ES2244083T3 - Dispositivo de ensayo y procedimiento para la determinacion de analitos en un producto lacteo liquido. - Google Patents

Dispositivo de ensayo y procedimiento para la determinacion de analitos en un producto lacteo liquido.

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ES2244083T3 ES98947242T ES98947242T ES2244083T3 ES 2244083 T3 ES2244083 T3 ES 2244083T3 ES 98947242 T ES98947242 T ES 98947242T ES 98947242 T ES98947242 T ES 98947242T ES 2244083 T3 ES2244083 T3 ES 2244083T3
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Dispositivo de ensayo que permite detectar la presencia de analitos en un producto lácteo líquido por emigración capilar tangencial de dicho producto lácteo, que comprende un soporte sólido (1) que posee un primer y un segundo extremo, en el cual se fijan, sucesivamente, partiendo desde el primer extremo, - una membrana (2) que permite la purificación del líquido analizado, - una membrana (3) sobre la cual se inmovilizan una o varias sustancias de captura, y - una membrana (4) absorbente, caracterizado porque la membrana (2) es una membrana tipo Leukosorb® fabricada a partir de fibras de poliéster no tejidas y es capaz de retener las sustancias presentes en el producto lácteo, que impiden la emigración sobre el dispositivo de ensayo de los analitos eventualmente presentes en el producto lácteo y reactivos de detección utilizados según el método practicado, y esto, durante la emigración capilar tangencial de la muestra después de la humectación del primer extremo del dispositivo de ensayo enel producto lácteo analizado.

Description

Dispositivo de ensayo y procedimiento para la determinación de analitos en un producto lácteo líquido.
La presente invención se refiere a un dispositivo de ensayo para la determinación de analitos en un producto lácteo líquido tal como la leche. Igualmente, se refiere a un procedimiento que permite la detección y la cuantificación de analitos en la leche gracias a este dispositivo de ensayo así como un kit de reactivos de ensayo que comprende este dispositivo de ensayo.
Hasta ahora, las exigencias sanitarias de numerosos países imponen controlar regularmente la presencia de diversas sustancias en los productos lácteos, tales como medicamentos de uso veterinario y hormonas, generalmente utilizados en la cría del ganado. Por razones médicas evidentes, estas sustancias se deben evitar en los productos lácteos destinados al consumo humano.
En otros casos, es deseable disponer de ensayos que permiten detectar la presencia de sustancias endógenas en la leche con el fin de optimizar las prácticas de cría del ganado. En particular, la determinación rápida de la tasa de hormonas en la leche permite identificar fácilmente los períodos propicios para la reproducción.
En otros casos también, se buscan métodos prácticos y fiables para controlar el origen de los productos lácteos derivados de las leches de diversas especies animales. Se buscan entonces métodos que permitirían identificar la presencia de proteínas características de la leche de algunas especies con respecto a otras.
Por otra parte, se conocen diversos ensayos en la literatura para la detección de analitos en líquidos biológicos. Estos ensayos utilizan generalmente métodos de detección que recurren a un agente de reconocimiento (receptor o anticuerpo) que reconoce específicamente el analito o un análogo de este analito, y a un agente de marcado (radioelemento, enzima, agente fluorescente, etc.) de aquí en adelante denominados reactivos de detección. En función de los elementos elegidos, se hablará de radioinmunoensayo (RIE), de radioreceptorensayo (RRE), de enzimainmunoensayo (EIE), etc... En su principio general, estas ensayos recurren a la combinación mínima de los dos elementos antes citados (reactivos de detección) que permitirá obtener un resultado cuyo valor es una Indicación de la cantidad de analito presente.
Conviene destacar que en función del procedimiento de detección elegido, el agente de marcado se puede acoplar bien sea al agente de reconocimiento o bien al analito o a una sustancia análoga del analito desde el punto de vista de su reconocimiento por el agente de reconocimiento. Igualmente, existen métodos en los cuales el agente de reconocimiento o el analito o la sustancia análoga del analito contiene intrínsecamente el agente de marcado (por ejemplo un analito marcado radioactivamente).
Para los productos lácteos, los ensayos de detección de analitos los que más se describen generalmente se refieren a la detección de antibióticos. Es muy conocido, en efecto, el uso de antibióticos para tratar algunas enfermedades infecciosas del ganado productor de leche.
Ahora bien, por razones médicas evidentes, la leche destinada al consumo humano debe, en principio, estar libre de todo rastro de antibióticos. Por otra parte, concentraciones en penicilina de 0,005 U.I./ml o menos pueden tener incidencias nefastas durante la fabricación de productos derivados de la leche tal como el queso, el yogur, etc...
Se pueden considerar varias situaciones. En un primer caso, por ejemplo para detectar la presencia de antibióticos en la explotación ganadera antes de transvasar a un camión, la prioridad se dará en un ensayo extremadamente rápido (inferior a 5 minutos) y simple. Igualmente, se puede prever el uso de tal ensayo rápido cuando por ejemplo el antibiótico que ha sido utilizado para el tratamiento se conoce y que por otra parte este ensayo permite la detección del antibiótico en cuestión a la norma legal. En el segundo caso, cuando no se hace hincapié en la rapidez, la importancia es detectar la mayoría, si no todos los antibióticos a las normas legales.
La legislación de algunos países impone en efecto normas de calidad bien precisas. Por ejemplo, las autoridades americanas exigen que las concentraciones en la leche de los seis antibióticos siguientes no superan valores bien precisos:
penicilina, 5 ppb; ampicilina, 10 ppb; amoxicilina, 10 ppb; cloxacilina, 10 ppb; cefapirina, 20 ppb; ceftiofur, 50 ppb. La Unión Europea impone, igualmente, normas de calidad: penicilina 4 ppb; amoxicilina 4 ppb; ampicilina 4 ppb; cloxacilina 30 ppb; dicloxacilina 30 ppb; oxacilina 30 ppb; cefapirina 10 ppb; ceftiofur 100 ppb: cefquinona 20 ppb; nafcilina 30 ppb; cefazolina 50 ppb.
Por lo tanto, podría ser interesante disponer de un ensayo que permitiría detectar la mayoría de los antibióticos. Por otra parte, en la industria láctea, se puede considerar que a falta de tener un ensayo que presenta todas las características de rapidez, sensibilidad y simplicidad, sería interesante un ensayo que permitiría combinar lo mejor posible estos tres parámetros, incluso si no están cubiertos completamente.
La patente de EE.UU. nº 4.239.852 describe un procedimiento microbiológico para la detección de antibióticos de núcleo \beta-lactama en la leche. Según este procedimiento, la muestra de leche se incuba, por una parte, en presencia de partes de células de un microorganismo muy sensible a los antibióticos, en particular Bacillus stearothermophilus, y, por otra parte, en presencia de un antibiótico marcado por un elemento radioactivo o por una enzima. La incubación se lleva en condiciones que permiten a los antibióticos eventualmente presentes en la muestra y al antibiótico marcado unirse a las partes de células.
Después de la incubación, las partes de células se separan de la mezcla, luego se lavan. A continuación, la cantidad de antibiótico marcado unido a las partes de células se determina y se compara a un patrón. La cantidad de antibiótico marcado unido a las partes de células es inversamente proporcional a la concentración de antibiótico presente en la muestra de leche analizada.
Este procedimiento requiere manipulaciones relativamente delicadas, en particular, durante la separación de las partes de células de la mezcla. Además, en su versión más sensible, este procedimiento utiliza un antibiótico marcado por un elemento radioactivo (^{14}C o ^{125}I). En este caso, la determinación de la cantidad de antibiótico eventualmente presente en la leche presenta la necesidad de poder recurrir a un aparato especial, como, por ejemplo, un contador de centelleo. Además, la manipulación de productos radioactivos, incluso en muy pequeñas cantidades no está totalmente libre de peligro para la persona que efectúa el análisis.
La solicitud de patente europea nº 593112 describe otro método que permite la detección de antibióticos en la leche. Este método utiliza una proteína aislada a partir de un microorganismo sensible a los antibióticos, tal como el Bacillus stearochermophilus. Esta proteína está, por otro lado, marcada por una enzima tal como una peroxidasa.
El ensayo procede de la siguiente manera: se incuba una muestra de leche en un tubo en presencia de la proteína marcada; después de la incubación, la leche se transfiere en un segundo tubo sobre las paredes del cual se inmovilizó un antibiótico de referencia; se procede a una segunda incubación, luego se elimina el contenido del tubo; las paredes de este segundo tubo se lavan tres veces por medio de una solución de lavado, que también se elimina, luego se transfieren los residuos presentes en el segundo tubo sobre un papel absorbente; se añade entonces un substrato colorante en el segundo tubo que se incuba de nuevo otra vez, luego se añade una solución que detiene el desarrollo del color; la coloración del tubo se compara con la coloración de un ensayo idéntico efectuado en paralelo sobre una muestra patrón de antibiótico. La cantidad de proteína marcada inmovilizada en el soporte, y por lo tanto, la intensidad de la coloración, es inversamente proporcional a la cantidad de antibiótico presente en la muestra de leche analizada.
Según el ejemplo 1 de esta solicitud de patente, este ensayo permite detectar la penicilina G hasta concentraciones del orden de 5 ppb y permite la detección de la amoxicilina (5 ppb), de la ampicilina (10 ppb), de la cefapirina (5 ppb) y del ceftiofur (5 ppb).
No obstante, el ensayo es bastante fastidioso de emplear, en particular por el personal no cualificado. En efecto, este ensayo incluye numerosas etapas, incluidas las etapas de transferencia de líquido y residuos y varias etapas de aclarado. Dado el número y el tipo de etapas requeridas en este ensayo, la obtención de un resultado fiable depende mucho de los conocimientos técnicos experimentales del ejecutor.
Además, la interpretación del resultado necesita la realización de dos ensayos en paralelo, lo que multiplica y complica también las operaciones.
Igualmente, se conocen otros tipos de procedimientos enzimáticos que permiten determinar bajas concentraciones de antibióticos en la leche (J. M. FRERE et al, Antimicrobial Agentes and Chemotherapy, 18 (4), 506-510 (1980) así como las solicitudes de patentes europeas nº 85667 y 468946) que se basan en la utilización de una enzima específica, en este caso, la D-alanil-D-alanina-carboxipeptidasa exocelular soluble, que se produce por Actinomadura R39 (de aquí en adelante designada como "enzima R39"). La enzima R39 posee una actividad específica de hidrólisis de los grupos D-alanil-D-alanina de diversos péptidos y es igualmente capaz de hidrolizar tioésteres particulares.
Además, la enzima R39 reacciona con los antibióticos de núcleo \beta-lactama para formar muy rápidamente un complejo enzima-antibiótico equimolar, inactivo y sensiblemente irreversible.
En la versión más reciente de este ensayo (solicitud de patente europea nº 468.946), se incuba un volumen determinado de una muestra del líquido que se debe examinar con una cantidad predeterminada de la enzima R39 en condiciones que permiten, al antibiótico \beta-lactama eventualmente presente en la muestra, reaccionar con la enzima para formar un complejo enzima-antibiótico equimolar, inactivo y sensiblemente irreversible.
A continuación, se incuba una cantidad determinada de substrato de tipo tioéster con el producto obtenido en la primera fase en condiciones que permiten la hidrólisis del substrato por la enzima R39 residual que no se acomplejó con el antibiótico durante la primera incubación. La cantidad de ácido mercaptoalcanoico así formada viene entonces determinada por valoración colorimétrica con la ayuda de un reactivo capaz de producir una coloración por reacción con el grupo SH libre del ácido mercaptoalcanoico. La intensidad de la coloración se compara con un patrón, previamente establecido a partir de muestras que contienen cantidades conocidas de antibióticos. La determinación cuantitativa se puede hacer por medida con espectrofotómetro; en el caso de la leche, la clarificación previa de la muestra puede resultar necesaria.
Claramente, este ensayo incluye menos etapas y es más simple de emplear que el ensayo descrito en la solicitud de patente europea nº 593112. No obstante, se limita a la detección de antibióticos de núcleo \beta-lactama, y esto, hasta el umbral de límites de detección accesibles con la enzima R39. Tal cual, este ensayo no se puede utilizar con otros receptores de antibióticos, y no puede directamente servir de base para la detección de otros analitos en la leche. La solicitud de patente europea nº 0408222 describe un dispositivo que permite separar componentes comprendidos en un líquido, este dispositivo comprende una membrana de separación microporosa.
Puesto que los ensayos actuales presentan también distintos inconvenientes, la firma solicitante se fijó como objetivo buscar nuevos métodos para la detección de analitos en los productos lácteos líquidos. Los métodos buscados deben permitir la determinación fiable de distintos tipos de analitos, preferentemente en el momento de la recogida en la explotación. Por lo tanto, la firma solicitante buscó un método que permita muy rápidamente obtener un resultado fiable y sensible en un número limitado de etapas simples, que no requieren conocimientos técnicos experimentales en particular. Además, la firma solicitante buscó un método que proporciona un resultado fácilmente detectable visualmente y que puede, además, ser objeto de una cuantificación por medida instrumental.
La firma solicitante acaba ahora de descubrir que estos objetivos se pueden lograr gracias a la utilización de un nuevo dispositivo de ensayo que permite determinar fácilmente la presencia de analitos en los productos lácteos líquidos, en particular, la leche.
Esta es la razón por la que la presente invención se refiere a un dispositivo de ensayo que permite detectar la presencia de analitos en un producto lácteo líquido por emigración capilar tangencial de dicho producto lácteo. El dispositivo de ensayo según la invención comprende un soporte sólido (1) que posee un primero y un segundo extremo, sobre el cual se fijan, sucesivamente, partiendo del primer extremo,
-
una membrana (2) que permite la purificación del líquido analizado,
-
una membrana (3) sobre la cual se inmovilizan una o varias sustancias de captura, y
-
una membrana (4) absorbente,
caracterizado porque la membrana (2) es una membrana tipo Leukosorb fabricada a partir de fibras de poliéster no tejidas y es capaz de retener las sustancias presentes en el producto lácteo, que impiden la emigración sobre el dispositivo de ensayo de los analitos eventualmente presentes en el producto lácteo y de los reactivos de detección utilizados según el método practicado, y esto, durante la emigración capilar tangencial de la muestra después de la humectación del primer extremo del dispositivo de ensayo en el producto lácteo analizado.
Según un modo de realización particular de la invención, el dispositivo de ensayo según la presente invención posee, además, una membrana (5) sobre la cual al menos se depositó un reactivo de detección, siendo este reactivo de detección capaz de solubilizarse rápidamente en presencia de dicho producto lácteo. Según este modo de realización particular, la membrana (5) se debe situarse antes de la membrana (3). Se puede situar, por ejemplo, bien sea antes de la membrana (2) en el primer extremo del dispositivo, o bien entre la membrana (2) y la membrana (3) o también por debajo o por encima de la membrana (2).
Las diferentes membranas presentes en el dispositivo de ensayo según la presente invención se superponen en sus extremos de tal manera que asegure la emigración continua del producto lácteo de una zona a otra. Preferentemente, la membrana (3) se coloca de tal manera que su extremo proximal esté colocado por debajo de la membrana (2) y su extremo distal por debajo de la membrana (4). Las membranas se pueden eventualmente mantener en contacto las unas con las otras gracias a una película plástica adhesiva (6). En este caso, la película plástica adhesiva se elige para no afectar a la emigración del líquido sobre el dispositivo de ensayo.
La opción de cubrir el dispositivo de ensayo por una película plástica adhesiva presente dos ventajas: asegura un contacto perfecto para la superposición de las membranas y constituye una película protectora. La película plástica adhesiva (6) puede bien sea recubrir completamente las membranas (2), (3), (4) y (5), o bien recubrir parcialmente las membranas individuales. Preferentemente, la película plástica adhesiva (6) no recubre los primeros milímetros del primer extremo de tal manera que permita una emigración más rápida del líquido sobre la membrana (2) del dispositivo de ensayo.
Las Figuras 1 a 3 ilustran ejemplos de dispositivos de ensayo según la presente invención. Las Figuras, 2 y 3 presentan vistas frontales y la Figura 1b presenta una vista en sección longitudinal.
El soporte sólido (1) presente en el dispositivo de ensayo según la presente invención es de vidrio o de material plástico, preferentemente, de material plástico. En el caso de un soporte de material plástico, su espesor está comprendido generalmente entre 0,05 y 1 mm, preferentemente entre 0,1 y 0,6 mm. Las membranas se fijan sobre el soporte sólido (1) gracias a un adhesivo.
La membrana (2) puede ser de distintos tipos. Por una parte, debe ser capaz de retener las sustancias presentes en el producto lácteo que impiden la emigración sobre el dispositivo de ensayo de los analitos eventualmente presentes en el producto lácteo y de los reactivos de detección utilizados según el método practicado. Por otra parte, debe permitir la emigración rápida de los analitos y reactivos de detección sobre el dispositivo de ensayo, preservando al mismo tiempo la actividad de estos analitos y reactivos de detección durante esta emigración. Un ejemplo no limitativo de membranas que permiten obtener este resultado es Leukosorb® LK4 (disponibles en Pall Gelman Ciencias).
La membrana Leukosorb® utilizada preferentemente es una membrana fabricada a partir de fibras de poliéster no tejidas, destinada a la retención de leucocitos a partir de muestras clínicas procedentes de la sangre, de la orina, de la saliva y del líquido cerebroespinal. La retención de los leucocitos se realiza por filtración del fluido, por paso transversal a través de la membrana.
La firma solicitante descubrió de manera inesperada que estos tipos de membranas permiten igualmente asegurar una función muy importante para la detección de analitos en un producto lácteo gracias a los dispositivos de ensayo según la presente invención, a saber, la retención de las sustancias presentes en los productos lácteos, que impiden el buen desarrollo de un ensayo de detección por emigración capilar tangencial del producto lácteo sobre dichos dispositivos de ensayo, permitiendo al mismo tiempo la emigración rápida de los analitos y reactivos de detección.
Para operar esta función de manera óptima, la membrana (2) debe ser suficientemente larga para permitir la eliminación de todas las sustancias presentes en el producto lácteo que impiden la emigración rápida de los analitos y reactivos de detección sobre el dispositivo de ensayo.
La membrana (3) debe permitir inmovilizar una o varias sustancias de captura y debe permitir la emigración rápida de la muestra de producto lácteo después del paso sobre la membrana (2). Preferentemente, se consolida la membrana (3) sobre un soporte no poroso de tipo poliéster. Ejemplos no limitativos de membranas que convienen según la presente invención son las membranas de nitrocelulosa de velocidad capilar alta tales como las membranas Hi-Flow (disponibles en Millipore), preferentemente las membranas Hi-Flow de tipo SX o ST. Estas membranas obtienen un resultado óptimo en combinación con las membranas (2) tales como se identifican anteriormente.
Se inmovilizan una o varias sustancias de captura sobre la membrana (3). El tipo de sustancia de captura inmovilizada depende por supuesto del método practicado para la detección de los analitos; las sustancias de captura son capaces de inmovilizar selectivamente al menos uno de los constituyentes presentes en el líquido que emigra sobre el dispositivo de ensayo, tal como uno de los reactivos de detección o el producto resultante de la formación de un complejo entre el analito o una sustancia análoga de este analito y al menos un reactivo de detección o también, el producto resultante de la formación de un complejo entre varios reactivos de detección. La sustancia de captura puede también ser uno de los reactivos de detección. Las sustancias de captura se colocan de manera concentrada sobre una porción o varias porciones bien delimitadas de la membrana (3), tales como discos o bandas finas, o cualquier otro motivo apropiado para la aplicación. Cualquiera que sea el motivo elegido, debe permitir obtener una lectura clara del resultado.
En cuanto a su dimensión, la membrana (3) debe ser de una longitud suficiente para contener todas las sustancias de captura utilizadas, y esto, en el orden y en las cantidades requeridas según el método de detección practicado.
El tipo de membrana utilizada para la membrana (4) importa poco, siempre que ésta sea capaz de absorber y de almacenar el líquido después de su paso sobre las membranas anteriores. La membrana (4) es de dimensión suficientemente grande para permitir absorber el líquido después de su paso sobre la membrana (3), pero también, desde un punto de vista práctico, para permitir una toma manual más fácil del dispositivo de ensayo.
Eventualmente, el dispositivo de ensayo según la presente Invención puede comprender una membrana (5) sobre la cual al menos se depositó un reactivo de detección. La membrana (5) debe permitir la emigración del producto lácteo, permitiendo al mismo tiempo la solubilidad y la liberación del (o de los) reactivo(s) de detección durante el paso del flujo de producto lácteo. Ejemplos no limitativos de membranas que pueden convenir a este efecto son: las membranas a base de resinas de fibra de vidrio tales como las membranas T5NM (disponibles en Millipore), las membranas F075-14 o F075-17 o GF/C (disponibles en Whatman) la membrana Cytosep 1663 (disponible en Pall Gelman Sciences), las membranas a base de resinas de fibras de poliéster tales como las membranas Accuwick (disponible en Pali Gelman Sciences) el papel celulósico 3 mm (disponibles en Whatman) o también las membranas de tipo Release Matrix PT-R2 (disponibles en Advances Micro Devices). Preferentemente, se utiliza una membrana a base de resinas de fibras de poliéster tales como las membranas Accuwick. La membrana (5) tiene una longitud suficiente para soportar la cantidad de reactivo de detección deseada.
Los dispositivos de ensayo según la presente invención se fabrican por los métodos conocidos por el experto en la técnica. Se pueden por ejemplo preparar tarjetas gracias a laminadores disponibles en el comercio. Las sustancias de captura utilizadas se depositan sobre la membrana (3) en forma de soluciones, antes o después del ensamblado de las tarjetas. La deposición de estas soluciones se puede realizar de manera muy precisa gracias a instrumentos disponibles en el comercio, tal como el Dispenser X-Y Platform Biojet Quanti-3000 de Bio Dot, Inc. Estas soluciones depositadas inmediatamente son evaporadas, por ejemplo, colocando la tarjeta bajo un flujo de aire caliente. Para la producción a gran escala, se pueden igualmente preparar rodillos. A continuación, las tarjetas y rodillos que llevan las sustancias de captura deseadas se recortan en láminas, constituyendo cada una de estas láminas un dispositivo de ensayo según la invención.
Cuando el dispositivo de ensayo comprende una membrana (5), el (o los) reactivo(s) de detección puede(n) ser depositado(s) antes del ensamblado de las tarjetas o rodillos, por simple inmersión de la membrana (5) en una solución que contiene el (o los) reactivo(s) de detección. Alternativamente, se puede(n) depositar después del ensamblado de las tarjetas o rodillos por una técnica análoga a la utilizada para la deposición de las sustancias de captura sobre la membrana (3).
En una variante de la invención, se coloca el dispositivo en una caja plástica que presenta dos aperturas: la primera, en forma de cubeta, se coloca exactamente sobre la membrana (2), y permite recibir el líquido que se debe analizar; la segunda es una ventana de apertura que permite visualizar el resultado sobre la membrana (3). En este caso, el dispositivo de ensayo no comprende película plástica adhesiva (6).
El dispositivo de ensayo según la presente invención permite detectar la presencia de analitos en un producto lácteo líquido, en particular la leche.
Esta es la razón por la que la presente invención igualmente, se refiere a un procedimiento para la detección de analitos en un producto lácteo líquido, utilizando un dispositivo de ensayo según la presente invención así como los reactivos de detección, que comprenden las siguientes etapas:
a)
la puesta en contacto de un volumen determinado de producto lácteo con el dispositivo de ensayo según la presente invención, teniendo esta puesta en contacto lugar en el primer extremo del dispositivo de ensayo,
b)
la emigración tangencial por capilaridad del producto lácteo sobre el dispositivo de ensayo de tal manera que los analitos y los reactivos de detección eventualmente presentes en el producto lácteo pasan progresivamente sobre la membrana (2), luego la membrana (3), y de tal manera que los constituyentes del producto lácteo que no se detienen por las membranas (2) y (3) lo consiguen en la membrana (4), y
c)
la determinación de una fijación sobre la membrana (3).
El procedimiento según la presente invención permite detectar analitos en un producto lácteo líquido, por ejemplo leche, suero de leche, leche batida,... La presente invención va dirigida más concretamente a la detección de analitos tales como medicamentos de uso veterinario, hormonas o proteínas susceptibles de estar presente en la leche.
Los reactivos de detección utilizados según el procedimiento de la invención pueden variar en número y en especie en función del modo de realización de la invención, el mismo basado en el método de detección practicado. El procedimiento según la invención utiliza al menos dos reactivos de detección. El primer reactivo de detección es un agente de reconocimiento capaz de reconocer específicamente el analito, y se denominará de aquí en adelante "Identificador". El segundo reactivo de detección es un agente de marcado, y se denominará de aquí en adelante "Marcador". Conviene destacar que en función del modo de realización elegido, algunos reactivos de detección pueden estar presentes sobre la membrana (3) o sobre la membrana (5). En función del analito que se debe detectar y de los reactivos de detección utilizados, puede resultar necesario añadir uno o varios reactivos de detección antes de la etapa de puesta en contacto del producto lácteo con el dispositivo de ensayo según la invención y mantener esta mezcla en condiciones de incubación que permiten la formación de un complejo entre reactivos de detección y el analito o una sustancia análoga del analito. En función del método elegido, el Identificador y el Marcador se pueden acoplar entre sí o pueden no ser más que una sola y misma sustancia. Por otra parte, puede haber varios Identificadores y/o Marcadores.
El Identificador permite detectar la presencia del tipo de analito buscado gracias a su capacidad para reconocer específicamente este analito o una sustancia análoga de este analito. Puede tratarse de un receptor capaz de formar selectivamente un complejo estable y esencialmente irreversible con el analito o una sustancia análoga del analito o de un anticuerpo monoclonal o policlonal específico del analito o de una sustancia análoga del analito. Para la detección de antibióticos, el Identificador se puede elegir entre anticuerpos monoclonales o policlonales específicos o entre los receptores obtenidos a partir de microorganismos sensibles a los antibióticos tales como los receptores obtenidos a partir de las especies Bacillus (Bacillus stearothermon hilus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis...) a Streptococcus (Streptococcus thermophilus...), Actinomvcètes (Actinomadura R39...).
Según un modo de realización preferido de la invención, se utiliza un Identificador que comprende a un receptor sensible a los antibióticos de núcleo \beta-lactama obtenido a partir de Bacillus licheniformis tal como el receptor BlaR o el receptor BlaR-CTD. El aislamiento y la secuencia peptídica de la proteína BlaR se describen en Y. ZHU et al J. Bacteriol., 1137-1141 (1990); el receptor BlaR-CTD es el ámbito carboxi terminal de BlaR cuyo aislamiento y la secuencia peptídica se describen en B. a JORIS et al, FEMS Microbiology Letters, 107-114 (1990).
La utilización de los receptores BlaR o BlaR-CTD según la presente invención para la detección de antibióticos de núcleo \beta-lactama presenta ventajas importantes con respecto a los agentes de reconocimiento utilizados hasta el presente. En efecto, los receptores BlaR y BlaR-CTD son capaces de acomplejar muy rápidamente un número elevado de antibióticos, y esto, a una temperatura de incubación inferior a la necesaria para los agentes de reconocimiento conocidos tales como, por ejemplo, los receptores obtenidos a partir de Bacillus stearothermophilus.
El segundo tipo de reactivo de detección utilizado es un Marcador que permite visualizar y cuantificar directa o indirectamente la presencia de los analitos en el producto lácteo. Los Marcadores utilizables según la invención pueden ser de partículas, fluorescentes, radioactivos, luminiscentes o enzimáticos. Se elige preferentemente un Marcador de partículas que proporciona una señal visual fácilmente detectable, incluso cuando éste está presente en pequeña cantidad. Como ejemplos no limitativos, se citarán las partículas coloidales metálicas (platino, oro, plata, etc), las partículas coloidales de selenio, carbono, azufre, telurio o también las partículas coloidales de látex sintéticos coloreados. Las partículas de oro coloidal que tienen un diámetro de partícula comprendido entre 1 y 60 nm se prefieren especialmente: proporcionan una coloración rosa-roja intensa fácilmente detectable.
El Marcador permite determinar la presencia del analito en la muestra de producto lácteo gracias a su acoplamiento a uno o varios reactivos de detección al analito o a una sustancia análoga al analito.
El acoplamiento entre el Marcador y el reactivo de detección se puede realizar según los métodos conocidos por el experto en la técnica. Cuando se utiliza un Marcador de partículas, el marcado puede tener lugar bien sea por adsorción directa sobre las partículas, o bien indirectamente, por medio de un brazo de sujeción químico, tal como un complejo biotina/antibiotina, por ejemplo. Este acoplamiento puede tener lugar, bien sea antes de la etapa de puesta en contacto del producto lácteo con el dispositivo de ensayo según la invención o bien durante la emigración del producto lácteo sobre el dispositivo de ensayo según la invención.
Según un modo de realización particular de la invención, se utiliza un tercer tipo de reactivo de detección, de aquí en adelante, denominado "Referencia". Se trata de una sustancia añadida en cantidad conocida a la muestra analizada, y que se fija sobre una sustancia de captura específica inmovilizada sobre la membrana (3). La Referencia proporciona una banda cuya intensidad sirve de referencia para la cuantificación del analito.
En lo que se refiere a la puesta en contacto del producto lácteo con el dispositivo de ensayo según la invención (etapa a) del procedimiento), se realiza colocando el dispositivo de ensayo según la presente invención en un recipiente en el fondo del cual se encuentra la muestra a analizar. El dispositivo de ensayo se coloca esencialmente verticalmente en el recipiente, de tal manera que el primer extremo del dispositivo esté en contacto con la mezcla.
En la variante de la invención que utiliza un dispositivo de ensayo colocado en una caja plástica, éste está dispuesto horizontalmente y la puesta en contacto se efectúa depositando una alícuota de muestra que se debe analizar en la apertura en forma de cubeta colocada por encima de la membrana (2).
Para la etapa de emigración b), se deja emigrar el líquido por capilaridad sobre el dispositivo de ensayo según la invención. El líquido que emigra por capilaridad sobre el dispositivo de ensayo según la invención encuentra en primer lugar la membrana (2) que permite retener las sustancias presentes en el producto lácteo que impiden la emigración de los analitos eventualmente presentes en el producto lácteo y reactivos de detección sobre el dispositivo de ensayo. Los analitos y los reactivos de detección emigran a continuación sobre la membrana (3) sobre la cual se inmovilizaron una o varias sustancias de captura. Las sustancias de captura inmovilizan selectivamente al menos uno de los constituyentes presentes en el líquido analizado. Según un procedimiento de realización particular de la invención, se utiliza una sustancia de captura colocada al final del curso de emigración del líquido sobre la membrana (3) que es capaz de fijar todos los Marcadores que no fueron detenidos por las sustancias de captura anteriores. Esta sustancia de captura permite completar las informaciones cuantitativas proporcionadas por las sustancias de captura anteriores.
La determinación de una fijación sobre la membrana (3) (etapa c) del procedimiento) se efectúa simplemente determinando la presencia de Marcadores en esta zona. Esta determinación es posible simplemente visualmente. No obstante, si se desea tener una medida precisa de la intensidad de las señales observadas, se puede recurrir a un aparato capaz de medir la intensidad de la señal observada, cuando se utiliza una Referencia, se fija con una sustancia de captura específica que proporciona una referencia interna para la medida de la intensidad de las señales observadas.
La interpretación del resultado obtenido depende del método de detección practicado, a saber, de los reactivos de detección y sustancias de captura utilizadas.
Con respecto a los procedimientos de detección de analitos en la leche anteriormente descritos en la literatura, el procedimiento según la presente invención presenta las ventajas siguientes. En primer lugar, este procedimiento es muy rápido y extremadamente simple de emplear: incluye esencialmente dos etapas de manipulación fácil, no requiriendo conocimientos técnicos experimentales en particular. A continuación, la valoración cualitativa y cuantitativa del resultado es inmediata y no requiere operaciones suplementarias particulares, tales como las requeridas cuando la detección se efectúa por colorantes y/o marcadores enzimáticos. Además este procedimiento es directamente aplicable para la detección de diferentes tipos de analitos. Por último, en el modo de realización que utiliza una Referencia, el resultado es directamente interpretable y cuantificable, sin que sea necesario tener que recurrir a uno o varios ensayos de referencia. Igualmente, la presente invención se refiere también a un procedimiento tal como se define en las reivindicaciones 14,15 y 19.
Igualmente, la presente invención se refiere a un kit de reactivos de ensayo para la detección de analitos en un producto lácteo que comprende un dispositivo de ensayo según la presente invención. Cuando procede, el kit de reactivos de ensayo según la presente invención puede igualmente contener los reactivos de detección que se deben añadir a la muestra antes de la puesta en contacto del producto lácteo con el dispositivo de ensayo.
Los ejemplos que siguen ilustran diferentes aspectos y modos de realización de la presente invención sin que por ello se limite su alcance.
Ejemplo 1 Fabricación de los dispositivos de ensayo. Modos operativos generales 1.1. Ensamblado de tarjetas membranales
Se ensamblan en primer lugar tarjetas que tienen un tamaño de 300 x 76,2 mm por medio de un laminador de tipo Chlamshell Laminator (disponible en Bio Dot, Inc.) según el siguiente método:
Se recorta un rectángulo de soporte plástico de tipo ArCare 8565 (disponible en Adhesive Research) de dimensión 300 x 76,2 mm (soporte sólido (1)). Se recorta a continuación un rectángulo de membrana tipo Leukosorb® LK4 (disponible en Pall Gelman Sciences) de dimensión 300 x 20 mm (membrana (2)), un rectángulo de membrana Hi-Flow SX (disponible en Millipore) de dimensión 300 x 25 mm (membrana (3)), un rectángulo de membrana de celulosa 3 mm (disponible en Whatmann) de dimensión 300 x 40 mm (membrana (4)) y un rectángulo de membrana Accuwick (disponible en Pall Gelman Sciences) de dimensión 300 x 0,8 mm (membrana (5)).
Se colocan sucesivamente las membranas (2) y (4), luego (5), luego (3) en un sitio específico del molde inferior del laminador. El soporte sólido (1) recubierto de adhesivo se mantiene por el mismo en la cubierta del aparato, estando el lado adhesivo expuesto al aire. Las membranas colocadas en el molde inferior se ponen en contacto con el soporte adhesivo volviendo a cerrar al laminador; las membranas se mantienen exactamente en su sitio por medio de una succión de aire realizada por una bomba de vacío. Cuando el vacío se rompe, se recupera una tarjeta constituida del soporte sólido (1) sobre el cual se fijan las membranas (2), (3), (4) y (5).
1.2. Deposición de las sustancias de captura sobre la membrana (3)
La deposición de las sustancias de captura sobre la membrana (3) se efectúa antes o después del ensamblado según el ejemplo 1.1.
Se prepara una solución acuosa que contiene la sustancia de captura. Se deposita sobre la membrana (3) de la tarjeta membranal preparada en el ejemplo 1.1. por medio de un "Dispenser" de tipo X-Y Platform Biojet Quanti-3000 de Bio Dot, Inc.
Las soluciones depositadas se evaporan inmediatamente colocando el conjunto de la tarjeta durante unos minutos bajo un aire impulsado caliente a 60ºC.
1.3. Deposición de la sustancia de marcado sobre la membrana (5) a) Antes del ensamblado según el ejemplo 1.1
Se prepara una solución acuosa que contiene la sustancia de marcado. La membrana (5) se sumerge en esta solución. A continuación se escurre, luego se seca durante una noche a temperatura ambiente bajo un vacío de 0,5 bar.
b) Después del ensamblado según el ejemplo 1.1
Se procede según el modo operativo descrito en el ejemplo 1.2. para la deposición de las sustancias de captura.
1.4. Deposición de la película plástica adhesiva (6)
Se recorta un rectángulo de película adhesiva del tipo ArCare 7759 (disponibles en Adhesive Researchl de dimensión 300 x 20 mm para una recubrimiento parcial, y 300 x 71,2 mm para una recubrimiento de todas las membranas.
La tarjeta obtenida según el ejemplo 1.1. se coloca en el molde inferior de un laminador y se coloca la película adhesiva en la tapa del laminador, estando el lado adhesivo expuesto al aire. La película plástica adhesiva se pone en contacto con la tarjeta membranal durante el cierre del aparato.
1.5. Recorte en láminas
Las tarjetas obtenidas después de ensamblado se recortan en láminas con la ayuda de un aparato de tipo guillotina o con ayuda de un aparato rotativo (disponible en Bio Dote, Kinematic o Akzo). Las láminas de los extremos se separan, estando las otras láminas listas para su empleo.
Para su conservación, los dispositivos de ensayo se colocan en un recipiente opaco y hermético en presencia de un agente desecante (Silgelac, Francia).
1.6. Presentación en un cárter plástico
Se coloca el dispositivo de ensayo en una caja plástica que presenta dos aperturas: la primera, en forma de cubeta, se coloca exactamente por encima de la membrana (2), y permite recibir el líquido que se debe analizar; el segundo es una ventana de apertura que permite visualizar el resultado sobre la membrana (3).
Ejemplo 2 Detección de antibióticos de núcleos \beta-lactama en la leche por medio de la enzima R39 2.1. Identificador
El identificador utilizado en este ejemplo es la Dalanil-D-alanina-carboxipeptidasa exocelular soluble producida por Actinomadura R39 obtenida según el modo operativo descrito en J. -M. FRERE et al, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18 (4), 506-510 (1980).
2.2. Acoplamiento del Identificador al Marcador 2.2.1. Biotinilación del Identificador
Se dializan 250 \mul de una solución acuosa de enzima R39 a 1 mg/ml durante 24 horas contra 500 ml de tampón HNM (Hepes 10 mM, pH 8, NaCl 10 mM, MgCl_{2} 5 mM). Se añade entonces a esta solución enzima R39 dializada, 2 ml de tampón bicarbonato (0,1 M en bicarbonato de sodio, pH 9) y 250 \mul de una solución de éster 6-(biotinamido)caproico de N-hidroxi-succinimida a 5 mg/ml en DMF anhidro. Esta solución se agita suavemente con agitador para tubos sobre eje rotativo de tipo LABINCO (disponible en VEL, Bélgica) a una velocidad de 2 rpm durante 3 horas a temperatura ambiente y al abrigo de la luz. La solución así obtenida se dializa contra el tampón HNM (Hepes 100 mM; pH 8, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 50 mM) durante 24 horas. De esta manera, se obtiene una solución de enzima R39 biotinilada que se diluye en el tampón HNM-BSA (Hepes 500 mM; pH 8, NaCl 500 mM, MgCl_{2} 250 mM, BSA 10 mg/ml) hasta una concentración de 100 \mug de enzima R39 por ml de tampón.
Esta solución se almacena a -20ºC.
2.2.2. Marcador
Como Marcador, se utilizan partículas de oro que tienen un diámetro de 40 nm, sobre las cuales se depositó un anticuerpo de cabra antibiotina en forma de suspensiones en una solución acuosa de tetraborato de sodio a 2 mM a pH 7,2 estabilizada por el nitruro de sodio a 0,1% (disponible en BRITISH BIOCELL (Ref. GAB40). La densidad óptica de estas suspensiones a 520 nm es aproximadamente 10 y la concentración en proteína es aproximadamente 24 \mug/ml.
2.2.3. Acoplamiento del Identificador biotinilado al Marcador Solución A para ensayo rápido
Se diluye la solución de enzima R39 biotinilada preparada en el ejemplo 2.2.1. 25 veces por el tampón HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCl 500 mM, MgCl_{2} 250 mM, BSA 10 mg/ml). Se mezclan a temperatura ambiente 17,5 partes en volumen de esta solución diluida de enzima biotinilada R39, 9,27 partes en volumen de suspensión de partículas de oro que sirven para marcar la enzima R39 y 6 partes en volumen de suspensión de partículas de oro de referencia (véase ejemplo 2.3).
Solución B para ensayo sensible
Se diluye la solución de enzima R39 biotinilada preparada en el ejemplo 2.2.1. 50 veces por el tampón HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCl 500 mM, MgCl_{2} 250 mM, BSA 10 mg/ml). Se mezclan a temperatura ambiente 17,5 partes en volumen de esta solución diluida de enzima R39 biotinilada, 9,27 partes en volumen de suspensión de partículas de oro que sirven para marcar la enzima R39 y 6 partes en volumen de suspensión de partículas de oro de referencia (véase ejemplo 2.3).
2.3. Referencia
Como Referencia, se utilizan partículas de oro de 40 nm sobre las cuales se depositó un anticuerpo de cabra antiinmunoglobulina de conejo. Estas partículas están disponibles en BRITISH BIOCELL (Ref. GAR40), en forma de suspensiones en una solución acuosa de tetraborato de sodio a 2 mM a pH 7,2, estabilizada por el nitruro de sodio a 0,1%. La densidad óptica de estas suspensiones a 520 nm es de aproximadamente 3 y la concentración en proteína es de aproximadamente 6 \mug/ml.
2.4. Sustancias de captura 2.4.1. Primera sustancia de captura
Se incuban 8 ml de una solución que contiene 213 mg de Gamma Globulina Humana (G4386, Sigma) y 8,6 mg de clorhidrato de 2-Iminotiolano (Aldrich, 33056-6) en tampón carbonato de sodio (100 mM; pH 9) durante una hora a 25ºC.
Por otra parte, se incuban 20 ml de una solución que contiene 119,8 mg de cefalosporina-C y 54 mg de sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxi (sSMCC, 22322 Pierce) en tampón carbonato de sodio (100 mM, pH 9) durante una hora a 25ºC.
A continuación, se mezclan las dos soluciones preparadas anteriormente. Se ajusta el pH de la solución resultante a 7,1 por adición de 3 ml NaH_{2}PO_{4} 500 mM y se incuba durante dos horas a 25ºC. La mezcla obtenida después de incubación se dializa tres veces contra 1 litro de tampón fosfato de sodio (10 mM, pH 7,5). La solución resultante se filtra sobre un filtro a 0,22 \mum, luego se alícuota y se congela a -20ºC hasta su utilización.
Durante la utilización, las alícuotas se descongelan, y se añade un colorante alimentario antes de efectuar la deposición sobre la membrana con el fin de apreciar en cualquier momento la posición exacta de la deposición y la calidad de la traza.
La primera sustancia de captura permite fijar los Identificadores acoplados a los Marcadores libres excedentarios con respecto a la cantidad de antibiótico presente en la muestra.
2.4.2. Segunda sustancia de captura
Para la segunda sustancia de captura, se utiliza una solución de inmunoglobulina de conejo (Sigma I 5006) a una concentración de 0,5 mg/ml en inmunoglobulina en el tampón fosfato de sodio 10 mM, pH 7,5, gamma globulina humana 5 mg/ml. Esta segunda sustancia de captura detiene la Referencia durante la emigración del líquido sobre el dispositivo de ensayo.
2.5. Dispositivo de ensayo
Se utilizan dispositivos de ensayo que contienen las membranas (2), (3) y (4), ensamblados según el modo operativo descrito en el ejemplo 1.1. La membrana (3) de estos dispositivos se lleva del lado proximal la sustancia de captura descrita en el ejemplo 2.4.1. y del lado distal la sustancia de captura descrita en el ejemplo 2.4.2. Las sustancias de captura se depositaron según el procedimiento descrito en el ejemplo 1.2.
2.5.1. Ensayo 1 - Ensayo rápido
Se preparan siete muestras de leche que contienen respectivamente 0; 2; 4; 5; 6; 8 y 10 ppb de penicilina G. Cada una de estas soluciones se analiza entonces de la siguiente manera.
Se toma una alícuota de 200 \mul de muestra de leche y 32,8 \mul de solución A preparada en el ejemplo 2.2.3. que se coloca en un tubo Eppendorf. Esta mezcla se incuba durante 3 minutos a 47ºC. Se coloca a continuación un dispositivo de ensayo verticalmente en el tubo Eppendorf de tal manera que el primer extremo del dispositivo de ensayo esté en contacto con la mezcla. Se deja emigrar la mezcla sobre el dispositivo de ensayo incubando al mismo tiempo el conjunto durante 2 minutos a 47ºC.
La tabla 1 presentada más abajo recoge los resultados obtenidos para las 7 muestras que permanecen. Se atribuye un valor de intensidad que va de 0 a 10 a las bandas detectadas, siendo el valor 10 dado para la banda más intensa y siendo el valor 0 dado para la banda menos intensa. Según esta escala, se atribuye un valor 6 a la banda de referencia. La intensidad de la señal observada en la primera banda de detección es inversamente proporcional a la cantidad de penicilina G presente en la muestra.
TABLA 1
Penicilina G Intensidad
(ppb) 1ª banda 2ª banda
0 10 6
2 8 6
4 5 6
5 3 6
6 2 6
8 1 6
10 0 6
En este ejemplo, cuando la primera banda tiene una intensidad inferior a la de la banda de referencia, el ensayo se da por positivo. Los resultados presentados en la tabla 1 muestran que este ensayo permite detectar en 5 minutos hasta 4 ppb de penicilina G en una muestra de leche.
2.5.2. Ensayo 2 - Ensayo sensible
Se preparan seis muestras de leche que contienen respectivamente 0; 2; 2,5; 3; 4 y 5 ppb de penicilina G. Cada una de estas soluciones se analiza entonces de la siguiente manera.
Se toma una alícuota de 200 \mul de muestra de leche y 32,8 \mul de solución B preparada en el ejemplo 2.2.3. que se coloca en un tubo Eppendorf. Esta mezcla se incuba durante 5 minutos a 47ºC. Se coloca a continuación un dispositivo de ensayo verticalmente en el tubo Eppendorf de tal manera que el primer extremo del dispositivo de ensayo esté en contacto con la mezcla. Se deja emigrar la mezcla sobre el dispositivo de ensayo incubando al mismo tiempo el conjunto durante 2 minutos a 47ºC.
La tabla 2 presentada más abajo recoge los resultados obtenidos para las 7 muestras ensayadas. Se atribuye un valor de intensidad que va de 0 a 10 a las bandas detectadas, siendo el valor 10 dado para la banda más intensa y siendo el valor 0 dado para la banda menos intensa. Según esta escala, se atribuye un valor 6 a la banda de referencia. La intensidad de la señal observada en la primera banda de detección es inversamente proporcional a la cantidad de penicilina G presente en la muestra.
TABLA 2
Penicilina G Intensidad
(ppb) 1ª banda 2ª banda
0 10 6
2 7 6
2,5 5 6
3 4 6
4 1 6
5 0 6
En este ejemplo, cuando la primera banda tiene una intensidad inferior a la de la banda de referencia, el ensayo se da por positivo. Los resultados presentados en la tabla 2 muestran que este ensayo permite detectar en 7 minutos hasta 2,5 ppb de penicilina G en una muestra de leche.
Ejemplo 3 Determinación de antibióticos de núcleo \beta-lactama en la leche por medio de BlaR
Este ejemplo ilustra la detección en la leche de antibióticos de núcleo \beta-lactama controlados por las autoridades sanitarias. El ensayo descrito en este ejemplo utiliza al receptor BlaR-CTD acoplado a bolas de oro que sirven de agentes de marcado y utiliza un soporte que se presenta bajo la forma de un dispositivo de ensayo que comprende un soporte sólido en el cual se fijan las membranas.
3.1. Acoplamiento de BlaR-CTD (Identificador) a las bolas de oro (Marcador) 3.1.1. Biotinilación de BlaR-CTD
Se recogen 3,79 ml de una solución de agente de reconocimiento BlaR-CTD a 6,6 mg/ml en tampón Fosfato de sodio 20 mM pH 7. Se añaden entonces a esta solución de BlaR-CTD 41,71 ml de tampón bicarbonato (0,1 M en bicarbonato de sodio pH 9) y 2 ml de una solución de éster 6-(biotinamido)caproico de N-hidroxi-succinimida a 2,23 mg/ml igualmente en tampón bicarbonato. Esta solución se agita suavemente con agitador para tubos sobre eje rotativo de tipo LABINCO (disponible en VEL, Bélgica) a una velocidad de 2 rpm durante 2 horas a temperatura ambiente y al abrigo de la luz. Se incuban 2,5 ml de una solución de tampón Tris 1 M pH 8 con la mezcla de la reacción en las mismas condiciones durante 30 minutos. La solución así obtenida se dializa contra el tampón HNM (Hepes 100 mM. pH 8, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 50 mM) durante 24 horas. De esta manera, se obtiene una solución de BlaR-CTD biotinilado que se diluye en el tampón HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCl 500 mM, MgCl_{2} 250 mM, BSA
10 mg/ml) hasta una concentración de 250 \mug de BlaR-CTD biotinilado por ml de tampón. Esta solución se almacena a -20ºC.
3.1.2. Agente de marcado
Como agente de marcado, se utiliza partículas de oro que tienen un diámetro de 40 nm, sobre las cuales se depositó un anticuerpo de cabra antibiotina en forma de suspensiones en una solución acuosa de tetraborato de sodio a 2 mM a pH 7,2, estabilizada por el nitruro de sodio al 0,1% (disponible en BRITISH BIOCELL (Ref. GAB40). La densidad óptica de estas suspensiones a 520 nm es de aproximadamente 10 y la concentración en proteína es de aproximadamente 24 \mug/ml.
3.1.3. Acoplamiento de BlaR-CTD biotinilado a las bolas de oro
La solución de BlaR-CTD biotinilado preparada en el ejemplo 3.1.1 se diluye 114,7 veces por el tampón HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCl 500 mM, MgCl_{2} 250 mM, BSA 10 mg/ml). Se mezclan a temperatura ambiente 22,5 partes en volumen de esta solución diluida de BlaR-CTD biotinilado, 7,5 partes en volumen de tampón HNM-BSA, 9,27 partes en volumen de suspensión de partículas de oro que sirven para marcar al BlaR-CTD biotinilado y 6 partes en volumen de suspensión de partículas de oro de referencia (véase ejemplo 3.1.4 siguiente).
3.1.4. Referencia independiente
En este ensayo, se utiliza igualmente una sustancia de referencia que proporcionauna banda cuya intensidad permite cuantificar rápidamente la cantidad de antibiótico presente en la muestra.
Para ello, se utilizan partículas de oro de 40 nm sobre las cuales se depositó un anticuerpo de cabra antiinmunoglobulina de conejo. Estas partículas están disponibles en BRITISH BIOCELL (Ref. GAR40), en forma de suspensiones en una solución acuosa de tetraborato de sodio a 2 mM a pH 7,2, estabilizada por el nitruro de sodio a 0,1%. La densidad óptica de estas suspensiones a 520 nm es de aproximadamente 3 y la concentración en proteína es de aproximadamente 6 \mug/ml.
3.2. Sustancias de captura 3.2.1. Primera sustancia de captura - Antibiótico de referencia
Se incuban 8 ml de una solución que contiene 213 mg de Gamma Globulina Humana (G4386, Sigma) y 8,6 mg de hidrocloruro de 2-Iminotiolano (Aldrich, 33056-6) en el tampón carbonato de sodio (100 mM, pH 9) durante una hora a 25ºC.
Por otra parte, se incuban 20 ml de una solución que contiene 119,8 mg de cefalosporina-C y 54 mg de sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (sSMCC, 22322 Pierce) en el tampón carbonato de sodio (100 mM, pH 9) durante una hora a 25ºC.
A continuación, se mezclan las dos soluciones preparadas anteriormente. Se ajusta el pH de la solución resultante a 7,1 por adición de 3 ml NaH_{2}PO_{4} 500 mM y se incuba durante dos horas a 25ºC. La mezcla obtenida después de la incubación se dializa tres veces contra 1 litro de tampón fosfato de sodio (10 mM, pH 7,5). La solución resultante se filtra sobre un filtro a 0,22 \mum, luego se alícuota y hasta su utilización se congela a -20ºC.
Durante la utilización, las alícuotas se descongelan, y se añade un colorante alimentario antes de efectuar la deposición sobre la membrana con el fin de apreciar en cualquier momento la posición exacta de la deposición y la calidad de la traza.
La primera sustancia de captura permite fijar BlaR-CTD acoplado a las bolas de oro presentes en excedente con respecto a la cantidad de antibiótico presente en la muestra.
3.2.2. Segunda sustancia de captura - Sustancia capaz de fijar la referencia independiente
Para la segunda sustancia de captura, se utiliza una solución de inmunoglobulina de conejo (Sigma I 5006) a una concentración de 0,5 mg/ml en inmunoglobulina en el tampón fosfato de sodio 10 mM, pH 7,5, gamma globulina humana 5 mg/ml. Esta segunda sustancia de captura detiene la referencia independiente en la emigración del líquido sobre el dispositivo de ensayo.
3.3 Dispositivo de ensayo
Se utilizan dispositivos de ensayo que contienen las membranas (2), (3) y (4), ensamblados según el modo operativo descrito en el ejemplo 1.1. La membrana (3) de estos dispositivos se lleva del lado proximal la sustancia de captura descrita en el ejemplo 3.2.1. y del lado distal la sustancia de captura descrita en el ejemplo 3.2.2. Las sustancias de captura se depositaron según el procedimiento descrito en el ejemplo 1 2.
3.4. Determinación de los antibióticos en la leche 3.4.1. Ensayo en 3 minutos - Ensayo rápido
Se preparan 7 muestras de leche fresca que contienen respectivamente 0; 1; 2; 3; 4; 5 y 6 ppb de penicilina G. Entonces, se analizan cada una de estas soluciones de la siguiente manera.
Se toma una alícuota de 200 \mul de muestra de leche y 45,27 \mul de solución preparada en el ejemplo 3.1.3 que se coloca en un frasco de vidrio. Esta mezcla se incuba durante 1 minuto a 47ºC. Se toma un dispositivo de ensayo que se coloca verticalmente en el frasco de vidrio de tal manera que el primer extremo del dispositivo de ensayo esté en contacto con la mezcla y de tal manera que el segundo extremo reposa en la pared del frasco de vidrio. Se deja emigrar la mezcla sobre el dispositivo de ensayo incubando al mismo tiempo el conjunto durante 2 minutos a 47ºC.
La tabla 1 presentada más abajo recoge los resultados obtenidos para las 7 muestras ensayadas. Se atribuye un valor de intensidad que va de 0 a 10 a las bandas detectadas, siendo el valor 10 dado para la banda más intensa y siendo el valor 0 dado para la banda menos intensa. Según esta escala, se atribuye un valor de 6 a la banda de referencia. La intensidad de la señal observada en la primera banda es inversamente proporcional a la cantidad de Penicilina G presente en la muestra.
TABLA 1
Penicilina G Intensidad
(ppb) 1ª banda 2ª banda
0 10 6
1 9 6
2 9 6
3 4 6
4 0 6
5 0 6
6 0 6
En este ejemplo, cuando la primera banda tiene una intensidad inferior a la de la segunda banda, el ensayo se da por positivo. Los resultados presentados en la tabla 1 muestran que este ensayo permite detectar en 3 minutos menos de 4 ppb de penicilina G en una muestra de leche.
Se realizaron igualmente algunos ensayos con otros antibióticos de núcleo \beta-lactama en las mismas condiciones. Este ensayo realizado en 3 minutos permite detectar la amoxicilina hasta 5 ppb, la ampicilina hasta 5 ppb, la cloxacilina a menos de 10 ppb, la dicloxacilina a menos de 20 ppb, la oxacilina a menos de 20 ppb y la cefapirina hasta 20 ppb en una muestra de leche.
1.3.2. Ensayo en 5 minutos
Se preparan 6 muestras de leche fresca que contienen respectivamente 0; 2; 4; 6; 8 y 10 ppb de cloxacilina. Entonces, se analiza cada una de estas soluciones de la siguiente manera.
Se toma una alícuota de 200 \mul de muestra de leche y 45,27 \mul de solución preparada en el ejemplo 3.1.3 que se coloca en un frasco de vidrio. Esta mezcla se incuba durante 3 minutos a 47ºC. Se toma un dispositivo de ensayo que se coloca verticalmente en el frasco de vidrio de tal manera que el primer extremo del dispositivo de ensayo esté en contacto con la mezcla y de tal manera que el segundo extremo reposa en la pared del frasco de vidrio. Se deja emigrar la mezcla sobre el dispositivo de ensayo incubando al mismo tiempo el conjunto durante 2 minutos a 47ºC.
La tabla 2 presentada más abajo recoge los resultados obtenidos para las 6 muestras ensayadas. Un valor de intensidad que va de 0 a 10 se atribuye a las bandas detectadas, siendo el valor 10 dado para la banda más intensa y siendo el valor 0 dado para la banda menos intensa. Según esta escala, se atribuye un valor de 6 a la banda de referencia. La intensidad de la señal observada en la primera banda es inversamente proporcional a la cantidad de Cloxacilina presente en la muestra.
TABLA 2
Cloxacilina Intensidad
(ppb) 1ª banda 2ª banda
0 10 6
2 6 6
4 5 6
6 3 6
8 3 6
10 3 6
En este ejemplo, cuando la primera banda tiene una intensidad inferior a la de la segunda banda, el ensayo se da por positivo. Los resultados presentados en la tabla 2 muestran que este ensayo permite detectar en 5 minutos hasta 4 ppb de cloxacilina en una muestra de leche.
Se realizaron igualmente algunos ensayos con otros antibióticos de núcleo \beta-lactama en las mismas condiciones. Este ensayo realizado en 5 minutos permite detectar la penicilina G hasta 3 ppb, la amoxicilina hasta 4 ppb, la ampicili-
na hasta 4 ppb, la dicloxacilina hasta 8 ppb, la oxacilina hasta 8 ppb, la cefapirina hasta 16 ppb, el ceftiofur hasta 100 ppb, la cefquinona a menos de 20 ppb, la nafcilina hasta 20 ppb y la cefazolina hasta 60 ppb en una muestra de leche.
Este ensayo conviene bien particularmente como ensayo de selección antes del trasiego de los camiones de leche en los silos.
1.3.3. Ensayo en 9 minutos
Se preparan 6 muestras de leche fresca que contiene respectivamente 0; 4; 6; 8; 10 y 12 ppb de cefapirina. Entonces, se analiza cada una de estas soluciones de la siguiente manera.
Se toma una alícuota de 200 \mul de muestra de leche y 45,27 \mul de solución preparada en el ejemplo 3.1.3 que se coloca en un frasco de vidrio. Esta mezcla se incuba durante 7 minutos a 47ºC. Se toma un dispositivo de ensayo que se coloca verticalmente en el frasco de vidrio de tal manera que el primer extremo del dispositivo de ensayo esté en contacto con la mezcla y de tal manera que el segundo extremo reposa en la pared del frasco de vidrio. Se deja emigrar la mezcla sobre el dispositivo de ensayo incubando al mismo tiempo el conjunto durante 2 minutos a 47ºC.
La tabla 3 presentada más abajo recoge los resultados obtenidos para las 6 muestras ensayadas. Se atribuye un valor de intensidad que va de 0 a 10 a las bandas detectadas, siendo el valor 10 dado para la banda más intensa y siendo el valor 0 dado para la banda menos intensa. Según esta escala, se atribuye un valor de 6 a la banda de referencia. La intensidad de la señal observada en la primera banda es inversamente proporcional a la cantidad de Cefapirina presente en la muestra.
TABLA 3
Cefaparina Intensidad
(ppb) 1ª banda 2ª banda
0 10 6
4 6 6
6 5 6
8 4 6
10 3 6
12 3 6
En este ejemplo, cuando la primera banda tiene una intensidad inferior a la de la segunda banda, el ensayo se da por positivo. Los resultados presentados en la tabla 3 muestran que este ensayo permite detectar en 9 minutos hasta 6 ppb de cefapirina en una muestra de leche.
Igualmente, se realizaron ensayos con otros antibióticos de núcleo \beta-lactama en las mismas condiciones. Este ensayo realizado en 9 minutos permite detectar la penicilina G hasta 3 ppb, la amoxicilina hasta 4 ppb, la ampicilina hasta 4 ppb, la cloxacilina hasta 4 ppb, la dicloxacilina a menos de 8 ppb, la oxacilina a menos de 8 ppb, el ceftiofur hasta 80 ppb, la cefquinona a menos de 20 ppb, la nafcilina a menos de 20 ppb y la cefazolina hasta 45 ppb en una muestra de leche.
Este ensayo realizado en 9 minutos permite, por lo tanto, detectar todos los antibióticos controlados actualmente por las autoridades europeas, y esto, hasta los límites legales impuestos por estas autoridades.
1.3.4. Ensayo en 20 minutos
Se preparan 6 muestras de leche fresca que contienen respectivamente 0; 20; 30; 40; 50 y 60 ppb de ceftiofur. Se analiza entonces cada una de estas soluciones de la siguiente manera.
Se toma una alícuota de 200 \mul de muestra de leche y 45,27 \mul de solución preparada en el ejemplo 3.1.3 que se coloca en un frasco de vidrio. Esta mezcla se incuba durante 18 minutos a 47ºC. Se toma un dispositivo de ensayo que se coloca verticalmente en el frasco de vidrio de tal manera que el primer extremo del dispositivo de ensayo esté en contacto con la mezcla y de tal manera que el segundo extremo reposa en la pared del frasco de vidrio. Se deja emigrar la mezcla sobre el dispositivo de ensayo incubando al mismo tiempo el conjunto durante 2 minutos a 47ºC.
La tabla 4 presentada más abajo recoge los resultados obtenidos para las 6 muestras ensayadas. Se atribuye un valor de intensidad que va de 0 a 10 a las bandas detectadas, siendo el valor 10 dado para la banda más intensa y siendo el valor 0 dado para la banda menos intensa. Según esta escala, se atribuye un valor de 6 a la banda de referencia. La intensidad de la señal observada en la primera banda es inversamente proporcional a la cantidad de Ceftiofur presente en la muestra.
TABLA 4
Ceftiofur Intensidad
(ppb) 1ª banda 2ª banda
0 10 6
20 6 6
30 5 6
40 4 6
50 3 6
60 3 6
En este ejemplo, cuando la primera banda tiene una intensidad inferior a la de la segunda banda, el ensayo se da por positivo. Los resultados presentados en la tabla 4 muestran que este ensayo permite detectar en 20 minutos hasta 30 ppb de ceftiofur en una muestra de leche.
Por lo tanto, este ensayo permite detectar en 20 minutos en un único ensayo todos los antibióticos controlados actualmente por las autoridades europeas y americanas, y esto, hasta los límites legales impuestos por estas autoridades.
Ejemplo 4 Utilización de un dispositivo de ensayo en un cárter plástico
Se utiliza un dispositivo de ensayo tal como describe en el ejemplo 1.6. En este caso, la puesta en contacto de la muestra con el dispositivo de ensayo se efectúa depositando la mezcla incubada en la apertura en forma de cubeta prevista para tal efecto.

Claims (25)

1. Dispositivo de ensayo que permite detectar la presencia de analitos en un producto lácteo líquido por emigración capilar tangencial de dicho producto lácteo, que comprende un soporte sólido (1) que posee un primer y un segundo extremo, en el cual se fijan, sucesivamente, partiendo desde el primer extremo,
-
una membrana (2) que permite la purificación del líquido analizado,
-
una membrana (3) sobre la cual se inmovilizan una o varias sustancias de captura, y
-
una membrana (4) absorbente,
caracterizado porque la membrana (2) es una membrana tipo Leukosorb® fabricada a partir de fibras de poliéster no tejidas y es capaz de retener las sustancias presentes en el producto lácteo, que impiden la emigración sobre el dispositivo de ensayo de los analitos eventualmente presentes en el producto lácteo y reactivos de detección utilizados según el método practicado, y esto, durante la emigración capilar tangencial de la muestra después de la humectación del primer extremo del dispositivo de ensayo en el producto lácteo analizado.
2. Dispositivo de ensayo según la reivindicación 1, caracterizado porque la membrana (3) es una membrana de nitrocelulosa de elevada velocidad capilar.
3. Dispositivo de ensayo según las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque posee, por otro lado, una membrana (5) sobre la cual al menos se depositó un reactivo de detección, estando la membrana (5) situada antes de la membrana (3).
4. Dispositivo de ensayo según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las membranas están recubiertas completa o parcialmente por una película plástica adhesiva (6).
5. Dispositivo de ensayo según la reivindicación 4, caracterizado porque la película plástica (6) no recubre los primeros milímetros del dispositivo de ensayo.
6. Dispositivo de ensayo según las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se coloca en una caja plástica que pre senta una apertura en forma de cubeta por encima de la membrana (2) y una ventana de apertura sobre la membrana (3).
7. Procedimiento para la detección de analitos en un producto lácteo líquido, que utiliza un dispositivo de ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 así como los reactivos de detección, que comprende las siguientes etapas:
a)
la puesta en contacto de un volumen determinado de producto lácteo con el dispositivo de ensayo, teniendo esta puesta en contacto lugar en el primer extremo del dispositivo de ensayo,
b)
la emigración tangencial por capilaridad del producto lácteo sobre el dispositivo de ensayo de tal manera que los analitos y los reactivos de detección eventualmente presentes en el producto lácteo pasan progresivamente sobre la membrana (2), luego sobre la membrana (3), y de tal manera que los constituyentes del producto lácteo que no se detienen por las membranas (2) y (3) lo consiguen en la membrana (4),y
c)
la determinación de una fijación sobre la membrana (3).
8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque los reactivos de detección comprenden al menos una sustancia capaz de reconocer específicamente el analito o una sustancia análoga de este analito y al menos un agente de marcado.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque se acopla al menos una sustancia capaz de reconocer específicamente el analito o una sustancia análoga de este analito a al menos un agente de marcado.
10. Procedimiento según las reivindicaciones 8 ó 9, caracterizado porque el agente de marcado es fluorescente, de partículas, radioactivo, luminiscente o enzimático.
11. Procedimiento según las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque se añade al menos un reactivo de detección antes de la etapa a).
12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque la mezcla preparada antes de la etapa a) se mantiene en condiciones de incubación que permiten a uno de los reactivos de detección formar un complejo estable y esencialmente irreversible con el analito o una sustancia análoga de este analito.
13. Procedimiento según las reivindicaciones 8 a 12, caracterizado porque los reactivos de detección comprenden por otro lado al menos una sustancia de referencia.
14. Procedimiento según las reivindicaciones 7 a 13, caracterizado porque el analito es una tetraciclina, oxitetraciclina o clortetraciclina.
15. Procedimiento según las reivindicaciones 7 a 13, caracterizado porque el analito es, por una parte una proteína exógena del producto lácteo líquido, o, por otra parte, una proteína endógena del producto lácteo.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque el analito es una hormona.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque el analito es la progesterona o la hormona de crecimiento.
18. Procedimiento según las reivindicaciones 7 a 13, caracterizado porque el analito es un antibiótico con núcleo \beta-lactama.
19. Procedimiento según las reivindicaciones 7 a 13, caracterizado porque el analito se elige entre el grupo constituido por benzilpenicilina ampicilina, amoxicilina, carbenicilina, metilcilina, cloxacilina, 6-APA, monolactama, axtreonama, mecilina, cefalexina, cefaloglicina, cefaloridina nitrocefina, cefatoxima, cefuromixa, ceftiofur, cefapirina, y 7-ACA.
20. Procedimiento según las reivindicaciones 7 ó 17, caracterizado porque la sustancia capaz de reconocer específicamente del analito o una sustancia análoga del analito se elige entre los receptores capaces de formar un complejo estable y esencialmente irreversible con el analito o una sustancia análoga del analito y los anticuerpos monoclonales o policlonales específicos del analito o de una sustancia análoga del analito.
21. Procedimiento según la reivindicación 20, caracterizado porque la sustancia capaz de reconocer específicamente el analito o una sustancia análoga del analito es un receptor obtenido a partir de un microorganismo sensible a los antibióticos.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, caracterizado porque la sustancia capaz de reconocer específicamente el analito o una sustancia análoga al analito es un receptor obtenido a partir de las especies Bacillus, Streptccoccus o Actinomicetos.
23. Procedimiento según las reivindicaciones 20, 21 ó 22, caracterizado porque la sustancia capaz de reconocer específicamente el analito o una sustancia análoga al analito es un receptor sensible a los antibióticos de núcleo \beta-lactama obtenido a partir de Bacillus licheniformis.
24. Procedimiento según la reivindicación 23, caracterizado porque el receptor sensible a los antibióticos de núcleo \beta-lactama obtenido a partir de Bacillus licheniformis es el receptor BlaR o el receptor BlaR-CTD.
25. Kit de reactivos de ensayo que comprende un dispositivo de ensayo según las reivindicaciones 1 a 6.
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