DK161205B - Enzymatisk fremgangsmaade til bestemmelse af beta-lactamantibiotica indeholdende en beta-lactam-kerne og proeveudstyr til saadan bestemmelse - Google Patents

Description

i

DK 161205 B

Den foreliggende opfindelse angår en hurtig og sensibil enzymatisk fremgangsmåde til bestemmelse af antibiotica med en beta-lactam-kerne i en biologisk væske, såsom mælk, urin og blodserum.

5 Denne fremgangsmåde omfatter følgende trin: (1) inkubation af væsken med den opløselige D-alanyl-D-alanin-carboxypeptidase frembragt af stammen Actino-madura R 39 med deponeringsnummer 1-127 hos C.N.C.M., idet inkubationen gennemføres under betingelser, der 10 tillader beta-lactam-antibioticum'et, om til stede i nævnte væske, at reagere med enzymet under dannelse af et inaktivt og i det væsentlige irreversibelt ækvimolært enzym-antibioticum-kompleks, (2) inkubation af produktet opnået fra slutningen af trin (1) 15 med en substrat-opløsning under betingelser, der til lader substratet at blive hydrolyseret af enzymet under dannelse af en mængde D-alanin svarende til den resterende enzymaktivitet, (3) bestemmelse af den i trin (2) dannede mængde D-ala- 20 nin, og (4) sammenligning af bestemmelsen fra trin (3) med en standard til opnåelse af antibioticum-koncentratio-nen i den biologiske væske.

25 Opfindelsen tilvejebringer også et prøveudstyr, der kan anvendes til gennemførelse af denne fremgangsmåde.

Antibiotica er meget anvendt ikke blot som terapeutiske midler ved behandling af infektionssygdomme forårsaget af bakterier, men også som præserveringsmidler for 30 fødevarer og som additiver i dyrefoder til vækststimulering. Der er derfor et stadigt stigende behov for at kunne påvise tilstedeværelse af antibiotica, selv i meget lave koncentrationer, i komplekse biologiske væsker, såsom mælk, urin, blod, serum, spyt, kødekstrakter og gæ-35 ringsvæsker.

DK 161205 B

2

Tilfældet med mælkeproduktion er et eksempel herpå.

Det er velkendt at anvende penicilliner til behandling af visse infektionssygdomme hos mælkeproducerende besætninger, for eksempel mastitis. Af medicinske grunde skal i-5 midlertid mælk, der er beregnet til menneskeføde, i princippet være fri for ethvert spor af antibiotica. Koncentrationer af penicillin på 0,005 I.E./ml eller mindre kan endvidere have ugunstige virkninger under fremstillingen , af produkter afledt af mælk, såsom ost, yoghurt og lig- ' 10 nende.

Det er derfor nødvendigt at være i stand til hurtigt og nøjagtigt at bestemme koncentrationen af penicilliner i den af en besætning producerede mælk og fortrinsvis at være i stand til at foretage denne bestemmelse di-15 rekte på produktionsstedet på gården.

Mikrobiologiske fremgangsmåder, der gør det muligt at bestemme relativt lave koncentrationer af beta-lactam-antibiotica i biologiske væsker, har længe været kendt.

Disse fremgangsmåder er baseret på måling af væksthæmnin-20 gen hos mikroorganismer, der er sensibile over for antibiotica i nærværelse af en prøve af den biologiske væske. Disse fremgangsmåder kræver imidlertid en betydelig tid og høj grad af teknisk fagkundskab. I bedste fald er den tid, der kræves til opnåelse af et resultat, på ca. 2 til 25 3 timer, hvilket er uantageligt i praksis.

Der er nyligt foreslået en hurtig mikrobiologisk fremgangsmåde til påvisning af tilstedeværelse af antibiotica i en biologisk væske, navnlig mælk (jf. US-pa-tentskrift 4.239.852).

30 Ifølge nævnte fremgangsmåde bliver den væskeprøve, der skal undersøges, inkuberet dels med celler eller celledele af en mikroorganisme, der er meget sensibil over for antibiotica, navnlig Bacillus stearothermophilus, og dels med et antibioticum mærket med et radioaktivt ele-35 ment eller med et enzym. Under inkubationen konkurrerer

DK 161205 B

3 det antibiotiske stof, om til stede i prøven, og det mærkede antibioticum med hensyn til at blive bundet til cellernes eller celledelenes receptorsteder. Den mængde mærket antibioticum, der er bundet til cellerne eller celle-5 delene, bestemmes derefter. Dette giver en indikation for tilstedeværelse (eller fraværelse) af antibiotica, da den mængde mærket antibioticum, der er bundet, er omvendt proportional med koncentrationen af antibioticum i prøven.

Ifølge nævnte US-patentskrift gør nævnte fremgangs-10 måde det muligt at påvise antibioticum-koncentrationer så lave som 0,01 I.E./ml eller endog 0,001 I.E./ml i mælk på lidt mindre end 15 minutter.

Den væsentligste ulempe ved nævnte fremgangsmåde er- imidlertid, at det til opnåelse af nævnte resultat er u- 15 omgængeligt at anvende et antibioticum mærket med et ra- 14 125 dioaktivt element (C eller I), og dette skal bestemmes ved hjælp af et specielt instrument, for eksempel en scintillationstæller. Endvidere er håndtering af radioaktive materialer selv i meget små mængder ikke helt uden 20 risiko for den person, der gennemfører analysen.

I Eksempel 2 af nævnte US-patentskrift er ganske vist beskrevet en anden udførelsesform for nævnte fremgangsmåde, ved hvilken et enzym-mærket antibioticum anvendes, og ved hvilken mængden af mærket antibioticum be- 25 stemmes ved en visuel kolorimetrisk metode. Denne variant gør det imidlertid kun muligt at påvise, om der er mere (eller mindre) end 0,05 I.E./ml af penicillin i en mælkeprøve. Nævnte fremgangsmåde er derfor tydeligt mindre sensibil og derfor langt mindre anvendelig.

30 N.FUAD et al. (Biochem. J. J55, (1976), 623-629) beskriver vekselvirkningen mellem beta-lactam-antibioti-ca og den exocellulære D,D-carboxypepsidase-transpep-sidase fra Streptomyces R39 ved hjælp af en tretrins reaktionsmodel. Det er muligt at benytte værdierne for 35 de kinetiske konstanter i forbindelse med reaktionen til opnåelse af en fysisk basis for spektret af den antibiotiske aktivitet.

4

DK 161205 B

Artiklen påviser, at Streptomyces R39 er mere følsom for beta-lactam-antibiotica end et tilsvarende enzym fra Streptomyces R61, og viser yderligere, at et vigtigt træk ved R39 enzymet er en overordentlig hurtig dannelse 5 af et inaktivt enzym-beta-lactam-antibiotica kompleks med en meget lang halveringstid, hvorfor nedbrydning af komplekset ved inkubering under tilstedeværelse af et substrat er ubetydelig og ikke påvirker måling af rest-enzymaktivitet.

10 Baseret på den kinetiske reaktionsmodel i oven nævnte artikel beskrives i en nylig publikation en enzymatisk fremgangsmåde, der gør det muligt at bestemme lave koncentrationer af beta-lactam-antibiotica i humane sera og i mælk (J-M FRERE, D. KLEIN og J-M. GHUYSEN, Antimi-15 crobial Agents and Chemotherapy, J_8, ( 1980, nr. 4), 506-510).

Nævnte fremgangsmåde (i det følgende betegnet "J- M.FRERE-metoden") er langt værdifuldere, fordi den ikke gør det nødvendigt at anvende radioaktive materialer, der 20 kræver forfinede måleinstrumenter, og samtidigt er meget hurtig og bemærkelsesværdigt nøjagtig. Nævnte fremgangsmåde er baseret på anvendelse af et specifikt enzym, dvs. den opløselige exocellulære D-alanyl-D-alanin-carboxy-peptidase, der produceres af Actinomadura R 39 (tidligere 25 betegnet Streptomyces R 39). I den foreliggende beskrivelse betegnes dette enzym "enzym R 39". Som dets navn angiver, udviser enzym R 39 en specifik aktivitet for hydrolysen af D-alanyl-D-alanin-endegrupperne hos forskellige peptider. Eksempelvis undergår tripeptidet ΝαΝε-30 diacetyl-L-lysyl-D-alanyl-D-alanin en hydrolysereaktion

DK 161205 B

5 under den katalytiske indvirkning af enzym R 39 ifølge ligningen: ^ v enzym AC2“L-Lys-D-Ala-D-Ala + H20 -* ACj-L-Lys-D-Ala + D- alanin 5 Et andet vigtigt karakteristikum for enzym R 39 er, at det reagerer med beta-lactam-antibiotica under meget hurtig dannelse af et ækvimolært enzym-antibioticum-kom-pleks, der er intaktivt og i det væsentlige irreversibelt.

Ved J-M.FRERE-metoden udnyttes nævnte egenskaber 10 hos enzym R 39 til at bestemme meget lave koncentrationer af beta-lactam-antibiotica. Nævnte metode omfatter tre væsentlige trin. I et første trin bliver et bestemt volumen af en prøve af den væske, der skal undersøges, inkuberet med en bestemt mængde af enzym R 39. Inkubationen 15 gennemføres under betingelser, der tillader beta-lactam-antibioticum'et, om til stede i prøven, at reagere med enzymet under dannelse af et inaktivt og i det væsentlige irreversibelt ækvimolært enzym-antibioticum-kompleks.

I et andet trin bliver en bestemt mængde substrat, 20 for eksempel Na,Ne-diacetyl-L-lysyl-D-alanyl-D-alanin, inkuberet med produktet vundet i det første trin, under betingelser, der tillader substratet at blive hydrolyseret af enzymet under dannelse af en mængde D-alanin svarende til den resterende enzymaktivitet af enzymet R 39, 25 der ikke er kompleksbundet med antibioticum’et i det første trin.

I et tredie trin bestemmes mængden af således dannet D-alanin. Det er klart, at en til mængden af antibio-ticum, der er til stede i prøven, svarende mængde af en-30 2ym r 39 vil blive inaktiveret i det første trin, og at mængden af D-alanin dannet i det andet trin (der klart afhænger af den resterende aktivitet af enzymet) derfor er omvendt proportional med mængden af antibioticum til stede i prøven. Hvis for eksempel prøven er fri for anti-35 bioticum, inaktiveres enzym R 39 ikke, og mængden af D-alanin fundet svarer til den totale aktivitet af det an-

DK 161205 B

6 vendte enzym R 39. Hvis på den anden side prøven indeholder en molær mængde antibioticum, der er lig eller større end den molære mængde af anvendt enzym R 39, bliver sidstnævnte fuldstændigt inaktiveret af antibiotucum'et, 5 og der dannes intet D-alanin. Mellem disse to ekstreme situationer svarer den fundne mængde D-alanin til den procentuelle resterende aktivitet af enzymet R 39. Mængden af dannet D-alanin er med andre ord et nøjagtigt kvantitativt udtryk for den i forsøgsprøven tilstedevæ-10 rende antibioticum-koncentration.

Ved J-M.FRERE-metoden bestemmes nævnte mængde D-alanin ved en enzymatisk metode. Denne er baseret på to koblede enzymatiske reaktioner. Ved den første reaktion oxideres D-alaninet til pyrodruesyre ved hjælp af en D-15 aminosyre-oxidase (sammen med dens coenzym, flavin-ade-nin-dinucleotid) , og samtidig dannes en tilsvarende mængde hydrogenperoxid ud fra luftens oxygen. Ved den anden reaktion anvendes det dannede hydrogenperoxid til at oxidere o-dianisidin ved hjælp af en peroxidase.

20 Dette er grunden til, at der i det tredie trin af J-M.FRERE-metoden foretages inkubation af blandingen vundet i det andet trin med en række reagenser omfattende en D-aminosyre-oxidase, dens coenzym (flavin-adenin-dinucle-otid (FAD)), en peroxidase og o-dianisidin. Da den oxide-25 rede form af o-dianisidin er farvet, fremkommer en brun farvning ved afslutningen af denne inkubation, og intensiteten af farvningen er en funktion af mængden af D-alanin.

Dette gør det således muligt at bestemme mængden af 30 D-alanin ved en kolorimetrisk metode, enten visuelt eller ved måling af den optiske tæthed på et spektrofotometer Umax = 460 nm) .

Ved fremstilling af en række prøver med en kendt antibioticum-koncentration og anvendelse af nævnte metode 35 er det således muligt at optegne en standardkurve, der stiller den procentuelle resterende enzymaktivitet af enzym R 39 i relation til antibioticum-koncentrationen.

DK 161205 B

7

Til opnåelse af et kvantitativt mål for antibioticum-koncentrationen i en prøve følges derefter nøjagtigt samme metode, og antibioticum-koncentrationen bestemmes ved hjælp af nævnte standardkurve. Denne kvantitative 5 bestemmelse kræver naturligvis anvendelse af et spektro-fotometer.

For at bestemme, om antibioticun-koncentrationen overstiger en vis kritisk værdi, er det imidlertid ikke nødvendigt at anvende et spektrofotometer eller andet 10 lignende måleinstrument. Det er tilstrækkeligt på forhånd at kende den kritiske antibioticum-koncentration, ved hvilken aktiviteten af enzym R 39 fuldstændigt undertrykkes, eller, med andre ord, den antibioticum-koncentration, ved hvilken intet D-alanin dannes, og der følgelig 15 ikke opstår nogen farvning ved afslutningen af den endelige inkubation. Med kendskab til denne kritiske koncentration er det klart muligt ved hjælp af en simpel visuel undersøgelse af bestemmelsesresultatet at vurdere, hvorvidt en given prøve indeholder en lavere eller højere an-20 tibioticum-koncentration end nævnte kritiske koncentration. Ved nævnte metode kan der derfor fås en hurtig og nøjagtig indikation for antibioticum-koncentrationen i mælk uden anvendelse af et specialinstrument.

Nævnte fremgangsmåde gør det endvidere muligt at 25 bestemme relativt lave koncentrationer af beta-lactam-antibioticum i mælk og i humane sera. Således er det for eksempel muligt ved at gå ud fra mælkeprøver med et volumen på ca. 20 μΐ og inkubere dem med 3 picomol af enzym R 39 kvantitativt (ved anvendelse af et spektrofotometer) 30 at bestemme penicillin-koncentrationer så lave som 0,02 I.E./ml mælk og kvalitativt, ved den ovennævnte visuelle metode, at bestemme koncentrationer på mere end 0,09 I.E.

/ml mælk på mindre end en time.

J-M.FRERE-metoden har imidlertid adskillige alvor-35 lige ulemper.

DK 161205 B

8

For det første er det til bestemmelse af antibio-tica i biologiske væsker, såsom mælk og serum, absolut nødvendigt først at fjerne de stoffer, der forstyrrer den kolorimetriske bestemmelse, fra forsøgsprøven. I tilfælde 5 af for eksempel mælk er det nødvendigt først at fælde proteinerne med citronsyre eller løbe og derefter filtrere den således behandlede prøve for at vinde et klart filtrat, der ikke længere kan forstyrre den kolorimetriske bestemmelse. Denne operation med fældning af protei-10 nerne er kompliceret og tidsrøvende, hvilket betyder, at processen ikke let kan gennemføres af ufaglærte på stedet for mælkeproduktionen.

For det andet er sensibiliteten af J-M.FRERE-metoden, navnlig i tilfælde af biologiske væsker (mælk, spyt, 15 serum og lignende), utilstrækkelig. Det er rigtigt, at denne sensibilitet kan forøges ved at nedsætte mængden af anvendt enzym R 39. Hvis for eksempel der anvendtes 0,3 picomol enzym i stedet for 3 picomol, ville det teoretisk være muligt at bestemme antibioticum-koncentrationer, der 20 er ti gange lavere. Når mængden af enzym nedsættes, er det imidlertid også nødvendigt, i samme forhold, at forøge dels reaktionstiden mellem antibioticum'et og enzym R 39 og dels hydrolysetiden for substratet. Dette betyder, at både det første og det andet trin af metoden ta-25 ger ca. ti gange længere tid.

En af de væsentligste fordele ved J-M.FRERE-meto-den, nemlig dens hurtighed, ville således gå tabt, og dette er uantageligt.

Der kunne også gøres forsøg på at forøge sensibili-3C teten ved at forøge volumenet af den prøve, der skal inkuberes med enzym R 39. Hvis der for eksempel anvendtes en prøve med et volumen på 200 μΐ i stedet for 20 yl, ville det teoretisk være muligt at bestemme antibioticum-koncentrationer, der er ti gange lavere. I dette tilfælde 3- ville det endvidere kun være nødvendigt at forøge reaktionstiden mellem antibioticum'et og enzym R 39, dvs. kun varigheden af metodens første trin.

9

DK 161205 B

Det er imidlertid ikke muligt at forøge sensibiliteten af J-M.FRERE-metoden på denne måde, navnlig ikke i tilfælde af komplekse væsker af biologisk oprindelse.

Det har i virkeligheden vist sig umuligt at gennemføre en passende bestemmelse, hvis volumenet af den biologiske 5 væskeprøve overstiger et vist kritisk volumen, der varierer med arten af den biologiske væske. Hvis således i tilfælde af mælk prøvevolumenet, der underkastes inkubation, overstiger ca. 20 yl, viser det sig, at mængden af dannet oxideret o-dianisidin nedsættes betydeligt. Det samme gælder for serum, hvis prøvevolumenet, der inkuberes med enzym R 39, overstiger ca. 50 yl.

Endelig påvises i tilfælde af urin ingen enzymatisk aktivitet selv ved anvendelse af prøvevolurnener så lave } som 10 yl. Det er derfor umuligt at anvende nævnte metode ^ til bestemmelse af antibiotica i urin.

Det antages, at biologiske væsker indeholder stoffer, der hæmmer virkningen af de til metoden anvendte enzymer. Det er således umuligt at anvende store prøvevolumener.

90

Af denne grund er der nu udviklet en hidtil ukendt fremgangsmåde til bestemmelse af beta-lactam-antibiotica i en biologisk væske, hvilken fremgangsmåde har den fordel, at den ikke viser de forskellige ulemper, der knytter sig til de kendte metoder.

^ Det har i forbindelse med den foreliggende opfin delse vist sig muligt at afhjælpe de forskellige ulemper ved J-M.FRERE-metoden ved at immobilisere enzym R 39 på en vanduopløselig bærer, navnlig på en poly(N,N-dimethyl-acrylamid)-harpiks.

30 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er således ejendommelig ved, at det anvendte enzym er inmobiliseret på en vanduopløselig bærer, og at dette immobiliserede enzym skilles fra den biologiske væske og vaskes, før den inkuberes med substratopløsningen i trin (2).

I modsætning til J-M.FRERE-metoden gør fremgangsmå-35 den ifølge den foreliggende opfindelse det muligt at gennemføre en bestemmelse direkte på den biologiske væske som sådan. Det er ikke nødvendigt på forhånd fra forsøgsprøverne at fjerne de stoffer, der er i stand til at for-

DK 161205B

ίο styrre den kolorimetriske bestemmelse.

Da enzym R 39 er immobiliseret på en vanduopløselig bærer, kan dette immobiliserede enzym, efter at det har reageret med antibioticum'et (om til stede i den biologi-5 ske væske), let skilles fra den biologiske væske ved simpel filtrering og vask. Under de efterfølgende operationer er der følgelig ikke længere mulighed for interferens fra den biologiske væske, da den allerede er fjernet i trin (1) af fremgangsmåden.

10 En af de væsentligste ulemper ved J-M.FKERE-metoden er herved afhjulpet.

Det har overraskende også vist sig, at det ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge den foreligggende opfindelse er muligt uden mindste vanskelighed at gennemfø-15 re udmærkede bestemmelser på prøvevolumener af biologisk væske på mellem 200 yl og 5 ml.

Dette er af fundamental betydning. Som ovenfor forklaret er det, ved stigende prøvevolumen, der skal inkuberes med enzym R 39, muligt at forøge sensibiliteten af 20 fremgangsmåden. Som allerede forklaret, er en af ulemperne ved J-M.FRERE-metoden, at det ikke er muligt at overskride et kritisk volumen (af størrelsesordenen 20 μΐ for mælk og 50 yl for serum) . Da denne ulempe afhjælpes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er det klart, at frem-25 gangsmåden ifølge opfindelsen, i modsætning til J-M.FEERE-metoden, gør det muligt at opnå en langt større sensibilitet ved bestemmelse af biologiske væsker, såsom mælk, serum og lignende. Som nedenfor påvist i eksemplerne, gør fremgangsmåden ifølge opfindelsen det således muligt, 30 startende fra mælkeprøver på 1 ml, visuelt og med sikkerhed at bestemme koncentrationer af penicillin G på mere end 0,002 I.E./ml (1,2 ng/ml) mælk og, ved hjælp af et spektrofotometer, koncentrationer så lave som 0,0005 I.E.

/ml (0,3 ng/ml) mælk, inden for tidsrum på mindre end en 35 time. Til sammenligning skal erindres, at fremgangsmåden beskrevet i US-patentskrift 4.239.852 gør det muligt at påvise koncentrationer af størrelsesordenen 0,01 til 0,001 I.E./ml mælk, forudsat imidlertid at der anvendes ti

DK 161205 B

radioaktive materialer og en scintillationstæller.

Det har også vist sig, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen er velegnet til bestemmelse af antibiotica ikke blot i mælk og serum, men også i andre komplekse 5 biologiske væsker, for eksempel urin, blod, spyt, kødekstrakter og gæringsvæsker. Set i dette lys repræsenterer fremgangsmåden ifølge opfindelsen en betydelig fordel sammenlignet med J-M.FRERE-metoden.

Den væsentligste fordel ved fremgangsmåden ifølge 10 opfindelsen er derfor, at den gør det muligt hurtigt at påvise meget lave koncentrationer af beta-lactam-antibio-tica for eksempel af størrelsesordenen 0,002 I.E./ml i vidt forskellige biologiske væsker, uden at der skal anvendes et analytisk specialinstrument.

15 De antibiotica, hvis koncentration kan bestemmes ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, hører til den gruppe antibiotica, der karakteriseres ved tilstedeværelse af en beta-lactamring i deres molekyle, dvs. i princippet alle penicilliner og 20 cephalosporiner. Eksempler på penicilliner, der kan nævnes, omfatter benzylpenicillin (penicillin G), ampicil-lin, phenoxymethylpenicillin, carbenicillin, methicillin, oxacillin, cloxacillin og lignende, og eksempler på cephalosporiner, der kan nævnes, omfatter cephalosporin C, 25 cephaloglycin, cephalothin, cephalexin og lignende. Særligt gunstige resultater er opnået med penicillin G.

I trin (1) af fremgangsmåden ifølge opfindelsen inkuberes et bestemt volumen af en prøve af en biologisk væske med en bestemt mængde enzym R 39, der er immobili-30 seret på en vanduopløselig bærer.

Som ovenfor forklaret er det, da enzym R 39 er im-mobiliseret på en vanduopløselig bærer, muligt at arbejde med meget store prøvevolumener. Ved at forøge prøvevolumenet, forøges tilsvarende fremgangsmådens sensibilitet.

35 Ved for eksempel at fordoble prøvevolurnenet, fordobles sensibiliteten, ved tredobling af prøvevolumenet tredob-les sensibiliteten, osv. Det er derfor muligt at vælge prøvevolumenet i overensstemmelse med den ønskede sensi-

DK 161205B

12 bilitet. For eksempel i tilfælde af mælk kan fremgangsmådens sensibilitet tilpasses efter de standarder, der er fastsat af det lands lovgivning, hvori fremgangsmåden anvendes, eller efter mejeriindustriens krav.

5 Det er rigtigt, at den samme effekt også kan opnås ved at reducere mængden af enzym R 39. I dette tilfælde skal imidlertid ikke blot varigheden af trin (1) , men også varigheden af trin (2) af fremgangsmåden forøges proportionalt, mens ved forøgelse af prøvevolumenet kun va-10 righeden af trin (1) af fremgangsmåden påvirkes. Det foretrækkes derfor at operere med en konstant mængde af enzym R 39, for eksempel en mængde på ca. 3 picomol, og at tilpasse prøvevolumenet efter den under de foreliggende omstændigheder Ønskede sensibilitet.

15 I praksis anvendes prøvevolurnener på mellem 200 μΐ og 5 ml, hvilket gør det muligt at bestemme meget lave antibioticum-koncentrationer, for eksempel af størrelsesordenen 0,002 I.E./ml af penicillin, i løbet af en time eller mindre. Den udmærkede sensibilitet, hurtighed og 20 præcision af fremgangsmåden ifølge opfindelsen skyldes på den ene side de særlige karakteristika af enzym R 39 og på den anden side enzymets immobilisering på en vand-uopløselig bærer.

Enzym R 39 er karakteriseret ved: 25 - den meget hurtige dannelse af et inaktivt ækvimolært enzym-antibioticum-kompleks, - den usædvanlige stabilitet af nævnte kompleks, fordi det, når det først er dannet, kun nedbrydes meget langsomt (eksempelvis er halveringstiden for komplekset 30 dannet mellem enzym R 39 og penicillin G ca. 70 timer ved 37°C), og - en udmærket enzymaktivitet resulterende i meget hurtig hydrolyse af D-alanyl-D-alanin-endegrupperne af peptidsubstratet.

35 Som følge af disse tre karakteristika indtager en zym R 39 en særstilling sammenlignet med de hidtil identificerede D-alanyl-D-alanin-carboxypeptidaser. Da nedbrydningstiden for enzym-antibioticum-komplekset er uen-

DK 161205 B

13 deligt meget længere end den totale tid, der er nødvendig for henholdsvis dannelse af komplekset og måling af den resterende enzymaktivitet, er der ingen fare for, at bestemmelsesresultaterne vil blive ændret af frigøringen 5 af aktivt enzym som følge af for tidlig nedbrydning af enzym-antibioticum-komplekset.

Undersøgelse af de hidtil kendte D-alanyl-D-alanin-carboxypeptidaser viser, at enzym. R 39 er det eneste, der fuldt ud opfylder nævnte betingelser, idet ellers enten 10 dannelseshastigheden for komplekset er ca. ti gange langsommere, eller stabiliteten af antibioticum-enzym-kom-plekset er helt utilstrækkelig, eller hydrolysehastigheden for peptidsubstratet er meget for langsom (dette er navnlig tilfældet med alle de membran-bundne endocellu-15 lære carboxypeptidaser).

Enzym R 39 er den specifikke, opløselige exocellu-lære D-alanyl-D-alanin-carboxypeptidase, der udskilles af Actinomadura R 39, når denne mikroorganisme (deponeret 10. juli 1981 i Institut Pasteur i Paris, under Nr.1-127) 20 dyrkes i et egnet dyrkningsmedium.

Til gennemførelse af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse skal dette enzym naturligvis være i det væsentlige rent. Dets fremstilling og rensning kan gennemføres ved metoderne beskrevet i litteraturen (i 25 denne sammenhæng kan henvises til artiklen af J-M.FRERE et al., Biochem.J.143, (1974), 233-240, med titlen "Molecular Weight, Amino Acid Composition and Physicochemical Properties of the Exocellular DD-Carboxypeptidase-Trans-peptidase of Streptomyces R 39"). Nævnte enzym er imid-30 lertid nu kommercielt tilgængeligt i ren tilstand og kan fås fra UCB BIOPRODUCTS, S.A. (Belgien).

Ifølge den foreliggende opfindelse immobiliseres enzym R 39 på en vanduopløselig bærer.

Den til denne immobilisering anvendte metode er 35 ikke kritisk. Alle de på området kendte konventionelle metoder kan derfor anvendes til dette formål, men der kan blandt disse metoder særligt nævnes dem, der indebærer enten binding af enzymet til bæreren ved en covalent bin-

DK 161205 B

14 ding eller fysisk adsorption af enzymet til bæreren eller indfangning af enzymet i en polymermatrice.

Arten af bærematerialet er heller ikke kritisk. I princippet er det muligt at anvende ethvert organisk el-5 ler uorganisk vanduopløseligt materiale, der er almindeligt benyttet til immobilisering af et enzym. Egnede bærematerialer, der kan nævnes, omfatter naturlige polymere, såsom cellulose og dets derivater, agarose, stivelse og dets derivater, dextran, collagen, keratin og lignen-10 de, syntetiske polymere, såsom tværbundne polyacrylamider i form af perler eller geler, tværbundne polystyrener, ethylen-maleinsyreanhydrid-copolymere, polyamider, tværbundet poly(2-hydroxyethyl-methacrylat), ionbytterhar-pikser og lignende, og de uorganiske stoffer, såsom glas, 15 aluminiumoxid, silica, calciumcarbonat, hydroxyapatit, lerarter og lignende.

Det er imidlertid klart, at det er nødvendigt at vælge en immobiliseringsmetode, der efterlader alle egenskaberne af enzym R 39 intakte, og som på ingen måde på-20 virker dets enzymaktivitet selv efter en lang lagringsperiode .

Et bæremateriale, der er særligt foretrukket til gennemførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er tværbundet poly(Ν,Ν-dimethylacrylamid) —harpiks, hvis an-25 vendelse tidligere er foreslået ved syntesen af polypep-tider i fast fase (jf. R.ARSHADY et al., J.Chem.Soc.Chem. Commun., 1979, Nr.9, 423-425). Denne harpiks har den fordel, at den let kan kvældes i mange forskellige både organiske og vandige opløsningsmidler (vand, methanol, N,N-30 dimethylformamid, Ν,Ν-dimethylacetamid, pyridin eller di-chlormethan) og også let kan håndteres. Den fremstilles fortrinsvis ved emulsionscopolymerisation af en blanding af Ν,Ν-dime thy lacry lamid, N,N*-ethylen-bis-acrylamid og methylestren af N-acryloylsarcosin.

35 Under disse betingelser foreligger den vundne har piks i form af faste partikler, for eksempel kugler eller perler, hvis størrelse fortrinsvis ligger mellem 0,1 mm og 2 mm, og som derfor let kan frafiltreres.

DK 161205B

15

Denne harpiks har en tredimensional tværbundet struktur, da polymerkæderne er bundet til hinanden af Ν,Ν-ethylen-bis-acrylamidet (der fungerer som et tværbindingsmiddel) , og den bærer også estergrupper på grund 5 af indføringen af methylestren af N-acryloylsarcosin (CH2=CH-CO-N(CH3)-CH2-COOCH3) i polymerkæderne.

Når polymerisationen af denne harpiks er afsluttet, bliver estergrupperne, der bæres af denne harpiks, også omdannet til funktionelle aminogrupper ved omsætning med 10 ethylendiamin ifølge ligningen:

Polymer-C-N-CH2-COOCH3 + H2N-(CH2)2“NH2 -> o ch3

Polymer-C-N-CH0-CO-HN- (CH-,) 0-NH0 Il I 2 2 2 2 15 O CH3

Den på denne måde modificerede poly (N,N-dimethyl-acrylamid)-harpiks indeholder i almindelighed fra 0,2 til 1 millimol ethylendiamin pr.gram harpiks. I denne form 20 udgør den et ideelt bæremateriale for immobiliseringen af enzym R 39.

Denne immobilisering gennemføres fortrinsvis ved at binde enzym R 39 til harpiksen ved en covalent binding. I modsætning til de andre immobiliseringsmetoder 25 gør denne metode det muligt at forebygge udludning af enzymet fra bæreren.

Den covalente binding af enzym R 39 til poly(N,N-dimethylacrylamid)-harpiksen, der er modificeret med ethylendiamin på den lige forklarede måde, kan gennem-30 føres for eksempel ved hjælp af et egnet koblingsmiddel indeholdende en funktionel gruppe, der kan reagere med de funktionelle aminogrupper fra poly(N,N-dimethylacryl-amid)-harpiksen, og en anden funktionel gruppe, der kan reagere med de frie aminogrupper fra enzym R 39.

35 Det foretrækkes at anvende koblingsmidler, der in deholder estergrupper med en tilstrækkelig lang halveringstid i et vandigt medium, for eksempel N-hydroxysuc-cinimiddiestrene af en aliphatisk dicarboxylsyre indehol-

DK 161205B

16 dende 4-9 carbonatomer, såsom glutarsyre, suberinsyre eller lignende. Da koblingsreaktionen med de frie amino-grupper fra enzym R 39 gennemføres i et vandigt medium, skal de funktionelle grupper fra koblingsmidlet være 5 tilstrækkeligt stabile i dette medium.

For at binde enzym R 39 til poly(Ν,Ν-dimethylacryl-amid) -harpiksen modificeret med ethylendiamin omsættes denne harpiks først med en N-hydroxy-succinimiddiester i et egnet organisk opløsningsmiddel (for eksempel N,N-di- 10 methylacetamid) for at hindre hydrolyse af estergrupperne. Ved hjælp af denne reaktion omdannes de funktionelle aminogrupper fra harpiksen til funktionelle estergrupper ifølge ligningen: 15 Polymer-C-N-CHo-C0-HN-(CH0)0-NH_ + II I 2 2 2 2 0 ch3 ch2-co ^co-ch9 1 ^N-0-C0-(CH2) -co-o-n j —> CH--CO V'CO-CH0 20 *

Polymer-C-N-CH 0-CO-HN-(CH0)o-NH-C0-(CH~) -CO-O-N + |||2 22 2n / \

O ch3 CO CO

.CO-CH- CHrCH2

HO-N I

25 "C0-CH2 (n = helt tal fra 2 til 7).

Koblingen mellem enzym R 39 og harpiksen gennemføres derefter ved at omsætte de funktionelle estergrupper, 30 der er indført i denne harpiks af N-hydroxysuccinimid-estren, med de frie aminogrupper fra enzym R 39 ifølge ligningen: l \

DK 161205 B

17 CO-CH

Polymer-C-N-CH,-CO-HN-(CH,),-NH-CO-(CH,) -CO-O-l/ I 2 + O CH3 2 2 2 n '“-«2 H2N-enzym R 39 -^ 5

Polymer-C-^-CH2-CO-HN- (CH2) 2-NH-CO- (cVn“C0“NH“en2ym R 39f /CO-CH-HO-N I i 10 "C°-CH2 (n = helt tal fra 2 til 7) .

Koblingsreaktionen mellem enzym R 39 og harpiksen forløber gennem adskillige timer ved en temperatur på 15 fra 0 til 20°C og i en egnet puffer til indstilling af pH på en værdi fra 7 til 8,5, fortrinsvis af størrelsesordenen 7,7. Det er klart, at denne puffer skal være fri for primære aminer, der er i stand til at reagere med de funktionelle estergrupper fra harpiksen.

20 Efter endt koblingsreaktion blokeres de ikke-omsat- te estergrupper med aminogrupperne fra sådanne forbindelser som ethanolamin eller methylestren af glycin. Det herved vundne immobiliserede enzym vaskes med en egnet puffer og kan anvendes som sådant til gennemførelse af 25 fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Ved anvendelse af denne fremgangsmåde er udbytterne ved immobiliseringen udmærkede. De kan variere mellem 15 og 95% alt efter pH af den anvendte puffer og også varigheden og temperaturen af koblingsreaktionen.

30 Et detaljeret eksempel, der illustrerer denne immo biliseringsmetode for enzym R 39 på en poly (N,N-dimethyl-acrylamid)-harpiks, er anført nedenfor:

Immobilisering af enzym R 39 på en poly(N,N-dimethyl-acrylamid)-harpiks: 35 a) Fremstilling af poly (Ν,Ν-dimethylacrylamid)-harpiksen bærende funktionelle aminogrupper afledt af ethylen-diamin.

Den som bærer anvendte poly(Ν,Ν-dimethylacrylamid)-

DK 161205 B

18 harpiks blev fremstillet ved emulsionscopolymerisaticn af en blanding af Ν,Ν-dimethylacrylamid (12 g), N,N'-ethylenbisacrylamid (1 g) og methylestren af N-acryl-oylsarcosin (1#4 g) ved metoden beskrevet af R.ARSHADY 5 et al., (J.Chem.Soc.Chem.Commun.1979, Nr.9, 423-425).

Dette gav ca. 12 til 13 g harpiks i form af perler med en størrelse på fra 0,1 mm til 2 mm.

Af denne harpiks blev 10 g sat til 320 ml ethylendi-amin, og den vundne blanding blev omrørt natten over 10 ved stuetemperatur. Harpiksen blev derefter frafiltreret og vasket successivt med Ν,Ν-dimethylformamid og vand, indtil filtratet havde en neutral pH-værdi. Til slut blev harpiksen vasket med methanol og henstillet i diethylether for at reversere kvældningen. Dette gav 15 10 g harpiks indeholdende 0,3 millimol ethylendiamin pr.gram.

b) Fremstilling af poly(Ν,Ν-dimethylacrylamid) -harpiksen bærende funktionelle estergrupper afledt af N-hydroxy-succinimiddiestren af glutarsyre.

20 b.l) Fremstilling af N-hydroxysuccinimiddiestren af glutarsyre.

6,7 g Glutarsyre og 12,7 g N-hydroxysuccinimid blev opløst i 50 ml Ν,Ν-dimethylacetamid ved 0°C.

En opløsning af 23,7 g dicyclohexylcarbodiimid i 25 50 ml methylenchlorid blev tilsat dråbevis. Reak tionsblandingen fik lov at genantage stuetemperatur og blev efter henstand natten over filtreret, og filtratet blev inddampet. Inddampningsresten blev omkrystalliseret af diethylether. Herved 30 vandtes N-hydroxysuccinimiddiestren af glutarsyre i så at sige kvantitativt udbytte. b.2) Fremstilling af poly (Ν,Ν-dimethylacrylamid)-harpiksen bærende funktionelle estergrupper.

500 mg Poly (Ν,Ν-dimethylacrylamid)-harpiks bæren-35 de funktionelle aminogrupper afledt af ethylendi amin, fremstillet som beskrevet under a), blev suspenderet i 50 ml Ν,Ν-dimethylacetamid. Der blev .tilsat 2 g af N-hydroxysuccinimiddiestren af

DK 161205 B

19 glutarsyre (fremstillet som beskrevet under b.,11).

Den vundne blanding blev omrørt i 24 timer ved stuetemperatur. Reaktionens fuldendelse blev bekræftet ved prøven ifølge E.KAISER (Anal.Biochem.

5 34, (1970, Nr.2), 595-598). Harpiksen blev fra filtreret og vasket fem gange med 100 ml N,N-di-methylacetamid og fem gange med 100 ml methanol, og harpiksen blev henstillet i diethylether for at reversere kvældningen.

10 c) Immobilisering af enzym R 39 på poly(Ν,Ν-dimethylacryt amid)-harpiksen bærende funktionelle estergrupper afledt af N-hydroxysuccinimiddiestren af glutarsyre.

c.l) Fremstilling af enzym R 39.

Det anvendte enzym R 39 blev fremstillet og ren-15 set ved metoden beskrevet i artiklen af J-M.FRERE

et al., (Biochem.J.143, (1974), 233-240).

Det på denne måde rensede enzym R 39 har en specifik aktivitet på 19,8 enheder/mg af protein.

Én enhed af enzym R 39 katalyserer hydrolysen af 20 1 ymol Na,Ne-diacetyl-L-lysyl-D-alanyl-D-alanin pr.minut ved 37°C, når enzymet inkuberes med en 8 mM opløsning af dette substrat i en 0,03 M Tris-HCl-puffer (pH 7,5) suppleret med 3 mM MgCl2.

25 600 yg Renset enzym R 39, opløst i 1 ml 0,1 M

Tris-HCl-puffer (pH 7,7) indeholdende 0,2 M NaCl og 0,05 M MgCl2, blev underkastet dialyse i 6 timer mod 200 ml 0,1 M Hepes-puffer (pH 7,7) indeholdende 0,1 M NaCl og 0,05 M MgCl2. Denne opera-30 tion blev gentaget fire gange.

Tris-HCl = 2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandidL-hydrochlorid,

Hepes = 4-hydroxyethyl-l-piperazinethansulfon-syre, 35 M = mol pr.liter.

DK 161205 B

20 c.2) Fremstilling af harpiksen.

100 mg Poly (N,N-dimethylacrylamid) -harpiks bærende funktionelle estergrupper afledt af N-hydroxy-succinimiddiestren af glutarsyre, fremstillet 5 som beskrevet under b.2), blev henstillet til kvældning i 50 ml N-N-dimethylacetamid. Da perlerne havde nået deres maksimale kvældningspunkt (efter ca. 3 timer), blev harpiksen frafiltreret og vasket fem gange med 100 ml 0,1 M Hepes-puffer 10 (pH 7,7) cg fem gange med 100 ml 0,1 M Hepes-puf fer (pH 7,7) indeholdende 0,1 M NaCl og 0,05 M MgCl2.

c.3) Kobling mellem enzym R 39 og harpiksen.

Den fugtige harpiks, fremstillet som beskrevet 15 under c.2), blev anbragt i en 10 ml medicinflaske.

70 yg (1.320 picomol) Enzym R 39, fremstillet som beskrevet under c.l) og opløst i 1,75 ml 0,1 M Hepes-puffer (pH 7,7) indeholdende 0,1 M NaCl og 0,05 M MgC^# blev tilsat. Medicinflasken blev 20 derefter roteret ved 100 rpm i 16 timer ved stue temperatur .

Harpiksen blev frafiltreret og vasket fem gange med 10 ml 0,1 M Hepes-puffer (pH 7,7) indeholdende 0,1 M NaCl og 0,05 M MgCl2· 25 Efter denne operation blev et vandpumpevakuum påført harpiksen i 30 minutter.

Vægten af den således vundne harpiks var 503 mg. Enzymaktiviteten af det på denne harpiks immobi-liserede enzym R 39 svarede til 15 yg (283 pico-30 mol). Udbyttet ved immobiliseringen var derfor 21%.

DK 161205 B

21

Enzym R 39 immobiliseret på en fast bærer har en udmærket stabilitet, og det modstår således høje temperaturer, der kan ligge på op til 70°C. Det er af denne grund, at inkubationen af den biologiske væske med det 5 immobiliserede enzym R 39 kan gennemføres inden for et temperaturområde på fra 20 til 50°C. Den anvendte temperatur er fortrinsvis af størrelsesordenen 37°C. Under disse betingelser er inkubationstiden, der er nært forbundet med den tid, der kræves til dannelse af det inak-10 tive ækvimolære enzym-antibioticum-kompleks, på ca. 20 minutter. Hævning af inkubationstemperaturen vil have den virkning at nedsætte inkubationstiden og vice versa.

Det er derfor muligt at afkorte varigheden af fremgangsmåden yderligere ved at hæve temperaturen.

15 Ifølge den foreliggende opfindelse bliver det im mobiliserede enzym R 39, ved afslutningen af trin (1) af fremgangsmåden skilt fra den biologiske væske. Denne fraskillelse kan gennemføres ved enhver egnet metode, for eksempel ved dekantering, filtre-20 ring eller centrifugering, idet en simpel filtrering foretrækkes. Det immobiliserede enzym vaskes derefter én eller flere gange med en egnet puffer for at fjerne spor af biologisk væske, der stadig måtte være til stede.

I trin (2) af fremgangsmåden ifølge opfindelsen 25 bliver det immobiliserede enzym (fra hvilket den biologiske væske er fjernet) inkuberet med en bestemt mængde substrat i opløsning.

Under dette trin bliver den del af enzymet, der ikke er forbrugt ved dannelsen af enzym-antibioticum-kom-30 plekset i trin (1) af fremgangsmåden, anvendt til at hydrolysere et substrat, der er specifikt for enzym R 39.

Denne hydrolysereaktion vil derfor frembringe en mængde D-alanin svarende til den resterende aktivitet af enzym R 39.

35 På grund af selve naturen af enzym R 39 er det klart, at der som substrat vil kunne anvendes ethvert peptid, der har endestillede D-alanyl-D-alanin-grupper.

Som ikke-begrænsende eksempler kan nævnes Not,Ne-diacetyl-

DK 161205 B

22 L-lysyl-D-alanyl-D-alanin, Na-acetyl-L-lysyl-D-alanyl-D-alanin og lignende.

Den anvendte mængde substrat er ikke kritisk, forudsat at substratmængden foreligger i stort overskud i 5 forhold til den anvendte mængde enzym R 39. Det er altid nødvendigt at operere under beringelser med enzymmætning med substratet.

De operationsbetingelser, der skal observeres under dette trin, er i det væsentlige de samme som dem, der er 10 anført ovenfor for trin (1). Inkubationen kan gennemføres inden for et temperaturområde på fra 20 til 50°C og fortrinsvis ved en temperatur af størrelsesordenen 37°C. Inkubationstiden skal være mindst tilstrækkelig til at opnå en målelig mængde D-alanin med det ikke-inaktiverede en-15 zym R 39. Denne tid er fortrinsvis ca. 30 minutter ved en inkubationstemperatur på 37°C. Denne tid kan nedsættes ved at hæve inkubationstemperaturen, eller den kan omvendt forøges ved at nedsætte inkubationstemperaturen.

Det er derfor også fordelagtigt at hæve temperaturen for 20 denne inkubation i alle tilfælde, hvor hastigheden af bestemmelsen er en vigtig faktor.

For at bevare en optimal enzymaktivitet skal inkubationsmediet fortrinsvis have en pH-værdi fra 7 til 8,5. Sædvanligvis opretholdes en pH-værdi af størrelsesordenen 25 7,7 ved at gennemføre inkubationen i en egnet puffer.

I trin ( 3) af fremgangsmåden ifølge opfindelsen bestemmes mængden af D-alanin dannet i trin ( 2).

Denne bestemmelse af D-alanin kan gennemføres ved kemiske eller enzymatiske metoder, der er velkendte på 30 området. Det er blot vigtigt, at den skal være hurtig og billig, og at den skal gøre det muligt at bestemme D-alanin specifikt, under udelukkelse af alle de andre produkter, der er til stede i den væske, der skal undersøges.

Af denne grund er de enzymatiske metoder, der mu-35 liggør en kolorimetrisk bestemmelse af D-alaninet, de foretrukne metoder.

En særligt foretrukken metode er den enzymatiske metode beskrevet af J-M.FEERE et al. i "Methods in Enzym-

DK 161205 B

23 ology", bind XLV, del B (1976), 610-636, navnlig på siderne 612 og 613.

Ved nævnte metode oxideres D-alaninet til pyrodrue-syre ved hjælp af en D-aminosyre-oxidase (sammen med dens 5 coenzym, flavin-adenin-dinucleotid), hvorved samtidig dannes en mængde hydrogenperoxid svarende til mængden af D-alanin. Dette hydrogenperoxid anvendes på sin side til at oxidere o-dianidisin ved hjælp af en peroxidase. Da mængden af herved dannet oxideret o-dianisidin hænger 10 nøje sammen med mængden af D-alanin, og da det oxiderede o-dianisidin frembringer en farvning, kan måling af intensiteten af den således frembragte farve anvendes til at bestemme mængden af D-alanin ved en kolorimetrisk bestemmelsesmetode .

15 Det er klart, at dette system i det væsentlige er baseret på anvendelsen af et stof, i dette tilfælde o-dianisidin, hvis oxiderede og reducerede former har forskellige farver. Stoffer af denne type kendes som redox-indikatorer.

20 Der findes et stort antal redox-indikatorer, der udmærket kan erstatte o-dianisidinet ved den ovennævnte metode. Eksempler, der kan nævnes, omfatter ammoniumsaltet af 2,2'-azinobis(3-ethyl-2,3-dihydro-6-benzothiazol-sulfon)syre, 4-amino-antipyrin i nærværelse af phenol el-25 ler Ν,Ν-dimethylanilin og lignende.

Af denne grund bliver ifølge en foretrukken udførelsesform mængden af D-alanin bestemt ved inkubation af blandingen fra trin (2) dels med en D-aminosyre-oxidase, der katalyserer oxidationen af D-alaninet til pyrodrue-30 syre (under samtidig dannelse af hydrogenperoxid) og dels med en peroxidase og en redox-indikator, hvor sidstnævnte oxideres af det dannede hydrogenperoxid, ved hjælp af peroxidasen, under frembringelse af en farvning, hvis intensitet er en funktion af mængden af D-alanin.

35 Coenzymet af D-aminosyre-oxidasen, flavin-adenin- dinuclotid (FAD), anvendes naturligvis altid sammen med D-aminosyre-oxidasen.

DK 161205 B

24

Ved den foretrukne udførelsesform er det i princippet muligt at anvende enhver redox-indikator, der er i stand til at blive oxideret af hydrogenperoxid, i nærværelse af peroxidase som katalysator. Særligt foretrukne 5 redox-indikatorer omfatter o-dianisidin, hvis oxiderede form har en brun farve (maksimal absorption ved λ= 460 nu), og ammoniumsaltet af 2#2'-azinobis(3-ethyl-2,3-dihydro-6-benzothiazolsulfon) syre, hvis oxiderede form har en grøn farve (maksimal absorption ved λ = 420 nm) .

10 Det skal bemærkes, at den brune farve af oxideret o-dianisidin med fordel kan ændres til en klar lyserød farve ved tilsætning af svovlsyre. Denne lyserøde farve er meget stabil, og dette er meget vigtigt, hvis det ønskes at holde bestemmelsesresultatet en vis tid.

15 For at sikre en hurtig bestemmelse er det endvide re muligt at gennemføre trin (2) og (3) samtidigt. Ved denne udførelsesform bliver de reagenser, der gør det muligt at bestemme D-alaninet, tilsat direkte, ved trin (3) af fremgangsmåden, til blandingen af det immobilise-20 rede enzym og substrat-opløsningen, og der gennemføres en enkelt inkubation af det hele under betingelser, der er i det væsentlige identiske med de ovenfor for trin (2) anførte betingelser.

I trin (4) af fremgangsmåden sammenlignes bestem-25 melsen fra trin (3) med en standard for at finde antibio-ticum-koncentrationen i den biologiske væske.

Den kvantitative bestemmelse af antibioticum-kon-centrationen kan gennemføres ved følgende metode:

Der fremstilles først en række prøver af den biolo-30 giske væske indeholdende en kendt koncentration af beta-lac tam-antibioticum.

Foruden et vist antal prøver indeholdende en stigende antibioticum-koncentration vil denne række omfatte to prøver af den biologiske væske, der ikke indeholder 35 antibioticum.

Alle disse prøver behandles derefter på nøjagtig samme måde ved at følge trin (1), (2) og (3) af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

DK 161205B

25

For den ene af prøverne uden indhold af antibioticum bliver imidlertid den i trin (2) anvendte substratopløsning erstattet med et identisk volumen vand. I dette særlige tilfælde vil derfor en opløsning, der indeholder 5 alle reagenserne undtagen substratet, blive opnået ved afslutningen af trin (3). På grund af fraværelsen af substratet vil der derfor ikke blive dannet noget D-alanin, og o-anisidinet vil følgelig ikke blive oxideret. Den vundne opløsning vil have en lysegul farve. Denne prøve 1) omtales i det følgende som "blindprøven".

I modsætning hertil frembringer den anden prøve uden indhold af antibioticum en tydelig brun farve. Da denne prøve ikke indeholder antibioticum, inaktiveres enzym R 39 ikke i trin (1),og der vil derfor blive dannet 15 en maksimal mængde D-alanin (svarende til den totale aktivitet af det anvendte enzym R 39) og dermed en maksimal mængde oxideret o-dianisidin, og der vil derfor blive frembragt en tydelig brun farve. Denne prøve omtales i det følgende som "kontrolprøven".

20 Det vil også forstås, at hvis prøverne indeholder en molær mængde antibioticum, der er mindre end den molære mængde af anvendt enzym R 39, vil kun en del af dette enzym blive inaktiveret af antibioticum'et i trin (1).

I disse tilfælde vil der derfor blive dannet en mængde 25 D-alanin svarende til aktiviteten (resterende) af den enzymfraktion, der ikke er inaktiveret af antibioticum fet, og dermed også en tilsvarende mængde oxideret o-anisidin.

I disse tilfælde vil der derfor også blive frembragt en brun farve, men dens intensitet vil være mindre end den 30 med kontrolprøven opnåede.

Hvis endelig prøverne indeholder en molær mængde antibioticum, der er lig eller større end den molære mængde af anvendt enzym R 39, vil enzymet blive fuldstændigt inaktiveret af antibioticum*et under trin (1). Intet 35 D-alanin vil derfor blive dannet, og o-dianisidinet vil ikke blive oxideret. I disse tilfælde vil der derfor blive opnået en lysegul farve identisk med den med blindprøven opnåede.

DK 161205 B

26

Til opnåelse af en nøjagtig bestemmelse bliver den optiske tæthed af de farvninger, der er opnået med alle prøverne inklusive blind- og kontrolprøverne, målt på et spektrofotometer.

5 Da en vis optisk tæthedsværdi også findes for blindprøven, er det nødvendigt at subtrahere denne værdi fra værdierne fundet for henholdsvis kontrolprøven og de andre prøver.

Startende fra de således opnåede optiske tætheds-10 værdier beregnes for hver prøve den procentuelle resterende aktivitet (af enzym R 39). Denne procent er lig forholdet, multipliceret med 100, mellem den for den pågældende prøve vundne optiske tæthedsværdi og den for kontrolprøven vundne optiske tæthedsværdi.

15 En kurve optegnes derefter med antibioticum-koncen- trationen på abscissen og den procentuelle restaktivitet af enzym R 39 på ordinaten.

Der fås en ret linie, der skærer ordinaten ved et punkt svarende til kontrolprøven (100% resterende enzym-20 aktivitet) og abscissen ved et punkt svarende til den prøve, der indeholder en mængde antibioticum lig den molære mængde af anvendt enzym R 39 (0% resterende enzyraak-tivitet).

Den således opnåede kurve udgør en "standardkurve", 25 der gør det muligt at bestemme en ukendt koncentration af beta-lactam-antibioticum i en prøve af den biologiske væske, der er anvendt til optegning af kurven. Til dette formål behandles prøven på nøjagtigt samme måde ved at følge trin (1), (2) og (3) af fremgangsmåden ifølge 30 opfindelsen, og den optiske tæthed for den opnåede farvning måles på et spektrofotometer, derfra substraheres den for blindprøven fundne optiske tæthedsværdi, den procentuelle resterende enzymaktivitet beregnes på den ovenfor angivne måde, og prøvens antibioticum-koncentration 35 findes ved hjælp af standardkurven.

Det er således muligt kvantitativt at bestemme an<-tibioticum-koncentrationer så lave som 0,0005 I.E./ml biologisk væske på lidt under en time.

DK 161205 B

27

Denne fremgangsmåde kræver anvendelse af et spek-trofotometer og skal derfor i princippet gennemføres i et laboratorium. Hvis det imidlertid kun er hensigten at bestemme/ hvorvidt antibioticum-koncentrationen oversti-5 ger en vis tærskel (for eksempel en maksimum-koncentration foreskrevet af mejeriindistrien), er det ikke nødvendigt at anvende et spektrofotometer. Denne metode kræver nogen forudgående forklaring.

Som ovenfor nævnt, skærer standardkurven abscissen 10 ved et punkt svarende til en prøve indeholdende en anti-bioticum-mængde lig den molære mængde af anvendt enzym R 39. Ved denne kritiske koncentration er den procentuelle resterende enzymaktivitet nul %, fordi der ved afslutningen af trin (3) af fremgangsmåden ifølge opfindelsen 15 opnås en lysegul farvning, der er identisk med den med blindprøven opnåede.

En lysegul farvning opnås også over for denne kritiske koncentration, fordi den procentuelle resterende enzymaktivitet stadig er nul %. Under denne kritiske kon-20 centration opnås derimod en brun farvning, fordi der stadig foreligger en vis procent resterende enzymaktivitet.

Alene på basis af den ved afslutningen af fremgangsmådens trin (3) observerede farvning er det derfor muligt direkte at vurdere, hvorvidt en prøves antibioti-25 cum-koncentration overstiger den kritiske koncentration.

Det er derfor tilstrækkeligt at kende den kritiske koncentration, for at det derefter er muligt, uden anvendelse af et spektrofotometer, hurtigt at bestemme, om en prøve indeholder en koncentration af beta-lactam-antibio-30 ticum, der overstiger (eller ikke overstiger) nævnte kritiske koncentration. Til dette formål behandles prøven på nøjagtigt samme måde ifølge trin (1), (2) og (3) af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, og den opnåede farvning observeres derefter blot. Hvis denne farvning er ly-35 segul, vil antibioticum-koncentrationen være mindst lig den kritiske koncentration, og hvis farven på den anden side er brun, vil antibioticum-koncentrationen være lavere end den kritiske koncentration.

DK 161205B

7Ά

Det er således muligt visuelt og med sikkerhed at bestemme, hvorvidt prøver indeholder mere eller mindre end 0,002 I.E. antibioticum pr.ml biologisk væske, og at foretage denne bestemmelse på mindre end en time. Denne fremgangsmåde er derfor perfekt egnet til undersøgelse af 5 en række mælkeprøver også uden for laboratoriet, for eksempel på selve gården af ufaglært personale.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til kvantitativ og kvalitativ bestemmelse af antibioticum-koncentrationen er forklaret detaljeret med henvisning til den farveæn-10 dring, der fremkaldes med o-dianisidin. Det vil imidlertid være klart, at det ved anvendelse af andre redox-in-dikatorer kun vil være farven, der er anderledes.

Endnu et formål for opfindelsen er at tilvejebringe et prøveudstyr, der kan anvendes til gennemførelse af 15 fremgangsmåden ifølge opfindelsen, dvs. som kan anvendes til bestemmelse af et beta-lactam-antibioticum i en biologisk væske.

Et sådant prøveudstyr er ejendommeligt ved, at det omfatter: (1) en bestemt mængde af en opløselig D-alanyl-D-alanin- 20 carboxypeptidase frembragt af Actinomadura R 39 med deponeringsnummer 1-127 hos C.N.C.M., hvilket enzym er immobiliseret på en vanduopløselig bærer, (2) en bestemt mængde substrat, (3) reagenser, der tillader bestemmelse af D-alanin, og 25 (4) om ønsket, en standard, med hvilken resultaterne af de med reagenserne (1), (2) og (3) gennemførte prøver kan sammenlignes.

Ifølge en foretrukken udførelsesform er enzym R 39 immobiliseret på en tværbundet poly(N,N-dimethylacryl-30 amidHiarpiks, substratet er tripeptidet Na,Ne-diacetyl-L-lysyl-D-alanyl-D-alanin eller Na-acetyl-L-Lysyl-D-alanyl-D-alanin, og reagenserne omfatter (a) en D-aminosyre-oxidase (sammen med dens coenzym, flavin-adenin-dinucleo-tid), (b) en peroxidase og (c) en redox-indikator, for

^ C

eksempel o-dianisidin eller ammoniumsaltet af 2,2'-azino-bis (3-ethyl-2,3-dihydro-6-benzothiazolsulfon) syre.

Som standard kan, om ønsket, en standardkurve vedrørende antibioticum-koncentrationen versus den procentu- 29

DK 1612 O 5 B

elle restaktivitet af enzym R 39 inkluderes i udstyret.

Det er således muligt at gennemføre kvantitative bestemmelser som ovenfor forklaret. Nævnte kurve er imidlertid ikke afgørende. Hvis prøveudstyret skal anvendes alene 5 til at bestemme, hvorvidt antibioticum-koncentrat ionen overstiger en vis kritisk værdi, er det tilstrækkeligt i brugsanvisningen at angive de antibioticum-koncentratio-ner, ved hvilke en farveændring observeres, efter at prøven er behandlet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

10 Ifølge en særligt fordelagtig udførelsesform er det immobil i serede enzym anbragt i en sprøjte, på hvis bund der findes en plade af filtreringsmateriale, for eksempel sintret glas. Denne anordning letter separationen af det immobiliserede enzym R 39 fra den biologiske 15 væske ved filtrering og vask af enzymet i trin (1) af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Opfindelsen beskrives nærmere gennem følgende eksempler .

20 Eksempel 1

Dette eksempel illustrerer anvendelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen til bestemmelse af lave koncentrationer af penicillin G i mælk.

(a) Fremstilling af reagenserne 25 1) Immobiliseret enzym R 39.

Enzym R 39 blev immobiliseret på en poly(N,N-dime-thylacrylamid)-harpiks ved metoden beskrevet i det ovenfor i beskrivelsen anførte eksempel.

2) Substrat-opløsning, 30 Der blev fremstillet en opløsning indeholdende 6 mg

Na,Ne-diacetyl-L-lysyl-D-alanyl-D-alanin i 1 ml vand.

3) D-aminosyre-oxidase-suspension.

Der blev fremstillet en suspension indeholdende 5 mg D-aminosyre-oxidase (specifik aktivitets 15 E/mg) pr.

35 ml af en 3 molær vandig opløsning af ammoniumsulfat.

4) Flavin-adenin-dinucleotid(FAD)-opløsning.

Der blev fremstillet en opløsning indeholdende 500 yg FAD i 6 ml 0,1 M Tris-HCl-puf.fer (pH 8,0) (M=mol pr.liter).

DK 161205B

30 5) Peroxidase-opløsning.

Der blev fremstillet en opløsning indeholdende 50 pg peroxidase pr .ml vand.

6) o-Dianisidin-opløsning.

5 Der blev fremstillet en opløsning indeholdende 2,6 mg o-dianisidin-dihydrochlorid pr. 500 pi vand.

(b) Metode

Der blev fremstillet en række mælkeprøver på 1 ml hver indeholdende en kendt koncentration af penicillin G 1Q og to mælkeprøver på 1 ml (blindprøve og kontrolprøve) uden indhold af penicillin G.

5,5 mg Immobiliseret enzym R 39 (= 3 picomol enzym) blev sat til hver prøve, og blandingen blev inkuberet i 20 minutter ved 37°C.

15 Mælken blev derefter skilt fra det immobiliserede enzym ved filtrering, og det immobiliserede enzym blev vasket tre gange med 1 ml 0,1 M Hepes-puffer (pH = 7,7) indeholdende 0,1 M NaCl og 0,05 M MgClj.

Enten 20 pi 0,1 M Hepes-puffer (pH 7,7) indeholdende 0,1 20 M NaCl og 0,05 M MgC^ og 10 pi af substratopløs- .

ningen (i tilfælde af kontrolprøven eller prøverne indeholdende penicillin G) eller 20 pi af Hepes-pufferen og 10 pi vand (i tilfælde af blindprøven) blev derefter sat til det fraskilte og vaskede immobiliserede enzym. Blan-25 dingen blev inkuberet i 30 minutter ved 37°C.

Ved afslutningen af denne inkubation blev 2 pi af D-aminosyre-oxidase-suspensionen, 60 pi af FAD-opløsnin-gen, 10 pi af pe.oxidase-opløsningen og 5 pi af o-diani-sidin-opløsningen sat til det respektive vundne produkt, 30 og blandingen blev derefter inkuberet igen i 10 minutter ved 37°C.

Den optiske tæthed af de vundne farvede opløsninger blev derefter målt på et spektrofotometer. Til dette formål blev 1 ml af en methanol/vand-opløsning (forhold 35 1:1) sat til cellen, og den optiske tæthed måltes ved 460 nm.

Den fundne optiske tæthedsværdi for blindprøven blev substraheret fra de optiske tæthedsværdier fundet

DK 161205B

31 for kontrolprøven og for de andre prøver. Til slut blev den procentuelle resterende enzymaktivitet beregnet for hver prøve ud fra de således vundne optiske tæthedsværdi-er.

5 Resultaterne opnået med to rækker mælkeprøver på 1 ml indeholdende varierende koncentrationer af penicillin G er anført i den følgende Tabel I:

Tabel I

10 1. Række

A B C Δ % D

1 0,0082 0,035 0,000 0 lysegul 2 0,0041 0,040 0,005 3 lysegul 3 0,0020 0,035 0,000 0 lysegul 15 4 0,0010 0,150 0,115 69 gulbrun 5 0,0005 0,170 0,135 82 brun kontrol 0 0,200 0,165 100 brun prøve” 0 0/035 “ " lysegul 20 2. Række

A B C Δ % D

1 0,0020 0,040 0,005 3 lysegul 2 0,0015 0,055 0,020 12 gul 3 0,0010 0,100 0,065 41 gulbrun 25 · 4 0,0005 0,145 0,110 69 gulbrun kontrol 0 0,195 0,160 100 brun 0 0.035 - - lysegul A = prøvenummer 30 B = koncentration af penicillin G (I.E./ml) C = optisk tæthed ved 460 nm Δ = optisk tæthed fundet (kolonne 3) - optisk tæthed for blindprøven % = procentuel resterende enzymaktivitet 35 D = observeret farvning.

DK 161205 B

32

De således opnåede resultater er reproduceret i form af en kurve, som vist på tegningen. På denne kurve er koncentrationen af penicillin G i I.E./ml afsat på abscissen, og den procentuelle resterende enzymaktivitet 5 (symbol %) er afsat på ordinaten-

Denne kurve udgør en standardkurve, der gør det muligt at bestemme koncentrationen af penicillin G i andre mælkeprøver på 1 ml. Til dette formål behandles disse prøver som beskrevet i dette eksempel, og de respekti-10 ve koncentrationer af penicillin G deri bestemmes ved hjælp af standardkurven.

Tabel I viser, at der for en prøve indeholdende 0,002 I.E. eller mere af penicillin pr.ml mælk findes en resterende enzymaktivitet af størrelsesordenen nul % og 15 observeres en lysegul farvning, der er identisk med farven af blindprøven. For prøverne indeholdende en penicillinmængde på mindre end 0,002 I.E. pr.ml mælk findes på den anden side en vis procentuel resterende enzymaktivitet, og der observeres en gulbrun eller brun farvning.

20 Alene på basis af den ved afslutningen af den ende lige inkubation observerede farvning er det således muligt visuelt og med sikkerhed at bestemme, hvorvidt en mælkeprøve indeholder en koncentration lig med mindst 0,002 I.E. penicillin pr.ml mælk, dvs. 1,2 ng/ml mælk.

25 Ved denne koncentration eller ved en højere koncentration fås en lysegul farvning, der er identisk med farven af blindprøven. Under nævnte koncentration (for eksempel hvis prøven ikke indeholder penicillin) ændres farven fra lysegul til brun.

30 Det fremgår således, at fremgangsmåden ifølge op findelsen gør det muligt at foretage en meget hurtig bestemmelse af meget lave koncentrationer af penicillin i mælk uden brug af et spektrofotometer eller andet lignende analyseinstrument. Dette viser den store anvendelighed 35 af fremgangsmåden, der gør det muligt at foretage hurtig bestemmelse på en række mælkeprøver på selve stedet for mælkeindsamlingen, for eksempel på en gård med ufaglært personale.

33

DK 161205 B

Det er endvidere klart, at den foreliggende fremgangsmåde også kan anvendes til gennemførelse af kvantitative bestemmelser i laboratoriet. Den på tegningen viste kurve viser, at det er muligt ved anvendelse af et spek-5 trofotometer at bestemme koncentrationer så lave som 0,0005 I.E. af penicillin pr.ml mælk, dvs. 0,3 ng/ml mælk.

Eksempel 2 10 Dette eksempel illustrerer anvendelsen af frem gangsmåden ifølge opfindelsen til bestemmelse af lave koncentrationer af penicillin G i serum og urin.

Fremgangsmåden fra Eksempel 1 fulgtes, idet der anvendtes de samme reagenser, men idet prøverne på 1 ml 15 mælk blev erstattet med serumprøver eller urinprøver på 1 ml.

De opnåede resultater er anført i de følgende Tabeller II og III for henholdsvis serum og urins 20 Tabel II (Serum)

A B C Δ I D

1 0,010 0,030 0,000 0 lysegul 2 0,003 0,035 0,005 4 lysegul kontrol 0 0,145 0,115 100 brun 25 blind- q 0,030 - - lysegul prøve '

Tabel III (Urin)

A B C Δ % D

30 1 0,010 0,035 0,005 4 lysegul 2 0,003 0,040 0,010 8 lysegul kontrol 0 0,150 0,120 100 brun biind- 0 0,030 - - lysegul prøve ' 35 34

DK 161205 B

Tabellerne II og III viser klart, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen med godt resultat kan anvendes til visuelt at bestemme, hvorvidt en prøve af serum eller urin indeholder en koncentration på mindst 0,003 I.E. af peni-5 cillin pr.ml serum eller urin.

Ved nævnte koncentration eller ved en højere koncentration vil den observerede farvning være lysegul.

Det skal bemærkes, at i tilfælde af urin er det umuligt at gennemføre en sådan bestemmelse ved J-M.FRERE-10 metoden, ved hvilken der anvendes opløselig, men ikke im-mobiliseret enzym R 39, og dette gælder selv i tilfælde af urinvolumener, der er så lave som 10 yl.

Eksempel 3 15 Dette eksempel illustrerer anvendelsen af frem gangsmåden ifølge opfindelsen til bestemmelse af cephalosporin C i serum.

Fremgangsmåden fra Eksempel 1 fulgtes, idet der anvendtes de samme! reagenser, men idet mælkeprøverne på 20 1 ml blev erstattet med serumprøver på 1 ml hver indehol dende en kendt koncentration af cephalosporin C.

De opnåede resultater er anført i følgende Tabel IV:

25 Tabel IV

A B1 C Δ % D

1 10 0,030 0,000 0 lysegul 2 2 0,040 0,010 8 lysegul 3 1 0,085 0,055 44 lysegul 30 kontrol 0 0,155 0,125 100 brun prø^" 0 ' 0,030 - - lysegul 35 B = cephalosporin C-koncentration (ng/ml).

DK 161205 B

35

Eksempel 4

Dette eksempel Illustrerer anvendelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen til bestemmelse af cephalosporin C i serum gennemført ved en højere temperatur.

5 Fremgangsmåden fra Eksempel 3 fulgtes, men hver in kubation gennemførtes ved 47°C og i den halve tid,

Endvidere blev der til hver serumprøve på 1 ml forud sat 100 μΐ 0,5 M (pH 7,7) Hepes-puffer indeholdende 0,5 M NaCl og 0,25 M MgCl2.

10 De opnåede resultater er anført i følgende Tabel V:

Tabel V

A B* C Δ % D

1 10 0,040 0,005 0 lysegul 15 2 2 0,035 0,000 0 lysegul 3 1 0,095 0,060 41 lysebrun kontrol 0 0,180 0,145 100 brun prjve' 0 °'035 - - 1yse9ul 20 #B = cephalosporin C-koncentration (ng/ml)

Dette eksempel viser klart, at det ved hævning af inkubationstemperaturen er muligt i betydelig grad at re-25 ducere den tid, der kræves til fremgangsmådens gennemførelse.

Claims (10)

1. Enzymatisk fremgangsmåde til bestemmelse af antibiotica indeholdende en beta-lactam-kerne i en biologisk væske, og omfattende følgende trin: 5(1) inkubation af væsken med den opløselige D-alanyl-D-alanin-carboxypeptidase frembragt af stammen Actino-madura R 39 med deponeringsnummer 1-127 hos C.N.C.M., idet inkubationen gennemføres under betingelser, der tillader beta-lactam-antibioticum'et, om til stede 10. nævnte væske, at reagere med enzymet under dannelse af et inaktivt og i det væsentlige irreversibelt ækvimolært enzym-antibioticum-kompleks, (2) inkubation af produktet opnået fra slutningen af trin (1) med en substrat-opløsning under betingelser, der til- 15 lader substratet at blive hydrolyseret af enzymet under dannelse af en mængde D-alanin svarende til den resterende enzymaktivitet, (3) bestemmelse af den i trin (2) dannede mængde D-alanin, 20 og (4) sammenligning af bestemmelsen fra trin (3) med en standard til opnåelse af antibioticum-koncentratio-nen i den biologiske væske, kendetegnet ved, at det anvendte enzym er immobil i seret på en vandu- 25 opløselig bærer, og at dette immobiliserede enzym skilles fra den biologiske væske og vaskes, før det inkuberes med substratopløsningen i trin (2).

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den vanduopløselige bærer er en tværbundet 30 poly (Ν,Ν-dimethylacrylamid) -harpiks.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at trin (2) og (3) gennemføres samtidigt. DK 161205 B

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegne t ved, at den biologiske væske vælges blandt mælk, serum, urin, blod, spyt, kødekstrakter og gæringsvæsker.

5. Fremgangsmåde ifølge krav l,kendeteg- 5. e t ved, at det antibioticum, der skal bestemmes, vælges blandt benzylpenicillin, ampicillin, phenoxymethyl-penicillin, carbenicillin, methicillin, oxacillin, clox-acillin, cephalosporin C, cephaloglycin, cephalothin og cephalexin.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at substratet er Na,Ne-diacetyl-L-lysyl-D-alanyl-D-alanin eller Na-acetyl-L-lysyl-D-alanyl-D-ala-nin.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg-15 n e t ved, at mængden af D-alanin bestemmes ved at inkubere blandingen fra trin (2) dels med en D-aminosyre-oxi-dase, der katalyserer oxidationen af D-alaninet til pyro-druesyre under samtidig dannelse af hydrogenperoxid, og dels med en peroxidase og en redox-indikator valgt blandt 20 o-dianisidin og ammoniumsaltet af 2,2-azinobis(3-ethyl- 2,3-dihydro-6-benzothiazolsulfon)syre, idet sidstnævnte oxideres af det dannede hydrogenperoxid, ved hjælp af peroxidasen, under tilvejebringelse af en farvning, hvis intensitet er en funktion af mængden af D-alanin.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at nævnte standard er en standardkurve for antibioticum-koncentration versus procentuel resterende enzymaktivitet.

9. Prøveudstyr til bestemmelse af et beta-lactam-30 antibioticum i en biologisk væske ved fremgangsmåden ifølge krav 1-6, kendetegnet ved, at det omfatter: (1) en bestemt mængde af en opløselig D-alanyl-D-alanin-carboxypeptidase frembragt af Actinomadura R 39 med 35 deponeringsnummer 1-127 hos C.N.C.M., hvilket enzym er immobiliseret på en vanduopløselig bærer, (2) en bestemt mængde substrat, DK 161205B (3) reagenser, der tillader bestemmelse af D-alanin, og (4) om ønsket, en standard, med hvilken resultaterne af de med reagenserne (1), (2) og (3) gennemførte prøver kan sammenlignes.

10. Prøveudstyr til bestemmelse af et beta-lac- tam-antibioticum i en biologisk væske ved fremgangsmåden ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det omfatter: (1) en bestemt mængde opløselig D-alanyl-D-alanin-carbo-10 xypeptidase frembragt af Actinomadura R 39 med deponeringsnummer 1-127 hos C.N.C.M., hvilket enzym er immobiliseret på en vanduopløselig tværbundet poly- (N, N-dimethylacry lamid) -harpiks, (2) en bestemt mængde substrat valgt blandt N°,Ne-diace-15 tyl-L-lysyl-D-alanyl-D-alanin og Na-acetyl-L-lysyl- D-alanyl-D-alanin, (3) reagenser, der tillader bestemmelse af D-alanin og omfattende (a) en D-aminosyre-oxidase, (b) en peroxidase og (c) en redox-indikator, og 20 (4) om ønsket, en standard, med hvilken resultaterne af de med reagenserne (1), (2) og (3) gennemførte prøver kan sammenlignes.