kterou byl nanesen alespoň jeden detekční reagent, přičemž membrána (5) je umístěna před membránou (3) .
  4. 4. Testovací zařízení podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že membrány jsou úplně nebo částečně zakryty adhesivní
    9 9*
    9 9·9>
    9 9 • 9
    -44*9·· ··» plastovou fólií (6).
  5. 5. Testovací zařízení podle nároku 4, vyznačující se tím, že plastová fólie (6) nezakrývá první milimetry testovacího zařízení.
  6. 6. Testovací zařízení podle nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že je umístěno do plastového obalu, který obsahuje jeden otvor ve tvaru misky nad membránou (2) a jedno okénko nad membránou (3).
    Ί. Způsob detekce látek v tekutém mléčném produktu, používající testovací zařízení podle kteréhokoli z nároků 1 až 6 a detekční reagenty, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:
    a) uvedení určeného objemu mléčného produktu do kontaktu s testovacím zařízením podle předloženého vynálezu, přičemž k tomuto kontaktu dochází na prvním konci testovacího zařízení,
    b) tečná migrace mléčného produktu na testovacím zařízení na základě kapilarity taková, že hledané látky a detekční reagenty, které jsou popřípadě přítomné v mléčném produktu procházejí postupně membránou (2), potom membránou (3) tak, že složky mléčného produktu, které nejsou zastaveny membránami (2) a (3) skončí v membráně (4), a
    c) určení fixace na membráně (3).
  7. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že detekční reagenty zahrnují alespoň jednu látku schopnou specificky rozpoznávat hledanou látku nebo látku analogickou této
    -45hledané látce a alespoň jedno označovací činidlo.
  8. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že alespoň jedna látka schopná specificky rozpoznávat hledanou látku nebo látku analogickou této hledané látce je vázána s alespoň jedním označovacím Činidlem.
  9. 10. Způsob podle nároků 8 nebo 9, vyznačující se tím, že označovací činidlo je fluorescenční, částicové, radioaktivní, luminescenční nebo enzymatické činidlo.
  10. 11. Způsob podle nároků 7 až 10, vyznačující se tím, že před provedením kroku a) je přidán alespoň jeden detekční reagent.
  11. 12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že směs připravená před krokem a) je udržována za inkubačních podmínek, které dovolují vytvoření stabilního a v zásadě ireverzibílního komplexu jednoho z detekčních reagentů s hledanou látku nebo látku analogickou této hledané látce.
  12. 13. Způsob podle nároků 8 až 12, vyznačující se tím, že detekční reagenty zahrnují navíc alespoň jednu referenční látku.
  13. 14. Způsob podle nároků 7 až 13, vyznačující se tím, že hledaná látka je tetracyklinová látka jako je tetracyklin, oxytetracyklin nebo chlortetracyklin.
  14. 15. Způsob podle nároků 7 až 13, vyznačující se tím, že hledaná látka je buď exogenní protein tekutého mléčného
    Ml
    4 4
    444
    -46• 4 *
    4444
    4 4444 4 · produktu, například cizí protein nebo endogenní protein mléčného produktu, například hormon jako je progesteron nebo růstový hormon.
  15. 16. Způsob podle nároků 7 až 13, vyznačující se tím, že hledaná látka je antibiotikum s β-laktamovým jádrem.
  16. 17. Způsob podle nároku 7 až 13, vyznačující se tím, že hledaná látka je zvolena ze souboru, zahrnujícího benzylpenicilin (nebo penicilín G), ampicilin, amoxicilin, karbenicilin, methylcilin, cloxacilin, 6-APA, monolaktam, aztreonam, mecilínam, cefalexin, cefaloglycín, cefaloridin, nitrocefin, cefatoxim, cefuroxim, ceftíofur, cefapyrin, 7ACA.
  17. 18. Způsob podle nároků 8 až 17, vyznačující se tím, že látka schopná specificky rozpoznávat hledanou látku nebo látku analogickou této hledané látce je zvolena ze souboru, zahrnujícího reeeptory schopné vytvoření stabilního a v zásadě ireverzibilního komplexu s hledanou látku nebo látku analogickou této hledané látce a monoklonální nebo polyklonální protilátky specifické pro hledanou látku nebo látku analogickou této hledané látce.
  18. 19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že látka schopná specificky rozpoznávat hledanou látku nebo látku analogickou této hledané látce je receptor získaný z mikroorganismu citlivého na antibiotika, jako jsou reeeptory získané z orgahismů druhů Bacillus, Streptococus nebo Actinomycetes.
    -4Ί
  19. 20. Způsob podle nároků 18 nebo 19, vyznačující se tím, že látka schopná specificky rozpoznávat hledanou látku nebo látku analogickou této hledané látce je receptor citlivý na antibiotika s β-laktamovým jádrem, získaný z Bacillus licheniformis.
  20. 21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že receptor citlivý na antibiotika s β-laktamovým jádrem, získaný z Bacillus licheniformis, je receptor BlaR nebo receptor BlaR-CTD.
  21. 22. Způsob výroby testovacího zařízení podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že se připraví karty z pevného nosiče (1) pokrytého lepidlem a membrán pomocí laminovacího zařízení, na membránu (3) se nanesou roztoky záchytných látek, potom se karty nastříhají na pásky a každý z pásků představuje jedno testovací zařízení.
  22. 23. Testovací souprava obsahující testovací zařízení podle nároků 1 až 6.
    Zastupuje:
    Λ
    Dr. Otakar Švorčík flfl· fl ··«« • · > · «
    * flfl·· ··· ?V <Z(m> - ίο?) fl* flfl ·· · • fl · • · · • fl
    PŘIHLÁŠKA VYNÁLEZU zveřejněná podle § 31 zákona č. 527/1990 Sb.
    <,19> , (22) Přihlášeno: 06.10.1998
    ČESKA
    REPUBLIKA (32) Datum podání prioritní přihlášky: 07.10.1997 25.06.1998
    ÚŘAD
    PRŮMYSLOVÉHO
    VLASTNICTVÍ (21) Číslo dokumentu:
    2000-1059 (31) Číslo prioritní přihlášky: 1997/9700807 1998/9800485 (33) Zemč priority: βΕ BE (40) Datum zveřejnění přihlášky vynálezu: 13.09.2000 (Věstník č. 9/2000) (86) PCT Číslo: PCT/BE98/00147 (87) PCT číslo zveřejnění: WO99/18439 (13) Druh dokumentu: A3 (51)Int. Cl.’;
    G01N 33/558 G01N 33/543
    CZ 2000-1059 A3 (71) Přihlašovatel:
    UCB BIOPRODUCTS, S. A, Bruxelles, BE;
    (72) Původce:
    Degelaen Jacques, Genappes, BE;
    Frere Jean-Marie, Nantrin, BE;
    Granier Benoit, Esneux, BE;
    Joris Bernard, Spa, BE;
    (74) Zástupce:
    Švorčík Otakar JUDr., Hálkova 2, Praha 2, 12000;
    (54) Název přihlášky vynálezu:
    Testovací zařízení pro provádění analýzy v tekutém mléčném produktu (57) Anotace:
    Řešení se týká testovacího zařízení, které dovoluje detekovat přítomnost zkoumaných látek v tekutém mléčném produktu na základé kapilární tečné migrace uvedeného mléčného produktu, přičemž zařízeni zahrnuje pevný nosič (1), který má první konec a druhý konec, na kterém jsou připevněny, postupujíce postupně od prvního konce, membrána (2), dovolující purifikaci analyzované kapaliny, membrána (3), na které jsou imobilizovány jedna nebo více zachycujících látek, a absorpční membrána (4). Řešeni se také týká způsobu detekce a kvantifikace látek v tekutém mléčném produktu, používajícího testovací zařízení a testovací soupravy, obsahující uvedené testovací zařízení.
    • · fl··· * * » ♦ · · ·· ··
    $.000 - 2osý
    JUDr. Otakar Švorčík advokát
    120 00 Praha 2, Hálkova 2
    Testovací zařízení pro provádění analýzy v tekutém mléčném produktu.
    Oblast techniky
    Vynález se týká testovacího zařízení pro provádění analýzy v tekutém mléčném produktu jako je mléko. Vynález se také týká způsobu provádění detekce a kvantitativního určování látek v mléku použitím uvedeného testovací zařízení a testovací soupravy, obsahující uvedené testovací zařízení.
    Dosavadní stav techniky
    V současné době zdravotní předpisy mrioha zemí vyžadují pravidelnou kontrolu přítomnosti různých látek v mléčných produktech, jako jsou veterinární léky a hormony, běžně používané při chovu dobytka. Ze zřejmých lékařských důvodů se tyto produkty nesmí vyskytovat v mléčných produktech určených pro lidskou spotřebu.
    V jiných případech je žádoucí mít k disposici testy dovolující detekci endogenních látek v mléku pro optimalizaci způsobů chovu dobytka. Konkrétně rychlé určení úrovní hormonů v mléku dovoluje snadno identifikovat období vhodná pro reprodukci.
    Ještě v dalších případech je potřeba praktických a spolehlivých způsobů kontroly původu mléčných produktů získaných z mléka různých zvířecích druhů. Je proto potřeba způsobů, které dovolují identifikaci přítomnosti proteinů v ··♦· *·· mléce, které jsou charakteristické pro jisté druhy ve srovnání s jinými druhy.
    Z literatury jsou známy různé druhy testů pro analýzu biologických tekutin. Tyto testy obecně používají způsoby detekce, které jsou založeny na rozpoznávacím činidlu (receptory nebo protilátky), které specificky rozpoznávají hledanou látku nebo její analog a na značkovacím činidlu (radioaktivní prvek, enzym, fluorescenční činidlo a podobně), které jsou dále označovány jako detekční činidla. V závislosti na zvoleném způsobu se mluví o radioimunologickém testu (RIA), radioreceptorovém testu (RRA), enzymovém imunologickém testu (EIA) a podobně. Ve svém obecném principu tyto testy využívají minimální kombinaci dvou výše uvedených prvků (detekčních činidel), která umožní získat výsledek, jehož hodnota indikuje množství zkoumané látky, které je přítomno.
    Je vhodné poznamenat, že v závislosti na použitém způsobu detekce může být označující činidlo spojeno buď s rozpoznávacím činidlem nebo s testovanou látkou nebo s látkou, která je analogická testované látce z hlediska rozpoznávání použitým rozpoznávacím činidlem. Existují také testovací způsoby, ve kterých rozpoznávací činidlo nebo testovaná látka nebo látka analogická testované látce obsahují v sobě označovací činidlo (například radioaktivně označená testovaná látka).
    U mléčných produktů se nejčastěji popisované testy týkají detekce antibiotik. Je totiž dobře známo, že antibiotika pěstitelé používají pro léčbu jistých infekčních onemocnění • te
    - 3 ··· ·*· • · te te te dobytka.
    Ze zřejmých lékařských důvodů mléko určené k lidské spotřebě musí v principu být prosté všech antibiotik. Mimo jiné koncentrace penicilinu 0, 005 U/ml nebo méně může mít škodlivé důsledky v průběhu výroby produktů odvozených z mléka, jako je sýr, jogurt a podobně.
    Může být předvídána řada situací. Například v prvním případě pro detekci přítomnosti antibiotik na farmě před převedením do kamionu, bude mít prioritu extrémně rychlý (méně než 5 minut) a jednoduchý test. Použití rychlého testu může být také vhodné jestliže například antibiotikum, které bylo použito pro ošetření je známé a jestliže dále uvedený test dovoluje detekci uvažovaného antibiotika podle zákonné normy. V opačném případě, pokud na rychlost není dáván důraz, je důležité detekovat většinu nebo všechna antibiotika v zákonných normách.
    Zákonné úpravy některých zemí stanoví přesně stanovené kvalitativní normy. Například americké úřady vyžadují, aby koncentrace šesti dále uvedených antibiotik v mléku nepřekračovaly přesně určené hodnoty: penicilín, 5 ppb; ampicilin, 10 ppb; amoxicilin, 10 ppb; cloxacilin, 10 ppb; cefapirin, 20 ppb; ceftiofur, 50 ppb. Evropské společenství také stanoví normy kvality: penicilín 4 ppb; amoxicilin 4 ppb; ampicilin 4 ppb; cloxacilin 30 ppb; dicloxacilin 30 ppb; oxacilin 30 ppb; cefapirin 10 ppb; ceftiofur 100 ppb: cefchínon 20 ppb; nafcilin 30 ppb; cefazolin 50 ppb.
    Může proto být užitečné mít k disposicí test, který • ·· • ΦΦΦ • ΦΦ dovoluje detekci většiny antibiotik. Kromě toho v mlékárenském průmyslu může být užitečné mít k disposici test, který má všechny vlastnosti rychlosti, citlivosti a jednoduchosti, test, který dovoluje vázat tyto tří parametry co nej lepším způsobem a to i pokud nejsou úplně pokryty.
    Vynález US 4.239.852 popisuje mikrobiologický způsob detekce antibiotik s β-iaktamovým jádrem v mléku. Podle tohoto způsobu se vzorek mléka inkubuje na jedné straně v přítomnosti částí buněk mikroorganismu, který je velmi citlivý na antibiotika, obzvláště Bacillus stearothermophilus a na druhé straně v přítomnosti antibiotika označeného radioaktivním prvkem nebo enzymem. Inkubace se provádí za podmínek dovolujících, aby antibiotika, popřípadě přítomná ve vzorku a označené antibiotikum se vázaly k částem buněk.
    Po ukončení inkubace se části buněk oddělí ze směsi a potom promývají. Potom se množství označených antibiotik vázaných na části buněk určí a porovnává se standardem. Množství označených antibiotik, vázaných ke zbytkům buněk je nepřímo úměrné koncentraci antibiotik, přítomných ve vzorku analyzovaného mléka.
    Tento způsob vyžaduje relativně jemné manipulace, zejména během separace částí buněk ze směsi. Mimoto ve své nejcitlivější verzi tento způsob používá antibiotikum označené radioaktivním prvkem (14C nebo 1Z5I) . V tomto případě určení množství antibiotika, které je popřípadě přítomno v mléku vyžaduje použití speciálního přístroje,
    - 5 •···· * jako je například scintilační počítač. Kromě toho manipulace s radioaktivními produkty, a to i v případě použití velmi malých množství, není zcela prostá nebezpečí pro osobu, která provádí analýzu.
    Evropská přihláška vynálezu 593.112 popisuje jiný způsob, dovolující detekci antibiotik v mléku. Tento způsob používá protein izolovaný z mikroorganismu citlivého na antibiotika, jako je například Bacillus stearothermophilus. Tento protein se kromě jiného označí enzymem jako je peroxidáza.
    Test postupuje následujícím způsobem: vzorek mléka se inkubuje ve zkumavce v přítomnosti označeného proteinu; po inkubaci se mléko přenese do druhé zkumavky, na jejíchž stěnách bylo imobilizováno referenční antibiotikum; provede se druhá inkubace, potom se odstraní obsah zkumavky; stěny druhé zkumavky se třikrát promývají promývacím roztokem, který se také odstraní, Potom se rezidua, přítomná na stěnách druhé zkumavky přenesou na savý papír; dále se do druhé zkumavky přidá barevný substrát, který se znovu inkubuje, potom se přidá roztok, který zastaví vývin barvy; zabarvení zkumavky se porovná se zabarvením, kterého bylo dosaženo v paralelně prováděném identickém testu na standardním vzorku antibiotika. Množství označeného proteinu, imobilizovaném na nosiči, tedy také intenzita zabarvení, je nepřímo úměrné množství antibiotika, přítomného v analyzovaném vzorku mléka.
    Podle příkladu 1 této přihlášky vynálezu tento test dovoluje detekovat penicilín G až do koncentrací řádu 5 ppb
    - 6 • ···· · · a dovoluje detekci amoxicilinu (5 ppb), ampicilinu (10 ppb), cefapirinu (5 ppb} a ceftiofuru (5 ppb).
    Nicméně test je značně náročný na provádění, obzvláště nekvalifikovaným personálem. Tento test totiž zahrnuje množství etap, v to počítaje etapy přelévání kapaliny a reziduí a několik etap promývání.
    Vzhledem k počtu a povaze etap požadovaných v tomto testu je získání spolehlivého výsledku závislé silně na schopnostech osoby, který test provádí.
    Mimo to interpretace výsledku si vyžaduje provedení dvou souběžných testů, což ještě více násobí a komplikuje operace.
    Jsou také známy další typy enzymatických způsobů, které umožňují určení slabých koncentrací antibiotik v mléku (J.M. FRERE a kol., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18(4), 506-510 (1980), a také vynálezy EP 85.667 a EP 468.946), které jsou založeny na použití specifického enzymu, totiž exobuněčné rozpustné D-alanyl-D-alanincarboxypeptidázy, kterou produkuje Actinomadura R39 (dále označovaná jako „enzym R39). Enzym R39 má specifickou aktivitu hydrolýzy skupin D-alanyl-D-alanin u různých peptidů a je také schopný hydrolyzovat konkrétní thioestery,
    Kromě jiného enzym R39 reaguje s antibiotiky s β-laktamovým jádrem za velmi rychlého vytvoření equimolárního komplexu enzym-antibiotikum, který je neaktivní a v zásadě
    -7 « 4444 ireverzibilní.
    V nejnovější verzi tohoto testu (EP 468.946) se určený objem vzorku kapaliny určení k testování inkubuje s určeným množstvím enzymu R39 za podmínek, které dovolují, aby βlaktamové antibiotikum, které je popřípadě přítomno ve vzorku, reagovalo s enzymem pro vytvoření ekvimolárního komplexu enzym-antíbiotikum, který je neaktivní a v zásadě ireverzibilní.
    Potom se určené množství substrátu typu thioesteru inkubuje s produktem získaným v první etapě za podmínek, dovolujících hydrolýzu substrátu reziduálním enzymem R39, který dosud nekomplexoval s antibiotikem během první inkubace. Množství takto vytvořené kyseliny merkaptoalkanové se potom určí kolorimetrickou metodou pomocí reaktantu, který je schopný vytvářet zabarvení s volnou skupinou SH kyseliny merkaptoalkanové. Intenzita zabarvení se porovnává s etalonem, který byl předem vytvořen ze vzorků obsahujících známá množství antibiotik. Kvantitativní určení může být provedeno měřením pomocí spektrofotometrie; v případě mléka může být nutné provést nejprve zprůhlednění vzorku.
    Je zřejmé, že tento test zahrnuje méně etap a je jednodušší k provádění než test popsaný v přihlášce vynálezu EP 593.112. Nicméně tento test je omezen na detekci antibiotik s β-laktamovým jádrem a u těchto antibiotik navíc do prahu dostupné detekce pomocí enzymu R39. Jako takový tento test nemůže být používán s dalšími receptory antibiotik a nemůže přímo sloužit jako základ pro detekci dalších druhů látek v • · · »·»· » · · * • · · · · ·· .· mléku.
    tt
    Jelikož současné testy vykazují ještě další nevýhody, přihlašovatelé si stanovili jako cíl hledat nové způsoby detekce látek v tekutých mléčných produktech, přičemž hledané způsoby by měly dovolovat spolehlivé určení různých druhů zkoumaných látek, výhodně v okamžiku odběru na farmě. Přihlašovatelé tedy hledali způsob, který by dovoloval velmi rychle získat spolehlivé a citlivé výsledky po provedení omezeného počtu jednoduchých kroků, které by nevyžadovaly obzvláštní dovednosti v provádění experimentů. Kromě toho přihlašovatelé hledali způsob, který by dával výsledky snadno zjistitelné vizuálně a dovolovaly mimoto provádět kvantitativní analýzu pomocí měření přístroji.
    Přihlašovatelé nyní zjistili, že tohoto cíle je možno dosáhnout díky použití nového testovací zařízení, které dovoluje snadno zjišťovat přítomnost zkoumaných látek v tekutých mléčných produktech, konkrétně v mléce.
    Podstata vynálezu
    Vynález se týká testovacího zařízení, které dovoluje detekovat přítomnost zkoumaných látek v tekutých mléčných produktech na základě kapilární tečné migrace uvedeného mléčného produktu. Testovací zařízení podle předloženého vynálezu zahrnuje pevný nosič (1) , který má první konec a druhý konec, na kterém jsou připevněny, postupujíce postupně od prvního konce, membrána (2) dovolující purifíkaci analyzované kapaliny,
    - 9 ···· ··♦ « * ···· · · *· * * · * · · · · *· · ·· ·* membrána (3) na které jsou imobilizovány jedna nebo více záchytných látek, a absorbční membrána (4), přičemž membrána (2) je schopná zadržovat látky, přítomné v mléčném produktu, která zabraňují migraci zkoumaných látek, popřípadě přítomných v mléčném produktu a detekčních reagentu použitých v prováděném způsobu, testovacím zařízením, a to během kapilární tečné migrace vzorku po navlhčení prvního konce testovacího zařízení v analyzovaném mléčném produktu.
    V konkrétním provedení předloženého vynálezu testovací zařízení podle předloženého vynálezu obsahuje dále membránu (5) na které je nanesen alespoň jeden detekční reagent a tento detekční reagent je schopen se rychle rozpouštět v přítomnosti uvedeného mléčného produktu. V tomto konkrétním provedení membrána (5) musí být umístěna před membránou (3). Může být umístěna například buď před membránou (2) na prvním konci zařízení a nebo mezi membránou (2) a membránou (3) nebo také pod nebo nad membránou (2).
    Různé membrány použité v testovacím zařízení podle předloženého vynálezu se překrývají na svých koncích tak, aby zajišťovaly kontinuální migraci mléčného produktu z jedné oblasti do druhé. Výhodně je membrána (3) umístěna tak, aby její blízký konec byl umístěn pod membránou (2) a její vzdálený konec byl umístěn pod membránou (4). Membrány mohou být popřípadě udržovány v kontaktu jedna s druhou díky adhezivní plastové fólii (6). V tomto případě se adhezivní plastová fólie volí tak, aby neovlivňovala migraci kapaliny testovacím zařízením.
    -10* φφφφ φφφφ · · • · φφφ · «·«· · · · φφ φ
    Možnost zakrýt testovací zařízení adhezivní plastovou fólií přináší dvě výhody: zajišťuje dokonalý kontakt membrán v místě překrývání a představuje ochranu zařízení. Adhezivní plastová fólie (6) může buď úplně zakrývat membrány (2), (3), (4) a (5) nebo částečně zakrývat jednotlivé membrány. Výhodně adhezivní plastová fólie (6) nezakrývá prvních několik milimetrů prvního konce, tak aby byla umožněna rychlejší migrace kapaliny membránou (2) testovacího zařízení. »
    Obrázky 1 až 3 ilustrují příklady testovacích zařízení podle předloženého vynálezu. Obrázky la, 2 a 3 představují pohled zpředu a Obrázek lb představuje pohled v podélném řezu. Pevný nosič (1) přítomný v testovacím zařízení podle předloženého vynálezu je vyroben ze skla nebo plastu, výhodně z plastu. V případě nosiče z plastu je jeho tloušťka obecně v rozmezí od 0,05 do 1 mm, s výhodou od 0,1 do 0,6 mm. Membrány jsou připevněny na pevném nosiči (1) přilepením.
    Membrána (2) může být různých typů. Na jedné straně musí být schopna zadržovat látky přítomné v mléčném produktu, které zabraňují migraci zkoumaných látek, popřípadě přítomných v mléčném produktu a detekčních reagentů použitých v prováděném způsobu, testovacím zařízením. Na druhé straně musí dovolovat rychlou migraci zkoumaných látek a detekčních reagentů testovacím zařízením, přičemž musí zachovávat aktivitu těchto zkoumaných látek a detekčních reagentů během uvedené migrace. Neomezující příklady membrán, dovolujících získat tyto výsledky jsou
    -11• · * · i··· · · · · • » · · · · „ *
    Cytosep 1663 a Leukosorb LK4 (dodávané společností Pall Gelman Sciences), GF/D, GF/DVA, 17CHR (dodávané společností
    Whatmann) a skleněná společností Alstrom).
    Výhodně používaná membrána netkaných polyesterových leukocytů z klinických cerebrospinální tekutiny, filtrací tekutiny při membránou.
    vlákna typu GF141 (dodávaná
    Leukosorb je membrána vyráběná z vláken, určená na zadržování vzorků krve, moči, slin a K zadržování leukocytů dochází jejím transverálním průstupu
    Přihlašovatelé neočekávaně zjistili, že tento typ membrán také dovoluje zajistit funkci, která je velmi důležitá pro detekci hledaných látek v mléčném produktu pomocí testovacího zařízení podle předloženého vynálezu, totiž zadržování látek přítomných v mléčných produktech, které zabraňují dobrému průběhu testu detekce, prováděného kapilární tečnou migrací mléčného produktu na uvedeném testovacím zařízení, přičemž současně dovoluje rychlou migraci hledaných látek a detekčních reagentů.
    K tomu aby mohla fungovat tímto optimálním způsobem, membrána (2) musí být dostatečně dlouhá, aby dovolila eliminaci všech látek přítomných v mléčných produktech, které zabraňují rychlé migraci hledaných látek a detekčních reagentů testovacím zařízením.
    Membrána (3) musí dovolovat imobilizaci jedné nebo více záchytných látek a musí dovolovat rychlou migraci vzorku mléčného produktu po průchodem membránou (2) . S výhodou je * · • · **·· ···
    V W W ' * · ···· • · · ·· · • to »4 * « · to · • to toto nosiči typu membrán oodle membrána (3) vytvořena na neporézním polyesteru. Neomezující příklady vhodných předloženého vynálezu jsou nitrocelulózové membrány se zvýšenou kapilární rychlostí jako jsou membrány Hi-Flow (dodávané společností Millipore), výhodně membrány Hi-Flow typu SX nebo ST. Tyto membrány dávají optimální výsledek spolu s membránami (2), které byly popsány výše.
    Jedna nebo více záchytných látek se imobilizuje na membráně (3) . Typ imobilizované záchytné látky závisí pochopitelně na způsobu použitému pro detekci hledaných látek; záchytné látky jsou schopné imobilizovat selektivně alespoň jednu složku přítomnou v tekutině, migrující na testovacím zařízením, jako je například jeden z detekčních reagentů nebo produkt vzniklý vytvořením komplexu mezi hledanou látkou nebo látkou analogickou této hledané látce a alespoň jedním detekčním reagentem nebo také produkt vzniklý vytvořením komplexu více detekčních reagentů. Záchytná látka může také být jedním z detekčních reagentů. Záchytné látky se umístí koncentrovaným způsobem na přesně definované jedné části nebo více částech membrány (3), jako jsou tenké kruhy nebo pásy nebo jakýkoli jiný motiv vhodný pro danou aplikaci. Ať je zvolený motiv jakýkoli, musí umožňovat zřetelné odečtení výsledku.
    Co se týče rozměrů, membrána (3) musí mít dostatečnou délku k tomu, aby obsahovala všechny použité záchytné látky a to v pořadí a v množství požadovaném použitým způsobem detekce.
    Typ membrány, použitý pro membránu (4) není příliš
    -13důležitý, dokud je tato membrána schopna absorbovat a uchovávat kapalinu po jejím průchodu předchozími membránami. Membrána (4) má dostatečně velkou velikost k absorbci kapaliny po jejím průchodu membránou (3), ale také z praktického hlediska takovou, aby dovolovala snadnější uchopení testovacího zařízení.
    Testovací zařízení podle předloženého vynálezu může také popřípadě zahrnovat membránu (5), na které je nanesen alespoň jeden detekční reagent. Membrána (5) musí dovolovat migraci mléčného produktu a přitom dovolovat solubilizaci a uvolňování detekční reagent (nebo detekčních reagentů) během průchodu proudu mléčného produktu. Neomezující příklady membrán, které mohou být vyhovující k tomuto účelu jsou: membrány na bázi pryskyřic ve skelných vláknech jako jsou membrány t5nm (dodávané společností Millipore), membrány F075-14 nebo F015-17 nebo GF/C (dodávané společností Whatman), membrána Cytosep 1663 (dodávaná společností Pall Gelman Sciences), membrány na bázi pryskyřic v polyesterových vláknech jako jsou membrány Accuwick (dodávané společností Pall Gelman Sciences), celulózový papír 3 mm (dodávaný společností Whatman) nebo nakonec membrány typu Release Matrix PT-R2 (dodávané společností Advances Micro Devices). Výhodně se používají membrány na bázi pryskyřic v polyesterových vláknech, jako jsou membrány Accuwick. Membrána (5) má délku dostatečnou pro požadované množství detekčního reagentů.
    Testovací zařízení podle předloženého vynálezu jsou vyráběna způsoby známými odborníkům. Je možné například připravit desky pomocí komerčně dostupných laminačních
    -14zařízení. Použité záchytné látky se nanášejí na membránu (3) ve formě roztoků, před nebo po sestavení karet. Nanášení těchto roztoků může být prováděno velice přesnými způsoby s použitím komerčně dostupných zařízení, jako je například Dispenser X-Y Platform Biojet Quanti-3000 společnosti Bio Dot, lne. Tyto nanesené roztoky se okamžitě odpaří, například umístěním karty do proudu teplého vzduchu. Pro výrobu ve velkém měřítku je možno také připravovat role. Nakonec se karty a role nesoucí požadované záchytné látky nastříhají na pásky a každý z těchto pásků představuje testovací zařízení podle předloženého vynálezu.
    Pokud testovací zařízení zahrnuje membránu (5), detekční reagent nebo reagenty mohou být naneseny před sestavením karet nebo rolí prostým ponořením membrány (5) do roztoku obsahujícího detekční reagent nebo reagenty. Alternativně mohou být naneseny po sestavení karet nebo rolí způsoby analogickými způsobům použitým pro nanášení záchytných látek na membránu (3).
    V alternativním provedení předloženého vynálezu, se zařízení umístí do plastového obalu, který má dva otvory: první ve tvaru misky, se nachází přímo nad membránou (2) a dovoluje příjem kapaliny, určené k analýze; druhý je okénko, které umožňuje vizualizaci výsledků na membráně (3). V tomto případě testovací zařízení neobsahuje adhesivní plastovou fólii (6).
    Testovací zařízení podle předloženého vynálezu dovoluje detekovat přítomnost hledaných látek v tekutém mléčném
    -15• · ···· ···· « » » » ···· · · · · * · »<· ···· ···· ··· ·· · ·· ·· produktu, obzvláště v mléku.
    Z uvedených důvodů se předložený vynález také týká způsobu detekce látek v tekutém mléčném produktu, používájÍcího testovací zařízení podle předloženého vynálezu a detekční reagenty, který sestává z následujících kroků:
    a) uvedení určeného objemu mléčného produktu do kontaktu s testovacím zařízením podle předloženého vynálezu, přičemž k tomuto kontaktu dochází na prvním konci testovacího zařízení,
    b) tečná migrace mléčného produktu na testovacím zařízení na základě kapilaríty taková, že hledané látky a detekční reagenty, které jsou popřípadě přítomné v mléčném produktu procházejí postupně membránou (2), potom membránou (3) tak, že složky mléčného produktu, které nejsou zastaveny membránami (2) a (3) skončí v membráně (4), a
    c) určení fixace na membráně (3).
    Způsob podle předloženého vynálezu dovoluje detektovat hledané látky v tekutém mléčném produktu, například mléce, syrovátce, podmáslí, . . . Předložený vynález se týká obzvláště detekce látek jako jsou veterinární léčiva, hormony nebo proteiny, o kterých se předpokládá, že jsou přítomny v mléku.
    Detekční reagenty použité ve způsobu podle předloženého vynálezu mohou být použity v různém počtu a mít odlišnou povahu v závislosti na způsobu provedení předloženého vynálezu, který vychází z použité detekční metody. Způsob podle předloženého vynálezu používá alespoň dva detekční
    -16• ···· · · Τ τ • · · · *«·* · · · · ;
    • * · · · · · · ·»· ·· · *· ·* reagenty. První detekční reagent je rozpoznávací činidlo, které specificky rozpoznává hledanou látku a bude nadále nazýván „identifikační činidlo. Druhý detekční reagent je činidlo, používané pro označení a bude nadále nazýván „označovací činidlo. Je třeba podotknout, že v závislosti na zvoleném způsobu provedení mohou být jisté detekční reagenty presentovány na membráně (3) nebo na membráně (S). V závislosti na povaze látky, která je určována, a na použitých detekčních reagentech se může stát, že je nutno přidat jeden nebo více dalších detekčních reagentů před krokem uvedení mléčného produktu do kontaktu s testovacím zařízením podle předloženého vynálezu a udržovat směs v podmínkách inkubace, které dovolují vytvoření komplexu detekčních reagentů a hledané látky nebo látky analogické hledané látce. V závislosti na použitém způsobu mohou být identifikační činidlo a označovací činidlo spojeny nebo mohou představovat tutéž látku.
    Na druhé straně může být použito více identifikačních činidel a/nebo označovacích činidel.
    Identifikačních činidlo dovoluje detekci přítomnosti typu hledané látky díky svojí schopnosti rozpoznávat specificky tuto hledanou látku nebo látku analogickou této hledané Látce. Může se jednat o receptor schopný vytvářet selektivně stabilní a v zásadě ireverzibilní komplex s hledanou látkou nebo o monoklonální nebo polyklonální protilátky specifické k hledané látce nebo látce analogické hledané látce. Pro detekci antibiotik může být identifikační činidlo zvoleno ze souboru, zahrnujícího specifické monoklonální nebo polyklonální protilátky nebo
    -17fl««
    V flfl* · » · ’ • · « fl··* · · flfl ♦ • · · · · · · fl* · ·« ·· receptory získané z mikroorganismů citlivých na antibiotika, jako jsou receptory získané z druhů Bacillus (Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, ...) Streptococcus (Streptococcus thermophilus, ...), Actinomycetes (Actinomadura R39, ...) .
    Ve výhodném provedení předloženého vynálezu se používá identifikační činidlo, které zahrnuje receptor citlivý na antibiotika s β-laktamovým jádrem získaný z Bacillus licheniformis, jako je například receptor BlaR nebo receptor BlaR-CTD. Izolace a peptidová sekvenace proteinu BlaR jsou popsány v Y. ZHU a kol., J. Bacteriol., 1137-1141 (1990); receptor BlaR-CTD je karboxy-terminální oblast BlaR, jehož izolace a peptidová sekvenace jsou popsány v B. JORIS a kol., FEMS Microbiology Letters, 107-114 (1990).
    Použití receptorů BlaR nebo BlaR-CTD podle předloženého vynálezu pro detekci antibiotik s β-laktamovým jádrem přináší významné výhody ve srovnání s rozpoznávacími činidly používanými do současné doby. Receptory BlaR a BlaR-CTD jsou totiž schopny komplexovat velmi rychle s velkým množstvím antibiotik a to při teplotách inkubace nižších než jsou teploty nutné pro známá rozpoznávací činidla, jako jsou například receptory získané z Bacillus stearothermophilus.
    Druhý typ použitého detekčního reagentu je označovací činidlo, které dovoluje vizualizaci a přímou nebo nepřímou kvantifikaci přítomnosti hledané látky v mléčném produktu. Označovací činidla, použitelná ve způsobu podle
    -189999 · « * v · · ·
    9 999 9 99
    9 9 9 9999 9 9 9 9 9
    9 9 9 »999 • ·9 9 99 9· předloženého vynálezu mohou být částicová, fluorescenční, radioaktivní, luminescenční nebo enzymatická. Konkrétní označovací činidlo se výhodně zvolí tak, aby poskytovalo snadno detekovatelný vizuální signál, dokonce i pokud je přítomno v malém množství. Jako neomezující příklady je možno uvést kovové koloidální částice (platina, zlato, stříbro a podobně), koloidální částice selenu, uhlíku, síry, teluru nebo dále obarvené syntetické latexové koloidální částice. Obzvláště výhodné jsou koloidální částice zlata o průměru částic v rozmezí od 1 do 60 nm: tyto částice poskytují silné růžovo-červené zabarvení, které je snadno detekovatelné.
    Označovací činidlo dovoluje určit přítomnost hledané látky ve vzorku mléčného produktu díky své vazbě na jeden nebo více detekčních reagentů, hledaných látek nebo látek analogických hledané látce.
    Vazba mezi označovacím činidlem a detekčním reagentem může být dosažena způsoby známými odborníkům v oboru. Pokud se používá částicové označovací činidlo, k označování může docházet buď přímou adsorpcí na částicích, nebo nepřímo na základě chemického zakotvení, jako je například komplex biotin/anti-biotin. K této vazbě může dojít buď v etapě uvedení mléčného produktu do kontaktu s testovacím zařízením podle předloženého vynálezu nebo během migrace mléčného produktu na testovacím zařízení podle předloženého vynálezu.
    V konkrétním provedení předloženého vynálezu se používá třetí typ detekční reagentů, dále označovaný jako
    -19···· • 4 4 4 * · • · 4 · ···» 4 4 • 4 4 · 4
    44 44 · „referenční činidlo. Jedná se o látku, přidanou ve známém množství do analyzovaného vzorku, která se fixuje na specifickou záchytnou látku imobilizovanou na membráně (3). Referenční činidlo vytváří pruh, jehož intenzita slouží jako reference pro kvantifikaci hledané látky.
    Ke kontaktu mléčného produktu s testovacím zařízením podle předloženého vynálezu (etapa a) způsobu podle předloženého vynálezu} dochází umístěním testovacího zařízení podle předloženého vynálezu do recipientu, na jehož dně se nachází analyzovaný vzorek. Testovací zařízení se vloží v zásadě vertikálně do nádoby, tak aby první konec zařízení byl v kontaktu se směsí.
    V provedení vynálezu, ve kterém se používá testovací zařízení uložené v plastovém obalu, se testovací zařízeni vloží horizontálně a uvedení do kontaktu se provádí nanesením alikvotu analyzovaného vzorku do otvoru ve formě misky, který se nachází nad membránou (2).
    Pro provedení kroku migrace b) e kapalina ponechá migrovat prostřednictvím kapilarity na testovacím zařízení podle předloženého vynálezu. Kapalina, která migruje prostřednictvím kapilarity na testovacím zařízení podle předloženého vynálezu se setká nejprve s membránou (2), která umožňuje zadržet látky, které se nachází v mléčném produktu a které zabraňují migrace hledané látky nebo látek, které jsou popřípadě přítomny v mléčném produktu a detekčních reagentů na testovacím zařízení. Hledané látky a detekčních reagenty migrují potom na membráně (3), na které je ímobilizována jedna nebo více záchytných látek. Záchytné
    -20látky selektivně imobilizují alespoň jednu složku, která se nachází v analyzované kapalině. V konkrétním provedení předloženého vynálezu se používá záchytná látka umístěná na konec dráhy migrace kapaliny na membráně (3), která je schopná fixovat všechna označovací činidla, která nebyla zastavena předcházejícími záchytnými látkami. Tato záchytná látka dovoluje kompletovat kvantitativní informace, pocházející od předcházejících záchytných látek.
    Určení fixace na membráně (3) (etapa c) způsobu podle předloženého vynálezu) se provádí jednoduše určením přítomnosti označovacích činidel v této oblasti. Toto určení je možné snadno vizuálním způsobem. Nicméně pokud je požadováno získání přesných hodnot intenzity pozorovaných signálů, je možno použít zařízení, které umožňuje přesné stanovení intenzity pozorovaných signálů. Pokud se používá referenčního činidla, je toto fixováno specifickou záchytnou látkou, která dává vnitřní referenci pro měření intenzity pozorovaných signálů.
    Interpretace získaného výsledku závisí na použitém způsobu detekce, to jest na použitých detekčních reagentech a záchytných látkách.
    Ve srovnání se způsoby detekce látek v mléku, které byly dříve popsány v literatuře má způsob podle předloženého vynálezu následující výhody. Především je tento způsob velmi rychlý a extrémně jednoduchý pro provádění: v zásadě sestává ze dvou etap jednoduché manipulace, které nevyžadují žádných zvláštních experimentálních dovedností. Poté následující kvalitativní a kvantitativní zhodnocení
    -21τ - - - v V » » Τ » • * ·«·« « 4 · 4 • · a · a ···♦ a a a a a • · ♦ · · »·«« tu· a»· ·« a aa aa výsledku je okamžité a nevyžaduje dodatečné zvláštní operace, jako jsou operace, které jsou nutné pokud se detekce provádí enzymatickými barvivý a/nebo označovacími činidly. Mimoto je způsob přímo použitelný pro detekci různých typů hledaných látek. Nakonec, v provedení, které používá referenční činidlo, je výsledek přímo interpretovatelný a kvantifikovatelný, aniž by bylo třeba používat jeden nebo více referenčních testů.
    Předložený vynález se týká také testovací soupravy pro detekci látek v mléčných produktech, která zahrnuje testovací zařízení podle předloženého vynálezu. V případě potřeby testovací souprava podle předloženého vynálezu může také obsahovat detekční reagenty, které se přidávají do vzorku před jeho uvedením mléčného produktu do kontaktu s těsto v ac íin z a ř i z e n i m.
    Příklady provedení vynálezu
    Následující příklady ilustrují různé předměty a způsoby provedení předloženého vynálezu, aniž by jeho rozsah jakýmkoli způsobem omezovaly.
    Příklad 1. Výroba testovacího zařízení. Obecné způsoby provedení.
    1.1. Sestavení membránových karet.
    Karty o velikosti 300 x 76,2 mm se napřed sestaví použitím laminačního zařízení typu Chlamshell Laminator (dodávané společností Bio Dot, lne.) postupujíce následujícím
    -22, · i · · · · · · ·««· ··· * * ·· ·· způsobem:
    Vyřízne se obdélník z plastového nosiče typu ArCare 8565 (dodávaného společností Adhesive Research) o rozměrech 300 x 76,2 mm {pevný nosič (1)). Potom se vyřízne obdélník membrány Leukosorb LK4 (dodávané společností Pall Gelman Sciences) o rozměrech 300 x 20 mm (membrána (2)), obdélník membrány Hi-Flow SX (dodávané společností Millipore) o rozměrech 300 x 25 mm (membrána (3)), obdélník membrány z celulózy 3 mm (dodávané společností Whatmann) o rozměrech 300 x 40 mm (membrána (4)) a obdélník membrány Accuwick (dodávané společností Pall Gelman Sciences) o rozměrech 300 x 0,8 mm (membrána (5)}.
    Membrány (2) a (4), potom (5) a potom (3) se postupně uloží na specifické místo spodní formy iaminačního zařízeni. Pevný nosič (1) pokrytý lepidlem je sám o sobě uchováván v příklopu tohoto zařízení. Lepivá strana nosiče je vystavena na vzduchu. Membrány uložené v spodní formě se uvedou do kontaktu s lepivým nosičem uzavřením Iaminačního zařízení; membrány se udržují přesně na svých místech pomocí podtlaku vytvářeného vývěvou. Po přerušení vytváření podtlaku se vyjme karta, tvořená pevným nosičem (1), na kterém jsou připevněny membrány (2), (3), (4) a (5).
    1.2. Nanesení záchytných látek na membránu (3).
    Nanesení záchytných látek na membránu (3) se provádí před nebo po provedení sestavení karty podle příkladu 1.1.
    Připraví se vodný roztok, obsahující záchytnou látku.
    -234 4 4444 4444 4 44 4444**4 44 4 * * *44 4*4*
    4*4* 444 44 4 « «4
    Roztok se nanese na membránu (3) membránové karty, připravené v příkladu 1.1. prostřednictvím nanášecího zařízení typu X-Y Platform Biojet Quanti-3000 společnosti Bio Dot, lne.
    Nanesené roztoky se okamžitě odpaří umístěním souboru karty na několik minut do proudu vzduchu o teplotě 60 °C.
    1.3. Nanesení označovací látky na membránu (5).
    a) Před sestavením podle příkladu 1.1.
    Připraví se vodný roztok obsahující označovací látku. Membrána (5) se vnoří do tohoto roztoku. Potom se membrána odkape, a potom suší pří teplotě okolí za podtlaku 0,5 baru.
    sestavení podle příkladu 1.1
    Postupuje se způsobem, který byl popsán v příkladu 1.2. pro nanášení záchytných látek.
    1.4. Připevnění adhezivní plastové fólie (6).
    Vystřihne se obdélník adhezivní fólie typu ArCare 7759 (dodávané společností Adhesive Research) o rozměrech 300 x 20 mm pro částečné zakrytí nebo a 300 x 71,2 mm pro zakrytí všech membrán.
    Karta získaná v příkladu 1.1 se umístí do spodní formy laminačního zařízení a adhezivní fólie se umístí do příklopu laminačního zařízení, přičemž lepivá strana je vystavena do vzduchu. Adhezivní plastová fólie se uvede do kontaktu s membránovou kartou po uzavření zařízení.
    ♦ ♦ · · • tttttttt · ·
    -24·«· · • tt · · • tttt tttt * • tt • tt
    1.5. Vystřižení pásků.
    Karty získané výše popsaným sestavením se nastříhají na pásky pomocí zařízení typu guilotiny nebo pomocí rotačního zařízení (dodávané společností Bio Dot, Kinematic nebo Akzo). Pásky vzniklé z konců karet jsou vyhozeny, ostatní pásky jsou připraveny k použití.
    Pro uchovávání se testovací zařízení podle předloženého vynálezu umístí do neprůhledné a hermeticky uzavřené nádoby v přítomnosti vysušovacího činidla (Silgelac, Francie).
    1.6. Uložení do plastového obalu.
    Testovací zařízení se umístí do plastového obalu, který má dva otvory: první, ve tvaru misky, se nachází přímo nad membránou (2) a dovoluje přijímat kapalinu určenou k analýze; druhým je okénko, které dovoluje vizuální odečítání výsledků na membráně (3).
    Příklad 2. Detekce antibiotik s β-laktamovým jádrem v mléku pomocí enzymu R39.
    2.1. Identifikační činidlo.
    Identifikační činidlo použité v tomto příkladu je rozpustná exobuněčná D-alanyl-D-alanin-karboxypeptidáza produkovaná organismem Actinomadura R39, získaná způsobem, který popsali J.-M. FRERE a kol·., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18(4), 506- 510 (1980).
    • · · · • ♦··· * ·
    -25···· ·«·
    2.2. Vazba identifikačního činidla na označovací činidlo.
    2.2.1. Biotinylace identifikačního činidla.
    250 μΐ vodného roztoku enzymu R39 o koncentraci 1 mg/ml se dialyzuje po 24 hodin proti 500 ml pufru HNM (Hepes 10 mM, pH 8, NaCl 10 mM, MgCl2 dialyzovaného enzymu R39 hydrogenuhličitanového pufru
    5 mM) . Do tohoto roztoku se potom přidají 2 ml (0,1 M hydrogenuhličitanů sodného, pH 9) a 250 μΐ roztoku N-hydroxy-sukcinimidového esteru kyseliny 6-(biotinamido)kapronové 5 mg/ml v bezvodém DMF. Tento roztok se jemně míchá ve válcovém míchači s rotační osou typu LABINCO (dodávaný společností VEL, Belgie) rychlostí 2 otáčky za minutu po dobu 3 hodin při teplotě okolí a chráněný před světlem. Takto získaný roztok se potom dialyzuje proti pufru HNM (Hepes 100 mM; pH 8, NaCl 100 mM, MgCl2 50 mM) po dobu 24 hodin. Tímto způsobem se získá roztok biotinylovaného enzymu R39, který se zředí v pufru HNM-BSA (Hepes 500 mM; pH 8, NaCl 500 mM, MgCl2 250 mM, BSA 10 mg/ml) až do dosažení koncentrace 100 μς enzymu R39 na ml pufru. Tento roztok se uchovává při teplotě -20 °C.
    2.2.2. Označovací činidlo.
    Jako označovací činidlo se používají částice zlata, které mají průměr 40 nm, na které byly naneseny kozí protilátky proti biotinu ve formě suspenze ve vodném roztoku tetraboritanu sodného 2 mM při pH 7,2, stabilizované nitridem sodným 0,1% (dodáváno společností BRITISH BIOCELL (Ref. GAB40) . Optická hustota této suspenze při 520 nm je
    -26• φ φφφφ φφφφ φ φ φ · φ φφφφ φ φ φ · φ φφφ φφφφ φφ φφφ «φ φ φ· φ* zhruba 10 a koncentrace proteinu je zhruba 24 gg/ml.
    2.2.3. Vazba biotinylovaného identifikačního činidla k označovacímu činidlu.
    Roztok A pro rychlý test
    Roztok biotinylovaného enzymu R39, připraveného v příkladu
    2.2.1. se zředí 25 násobně pufrem HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCl 500 mM, MgCl2 250 mM, ΒΞΑ 10 mg/ml) . Při teplotě okolí se smíchá 17,5 objemových částí tohoto zředěného roztoku biotinylovaného enzymu R39, 9,27 objemových části suspenze částic zlata, sloužících jako označovač enzymu R39 a 6 objemových částí suspenze referenčních částic zlata (viz příklad 2.3).
    Roztok B pro citlivý test
    Roztok biotinylovaného enzymu R39, připraveného v příkladu
    2.2.1. se zředí 50 násobně pufrem HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCl 500 mM, MgCl2 250 mM, BSA 10 mg/ml) . Při teplotě okolí se smíchá 17,5 objemových částí tohoto zředěného roztoku biotinylovaného enzymu R39, 9,27 objemových částí suspenze částic zlata, sloužících jako označovač enzymu R39 a 6 objemových částí suspenze referenčních částic zlata (viz příklad 2.3).
    2.3. Referenční činidlo
    Jako referenční činidlo se použijí částice zlata o průměru
    40 nm na které byly naneseny kozí protilátky proti
    -27····
    0 0 0 • 000· 0 · králičímu imunoglobulinu. Tyto částice jsou dodávány společností BRITISH BIOCELL (Ref. GAR40) ve formě suspenzí ve vodném roztoku tetraboritanu sodného 2 mM při pH 7,2, stabilizované nitridem sodným 0,1%. Optická hustota této suspenze při 520 nm je zhruba 3 a koncentrace proteinu je zhruba 6 gg/ml.
    2.4. Záchytné látky.
    2.4.1. První záchytná látka.
    8 ml roztoku obsahujícího 213 mg lidského gamaglobulinu (G4386, Sigma) a 8,6 mg hydrochloridu 2-iminothiolanu (Aldrich, 33056-6) v pufru uhličitanu sodného (100 mM, pH 9) se inkubují po jednu hodinu při teplotě 25 °C.
    Odděleně se inkubuje po jednu hodinu při teplotě 25 °C 20 ml roztoku obsahujícího 119,8 mg cefalosporinu-C a 54 mg sulfosukcinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyklohexan-1karboxylátu (sSMCC, 22322 Pierce) v pufru uhličitanu sodného (100 mM, pH 9).
    Dva roztoky, které byly připraveny dříve se potom smíchají. pH vzniklého roztoku se upraví na 7,1 přidáním 3 ml NaH2PO4 500 mM a inkubuje se po dvě hodiny při teplotě 25 °C. Směs získaná po inkubaci se dialyzuje třikrát proti 1 litru pufru fosforečnanu sodného (10 mM, pH 7,5). Vzniklý roztok se filtruje na filtru 0,22 μιη, potom se alikvotuje a zmrazí pří teplotě -20 QC až do použití.
    Při použití se alíkvoty rozmrazí a přidá se potravinářské
    -284 4·· 4 44 * • · · «··· · · · 4 4 • * · · « 4 ·· · ·· ·· barvivo před uskutečněním nanesení na membrána aby byla v každém okamžiku zaručena přesná poloha nanesení a kvalita stopy.
    První záchytná látka dovoluje fixaci identifikačních činidel vázaných na volná označovací činidla přítomná v přebytku vzhledem k množství antibiotik přítomných ve vzorku.
    2.4.2. Druhá záchytná látka.
    Jako druhá záchytná látka se používá roztok králičího imunogiobulinu (Sigma I 5006) v koncentraci 0,5 mg/ml immunoglobulinu v pufru fosforečnanu sodného 10 mM, pH 7,5, lidský gammaglobulin 5 mg/ml. Tato druhá záchytná látka
    Ldciiyuavci r vnc-n.
    testovacím zařízení.
    činidlo běhsiu inicfir^cs kspsliny π 3
    2.5. Testovací zařízení.
    Používá se testovací zařízení, obsahující membrány (2), (3) a (4), sestavené způsobem, který byl popsán v příkladu 1.1. Membrána (3) tohoto zařízení nese na blízkém konci záchytnou látku popsanou v příkladu 2.4.1. a na vzdáleném konci záchytnou látku popsanou v příkladu 2.4.2. Záchytné látky jsou naneseny způsobem, který byl popsán v příkladu
    1,2,
    2.5.1. Test 1 - Rychlý test
    Připraví se sedm vzorků mléka, které obsahují postupně 0;
    -29«Φ·· ·φφ
    2; 4; 5; 6; 8 a 10 ppb penicilinu G. Každý z těchto roztoků je potom analyzován následujícím způsobem.
    Odebere se alikvot 200 μΐ vzorku mléka a 32,8 μΐ roztoku A připraveného v příkladu 2.2.3, které se umístí do Eppendorfovy trubice. Tato směs se inkubuje po 3 minuty při teplotě 47 °C. Potom se testovací zařízení umístí vertikálně do Eppendorfovy trubice tak, aby byl první konec testovacího zařízení v kontaktu se směsí. Směs se ponechá migrovat testovacím zařízením a soubor se nechá inkubovat po 2 minuty pří teplotě 47 °c.
    Níže uvedená Tabulka 1 udává výsledky získané pro 7 vzorků, které byly testovány. Detekovaným pruhům byla přiřazena intenzita v rozmezí od 0 do 10, přičemž hodnota 10 znamená nej intenzivnější pruh a hodnota 0 znamená nejméně intenzivní pruh. V této stupnici byla hodnota 6 přiřazena referenčnímu pruhu. Intenzita signálu pozorovaného v prvním detekčním pruhu je nepřímo úměrná množství penicilinu G, který je přítomen ve vzorku.
    Tabulka 1
    Penicilín G
    Intenzita (ppb)
    1. pruh
    2, pruh
    -304 4 4 4 4 4 4
    4 4444 444* 4 4
    4 4 4 4 4 4
    4444 444 44 4
    4 4 *
    4 4 4
    4 4 4
    V tomto příkladu pokud byl první pruh méně intenzivní než referenční pruh, byl test považován za pozitivní. Výsledky uvedené v Tabulce 1 ukazují, že test dovoluje detekovat do 5 minut až do 4 ppb penicilinu G ve vzorku mléka.
    2.5.2. Test 2 - Citlivý test.
    Bylo připraveno šest vzorků mléka obsahujících postupně 0; 2; 2,5; 3; 4 a 5 ppb penicilinu G. Každý z těchto roztoků byl potom analyzován následujícím způsobem:
    Odebere se alikvot 200 μΐ vzorku mléka a 32,8 μΐ roztoku B připraveného v příklad 2.2.3, které se umístí do Eppendorfovy trubice. Tato směs se inkubuje po 5 minut při teplotě 47 °C. Potom se testovací zařízení umístí vertikálně do Eppendorfovy trubice tak, aby první konec testovací zařízení byl v kontaktu se směsí. Směs se ponechá migrovat na testovacím zařízení za inkubace souboru po 2 minuty při teplotě 47 °C.
    Tabulka 2 uvedená níže udává výsledky získané pro 7 vzorků, které byly testovány. Detekovaným pruhům byla přiřazena intenzita v rozmezí od 0 do 10, přičemž hodnota 10 znamená nejintenzivnější pruh a hodnota 0 znamená nejméně intenzivní pruh. V této stupnici byla hodnota 6 přiřazena referenčnímu pruhu. Intenzita signálu pozorovaného v prvním detekčním pruhu je nepřímo úměrná množství penicilinu G, který je přítomen ve vzorku.
    -31• ΒΦΒ ·· • · · Β *««* • φ · ΒΒΦΦ Β φ · · · φ φ φ φ φ · ·
    BI Β Φ· Φ·
    Tabulka 2
    Penicilín G (ppb)
    O
    2,5
    Intenzita
    1. pruh 10
    O
    2. pruh 6 6 6 6 6 6
    V tomto příkladu pokud byl první pruh méně intenzivní než referenční pruh, byl test považován za pozitivní. Výsledky uvedené v Tabulce 2 ukazuji, že test dovoluje detekovat do 7 minut až do 2,5 ppb penicilinu G ve vzorku mléka.
    Příklad 3. Určení antibiotik s β-laktamovým jádrem v mléku pomocí BlaR.
    Tento příklad ilustruje detekci antibiotik s β-laktamovým jádrem, které jsou kontrolovány hygienickými úřady, v mléku. Test popsaný v tomto příkladu používá receptor BlaRCTD vázaný na kuličky zlata, které slouží jako označovací činidlo a používá nosič, vytvořený ve formě testovacího zařízení zahrnujícího pevný nosič, na kterém jsou připevněny membrány.
    3.1. Vazba BlaR-CTD (identifikační činidlo) na kuličky zlata (označovací činidlo).
    -32• 9 999· 99·· • 9 9 9 9 9999 9 · 9 9 9
    9 9 999 *99· • 999 ··· 90 9 99 09
    3.1.1. Biotinylace BlaR-CTD.
    3,79 ml vodného roztoku rozpoznávacího činidla BlaR-CTD o koncentraci 6,6 mg/ml se vyjme pufrem fosforečnanu sodného 20 mM pH 1. Do tohoto roztoku BlaR-CTD se potom přidá 41,71 ml hydrogenuhličitanového pufru (0,1 M hydrogenuhličitanu sodného, pH 9) a 2 ml roztoku N-hydroxy-sukcinimidového esteru kyseliny 6-(biotinamido)kapronové 2,23 mg/ml také v hydrogenuhličitanovém pufru. Tento roztok se jemně míchá ve válcovém míchači s rotační osou typu LABINCO (dodávaný společností VEL, Belgie) rychlostí 2 otáčky za minutu po dobu 2 hodin při teplotě okolí a chráněný před světlem. 2,5 ml roztoku pufru Tris 1 M pH 8 se inkubuje s reakční směsí za stejných podmínek po 30 minut. Takto získaný roztok se potom dialyzuje proti pufru HNM (Hepes 100 mM; pH 8, NaCl iUti mM, MgCi2 5U mM) po dobu 24 hodin. Tímto způsobem se získá roztok biotinylovaného BlaR-CTD, který se zředí v pufru ΗΝΜ-ΒΞΑ (Hepes 500 mM; pH 8, NaCl 500 mM, MgCl2 250 mM, BSA 10 mg/ml) až do dosažení koncentrace 250 μς BlaRCTD na ml pufru. Tento roztok se uchovává při teplotě -20 °C.
    3.1.2. Označovací činidlo.
    Jako označovací činidlo se používají částice zlata, které mají průměr 40 nm, na které byly naneseny kozí protilátky proti biotinu ve formě suspenze ve vodném roztoku tetraboritanu sodného 2 mM při pH 7,2, stabilizované nitridem sodným 0,1% (dodáváno společností BRITISH BIOCELL (Ref. GAB40) . Optická hustota této suspenze při 520 nm je zhruba 10 a koncentrace proteinu je zhruba 24 pg/ml.
    -333.1.3. Vazba biotinylovaného BlaR-CTD na kuličky zlata.
    to · toto·· toto·· tf · · * to ···· toto · to » to « #·· · ♦ ♦ ♦ •to·* to·· toto · ·* ·*
    Roztok biotinylovaného BlaR-CTD, připraveného v příkladu
    3.1.1. se zředí 114,7 násobně pufrem HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCl 500 mM, MgCl2 250 mM, BSA 10 mg/ml). Při teplotě okolí se smíchá 22,5 objemových částí tohoto zředěného roztoku biotinylovaného BlaR-CTD, 7,5 objemových částí pufru HNM-BSA, 9,27 objemových částí suspenze částic zlata, sloužících jako označovač biotinylovaného BlaR-CTD a 6 objemových částí suspenze referenčních částic zlata (viz příklad 3.1.4 uvedený dále).
    3.1.4. Nezávislé referenční činidlo
    Jako referenční činidlo se použije také referenční látka, která vytváří pruh, jehož intenzita dovoluje rychlé stanovení množství antibiotik, přítomných ve vzorku. Pro tento účel se použijí částice zlata o průměru 40 nm na které byly naneseny kozí protilátky proti králičímu imunoglobulinu. Tyto částice jsou dodávány společností BRITISH BIOCELL (Ref. GAR40) ve formě suspenzí ve vodném roztoku tetraboritanu sodného 2 mM při pH 7,2, stabilizované nitridem sodným 0,1%. Optická hustota této suspenze při 520 nm je zhruba 3 a koncentrace proteinu je zhruba 6 gg/ml.
    3.2. Záchytné látky
    3.2.1. První záchytná látka - referenční antibiotikum.
    8 ml roztoku obsahujícího 213 mg lidského gamaglobulinu
    -34* · ···· ···* • · · * · ···· · · · · · • · · · · · · · · ···> »·· »· · ·· ·· (G4386, Sigma) a 8,6 mg hydrochloridu 2-iminothiolanu (Aldrich, 33056-6) v pufru uhličitanu sodného (100 mM, pH 9) se inkubují po jednu hodinu při teplotě 25 °C.
    Odděleně se inkubuje po jednu hodinu při teplotě 25 °C 20 ml roztoku obsahujícího 119,8 mg cefalosporinu-C a 54 mg sulfosukcinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyklohexan-1karboxylátu (sSMCC, 22322 Pierce) v pufru uhličitanu sodného (100 mM, pH 9).
    Dva roztoky, které byly připraveny dříve se potom smíchají. pH vzniklého roztoku se upraví na 7,1 přidáním 3 ml NaH2PO4 500 mM a inkubuje se po dvě hodiny při teplotě 25 °C. Směs získaná po inkubaci se dialyzuje třikrát proti 1 litru pufru fosforečnanu sodného (10 mM, pH 7,5). Vzniklý roztok se filtruje na filtru 0,22 μπι, potom se alikvotuje a zmrazí při teplotě -20 °C až do použití.
    Při použití se alikvoty rozmrazí a přidá se potravinářské barvivo před uskutečněním nanesení na membrána aby byla v každém okamžiku zaručena přesná poloha nanesení a kvalita stopy.
    První záchytná látka dovoluje fixaci BlaR-CTD vázaného na kuličky zlata, přítomné v přebytku vzhledem k množství antibiotik přítomných ve vzorku.
    3.2.2. Druhá záchytná látka - látka schopná fixovat nezávislé referenční činidlo.
    Jako druhá záchytná látka se používá roztok králičího
    -35• ·
    9 · 99*9 »99 « 9 · 9 · ···· · · · 9 • « «99 »99 ···· ·*· ·♦ 9 99 imunoglobulinu (Sigma I 5006) v koncentraci 0,5 mg/ml immunoglobulinu v pufru fosforečnanu sodného 10 mM, pH 7,5, lidský gammaglobulin 5 mg/ml. Tato druhá záchytná látka zachytává referenční činidlo během migrace kapaliny na testovacím zařízení.
    3.3 Testovací zařízení.
    Používá se testovací zařízení, obsahující membrány (2), (3) a (4), sestavené způsobem, který byl popsán v příkladu 1.1. Membrána (3) tohoto zařízení nese na blízkém konci záchytnou látku popsanou v příkladu 3.2. a na vzdáleném konci záchytnou látku popsanou v příkladu 3.2.2. Záchytné látky jsou naneseny způsobem, který byl popsán v příkladu
    1.2.
    3.4. určení antibiotik v mléku.
    3.4.1. Test ve 3 minutách - Rychlý test
    Připraví se sedm vzorků mléka, které obsahují postupně 0:l;2;3;4;5 a 6 ppb penicilinu G. Každý z těchto roztoků je potom analyzován následujícím způsobem:
    *
    Odebere se alikvot 200 μί vzorku mléka a 45,27 μί roztoku připraveného v příkladu 3.1.3, které se umístí do skleněné baňky. Testovací zařízení se umístí vertikálně do baňky tak, aby byl první konec testovacího zařízení v kontaktu se směsí a aby druhý konec spočíval na stěně skleněné baňky. Směs se ponechá migrovat testovacím zařízením a soubor se nechá inkubovat po 2 minuty při teplotě 47 °C.
    t · fc · fc fcfcfc9 * fc * ·
    -36• fcfcfc fcfcfc « · fcfc fc fcfc « ·· *·
    Níže uvedená Tabulka 1 udává výsledky získané pro 7 vzorků, které byly testovány. Detekovaným pruhům byla přiřazena intenzita v rozmezí od 0 do 10, přičemž hodnota 10 znamená nej intenzivnější pruh a hodnota 0 znamená nejméně intenzivní pruh. V této stupnici byla hodnota 6 přiřazena referenčnímu pruhu. Intenzita signálu pozorovaného v prvním detekčním pruhu je nepřímo úměrná množství penicilinu G, který je přítomen ve vzorku.
    Penicilín G (ppb)
    Tabulka 1
    Intenzita
    1. pruh 2. pruh
    V tomto příkladu pokud byl první pruh méně intenzivní než referenční pruh, byl test považován za pozitivní. Výsledky uvedené v Tabulce 1 ukazují, že test dovoluje detekovat za 5 minut méně než 4 ppb penicilinu G ve vzorku mléka.
    Testy byly také prováděny s dalšími antibiotiky s βlaktamovým jádrem za stejných podmínek. Tento test, trvající 3 minuty dovoluje detekovat amoxicilin až do 5 ppb, ampicilin až do 5 ppb, cloxacilin méně než 10 ppb, dicloxacilin méně než 20 ppb, oxacilin méně než 20 ppb a cefapirin až do 20 ppb ve vzorku mléka.
    -374
    4444
    4 · 4 *
    4 4 4 ·
    4« 44
    1.3.2. Test v 5 minutách
    Bylo připraveno šest vzorků mléka obsahujících postupně 0; 2; 4; 6; 8 a 10 ppb cloxacilinu. Každý z těchto roztoků byl potom analyzován následujícím způsobem:
    Odebere se alikvot 200 μΐ vzorku mléka a 45,27 μΐ roztoku připraveného v příkladu 3.1.3, které se umístí do skleněné baňky. Směs se inkubuje po 3 minuty při teplotě 47 °C. Testovací zařízení se umístí vertikálně do skleněné baňky tak, aby byl první konec testovacího zařízení v kontaktu se směsí a aby druhý konec spočíval na stěně skleněné baňky. Směs se ponechá migrovat testovacím zařízením a soubor se nechá inkubovat po 2 minuty při teplotě 47 °C.
    Níže uvedená Tabulka 2 udává výsledky získané pro 6 vzorků, které byly testovány. Detekovaným pruhům byla přiřazena intenzita v rozmezí od 0 do 10, přičemž hodnota 10 znamená nej intenzivnější pruh a hodnota 0 znamená nejméně intenzivní pruh. V této stupnici byla hodnota 6 přiřazena referenčnímu pruhu. Intenzita signálu pozorovaného v prvním detekčním pruhu je nepřímo úměrná množství cloxacilinu, který je přítomen ve vzorku.
    • · ····♦ • · · ·· ·
    -38«·»+ ·· • · · * * ♦ · · ·· ··
    Cloxacilin Tabulka 2 Intenzita (ppb) 1. pruh 2. pruh 0 10 6 2 6 6 4 5 6 6 3 6 8 3 6 10 3 6 V tomto příkladu pokud byl první pruh méně intenzivní než druhý pruh, byl test považován za pozitivní. Výsledky uvedené v Tabulce 2 ukazují, že test dovoluje detekovat za 5 minut méně než 4 ppb cloxacilinu ve vzorku mléka.
    Testy byly také prováděny s dalšími antibiotiky s βlaktamovým jádrem za stejných podmínek. Tento test, trvající 5 minut dovoluje detekovat penicilín G až do 3 ppb, amoxicilin až do 4 ppb, ampicilin až do 4 ppb, dicloxacilin až do 8 ppb, oxacilin až do 8 ppb, cefapirin až do 16 ppb, ceftiofur až do 100 ppb, cefchinon méně než 20 ppb, nafcilin až do 20 ppb a cefazolin až do 60 ppb ve vzorku mléka.
    Tento test je obzvláště vhodný jako test před vypouštěním kamionů mléka do nádrží.
    1.3.3. Test v 9 minutách
    Bylo připraveno 6 vzorků čerstvého mléka obsahujících
    -39* 4 4 4
    4···· · *
    444 postupně 0; 4; 6; 8; 10 a 12 ppb cefapirinu. Každý z těchto roztoků byl potom analyzován následujícím způsobem.
    Odebere se alikvot 200 μΐ vzorku mléka a 45,27 μΐ roztoku připraveného v příkladu 3.1.3, které se umístí do skleněné baňky. Směs se inkubuje po 7 minut při teplotě 47 °C. Testovací zařízení se umístí vertikálně do skleněné baňky tak, aby byl první konec testovacího zařízení v kontaktu se směsí a aby druhý konec spočíval na stěně skleněné baňky. Směs se ponechá migrovat testovacím zařízením a soubor se nechá inkubovat po 2 minuty při teplotě 47 °C.
    Níže uvedená Tabulka 3 udává výsledky získané pro 6 vzorků, které byly testovány. Detekovaným pruhům byla přiřazena intenzita v rozmezí od 0 do 10, přičemž hodnota 10 znamená nejintenzivnějši pruh a hodnota 0 znamená nejméně intenzivní pruh. V této stupnici byla hodnota 6 přiřazena referenčnímu pruhu. Intenzita signálu pozorovaného v prvním detekčním pruhu je nepřímo úměrná množství cefapirinu, který je přítomen ve vzorku.
    Tabulka 3
    Cefapirin (ppb)
    1.
    Intenzita pruh 2. pruh
    6 6 6 6 • ··· fl «
    -40• flfl*
    4« ··· * · « · • ·· * ·· ·♦
    V tomto příkladu pokud byl první pruh méně intenzivní než druhý pruh, byl test považován za pozitivní. Výsledky uvedené v Tabulce 3 ukazují, že test dovoluje detekovat za 9 minut až do 6 ppb cefapirinu ve vzorku mléka.
    Testy byly také prováděny s dalšími antibiotiky s βlaktamovým jádrem za stejných podmínek. Tento test, trvající 9 minut dovoluje detekovat penicilín G až do 3 ppb, amoxicilin - až do 4 ppb, ampicilin až do 4 ppb, cloxacilin až do 4 ppb, dicloxacilin méně než 8 ppb, oxacilin méně než 8 ppb, ceftiofur až do 80 ppb, cefchinon méně než 20 ppb, nafcilin méně než 20 ppb a cefazolin až do 45 ppb ve vzorku mléka.
    Tento test, prováděný za 9 minut tedy dovoluje detekovat všechna antibiotika kontrolovaná v současné době evropskými úřady a to až do zákonných limitů, stanovených těmito úřady.
    1.3.4. Test ve 20 minutách
    Bylo připraveno šest vzorků čerstvého mléka obsahujících postupně 0; 20; 30; 40; 50 a 60 ppb ceftiofuru. Každý z těchto roztoků byl potom analyzován následujícím způsobem:
    Odebere se alikvot 200 μΐ vzorku mléka a 45,27 μΐ roztoku připraveného v příkladu 3.1.3, které se umístí do skleněné baňky. Směs se inkubuje po 18 minut při teplotě 47 °C. Testovací zařízení se umístí vertikálně do skleněné baňky tak, aby byl první konec testovacího zařízení v kontaktu se směsí a aby druhý konec spočíval na stěně skleněné baňky.
    -41Směs se ponechá migrovat testovacím zařízením a soubor se nechá inkubovat po 2 minuty při teplotě 47 °C.
    Níže uvedená Tabulka 4 udává výsledky získané pro 6 vzorků, které byly testovány. Detekovaným pruhům byla přiřazena intenzita v rozmezí od 0 do 10, přičemž hodnota 10 znamená nejintenzivnější pruh a hodnota 0 znamená nejméně intenzivní pruh. V této stupnici byla hodnota 6 přiřazena referenčnímu pruhu. Intenzita signálu pozorovaného v prvním detekčním pruhu je nepřímo úměrná množství ceftiofuru, který je přítomen ve vzorku.
    Tabulka 4
    Ceftiofur (ppb) n
    v
    Intenzita
    1. pruh 2. pruh
    V tomto příkladu pokud byl první pruh méně intenzivní než druhý pruh, byl test považován za pozitivní. Výsledky uvedené v Tabulce 4 ukazují, že test dovoluje detekovat za 20 minut až do 30 ppb ceftiofuru ve vzorku mléka.
    Tento test ve 20 minutách tedy dovoluje detekovat v jediném testu všechna antibiotika kontrolovaná v současné době evropskými a americkými úřady a to až do zákonných limitů, stanovených těmito úřady.
    * *··· · · • · · *· ·
    -42,«·» ···
    Příklad 4. Použití testovacího zařízení v plastovém obalu. Používá se testovací zařízení, které bylo popsáno v příkladu 1.6. V tomto případě se uvedení vzorku do kontaktu s testovacím zařízením provádí nanesením inkubované směsi otvorem ve tvaru misky, která byla k tomuto účelu vytvořena.
CZ20001059A 1997-10-07 1998-10-06 Zpusob detekce analytu v tekutém mlécném produktu a testovací zarízení k provádení zpusobu CZ301093B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BE9700807A BE1011487A3 (fr) 1997-10-07 1997-10-07 Dispositif d'essai pour la determination d'analytes dans un produit laitier liquide.
BE9800485A BE1012049A6 (fr) 1998-06-25 1998-06-25 Procede pour la determination d'antibiotique a noyau beta-lactame dans un liquide biologique.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20001059A3 true CZ20001059A3 (cs) 2000-09-13
CZ301093B6 CZ301093B6 (cs) 2009-11-04

Family

ID=25663116

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20001059A CZ301093B6 (cs) 1997-10-07 1998-10-06 Zpusob detekce analytu v tekutém mlécném produktu a testovací zarízení k provádení zpusobu

Country Status (23)

Country Link
US (2) US20020127737A1 (cs)
EP (1) EP1023603B1 (cs)
JP (2) JP2001519533A (cs)
KR (1) KR100614632B1 (cs)
CN (1) CN1126956C (cs)
AR (1) AR013671A1 (cs)
AT (1) ATE297016T1 (cs)
AU (1) AU738143B2 (cs)
BR (1) BR9812876B1 (cs)
CA (1) CA2305774C (cs)
CZ (1) CZ301093B6 (cs)
DE (1) DE69830416T2 (cs)
DK (1) DK1023603T3 (cs)
ES (1) ES2244083T3 (cs)
IL (1) IL134939A (cs)
NO (1) NO20001817D0 (cs)
NZ (1) NZ503430A (cs)
PL (1) PL191687B1 (cs)
PT (1) PT1023603E (cs)
RU (1) RU2206093C2 (cs)
SI (1) SI1023603T1 (cs)
TR (1) TR200000921T2 (cs)
WO (1) WO1999018439A1 (cs)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ298192B6 (cs) * 1998-06-25 2007-07-18 Neogen Corporation (Michigan Corporation) Zpusob urcování antibiotik s beta-laktamovým jádrem v biologické tekutine

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1923471T3 (da) 1999-04-20 2013-04-02 Illumina Inc Detektion af nukleinsyrereaktioner på bead-arrays
US6447657B1 (en) 2000-12-04 2002-09-10 Roche Diagnostics Corporation Biosensor
EP1417491A4 (en) * 2001-07-18 2004-08-11 Siliang Zhou TEST STRIP FOR SIDE FLOW ASSAY OF A SAMPLE CONTAINING WHOLE CELLS
CN1300586C (zh) * 2003-09-30 2007-02-14 江西中德生物工程有限公司 展青霉素免疫层析检测试纸的制作方法与应用
EP1733235A1 (en) * 2004-01-29 2006-12-20 DSM IP Assets B.V. Improved lateral flow binding assay
US8003407B2 (en) * 2004-07-29 2011-08-23 Relia Diagnostic Systems, Llc Lateral flow system and assay
CN100356171C (zh) * 2005-09-13 2007-12-19 中国农业科学院畜牧研究所 一种检测鲜牛奶和巴氏牛奶中还原奶的方法
FR2918460B1 (fr) * 2007-07-02 2013-10-04 Najim Chaibi Nouveau dispositif permettant l'obtention des resultats des systemes abo,rhesus et autres pherotypes et systemes rares, rai.
US8005280B2 (en) * 2007-12-12 2011-08-23 Jadak, Llc Optical imaging clinical sampler
NZ596163A (en) * 2009-04-15 2014-01-31 Relia Diagnostic Systems Inc Diagnostic devices and related methods
CN102478573A (zh) * 2010-11-29 2012-05-30 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 一种评价乳制品检测中庆大霉素试纸条有效性的方法
JP5693938B2 (ja) * 2010-12-10 2015-04-01 旭化成株式会社 乳汁中の特定物質を検出する方法
WO2013053953A1 (en) * 2011-10-14 2013-04-18 Université de Liège Method for measuring beta-lactam antibiotics
BR112014010718B1 (pt) * 2011-11-16 2020-12-22 Becton, Dickinson And Company métodos, sistemas, dispositivos e kits para detecção de analito em amostra
JP6162370B2 (ja) * 2012-05-30 2017-07-12 古河電気工業株式会社 イムノクロマトグラフィー用試験片
IN2014DN10498A (cs) * 2012-06-13 2015-08-21 Asahi Chemical Ind
KR101429193B1 (ko) * 2013-05-10 2014-08-13 호서대학교 산학협력단 클로르테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머
CN103897046A (zh) * 2013-05-23 2014-07-02 华中农业大学 β-内酰胺类抗生素残留检测的受体分析法与试剂盒
CN104198699B (zh) * 2014-09-04 2016-06-15 深圳市领治医学科技有限公司 一种快速诊断试纸及其制备方法
JP6254994B2 (ja) * 2014-11-18 2017-12-27 株式会社ニチレイバイオサイエンス 検査キット
AU2016224107B2 (en) 2015-02-27 2021-09-23 Mastaplex Limited Bacteria identification and antimicrobial susceptibility test
US10551381B2 (en) 2016-02-11 2020-02-04 Massachusetts Institute Of Technology Anti-dengue virus NS1 protein monoclonal antibodies
CN106568965A (zh) * 2016-10-14 2017-04-19 广州安诺食品科学技术有限公司 金胺o胶体金检测卡及其制备方法
EP3374771A1 (en) 2016-12-28 2018-09-19 Neogen Corporation Implement analyzing device and method for utilizing the same
USD834721S1 (en) 2017-03-03 2018-11-27 Neogen Corporation Assay cartridge

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4239852A (en) * 1978-06-12 1980-12-16 Penicillin Assays, Inc. Antibiotic detection method
CA1185881A (en) * 1982-02-01 1985-04-23 Jacques Degelaen ENZYMATIC PROCESS FOR THE DETERMINATION OF .beta.-LACTAM ANTIBIOTICS
US4786594A (en) * 1986-05-14 1988-11-22 Syntex (U.S.A.) Inc. Enzyme immunoassay
US4918025A (en) * 1987-03-03 1990-04-17 Pb Diagnostic Systems, Inc. Self contained immunoassay element
CA1303983C (en) * 1987-03-27 1992-06-23 Robert W. Rosenstein Solid phase assay
DE3842702A1 (de) * 1988-12-19 1990-06-21 Boehringer Mannheim Gmbh Testtraeger zur analytischen untersuchung einer probenfluessigkeit mit hilfe einer spezifischen bindungsreaktion zweier bioaffiner bindungspartner und entsprechendes testverfahren
US5234813A (en) * 1989-05-17 1993-08-10 Actimed Laboratories, Inc. Method and device for metering of fluid samples and detection of analytes therein
CA2020029A1 (en) * 1989-07-12 1991-01-13 Yatin B. Thakore Device and method for separation of plasma from blood and determination of blood analytes
GB9009692D0 (en) * 1990-04-30 1990-06-20 Ucb Bioproducts An enzymatic method of determining beta-lactam ring antibiotics
US5648274A (en) * 1991-05-29 1997-07-15 Smithkline Diagnostics, Inc. Competitive immunoassay device
JP2948318B2 (ja) * 1992-03-10 1999-09-13 クイデル コーポレイション 特異的結合アッセイ用の赤血球の分離方法
PT653639E (pt) * 1993-11-12 2000-06-30 Unilever Nv Equipamentos analiticos e metodos para a sua utilizacao
WO1996010177A1 (en) * 1994-09-28 1996-04-04 Spectral Diagnostics Inc. Method and device for determination of proteins
US5662813A (en) * 1994-10-21 1997-09-02 Bioseparations, Inc. Method for separation of nucleated fetal erythrocytes from maternal blood samples
WO1996015453A1 (en) * 1994-11-14 1996-05-23 Spectral Diagnostics Inc. Method and device for determination of proteins employing antigen/antibody reactions
JPH08285849A (ja) * 1995-04-14 1996-11-01 Mochida Pharmaceut Co Ltd 簡易測定装置およびこれを用いる測定方法
US5712172A (en) * 1995-05-18 1998-01-27 Wyntek Diagnostics, Inc. One step immunochromatographic device and method of use
EP0823877B1 (en) * 1995-05-02 2001-11-07 Carter Wallace, Inc. Process of preparing a laminated substrate
ATE334392T1 (de) * 1995-05-09 2006-08-15 Beckman Coulter Inc Vorrichtungen und verfahren zur abtrennung zellulärer blutkomponenten von flüssigen blutanteilen
US5981294A (en) * 1995-11-29 1999-11-09 Metrika, Inc. Device for blood separation in a diagnostic device
US5821073A (en) * 1996-05-09 1998-10-13 Syntron Bioresearch, Inc. Method and apparatus for single step assays of whole blood
US6001658A (en) * 1996-09-13 1999-12-14 Diagnostic Chemicals Limited Test strip apparatus and method for determining presence of analyte in a fluid sample
US5958714A (en) * 1996-10-02 1999-09-28 Safety Associates, Inc. Test kits for determining at least two specific analytes in foods and other complex matrices
US6319466B1 (en) * 1997-07-16 2001-11-20 Charm Sciences, Inc. Test device for detecting the presence of a residue analyte in a sample
US5985675A (en) * 1997-12-31 1999-11-16 Charm Sciences, Inc. Test device for detection of an analyte

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ298192B6 (cs) * 1998-06-25 2007-07-18 Neogen Corporation (Michigan Corporation) Zpusob urcování antibiotik s beta-laktamovým jádrem v biologické tekutine

Also Published As

Publication number Publication date
US20040096356A1 (en) 2004-05-20
US20020127737A1 (en) 2002-09-12
WO1999018439A1 (fr) 1999-04-15
RU2206093C2 (ru) 2003-06-10
CN1274423A (zh) 2000-11-22
AU738143B2 (en) 2001-09-13
AR013671A1 (es) 2001-01-10
AU9424898A (en) 1999-04-27
DE69830416D1 (de) 2005-07-07
KR20010024457A (ko) 2001-03-26
BR9812876A (pt) 2000-08-08
NO20001817L (no) 2000-04-07
TR200000921T2 (tr) 2000-07-21
NO20001817D0 (no) 2000-04-07
NZ503430A (en) 2001-09-28
PT1023603E (pt) 2005-10-31
EP1023603A1 (fr) 2000-08-02
CA2305774A1 (fr) 1999-04-15
PL339901A1 (en) 2001-01-15
PL191687B1 (pl) 2006-06-30
KR100614632B1 (ko) 2006-08-22
CZ301093B6 (cs) 2009-11-04
DK1023603T3 (da) 2005-09-12
DE69830416T2 (de) 2005-11-10
IL134939A0 (en) 2001-05-20
BR9812876B1 (pt) 2011-09-06
JP2009133877A (ja) 2009-06-18
ES2244083T3 (es) 2005-12-01
IL134939A (en) 2004-05-12
ATE297016T1 (de) 2005-06-15
CA2305774C (fr) 2011-06-07
JP2001519533A (ja) 2001-10-23
SI1023603T1 (sl) 2005-12-31
CN1126956C (zh) 2003-11-05
EP1023603B1 (fr) 2005-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20001059A3 (cs) Testovací zařízení pro provádění analýzy v tekutém mléčném produktu
US9274112B2 (en) Device and method for detection of analytes
KR920009420B1 (ko) 고체상 분석장치 및 이를 이용하는 방법
US5126276A (en) Method for the determination and measurements of more than one unknown material in a single surface of a multianalytic assay
US20080090262A1 (en) Method to simultaneously detect different antibodies and antigens in clinical alimentary and environmental samples
EP0998676A1 (en) A test device and method for detecting the presence of a residue analyte in a sample
US8106155B2 (en) Test kit for determining process for determining antibiotics containing a beta-lactam ring in a biological fluid
US8664001B2 (en) Immunochemical filter device and methods for use thereof
CA2570383C (en) Filter device, the method, kit and use thereof
BE1011487A3 (fr) Dispositif d&#39;essai pour la determination d&#39;analytes dans un produit laitier liquide.
MXPA00003325A (en) Testing device for determining analytes in a liquid dairy product
CN108463726B (zh) 检测分析物的方法
JP2004177321A (ja) 微量検出方法及び装置
MXPA00012583A (en) METHOD FOR DETERMINING ANTIBIOTICS WITH&amp;bgr;-LACTAM CORE IN A BIOLOGICAL FLUID

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20141006