KR20010024457A

KR20010024457A - 액체 유제품내의 분석물질을 결정하기 위한 검정 장치

Info

Publication number: KR20010024457A
Application number: KR1020007003770A
Authority: KR
Inventors: 쟈끄 데겔랜; 장-마리 프레르; 베노이뜨 그라니에; 베르나르뜨 요리스
Original assignee: 지. 카파트; 유씨비 소시에떼아노님
Priority date: 1997-10-07
Filing date: 1998-10-06
Publication date: 2001-03-26
Also published as: US20040096356A1; US20020127737A1; WO1999018439A1; RU2206093C2; CN1274423A; AU738143B2; CZ20001059A3; AR013671A1; AU9424898A; DE69830416D1; BR9812876A; NO20001817L; TR200000921T2; NO20001817D0; NZ503430A; PT1023603E; EP1023603A1; CA2305774A1; PL339901A1; PL191687B1

Abstract

본 발명은 제 1 및 제 2 단부를 가진 솔리드 지지체(1)를 포함하는 유제품의 모세관 이동에 의해 액체 유제품내의 분석물질을 검출하기 위한 검정 장치로서, 제 1단부로부터 시작하여 연속적으로, 분석된 액체를 정화시키도록 하는 막(2), 하나 이상의 포획 물질을 움직이지 못하게 하는 막(3)과 흡수막(4)이 고정되어 있다. 본 발명은 또한 검정 장치에 의해 액체 유제품내의 분석물질을 검출하고 수량화하는 방법과 상기 검정 장치를 포함하는 검정 키트에 관한 것이다.

Description

액체 유제품내의 분석물질을 결정하기 위한 검정 장치{TESTING DEVICE FOR DETERMINING ANALYTES IN A LIQUID DAIRY PRODUCT}

현재에, 많은 나라의 위생 조건은 가축의 사육에 흔히 사용되는 수의 약제 및 호르몬과 같은, 다양한 물질의 유제품내에 존재를 규칙적으로 모니터링하는 것을 필요로 한다. 의학적 이유 때문에, 이들 물질은 사람이 소비하는 유제품내에서 제거해야 한다.

다른 경우에, 가축 사육을 최상으로 하기 위해서 내인성 물질의 존재를 우유내에서 검출할 수 있는 실험을 하는 것이 바람직하다. 특히, 우유내의 호르몬 레벨의 빠른 결정은 재생산에 양호한 상태(phases)를 쉽게 확인시켜줄 수 있다.

여전히 다른 경우에, 다양한 동물족의 우유로부터 뽑은 유제품의 원산지를 모니터하는데 신뢰성과 실행성을 가진 방법을 찾게된다. 그러므로, 다른 족에 대해서 특정 족의 우유의 단백질 특성의 존재를 확인할 수 있게 만드는 방법을 찾고 있다.

특히, 다양한 실험은 생물학적 액체내의 분석물질의 검출에 대한 문헌에 잘알려져 있다. 이들 실험은 일반적으로 인식제(recognition agent)(수용체 또는 항체) 및 식별제(방사선 원소, 효소, 형광제 등)를 사용하는 검출 방법을 사용하며, 인식 제는 분석물질 또는 이런 분석 물질의 유사물을 특별히 인식하며, 이런 시약들을 이후에 검출 시약이라 부른다. 선택된 원소에 따라서, 방사 면역 검정(RIA), 방사 수용체 검정(RRA), 효소 면역 검정(EIA) 등의 용어를 사용한다. 이들 일반적인 원리에서, 이들 실험은 분석물질 존재의 량을 표시하는 결과치를 얻을 수 있는 상술한 요소(검출 시약)들 중 두 요소의 최소 조합을 사용한다.

선택된 검출 방법에 따라서, 식별제는 인식제 또는 분석물질 또는 인식제에 의한 인식에서 분석물질과 유사한 물질에 교대로 결합될 수 있음을 알 수 있다. 또한 인식제 또는 분석물질 또는 분석물질과 유사한 물질이 본질적으로 식별제를 포함하고 있는 방법도 있다(예들 들어, 식별용 방사성 분석물질).

유제품에서, 가장 흔히 공지되어 있는 분석물질 검출 실험은 항생 물질의 검출에 관한 것이다. 사실상 젖소의 약간의 전염병을 치료하는데 항생 물질을 사용하는 것은 잘 알려져 있다.

그러나, 분명한 의학적 이유 때문에, 사람이 소비하고자 하는 우유는 원칙적으로 항생 물질의 어떠한 트레이스(trace)도 없어야 한다. 특히 0.005 I.U/ml 이하의 페니실린 농도는 치즈, 요쿠르트 등의 우유 파생 제품의 제조동안 나쁜 결과를 줄 수 있다.

다양한 사항이 직면될 수 있다. 첫 번째 경우에, 예들 들어 로리(화물차; lorry)로 이동하기 전에 농장에서의 항생 물질의 존재를 검출하기 위해서, 매우 빠르고(5분 이하) 간단한 실험이 우선적으로 선행될 것이다. 또한, 예들 들어 처리해야할 항생 물질이 알려질 때, 특히 이 실험이 문제의 항생 물질을 법률 기준에 따라 검출하도록 할 때 이런 종류의 급속한 실험을 사용하는 것은 약간의 문제점에 직면할 수 있다. 두 번째 경우, 빨리 실험하는 것이 중요하지 않을 때, 법률 기준에 따라 항생 물질의 대부분을 검출하는 것이 중요하다.

이와 관련해서, 약간의 나라에서의 법령은 아주 특정한 량의 기준을 부과하고 있다. 예들 들어, 미국 당국은 6개의 아래의 항생 물질의 우유내의 농도를 특정치를 초과하지 않을 것을 요구한다. 즉, 페니실린 5ppb, 암피실린 10ppb, 아목시실린 10ppb, 클록서실린 10ppb, 세파피린 20ppb, 세프티오푸르 50ppb를 초과하지 않은 것을 요구한다. 영국도 페니실린 4ppb, 암피실린 4ppb, 아목시실린 4ppb, 클록서실린 30ppb, 디클록서실린 30ppb, 옥사실린 30ppb, 세파피린 10ppb, 세프티오푸르 100ppb, 세프퀴노네 20ppb, 나프실린 30ppb 및 세파졸린 50ppb로 기준량을 부과하고 있다.

그러므로, 항생 물질의 대부분을 검출하도록 하는 실험에 근접하는 것이 바람직하다. 더욱이, 낙농 산업에서, 속도, 민감성 및 간단성의 모든 특성을 가진 실험이 부재시, 이들 모두를 전체적으로 커버할 수 없어도, 이들 3개의 매개변수의 가장 양호한 조합을 허용하는 실험이 바람직한 것으로 생각할 수 있다.

미국 특허 제 4,239,852 호는 β-락탐 링(β-lactam ring)을 가진 항생 물질을 우유내에서 검출하기 위한 미생물학적 공정을 기술한다. 이 공정에 따라서, 우유의 샘플은 먼저 항생 물질 및 특히 바실루스 스테아로고온균(bacillus stearothermophilus) 에 매우 민감한 미생물의 셀부분(cell part)의 존재하에서 먼저 배양되며, 두 번째로 방사능 원소 또는 효소로 표지(labelled"(tagged)")되어 있는 항생 물질의 존재하에서 배양된다. 배양은 샘플내의 존재하는 항생 물질 및 표지된 항생 물질이 셀부분에 결합하도록 허용하는 상태하에서 실행된다.

배양 다음에, 셀부분은 혼합물로부터 분리되고 그 다음 세척된다. 계속해서, 셀부분에 결합된 표지 항생 물질의 량은 결정되고 기준과 비교된다. 셀부분에 결합된 표지 항생 물질의 량은 분석된 우유 샘플내에 존재한 항생 물질의 농도에 반 비례한다.

이러한 공정은 특히 셀부분을 혼합물로부터 분리하는 단계에서 상당히 셈세한 처리를 필요로 한다. 추가로, 가장 민감한 변경예에서, 이런 공정은 방사능 원소(¹⁴C 또는¹²⁵I)로 표지된 항생 물질을 사용한다. 이런 경우에, 우유내의 항생 물질 존재량 또는 존재하지 않은 것을 결정하기 위해서는 예들 들어 신틸레이션 계수기(sintillation counter)와 같은 특정 기구의 사용을 필요로 한다. 추가로, 심지어 매우 소량의 반사능 제품을 처리하는 경우도 분석을 실행하는 사람이 위험에서 완전히 자유로울 수는 없다.

유럽 특허출원 제 593 112 호는 우유내의 항생 물질의 검출을 허용하는 다른 방법을 기술한다. 이 방법은 바실루스 스테아로고온균과 같은, 항생 물질-민감성 미생물로부터 격리된 단백질을 사용한다. 이런 단백질은 추가로 과산화효소와 같은 효소로 표지된다.

실험은 다음과 같이 진행된다. 우유 샘플을 표지된 단백질의 존재하에서 튜브내에 배양한다. 배양후, 우유를 기준 항생 물질이 고정되어 있는 벽을 가진 제 2 튜브로 이동한다. 두 번째 배양을 실행하고 그 다음 튜브의 내용물을 제거한다. 상기 제 2 튜브의 벽을 자체 제거되는 세척액으로 3번 세척하고, 그 다음 제 2튜브내에 존재하는 잔류물을 한 편의 흡수 페이퍼로 이동하고, 그리고 나서 제 2튜브에 칼라링 기판을 추가하여 다시 한번 배양하고, 그 다음 칼라의 현상을 지연하는 용액을 추가하고, 튜브의 색채를 항생 물질의 표준 샘플상에 동일하게 실행된 동일한 실험의 색채와 비교한다. 지지체상에 이동 불가능한 표지된 단백질의 량 그러므로 색채의 세기는 분석된 우유 샘플내에 존재하는 항생 물질의 량에 반비례한다.

이런 특허출원의 예 1에 따라서, 이런 실험은 5ppb 정도의 농도 아래로 페니실린 G를 검출할 수 있게 만들고 아목시실린(5ppb), 암피실린(10ppb), 세파피린 (5ppb), 세프티오푸르(5ppb)를 검출할 수 있게 만든다.

그러나, 이 실험은 특히 숙련되지 못한 사람이 수행하기에 매우 지루하다. 사실상, 이 실험은 한 용기로부터 다른 용기로 액체 및 잔류물을 이동하는 단계와 다수 번의 린스 단계를 포함하는 여러 단계로 이루어져 있다. 이 실험에 필요한 단계의 수와 형태가 정해지면, 작동자의 경험적인 노하우에 크게 의존하여 신뢰성 있는 결과를 얻을 수 있다.

추가로, 결과를 해석함에 있어서 동일하게 수행되어진 두 실험을 필요로 함으로써, 작동수를 크게 증가하고 더욱이 작동을 복잡하게 한다.

다른 형태의 효과 공정이 기재되어 있으며, 여기서는 또한 특정 효소, 즉 Actinomadura R 39(이후에 "효소 R 39로 언급함)로 생산되는 용해성 외세포질 D-알안리-D 알안닌 카복시페프티다스(soluble exocellular D-alanyl-D-alanine carboxypeptidase)의 사용을 근거한, 우유내의 항생 물질의 저 농도를 결정할 수 있다( 제이. 엠. 프레레 등의, 항균제 및 화학요법, 18(4), 506-510(1980) 및 유럽특허 제 85 667 호 및 제 468 946 호). 효소 R39는 다양한 펩티드의 D-알안리-D 알안닌 그룹을 가수분해하는 특정 활성을 소유하고 또한 약간의 유화에스테르를 가수분해할 수 있다.

추가로, 효소 R39는 β-락탐 링을 가진 항생 물질과 반응하여 불활성이고 거의 변경할 수 없는 동일질량 효소-항생 물질 복합물을 매우 급속하게 형성한다.

이 실험의 가장 최근의 변경예(유럽특허 제 468 946 호)에서, 액체의 샘플의 사전설정 볼륨을 샘플내에 존재할 수 있는 β-락탐 항생 물질이 효소와 반응하여 불활성이고 거의 변경할 수 없는 동일질량 효소-항생 물질 복합물을 허용하는 조건하에서 효소 R39의 사전설정 량으로 배양한다.

계속해서, 유화에스테르 기질의 사전설정 량을 제 1단계하에서 얻은 제품으로, 기질이 제 1배양의 과정에서 항생 물질과 복합되지 않은 잔류 효소 R 39에 의해 가수분해되도록 허용하는 조건하에서, 배양한다. 그러므로 이렇게 형성된 머캅토알카노익 산(mercaptoalkanoic acid)의 량을 머캅토알카노익 산의 프리 SH 그룹과 반응하여 색채를 생성할 수 있는 시약의 도움으로 색채 검정함으로써 결정한다. 색채의 세기를 종래 알려진 량의 항생 물질을 포함하는 샘플로부터 이전에 설정된 기준과 비교한다. 수량적 결정을 분광 광도계로 측정함으로써 실행할 수 있으며, 우유의 경우에, 사전에 샘플을 정화할 필요가 있을 수 있다.

분명하게, 이 실험은 소수의 단계들을 포함하며 유럽 특허출원 제 593 112 호에 기술한 실험보다 간단하게 실행된다. 그러나, 이것은 β-락탐 링을 가진 항생 물질의 검출에 제한되고 효소 R 39로 이용가능한 초기 검출 제한값에 제한된다. 이와 같이, 이런 실험은 다른 항생 물질 수용체에 사용될 수 없으며 우유내의 다른 분석물질을 검출하기 위한 기본자료로서 직접사용될 수 없다.

현재의 실험이 여전히 다양한 단점을 가지고 있기 때문에, 본 발명자의 목적은 액체 유제품내의 분석물질의 검출에 대한 새로운 방법을 찾는 것으로, 여러 형태의 분석물질을 신뢰성 있고, 양호하게 농장에서의 수집시에 결정할 수 있는 방법을 찾을 필요하다. 그러므로 본 발명자는 어떠한 특수한 경험 노하우를 요구하지 않는 제한된 수의 간단한 단계로 매우 빠르고, 신뢰성 있고 민감한 결과를 얻을 수 있는 방법을 찾고 있었다. 추가로, 본 발명자는 시각적으로 쉽게 검출될 수 있고 특히 기구 측정에 의해 수량화될 수 있는 결과를 제공하는 방법을 찾고 있었다.

본 발명은 우유와 같은 액체 유제품내의 분석물질을 결정하기 위한 검정 장치에 관한 것이고, 또한 이 검정 장치에 의해 우유내의 분석물의 검출 및 수량화를 허용하는 공정 및 이런 검정 장치를 포함하는 검정 키트에 관한 것이다.

도 1 내지 도 3은 본 발명에 따라 검정 장치의 예를 도시하며, 도 1의 (a), 도 2 및 도 3은 전면도이고 도 1의 (b)는 종방향 단면도이다.

본 발명자는 액체 유제품, 특히 우유내의 분석물질의 존재를 용이하게 결정할 수 있게 만드는 신규의 검정 장치의 사용에 의해 상술한 목적을 얻을 수 있다는 것을 지금 발견하였다.

그러므로, 본 발명은 분석물질의 존재가 액체 유제품내에서 상기 유제품의 약간 빗나간 모세관 이동(tangential capillary migration)에 의해 검출되도록 허용하는 검정 장치를 제공하는 것이다. 본 발명의 검정 장치는 제 1 및 제 2 단부를 가지며, 상기 제 1단부로부터 시작하여,

- 분석된 액체를 정화시키도록 하는 막(2),

- 하나 이상의 포획 물질을 움직이지 못하게 하는 막(3)과,

- 흡수막(4)이 연속적으로 고정되어 있는 솔리드 지지체(1)를 포함하며,

상기 막(2)은 유제품내에 존재할 수 있는 분석물질과 실행된 방법에 따라서 사용된 검출 시약이, 검정 장치의 상기 제 1단부가 분석된 유제품에 젖게 된 후 샘플의 약간의 벗어난 모세관 이동 동안, 검정 장치에서 이동하지 못하게 유제품내의 존재한 물질을 유지할 수 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 특정 실시예에 따라서, 본 발명에 따른 검정 장치는 추가로 하나 이상의 검출 시약이 증착되어 있는 막(5)을 포함하며, 상기 검출 시약은 상기 유제품의 존재하에 급격하게 용해될 수 있다. 이런 특정 실시예에 따라서, 막(5)은 막(3) 앞에 놓여야 한다. 변경적으로 막(5)은 예들 들어, 장치의 제 1단부에 있는 막(2)의 앞에 또는 막(2)과 막(3)사이에 또는 그밖에 막(2)의 위와 아래에 놓일 수 있다.

본 발명에 따른 검정 장치내에 존재된 여러 가지 막은 이들 단부에서 서로 포개져 있으므로, 한 영역으로부터 다른 영역으로 유제품의 연속적인 이동을 보장한다. 양호하게, 막(3)은 막의 인접단부가 막(2)의 아래에 위치되고 말단부가 막(4)의 아래에 위치되도록 위치된다. 막들은 접착 플라스틱 필름(6)에 의해 서로 접촉한 상태로 선택적으로 유지될 수 있다. 이 경우에, 접착 플라스틱 필름은 검정 장치위에 액체의 이동에 영향을 주지 않도록 선택된다.

접착 플라스틱 필름으로 검정 장치의 커버링하는 옵션은 두 가지 장점을 가지며, 즉, 막들의 포개진 점에서 완전한 접촉을 보장하고 보호막을 이루는 것이다. 접착 플라스틱 필름(6)은 개별 막들(2, 3, 4, 5)을 완전히 커버하든지 또는 개별적으로 부분적으로 커버할 수 있다. 양호하게, 접착 플라스틱 필름(6)은 검정 장치의 막(3)에서의 액체의 보다 빠른 이동을 허용하기 위해서, 제 1단부의 처음 몇 밀리미터를 커버하지 않는다.

본 발명에 따른 검정 장치내에 존재한 솔리드 지지체(1)는 유리 또는 플라스틱, 적합하게 플라스틱으로 만들어져 있다. 플라스틱으로 지지체를 만드는 경우에, 지지체의 두께는 일반적으로 0.05와 1mm 사이이고, 적합하게 0.1과 0.6mm 사이이다. 막들은 접착제에 의해 솔리드 구조체(1)상에 고정되어 있다.

막(2)은 다양한 형태로 될 수 있다. 막(2)은 한 편으로, 유제품내에 존재할 수 있는 분석물질과 실행된 방법에 따라서 사용된 검출 시약이 검정 장치로부터 이동하지 못하게 유제품내의 존재한 물질을 유지할 수 있어야 한다. 다른 한편으로 상기 이동 동안 이들 분석물질과 검출 시약의 활성도를 보존하면서 검정 장치에서의 분석물질과 검출 시약의 급격한 이동을 허용해야 한다. 이러한 결과를 얻을 수 있게 만드는 막들의 비제한 예는 시토셉 1663(Cytosep 1663)과 백혈구흡수 LK4(Leukosorb LK14)( Pall Gelman Sciences으로부터 이용가능함), GF/D, GF/DVA, 17 CHR 및 GF141형태의 유리섬유(Alstrom으로부터 이용가능함)이다.

양호하게 사용된 백혈구흡수 막은 비직조 폴리에스테르 섬유로부터 제조된 막이고 혈액, 소변, 침 및 뇌척수 유체로부터 얻는 임상 샘플로부터 백혈구를 유지하려는 경향이 있다. 백혈구 유지는 막을 통과하는 종방향 통로에 의한 유체의 여과에 의해 실현된다.

본 발명자는 또한 이러한 형태의 막이 본 발명에 따른 검정 장치에 의해서 유제품내의 분석물질의 검출에 매우 중요한 기능, 즉, 유제품내에 존재한 물질의 유지가 분석물질 및 검출 시약의 급속 이동을 허용하면서, 상기 검정 장치에서의 유제품의 약간 벗어난 모세관 급속 이동에 의해 검출 실험의 적당한 기능을 방지하는 기능을 제공하는 것을 가능하게 만드는 것을 예상치 않게 발견했다.

이들 기능을 가장 효과적으로 실행하기 위해서, 막(2)은 검정 장치에서의 분석물질 및 검출 시약의 이동을 방지하는 유제품내에 존재한 모든 물질의 제거를 허용하도록 충분히 길어야 한다.

막(3)은 하나 이상의 포획 물질을 이동하지 못하게 할 수 있어야 하고 막(2)의 통과 후 유제품의 샘플의 급격한 이동을 허용해야 한다. 적합하게, 막(3)은 폴리에스테르 형태의 비다공성 지지체상에 굳어진다. 본 발명에 따른 적합한 막들의 비제한 예는 하이-플루 막들(Millipore로부터 이용가능함), 적합하게 SX 또는 ST 형태의 하이 플루 막들과 같은 고속 모세관 속도를 가진 니트로셀루로스 막들이다. 이들 막들은 상술한 바와 같은 막(2)과 조합해서 최상의 결과를 제공한다.

하나 이상의 포획 물질은 막(3)상에서 움직이지 못한다. 이런 형태의 움직이지 못하는 포획 물질은 물론, 분석물질의 검출의 실행된 방법에 의존하며, 포획 물질은 검출 시약중 하나, 또는 분석물질사이의 복합물의 형성을 가져오는 제품, 또는 이런 분석물질의 유사한 물질과 하나 이상의 검출 시약 또는 선택적으로 두 이상의 검출 시약 사이의 복합물의 형성을 가져오는 제품과 같은, 검정 장치에서 이동하는 액체내에 존재한 구성성분중 하나 이상을 선택적으로 움직이지 못하게 할 수 있다. 포획 물질은 또한 검출 시약중 하나 일 수 있다. 포획 물질은 디스크 또는 얇은 스트립 또는 적용분야에 맞는 어느 다른 적당한 디자인과 같이, 막(3)의 잘 정의된 일부분 또는 몇 몇 부분상에 집중형태로 위치되어 있다. 어떠한 디자인을 선택해도 좋으나, 디자인은 결과의 분명한 판단을 허용해야 한다.

막(3)의 길이에 관련해서, 막(3)은 검출의 실행된 방법에 따라서 요구된 정도와 량에 사용된 모든 포획 물질을 함유하기에 충분히 길어야 한다.

막(4)에 맞게 사용된 막의 형태는 앞의 막들을 통과한 후 액체를 흡수 및 저장할 수 있다면 그다지 중요하지 않다. 막(4)은 막(3)을 통과한 후 액체를 흡수할 수 있게 하지만 또한, 실제적 관점에서, 검정 장치를 보다 쉽게 처리할 수 있게 허용하도록 충분히 커야한다.

선택적으로, 본 발명에 따른 검정 장치는 하나 이상의 검출 시약이 증착되어있는 막(5)을 포함한다. 막(5)은 유제품의 이동을 허용하면서 동시에 유제품의 흐름의 통과시 검출 시약(또는 시약들)의 용해 및 릴리스를 허용해야 한다. 이러한 목적에 적합할 수 있는 막의 비제한적 예는 T5NM(Millipore로부터 이용가능함), F075-14 또는 Fo75-17 또는 CF/C 막(Whatman으로부터 이용가능함), 막 시토셉 1663(Pall Gelman Sciences로부터 이용가능함)과 같은 유리 섬유 수지계 막, 악쿠위크 막(Accuwick membranes)(Pall Gelman Sciences로부터 이용가능함), 3mm 셀루로스 페이퍼(Whatman으로부터 이용가능함)와 같은 폴리에스테르 섬유 수지계 막 또는 릴리스 매트릭스 PT-R2형의 막(Advance Micro Devices)으로부터 이용가능함)이다. 악쿠위크 막과 같은 폴리에스테르 섬유 수지계 막을 사용하는 것이 바람직하다. 막(5)은 검출 시약의 소망의 량을 지지할 수 있을 정도로 충분히 길다.

본 발명에 따른 검정 장치는 당업자에 알려진 방법에 의해 제조된다. 예들 들어 상업적으로 이용가능한 적층기를 사용해서 카드를 준비할 수 있다. 사용한 포획 물질을 카드의 조립 전 또는 후에 용액 형태로 막(3)상에 증착한다. 이들 용액을 바이오돗 인코포레이티드(BioDot, Inc)의 Biojet Quanti-3000 X-Y 플랫폼 디스펜서와 같은 상업적으로 이용가능한 장치를 사용해서 매우 정확하게 증착할 수 있다. 이들 증착된 용액은 예들 들어 카드를 고온 공기의 스트림하에 놓으므로써 즉시 증발된다. 대규모 제조시, 롤을 준비하는 것이 바람직하다. 결과적으로, 소망의 포획 물질을 지탱하는 카드와 롤은 스트립으로 절단되고, 이들 각각의 스트립은 본 발명에 따른 검정 장치를 이룬다.

검정 장치가 막(5)을 포함하면, 검출 시약은 검출 시약을 포함하는 용액내에 막(5)을 간단히 함침시킴으로써 카드 또는 롤의 조립 전에 증착될 수 있다. 변경적으로, 시약은 막(3)상에 포획 물질을 증착하기 위해서 사용되는 것과 유사한 기술에 의해 카드 또는 롤의 조립 후에 증착될 수 있다.

본 발명의 한 변경예에서, 장치는 두 개의 구멍을 가진 플라스틱 박스내에 위치되어 있으며, 상기 구멍중 대야(basin)형태의 제 1구멍은 막(2) 바로 위에 위치되어 있으며 액체가 분석되어지도록 하며, 제 2구멍은 막(3)상의 결과가 관찰되어지도록 하는 윈도우 구멍이다. 이 경우에, 검정 장치는 접착 플라스틱 필름(6)을 포함하지 않는다.

본 발명에 따른 검정 장치는 액체 유제품, 특히 우유내 분석물질의 존재의 검출을 허용한다.

따라서, 본 발명은 유사하게 본 발명에 따른 검정 장치와 검출 시약을 사용해서, 액체 유제품내의 분석물질을 검출하기 위한 방법을 제공하는 것으로 다음 단계를 포함한다.

a) 본 발명에 따른 검정 장치와 일정량의 유제품을 상기 검정 장치의 제 1단부에서 접촉하는 접촉 단계와,

b) 유제품내에 존재할 수 있는 분석물질 및 검출 시약이 점차적으로 막(2), 그리고 나서 막(3)을 통과하도록, 그리고 막(2)과 막(3)에 의해 중단되지 않은 유제품의 성분이 막(4)내에서 끝나도록 검정 장치에서의 유제품의 모세관 현상에 의한 약간 벗어난 이동 단계와,

c) 상기 막(3)상의 고정물을 결정하는 결정 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 방법은 예들 들어, 우유, 유장(whey), 교유 우유(churned milk) 등과 같은 액체 유제품내의 분석물질의 검출을 허용한다. 본 발명은 특히 우유내에 존재할 수 있는 수의 약제, 호르몬 또는 단백질과 같은 분석물의 검출에 관한 것이다.

본 발명의 방법에 따라 사용된 검출 시약은 본 발명의 실시 모드의 기능에 따라서 수적으로 그리고 성질면에서 변경될 수 있으며, 본 발명의 기능은 실행된 검출의 방법을 근거하고 있다. 본 발명에 따른 방법은 두 개 이상의 검출 시약을 사용한다. 제 1검출 시약은 분석물질을 특별히 인식할 수 있는 인식제이고 아래에 "식별제(identifier)"로 언급하겠다. 제 2검출 시약은 표지제이고 아래에 '마커"로 언급하겠다. 실시의 선택 모드에 따라서, 약간의 검출 시약은 막(3) 또는 막(5)상에 존재할 수 있음을 주목해주기 바란다. 검출되어질 분석물질과 사용된 검출 시약에 따라서, 본 발명에 따른 검정 장치와 유 제품의 접촉 단계 전에 하나 이상의 검출 시약을 추가하고 이 혼합물을 검출 시약과 분석물질 또는 분석물질과 유사한 물질 사이의 복합물의 형성을 허용하는 배양 조건하에서 유지하는 것이 필요하다. 선택 방법에 따라서, 식별제와 마커는 서로 결합될 수 있고 또는 싱글 물질일 수 있다. 한 편으로는, 다수의 식별제 및/또는 마커가 있을 수 있다.

식별제는 식별제의 캐패시티에 의해서 관찰된 분석물질의 형태의 존재의 검출이 상기 분석물질 또는 상기 분석물질과 유사한 물질을 특별히 인식할 수 있게 허용한다. 분석물질 또는 상기 분석물질과 유사한 물질과의 안정하고 필수적으로 변경할 수 없는 복합물, 또는 분석물질 또는 분석물질의 유사한 물질에 맞는 특정 단클론 항체 또는 다중클론 항체를 선택적으로 형성할 수 있는 수용체일 수 있다. 항체의 검출을 위해서, 식별제는 특정 다중클론 또는 단클론 항체로부터 선택될 수 있거나 항체에 민감한 미생물로부터 얻은 수용체로부터 선택될 수 있다. 이와 같은 수용체는 바실루스 족(바실루스 스테아로고온균, 바실루스 서브틸리, 바실루스 리첸니포르미스(Bacillus licheniformis, 등), 연쇄구균 족( 연쇄구균 고온균, 등), 또는 방사선균 족(안티노마두라 R39, 등)으로부터 얻어진다.

본 발명의 양호한 실시예에 따라서, 식별제가 사용되며, 식별제는 β-락탐 링을 가진 항체에 민감한 수용체를 포함하며, 상기 수용체는 수용체 BlaR 또는 수용체 BlaR-CTD와 같은 바실루스 리첸니포르미스로부터 얻어진다. 단백질 BlaR의 격리와 펩티드 과정은 와이. 쥬(Y. Zhu) 등의, 제이, 박테리올.(J. Bacteriol.), 1137-1141(1990)에 기술되어 있으며, 수용체 BlaR-CTD는 BlaR의 카복시-터미널 영역이고, 이들의 격리와 펩티드는 비이, 조리스 등의 FEMS 마이크로바이오로지 레터스, 107-114(1990)에 기술되어 있다.

β-락탐 링을 가진 항체의 검출을 위해 본 발명에 따른 수용체 BlaR 또는 BlaR-CTD의 사용은 테이트에 사용된 인식제에서 큰 장점을 준다. 사실상, 수용체 BlaR 및 BlaR-CTD는 많은 수의 항체를 매우 급속하게 복합할 수 있고, 예들 들어 바실루스 스테아로고온균을으로부터 얻은 수용체와 같은 알려진 인식제에 필요한 것보다 낮은 배양 온도에서 이렇게 할 수 있다.

사용된 검출 시약의 제 2형태는 마커이며, 마커는 유제품내의 분석물질의 존재의 직접 또는 간접 수량화 및 구상화를 허용한다. 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 마커는 미립자, 형광물질, 방사능 물질, 발광성 물질 또는 효소일 수 있다. 심지어 소량이 존재해도 쉽게 검출가능하고 볼 수 있는 신호를 내는 특정 마커를 선택하는 것이 바람직하다. 비 제한 예로서 마커는 콜로이드 금속성 입자(백금, 금, 은 등), 셀레늄, 카본, 황, 텔루르 또는 그밖에 착색물, 합성물의 콜로이드 입자, 유액의 콜로이드 입자로 만들어질 수 있다. 1과 60nm사이의 직경을 가진 콜로이드 입자는 특히 양호하다. 이들은 쉽게 검출가능한 강한 핑크-레드 색채를 낸다. 마커는 분석물질 또는 상기 분석물질의 유사한 물질과 하나 이상의 검출 시약의 커플링에 의해 유제품의 샘플내에 분석물질의 존재를 결정하는 것을 가능하게 한다. 마커와 검출 시약 사이의 커플링은 당업자에 알려진 방법에 따라서 실행될 수 있다. 미립자 마커가 사용되면, 표지는 예를 들어 비오틴/안티-비오틴 복합물과 같은 화학적 고정 아암의 상호매개를 통해서, 입자의 직접 흡수이든지 또는 간접적으로 일어날 수 있다. 이런 커플링은 본 발명에 따른 검정 장치와 유제품과의 접촉 단계 전이든지 또는 본 발명에 따른 검정 장치에서의 유제품의 이동 동안에 일어날 수 있다. 본 발명의 특정 실시예에 따라서, 검출 시약의 제 3형태가 사용되어 있으며, 이후에 "레퍼런스"로서 언급된다. 이것은 막(3)상에 움직이지 못하는 특정 포획 물질에 그 자체를 고정하는 는 분석된 샘플에 알려진 량으로 추가된 물질이다. 레퍼런스는 분석물질의 량을 정하는 기준으로서 역할하는 세기를 가진 밴드를 부여한다.

본 발명에 따른 검정 장치와 유제품의 접촉(방법의 단계 a))이 관련하여, 상기 접촉은 용기내에 본 발명에 따른 검정 장치를 위치시킴으로써 이루어지며, 용기의 바닥에 분석되어질 샘플이 있다. 검정 장치는 용기내에 필수적으로 수직으로 위치시키므로, 장치의 제 1단부가 혼합물과 접촉한다.

플라스틱 박스내에 위치된 검정 장치를 사용하는 본 발명의 변경예에 있어서, 박스는 수평으로 배열되고 접촉은 막(2)위에 위치된 대야 모양의 개구내에 분석되어질 샘플의 분액(aliquot)을 증착함으로써 일어난다.

이동 단계 b)에 대해서, 액체는 본 발명에 따른 검정 장치에서의 모세관 현상에 의해 이동되어진다. 본 발명에 따른 검정 장치에서의 모세관 현상에 의해 이동하는 액체는 먼저 막(2)을 만나고 유제품내에 존재될 수 있는 분석물질과 검정 장치에서의 검출 시약의 이동을 방지하는 유제품내에 존재한 물질들을 유지할 수 있게 한다. 계속해서 분석물질과 검출 시약은 하나 이상의 포획 물질을 움직이지 못하게 하는 막(3)으로 이동한다. 포획 물질은 분석된 액체내에 존재한 하나 이상의 구성 성분을 선택적으로 움직이지 못하게 한다. 본 발명의 특정 실시예에 따라서 막(3)에서의 액체의 이동 통로의 단부에 위치되어 있는, 포획 물질로 만들어진 발명에서, 포획 물질은 선행의 포획 물질에 의해 멈추어지지 않은 모든 마커를 고정할 수 있다. 이런 포획 물질은 선행의 포획 물질에 의해 공급된 수량적 정보를 완전히 공급할 수 있게 한다.

막(3)의 고정물의 결정( 단계 c))은 이 영역내의 마커의 존재를 결정함으로써 간단하게 실행된다. 이런 결정은 간단한 방법으로 시각적으로 가능하다. 그러나, 관찰된 신호의 세기의 정확한 측정이 필요하다면, 관찰된 신호의 세기를 측정할 수 있는 기구를 사용하는 것이 가능하다. 레퍼런스가 사용되면, 관찰된 신호의 세기의 측정을 위한 내부 레퍼런스를 공급하는 특정 포획 물질에 의해 고정된다.

얻어진 결과의 해석은 실행된 검출 방법, 즉 사용되는 검출 시약 및 포획 물질에 의존한다.

문헌에서 이미 기술되어 있는 우유내의 분석물질을 검출하기 위한 방법에 관련해서, 본 발명의 방법은 아래의 장점을 가진다. 먼저, 본 발명은 실시하는데 매우 빠르고 극히 간단하며, 특별한 경험적 노하우를 요하지 않은 필수적으로 두 개의 용이한 작업 단계를 포함한다. 따라서, 결과의 양적 및 질적 판단은 즉시 이루어지고 착색제 및/또는 효소 마커에 의해 검출이 실행될 때에 필요한 것과 같은 특정 추가의 작업을 요하지 않는다. 추가로, 본 방법은 여러 형태의 분석물질의 검출에 직접 적용될 수 있다. 끝으로, 레퍼런스를 사용하는 실시예에서, 결과는 하나 이상의 레퍼런스 테스트를 실행할 필요 없이 바로 수량화되어 해석될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 검정 장치를 포함하는, 유제품내의 분석물질의 검출용 검정 키트를 제공한다. 적합하게, 본 발명에 따른 검정 키트는 또한 유제품이 검정 장치와 접촉하기 전에 샘플에 추가하기 위한 검출 시약을 포함할 수 있다.

본 발명의 다양한 특성의 실시예에 대해서 아래의 예를 통해서 설명되지만, 본 발명의 범위를 여기서 제한하는 것은 아니다.

예 1. 검정 장치의 제조. 일반적인 과정

1.1. 막 카드 조립

300 ×76.2 mm의 크기를 가진 카드를 우선 아래의 방법에 따라 Clamshell Laminator 형( Biodot, Inc.로부터 이용가능함)의 적층기를 사용해서 조립한다.

ArCare 8565형(Adhesive Research로부터 이용가능함)의 직사각형 플라스틱 지지체를 300 ×76.2 mm(솔리드 지지체(1))를 측정하여 절단한다. 계속해서, 백혈구 흡수 LK4 막( Pall Gelman Sciences으로부터 이용가능함)의 직사각형 300 ×20 mm(막(2)), 하이-플루 SX 막(Mllipore로부터 이용가능함)의 직사각형 300 ×25 mm(막(3)), 3mm 셀루로스 막(Whatman으로부터 이용가능함)의 직사각형 300 ×40 mm(막(4))과 악쿠위크 막(Pall Gelman Sciences로부터 이용가능함)의 직사각형 300 ×0.8 mm(막(5))를 절단한다.

계속해서, 막(2)과 막(4), 그 다음에 (5), 그리고 (3)를 적층기의 하부 몰드의 특정 장소에 위치시킨다. 접착제로 덮은 솔리드 지지체(1)는 장치의 커버내에서 부분적으로 유지되며, 접착제는 공기에 바로 노출되어 있다. 하부 몰드내에 놓인 막은 적층기를 폐쇄함으로써 접착 지지체와 접촉하게 되며, 막은 진공 펌프로부터의 공기 흡입에 의해 정확하게 정위치에 유지된다. 진공이 파괴되면, 카드는 회복되어 여기에 고정된 막(2, 3, 4, 5)을 가진 솔리드 지지체(1)를 구성한다.

1.2. 막(3)상에 포획 물질 증착

막(3)상에 포획 물질의 증착을 예 1.1에 따른 조립 전 또는 후에 실행한다.

포획 물질을 포함하는 수용액을 준비한다. Biodot, Inc산의 BioJet X-Y Platform Quanti-3000 Dispenser에 의해 예 1.1에서 준비한 막 카드의 막(3)상에 증착한다.

증착된 용액을 1분 동안 60℃에서 고온 펄스된 공기의 스트림하에서 카드의 전체를 놓으므로써 즉시 증발한다.

1.3. 막(5)상에 표지 물질 증착

a) 예 1.1에 따른 조립 전

표지 물질을 포함하는 수용액을 준비한다. 막(5)을 이 용액에 함침한다. 계속해서 0.5바의 진공하에서 대기 온도에서 밤새도록 배출해서 건조시킨다.

b) 예 1.1에 따른 조립 후

포획 물질의 증착을 위한 예 1.2에 기술한 과정을 따른다.

1.4 접착 플라스틱 필름(6) 증착

ArCare 7759형(Adhesive Research로부터 이용가능함)의 접착 필름의 직사각형을 막들을 부분적으로 커버링하기 위해서 300×20mm로 그리고 모든 막을 커버링하기 위해서 300 ×71.2 mm로 측정하여 절단한다.

예 1.1에 따라서 얻은 카드를 적층기의 하부 몰드내에 위치시키고 접착 필름을 적층기의 커버내에 위치시키며, 여기서 접착제 필름은 공기에 바로 노출되어 있다. 접착 필름을 장치가 폐쇄될 때 막 카드와 접촉시킨다.

1.5 스트립으로 절단

조립 후 얻은 카드를 제단기형 장치 또는 회전장치(BioDot, Kinematic 또는 Akzo로부터 이용가능함)의 도움으로 스트립으로 절단한다. 단부 스트립을 제거하고 다른 스트립을 사용을 위해 준비한다.

이들을 저장하기 위해서, 검정 장치를 데시컨트(dessicant)(프랑스의 Silgelac)의 존재하에 투명한 밀봉 시일된 용기내에 위치시킨다.

1.6. 플라스틱 케이스내의 프레젠테이션

검정 장치를 두 개의 개구를 가진 플라스틱 박스내에 위치시키며, 첫 번째로, 용기 형태로, 막(2) 바로 위에 배치하여 분석되어질 액체를 수용할 수 있는 구멍이고, 두 번째로, 막(3)상의 결과를 시각화시키는 윈도우 구멍이다.

예 2. 효소 R39를 사용하여 우유내의 β-락탐 링을 가진 항체의 검출

2.1. 식별제

이 예에서 사용된 식별제는 제이. 엠. 프레레 등의, 항균제 및 화학요법, 18(4), 506-510(1980)에 기술한 과정에 의해 얻은 안티노마두라 R39에 의해 생성된 용해성 외세포질 D-알안리-D 알안닌 카복시페프티다스(soluble exocellular D-alanyl-D-alanine carboxypeptidase)이다.

2.2. 식별제와 마커의 커플링

2.2.1 식별제를 비오틴화(biotinylating the identifier)

1mg/ml의 농도를 가진 효소39의 수용액 250㎕을 500ml의 HNM 버퍼(헤페스(Hepes) 10mM, pH 8, NaCl 10 mM, MgCl₂5mM)에 대해서 24시간 동안 투석한다. 효소 R39의 상기 투석된 용액에 2ml 중탄산염 버퍼(0.1 M 중탄산나트륨, pH 9)와 무수 DMF내의 5mg/ml의 농도를 가진 N-히드록시숙신이미드 6-(비오틴아미도)카프로익 에스테르를 추가한다. 이 용액을 실온에서 3시간 동안 2회전/분의 속도로 빛 없이 회전축상의 튜브용 LABINCO 교반기(벨기에의 VEL로 이용가능함)내에서 부드럽게 교반한다. 이렇게 얻은 용액을 HNM 버퍼(헤페스 100mM, pH 8, NaCl 100 mM, MgCl₂50mM)에 대해서 24시간 동안 투석한다. 이 방법으로, 비오틴화 효소 R39의 용액을 얻어 HNM-BSA 버퍼(헤페스 500mM, pH 8, NaCl 500 mM, MgCl₂250mM, BSA 10mg/ml)내에서, 버퍼의 ml 당 효소 R39dml 100㎍의 농도까지 희석한다.

2.2.2 마커

아지화나트륨(British Biocell(Ref. GAB40)으로부터 이용가능함) 0.1%에 의해 안정화되는, pH 7.2를 가진 2mM 4중붕산 나트륨 수용액내의 현탁액의 형태로 염소 항-비오틴 항체가 증착되어 있는 40nm 직경을 가진 금 입자로 만들어진 마커가 사용된다. 520nm에서의 이들 현탁액의 광밀도는 약 10이고 단백질 농도는 약 24㎍/ml이다.

2.2.3. 비오틴화 식별제와 마커의 커플링

급속 실험용 용액 A

예 2.2.1에서 준비한 비오틴화 효소 R39를 HNM-BSA 버퍼(헤페스 500mM, pH 8, NaCl 500 mM, MgCl₂250mM, BSA 10mg/ml)로 25번 희석한다. 실온에서, 상기 희석된 비오틴화 효소 R39의 17.5 체적%와, 효소 R39를 표지하는데 사용된 금 입자 현탁액의 9.27 체적%와 레퍼런스 금 입자 현탁액의 6 체적%를 혼합한다(예 2.3 참조).

민감성 실험용 용액 B

예 2.2.1에서 준비한 비오틴화 효소 R39를 HNM-BSA 버퍼(헤페스 500mM, pH 8, NaCl 500 mM, MgCl₂250mM, BSA 10mg/ml)로 50번 희석한다. 실온에서, 상기 희석된 비오틴화 효소 R39의 17.5 체적%와, 효소 R39를 표지하는데 사용된 금 입자 현탁액의 9.27 체적%와 레퍼런스 금 입자 현탁액의 6 체적%를 혼합한다(예 2.3 참조).

2.3. 레퍼런스

레퍼런스로서 염소 항-토끼 면역글로블린 항체가 증착되어 있는 40nm 금 입자로 만들어진다. 이들 입자는 아지화나트륨 0.1%에 의해 안정화되는, pH 7.2를 가진 2mM 4중붕산 나트륨 수용액내의 현탁액의 형태로, British Biocell(Ref. GAB40)로부터 이용가능하다. 520nm에서의 이들 현탁액의 광밀도는 약 3이고 단백질 농도는 약 6㎍/ml이다.

2.4. 포획 물질

2.4.1 제 1포획 물질

사람 감마 플로불린(G4386, Sigma)의 213mg과, 탄산나트륨 버퍼(100mM, pH 9)내의 20이미노티오란 히드로클로라이드(Aldrich, 33056-6)의 8.6mg를 포함하는 용액 8ml을 25℃에서 한 시간동안 배양한다.

추가로, 세파로스포린 C의 119.8mg의 탄산나트륨 버퍼(100mM, pH 9)내의 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트(sSMCC, 22322 Pierce)의 8.6mg를 함유하는 용액 20ml을 25℃에서 한 시간동안 배양한다.

그 다음 위에서 준비한 두 용액을 혼합한다. 이렇게 만들어진 용액의 pH를 NaH₂PO₄의 3ml를 추가함으로써 7.1로 조정되고, 이 용액을 25℃에서 두 시간동안 배양한다. 배양 후 얻은 혼합물을 인산나트륨 버퍼(10mM, pH 9)의 1리터에 대해 3번 투석한다. 이렇게 만들어진 용액을 0.22㎛ 필터를 통해서 여과하고, 그 다음 분액으로 나누어 사용할 때까지 -20℃에서 냉각한다.

사용할 때에, 분액을 녹이고 이들이 막에 증착되기 전에 식품 착색제를 추가하여, 어떠한 이동에서도 증착물의 정확한 위치와 트레이스의 품질을 표시하도록 한다.

제 1포획 물질은 샘플내에 존재한 항체의 수량에 대해서 초과로 존재한 프리 마커(free marker)와 커플링된 식별제를 고정할 수 있게 한다.

2.4.2. 제 2포획 물질

제 2포획 물질로서, 사람 감마 플로불린 5mg/ml 버퍼, pH 7.5, 10mM 인산나트륨내의 면역플로불린 농도를 가진 토끼 면역플로블린(Sigma I 5006)으로 만들어져서 사용된다. 상기 제 2포획 물질은 액체가 검정 장치에서 이동할 때 레퍼런스를 중단한다.

2.5. 검정 장치

예 1.1에서 설명한 과정에 따라서 조립되어 있는 막(2, 3, 4)을 포함하는 검정 장치가 사용된다. 이들 장치의 막(3)은 예 2.4.1.에 기술한 포획 물질의 인접한 측면상에 그리고 예 2.4.2.에 기술한 포획 물질의 말단 측면상에 지지한다. 포획 물질은 예 1.2.에 설명한 과정에 따라서 증착되어 있다.

2.5.1. 실험 1- 급속 실험

페니실린 G의 0; 2; 4; 5; 6; 8 및 10 ppb를 제각기 함유하는, 우유의 7개 샘플을 준비한다. 그리고 나서 이들 용액 각각을 다음과 같이 분석한다.

우유 샘플의 200㎕와 예 2.2.3에서 준비한 용액 A의 32.8㎕으로 분액을 만들고 에펜도르프관(Eppendorf tube)내에 놓는다. 이 혼합물을 47℃에서 3분 동안 배양한다. 그 다음, 검정 장치를 에펜도르프관내에 수직으로 위치시켜서 검정 장치의 제 1단부가 혼합물과 접촉하게 한다. 혼합물을 검정 장치에서 이동시키면서 조립체를 47℃에서 2분 동안 배양한다.

아래의 표 1은 실험한 7개의 샘플에 대해서 얻은 결과를 도시한다. 0에서부터 10까지의 범위의 세기 값은 검출된 밴드에 주어진 것이며, 값 10은 가장 강한 밴드에 주어진 것이고 값 0은 가장 낮은 밴드에 주어진 것이다. 이 규모에서, 값 6은 레퍼런스 밴드를 가르킨다. 제 1검출 밴드내에서 관찰된 신호의 세기는 샘플내에 존재한 페니실린 G의 량에 반비례한다.

표 1

페니실린 G(ppb)	1차 밴드 세기	2차 밴드 세기
0	10	6
2	8	6
4	5	6
5	3	6
6	2	6
8	1	6
10	0	6

이 예에서, 실험은 1차 밴드가 레퍼런스 밴드의 세기보다 낮은 세기를 가질 때 포지티브한 것으로 나타나 있다. 표 1에 도시한 결과는 이 실험이 우유 샘플내의 페니실린 G가 4ppb까지는 5분내에 검출할 수 있다는 것을 가르킨다.

2.5.2. 실험 2- 민감한 실험

페니실린 G의 0; 2; 2.5; 3; 4 및 5 ppb를 제각기 함유하는, 우유의 6개 샘플을 준비한다. 그리고 나서 이들 용액 각각을 다음과 같이 분석한다.

우유 샘플의 200㎕와 예 2.2.3에서 준비한 용액 B의 32.8㎕으로 분액을 만들고 에펜도르프관내에 놓는다. 이 혼합물을 47℃에서 3분 동안 배양한다. 그 다음, 검정 장치를 에펜도르프관내에 수직으로 위치시켜서 검정 장치의 제 1단부가 혼합물과 접촉하게 한다. 혼합물을 검정 장치에서 이동시키면서 조립체를 47℃에서 2분 동안 배양한다.

아래의 표 2는 실험한 6개의 샘플에 대해서 얻은 결과를 도시한다. 0에서부터 10까지의 범위의 세기 값은 검출된 밴드에 주어진 것이며, 값 10은 가장 강한 밴드에 주어진 것이고 값 0은 가장 낮은 밴드에 주어진 것이다. 이 규모에서, 값 6은 레퍼런스 밴드를 가르킨다. 제 1검출 밴드내에서 관찰된 신호의 세기는 샘플내에 존재한 페니실린 G의 량에 반비례한다.

표 2

페니실린 G(ppb)	1차 밴드 세기	2차 밴드 세기
0	10	6
2	7	6
2.5	5	6
3	4	6
4	1	6
5	0	6

이 예에서, 실험은 1차 밴드가 레퍼런스 밴드의 세기보다 낮은 세기를 가질 때 포지티브한 것으로 나타나 있다. 표 2에 도시한 결과는 이 실험이 우유 샘플내의 페니실린 G가 2.5 ppb까지는 7분내에 검출할 수 있다는 것을 가르킨다.

예 3. BlaR를 사용해서 우유내의 β-락탐 링을 가진 항체의 결정

이 예는 보건국에 의해 모니터되는 β-락탐 링을 가진 항체를 우유내에서의 검출을 도시한다. 이 예에서 설명한 실험은 표지제로서 작용하는 금 비드(gold beads)와 커플링된 수용체 BlaR-CTD를 사용하고 막이 고정되어 있는 솔리드 지지체를 포함하는 검정 장치의 형태인 지지체를 사용한다.

3.1. 금 비드(마커)와 BlaR-CTD(식별제)의 커플링

3.1.1 BlaR-CTD의 비오틴화

6.6mg/ml의 농도를 가진 인식제 BlaR-CTD의 용액 3.79ml을 20mM pH 7의 인산나트륨 버퍼내에서 취한다. 그 다음에, BlaR-CTD의 용액에 41.71ml 중탄산염 버퍼(0.1 M 중탄산나트륨, pH 9)와 중탄산염 버퍼외에 2.23mg/ml를 포함하는 N-히드록시숙신이미드 6-(비오틴아미도)카프로익 에스테르의 용액 2ml를 추가한다. 이 용액을 실온에서 2시간 동안 2회전/분의 속도로 빛 없이 회전축상의 튜브용 LABINCO 교반기(벨기에의 VEL로 이용가능함)내에서 부드럽게 교반한다. 1M pH 8 트리스 버퍼의 용액의 2.5ml를 30분 동안 동일한 조건하에서 반응 혼합물로 배양한다. 이렇게 얻은 용액을 HNM 버퍼(헤페스 100mM, pH 8, NaCl 100 mM, MgCl₂50mM)에 대해서 24시간 동안 투석한다. 이 방법으로, 비오틴화 BlaR-CTD 용액을 얻어 HNM-BSA 버퍼(헤페스 500mM, pH 8, NaCl 500 mM, MgCl₂250mM, BSA 10mg/ml)내에서, 버퍼의 ml 당 비오틴화 BlaR-CTD의 250㎍의 농도까지 희석한다. 이 용액을 -20℃에서 저장한다.

3.1.2 표지제

아지화나트륨(British Biocell(Ref. GAB40)로부터 이용가능함) 0.1%에 의해 안정화되는, pH 7.2를 가진 2mM 4중붕산 나트륨 수용액내의 현탁액의 형태로 염소 항-비오틴 항체가 증착되어 있는 40nm 직경을 가진 금 입자로 만들어진 표지제가 사용된다. 520nm에서의 이들 현탁액의 광밀도는 약 10이고 단백질 농도는 약 24㎍/ml이다.

3.1.3. 비오틴화 BlaR-CTD를 금 비드에 커플링

예 3.1.1에서 준비한 비오틴화 BlaR-CTD 용액을 HNM-BSA 버퍼(헤페스 500mM, pH 8, NaCl 500 mM, MgCl₂250mM, BSA 10mg/ml)로 114.7번 희석한다. 실온에서, 상기 희석된 비오틴화 BlaR-CTD 용액의 22.5 체적%와, HNM-BSA 버퍼의 7.5 체적%와, 비오틴화 BlaR-CTD를 표지하는데 사용된 금 입자 현탁액의 9.27 체적%와 레퍼런스 금 입자 현탁액의 6 체적%를 혼합한다(아래의 예 3.1.4 참조).

3.1.4. 독립 레퍼런스

이 실험에서, 또한 샘플내에 존재한 항체의 급속한 수량화를 할 수 있는 세기를 가진 밴드를 공급하는 레퍼런스 물질로 만들어 사용한다.

이 목적으로 염소 항-토끼 면역글로블린 항체가 증착되어 있는 40nm 금 입자가 만들어진다. 이들 입자는 아지화나트륨 0.1%에 의해 안정화되는, pH 7.2를 가진 2mM 4중붕산 나트륨 수용액내의 현탁액의 형태로, British Biocell(Ref. GAB40)로부터 이용가능하다. 520nm에서의 이들 현탁액의 광밀도는 약 3이고 단백질 농도는 약 6㎍/ml이다.

3.2. 포획 물질

3.2.1 제 1포획 물질-레퍼런스 항체

추가로, 세파로스포린 C의 119.8mg의 탄산나트륨 버퍼(100mM, pH 9)내의 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트(sSMCC, 22322 Pierce)의 54mg를 함유하는 용액 20ml을 25℃에서 한 시간동안 배양한다.

제 1포획 물질은 샘플내에 존재한 항체의 수량에 대해서 초과로 존재한 금 비드와 커플링된 BlaR-CTD를 고정할 수 있게 한다.

3.2.2. 제 2포획 물질- 독립 레퍼런스를 고정할 수 있는 물질

제 2포획 물질로서, 사람 감마 플로불린 5mg/ml 버퍼, pH 7.5, 10mM 인산나트륨내의 면역플로불린 농도를 가진 토끼 면역플로블린(Sigma I 5006)으로 만들어져서 사용된다. 상기 제 2포획 물질은 액체가 검정 장치에서 이동할 때 독립 레퍼런스를 중단한다.

3.3. 검정 장치

예 1.1에서 설명한 과정에 따라서 조립되어 있는 막(2, 3, 4)을 포함하는 검정 장치가 사용된다. 이들 장치의 막(3)은 예 3.2.1.에 기술한 포획 물질의 인접한 측면상에 그리고 예 3.2.2.에 기술한 포획 물질의 말단 측면상에 지지한다. 포획 물질은 예 1.2.에 설명한 과정에 따라서 증착되어 있다.

3.4. 우유내의 항체의 결정

3.4.1. 3-분 실험 1- 급속 실험

페니실린 G의 0; 1; 2; 3; 4; 5 및 6 ppb를 제각기 함유하는, 우유의 7개 샘플을 준비한다. 그리고 나서 이들 용액 각각을 다음과 같이 분석한다.

우유 샘플의 200㎕와 예 3.1.3에서 준비한 용액 45.27㎕으로 분액을 만들고 유리 플라스크(glass flask)내에 놓는다. 이 혼합물을 47℃에서 1분 동안 배양한다. 그 다음, 검정 장치를 유리 플라스크내에 수직으로 위치시켜서 검정 장치의 제 1단부가 혼합물과 접촉하게 하고 제 2단부가 유리 플라스크의 벽에 놓이도록 한다. 혼합물을 검정 장치에서 이동시키면서 조립체를 47℃에서 2분 동안 배양한다.

표 1

페니실린 G(ppb)	1차 밴드 세기	2차 밴드 세기
0	10	6
1	9	6
2	9	6
3	4	6
4	0	6
5	0	6
6	0	6

이 예에서, 실험은 1차 밴드가 레퍼런스 밴드의 세기보다 낮은 세기를 가질 때 포지티브한 것으로 나타나 있다. 표 1에 도시한 결과는 이 실험이 우유 샘플내의 페니실린 G가 4ppb이하 까지는 3분내에 검출할 수 있다는 것을 가르킨다.

검정을 다른 β-락탐 링 항체에서 동일 조건하에서 실행한다. 이 실험은 3분 내에, 우유 샘플내의 아목시실린 5ppb이하까지, 암피실린 5ppb 까지, 클록서실린 10ppb 이하, 디클록서실린 20ppb 이하, 옥사실린 20ppb 이하 및 세파피린 20ppb까지 검출할 수 있게 한다.

1.3.2. 5분 실험

클록서실린의 0; 2; 4; 6; 8 및 10 ppb를 제각기 함유하는, 우유의 6개 샘플을 준비한다. 그리고 나서 이들 용액 각각을 다음과 같이 분석한다.

우유 샘플의 200㎕와 예 3.1.3에서 준비한 용액 45.27㎕으로 분액을 만들고 유리 플라스크내에 놓는다. 이 혼합물을 47℃에서 3분 동안 배양한다. 그 다음, 검정 장치를 유리 플라스크내에 수직으로 위치시켜서 검정 장치의 제 1단부가 혼합물과 접촉하게 하고 제 2단부가 유리 플라스크의 벽에 놓이게 한다. 혼합물을 검정 장치에서 이동시키면서 조립체를 47℃에서 2분 동안 배양한다.

아래의 표 2는 실험한 6개의 샘플에 대해서 얻은 결과를 도시한다. 0에서부터 10까지의 범위의 세기 값은 검출된 밴드에 주어진 것이며, 값 10은 가장 강한 밴드에 주어진 것이고 값 0은 가장 낮은 밴드에 주어진 것이다. 이 규모에서, 값 6은 레퍼런스 밴드를 가르킨다. 제 1검출 밴드내에서 관찰된 신호의 세기는 샘플내에 존재한 클록서실린의 량에 반비례한다.

표 2

클록서실린(ppb)	1차 밴드 세기	2차 밴드 세기
0	10	6
2	6	6
4	5	6
6	3	6
8	3	6
10	3	6

이 예에서, 실험은 1차 밴드가 2차 밴드의 세기보다 낮은 세기를 가질 때 포지티브한 것으로 나타나 있다. 표 2에 도시한 결과는 이 실험이 우유 샘플내의 클록서실린이 4ppb까지는 5분내에 검출할 수 있다는 것을 가르킨다.

검정을 다른 β-락탐 링 항체에서 동일 조건하에서 실행한다. 이 실험은 5분 내에, 우유 샘플내의 페니실린 G 3ppb이하까지, 아목시실린 4ppb이하까지, 암피실린 4ppb 까지, 디클록서실린 8ppb 까지, 옥사실린 8ppb 까지, 세파피린 16ppb까지, 세프티오푸르 100ppb까지, 세프퀴노네 20ppb 이하, 나프실린 20ppb까지 및 세파졸린 60ppb까지 검출할 수 있게 한다.

이 실험은 특히 우유 롤리의 내용물을 사일로에 전달하기전 분류 실험으로서 적합하다.

1.3.3. 9분 실험

세파피린 0; 4; 6; 8; 10 및 12 ppb를 제각기 함유하는, 우유의 6개 샘플을 준비한다. 그리고 나서 이들 용액 각각을 다음과 같이 분석한다.

우유 샘플의 200㎕와 예 3.1.3에서 준비한 용액 45.27㎕으로 분액을 만들고 유리 플라스크내에 놓는다. 이 혼합물을 47℃에서 7분 동안 배양한다. 그 다음, 검정 장치를 유리 플라스크내에 수직으로 위치시켜서 검정 장치의 제 1단부가 혼합물과 접촉하게 하고 제 2단부가 유리 플라스크의 벽에 놓이게 한다. 혼합물을 검정 장치에서 이동시키면서 조립체를 47℃에서 2분 동안 배양한다.

아래의 표 3은 실험한 6개의 샘플에 대해서 얻은 결과를 도시한다. 0에서부터 10까지의 범위의 세기 값은 검출된 밴드에 주어진 것이며, 값 10은 가장 강한 밴드에 주어진 것이고 값 0은 가장 낮은 밴드에 주어진 것이다. 이 규모에서, 값 6은 레퍼런스 밴드를 가르킨다. 제 1검출 밴드내에서 관찰된 신호의 세기는 샘플내에 존재한 세파피린의 량에 반비례한다.

표 3

세파피린	1차 밴드 세기	2차 밴드 세기
0	10	6
4	6	6
6	5	6
8	4	6
10	3	6
12	3	6

이 예에서, 실험은 1차 밴드가 2차 밴드의 세기보다 낮은 세기를 가질 때 포지티브한 것으로 나타나 있다. 표 2에 도시한 결과는 이 실험이 우유 샘플내의 세파피린이 6ppb까지는 9분내에 검출할 수 있다는 것을 가르킨다.

검정을 다른 β-락탐 링 항체에서 동일 조건하에서 실행한다. 이 실험은 9분 내에, 우유 샘플내의 페니실린 G 3ppb이하까지, 아목시실린 4ppb이하까지, 암피실린 4ppb 까지, 클록서실린 4ppb 까지, 디클록서실린 8ppb 까지, 옥사실린 8ppb 까지, 세프티오푸르 80ppb까지, 세프퀴노네 20ppb 이하, 나프실린 20ppb까지 및 세파졸린 450ppb까지 검출할 수 있게 한다.

그러므로, 9분내에 실시된 이 실험은 현재 유럽국에 의해 모니터되는 모든 항체의 검출을 허용하고 이들 유럽국에 의해 부과된 법률상 규제값 아래 있도록 한다.

1.3.4. 20분 실험

세프티오프르 0; 20; 30; 40; 50 및 60 ppb를 제각기 함유하는, 신선한 우유의 6개 샘플을 준비한다. 그리고 나서 이들 용액 각각을 다음과 같이 분석한다.

우유 샘플의 200㎕와 예 3.1.3에서 준비한 용액 45.27㎕으로 분액을 만들고 유리 플라스크내에 놓는다. 이 혼합물을 47℃에서 18분 동안 배양한다. 그 다음, 검정 장치를 유리 플라스크내에 수직으로 위치시켜서 검정 장치의 제 1단부가 혼합물과 접촉하게 하고 제 2단부가 유리 플라스크의 벽에 놓이게 한다. 혼합물을 검정 장치에서 이동시키면서 조립체를 47℃에서 2분 동안 배양한다.

아래의 표 4는 실험한 6개의 샘플에 대해서 얻은 결과를 도시한다. 0에서부터 10까지의 범위의 세기 값은 검출된 밴드에 주어진 것이며, 값 10은 가장 강한 밴드에 주어진 것이고 값 0은 가장 낮은 밴드에 주어진 것이다. 이 규모에서, 값 6은 레퍼런스 밴드를 가르킨다. 제 1검출 밴드내에서 관찰된 신호의 세기는 샘플내에 존재한 세프티오푸르의 량에 반비례한다.

표 4

세프티오푸르	1차 밴드 세기	2차 밴드 세기
0	10	6
20	6	6
30	5	6
40	4	6
50	3	6
60	3	6

이 예에서, 실험은 1차 밴드가 2차 밴드의 세기보다 낮은 세기를 가질 때 포지티브한 것으로 나타나 있다. 표 4에 도시한 결과는 이 실험이 우유 샘플내의 세프티오푸르 30ppb까지는 20분내에 검출할 수 있다는 것을 가르킨다.

그러므로, 20분 실험은 현재 유럽 및 미국에 의해 모니터되는 모든 항체의 단일 실험으로 검출을 허용하고 이들 국가에 의해 부과된 법률상 규제값 아래 있도록 한다.

예 4. 플라스틱 케이스내의 검정 장치 사용

예 1.6에서 기술한 바와 같은 검정 장치가 사용된다. 이 예에서, 샘플과 검정 장치를 접촉시키는 접촉 단계는 본 발명의 목적으로 제공된 용기형상 개구내에 배양된 혼합물을 증착함으로써 실시된다.

Claims

액체 유제품내의 검출되어질 분석물질의 존재를 상기 유제품의 약간 빗나간 모세관 이동에 의해 검출되도록 허용하는 검정 장치로서, 상기 검정 장치는 제 1 및 제 2 단부를 가지며, 상기 제 1단부로부터 시작하여,

- 분석된 액체를 정화시키도록 하는 막(2),

- 하나 이상의 포획 물질을 움직이지 못하게 하는 막(3)과,

- 흡수막(4)이 연속적으로 고정되어 있는 솔리드 지지체(1)를 포함하는 검정 장치에 있어서,

상기 막(2)은 상기 유제품내에 존재할 수 있는 분석물질과 실행된 방법에 따라서 사용된 검출 시약이, 검정 장치의 상기 제 1단부가 분석된 유제품에 젖게 된후 샘플의 약간의 벗어난 모세관 이동 동안, 검정 장치에서 이동하지 못하게 유제품내의 존재한 물질을 유지할 수 있는 것을 특징으로 하는 검정 장치.
제 1항에 있어서, 상기 막(2)은 백혈구흡수 막인 것을 특징으로 하는 검정 장치.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 추가로 하나 이상의 검출 시약이 증착되어 있는 막(5)을 포함하며, 상기 막(5)은 막(3) 앞에 놓여 있는 것을 특징으로 하는 검정 장치.
제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 막들은 접착 플라스틱 필름(6)에 의해 완전히 또는 부분적으로 커버되는 것을 특징으로 하는 검정 장치.
제 4항에 있어서, 상기 플라스틱 막(6)은 상기 검정 장치의 처음 몇 밀리미터를 커버하지 않는 것을 특징으로 하는 검정 장치.
제 1항 내지 제 4항중 어느 한 항에 있어서, 상기 막(2)위의 용기 형태의 구멍과 막(3)위의 윈도우 구멍을 가진 플라스틱 박스내에 위치되어 있는 것을 특징으로 하는 검정 장치.
제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 따른 검정 장치와 검출 시약을 사용해서 액체 유제품내의 분석물질을 검출하기 위한 방법에 있어서,

a) 본 발명에 따른 검정 장치와 일정량의 유제품을 상기 검정 장치의 제 1단부에서 접촉하는 접촉 단계와,

b) 유제품내에 존재할 수 있는 분석물질 및 검출 시약이 점차적으로 막(2), 그리고 나서 막(3)을 통과하도록, 그리고 막(2)과 막(3)에 의해 중단되지 않은 유제품의 성분이 막(4)내에서 끝나도록 검정 장치에서의 유제품의 모세관 현상에 의한 약간 벗어난 이동 단계와,

c) 상기 막(3)상의 고정물을 결정하는 결정 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 검출 시약은 특히 분석물질 또는 상기 분석물질과 유사한 물질을 인식할 수 있는 하나 이상의 물질과 하나 이상의 표지제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 특히 분석물질 또는 상기 분석물질과 유사한 물질을 인식할 수 있는 하나 이상의 물질은 하나 이상의 표지제와 커플링하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 표지제는 미립자, 형광물질, 방사능 물질, 발광성 물질 또는 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항 내지 제 10항중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 검출 시약을 단계 a)전에 추가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서, 단계 a) 전에 준비한 혼합물을 상기 검출 시약중 하나가 상기 분석물질 또는 상기 분석물질과 유사한 물질과 안정하고 필수적으로 변경할 수 없는 복합물을 형성하도록 허용하는 배양 조건하에서 유지하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항 내지 제 12항중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 시약은 추가로 하나 이상의 레퍼런스 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항 내지 제 13항중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석물질은 테트라사이클린, 옥시테트라사이클린 또는 클로르테트라사이클린과 같은 테트라사이클린인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항 내지 제 13항중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석물질은 첫 번째로, 예들 들어 왜래 단백질의 액체 유제품의 외인성 단백질 또는 두 번째로 예들 들어 프로게스테론 또는 성장 호르몬과 같은 호르몬의 유제품의 내인성 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항 내지 제 13항중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석물질은 β-락탐 링의 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항 내지 제 13항중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석물질은 벤질페닐실린(페니실린 G), 암피실린, 아목시실린, 카르베니실린, 메티실린, 클록아실린, 6-APA, 모노락탐, 아제트레오남, 메실리남, 세파렉신, 세파로그라신, 세파로리딘, 니트로세핀, 세파톡심, 디푸록심, 세프티오프르, 세파피린, 7-ACA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항 내지 제 13항중 어느 한 항에 있어서, 상기 특히 분석물질 또는 분석물질의 유사한 물질을 인식할 수 있는 물질은 상기 분석물질 또는 상기 분석물질과 유사한 물질과 안정하고 필수적으로 변경할 수 없는 복합물을 형성할 수 있는 수용체와 상기 분석물질 또는 상기 분석물질의 유사한 물질용 단클론 또는 다중클론 항체 족으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18항에 있어서, 상기 특히 분석물질 또는 분석물질의 유사한 물질을 인식할 수 있는 물질은 바실루스 스테아로고온균 또는 악티노미세트(actinomycetes) 족으로부터 얻은 수용체와 같은 항체 민감성 조직으로부터 얻은 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 18항 또는 제 19항에 있어서, 상기 특히 분석물질 또는 분석물질의 유사한 물질을 인식할 수 있는 물질은 바실루스 리첸니포르미스로부터 얻은, β-락탐 링을 가진 항체에 민감한 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 20항에 있어서, 상기 바실루스 리첸니포르미스로부터 얻고, β-락탐 링을 가진 항체에 민감한 수용체는 수용체 BlaR 또는 수용체 BlaR-CTD인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 따른 검정 장치를 준비하기 위한 방법에 있어서,

적층기에 의해 막들로부터 그리고 접착제로 덮은 지지체(1)로부터 카드를 준비하고, 막(3)상에 포획 용액을 증착하고, 그리고 나서 카드를 각각이 검정 장치를 이루는 스트립으로 절단하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 따른 검정 장치를 포함하는 검정 키트.