MXPA00003325A - Dispositivo de ensayo para la determinacion de analitos en un producto lacteo liquido - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un dispositivo de ensayo para la determinación de analitos en un producto lácteo liquido por medio de migración capilar del producto lácteo, que comprende un soporte sólido (1) que posee una primera y una segunda extremidad, sobre el cual están fijadas, sucesivamente, partiendo de la primera extremidad:una primera membrana (2) para purificar el liquido analizado, una membrana (3) sobre la cual se encuentran inmovilizadas una o varias substancias de captura, y una membrana absorbente (4). La invención también se refiere a un procedimiento lácteo liquido por medio del dispositivo de ensayo y un estuche de ensayo que comprende dicho dispositivo de ensayo.

Description

"DISPOSITIVO DE ENSAYO PARA LA DETERMINACIÓN DE ANALITOS EN UN PRODUCTO LÁCTEO LIQUIDO" DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un dispositivo de - ensayo para la determinación de analitos en un producto lácteo líquido como la leche. La misma se refiere igualmente a un - procedimiento que permite la detección y la cuantificación de analitos en la leche gracias a este dispositivo de ensayo, así como a un estuche de ensayo que comprende este dispositivo de ensayo. En la actualidad, las exigencias sanitarias de numerosos países imponen el control regular de la presencia de dive_ sas substancias en los productos lácteos, tales como medicamejí tos veterinarios y hormonas, comúnmente utilizados en la cría del ganado. Por razonez médicas evidentes, estas substancias deben evitarse en los productos lácteos destinados al consumo humano. En otros casos, es deseable disponer de ensayos que permitan detectar la presencia de substancias endógenas en la leche con el fin de optimizar las prácticas de cría del ganado. En particular, la determinación rápida del contenido en hormonas en la leche permite identificar con facilidad los periodos propicios para la reproducción. En otros casos, se buscan métodos prácticos y fiables para controlar el origen de los productos lácteos derivados de REF.: 33055 las leches de diversas especies animales. Se buscan métodos que permitan identificar la presencia de proteínas características de la leche de ciertas especies con respecto a otras. Por otra parte, son conocidos por la literatura diver-sos ensayos para la detección de analitos en líquidos biológicos. Estos ensayos emplean generalmente métodos de detección que recurren a un agente de reconocimiento (receptor o anti -cuerpo) que reconoce específicamente al analito o a un análogo de este analito, y a un agente de marcado (radioelemento, enzj_ ma, agente fluorescente entre otros) en lo que sigue denomina dos reactivos de detección. En función de los elementos elegidos, se hablará de radioinmunoensayo (RÍA), de radiorecepto-rensayo (RRA), de enzimain unoensayo (EIA) entre otros. En -su principio general, estos ensayos recurren a la combinación mínima de los dos elementos anteriormente citados (reactivos de detección) que permiten la obtención de un resultado cuyo -valor es una indicación de la cantidad de analito presente. Es conveniente señalar que en función del método de de tección elegido, el agente de marcado puede acoplarse bien al agente de reconocimiento o al analito o a una substancia anál ga del analito, desde el punto de vista de su reconocimiento -por el agente de reconocimiento. Existen igualmente proced_i_ mientos en los que el agente de reconocimiento o el analíto o la substancia análoga del analito contiene intrínsecamente el agente de marcado (por ejemplo un analito marcado radioactiva- ^^^ ^^¡^^^s^ ^¡? mente) . Para los productos lácteos, los ensayos de detección de analitos más comunes descritos se refieren a la detección de an tibióticos. En efecto, es muy conocido el empleo de antibiótj^ cos para el tratamiento de ciertas enfermedades infecciosas del ganado productor de leche. Ahora bien, por razones médicas evidentes, la leche de_s tinada al consumo humano debe, en principio, estar exenta de cualquier traza de antibióticos. Por otra parte las concentra ciones en penicilina de 0,005 U.I/ml o menores pueden tener incidencias nefastas durante la elaboración de productos deriva -dos de la leche como el queso, el yogur, etc. Se pueden tener en cuenta varias situaciones. En un -primer caso, por ejemplo, para la detección de la presencia de antibióticos en la granja, antes del transvase a un camión, se dará la prioridad a un ensayo extremadamente rápido (inferior a 5 minutos) y sencillo. Se puede tener en cuenta igualmente la utilización de un ensayo de este tipo cuando, por ejemplo, se conoce el antibiótico utilizado para el tratamiento, y que, por otra parte, este ensayo permite la dirección del antibiótj^ co en cuestión conforme a la ley. En el segundo caso, cuando no se hace hincapié en la rapidez, lo importante es el detec -tar la mayor parte de antibiótico y no todos los antibióticos conforme a la ley. La legislación de algunos países impone, en efecto, ^.7^^.M,^.. .. . ..*- ^.ya>.., | ¡ , MMMÍÍiM-littr | - - «¡ÉTí r ^ — J— normas de calidad muy precisas. Por ejemplo las autoridades americanas exigen que las concentraciones en la leche de seis antibióticos siguientes no sobrepasen valores muy precisos: p^ n i c i 1 i na , 5 ppb; ampicilina, 10 ppb; amoxicilina, 10 ppb; cloxacilina, 10 ppb; c ef_a pirina, 20 ppb; ceftiofur, 50 ppb. La Unión Europea impone, a su vez, normas de calidad, penicilina 4 ppb; amoxicilina 4 - ppb; ampicilina 4 ppb; cloxacilina 30 ppb; dicloxaci 1 ina 30 - ppb; oxacilina 30 ppb; cefapirina 10 ppb; cetiofur 100 ppb; ce fquinona 20 ppb; nafcilina 30 ppb; cefazolina 50 ppb. Por tanto, resulta interesante disponer de un ensayo que permita detectar la mayor parte de los antibióticos. Por otra parte, en el ámbito de la industria láctea, se puede considerar, en ausencia de un ensayo que presente todas las cara terísticas de rapidez, sensibilidad y sencillez, sería intere- sante un ensayo que permita aunar al menos estos tres par me - tros, incluso en caso de que no estén totalmente cubiertos. La patente US 4.239.852, describe un procedimiento mi- crobiológico para la detección de antibióticos con núcleo ß- lactama en la leche. Según este procedimiento, la muestra de leche se incuba, por una parte, en presencia de partes de céljj las de un microorganismo muy sensible a los antibióticos, en - particular Bacillus stearothermophi lus , y, por otra parte- en presencia de un antibiótico marcado por un elemento radioactivo o por una enzima. La incubación se lleva a cabo en condicio- nes tales aue permiten a los antibióticos eventualmente presen tes en la muestra y en el antibiótico marcado unirse a las partes de células. Tras la incubación, las partes de células se separan de la mezcla, después se lavan. A continuación, se determina la 5 cantidad marcada unida a las partes de células y se compara con un patrón. La cantidad de antibiótico marcado unido a las par tes de células es inversamente proporcional a la concentración de antibiótico presente en la muestra de leche analizada. Este procedimiento requiere manipulaciones relativamen- 10 te delicadas, particularmente durante la separación de las partes de células de la mezcla. Además, en su versión más sensible, este procedimiento emplea un antibiótico marcado por un 1 1 ?5 elemento radioactivo ( C o I). En este caso, la determina ción de la cantidad de antibiótico presente eventualmente en la 15 leche necesita recurrir a un aparato especial, como por ejemplo un contador de centelleo. Además, la manipulación de produc - tos radioactivos, incluso en cantidades muy pequeñas no está to talmente exenta de peligro para la persona que efectúa el análj_ sis. 20 La solicitud de patente europea 593.112 describe otro - método que permite la detección de antibióticos en la leche. - Este método emplea una proteína aislada a partir de un microorganismo sensible a los antibióticos tal como el Bacillus stearo- thermophi lus. Además, esta proteína está marcada por una en- 25 zima tal como la peroxidasa. ^ ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^j^^^ El ensayo procede de la siguiente manera: una muestra -de leche se incuba en un tubo en presencia de la proteína marcada, tras la incubación, la leche se transfiere a un segundo tubo sobre cuyas paredes se ha inmovilizado un antibiótico de referencia. Se procede a una segunda incubación, eliminándose a continuación el contenido del tubo y las paredes de este segundo tubo se lavan tres veces mediante una solución de lav^ do, que será eliminada a su vez, después los residuos presen -tes en el segundo tubo se transfieren sobre un papel absorben-te. Se añade entonces un substrato colorante en el segundo -tubo que es incubado una nueva vez, a continuación se añade -una solución que detiene el desarrollo del color. La coloración del tubo se compara con la coloración de un ensayo idént^ co efectuado de forma paralela sobre una muestra patrón del ají tibiótico. La cantidad de proteína marcada inmovilizada sobre el soporte y por tanto la intensidad de la coloración es inve_r sámente proporcional a la cantidad de antibiótico presente en la muestra de leche analizada. Según el ejemplo 1 de esta solicitud de patente, este ensayo permite la detección de la penicilina G hasta concentra ciones del orden de 5 ppb y permite la detección de la amoxicj_ lina (5ppb), de la ampicilina (10 ppb), de la cefapirina (5 ppb) y del ceftiofur (5 ppb) Sin embargo, el ensayo es muy fastidioso de llevar a -cabo, en particular por personal no cualificado. En efecto, - «iattW-i-riMlM. este ensayo comprende numerosas etapas incluidas las etapas de transvase de líquido y de residuos y de varias etapas de enjua gue. Habida cuenta del número y del tipo de etapas requerí -das en este ensayo, la obtención de un resultado fiable depen-de mucho de los conocimientos del ejecutante. Además, la interpretación del resultado necesita la realización de dos ensayos paralelos, lo que multiplica y complica las operaciones. Se conocen igualmente otros tipos de procedimientos enzimáticos que permiten determinar concentra -ciones bajas de antibióticos en la leche (J.M. FRERE et al,, -Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18(4), 506-510(1908) así como las patentes EP 85.667 y EP 468.946) basadas en el em pleo de una enzima específica, en este caso, la D-alani 1-D-alji nina-carboxipepetidasa exocelular soluble producida por Actino-madura R39 (en lo que sigue se designará como "enzima R39"). -La enzima R39 posee una actividad específica de hidrólisis de grupos D-alani 1-D-alanina de diversos péptidos y es capaz iguaj^ mente de hidrolizar tioésteres particulares. Además, la enzima R39 reacciona con los antibióticos -con núcleo ß-lactama para formar muy rápidamente un complejo enzima-antibiótico equimolecular, inactivo y sensiblemente irre versible. En la versión más reciente de este ensayo (EP 468.946), se incuba un volumen determinado de una muestra del líquido su-jeto a examen con una cantidad predeterminada de la enzima R39 -^a*"*^*— —^ g|é^J^ en condiciones tales que permiten al antibiótico ß-lactama, presente eventualmente en la muestra, reaccionar con la enzima para formar un complejo enzima-antibiótico equimolecular, inac^ tivo y sensiblemente irreversible. 5 A continuación, una cantidad determinada de substrato- de tipo tioéster se incuba con el producto obtenido en la primera etapa en condiciones tales que permitan la hidrólisis del substrato mediante la enzima R39 residual, que no ha sido complejada con el antibiótico durante la primera incubación. 10 La cantidad de ácido mercaptoalcanoico, así formado, se determina por dosificación colorimétrica con ayuda de un reactivo - capaz de producir una coloración por reacción con el grupo SH libre del ácido mercaptoalcanoico. La intensidad de la coloración se compara con un patrón previamente establecido, a pa 15 tir de muestras que contienen cantidades conocidas de antibióticos. La determinación cuantitativa puede llevarse a cabo por medida con el espectrofotómetro, en el caso de la leche, - puede resultar necesario clarificar previamente la muestra. Claramente, este ensayo comprende menos etapas y es 20 más sencillo de llevar a cabo que el ensayo descrito en la solicitud de patente EP 593.112. Sin embargo, se limita a la - detección de antibióticos con núcleo ß-lactama y a umbrales límites de detección accesibles con la enzima R39. De modo - que, este ensayo no puede ser empleado con otros receptores - 25 de antibióticos y no puede servir directamente de base para la |MÍM8|i^^||teádttatfM^jfi| Maa||v ^— • - - • ' ^*E- - -.^a¿att^ detección de otros analitos en la leche. Puesto que los ensayos actuales presentan aún diversos inconvenientes, el solicitante se fijó como objetivo la busque da de nuevos métodos- para la detección de analitos en los pro-ductos lácteos líquidos, debiendo permitir los métodos buscados la determinación fiable de diferentes tipos de analitos, prefe rentemente en el momento de la recogida en la granja. Por tanto, el solicitante buscó un método que permita obtener muy rápidamente un resultado fiable y sensible en un número limita do de etapas sencillas, que no requieran conocimientos experimentales particulares. Además, el solicitante buscó un método que proporcionará un resultado de fácil detección visual y que, además, pudiera ser objeto de una cuantificación mediante medida instrumental. El solicitante acaba de descubrir que estos objetivos pueden alcanzarse gracias al empleo de un nuevo dispositivo de ensayo que permite determinar fácilmente la presencia de anaH tos en los productos lácteos líquidos, en particular, la leche. Por ello, la presente invención se refiere a un disposj^ tivo de ensayo que permite la detección de la presencia de an litos en un producto lácteo líquido por migración capilar tají gencial de dicho producto lácteo. El dispositivo de ensayo, según la invención, comprende un soporte sólido (1) que posee una primera y una segunda extremidad, sobre el cual están fija^ das, sucesivamente, partiendo de la primera extremidad, 3± *?af ¿- JrtS?Xi M una membrana (2) que permite la purificación del l_í quido analizado. una membrana (3) sobre la que se encuentran inmovilizados una o varias substancias de captura y 5 - una membrana (4) absorbente, caracterizada porque la membrana (2) es capaz de retener las - substancias presentes en el producto lácteo, que impiden la m_i_ gración sobre el dispositivo de ensayo de los analitos presentes eventualmente en el producto lácteo y de los reactivos de 10 detección utilizados según el método empleado y durante la migración capilar tangencial de la muestra tras el remojo de la primera extremidad del dispositivo de ensayo en el producto - lácteo analizado. De acuerdo con un modo de realización particular de la 15 invención, el dispositivo de ensayo, de acuerdo con la presente invención, posee una membrana (5) sobre la que se ha depos_i_ tado al menos un reactivo de detección, siendo capaz este reac^ tivo de detección de solubi 1 izarse rápidamente en presencia de dicho producto lácteo. Según este modo de realización particu^ 20 lar, la membrana (5) debe situarse antes de la membrana (3). - La misma puede situarse, por ejemplo, bien antes de la membrana (2), en la primera extremidad del dispositivo, o bien entre la membrana (2) y la membrana (3) o también por debajo o por - encima de la membrana(2). 25 Las diferentes membranas en el dispositivo de ensayo, - ^^¿^^^^¡?^^^^^^^i^^^^^^^^^^j^^^^^^/^^^ según la presente invención, se superponen a sus extremidades • con el fin de asegurar la migración continua del producto lácteo de una zona a otra. Preferentemente, la membrana (3) se coloca de modo que su extremidad próxima quede situada por de-bajo de la membrana (2) y su extremidad lejana quede por debajo de la membrana (4). Las membranas pueden mantenerse eventualmente en contacto entre sí gracias a una película de plástico adhesiva (6). En este caso, la película de plástico adhesiva se elige con el fin de no afectar a la migración del líquido sobre el dispositivo de ensayo. La opción de cubrir el dispositivo de ensayo mediante-una película de plástico adhesiva presenta dos ventajas: asegj ra un contacto perfecto a la superposición de las membranas y constituye una película protectora. La película de plástico adhesiva (6) puede bien recubrir completamente las membranas -(2), (3), (4) y (5) o bien recubrir parcialmente las membranas individuales. Preferentemente, la película de plástico adhesiva (6) no recubre los primeros milímetros de la primera ex -tremidad con el fin de permitir una migración más rápida del -líquido sobre las membranas (2) del dispositivo de ensayo. Las figuras 1 a3 ilustran ejemplos de dispositivos de ensayo según la presente invención. Las figuras la, 2 y 3 presentan vistas frontales y la figura 1b presenta una vista -en sección longitudinal. El soporte sólido (1) presente en el dispositivo de en 1 1 laÜÜlíf? ?? '(Iri -™"*^*»**-sayo, según la presente invención, está realizado en cristal o en materia plástica, preferentemente, en materia plástica. En el caso de un soporte realizado en materia plástica, su espesor se encuentra comprendido generalmente entre 0,05 y 1 mm, prefe-rentemente entre 0,1 y 0,6 mm. Las membranas están fijadas s^> bre el soporte sólido (1) gracias a un adhesivo. La membrana (2) puede ser de diferentes tipos. Por una parte, debe ser capaz de retener las substancias presentes en el producto lácteo impidiendo la migración sobre el disposi-tivo de ensayo de los analitos presentes eventualmente en el producto lácteo y de los reactivos de detección empleados, se -gún el método empleado. Por otra parte, debe permitir la mi -gración rápida de los analitos y de los reactivos de detección sobre el dispositivo de ensayo preservando la actividad de es -tos analitos y reactivos de detección durante esta migración. Ejemplos no limitativos de membranas que permiten la obtención de este resultado son Cytosep 1663 y Leukosorb LK4 (disponibles en Pall Gelman Sciences), GF/D, GF/DVA, 17CHR (disponibles en Whatmann) y fibra de vidrio de tipo GF 141 (disponible en Als-trom). La membrana Leukosorb empleada preferentemente en una membrana elaborada a partir de fibra de poliéster no tejido, -destinado a la retención de leucocitos a partir de muestras -clínicas procedentes de la sangre, la orina, la saliva, y el -líquido cerebro-espinal. La retención de los leucocitos se - ^^&j^^¡É£^^gljjl!^ lleva a cabo por filtración del fluido, por paso transversal a través de la membrana. El solicitante descubrió de forma inesperada que estos tipos de membranas permiten igualmente asegurar una función muy importante para la detección de analitos en un producto lácteo, gracias a los dispositivos de ensayos según la presente invención, a saber, la retención de las substancias presentes en los productos lácteos, que impiden el buen desarrollo - de un ensayo de detección por migración capilar tangencial del producto lácteo sobre dichos dispositivos de ensayo, permitier do la migración rápida de los analitos y de los reactivos de - detección. Para realizar esta función de forma óptima, la membrana (2) debe ser suficientemente larga para permitir la elimina^ ción de todas las substancias presentes en el producto lácteo que impiden la migración rápida de los analitos y reactivos de detección sobre el dispositivo de ensayo. La membrana (3) debe permitir inmovilizar una o varias substancias de captura y debe permitir la migración rápida de la muestra de producto lácteo tras paso sobre la membrana (2). Preferentemente, la membrana (3) se consolida sobre un soporte no poroso de tipo poliéster. Ejemplos no limitativos de - membranas convenientes, según la presente invención, son las - membranas realizadas en nitrocelulosa de elevada velocidad ca- pilar, tales como las membranas Hi-Flow (disponibles en Milli- pore), preferentemente las membranas Hi-Flow de tipo SX o ST. Estas membranas proporcionan un resultado óptimo en combina -ción con las membranas (2), tal y como se han identificado anteriormente. Una o varias substancias de captura son inmovilizadas sobre la membrana (3). El tipo de substancia de captura inrno vilizada depende, por supuesto, del método empleado para la d_e tección de los analitos. Las substancias de captura son capj? ees de inmovilizar de forma selectiva al menos uno de los cons^ tituyentes presentes en el líquido emigrante sobre el dispositivo de ensayo, tal como uno de los reactivos de detección o -el producto resultante de la formación de un complejo entre el analito o una substancia análoga de este analito y al menos un reactivo de detección o también, el producto resultante de la formación de un complejo entre varios reactivos de detección. La substancia de captura puede igualmente ser uno de los reactivos de detección. Las substancias de captura se sitúan de forma concentrada sobre una porción o varias porciones muy delimitadas de la membrana (3), tales como discos o banda delga-das o cualquier motivo apropiado para la aplicación. Independientemente del motivo elegido, debe permitir obtener una lectura clara del resultado. En lo que se refiere a su dimensión, la membrana (3) -debe ser suficientemente larga para contener todas las substají cias de captura empleadas en el orden y en las cantidades re -queridas según el método de detección empleado. No es relevante el tipo de membrana utilizada para la -membrana (4), sin embargo debe ser capaz de absorber y almace -nar el líquido tras su paso sobre las membranas anteriores. La membrana (4) es de dimensión suficientemente grande para permitir la absorción del líquido tras su paso sobre la membrana (3), pero también, desde un punto de vista práctico, para permitir -un manejo más fácil del dispositivo de ensayo. Eventualmente, el dispositivo de ensayo según la preseí te invención puede comprender una membrana (5) sobre la que se ha depositado al menos un reactivo de detección. La membrana (5) debe permitir la migración del producto lácteo permitiendo la solubilización y el ensanche del (o de los) reactivos de detección durante el paso del flujo de producto lácteo. Ejemplos no limitativos de membranas que pueden resultar convenientes pa^ ra este fin son: las membranas a base de resinas de fibra de v^ drio, tales como las membranas T5NM (disponibles en Millipore), las membranas F075-14 o F075-17 o GF/C (disponible en Whatman), la membrana Cytosep 1663 (disponibles en Pall Gelman Sciencies), las membranas a base de resinas de fibra de poliéster tales como las membranas Accuwick (disponibles en Pall Gelman Sciencies) el papel de celulosa 3 mm (disponible en Whatman) o también las membranas de tipo Reléase Matrix PT-R2 (disponibles en Advances Micro Devices). Preferentemente, se utiliza una membrana a ba se de resinas de fibra de poliéster, tales como las membranas - jaujua-an j^ i ¡ ? ¡ Uli Accuwick. La membrana (5) tiene una longitud suficiente para soportar la cantidad de reactivo de detección deseada. Los dispositivos de ensayo, según la presente invención, se elaboran mediante métodos conocidos por el técnico en la m 5 teria. Se pueden preparar, por ejemplo, tarjetas, gracias a laminadores disponibles en el comercio. Las substancias de - captura empleadas se depositan sobre la membrana (3) bajo forma de solución, antes o después del ensamblado de tarjetas. El depósito de estas soluciones puede realizarse de forma muy 10 precisa gracias a equipos disponibles en el comercio, tal como el Dispenser A-Y Platform Biojet Quanti-3000 de Bio Dot, Inc. Estas soluciones depositadas son tan pronto evaporadas, por ejemplo, colocando la tarjeta bajo un flujo de aire caliente. Para la producción a gran escala, se pueden preparar igualmen- 15 te rodillos. A continuación, las tarjetas y rodillos que po tan las substancias de captura deseadas se cortan en láminas, constituyendo cada una de estas láminas un dispositivo de ens_a yo, según la invención. Cuando el dispositivo de ensayo comprende una membrana 20 (5), el ( los) reactivo( s) de detección puede(n) depositarse antes del ensamblado de las tarjetas o rodillos, por simple in - mersión de la membrana (5) en una solución que contiene elt(los) reactivo(s) de detección. Alternativamente, se puede(n) dep^ sitar tras el ensamblado de las tarjetas o rodillos por una 25 técnica análoga a la utilizada para el depósito de las substan ? iu t^ ^ ? ^^ ^m?ß ^ ^^ cias de captura sobre la membrana (3). En una variante de la invención, el dispositivo se encuentra en una caja de plástico que presenta dos aberturas: la primera, en forma de cubierta, está situada justo por encima - 5 de la membrana (2) y permite recibir el líquido que se desea - analizar, la segunda es una ventana de abertura que permite la visualización del resultado sobre la membrana (3). En este - caso, el dispositivo de ensayo no comprende película de p 1 á st_ co adhesiva (6). 10 El dispositivo de ensayo de acuerdo con la invención, permite la detección de la presencia de analitos en un producto lácteo líquido, en particular la leche. Por ello, la presente invención se refiere igualmente a un procedimiento para la detección de analitos en un producto - 15 lácteo líquido utilizando un dispositivo de ensayo, según la presente invención, así como reactivos de detección, que com prenden las siguientes etapas. a) la puesta en contacto de un volumen determinado de producto lácteo con el dispositivo de ensayo, según la presente invención, teniendo lugar esta puesta - en contacto en la primera extremidad del dispositivo de ensayo. b) la migración tangencial por capilaridad del producto lácteo sobre el dispositivo de ensayo con el fin de que los analitos y los reactivos de detección ^^^^fc^.gB^^^^^^^^ggl^^^^^Ag^g^^^^gj«j¡g*j^<g^^^^^^ ^g*^¿j presentes eventualmente en el producto lácteo pasen de forma progresiva sobre la membrana (2), de^ pues sobre la membrana (3) y de modo que los constituyentes del producto lácteo no detenidos por 5 las membranas (2) y (3) lleguen a la membrana (4) y (c) la determinación de una fijación sobre la membrana (3) . El procedimiento según la presente invención permite - 10 la detección de los analitos en un producto lácteo líquido, por ejemplo leche, suero, leche batida entre otros. La presente invención se refiere más particularmente a la detección de analitos, tales como medicamentos veterinarios, hormonas o proteínas susceptibles de encontrarse en la leche. 15 Los reactivos de detección utilizados según la presente invención pueden variar en número y en naturaleza en función del modo de realización de la invención, basado a su vez en el método de detección empleado. El procedimiento, según la invención, emplea al menos dos reactivos de detección. El pri- 20 mer reactivo de detección es un agente de reconocimiento capaz de reconocer específicamente el analito y será en lo que sigue denominado como "identificador". El segundo reactivo de de - tección es un agente de marcado y será en lo que sigue denominado como "Marcador". Resulta conveniente señalar que en 25 función del modo de realización elegido, ciertos reactivos de ^ M& ^?á^^^bflü*''<^ «* M»é £t* U??fo* ,., n&stié?ß?*. detección pueden estar presentes sobre la membrana (3) o sobre la membrana (5). En función del analito a detectar y de los - reactivos de detección utilizados se puede revelar necesario - añadir uno o varios reactivos de detección antes de la etapa - de puesta en contacto del producto lácteo con el dispositivo - de ensayo, según la invención, y mantener esta mezcla en condj^ ciones de incubación permitiéndose así la formación de un complejo entre reactivos de detección y el analito o una substancia análoga del analito. En función del método empleado, el Identif icador y el Marcador pueden acoplarse entre sí o pueden consistir en una única substancia. Por otra parte, pueden existir varios Identif icadores y/o Marcadores. El identificador permite detectar la presencia del tipo de análisis buscado gracias a su capacidad de reconocimien- to específico de este analito o de una substancia análoga de - este analito. Puede tratarse de un receptor capaz de formar selectivamente un complejo estable y esencialmente irreversible con el analito o una substancia análoga del analito o de un ají ticuerpo monoclonal o policlonal específico del analito o de - una substancia análoga del analito. Para la detección de antibióticos, el Identif icador puede elegirse entre anticuerpos monoclonales o policlonales específicos o entre los receptores obtenidos a partir de microorganismos sensibles a los antibióticos, tales como los receptores obtenidos a partir de las es- pecies Bacillus (Bacillus stearothermophi lus , Bacillus subtilis/ Bacillus 1 icheniformis, entre otros). Streptococcus (Strepto coccus thermophi lus , entre otros), Actinomvcetes (Actinomadura R39, entre otros) Según un modo de realización preferido de la invención, 5 se emplea un Identif icador que comprende un receptor sensible a los antibióticos con núcleo ß-lactama obtenido a partir de- Bacillus 1 icheniformis , tal como el receptor BlaR o el receptor BlaR-CTD. El aislamiento y la secuencia peptídica del prote^ na BlaR se han descrito en Y. ZHU et al., J. Bacteriol., 1137- 10 1141 (1990), el receptor BlaR-CTD es el dominio carboxi terminal de BlaR cuyo aislamiento y la secuencia peptídica se han de^ crito en B.JORIS et al., FEMS Microbiology Letters, 107-144 - (1990). El uso de receptores BlaR o BlaR-CTD, según la presen- 15 te invención, parala detección de antibióticos con núcleo lactama, presenta ventajas importantes con respecto a los agejí tes de reconocimiento utilizados hasta ahora. En efecto, los receptores BlaR y BlaR-CTD son capaces de compiejar muy ráDida- mente un número elevado de antibióticos y a una temperatura de 20 incubación menor que la necesitada para los agentes de reconocimiento conocidos tales como, por ejemplo, los receptores obtenidos a partir de Bacillus stearothermophi lus. El segundo tipo de detección utilizado es un Marcador que permite la visualización y la cuantificación directa e in- 25 directa de la presencia de los analitos en el producto lácteo. ,^fa¿ ¿«.., *•<. <**«******** ».„* ASfii . .. ^..^^aaÉfc^...

Los Marcadores que pueden emplearse, de acuerdo con la inven - ción, pueden ser particularmente fluorescentes, radioactivos, luminiscentes o enzimáticos. Se elige preferentemente un Marcador particular que proporcione una señal visual fácilmente de^ 5 tectable incluso en pequeñas cantidades. A título de ejemplos no limitativos, se citará las partículas coloidales metálicas - (platino, oro, plata entre otros), las partículas coloidales de selenio, carbono, azufre, teluro o también partículas coloida - les de látex sintéticos coloreados. Las partículas de oro co- 10 loidales con un diámetro particular comprendido entre 1 y 60 mm se prefieren particularmente. Estas proporcionan una coloración de color rosa-rojo intenso fácilmente detectable. El Marcador permite determinar la presencia del analito en la muestra de producto lácteo gracias a su acoplamiento a - 15 uno o varios reactivos de detección al analito o a una substancia análoga del analito. El acoplamiento entre el Marcador y el reactivo de de - tección puede realizarse según los métodos conocidos por el téc^ nico en la materia. Cuando se emplea un Marcador particular, el marcado puede tener lugar bien por absorción directa sobre - las partículas o bien indirectamente, por el sesgo de un brazo de anclaje químico, tal como un complejo biot ina/antibiotina , por ejemplo. Este acoplamiento puede tener lugar, bien antes de la etapa de puesta en contacto con el producto lácteo con - 25 el dispositivo de ensayo, de acuerdo con la invención, o bien- «M^^^^a^^^^^^^^^g^b^^^^^^^^^^^^^^^fMMte^^^ s^ durante la migración del producto lácteo sobre el dispositivo -de ensayo según la invención. Según un modo de realización particular de la invención, se utiliza un tercer tipo de reactivo de detección, en lo que -sigue se denominará como "Referencia". Se trata de una subs -tancia añadida en cantidad conocida a la mezcla analizada y que se fija sobre una substancia de captura específica inmovilizada sobre la membrana (3). La referencia proporciona una banda a¿ ya intensidad sirve de referencia para la cuantificación del anal ito. En lo que se refiere a la toma en contacto del producto lácteo con el dispositivo de ensayo según la invención (etapa a) del procedimiento), esta se lleva a cabo colocando el dispositivo de ensayo, de acuerdo con la presente invención, en un reci-píente en cuyo fondo se encuentra la muestra que se desea anaH zar. El dispositivo de ensayo se coloca esencialmente de forma vertical en el recipiente, de modo que la primera extremidad del dispositivo quede en contacto con la mezcla. En la variante de la invención que utiliza un dispositi_ vo de ensayo colocado en una caja de plástico, éste está dispue_s to de forma horizontal y la puesta en contacto se lleva a cabo depositando una alícuota de muestra que se desea analizar en la abertura en forma de cubeta situada por encima de la membrana (2), Para la etapa de migración b), se deja migrar el líquido por capilaridad sobre el dispositivo de ensayo según la inven - 1^a^^Ji^^a^^iMMÉ¡^MMfe^,^^t»!^ sb^^^ ^M^É? ción. El líquido que migra por capilaridad sobre el disoosi- tivo de ensayo, según la invención, se encuentra en primer lugar con la membrana (2) que permite retener las substancias presentes en el producto lácteo que impide la migración de los analitos presentes eventualmente en el producto lácteo y reactivos de detección sobre el dispositivo de ensayo. Los analj_ tos y reactivos de detección migran a continuación sobre la mem brana (3) sobre la que se han inmovilizado una o varias substaní cias de caDtura. Las substancias de captura inmovilizan de - forma selectiva al menos uno de los constituyentes presentes en el líquido analizado. Según un modo de realización particular de la invención, se utiliza una substancia de captura situada - al final del recorrido de migración del líquido sobre la membra na (3) que es capaz de fijar todos los marcadores que no han s_i_ do detenidos por las substancias de captura anteriores. Esta substancia de captura permite completar las informaciones cuantitativas proporcionadas por las substancias de captura anteri^ res . La determinación de una fijación sobre la membrana (3) (etapa c) del procedimiento) se efectúa sencillamente determi - nando la presencia de Marcadores en esta zona. Esta determina ción es posible sencillamente de forma visual. Sin embargo, si se desea tener una medida precisa de la intensidad de las señales observadas, se puede recurrir a un aDarato capaz de medir - la intensidad de la señal observada. Cuando se utiliza una - referencia, ésta la fija una substancia de captura específica - que proporciona una referencia interna para la medida de la intensidad de las señales observadas. La interpretación del resultado obtenido depende del rné 5 todo de detección empleado, a saber, de los reactivos de detección y substancias de captura empleada. Con respecto a los procedimientos de detección de anaU tos en la leche anteriormente descritos en la bibliografía, el procedimiento según la presente invención presenta las ventajas siguientes. En primer lugar, este procedimiento es muy rápido y extremadamente sencillo de llevar a cabo, comprende esencialmente dos etapas de fácil manipulación, no requiere de conocí - mientos experimentales particulares. A continuación, la apreciación cualitativa y cuantitativa del resultado es inmediata y no necesita de operaciones suplementarias particulares, tales - como las requeridas cuando la detección se efectúa mediante colorantes y/o marcadores enzimáticos. Además, este procedimiejí to se aplica directamente para la detección de diferentes tipos de analitos. Finalmente, en el modo de realización que utili- 20 za una Referencia, el resultado se puede interpretar y cuantifj_ car directamente, sin que sea necesario recurrir a uno o varios ensayos de referencia. La presente invención se refiere igualmente a un estu - che de ensayo para la detección de analitos en un producto lác- 25 teo que comprende un dispositivo de ensayo según la presente - invención. Llegado el caso, el estuche de ensayo, según la - presente invención, puede contener igualmente los reactivos de detección que se tiene que añadir a la muestra antes de la pue^ ta en contacto del producto lácteo con el dispositivo de ensa- 5 yo. Los ejemplos que siguen a continuación ilustran dife - rentes aspectos y modos de realización de la presente inven ción sin limitar, sin embargo, su alcance. Ejemplo 1. Fabricación de los dispositivos de ensayo. 10 Modos operatorios generales. 1.1. Ensamblado de tarjetas membranosas. Las tarjetas con un tamaño de 300 x 76.2 mm se ensamblan en primer lugar por medio de un laminador de tipo Chlam - shell Laminator (disponible en 3io Dot, Inc.) según el s i gu i ej 15 te método: Se corta un rectángulo de soporte de plástico de tipo ArCare 8565 (disponible en Adhesive Research) de dimensión 300 x 76.2 mm (soporte sólido (1)). Se corta a continuación un - rectángulo de membrana Leukosorb LK4 (disponible en Pall Gel - 20 man Sciences) de dimensión 300 x 20 mm (membranas 2)), un rectángulo de membrana Hi-Flow SX (disponible en Millipore) de d_i_ mensión 300 x 25 mm (membrana (3)), un rectángulo de membrana de celulosa 3 mm (disponiDle en Whatmann) de dimensión 300 x 40 mm (membrana (4)) y un rectángulo de membrana Accuwick (dispo- 25 nible en Pall Gelman Sciences) de dimensión 300 x 0.8 mm (mem- brana (5) ) . Se aloja sucesivamente las membranas (2) y (4), después la (5) y a continuación la (3) en un emplazamiento específico - del molde inferior del laminador. El soporte sólido (1) recu- 5 bierto de adhesivo se mantiene en la cubierta del aparato, siejí do expuesto al aire el lado adhesivo. Las membranas alojadas en el molde inferior están en contacto con el soporte adhesivo cerrando el laminador, las membranas quedan en su sitio exactamente por medio de una succión de aire realizada por una bomba 10 de vacío. Cuando el vacío se interrumpe, se recupera una tar ^ ta constituida por el soporte sólido (1) sobre el que están fijadas las membranas (2), (3), (4) y (5). 1.2. Depósito de las substancias de captura sobre la membrana (3), 15 El depósito de substancias de captura sobre la membrana (3) se lleva a cabo antes o después del ensamblado según el ejem pío 1.1. Se prepara una solución acuosa que contiene la substancia de captura. Esta se deposita sobre la membrana (3) de la - 20 tarjeta membranosa preparada en el ejemplo 1.1. por medio'de un "Dispenser" de tipo X-Y platform Biojet Quanti-3000 de Bio Dot, Inc. Las soluciones depositadas se evaporan inmediatamente - colocando el conjunto de la tarjeta durante un minuto bajo aire expulsado a dO^c. 1.3. Depósito de la substancia de marcado sobre la merrir brana (5). a) Antes del ensamblado según el ejemplo 1.1. Se prepara una solución acuosa que contiene la substan- x" cia de marcado. La membrana (5) se sumerge en esta solución.

La misma se escurre, después se deja secar durante una noche a temperatura ambiente bajo vacío de 0,5 bar. b) Tras el ensamblado según el ejemplo 1.1. Se procede según el modo operatorio descrito en el ejem pío 1.2 para el depósito de las substancias de captura. 1.4. Depósito de la película de plástico adhesiva (6). Se corta un rectángulo de película adhesiva del tipo ArCare 7759 (disponible en Adhesive Research de dimensión 300 x 20 mm para un recubrimiento parcial y 300 x 20 mm para un -recubrimiento parcial y 300 x 71.2 mm para un recubrimiento de todas las membranas. La tarjeta obtenida según el ejemplo 1.1 se coloca en el molde inferior de un laminador y la película adhesiva se c loca en la tapa del laminador, siendo expuesto el lado adhes_i_ vo al aire. La película de plástico adhesiva se pone en contacto con la tarjeta membranosa durante el cierre del aparato. 1.5.- Corte en láminas . Las tarjetas obtenidas tras ensamblado se cortan en l_á minas con ayuda de urr aparato de tipo guillotina o con ayuda -de un aparato rotativo (disponible en Bio Dot .Kinematic o - - 23 - Akzo). Las láminas de las extremidades se separan, quedando listas las otras láminas para su uso. Para su conservación, los dispositivos de ensayos se colocan en un recipiente opaco y hermético en presencia de un agente desecante (Siligelac, Francia). 1.6.- Presentación en un cárter de plástico. Se coloca el dispositivo de ensayo en una caja de plá_s tico que presenta dos aberturas: la primera, en forma de cubeta, se coloca justo por encima de la membrana (2) y permite re cibir el líquido que se desea analizar, el segundo es una ventana de abertura que permite la visualización del resultado SD bre la membrana ( 3) . Ejemplo 2. Detección de antibióticos con núcleos ß -1 a^ tama en la leche por medio de la enzima R39. 2.1. Identif icador. El identificador utilizado en este ejemplo es la D-alja ni 1-D-alanina-carboxipeptidasa exocelular soluble producida por Actinomdura R39 obtenida según el modo operatorio descrito en J.M. FRERE et al ..Antimicrobial Agentes and Chemotherapy, 18(4) ,506-510 (1980). 2.2. Acoplamiento del Identif icador con el Marcador 2.2.1 3iotíni lación del Identif icador . Se dializan 250 u 1 de una solución acuosa de enzima _ R39 con una concentración de 1 mg/ml durante 24 horas contra -500 ml de tampón HNM;ÍHepes 10mM, pH8 ,NaC 1 10mM, MgCl 5 mM).

Se añaden a esta solución <$? enzima R39 dializada, 2 mí de tam-pon bicarbonato (0.1 M de bicarbonato sódico pH 9) y 250 j 1 de una solución de éster 6- (biotinamido)caproico de N-hidroxi succi -nimida con una concentración de 5 mg/ml en DMF anhidro. Esta solución se agita suavemente sobre agitador para tubos sobre -eje rotativo de tipo LABINCO (disponible en VEL, Bélgica) a una velocidad de 2 r.p.m. durante 3 horas a temperatura ambiente y preservada de la luz. La solución así obtenida se dial i -za contra un tampón HNM (Hepes 100 M, pH 8, NaCl 100mM, MgC 12 50 mM) durante 24 horas. De este modo, se obtiene una solu -ción de enzima R39 biotinilado que se diluye en tampón HNM-BSA (Hepes 500 mM,pH8, NaCl 500 mM, MgCl2 250 mM, BSA 10 mg/ml) -hasta una concentración de 100 g de enzima R39 por ml de tampón. Esta solución se almacena a -20QC. 2.2.2. Marcador. Como Marcador, se utilizan partículas de oro con un di_á metro de 40 nm, sobre las que se ha depositado un anticuerpo de cabra bajo forma de suspensiones en una solución acuosa de te -traborato de sodio 2mM a pH 7,2, estabilizada por el nitruro de sodio al 0,1% (disponible en BRITISH BI0CELL (Ref. GAB40). La densidad óptica de estas suspensiones de 520 nm es aproximada -mente 10 y la concentración en proteína es de 24 ug/ml aproxiina damente. 2.2.3. Acoplamiento del Identif icador biotinilado con -el Marcador Solución A para ensayo rápido. La solución de enzima R39 biotinilado preparado en el -ejemplo 2.2.1 se diluye 25 veces mediante tampón HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH3, NaCl 500 mM, MgCl2 250 mM.BSA 10 mg/ml). Se mez-cía a temperatura ambiente 17;5 partes en volumen de esta solución diluida en enzima R39 biotinilado, 9,27 partes en volumen de suspensión de partículas de oro que sirven para marcar la -enzima R39 y 6 partes en volumen de suspensión de partículas de oro de referencia (véase el ejemplo 2.3). Solución B para ensayo sensible. La solución de enzima R39 biotinilada preparada en el-ejemplo 2.2.1 se diluye 50 veces por tampón HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCl 500 M, MgCl2 250 mM , BSA 10 mg/ml). Se mezcla a temperatura ambiente 17 5 partes en volumen de esta solución diluida de enzima R39 biotinilada, 9;27 partes en volumen de -suspensión de partículas de oro que sirven para marcar la enzima R39 y 6 partes en volumen de suspensión de partículas de -oro de referencia (véase el ejemplo 2.3). 2.3 Referencia Como referencia, se utilizan partículas de oro de 40 nm sobre las que se han depositado anticuerpos de cabra anti-Inpuj noglobulina de conejo. Estas partículas se encuentran dispon_i_ bles en BRITISH BI0ICELL (Ref. GAR 40), bajo la forma de suspen^ sión en una solución acuosa de tetraborato de sodio 2mM a pH -7.2 estabilizada por nitruro de sodio al 0.1%. La densidad -óptica de estas suspensiones de 520 nm es de 3 aproximadamente y la concentración en proteína es de 6 µg /m \ aproximadamente. 2.4. Substancias de captura. 2.4.1 Primeras substancias de captura. Se incuban 8 ml de una solución que contiene 213 mg de gra maglobul ina humana (G4386, Sigma) y 8,6 mg de clorhidrato de 2- iminotiolano (Aldrich, 33056-6) en tampón carbonato de sodio OOOmM, pH9) durante una hora a 259C. Por otra parte. se incuban 20 ml de una solución que coj tiene 119.8 mg de cefalosporina-C y 54 mg de sulfosuccinimidi 1 4-(N-maleinidometi 1 ) ciclohexano-1-carboxi lato (sSMCC, 22322 Pie_r ce) en tampón carbonato de sodio (100 mM, pH 9) durante una hora a 259C. A continuación, se mezclan las dos soluciones preparadas anteriormente. Se ajusta el pH de la solución resultante a 7,1 añadiendo 3 ml de NaH^PO» 500 mM y se incuba durante dos horas a 259C. La mezcla obtenida tras la incubación se dializa tres -veces contra 1 litro de tampón fosfato de sodio (10 mM,pH 7,5). La solución resultante se filtra sobre un filtro a 0,22jum, des-pues se toman alícuotas y se congela a -20QC hasta su uso. Durante su uso, las alícuotas se descongelan y se añade un colorante alimenticio antes de efectuar el depósito sobre la membrana, con el fin de apreciar en todo momento la posición -exacta del depósito y la calidad del trazo. La primera substancia de captura permite fijar los Iden ^^^^^^ß^^^^^^^^^^^^^^^^^g^^^^^^^^^Sß^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ tificadores acoplados a los Marcadores libres excedentes con -respecto a la cantidad de antibiótico presente en la muestra. 2.4.2 Segunda substancia de captura. Para la segunda substancia de captura, se utiliza una solución de inmunoglobulina de conejo (Sigma I 5006) con una -concentración de 0,5 mg/ml de inmunoglobulina en tampón fosfato de sodio 10 mM pH 7.5 gammaglobul ina humana 5 mg/ml. Esta segunda substancia de captura detiene la Referencia durante la migración del líquido sobre el dispositivo de ensayo. 2.5. Dispositivo de ensayo. Se utilizan dispositivos de ensayo que contienen la em brana (2), (3) y (4) ensamblados según el modo operatorio des -crito en el ejemplo 1.1. La membrana (3) de estos dispositivos porta del lado próximo a la substancia de captura descrita en el ej emp 1 o 2.4.1 y del lado lejano a la substancia de captura descrita en el ejemplo 2.4.2. Las substancias de captura se han depositado según el procedimiento descrito en el ejemplo 1.2. 2.5.1. Ensayo 1 - ensayo rápido Se preparan siete muestras de leche que contienen respectivamente 0; 2;4;5;6; 8 y 10 ppb de penicilina G. Cada una de estas soluciones se analiza de la siguiente manera. Se toma una alícuota de 200 µ \ de muestra de leche y 32,8 ^J 1 de solución A preparada en el ejemplo 2.2.3 que se coloca en un tubo Eppendorf. Esta mezcla se incuba durante 3 minutos a 47QC. Se coloca a continuación un dispositivo de ensayo verticalmente en el tubo Eppendorf de modo que la primera extre- .J¿BS8ito> . ? midad del dispositivo de ensayo quede en contacto con la mezcla. Se deja migrar la mezcla sobre el dispositivo de ensayo incubají do el conjunto durante 2 minutos a 47SC. La Tabla 1 que sigue a continuación recoge los resulta-dos obtenidos por las 7 muestras ensayadas. Un valor de intejí sidad comprendido en el intervalo de 0 a 10 se atribuye a las -bandas detectadas, dándose el valor de 10 a la banda más intensa y el valor 0 a la banda menos intensa. Según esta escala, se atribuye un valor 6 a la banda de referencia. La intensi-dad de la señal observada en la primera banda de detección es inversamente proporcional a la cantidad de penicilina G presejn te en la muestra.

Tabla 1. Penici lina G Intens :i diid (ppb) la. banda 2a. banda 0 10 6 2 8 6 4 5 6 5 3 6 6 2 6 8 1 6 10 0 6 En este ejemplo, cuando la primera banda tiene una inten jaB¡a &ih*gatátfB».~ . „- ..«¿gfesc . .. ~afe¿a.:¡»^fe. sidad menor que la de la banda de referencia, el ensayo se considera positivo. Los resultados presentados en la Tabla 1 muestran que este ensayo permite detectar en 5 minutos hasta 4 ppb de penicilina G en una muestra de leche. 2.5.2 ensayo 2 - Ensayo sensible. Se preparan seis muestras de leche que contienen receptivamente 0;2;2,5;3,4 y 5 ppb de penicilina G. Cada una de e^ tas soluciones se analiza de la siguiente manera. Se toma una alícuota de 200 u 1 de muestra de leche y 32,8 U 1 de solución B preparada en el ejemplo 2.2.3 que se col^ ca en un tubo Eppendorf. Esta mezcla se incuba durante 5 inu tos a 479C. Se coloca a continuación un dispositivo de ensayo verticalmente en el tubo Eppendorf de modo que la primera extre idad del dispositivo de ensayo quede en contacto con la mezcla. Se deja migrar la mezcla sob e el dispositivo de ensayo incubaí do el conjunto durante 2 minutos a 47QC. La tabla 2 que sigue a continuación recoge los resultados obtenidos para las 7 muestras ensayadas. Un valor de in -tensidad comprendido en el intervalo de 0 a 10 se atribuye a -las bandas detectadas, dándose el valor 10 a la banda más i ntejn sa y el valor 0 a la banda menos intensa. Según esta escala, se atribuye un valor 6 a la banda de referencia. La intensidad de la señal observada en la primera banda de detección es inve^ sámente proporcional a la cantidad de penicilina G presente en la muestra.

Tabla 2 Penicilina G Intensidad ÍEE } Ia banda 2a banda O 10 ^ 6 2 7 6 2,5 5 6 3 4 6 4 1 6 5 0 6 En este ejemplo, cuando la primera banda tiene una intensidad menor que la banda de referencia, el ensayo se consid^ ra positivo. Los resultados presentados en la tabla 2 mués -tran que este ensayo permite detectar en 7 minutos hasta 2,5 -ppb de penicilina G en una muestra de leche. Ejemplo 3. Determinación de antibióticos con núcleo -lactama en la leche por medio de BlaR. Este ejemplo ilustra la detección en la leche de antibióticos con núcleo ß -lactama controlados por las autoridades sanitarias. El ensayo descrito en este ejemplo utiliza el receptor BlaR-CTD acoplado a bolas de oro que sirven de agentes -de marcado y emplea un soporte sólido que se presenta bajo la -forma de un dispositivo de ensayo, que comprende un soporte so^ lido sobre el que están fijadas las membranas. 3.1. Acoplamiento de BlaR-CTD ( Identif icador) con bolas de oro (Marcador) 3.1.1. Biotini lación de BlaR-CTD. Se toman 3,79 ml de una solución de agente de reconocimiento BlaR-CTD con una concentración de 6,6 mg/ml en tampón Fosfato de sodio 20 mM pH 7. Se añade a esta solución de BlaR-CTD 41,71 ml de tampón bicarbonato (0,1 M de bicarbonato sódico pH9) y 2 ml de una solución de éster 6- (biotinamido)caproico de N-nidroxi-succinamida con una concentración de 2,23 mg/ml iguaj_ mente de tampón bicarbonato. Esta solución se agita suavemente sobre agitador para tubos sobre eje rotativo de tipo LABINCO (disponible en VEL., Bélgica) con una velocidad de 2 r.p.m du -rante 2 horas a temperatura ambiente y preservado de la luz. Se incuban 2,5 ml de una solución Tampon Tris 1M pH 8 con la mezcla de reacción en las mismas condiciones durante 30 minutos. La -solución así obtenida se dializó contra tampón HNM (Hepes 100 mM, pH 8, NaCl 100 mM , MgC12 50 M) durante 24 horas. De este modo, se obtiene una solución de BlaR-CTD bitinilado que se diluye en tampon HNM-BSA (Hepes 500mM, pH 8, NaCldOO mM, MgCl2 -250 mM, BSA 10 mg/ml) hasta una concentración de 250 g de BlaR-CTD biotinilado por ml de tampón. Esta solución se almacena a -203C. 3.1.2. Agente de marcado. Como agente de marcado, se utilizan partículas de oro con un diámetro de 40 nm;sobre las que se ha depositado un antj_ cuerpo de cabra bajo la forma de suspensiones en una solución -acuosa de tetraborato de sodio 2mM a pH 7,2 estabilizada mediain te nitruro de sodio al 0,1% (disponible en BRITISH BIOCELL (Ref GAB40). La densidad óptica de estas suspensiones de 520 nm es de 10 aproximadamente y la concentración en proteína es de 24 - ?g/ml aproximadamente. 3.1.3 Acoplamiento de BlaR-CTD biotinilado con bolas de oro. La solución de BlaR-CTD biotinilado preparado en el •-ejemplo 3.1.1. se diluye 114,7 veces por tampón HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCl 500 mM , MgCl2 250 mM.BSA 10 mg/ml). Se mez cía a temperatura ambiente 22,5 partes en volumen de esta so ción diluida de BlaR-CTD biotinilado, 7,5 partes en volumen de tampón HNM-BSA, 9,27 partes en volumen de suspensión de part_i_ cular de oro que sirven para marcar BlaR-CTD biotinilado y 6 -partes en volumen de suspensión de partículas de oro de refereí cia (véase el ejemplo 3.1.3 de arriba). 3.1.4. Referencia independiente. En este ensayo, se utiliza igualmente una substancia de referencia que proporciona una banda cuya intensidad permite cuantificar rápidamente la cantidad de antibiótico presente en la muestra. Para ello, se utilizan partículas de oro de 40 nm sobre las que se ha depositado un anticuerpo de cabra anti -inmunoglobu^ lina de conejo. Esas partículas están disponibles en BRITISH BIOCELL (Ref. GAR 40), bajo la forma de suspensiones en una so-lución acuosa de tetraborato de sodio 2mM a pH 7,2 estabilizado por nitruro de sodio al 0,1%. La densidad óptica de estas suspensiones a 520 nm es de 3 aproximadamente y la concentra -ción en proteína es de 6 ^ 1 /ml aproximadamente. 3.2. Substancias de captura. 3.2.1. Primera substancia de captura - Antibiótico de referencia . Se incuban 8 ml de una solución que contiene 213 mg de Gamma Globulina Humana (G4386, Sigma) y 8,5 mg de clorhidrato-de 2-Iminotiolance (Aldrich, 33056-6) en tampón carbonato de -sodio (100 mM, pH 9) durante una hora a 259C. Por otra parte, se incuban 20 ml de una solución que -contiene 119,8 mg de cefalospor ina-C y 54 mg de sulfosucc inirrp di 1 -4- (N-maleimidometi 1 )ciclohexano- 1 -carboxi lato (sSMCC 22322 Pierce) en tampón carbonato de sodio (100 mM.pH 9) durante una hora a 25QC. A continuación, se mezclan las dos soluciones preparadas anteriormente. Se ajusta el pH de la solución resultante a 7,1 añadiendo 3 ml de NaH2P04 y se incuba durante dos horas a 25QC. La mezcla obtenida tras la incubación se dializa tres veces contra 1 litro de tampón fosfato de sodio (10 mM, pH 7,5). La solución resultante se filtra sobre un filtro de 0,22 después se toman alícuotas y se congelan a -20QC hasta su uso. Durante su uso, las alícuotas se descongelan y se aña-de un colorante alimenticio antes de efectuar el depósito so -bre las membranas con el ft-Ja <fl apreciar en todo momento la po sición exacta del depósito y la calidad del trazo. La primera substancia de captura permite fijar BlaR-CTD acoplado con las bolas de oro,-presente en excedente con -respecto a la cantidad de antil jtico presente en la muestra. 3.2.2 Segunda substancia de captura - Substancia capaz de fijar la referencia independiente. Para la segunda substancia de captura, se utiliza una solución de inmunoglobulina de conejo (Sigma I 5006) con una -concentración de 0,5 mg/ml de inmunoglobulina en tampón fosfato de sodio 10 mM pH 7,5 gammaglobul ina humana 5 mg/ml. Esta segunda substancia de captura detiene la Referencia durante la migración del líquido sobre el dispositivo de ensayo. 3.3. Dispositivo de ensayo. Se utilizan dispositivos de ensayo que contienen las -membranas (2), (3) y (4) ensamblados según el modo operatorio descrito en el ejemplo 1.1. La membrana (3) de estos disposJ_ tivos lleva del lado próximo la substancia de captura descrita en el ejemplo 3.2.1 y del lado distal la substancia de captura descrita en el ejemplo 3.2.2. Las substancias de captura se han depositado según el procedimiento descrito en el ejemplo 1.2. 3.4. Determinación de los antibióticos en la leche. 3.4.1 Ensayo en 3 minutos - Ensayo rápido. Se preparan 7 muestras de leche fresca que contiene respectivamente 0;1;2;3;4;5 y 6 ppb de penicilina G. Cada una de estas soluciones se analiza de la siguiente forma: Se toma una alícuota de 200 ?l de muestra de leche y 45,27 ^ul de solución preparada en el ejemplo 3.1.3 que se colo-ca en un frasco de cristal. Esta mezcla se incuba durante 1 minuto a 47QC. Se toma un dispositivo de ensayo que se coloca verticalmente en el frasco de cristal de modo que la primera extremidad del dispositivo de ensayo quede en contacto con la mezcla y de modo que la segunda extremidad repose sobre la pared del frasco de cristal. Se deja migrar la mezcla sobre el dispositivo de ensayo incubando el conjunto durante 2 minutos a 47*C La tabla 1 que sigue a continuación recoge los resultados obtenidos para las 7 muestras ensayadas. Un valor de in-tensidad comprendido en el intervalo de 0 a 10 se atribuye a las bandas detectadas, dándose el valor de 10 a la banda más -intensa y el valor 0 a la banda menos intensa. Según esta e_s cala, se atribuye un valor 6 a la banda de referencia. La í_rt tensidad de la señal observada en la primera banda de detec ción es inversamente proporcional a la cantidad de Penicilina G presente en la muestra. *á3ts-aaa&»y - 4 Tabla 1 Penici lina G Intensi dad (ppb) la. banda 2a, .banda 0 10 6 1 9 6 2 9 6 3 4 6 4 0 6 5 0 6 6 0 6 En este ejemplo, cuando la primera banda tiene una intensidad menor que la de la banda de referencia, el ensayo se considera como positivo. Los resultados presentados en la Ta bla 1 muestran que este ensayo permite detectar en 3 minutos -hasta 4 ppb de penicilina G en una muestra de leche. Se han realizado ensayos igualmente con otros antibióticos con núcleo ß-lactama en las mismas condiciones. Este ensayo realizado en 3 minutos permite detectar la amoxicilina hasta 5 ppb, la ampicilina hasta 5 ppb, la cloxacilina a menos de 10 ppb, la diocloxaci 1 ina a menos de 20 ppb, la oxacilina a menos de 20 ppb y la cefapirina hasta 20 ppb en una muestra de leche. 1.3.2 Ensayo en 5 minutos. Se preparan 6 muestras de leche fresca que contienen respectivamente 0;2;4;6; 8 y 10 ppb de cloxacilina. Cada una de estas soluciones se analiza de la siguiente manera: Se toma una alícuota de 200 ul de muestra de leche y -45,27 ^ 1 de solución preparada en el ejemplo 3.1.3 que se colo^ ca en un frasco de cristal. Esta mezcla se incuba durante 3 minutos a 475C. Se coloca a continuación un dispositivo de -ensayo verticalmente en el frasco de vidrio de modo que la prj_ mera extremidad del dispositivo de ensayo quede en contacto con la mezcla y de modo que la segunda extremidad repose sobre la pared del frasco de cristal. Se deja migrar la mezcla sobre el dispositivo de ensayo incubando el conjunto durante 2 minutos a 47^C. La Tabla 2 que sigue a continuación recoge los resulta dos obtenidos para las 6 muestras ensayadas. Un valor de in-tensidad comprendido en el intervalo de 0 a 10 se atribuye a -bandas detectadas, dándose el valor de 10 a la banda más intejp sa y el valor 0 a la banda menos intensa. Según esta escala, se atribuye un valor 6 a la banda de referencia. La intensidad de la señal observada en la primera banda de detección es inversamente proporcional a la cantidad de Cloxacilina presente en la muestra.

Cloxaci 1 ina I ntens idad (ppb) la. banda 2a. banda 0 10 6 2 6 6 4 5 6 6 3 6 8 3 6 10 3 6 En este ejemplo, cuando la primera banda tiene una intensidad menor que la de la banda de referencia, el ensayo se considera como positivo. Los resultados presentados en la Ta bla 3 muestran que este ensayo permite detectar en 5 minutos -hasta 4 ppb de cloxacilina en una muestra de leche. Se han realizado ensayos igualmente con otros antibióticos con núcleo ß -lactama en las mismas condiciones. Este ensayo realizado en 5 minutos permite detectar la penicilina G hasta 3 ppb, la amoxicilina hasta 4 ppb, la ampicilina jasta 4 ppb, la dioc loxaci 1 ina hasta 8 ppb, la oxacilina hasta 8 ppb,-la cefapirina hasta 16 ppb la ceftiofur hasta 100 ppb, la cef_ quinona a menos de 20 ppb, la nafcilina hasta 20 ppb y la cefa zolina hasta 60 ppb en una muestra de leche. Este ensayo resulta conveniente particularmente bien co mo ensayo de clasificación antes del trasiego de los camiones de leche en los silos. 1.3.3. Ensayo en 9 minutos. Se preparan 6 muestras de leche fresca que contienen -respectivamente 0;2;4;6; 8 y 10 ppb de cloxacilina. Cada una de estas soluciones se analiza de la siguiente manera: Se toma una alícuota de 200 u 1 de muestra de leche y -45,27 ?l de solución preparada en el ejemplo 3.1.3 que se COID ca en un frasco de cristal. Esta mezcla se incuba durante 3 minutos a 47QC. Se coloca a continuación un dispositivo de -ensayo verticalmente en el frasco de vidrio de modo que la pr^ mera extremidad del dispositivo de ensayo quede en contacto con la mezcla y de modo que la segunda extremidad repose sobre la pared del frasco de cristal. Se deja migrar la mezcla sobre el dispositivo de ensayo incubando el conjunto durante 2 -minutos a 47eC. La Tabla 3 que sigue a continuación recoge los resulta dos obtenidos para las 6 muestras ensayadas. Un valor de intensidad comprendido en el intervalo de 0 a 10 se atribuye a bandas detectadas, dándose el valor de 10 a la banda más intejí sa y el valor 0 a la banda menos intensa. Según esta escala, se atribuye un valor 6 a la banda de referencia. La intensidad de la señal observada en la primera banda de detección es inversamente proporcional a la cantidad de Cefapirina presente en la muestra.

Tabla 3 1 Cefapirina Intensidad (ppb) 1a. banda 2a . banda 0 10 5 4 6 6 6 5 6 8 4 6 10 3 6 12 3 6 En este ejemplo, cuando la primera banda tiene una intensidad menor que la de la banda de referencia, el ensayo se considera como positivo. Los resultados presentados en la Tabla 3 muestran que este ensayo permite detectar en 9 minutos -hasta 6 ppb de cefapirina en una muestra de leche. Se han realizado ensayos igualmente con otros antibiót_i_ cos con núcleo ß-lactama en las mismas condiciones. Este en sayo realizado en 9 minutos permite detectar la penicilina G -hasta 3 ppb, la amoxicilina hasta 4 ppb, la ampicilina hasta 4 ppb, 1 _ diocloxacilina hasta 8 ppb, la oxacilina a menos de 8 ppb, el ceftiofur hasta 80 ppb, la cefquinona a menos de 20 ppb, la nafcilina a menos de 20 ppb y la cefazolina hasta 45 ppb en una muestra de leche. Este ensayo realizado en 9 minutos permite por tanto de tectar todos los antibióticos controlados actualmente por las -autoridades europeas y hasta los límites legales impuestos por estas autoridades. 1.3.4 Ensayo en 20 minutos. Se preparan 6 muestras de leche fresca que contienen -respectivamente 0; 20; 30; 40; 50 y 60 ppb de ceftiofur. Cada una de estas soluciones se analiza de la siguiente manera: Se toma una alícuota de 200 p l de muestra de leche y 45,27 iil de solución preparada en el ejemplo 3.1.3 que se COID ca en un frasco de cristal. Esta mezcla se incuba durante -18 minutos a 47QC. Se coloca a continuación un dispositivo -de ensayo verticalmente en el frasco de vidrio de modo que la primera extremidad del dispositivo de ensayo quede en contacto con la mezcla y de modo que la segunda extremidad repose sobre la pared del frasco de cristal. Se deja migrar la mezcla so-bre el dispositivo de ensayo incubando el conjunto durante 2 -minutos a 47SC. La Tabla 4 que sigue a continuación recoge los resulta dos obtenidos para las 6 muestras ensayadas. Un valor de intensidad comprendido en el intervalo de 0 a 10 se atribuye a -bandas detectadas, dándose el valor de 10 a la banda más intejí sa y el valor 0 a la banda menos intensa. Según esta escala, se atribuye un valor 6 a la banda de referencia. La intensidad de la señal observada en la primera banda de detección es inversamente proporcional a la cantidad de Ceftiofur presente en la muestra.

Ceftiofur Intens:id,ad (ppb) 1 a. banda 2a. banda 0 10 6 20 6 6 30 5 6 40 4 0 50 3 6 60 3 6 En este ejemplo, cuando la primera banda tiene una intensidad menor que la de la segunda banda, el ensayo se considera como positivo. Los resultados presentados en la Tabla 4 muestran que este ensayo permite detectar en 20 minutos hasta 30 ppb de ceftiofur en una muestra de leche. Este ensayo realizado en 20 minutos permite por tanto en un solo ensayo detectar los antibióticos controlados actua_l_ mente por las autoridades europeas y americanas, hasta los límites legales impuestos por estas autoridades. Ejemplo 4. Utilización de un dispositivo de ensayo en un cárter de plástico.

Se utiliza un dispositivo de ensayo tal como el descrj_ to en el ejemplo 1.6. En este caso, la puesta en contacto -de la muestra con el dispositivo de ensayo se efectúa deposi-tando la mezcla incubada en la abertura en forma de cubeta prevista para este fin. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descrij) ción de la invención. . . ?.¿&Aí á2íY-

Claims (23)

1. R E I V I N D I C A C I O N E S Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindica ciones: 1.- Dispositivo de ensayo que permite la detección de la presencia de analitos en un producto lácteo líquido por mi -gración capilar tangencial de dicho producto lácteo, que com -prende un soporte sólido que posee una primera y una segunda -extremidad, sobre el cual están fijadas, sucesivamente, partían do de la primera extremidad, una membrana que permite la purificación del líquido anal izado. una membrana sobre la que se encuentran inmoviliza - das una o varias substancias de captura y - una membrana absorbente. caracterizado porque la membrana es capaz de retener las substancias presentes en el producto lácteo, que impiden la migración sobre el dispositivo de ensayo de los analitos presentes eventualmente en el producto lácteo y de los reactivos de de-tección utilizados según el método empleado, y durante la migración capilar tangencial de la muestra tras el remojo de la primera extremidad del dispositivo de ensayo en el producto -lácteo analizado.
2. 2.- Dispositivo según la reivindicación 1, caracte-rizado porque la membrana es la membrana Leukosorb.
3. 3.- Dispositivo de ensayo según las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque posee además una membrana sobre la que se ha depositado al menos un reactivo, estando situada la -membrana antes de la otra membrana.
4. 4.- Dispositivo de ensayo según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las membranas están recubiertas completa o parcialmente por una película de plástico adhesiva.
5. 5.- Dispositivo de ensayo según la reivindicación 4, caracterizado porque la película de plástico no recubre los primeros milímetros del dispositivo de ensayo.
6. 6.- Dispositivo de ensayo según las rei virldicac iones 1 a 4, caracterizado porque está colocado ^fr una caja de plástico que presenta una abertura en forma de cubeta por encima -de la membrana y una ventana de abertura por encima de la mem-brana.
7. 7.- Procedimiento para la detección de analitos en -un producto lácteo líquido, que utiliza un dispositivo de ens yo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 así como reactivos de detección caracterizado porque comprende las si -guientes etapas: a) la puesta en contacto de un volumen determinado de producto lácteo con el dispositivo de ensayo según la presente invención, teniendo lugar esta puesta en contacto en la primera extremidad del dispositj_ vo de ensayo, ^^^^^^^^^^^^^^^ite^^^^^^^^^^^^^g?&jg^g^*«^ b) la migración tangencial por capilaridad del producto lácteo sobre el dispositivo de ensayo de modo que los analitos y los reactivos de detección pre - sentes eventualmente en el producto lácteo pasen de forma progresiva sobre la membrana, después sobre la otra membrana y de modo que los constituyentes del producto lácteo no detenidos por las membra ñas lleguen a la última membrana, y c) la determinación de una fijación sobre la membrana.
8. 8.- Procedimiento según la reivindicación 7, carácter^ zado porque los reactivos de reacción comprenden al menos una substancia capaz de reconocer específicamente al analito o a una substancia análo'ga de este analito y al menos a un agente de mar cado.
9. 9.- Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque al menos una substancia capaz de reconocer específicamente el analito o a una substancia análoga de este analito está acoplada al menos con un agente de marcado.
10. 10.- Procedimiento según las reivindicaciones 8 o 9, caracterizado porque el agente de marcado es fluorescente, particular, radioactivo, luminiscente o enzimático.
11. 11.- Procedimiento según las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque se añade al menos un reactivo de detección antes de la etapa a) .
12. 12.- Procedimiento según la reivindicación 11, carac- ^l^Aaat^aflauaafaaa^^-,^^.^.^-. _- -^»^. „., , ¡-^aMaaaiis »^.-^ ¡, ~ terizado porque la mezcla preparada antes de la etapa a) se mantiene en condiciones de incubación permitiendo a uno de los reactivos de detección formar un complejo estable y esencialme_n te irreversible con el analito o con una substancia análoga de este analito.
13. 13.- Procedimiento según las reivindicaciones 8 a 12, caracterizado porque los reactivos de detección comprenden además al menos una substancia de referencia.
14. 14.- Procedimiento según las reivindicaciones 7 a 13, caracterizado porque el analito es una tetraciclina, tal como la tetraciclina, la oxitetraciclina o la clortetraciclina.
15. 15.- Procedimiento según las reivindicaciones 7 a 13, caracterizado porque el analito es, por una parte, una proteina exógena del producto lácteo, por ejemplo una proteína extraña o, por otra parte, una proteína endógena del producto lácteo, por ejemplo una hormona como la progesterona o la hormona de -crecimiento.
16. 16.- Procedimiento según las reivindicaciones 7 a -13, caracterizado porque el analito es un antibiótico con nú-cleo ß -lactama.
17. 17.- Procedimiento según la reivindicación 7 a 13,-caracterizado porque el analito se elige entre el grupo constituido por benc i lpenici 1 ina (penicina G) , ampicilina, amoxicilina, carbenici 1 ina , metilcilina, cloxacilina, 6-APA, mono-lactama, aztreonama, mecilinama, cefalexina, cefalogl icina , - jj^ggjg^í^ cefaloridina , nitrocefina, cefatoxima, cefuroxima, ceftiofur, -cefapirina, 7-ACA.
18. 18.- Procedimiento según las reivindicaciones 8 a 17, caracterizado porque la substancia capaz de reconocer específi-camente el analito o una substancia análoga del analito se elige entre los receptores capaces de formar un complejo estable y esencialmente reversible con el analito o una substancia análoga del analito y los anticuerpos monoclonales o policlonales e_s pecíficos del analito o de una substancia análoga del analito.
19. 19.- Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque la substancia capaz de reconocer específicamente al analito o a una substancia análoga del analito es un re -ceptor obtenido a partir de un microorganismo sensible a los a n tibióticos, tal como los receptores obtenidos a partir de las -especies Baci 11 us , Streptococus o Actino vcetes .
20. 20.- Procedimiento según las reivindicaciones 18 ó 19, caracterizado porque la substancia capa de reconocer específica mente el analito o a una substancia análoga del analito es un -receptor sensible a los antibióticos con núcleo ß-lactama obte nido a partir de Baci. lus Licheniformi s .
21. 21.- Procedimiento según la reivindicación 20, caracterizado porque el receptor sensible a los antibióticos con núcleo ß-lactama obtenido a partir de Bacillus 1 icherniformis es el receptor BIR o el receptor BlaR-CTD.
22. 22.- Procedimiento para la preparación de un disposi- tivo de ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - a 6, caracterizado porque se preparan tarjetas a partir del soporte sólido recubierto con un adhesivo y con membranas por me dio de un laminador, porque se depositan las soluciones de cap- tura sobre la membrana, y porque a continuación se cortan las - tarjetas en láminas, constituyendo cada una de estas láminas un dispositivo de ensayo
23. 23.- Estuche de ensayo, caracterizado porque comprende un dispositivo de ensayo según las reivindicaciones 1 a 6. DISPOSITIVO DE ENSAYO PARA LA DETERMINACIÓN DE ANALITOS EN UN PRODUCTO LACTO LIQUIDO RESUMEN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un dispositivo de ensayo para la determinación de analitos en un producto lácteo liquido por medio de migración capilar del producto lácteo, que comprende un soporte sólido (1) que posee una primera y una segunda extremidad, sobre el cuál están fijadas, sucesivamente, partiendo de la primera extremidad: una membrana (2) para purificar el liquido analizado, una membrana (3) sobre la cuál se encuentran inmovilizadas una o varias substancias de captura, y una membrana absorbente (4) . La invención también se refiere a un procedimiento para detectar y cuantificar analitos en un producto lácteo liquido por medio del dispositivo de ensayo y un estuche de ensayo que comprende dicho dispositivo de ensayo. t 'Mi li I MI - - ye^jcsjx xg^