ES2244083T3 - Dispositivo de ensayo y procedimiento para la determinacion de analitos en un producto lacteo liquido. - Google Patents
Dispositivo de ensayo y procedimiento para la determinacion de analitos en un producto lacteo liquido.Info
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Abstract
Dispositivo de ensayo que permite detectar la presencia de analitos en un producto lácteo líquido por emigración capilar tangencial de dicho producto lácteo, que comprende un soporte sólido (1) que posee un primer y un segundo extremo, en el cual se fijan, sucesivamente, partiendo desde el primer extremo, - una membrana (2) que permite la purificación del líquido analizado, - una membrana (3) sobre la cual se inmovilizan una o varias sustancias de captura, y - una membrana (4) absorbente, caracterizado porque la membrana (2) es una membrana tipo Leukosorb® fabricada a partir de fibras de poliéster no tejidas y es capaz de retener las sustancias presentes en el producto lácteo, que impiden la emigración sobre el dispositivo de ensayo de los analitos eventualmente presentes en el producto lácteo y reactivos de detección utilizados según el método practicado, y esto, durante la emigración capilar tangencial de la muestra después de la humectación del primer extremo del dispositivo de ensayo enel producto lácteo analizado.
Description
Dispositivo de ensayo y procedimiento para la
determinación de analitos en un producto lácteo líquido.
La presente invención se refiere a un dispositivo
de ensayo para la determinación de analitos en un producto lácteo
líquido tal como la leche. Igualmente, se refiere a un
procedimiento que permite la detección y la cuantificación de
analitos en la leche gracias a este dispositivo de ensayo así como
un kit de reactivos de ensayo que comprende este dispositivo de
ensayo.
Hasta ahora, las exigencias sanitarias de
numerosos países imponen controlar regularmente la presencia de
diversas sustancias en los productos lácteos, tales como
medicamentos de uso veterinario y hormonas, generalmente utilizados
en la cría del ganado. Por razones médicas evidentes, estas
sustancias se deben evitar en los productos lácteos destinados al
consumo humano.
En otros casos, es deseable disponer de ensayos
que permiten detectar la presencia de sustancias endógenas en la
leche con el fin de optimizar las prácticas de cría del ganado. En
particular, la determinación rápida de la tasa de hormonas en la
leche permite identificar fácilmente los períodos propicios para la
reproducción.
En otros casos también, se buscan métodos
prácticos y fiables para controlar el origen de los productos
lácteos derivados de las leches de diversas especies animales. Se
buscan entonces métodos que permitirían identificar la presencia de
proteínas características de la leche de algunas especies con
respecto a otras.
Por otra parte, se conocen diversos ensayos en la
literatura para la detección de analitos en líquidos biológicos.
Estos ensayos utilizan generalmente métodos de detección que
recurren a un agente de reconocimiento (receptor o anticuerpo) que
reconoce específicamente el analito o un análogo de este analito, y
a un agente de marcado (radioelemento, enzima, agente fluorescente,
etc.) de aquí en adelante denominados reactivos de detección. En
función de los elementos elegidos, se hablará de radioinmunoensayo
(RIE), de radioreceptorensayo (RRE), de enzimainmunoensayo (EIE),
etc... En su principio general, estas ensayos recurren a la
combinación mínima de los dos elementos antes citados (reactivos de
detección) que permitirá obtener un resultado cuyo valor es una
Indicación de la cantidad de analito presente.
Conviene destacar que en función del
procedimiento de detección elegido, el agente de marcado se puede
acoplar bien sea al agente de reconocimiento o bien al analito o a
una sustancia análoga del analito desde el punto de vista de su
reconocimiento por el agente de reconocimiento. Igualmente, existen
métodos en los cuales el agente de reconocimiento o el analito o la
sustancia análoga del analito contiene intrínsecamente el agente de
marcado (por ejemplo un analito marcado radioactivamente).
Para los productos lácteos, los ensayos de
detección de analitos los que más se describen generalmente se
refieren a la detección de antibióticos. Es muy conocido, en
efecto, el uso de antibióticos para tratar algunas enfermedades
infecciosas del ganado productor de leche.
Ahora bien, por razones médicas evidentes, la
leche destinada al consumo humano debe, en principio, estar libre de
todo rastro de antibióticos. Por otra parte, concentraciones en
penicilina de 0,005 U.I./ml o menos pueden tener incidencias
nefastas durante la fabricación de productos derivados de la leche
tal como el queso, el yogur, etc...
Se pueden considerar varias situaciones. En un
primer caso, por ejemplo para detectar la presencia de antibióticos
en la explotación ganadera antes de transvasar a un camión, la
prioridad se dará en un ensayo extremadamente rápido (inferior a 5
minutos) y simple. Igualmente, se puede prever el uso de tal ensayo
rápido cuando por ejemplo el antibiótico que ha sido utilizado para
el tratamiento se conoce y que por otra parte este ensayo permite
la detección del antibiótico en cuestión a la norma legal. En el
segundo caso, cuando no se hace hincapié en la rapidez, la
importancia es detectar la mayoría, si no todos los antibióticos a
las normas legales.
La legislación de algunos países impone en efecto
normas de calidad bien precisas. Por ejemplo, las autoridades
americanas exigen que las concentraciones en la leche de los seis
antibióticos siguientes no superan valores bien precisos:
penicilina, 5 ppb; ampicilina, 10 ppb;
amoxicilina, 10 ppb; cloxacilina, 10 ppb; cefapirina, 20 ppb;
ceftiofur, 50 ppb. La Unión Europea impone, igualmente, normas de
calidad: penicilina 4 ppb; amoxicilina 4 ppb; ampicilina 4 ppb;
cloxacilina 30 ppb; dicloxacilina 30 ppb; oxacilina 30 ppb;
cefapirina 10 ppb; ceftiofur 100 ppb: cefquinona 20 ppb; nafcilina
30 ppb; cefazolina 50 ppb.
Por lo tanto, podría ser interesante disponer de
un ensayo que permitiría detectar la mayoría de los antibióticos.
Por otra parte, en la industria láctea, se puede considerar que a
falta de tener un ensayo que presenta todas las características de
rapidez, sensibilidad y simplicidad, sería interesante un ensayo
que permitiría combinar lo mejor posible estos tres parámetros,
incluso si no están cubiertos completamente.
La patente de EE.UU. nº 4.239.852 describe un
procedimiento microbiológico para la detección de antibióticos de
núcleo \beta-lactama en la leche. Según este
procedimiento, la muestra de leche se incuba, por una parte, en
presencia de partes de células de un microorganismo muy sensible a
los antibióticos, en particular Bacillus stearothermophilus,
y, por otra parte, en presencia de un antibiótico marcado por un
elemento radioactivo o por una enzima. La incubación se lleva en
condiciones que permiten a los antibióticos eventualmente presentes
en la muestra y al antibiótico marcado unirse a las partes de
células.
Después de la incubación, las partes de células
se separan de la mezcla, luego se lavan. A continuación, la
cantidad de antibiótico marcado unido a las partes de células se
determina y se compara a un patrón. La cantidad de antibiótico
marcado unido a las partes de células es inversamente proporcional
a la concentración de antibiótico presente en la muestra de leche
analizada.
Este procedimiento requiere manipulaciones
relativamente delicadas, en particular, durante la separación de
las partes de células de la mezcla. Además, en su versión más
sensible, este procedimiento utiliza un antibiótico marcado por un
elemento radioactivo (^{14}C o ^{125}I). En este caso, la
determinación de la cantidad de antibiótico eventualmente presente
en la leche presenta la necesidad de poder recurrir a un aparato
especial, como, por ejemplo, un contador de centelleo. Además, la
manipulación de productos radioactivos, incluso en muy pequeñas
cantidades no está totalmente libre de peligro para la persona que
efectúa el análisis.
La solicitud de patente europea nº 593112
describe otro método que permite la detección de antibióticos en la
leche. Este método utiliza una proteína aislada a partir de un
microorganismo sensible a los antibióticos, tal como el Bacillus
stearochermophilus. Esta proteína está, por otro lado, marcada
por una enzima tal como una peroxidasa.
El ensayo procede de la siguiente manera: se
incuba una muestra de leche en un tubo en presencia de la proteína
marcada; después de la incubación, la leche se transfiere en un
segundo tubo sobre las paredes del cual se inmovilizó un
antibiótico de referencia; se procede a una segunda incubación,
luego se elimina el contenido del tubo; las paredes de este segundo
tubo se lavan tres veces por medio de una solución de lavado, que
también se elimina, luego se transfieren los residuos presentes en
el segundo tubo sobre un papel absorbente; se añade entonces un
substrato colorante en el segundo tubo que se incuba de nuevo otra
vez, luego se añade una solución que detiene el desarrollo del
color; la coloración del tubo se compara con la coloración de un
ensayo idéntico efectuado en paralelo sobre una muestra patrón de
antibiótico. La cantidad de proteína marcada inmovilizada en el
soporte, y por lo tanto, la intensidad de la coloración, es
inversamente proporcional a la cantidad de antibiótico presente en
la muestra de leche analizada.
Según el ejemplo 1 de esta solicitud de patente,
este ensayo permite detectar la penicilina G hasta concentraciones
del orden de 5 ppb y permite la detección de la amoxicilina (5
ppb), de la ampicilina (10 ppb), de la cefapirina (5 ppb) y del
ceftiofur (5 ppb).
No obstante, el ensayo es bastante fastidioso de
emplear, en particular por el personal no cualificado. En efecto,
este ensayo incluye numerosas etapas, incluidas las etapas de
transferencia de líquido y residuos y varias etapas de aclarado.
Dado el número y el tipo de etapas requeridas en este ensayo, la
obtención de un resultado fiable depende mucho de los conocimientos
técnicos experimentales del ejecutor.
Además, la interpretación del resultado necesita
la realización de dos ensayos en paralelo, lo que multiplica y
complica también las operaciones.
Igualmente, se conocen otros tipos de
procedimientos enzimáticos que permiten determinar bajas
concentraciones de antibióticos en la leche (J. M. FRERE et
al, Antimicrobial Agentes and Chemotherapy, 18 (4),
506-510 (1980) así como las solicitudes de patentes
europeas nº 85667 y 468946) que se basan en la utilización de una
enzima específica, en este caso, la
D-alanil-D-alanina-carboxipeptidasa
exocelular soluble, que se produce por Actinomadura R39 (de
aquí en adelante designada como "enzima R39"). La enzima R39
posee una actividad específica de hidrólisis de los grupos
D-alanil-D-alanina
de diversos péptidos y es igualmente capaz de hidrolizar tioésteres
particulares.
Además, la enzima R39 reacciona con los
antibióticos de núcleo \beta-lactama para formar
muy rápidamente un complejo enzima-antibiótico
equimolar, inactivo y sensiblemente irreversible.
En la versión más reciente de este ensayo
(solicitud de patente europea nº 468.946), se incuba un volumen
determinado de una muestra del líquido que se debe examinar con una
cantidad predeterminada de la enzima R39 en condiciones que
permiten, al antibiótico \beta-lactama
eventualmente presente en la muestra, reaccionar con la enzima para
formar un complejo enzima-antibiótico equimolar,
inactivo y sensiblemente irreversible.
A continuación, se incuba una cantidad
determinada de substrato de tipo tioéster con el producto obtenido
en la primera fase en condiciones que permiten la hidrólisis del
substrato por la enzima R39 residual que no se acomplejó con el
antibiótico durante la primera incubación. La cantidad de ácido
mercaptoalcanoico así formada viene entonces determinada por
valoración colorimétrica con la ayuda de un reactivo capaz de
producir una coloración por reacción con el grupo SH libre del ácido
mercaptoalcanoico. La intensidad de la coloración se compara con un
patrón, previamente establecido a partir de muestras que contienen
cantidades conocidas de antibióticos. La determinación cuantitativa
se puede hacer por medida con espectrofotómetro; en el caso de la
leche, la clarificación previa de la muestra puede resultar
necesaria.
Claramente, este ensayo incluye menos etapas y es
más simple de emplear que el ensayo descrito en la solicitud de
patente europea nº 593112. No obstante, se limita a la detección de
antibióticos de núcleo \beta-lactama, y esto,
hasta el umbral de límites de detección accesibles con la enzima
R39. Tal cual, este ensayo no se puede utilizar con otros
receptores de antibióticos, y no puede directamente servir de base
para la detección de otros analitos en la leche. La solicitud de
patente europea nº 0408222 describe un dispositivo que permite
separar componentes comprendidos en un líquido, este dispositivo
comprende una membrana de separación microporosa.
Puesto que los ensayos actuales presentan también
distintos inconvenientes, la firma solicitante se fijó como
objetivo buscar nuevos métodos para la detección de analitos en los
productos lácteos líquidos. Los métodos buscados deben permitir la
determinación fiable de distintos tipos de analitos,
preferentemente en el momento de la recogida en la explotación. Por
lo tanto, la firma solicitante buscó un método que permita muy
rápidamente obtener un resultado fiable y sensible en un número
limitado de etapas simples, que no requieren conocimientos técnicos
experimentales en particular. Además, la firma solicitante buscó un
método que proporciona un resultado fácilmente detectable
visualmente y que puede, además, ser objeto de una cuantificación
por medida instrumental.
La firma solicitante acaba ahora de descubrir que
estos objetivos se pueden lograr gracias a la utilización de un
nuevo dispositivo de ensayo que permite determinar fácilmente la
presencia de analitos en los productos lácteos líquidos, en
particular, la leche.
Esta es la razón por la que la presente invención
se refiere a un dispositivo de ensayo que permite detectar la
presencia de analitos en un producto lácteo líquido por emigración
capilar tangencial de dicho producto lácteo. El dispositivo de
ensayo según la invención comprende un soporte sólido (1) que posee
un primero y un segundo extremo, sobre el cual se fijan,
sucesivamente, partiendo del primer extremo,
- -
- una membrana (2) que permite la purificación del líquido analizado,
- -
- una membrana (3) sobre la cual se inmovilizan una o varias sustancias de captura, y
- -
- una membrana (4) absorbente,
- caracterizado porque la membrana (2) es una membrana tipo Leukosorb fabricada a partir de fibras de poliéster no tejidas y es capaz de retener las sustancias presentes en el producto lácteo, que impiden la emigración sobre el dispositivo de ensayo de los analitos eventualmente presentes en el producto lácteo y de los reactivos de detección utilizados según el método practicado, y esto, durante la emigración capilar tangencial de la muestra después de la humectación del primer extremo del dispositivo de ensayo en el producto lácteo analizado.
- Según un modo de realización particular de la invención, el dispositivo de ensayo según la presente invención posee, además, una membrana (5) sobre la cual al menos se depositó un reactivo de detección, siendo este reactivo de detección capaz de solubilizarse rápidamente en presencia de dicho producto lácteo. Según este modo de realización particular, la membrana (5) se debe situarse antes de la membrana (3). Se puede situar, por ejemplo, bien sea antes de la membrana (2) en el primer extremo del dispositivo, o bien entre la membrana (2) y la membrana (3) o también por debajo o por encima de la membrana (2).
Las diferentes membranas presentes en el
dispositivo de ensayo según la presente invención se superponen en
sus extremos de tal manera que asegure la emigración continua del
producto lácteo de una zona a otra. Preferentemente, la membrana
(3) se coloca de tal manera que su extremo proximal esté colocado
por debajo de la membrana (2) y su extremo distal por debajo de la
membrana (4). Las membranas se pueden eventualmente mantener en
contacto las unas con las otras gracias a una película plástica
adhesiva (6). En este caso, la película plástica adhesiva se elige
para no afectar a la emigración del líquido sobre el dispositivo de
ensayo.
La opción de cubrir el dispositivo de ensayo por
una película plástica adhesiva presente dos ventajas: asegura un
contacto perfecto para la superposición de las membranas y
constituye una película protectora. La película plástica adhesiva
(6) puede bien sea recubrir completamente las membranas (2), (3),
(4) y (5), o bien recubrir parcialmente las membranas individuales.
Preferentemente, la película plástica adhesiva (6) no recubre los
primeros milímetros del primer extremo de tal manera que permita una
emigración más rápida del líquido sobre la membrana (2) del
dispositivo de ensayo.
Las Figuras 1 a 3 ilustran ejemplos de
dispositivos de ensayo según la presente invención. Las Figuras, 2 y
3 presentan vistas frontales y la Figura 1b presenta una vista en
sección longitudinal.
El soporte sólido (1) presente en el dispositivo
de ensayo según la presente invención es de vidrio o de material
plástico, preferentemente, de material plástico. En el caso de un
soporte de material plástico, su espesor está comprendido
generalmente entre 0,05 y 1 mm, preferentemente entre 0,1 y 0,6 mm.
Las membranas se fijan sobre el soporte sólido (1) gracias a un
adhesivo.
La membrana (2) puede ser de distintos tipos. Por
una parte, debe ser capaz de retener las sustancias presentes en el
producto lácteo que impiden la emigración sobre el dispositivo de
ensayo de los analitos eventualmente presentes en el producto
lácteo y de los reactivos de detección utilizados según el método
practicado. Por otra parte, debe permitir la emigración rápida de
los analitos y reactivos de detección sobre el dispositivo de
ensayo, preservando al mismo tiempo la actividad de estos analitos y
reactivos de detección durante esta emigración. Un ejemplo no
limitativo de membranas que permiten obtener este resultado es
Leukosorb® LK4 (disponibles en Pall Gelman Ciencias).
La membrana Leukosorb® utilizada preferentemente
es una membrana fabricada a partir de fibras de poliéster no
tejidas, destinada a la retención de leucocitos a partir de
muestras clínicas procedentes de la sangre, de la orina, de la
saliva y del líquido cerebroespinal. La retención de los leucocitos
se realiza por filtración del fluido, por paso transversal a través
de la membrana.
La firma solicitante descubrió de manera
inesperada que estos tipos de membranas permiten igualmente asegurar
una función muy importante para la detección de analitos en un
producto lácteo gracias a los dispositivos de ensayo según la
presente invención, a saber, la retención de las sustancias
presentes en los productos lácteos, que impiden el buen desarrollo
de un ensayo de detección por emigración capilar tangencial del
producto lácteo sobre dichos dispositivos de ensayo, permitiendo al
mismo tiempo la emigración rápida de los analitos y reactivos de
detección.
Para operar esta función de manera óptima, la
membrana (2) debe ser suficientemente larga para permitir la
eliminación de todas las sustancias presentes en el producto lácteo
que impiden la emigración rápida de los analitos y reactivos de
detección sobre el dispositivo de ensayo.
La membrana (3) debe permitir inmovilizar una o
varias sustancias de captura y debe permitir la emigración rápida de
la muestra de producto lácteo después del paso sobre la membrana
(2). Preferentemente, se consolida la membrana (3) sobre un soporte
no poroso de tipo poliéster. Ejemplos no limitativos de membranas
que convienen según la presente invención son las membranas de
nitrocelulosa de velocidad capilar alta tales como las membranas
Hi-Flow (disponibles en Millipore), preferentemente
las membranas Hi-Flow de tipo SX o ST. Estas
membranas obtienen un resultado óptimo en combinación con las
membranas (2) tales como se identifican anteriormente.
Se inmovilizan una o varias sustancias de captura
sobre la membrana (3). El tipo de sustancia de captura inmovilizada
depende por supuesto del método practicado para la detección de los
analitos; las sustancias de captura son capaces de inmovilizar
selectivamente al menos uno de los constituyentes presentes en el
líquido que emigra sobre el dispositivo de ensayo, tal como uno de
los reactivos de detección o el producto resultante de la formación
de un complejo entre el analito o una sustancia análoga de este
analito y al menos un reactivo de detección o también, el producto
resultante de la formación de un complejo entre varios reactivos de
detección. La sustancia de captura puede también ser uno de los
reactivos de detección. Las sustancias de captura se colocan de
manera concentrada sobre una porción o varias porciones bien
delimitadas de la membrana (3), tales como discos o bandas finas, o
cualquier otro motivo apropiado para la aplicación. Cualquiera que
sea el motivo elegido, debe permitir obtener una lectura clara del
resultado.
En cuanto a su dimensión, la membrana (3) debe
ser de una longitud suficiente para contener todas las sustancias
de captura utilizadas, y esto, en el orden y en las cantidades
requeridas según el método de detección practicado.
El tipo de membrana utilizada para la membrana
(4) importa poco, siempre que ésta sea capaz de absorber y de
almacenar el líquido después de su paso sobre las membranas
anteriores. La membrana (4) es de dimensión suficientemente grande
para permitir absorber el líquido después de su paso sobre la
membrana (3), pero también, desde un punto de vista práctico, para
permitir una toma manual más fácil del dispositivo de ensayo.
Eventualmente, el dispositivo de ensayo según la
presente Invención puede comprender una membrana (5) sobre la cual
al menos se depositó un reactivo de detección. La membrana (5) debe
permitir la emigración del producto lácteo, permitiendo al mismo
tiempo la solubilidad y la liberación del (o de los)
reactivo(s) de detección durante el paso del flujo de
producto lácteo. Ejemplos no limitativos de membranas que pueden
convenir a este efecto son: las membranas a base de resinas de fibra
de vidrio tales como las membranas T5NM (disponibles en Millipore),
las membranas F075-14 o F075-17 o
GF/C (disponibles en Whatman) la membrana Cytosep 1663 (disponible
en Pall Gelman Sciences), las membranas a base de resinas de fibras
de poliéster tales como las membranas Accuwick (disponible en Pali
Gelman Sciences) el papel celulósico 3 mm (disponibles en Whatman)
o también las membranas de tipo Release Matrix PT-R2
(disponibles en Advances Micro Devices). Preferentemente, se utiliza
una membrana a base de resinas de fibras de poliéster tales como
las membranas Accuwick. La membrana (5) tiene una longitud
suficiente para soportar la cantidad de reactivo de detección
deseada.
Los dispositivos de ensayo según la presente
invención se fabrican por los métodos conocidos por el experto en
la técnica. Se pueden por ejemplo preparar tarjetas gracias a
laminadores disponibles en el comercio. Las sustancias de captura
utilizadas se depositan sobre la membrana (3) en forma de
soluciones, antes o después del ensamblado de las tarjetas. La
deposición de estas soluciones se puede realizar de manera muy
precisa gracias a instrumentos disponibles en el comercio, tal como
el Dispenser X-Y Platform Biojet
Quanti-3000 de Bio Dot, Inc. Estas soluciones
depositadas inmediatamente son evaporadas, por ejemplo, colocando
la tarjeta bajo un flujo de aire caliente. Para la producción a
gran escala, se pueden igualmente preparar rodillos. A continuación,
las tarjetas y rodillos que llevan las sustancias de captura
deseadas se recortan en láminas, constituyendo cada una de estas
láminas un dispositivo de ensayo según la invención.
Cuando el dispositivo de ensayo comprende una
membrana (5), el (o los) reactivo(s) de detección
puede(n) ser depositado(s) antes del ensamblado de las
tarjetas o rodillos, por simple inmersión de la membrana (5) en una
solución que contiene el (o los) reactivo(s) de detección.
Alternativamente, se puede(n) depositar después del
ensamblado de las tarjetas o rodillos por una técnica análoga a la
utilizada para la deposición de las sustancias de captura sobre la
membrana (3).
En una variante de la invención, se coloca el
dispositivo en una caja plástica que presenta dos aperturas: la
primera, en forma de cubeta, se coloca exactamente sobre la
membrana (2), y permite recibir el líquido que se debe analizar; la
segunda es una ventana de apertura que permite visualizar el
resultado sobre la membrana (3). En este caso, el dispositivo de
ensayo no comprende película plástica adhesiva (6).
El dispositivo de ensayo según la presente
invención permite detectar la presencia de analitos en un producto
lácteo líquido, en particular la leche.
Esta es la razón por la que la presente invención
igualmente, se refiere a un procedimiento para la detección de
analitos en un producto lácteo líquido, utilizando un dispositivo
de ensayo según la presente invención así como los reactivos de
detección, que comprenden las siguientes etapas:
- a)
- la puesta en contacto de un volumen determinado de producto lácteo con el dispositivo de ensayo según la presente invención, teniendo esta puesta en contacto lugar en el primer extremo del dispositivo de ensayo,
- b)
- la emigración tangencial por capilaridad del producto lácteo sobre el dispositivo de ensayo de tal manera que los analitos y los reactivos de detección eventualmente presentes en el producto lácteo pasan progresivamente sobre la membrana (2), luego la membrana (3), y de tal manera que los constituyentes del producto lácteo que no se detienen por las membranas (2) y (3) lo consiguen en la membrana (4), y
- c)
- la determinación de una fijación sobre la membrana (3).
El procedimiento según la presente invención
permite detectar analitos en un producto lácteo líquido, por ejemplo
leche, suero de leche, leche batida,... La presente invención va
dirigida más concretamente a la detección de analitos tales como
medicamentos de uso veterinario, hormonas o proteínas susceptibles
de estar presente en la leche.
Los reactivos de detección utilizados según el
procedimiento de la invención pueden variar en número y en especie
en función del modo de realización de la invención, el mismo basado
en el método de detección practicado. El procedimiento según la
invención utiliza al menos dos reactivos de detección. El primer
reactivo de detección es un agente de reconocimiento capaz de
reconocer específicamente el analito, y se denominará de aquí en
adelante "Identificador". El segundo reactivo de detección es
un agente de marcado, y se denominará de aquí en adelante
"Marcador". Conviene destacar que en función del modo de
realización elegido, algunos reactivos de detección pueden estar
presentes sobre la membrana (3) o sobre la membrana (5). En función
del analito que se debe detectar y de los reactivos de detección
utilizados, puede resultar necesario añadir uno o varios reactivos
de detección antes de la etapa de puesta en contacto del producto
lácteo con el dispositivo de ensayo según la invención y mantener
esta mezcla en condiciones de incubación que permiten la formación
de un complejo entre reactivos de detección y el analito o una
sustancia análoga del analito. En función del método elegido, el
Identificador y el Marcador se pueden acoplar entre sí o pueden no
ser más que una sola y misma sustancia. Por otra parte, puede haber
varios Identificadores y/o Marcadores.
El Identificador permite detectar la presencia
del tipo de analito buscado gracias a su capacidad para reconocer
específicamente este analito o una sustancia análoga de este
analito. Puede tratarse de un receptor capaz de formar
selectivamente un complejo estable y esencialmente irreversible con
el analito o una sustancia análoga del analito o de un anticuerpo
monoclonal o policlonal específico del analito o de una sustancia
análoga del analito. Para la detección de antibióticos, el
Identificador se puede elegir entre anticuerpos monoclonales o
policlonales específicos o entre los receptores obtenidos a partir
de microorganismos sensibles a los antibióticos tales como los
receptores obtenidos a partir de las especies Bacillus (Bacillus
stearothermon hilus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis...)
a Streptococcus (Streptococcus thermophilus...), Actinomvcètes
(Actinomadura R39...).
Según un modo de realización preferido de la
invención, se utiliza un Identificador que comprende a un receptor
sensible a los antibióticos de núcleo
\beta-lactama obtenido a partir de Bacillus
licheniformis tal como el receptor BlaR o el receptor
BlaR-CTD. El aislamiento y la secuencia peptídica de
la proteína BlaR se describen en Y. ZHU et al J. Bacteriol.,
1137-1141 (1990); el receptor
BlaR-CTD es el ámbito carboxi terminal de BlaR cuyo
aislamiento y la secuencia peptídica se describen en B. a JORIS
et al, FEMS Microbiology Letters, 107-114
(1990).
La utilización de los receptores BlaR o
BlaR-CTD según la presente invención para la
detección de antibióticos de núcleo \beta-lactama
presenta ventajas importantes con respecto a los agentes de
reconocimiento utilizados hasta el presente. En efecto, los
receptores BlaR y BlaR-CTD son capaces de acomplejar
muy rápidamente un número elevado de antibióticos, y esto, a una
temperatura de incubación inferior a la necesaria para los agentes
de reconocimiento conocidos tales como, por ejemplo, los receptores
obtenidos a partir de Bacillus stearothermophilus.
El segundo tipo de reactivo de detección
utilizado es un Marcador que permite visualizar y cuantificar
directa o indirectamente la presencia de los analitos en el
producto lácteo. Los Marcadores utilizables según la invención
pueden ser de partículas, fluorescentes, radioactivos,
luminiscentes o enzimáticos. Se elige preferentemente un Marcador
de partículas que proporciona una señal visual fácilmente
detectable, incluso cuando éste está presente en pequeña cantidad.
Como ejemplos no limitativos, se citarán las partículas coloidales
metálicas (platino, oro, plata, etc), las partículas coloidales de
selenio, carbono, azufre, telurio o también las partículas
coloidales de látex sintéticos coloreados. Las partículas de oro
coloidal que tienen un diámetro de partícula comprendido entre 1 y
60 nm se prefieren especialmente: proporcionan una coloración
rosa-roja intensa fácilmente detectable.
El Marcador permite determinar la presencia del
analito en la muestra de producto lácteo gracias a su acoplamiento
a uno o varios reactivos de detección al analito o a una sustancia
análoga al analito.
El acoplamiento entre el Marcador y el reactivo
de detección se puede realizar según los métodos conocidos por el
experto en la técnica. Cuando se utiliza un Marcador de partículas,
el marcado puede tener lugar bien sea por adsorción directa sobre
las partículas, o bien indirectamente, por medio de un brazo de
sujeción químico, tal como un complejo biotina/antibiotina, por
ejemplo. Este acoplamiento puede tener lugar, bien sea antes de la
etapa de puesta en contacto del producto lácteo con el dispositivo
de ensayo según la invención o bien durante la emigración del
producto lácteo sobre el dispositivo de ensayo según la
invención.
Según un modo de realización particular de la
invención, se utiliza un tercer tipo de reactivo de detección, de
aquí en adelante, denominado "Referencia". Se trata de una
sustancia añadida en cantidad conocida a la muestra analizada, y que
se fija sobre una sustancia de captura específica inmovilizada
sobre la membrana (3). La Referencia proporciona una banda cuya
intensidad sirve de referencia para la cuantificación del
analito.
En lo que se refiere a la puesta en contacto del
producto lácteo con el dispositivo de ensayo según la invención
(etapa a) del procedimiento), se realiza colocando el dispositivo
de ensayo según la presente invención en un recipiente en el fondo
del cual se encuentra la muestra a analizar. El dispositivo de
ensayo se coloca esencialmente verticalmente en el recipiente, de
tal manera que el primer extremo del dispositivo esté en contacto
con la mezcla.
En la variante de la invención que utiliza un
dispositivo de ensayo colocado en una caja plástica, éste está
dispuesto horizontalmente y la puesta en contacto se efectúa
depositando una alícuota de muestra que se debe analizar en la
apertura en forma de cubeta colocada por encima de la membrana
(2).
Para la etapa de emigración b), se deja emigrar
el líquido por capilaridad sobre el dispositivo de ensayo según la
invención. El líquido que emigra por capilaridad sobre el
dispositivo de ensayo según la invención encuentra en primer lugar
la membrana (2) que permite retener las sustancias presentes en el
producto lácteo que impiden la emigración de los analitos
eventualmente presentes en el producto lácteo y reactivos de
detección sobre el dispositivo de ensayo. Los analitos y los
reactivos de detección emigran a continuación sobre la membrana (3)
sobre la cual se inmovilizaron una o varias sustancias de captura.
Las sustancias de captura inmovilizan selectivamente al menos uno de
los constituyentes presentes en el líquido analizado. Según un
procedimiento de realización particular de la invención, se utiliza
una sustancia de captura colocada al final del curso de emigración
del líquido sobre la membrana (3) que es capaz de fijar todos los
Marcadores que no fueron detenidos por las sustancias de captura
anteriores. Esta sustancia de captura permite completar las
informaciones cuantitativas proporcionadas por las sustancias de
captura anteriores.
La determinación de una fijación sobre la
membrana (3) (etapa c) del procedimiento) se efectúa simplemente
determinando la presencia de Marcadores en esta zona. Esta
determinación es posible simplemente visualmente. No obstante, si
se desea tener una medida precisa de la intensidad de las señales
observadas, se puede recurrir a un aparato capaz de medir la
intensidad de la señal observada, cuando se utiliza una Referencia,
se fija con una sustancia de captura específica que proporciona una
referencia interna para la medida de la intensidad de las señales
observadas.
La interpretación del resultado obtenido depende
del método de detección practicado, a saber, de los reactivos de
detección y sustancias de captura utilizadas.
Con respecto a los procedimientos de detección de
analitos en la leche anteriormente descritos en la literatura, el
procedimiento según la presente invención presenta las ventajas
siguientes. En primer lugar, este procedimiento es muy rápido y
extremadamente simple de emplear: incluye esencialmente dos etapas
de manipulación fácil, no requiriendo conocimientos técnicos
experimentales en particular. A continuación, la valoración
cualitativa y cuantitativa del resultado es inmediata y no requiere
operaciones suplementarias particulares, tales como las requeridas
cuando la detección se efectúa por colorantes y/o marcadores
enzimáticos. Además este procedimiento es directamente aplicable
para la detección de diferentes tipos de analitos. Por último, en el
modo de realización que utiliza una Referencia, el resultado es
directamente interpretable y cuantificable, sin que sea necesario
tener que recurrir a uno o varios ensayos de referencia.
Igualmente, la presente invención se refiere también a un
procedimiento tal como se define en las reivindicaciones 14,15 y
19.
Igualmente, la presente invención se refiere a un
kit de reactivos de ensayo para la detección de analitos en un
producto lácteo que comprende un dispositivo de ensayo según la
presente invención. Cuando procede, el kit de reactivos de ensayo
según la presente invención puede igualmente contener los reactivos
de detección que se deben añadir a la muestra antes de la puesta en
contacto del producto lácteo con el dispositivo de ensayo.
Los ejemplos que siguen ilustran diferentes
aspectos y modos de realización de la presente invención sin que
por ello se limite su alcance.
Se ensamblan en primer lugar tarjetas que tienen
un tamaño de 300 x 76,2 mm por medio de un laminador de tipo
Chlamshell Laminator (disponible en Bio Dot, Inc.) según el
siguiente método:
Se recorta un rectángulo de soporte plástico de
tipo ArCare 8565 (disponible en Adhesive Research) de dimensión 300
x 76,2 mm (soporte sólido (1)). Se recorta a continuación un
rectángulo de membrana tipo Leukosorb® LK4 (disponible en Pall
Gelman Sciences) de dimensión 300 x 20 mm (membrana (2)), un
rectángulo de membrana Hi-Flow SX (disponible en
Millipore) de dimensión 300 x 25 mm (membrana (3)), un rectángulo
de membrana de celulosa 3 mm (disponible en Whatmann) de dimensión
300 x 40 mm (membrana (4)) y un rectángulo de membrana Accuwick
(disponible en Pall Gelman Sciences) de dimensión 300 x 0,8 mm
(membrana (5)).
Se colocan sucesivamente las membranas (2) y (4),
luego (5), luego (3) en un sitio específico del molde inferior del
laminador. El soporte sólido (1) recubierto de adhesivo se mantiene
por el mismo en la cubierta del aparato, estando el lado adhesivo
expuesto al aire. Las membranas colocadas en el molde inferior se
ponen en contacto con el soporte adhesivo volviendo a cerrar al
laminador; las membranas se mantienen exactamente en su sitio por
medio de una succión de aire realizada por una bomba de vacío.
Cuando el vacío se rompe, se recupera una tarjeta constituida del
soporte sólido (1) sobre el cual se fijan las membranas (2), (3),
(4) y (5).
La deposición de las sustancias de captura sobre
la membrana (3) se efectúa antes o después del ensamblado según el
ejemplo 1.1.
Se prepara una solución acuosa que contiene la
sustancia de captura. Se deposita sobre la membrana (3) de la
tarjeta membranal preparada en el ejemplo 1.1. por medio de un
"Dispenser" de tipo X-Y Platform Biojet
Quanti-3000 de Bio Dot, Inc.
Las soluciones depositadas se evaporan
inmediatamente colocando el conjunto de la tarjeta durante unos
minutos bajo un aire impulsado caliente a 60ºC.
Se prepara una solución acuosa que contiene la
sustancia de marcado. La membrana (5) se sumerge en esta solución. A
continuación se escurre, luego se seca durante una noche a
temperatura ambiente bajo un vacío de 0,5 bar.
Se procede según el modo operativo descrito en el
ejemplo 1.2. para la deposición de las sustancias de captura.
Se recorta un rectángulo de película adhesiva del
tipo ArCare 7759 (disponibles en Adhesive Researchl de dimensión
300 x 20 mm para una recubrimiento parcial, y 300 x 71,2 mm para
una recubrimiento de todas las membranas.
La tarjeta obtenida según el ejemplo 1.1. se
coloca en el molde inferior de un laminador y se coloca la película
adhesiva en la tapa del laminador, estando el lado adhesivo
expuesto al aire. La película plástica adhesiva se pone en contacto
con la tarjeta membranal durante el cierre del aparato.
Las tarjetas obtenidas después de ensamblado se
recortan en láminas con la ayuda de un aparato de tipo guillotina o
con ayuda de un aparato rotativo (disponible en Bio Dote, Kinematic
o Akzo). Las láminas de los extremos se separan, estando las otras
láminas listas para su empleo.
Para su conservación, los dispositivos de ensayo
se colocan en un recipiente opaco y hermético en presencia de un
agente desecante (Silgelac, Francia).
Se coloca el dispositivo de ensayo en una caja
plástica que presenta dos aperturas: la primera, en forma de
cubeta, se coloca exactamente por encima de la membrana (2), y
permite recibir el líquido que se debe analizar; el segundo es una
ventana de apertura que permite visualizar el resultado sobre la
membrana (3).
El identificador utilizado en este ejemplo es la
Dalanil-D-alanina-carboxipeptidasa
exocelular soluble producida por Actinomadura R39 obtenida según el
modo operativo descrito en J. -M. FRERE et al, Antimicrobial
Agents and Chemotherapy, 18 (4), 506-510
(1980).
Se dializan 250 \mul de una solución acuosa de
enzima R39 a 1 mg/ml durante 24 horas contra 500 ml de tampón HNM
(Hepes 10 mM, pH 8, NaCl 10 mM, MgCl_{2} 5 mM). Se añade entonces
a esta solución enzima R39 dializada, 2 ml de tampón bicarbonato
(0,1 M en bicarbonato de sodio, pH 9) y 250 \mul de una solución
de éster 6-(biotinamido)caproico de
N-hidroxi-succinimida a 5 mg/ml en
DMF anhidro. Esta solución se agita suavemente con agitador para
tubos sobre eje rotativo de tipo LABINCO (disponible en VEL,
Bélgica) a una velocidad de 2 rpm durante 3 horas a temperatura
ambiente y al abrigo de la luz. La solución así obtenida se dializa
contra el tampón HNM (Hepes 100 mM; pH 8, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 50
mM) durante 24 horas. De esta manera, se obtiene una solución de
enzima R39 biotinilada que se diluye en el tampón
HNM-BSA (Hepes 500 mM; pH 8, NaCl 500 mM, MgCl_{2}
250 mM, BSA 10 mg/ml) hasta una concentración de 100 \mug de
enzima R39 por ml de tampón.
Esta solución se almacena a -20ºC.
Como Marcador, se utilizan partículas de oro que
tienen un diámetro de 40 nm, sobre las cuales se depositó un
anticuerpo de cabra antibiotina en forma de suspensiones en una
solución acuosa de tetraborato de sodio a 2 mM a pH 7,2 estabilizada
por el nitruro de sodio a 0,1% (disponible en BRITISH BIOCELL (Ref.
GAB40). La densidad óptica de estas suspensiones a 520 nm es
aproximadamente 10 y la concentración en proteína es
aproximadamente 24 \mug/ml.
Se diluye la solución de enzima R39 biotinilada
preparada en el ejemplo 2.2.1. 25 veces por el tampón
HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCl 500 mM, MgCl_{2}
250 mM, BSA 10 mg/ml). Se mezclan a temperatura ambiente 17,5
partes en volumen de esta solución diluida de enzima biotinilada
R39, 9,27 partes en volumen de suspensión de partículas de oro que
sirven para marcar la enzima R39 y 6 partes en volumen de suspensión
de partículas de oro de referencia (véase ejemplo 2.3).
Se diluye la solución de enzima R39 biotinilada
preparada en el ejemplo 2.2.1. 50 veces por el tampón
HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCl 500 mM, MgCl_{2}
250 mM, BSA 10 mg/ml). Se mezclan a temperatura ambiente 17,5
partes en volumen de esta solución diluida de enzima R39
biotinilada, 9,27 partes en volumen de suspensión de partículas de
oro que sirven para marcar la enzima R39 y 6 partes en volumen de
suspensión de partículas de oro de referencia (véase ejemplo
2.3).
Como Referencia, se utilizan partículas de oro de
40 nm sobre las cuales se depositó un anticuerpo de cabra
antiinmunoglobulina de conejo. Estas partículas están disponibles
en BRITISH BIOCELL (Ref. GAR40), en forma de suspensiones en una
solución acuosa de tetraborato de sodio a 2 mM a pH 7,2,
estabilizada por el nitruro de sodio a 0,1%. La densidad óptica de
estas suspensiones a 520 nm es de aproximadamente 3 y la
concentración en proteína es de aproximadamente 6 \mug/ml.
Se incuban 8 ml de una solución que contiene 213
mg de Gamma Globulina Humana (G4386, Sigma) y 8,6 mg de clorhidrato
de 2-Iminotiolano (Aldrich,
33056-6) en tampón carbonato de sodio (100 mM; pH 9)
durante una hora a 25ºC.
Por otra parte, se incuban 20 ml de una solución
que contiene 119,8 mg de cefalosporina-C y 54 mg de
sulfosuccinimidil
4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxi
(sSMCC, 22322 Pierce) en tampón carbonato de sodio (100 mM, pH 9)
durante una hora a 25ºC.
A continuación, se mezclan las dos soluciones
preparadas anteriormente. Se ajusta el pH de la solución resultante
a 7,1 por adición de 3 ml NaH_{2}PO_{4} 500 mM y se incuba
durante dos horas a 25ºC. La mezcla obtenida después de incubación
se dializa tres veces contra 1 litro de tampón fosfato de sodio (10
mM, pH 7,5). La solución resultante se filtra sobre un filtro a
0,22 \mum, luego se alícuota y se congela a -20ºC hasta su
utilización.
Durante la utilización, las alícuotas se
descongelan, y se añade un colorante alimentario antes de efectuar
la deposición sobre la membrana con el fin de apreciar en cualquier
momento la posición exacta de la deposición y la calidad de la
traza.
La primera sustancia de captura permite fijar los
Identificadores acoplados a los Marcadores libres excedentarios con
respecto a la cantidad de antibiótico presente en la muestra.
Para la segunda sustancia de captura, se utiliza
una solución de inmunoglobulina de conejo (Sigma I 5006) a una
concentración de 0,5 mg/ml en inmunoglobulina en el tampón fosfato
de sodio 10 mM, pH 7,5, gamma globulina humana 5 mg/ml. Esta
segunda sustancia de captura detiene la Referencia durante la
emigración del líquido sobre el dispositivo de ensayo.
Se utilizan dispositivos de ensayo que contienen
las membranas (2), (3) y (4), ensamblados según el modo operativo
descrito en el ejemplo 1.1. La membrana (3) de estos dispositivos
se lleva del lado proximal la sustancia de captura descrita en el
ejemplo 2.4.1. y del lado distal la sustancia de captura descrita en
el ejemplo 2.4.2. Las sustancias de captura se depositaron según el
procedimiento descrito en el ejemplo 1.2.
Se preparan siete muestras de leche que contienen
respectivamente 0; 2; 4; 5; 6; 8 y 10 ppb de penicilina G. Cada una
de estas soluciones se analiza entonces de la siguiente manera.
Se toma una alícuota de 200 \mul de muestra de
leche y 32,8 \mul de solución A preparada en el ejemplo 2.2.3.
que se coloca en un tubo Eppendorf. Esta mezcla se incuba durante 3
minutos a 47ºC. Se coloca a continuación un dispositivo de ensayo
verticalmente en el tubo Eppendorf de tal manera que el primer
extremo del dispositivo de ensayo esté en contacto con la mezcla.
Se deja emigrar la mezcla sobre el dispositivo de ensayo incubando
al mismo tiempo el conjunto durante 2 minutos a 47ºC.
La tabla 1 presentada más abajo recoge los
resultados obtenidos para las 7 muestras que permanecen. Se
atribuye un valor de intensidad que va de 0 a 10 a las bandas
detectadas, siendo el valor 10 dado para la banda más intensa y
siendo el valor 0 dado para la banda menos intensa. Según esta
escala, se atribuye un valor 6 a la banda de referencia. La
intensidad de la señal observada en la primera banda de detección
es inversamente proporcional a la cantidad de penicilina G presente
en la muestra.
| Penicilina G | Intensidad | |
| (ppb) | 1ª banda | 2ª banda |
| 0 | 10 | 6 |
| 2 | 8 | 6 |
| 4 | 5 | 6 |
| 5 | 3 | 6 |
| 6 | 2 | 6 |
| 8 | 1 | 6 |
| 10 | 0 | 6 |
En este ejemplo, cuando la primera banda tiene
una intensidad inferior a la de la banda de referencia, el ensayo
se da por positivo. Los resultados presentados en la tabla 1
muestran que este ensayo permite detectar en 5 minutos hasta 4 ppb
de penicilina G en una muestra de leche.
Se preparan seis muestras de leche que contienen
respectivamente 0; 2; 2,5; 3; 4 y 5 ppb de penicilina G. Cada una
de estas soluciones se analiza entonces de la siguiente manera.
Se toma una alícuota de 200 \mul de muestra de
leche y 32,8 \mul de solución B preparada en el ejemplo 2.2.3.
que se coloca en un tubo Eppendorf. Esta mezcla se incuba durante 5
minutos a 47ºC. Se coloca a continuación un dispositivo de ensayo
verticalmente en el tubo Eppendorf de tal manera que el primer
extremo del dispositivo de ensayo esté en contacto con la mezcla.
Se deja emigrar la mezcla sobre el dispositivo de ensayo incubando
al mismo tiempo el conjunto durante 2 minutos a 47ºC.
La tabla 2 presentada más abajo recoge los
resultados obtenidos para las 7 muestras ensayadas. Se atribuye un
valor de intensidad que va de 0 a 10 a las bandas detectadas,
siendo el valor 10 dado para la banda más intensa y siendo el valor
0 dado para la banda menos intensa. Según esta escala, se atribuye
un valor 6 a la banda de referencia. La intensidad de la señal
observada en la primera banda de detección es inversamente
proporcional a la cantidad de penicilina G presente en la
muestra.
| Penicilina G | Intensidad | |
| (ppb) | 1ª banda | 2ª banda |
| 0 | 10 | 6 |
| 2 | 7 | 6 |
| 2,5 | 5 | 6 |
| 3 | 4 | 6 |
| 4 | 1 | 6 |
| 5 | 0 | 6 |
En este ejemplo, cuando la primera banda tiene
una intensidad inferior a la de la banda de referencia, el ensayo
se da por positivo. Los resultados presentados en la tabla 2
muestran que este ensayo permite detectar en 7 minutos hasta 2,5 ppb
de penicilina G en una muestra de leche.
Este ejemplo ilustra la detección en la leche de
antibióticos de núcleo \beta-lactama controlados
por las autoridades sanitarias. El ensayo descrito en este ejemplo
utiliza al receptor BlaR-CTD acoplado a bolas de oro
que sirven de agentes de marcado y utiliza un soporte que se
presenta bajo la forma de un dispositivo de ensayo que comprende un
soporte sólido en el cual se fijan las membranas.
Se recogen 3,79 ml de una solución de agente de
reconocimiento BlaR-CTD a 6,6 mg/ml en tampón
Fosfato de sodio 20 mM pH 7. Se añaden entonces a esta solución de
BlaR-CTD 41,71 ml de tampón bicarbonato (0,1 M en
bicarbonato de sodio pH 9) y 2 ml de una solución de éster
6-(biotinamido)caproico de
N-hidroxi-succinimida a 2,23 mg/ml
igualmente en tampón bicarbonato. Esta solución se agita suavemente
con agitador para tubos sobre eje rotativo de tipo LABINCO
(disponible en VEL, Bélgica) a una velocidad de 2 rpm durante 2
horas a temperatura ambiente y al abrigo de la luz. Se incuban 2,5
ml de una solución de tampón Tris 1 M pH 8 con la mezcla de la
reacción en las mismas condiciones durante 30 minutos. La solución
así obtenida se dializa contra el tampón HNM (Hepes 100 mM. pH 8,
NaCl 100 mM, MgCl_{2} 50 mM) durante 24 horas. De esta manera, se
obtiene una solución de BlaR-CTD biotinilado que se
diluye en el tampón HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8,
NaCl 500 mM, MgCl_{2} 250 mM, BSA
10 mg/ml) hasta una concentración de 250 \mug de BlaR-CTD biotinilado por ml de tampón. Esta solución se almacena a -20ºC.
10 mg/ml) hasta una concentración de 250 \mug de BlaR-CTD biotinilado por ml de tampón. Esta solución se almacena a -20ºC.
Como agente de marcado, se utiliza partículas de
oro que tienen un diámetro de 40 nm, sobre las cuales se depositó
un anticuerpo de cabra antibiotina en forma de suspensiones en una
solución acuosa de tetraborato de sodio a 2 mM a pH 7,2,
estabilizada por el nitruro de sodio al 0,1% (disponible en BRITISH
BIOCELL (Ref. GAB40). La densidad óptica de estas suspensiones a 520
nm es de aproximadamente 10 y la concentración en proteína es de
aproximadamente 24 \mug/ml.
La solución de BlaR-CTD
biotinilado preparada en el ejemplo 3.1.1 se diluye 114,7 veces por
el tampón HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCl 500 mM,
MgCl_{2} 250 mM, BSA 10 mg/ml). Se mezclan a temperatura ambiente
22,5 partes en volumen de esta solución diluida de
BlaR-CTD biotinilado, 7,5 partes en volumen de
tampón HNM-BSA, 9,27 partes en volumen de
suspensión de partículas de oro que sirven para marcar al
BlaR-CTD biotinilado y 6 partes en volumen de
suspensión de partículas de oro de referencia (véase ejemplo 3.1.4
siguiente).
En este ensayo, se utiliza igualmente una
sustancia de referencia que proporcionauna banda cuya intensidad
permite cuantificar rápidamente la cantidad de antibiótico presente
en la muestra.
Para ello, se utilizan partículas de oro de 40 nm
sobre las cuales se depositó un anticuerpo de cabra
antiinmunoglobulina de conejo. Estas partículas están disponibles
en BRITISH BIOCELL (Ref. GAR40), en forma de suspensiones en una
solución acuosa de tetraborato de sodio a 2 mM a pH 7,2,
estabilizada por el nitruro de sodio a 0,1%. La densidad óptica de
estas suspensiones a 520 nm es de aproximadamente 3 y la
concentración en proteína es de aproximadamente 6 \mug/ml.
Se incuban 8 ml de una solución que contiene 213
mg de Gamma Globulina Humana (G4386, Sigma) y 8,6 mg de hidrocloruro
de 2-Iminotiolano (Aldrich,
33056-6) en el tampón carbonato de sodio (100 mM, pH
9) durante una hora a 25ºC.
Por otra parte, se incuban 20 ml de una solución
que contiene 119,8 mg de cefalosporina-C y 54 mg de
sulfosuccinimidil
4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato
(sSMCC, 22322 Pierce) en el tampón carbonato de sodio (100 mM, pH
9) durante una hora a 25ºC.
A continuación, se mezclan las dos soluciones
preparadas anteriormente. Se ajusta el pH de la solución resultante
a 7,1 por adición de 3 ml NaH_{2}PO_{4} 500 mM y se incuba
durante dos horas a 25ºC. La mezcla obtenida después de la
incubación se dializa tres veces contra 1 litro de tampón fosfato
de sodio (10 mM, pH 7,5). La solución resultante se filtra sobre un
filtro a 0,22 \mum, luego se alícuota y hasta su utilización se
congela a -20ºC.
Durante la utilización, las alícuotas se
descongelan, y se añade un colorante alimentario antes de efectuar
la deposición sobre la membrana con el fin de apreciar en cualquier
momento la posición exacta de la deposición y la calidad de la
traza.
La primera sustancia de captura permite fijar
BlaR-CTD acoplado a las bolas de oro presentes en
excedente con respecto a la cantidad de antibiótico presente en la
muestra.
Para la segunda sustancia de captura, se utiliza
una solución de inmunoglobulina de conejo (Sigma I 5006) a una
concentración de 0,5 mg/ml en inmunoglobulina en el tampón fosfato
de sodio 10 mM, pH 7,5, gamma globulina humana 5 mg/ml. Esta
segunda sustancia de captura detiene la referencia independiente en
la emigración del líquido sobre el dispositivo de ensayo.
Se utilizan dispositivos de ensayo que contienen
las membranas (2), (3) y (4), ensamblados según el modo operativo
descrito en el ejemplo 1.1. La membrana (3) de estos dispositivos
se lleva del lado proximal la sustancia de captura descrita en el
ejemplo 3.2.1. y del lado distal la sustancia de captura descrita en
el ejemplo 3.2.2. Las sustancias de captura se depositaron según el
procedimiento descrito en el ejemplo 1 2.
Se preparan 7 muestras de leche fresca que
contienen respectivamente 0; 1; 2; 3; 4; 5 y 6 ppb de penicilina G.
Entonces, se analizan cada una de estas soluciones de la siguiente
manera.
Se toma una alícuota de 200 \mul de muestra de
leche y 45,27 \mul de solución preparada en el ejemplo 3.1.3 que
se coloca en un frasco de vidrio. Esta mezcla se incuba durante 1
minuto a 47ºC. Se toma un dispositivo de ensayo que se coloca
verticalmente en el frasco de vidrio de tal manera que el primer
extremo del dispositivo de ensayo esté en contacto con la mezcla y
de tal manera que el segundo extremo reposa en la pared del frasco
de vidrio. Se deja emigrar la mezcla sobre el dispositivo de ensayo
incubando al mismo tiempo el conjunto durante 2 minutos a 47ºC.
La tabla 1 presentada más abajo recoge los
resultados obtenidos para las 7 muestras ensayadas. Se atribuye un
valor de intensidad que va de 0 a 10 a las bandas detectadas,
siendo el valor 10 dado para la banda más intensa y siendo el valor
0 dado para la banda menos intensa. Según esta escala, se atribuye
un valor de 6 a la banda de referencia. La intensidad de la señal
observada en la primera banda es inversamente proporcional a la
cantidad de Penicilina G presente en la muestra.
| Penicilina G | Intensidad | |
| (ppb) | 1ª banda | 2ª banda |
| 0 | 10 | 6 |
| 1 | 9 | 6 |
| 2 | 9 | 6 |
| 3 | 4 | 6 |
| 4 | 0 | 6 |
| 5 | 0 | 6 |
| 6 | 0 | 6 |
En este ejemplo, cuando la primera banda tiene
una intensidad inferior a la de la segunda banda, el ensayo se da
por positivo. Los resultados presentados en la tabla 1 muestran que
este ensayo permite detectar en 3 minutos menos de 4 ppb de
penicilina G en una muestra de leche.
Se realizaron igualmente algunos ensayos con
otros antibióticos de núcleo \beta-lactama en las
mismas condiciones. Este ensayo realizado en 3 minutos permite
detectar la amoxicilina hasta 5 ppb, la ampicilina hasta 5 ppb, la
cloxacilina a menos de 10 ppb, la dicloxacilina a menos de 20 ppb,
la oxacilina a menos de 20 ppb y la cefapirina hasta 20 ppb en una
muestra de leche.
Se preparan 6 muestras de leche fresca que
contienen respectivamente 0; 2; 4; 6; 8 y 10 ppb de cloxacilina.
Entonces, se analiza cada una de estas soluciones de la siguiente
manera.
Se toma una alícuota de 200 \mul de muestra de
leche y 45,27 \mul de solución preparada en el ejemplo 3.1.3 que
se coloca en un frasco de vidrio. Esta mezcla se incuba durante 3
minutos a 47ºC. Se toma un dispositivo de ensayo que se coloca
verticalmente en el frasco de vidrio de tal manera que el primer
extremo del dispositivo de ensayo esté en contacto con la mezcla y
de tal manera que el segundo extremo reposa en la pared del frasco
de vidrio. Se deja emigrar la mezcla sobre el dispositivo de ensayo
incubando al mismo tiempo el conjunto durante 2 minutos a 47ºC.
La tabla 2 presentada más abajo recoge los
resultados obtenidos para las 6 muestras ensayadas. Un valor de
intensidad que va de 0 a 10 se atribuye a las bandas detectadas,
siendo el valor 10 dado para la banda más intensa y siendo el valor
0 dado para la banda menos intensa. Según esta escala, se atribuye
un valor de 6 a la banda de referencia. La intensidad de la señal
observada en la primera banda es inversamente proporcional a la
cantidad de Cloxacilina presente en la muestra.
| Cloxacilina | Intensidad | |
| (ppb) | 1ª banda | 2ª banda |
| 0 | 10 | 6 |
| 2 | 6 | 6 |
| 4 | 5 | 6 |
| 6 | 3 | 6 |
| 8 | 3 | 6 |
| 10 | 3 | 6 |
En este ejemplo, cuando la primera banda tiene
una intensidad inferior a la de la segunda banda, el ensayo se da
por positivo. Los resultados presentados en la tabla 2 muestran que
este ensayo permite detectar en 5 minutos hasta 4 ppb de
cloxacilina en una muestra de leche.
Se realizaron igualmente algunos ensayos con
otros antibióticos de núcleo \beta-lactama en las
mismas condiciones. Este ensayo realizado en 5 minutos permite
detectar la penicilina G hasta 3 ppb, la amoxicilina hasta 4 ppb, la
ampicili-
na hasta 4 ppb, la dicloxacilina hasta 8 ppb, la oxacilina hasta 8 ppb, la cefapirina hasta 16 ppb, el ceftiofur hasta 100 ppb, la cefquinona a menos de 20 ppb, la nafcilina hasta 20 ppb y la cefazolina hasta 60 ppb en una muestra de leche.
na hasta 4 ppb, la dicloxacilina hasta 8 ppb, la oxacilina hasta 8 ppb, la cefapirina hasta 16 ppb, el ceftiofur hasta 100 ppb, la cefquinona a menos de 20 ppb, la nafcilina hasta 20 ppb y la cefazolina hasta 60 ppb en una muestra de leche.
Este ensayo conviene bien particularmente como
ensayo de selección antes del trasiego de los camiones de leche en
los silos.
Se preparan 6 muestras de leche fresca que
contiene respectivamente 0; 4; 6; 8; 10 y 12 ppb de cefapirina.
Entonces, se analiza cada una de estas soluciones de la siguiente
manera.
Se toma una alícuota de 200 \mul de muestra de
leche y 45,27 \mul de solución preparada en el ejemplo 3.1.3 que
se coloca en un frasco de vidrio. Esta mezcla se incuba durante 7
minutos a 47ºC. Se toma un dispositivo de ensayo que se coloca
verticalmente en el frasco de vidrio de tal manera que el primer
extremo del dispositivo de ensayo esté en contacto con la mezcla y
de tal manera que el segundo extremo reposa en la pared del frasco
de vidrio. Se deja emigrar la mezcla sobre el dispositivo de ensayo
incubando al mismo tiempo el conjunto durante 2 minutos a 47ºC.
La tabla 3 presentada más abajo recoge los
resultados obtenidos para las 6 muestras ensayadas. Se atribuye un
valor de intensidad que va de 0 a 10 a las bandas detectadas,
siendo el valor 10 dado para la banda más intensa y siendo el valor
0 dado para la banda menos intensa. Según esta escala, se atribuye
un valor de 6 a la banda de referencia. La intensidad de la señal
observada en la primera banda es inversamente proporcional a la
cantidad de Cefapirina presente en la muestra.
| Cefaparina | Intensidad | |
| (ppb) | 1ª banda | 2ª banda |
| 0 | 10 | 6 |
| 4 | 6 | 6 |
| 6 | 5 | 6 |
| 8 | 4 | 6 |
| 10 | 3 | 6 |
| 12 | 3 | 6 |
En este ejemplo, cuando la primera banda tiene
una intensidad inferior a la de la segunda banda, el ensayo se da
por positivo. Los resultados presentados en la tabla 3 muestran que
este ensayo permite detectar en 9 minutos hasta 6 ppb de cefapirina
en una muestra de leche.
Igualmente, se realizaron ensayos con otros
antibióticos de núcleo \beta-lactama en las
mismas condiciones. Este ensayo realizado en 9 minutos permite
detectar la penicilina G hasta 3 ppb, la amoxicilina hasta 4 ppb,
la ampicilina hasta 4 ppb, la cloxacilina hasta 4 ppb, la
dicloxacilina a menos de 8 ppb, la oxacilina a menos de 8 ppb, el
ceftiofur hasta 80 ppb, la cefquinona a menos de 20 ppb, la
nafcilina a menos de 20 ppb y la cefazolina hasta 45 ppb en una
muestra de leche.
Este ensayo realizado en 9 minutos permite, por
lo tanto, detectar todos los antibióticos controlados actualmente
por las autoridades europeas, y esto, hasta los límites legales
impuestos por estas autoridades.
Se preparan 6 muestras de leche fresca que
contienen respectivamente 0; 20; 30; 40; 50 y 60 ppb de ceftiofur.
Se analiza entonces cada una de estas soluciones de la siguiente
manera.
Se toma una alícuota de 200 \mul de muestra de
leche y 45,27 \mul de solución preparada en el ejemplo 3.1.3 que
se coloca en un frasco de vidrio. Esta mezcla se incuba durante 18
minutos a 47ºC. Se toma un dispositivo de ensayo que se coloca
verticalmente en el frasco de vidrio de tal manera que el primer
extremo del dispositivo de ensayo esté en contacto con la mezcla y
de tal manera que el segundo extremo reposa en la pared del frasco
de vidrio. Se deja emigrar la mezcla sobre el dispositivo de ensayo
incubando al mismo tiempo el conjunto durante 2 minutos a 47ºC.
La tabla 4 presentada más abajo recoge los
resultados obtenidos para las 6 muestras ensayadas. Se atribuye un
valor de intensidad que va de 0 a 10 a las bandas detectadas,
siendo el valor 10 dado para la banda más intensa y siendo el valor
0 dado para la banda menos intensa. Según esta escala, se atribuye
un valor de 6 a la banda de referencia. La intensidad de la señal
observada en la primera banda es inversamente proporcional a la
cantidad de Ceftiofur presente en la muestra.
| Ceftiofur | Intensidad | |
| (ppb) | 1ª banda | 2ª banda |
| 0 | 10 | 6 |
| 20 | 6 | 6 |
| 30 | 5 | 6 |
| 40 | 4 | 6 |
| 50 | 3 | 6 |
| 60 | 3 | 6 |
En este ejemplo, cuando la primera banda tiene
una intensidad inferior a la de la segunda banda, el ensayo se da
por positivo. Los resultados presentados en la tabla 4 muestran que
este ensayo permite detectar en 20 minutos hasta 30 ppb de
ceftiofur en una muestra de leche.
Por lo tanto, este ensayo permite detectar en 20
minutos en un único ensayo todos los antibióticos controlados
actualmente por las autoridades europeas y americanas, y esto,
hasta los límites legales impuestos por estas autoridades.
Se utiliza un dispositivo de ensayo tal como
describe en el ejemplo 1.6. En este caso, la puesta en contacto de
la muestra con el dispositivo de ensayo se efectúa depositando la
mezcla incubada en la apertura en forma de cubeta prevista para tal
efecto.
Claims (25)
1. Dispositivo de ensayo que permite detectar la
presencia de analitos en un producto lácteo líquido por emigración
capilar tangencial de dicho producto lácteo, que comprende un
soporte sólido (1) que posee un primer y un segundo extremo, en el
cual se fijan, sucesivamente, partiendo desde el primer extremo,
- -
- una membrana (2) que permite la purificación del líquido analizado,
- -
- una membrana (3) sobre la cual se inmovilizan una o varias sustancias de captura, y
- -
- una membrana (4) absorbente,
caracterizado porque la membrana (2) es
una membrana tipo Leukosorb® fabricada a partir de fibras de
poliéster no tejidas y es capaz de retener las sustancias presentes
en el producto lácteo, que impiden la emigración sobre el
dispositivo de ensayo de los analitos eventualmente presentes en el
producto lácteo y reactivos de detección utilizados según el método
practicado, y esto, durante la emigración capilar tangencial de la
muestra después de la humectación del primer extremo del dispositivo
de ensayo en el producto lácteo analizado.
2. Dispositivo de ensayo según la reivindicación
1, caracterizado porque la membrana (3) es una membrana de
nitrocelulosa de elevada velocidad capilar.
3. Dispositivo de ensayo según las
reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque posee, por otro
lado, una membrana (5) sobre la cual al menos se depositó un
reactivo de detección, estando la membrana (5) situada antes de la
membrana (3).
4. Dispositivo de ensayo según las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las membranas
están recubiertas completa o parcialmente por una película plástica
adhesiva (6).
5. Dispositivo de ensayo según la reivindicación
4, caracterizado porque la película plástica (6) no recubre
los primeros milímetros del dispositivo de ensayo.
6. Dispositivo de ensayo según las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se coloca en
una caja plástica que pre senta una apertura en forma de cubeta por
encima de la membrana (2) y una ventana de apertura sobre la
membrana (3).
7. Procedimiento para la detección de analitos en
un producto lácteo líquido, que utiliza un dispositivo de ensayo
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 así como los
reactivos de detección, que comprende las siguientes etapas:
- a)
- la puesta en contacto de un volumen determinado de producto lácteo con el dispositivo de ensayo, teniendo esta puesta en contacto lugar en el primer extremo del dispositivo de ensayo,
- b)
- la emigración tangencial por capilaridad del producto lácteo sobre el dispositivo de ensayo de tal manera que los analitos y los reactivos de detección eventualmente presentes en el producto lácteo pasan progresivamente sobre la membrana (2), luego sobre la membrana (3), y de tal manera que los constituyentes del producto lácteo que no se detienen por las membranas (2) y (3) lo consiguen en la membrana (4),y
- c)
- la determinación de una fijación sobre la membrana (3).
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque los reactivos de detección comprenden
al menos una sustancia capaz de reconocer específicamente el
analito o una sustancia análoga de este analito y al menos un agente
de marcado.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado porque se acopla al menos una sustancia capaz
de reconocer específicamente el analito o una sustancia análoga de
este analito a al menos un agente de marcado.
10. Procedimiento según las reivindicaciones 8 ó
9, caracterizado porque el agente de marcado es
fluorescente, de partículas, radioactivo, luminiscente o
enzimático.
11. Procedimiento según las reivindicaciones 7 a
10, caracterizado porque se añade al menos un reactivo de
detección antes de la etapa a).
12. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque la mezcla preparada antes de la etapa
a) se mantiene en condiciones de incubación que permiten a uno de
los reactivos de detección formar un complejo estable y
esencialmente irreversible con el analito o una sustancia análoga
de este analito.
13. Procedimiento según las reivindicaciones 8 a
12, caracterizado porque los reactivos de detección
comprenden por otro lado al menos una sustancia de referencia.
14. Procedimiento según las reivindicaciones 7 a
13, caracterizado porque el analito es una tetraciclina,
oxitetraciclina o clortetraciclina.
15. Procedimiento según las reivindicaciones 7 a
13, caracterizado porque el analito es, por una parte una
proteína exógena del producto lácteo líquido, o, por otra parte,
una proteína endógena del producto lácteo.
16. Procedimiento según la reivindicación 15,
caracterizado porque el analito es una hormona.
17. Procedimiento según la reivindicación 16,
caracterizado porque el analito es la progesterona o la
hormona de crecimiento.
18. Procedimiento según las reivindicaciones 7 a
13, caracterizado porque el analito es un antibiótico con
núcleo \beta-lactama.
19. Procedimiento según las reivindicaciones 7 a
13, caracterizado porque el analito se elige entre el grupo
constituido por benzilpenicilina ampicilina, amoxicilina,
carbenicilina, metilcilina, cloxacilina, 6-APA,
monolactama, axtreonama, mecilina, cefalexina, cefaloglicina,
cefaloridina nitrocefina, cefatoxima, cefuromixa, ceftiofur,
cefapirina, y 7-ACA.
20. Procedimiento según las reivindicaciones 7 ó
17, caracterizado porque la sustancia capaz de reconocer
específicamente del analito o una sustancia análoga del analito se
elige entre los receptores capaces de formar un complejo estable y
esencialmente irreversible con el analito o una sustancia análoga
del analito y los anticuerpos monoclonales o policlonales
específicos del analito o de una sustancia análoga del analito.
21. Procedimiento según la reivindicación 20,
caracterizado porque la sustancia capaz de reconocer
específicamente el analito o una sustancia análoga del analito es
un receptor obtenido a partir de un microorganismo sensible a los
antibióticos.
22. Procedimiento según la reivindicación 21,
caracterizado porque la sustancia capaz de reconocer
específicamente el analito o una sustancia análoga al analito es un
receptor obtenido a partir de las especies Bacillus,
Streptccoccus o Actinomicetos.
23. Procedimiento según las reivindicaciones 20,
21 ó 22, caracterizado porque la sustancia capaz de
reconocer específicamente el analito o una sustancia análoga al
analito es un receptor sensible a los antibióticos de núcleo
\beta-lactama obtenido a partir de Bacillus
licheniformis.
24. Procedimiento según la reivindicación 23,
caracterizado porque el receptor sensible a los antibióticos
de núcleo \beta-lactama obtenido a partir de
Bacillus licheniformis es el receptor BlaR o el receptor
BlaR-CTD.
25. Kit de reactivos de ensayo que comprende un
dispositivo de ensayo según las reivindicaciones 1 a 6.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BE9700807A BE1011487A3 (fr) | 1997-10-07 | 1997-10-07 | Dispositif d'essai pour la determination d'analytes dans un produit laitier liquide. |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98947242T Expired - Lifetime ES2244083T3 (es) | 1997-10-07 | 1998-10-06 | Dispositivo de ensayo y procedimiento para la determinacion de analitos en un producto lacteo liquido. |
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|---|---|
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Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BE1012049A6 (fr) * | 1998-06-25 | 2000-04-04 | Ucb Bioproducts | Procede pour la determination d'antibiotique a noyau beta-lactame dans un liquide biologique. |
| DK1923471T3 (da) | 1999-04-20 | 2013-04-02 | Illumina Inc | Detektion af nukleinsyrereaktioner på bead-arrays |
| US6447657B1 (en) | 2000-12-04 | 2002-09-10 | Roche Diagnostics Corporation | Biosensor |
| EP1417491A4 (en) * | 2001-07-18 | 2004-08-11 | Siliang Zhou | TEST STRIP FOR SIDE FLOW ASSAY OF A SAMPLE CONTAINING WHOLE CELLS |
| CN1300586C (zh) * | 2003-09-30 | 2007-02-14 | 江西中德生物工程有限公司 | 展青霉素免疫层析检测试纸的制作方法与应用 |
| EP1733235A1 (en) * | 2004-01-29 | 2006-12-20 | DSM IP Assets B.V. | Improved lateral flow binding assay |
| US8003407B2 (en) * | 2004-07-29 | 2011-08-23 | Relia Diagnostic Systems, Llc | Lateral flow system and assay |
| CN100356171C (zh) * | 2005-09-13 | 2007-12-19 | 中国农业科学院畜牧研究所 | 一种检测鲜牛奶和巴氏牛奶中还原奶的方法 |
| FR2918460B1 (fr) * | 2007-07-02 | 2013-10-04 | Najim Chaibi | Nouveau dispositif permettant l'obtention des resultats des systemes abo,rhesus et autres pherotypes et systemes rares, rai. |
| US8005280B2 (en) * | 2007-12-12 | 2011-08-23 | Jadak, Llc | Optical imaging clinical sampler |
| NZ596163A (en) * | 2009-04-15 | 2014-01-31 | Relia Diagnostic Systems Inc | Diagnostic devices and related methods |
| CN102478573A (zh) * | 2010-11-29 | 2012-05-30 | 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 | 一种评价乳制品检测中庆大霉素试纸条有效性的方法 |
| JP5693938B2 (ja) * | 2010-12-10 | 2015-04-01 | 旭化成株式会社 | 乳汁中の特定物質を検出する方法 |
| WO2013053953A1 (en) * | 2011-10-14 | 2013-04-18 | Université de Liège | Method for measuring beta-lactam antibiotics |
| BR112014010718B1 (pt) * | 2011-11-16 | 2020-12-22 | Becton, Dickinson And Company | métodos, sistemas, dispositivos e kits para detecção de analito em amostra |
| JP6162370B2 (ja) * | 2012-05-30 | 2017-07-12 | 古河電気工業株式会社 | イムノクロマトグラフィー用試験片 |
| IN2014DN10498A (es) * | 2012-06-13 | 2015-08-21 | Asahi Chemical Ind | |
| KR101429193B1 (ko) * | 2013-05-10 | 2014-08-13 | 호서대학교 산학협력단 | 클로르테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 |
| CN103897046A (zh) * | 2013-05-23 | 2014-07-02 | 华中农业大学 | β-内酰胺类抗生素残留检测的受体分析法与试剂盒 |
| CN104198699B (zh) * | 2014-09-04 | 2016-06-15 | 深圳市领治医学科技有限公司 | 一种快速诊断试纸及其制备方法 |
| JP6254994B2 (ja) * | 2014-11-18 | 2017-12-27 | 株式会社ニチレイバイオサイエンス | 検査キット |
| AU2016224107B2 (en) | 2015-02-27 | 2021-09-23 | Mastaplex Limited | Bacteria identification and antimicrobial susceptibility test |
| US10551381B2 (en) | 2016-02-11 | 2020-02-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Anti-dengue virus NS1 protein monoclonal antibodies |
| CN106568965A (zh) * | 2016-10-14 | 2017-04-19 | 广州安诺食品科学技术有限公司 | 金胺o胶体金检测卡及其制备方法 |
| EP3374771A1 (en) | 2016-12-28 | 2018-09-19 | Neogen Corporation | Implement analyzing device and method for utilizing the same |
| USD834721S1 (en) | 2017-03-03 | 2018-11-27 | Neogen Corporation | Assay cartridge |
Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4239852A (en) * | 1978-06-12 | 1980-12-16 | Penicillin Assays, Inc. | Antibiotic detection method |
| CA1185881A (en) * | 1982-02-01 | 1985-04-23 | Jacques Degelaen | ENZYMATIC PROCESS FOR THE DETERMINATION OF .beta.-LACTAM ANTIBIOTICS |
| US4786594A (en) * | 1986-05-14 | 1988-11-22 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Enzyme immunoassay |
| US4918025A (en) * | 1987-03-03 | 1990-04-17 | Pb Diagnostic Systems, Inc. | Self contained immunoassay element |
| CA1303983C (en) * | 1987-03-27 | 1992-06-23 | Robert W. Rosenstein | Solid phase assay |
| DE3842702A1 (de) * | 1988-12-19 | 1990-06-21 | Boehringer Mannheim Gmbh | Testtraeger zur analytischen untersuchung einer probenfluessigkeit mit hilfe einer spezifischen bindungsreaktion zweier bioaffiner bindungspartner und entsprechendes testverfahren |
| US5234813A (en) * | 1989-05-17 | 1993-08-10 | Actimed Laboratories, Inc. | Method and device for metering of fluid samples and detection of analytes therein |
| CA2020029A1 (en) * | 1989-07-12 | 1991-01-13 | Yatin B. Thakore | Device and method for separation of plasma from blood and determination of blood analytes |
| GB9009692D0 (en) * | 1990-04-30 | 1990-06-20 | Ucb Bioproducts | An enzymatic method of determining beta-lactam ring antibiotics |
| US5648274A (en) * | 1991-05-29 | 1997-07-15 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Competitive immunoassay device |
| JP2948318B2 (ja) * | 1992-03-10 | 1999-09-13 | クイデル コーポレイション | 特異的結合アッセイ用の赤血球の分離方法 |
| PT653639E (pt) * | 1993-11-12 | 2000-06-30 | Unilever Nv | Equipamentos analiticos e metodos para a sua utilizacao |
| WO1996010177A1 (en) * | 1994-09-28 | 1996-04-04 | Spectral Diagnostics Inc. | Method and device for determination of proteins |
| US5662813A (en) * | 1994-10-21 | 1997-09-02 | Bioseparations, Inc. | Method for separation of nucleated fetal erythrocytes from maternal blood samples |
| WO1996015453A1 (en) * | 1994-11-14 | 1996-05-23 | Spectral Diagnostics Inc. | Method and device for determination of proteins employing antigen/antibody reactions |
| JPH08285849A (ja) * | 1995-04-14 | 1996-11-01 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | 簡易測定装置およびこれを用いる測定方法 |
| US5712172A (en) * | 1995-05-18 | 1998-01-27 | Wyntek Diagnostics, Inc. | One step immunochromatographic device and method of use |
| EP0823877B1 (en) * | 1995-05-02 | 2001-11-07 | Carter Wallace, Inc. | Process of preparing a laminated substrate |
| ATE334392T1 (de) * | 1995-05-09 | 2006-08-15 | Beckman Coulter Inc | Vorrichtungen und verfahren zur abtrennung zellulärer blutkomponenten von flüssigen blutanteilen |
| US5981294A (en) * | 1995-11-29 | 1999-11-09 | Metrika, Inc. | Device for blood separation in a diagnostic device |
| US5821073A (en) * | 1996-05-09 | 1998-10-13 | Syntron Bioresearch, Inc. | Method and apparatus for single step assays of whole blood |
| US6001658A (en) * | 1996-09-13 | 1999-12-14 | Diagnostic Chemicals Limited | Test strip apparatus and method for determining presence of analyte in a fluid sample |
| US5958714A (en) * | 1996-10-02 | 1999-09-28 | Safety Associates, Inc. | Test kits for determining at least two specific analytes in foods and other complex matrices |
| US6319466B1 (en) * | 1997-07-16 | 2001-11-20 | Charm Sciences, Inc. | Test device for detecting the presence of a residue analyte in a sample |
| US5985675A (en) * | 1997-12-31 | 1999-11-16 | Charm Sciences, Inc. | Test device for detection of an analyte |
-
1998
- 1998-10-06 AT AT98947242T patent/ATE297016T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-10-06 CN CN98809987A patent/CN1126956C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-10-06 AU AU94248/98A patent/AU738143B2/en not_active Ceased
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