JPH0648272B2 - グラム陰性細菌尿症のスクリーニング法 - Google Patents

グラム陰性細菌尿症のスクリーニング法

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JPH0648272B2
JPH0648272B2 JP61286108A JP28610886A JPH0648272B2 JP H0648272 B2 JPH0648272 B2 JP H0648272B2 JP 61286108 A JP61286108 A JP 61286108A JP 28610886 A JP28610886 A JP 28610886A JP H0648272 B2 JPH0648272 B2 JP H0648272B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、グラム陰性菌について尿試料をスクリーニン
グするための診断試験方法に関する。
“グラク陰性細菌尿症”という表現は、グラム陰性菌が
原因となっておこる尿路感染に言及するのに使用され
る。尿路感染は、症状、再発及び複雑にからみ合う因子
に基づいて４つのカテゴリーに分類される。合併症のな
い急性のグラム陰性細菌尿症は自然に消えるかもしれな
いが、通常それに続いて執ような又は再発性の細菌尿症
が起こり、長期に亘る薬剤療法が必要となることもあ
る。他の３つのカテゴリーの細菌尿症は、もし治療され
なければ腎感染又は死をもたらすかもしれない。更に加
えて、グラム陰性細菌尿症は体中に拡がり、体を衰弱さ
せても、それに伴う症候は識別するのが難しく、いわゆ
る無症候性の患者の部類となることもある。
尿試料の培養は試料１ml当り１０４個の細菌濃度を検出
することができ、この濃度は正常なグラム陰性菌含有量
のカットオフとして時々使われるものであるが、培養結
果は少なくとも１８〜２４時間は得られず、熟練した人
員を必要とし、結果を得るには費用がかかる。顕微鏡検
査はより迅速で約４５分を必要とするが、１ml当り１０
５個の細菌にしか感度を示さず、また熟練した人員を必
要とする。いずれの方法もスクリーニング法としては考
えられなかった。迅速で便利で費用のかからないスクリ
ーニング法は学童や軍人のような集団における大規模な
検査に特に有用であろう。
リムルス・アメボサイト・ライセート〔Limulus Ameboc
yte Lysate（ＬＡＬ）〕試験はあるカニの種から抽出し
た天然物質由来のライセートの使用に基づく。このライ
セートは前酵素と天然の基質凝固原を含有することが最
近判明した。このライセートのカスケードはグラム陰性
菌の細胞壁の一成分である内毒素（エンドトキシン）に
より活性化される。このカスケードの活性化により、当
然のこととしてゲル終点の形成がおこる。
ゲル化ＬＡＬ試験のための試薬を含む透明管からなる装
置がヨーロッパ特許第０ １２１ ８６８号においてエ
ンドトキシンを測定するために開示されている。任意の
試験体液を分析できる。
エンドトキシンが尿中に存在することは、またエンドト
キシンによるリムルス・アメボサイト・ライセート酵素
カスケードの活性化がもたらす濁度を検出することがで
きる計器を用いて、細菌尿症が存在することと関連づけ
られている。エンドトキシンによるこのカスケードの活
性化後の濁度の程度が測定され、細菌尿症の存在と関連
づけられている。検出限界は試料１ml当り１０５個の細
菌であると報告されているが、必要な装置が高価である
ためにこの方法はスクリーニング法としては考えられな
い。
最近、発色性もしくは発蛍光性基を含有する合計ペプチ
ド基質が使用されるようになってきたが、これらはＬＡ
Ｌカスケードがエンドトキシンにより活性化される際に
生成される凝固酵素により開裂されうるものである。種
々の合成基質が開示されている。例えば、英国特許第
１，５４７，７４７号及び米国特許第４，１８８，２６
４号を参照されたい。一般に２つのアミノ酸の配列、グ
リシン−アルギニンが凝固酵素による発色性又は発蛍光
性脱離基の開裂に必要不可欠であることが判明してい
る。ニトロフェニル、メチルクマリン誘導体、ｐ−
（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン）アニリン及びインドキシル
のような開裂しうる脱離基が開示されている。日本特許
公報第５６−４２５９７号は尿をはじめとするあらゆる
体液内のエンドトキシンの測定について開示している
が、その測定には開裂生成物が１−ナフトール−２−ス
ルホン酸と反応して青色を呈する基質が用いられる。
発色性又は発蛍光性基質は、主に静脈中の溶液及び血液
の中のエンドトキシンの試験に用いられている。血液中
での測定は細菌血症（血中の細菌感染）に関連づけられ
ている。血中のエンドトキシン測定は、ＬＡＬカスケー
ドの阻害物質が存在するために複雑である。大部分の特
許や文献資料は、この妨害因子の除去か新しい合成基質
のいずれかを目指したものである。例えば、エンドトキ
シンの測定に必要とされる妨害因子の除去を目指してい
るヨーロッパ特許出願第０ ８０ ６４９号を参照され
たい。この明細書には、開示されている妨害因子除去法
を細菌尿症の測定に応用することが述べられている。
特開昭第５６−３５９９４号はエンドトキシンの測定用
装置を開示しているが、この装置はライセートから分離
されている酵素前駆体を有する部分と、隔離された容器
に密封された光学的に測定可能なペプチド基質を有する
部分を含んでいる。
ザ・フィットテーカー、エム・エー、バイオプロダク
ツ、ウオークブィル、エムディ・キット（the Whittake
r, M. A., Bioproducts, Walkeville, MD kit)（ＱＣＬ
−１０００）を用いて、グラム陰性細菌尿症の診断のた
めの１ml当り１０５個のグラム陰性菌細胞の測定用の発
色性ＬＡＬ溶液試験が開示されている〔ナッカム及びベ
ルゾフスキー（Nachum and Berzofsky), J. Clin. Micr
obiol., 759-763, 1985〕。
本発明は、非希釈尿試料１ml当り１０４個のグラム陰性
菌を測定するための便利なスクリーニング法を提供する
ものである。
尿試料中のグラム陰性細菌の存在を１０４細胞/ml の検
出感度で測定するためのスクリーニング法は、 （ａ）測定すべき非希釈尿試料を、カブトガニ・アメボ
サイト・ライセート（horseshoe crab amebocyte lysat
e)及びpHを６．３から７．５の範囲に保ち得る第一緩衝
液を含む試験管に添加して試験管内混合物を調製し、こ
の際ライセートの濃度は調製された試験管内混合物１ml
当り少なくとも３．５mgであり； （ｂ）試験管内混合物を、ライセートを活性化するのに
十分な時間インキュベートし； （ｃ）試験具を、活性化された試験管内混合物と接触さ
せ、ここで前記試験具は活性化されたライセートにより
開裂されうる発色性又は発蛍光性脱離基を含む合成ペプ
チド基質及びpHを８．０から８．９の範囲に保ち得る第
二緩衝液を包含せしめた担体マトリックスからなり； （ｄ）接触させた試験具を取出し；次いで （ｅ）開裂した脱離基の濃度を測定する 各工程からなる。このスクリーニング法は便利で費用の
かからない方法であり、しかも尿試料１ml当り１０４個
のグラム陰性菌の濃度を検出するのに十分な感度を有し
ており、この濃度は臨床的には有意であるが、無症候性
患者に検出されることが多い濃度である。
細菌尿症は広く一般に蔓延しているので、その存在を検
出し診断するための多くの方法が開発されている。合成
基質とのＬＡＬカスケードを用いる、非希釈尿試料１ml
当り１０４個の細菌の存在に対して感度を有する細菌尿
症のためのスクリーニング法は現在のところない。
本発明の細菌尿症の検出試験は、カブトガニ・アメボサ
イト・ライセート中に存在する天然酵素カスケードをベ
ースにしている。カブトガニ・アメボサイト・ライセー
トは、カニのリムルス（Limulus)属又はタキプリウス
（Tachypleus）属の種から得ることができる。リムルス
属の種はカブトガニの西部の種であり、リムルス・ライ
セートは、アソシエーツ・オブ・ケープ・コッド、ウッ
ズ・ホール、マサチューセッツ（Associates of Cape C
od, Woods Hole, MA）から容易に入手できる。これはい
つも変らぬ品質であり、かつ本発明に有用な濃縮形で入
手できるので、好ましいライセート源である。ライセー
トカスケードは、エンドトキシンの存在に対してあまり
に感度が高すぎるため細菌尿症に対して有用な試験を行
うことができないと信じられてきたが、本発明は、尿試
料中の閾値濃度のグラム陰性菌の存在を陽性表示として
与えるよう注意深く設計されたものであり、この濃度は
尿道のグラム陰性菌感染を示すものであると考えられ
る。
Ａ．尿中エンドトキシンの正常濃度 有用であるためには、スクリーニング法は、許容しがた
い程高い、まちがった陽性表示を与えることはなしに、
しかし医学上の問題がおこる可能性を示す信号となる、
分析対象物の閾値濃度を陽性表示として示すものでなけ
ればならない。通常、スクリーニング法により陽性結果
が出ると、その後にそれを更に詳しく検査する操作が必
要とされる。従って更に費用のかかる試験を行わねばな
らない場合には、スクリーニング法が有用であるかどう
かは、迅速で便利な費用のかからない測定方法を提供す
ることができるかどうかにかかっている。細菌尿症にと
って好結果を生むスクリーニング法は、単に正常な濃度
のグラム陰性菌が存在するに過ぎない場合に誤った陽性
表示を示すことなく、尿試料１ml当り所望濃度のグラム
陰性菌について陽性表示を示すものでなければならな
い。
計器による濁度測定及びグラム染色の両者は１ml当り１
０５の細胞に対して感度を有するが、１ml当り１０４個
の細胞の検出を行えば、ある無症候患者、又は症候性で
あっても細菌尿症ときめるのはむずかしい患者を正確に
診断できるであろうとある医学の権威者達は信じてい
る。
これらの患者は、もし１０４個の検出が可能な診断法を
用いれば細菌感染の初期段階で助けられたであろうが、
硝酸塩還元性細菌（グラム陰性菌の一種）の存在を検出
する亜硝酸塩試薬片又は感染のために体により生成され
る白血球を検出する白血球試薬片のような現在利用しう
るスクリーニング法では見逃されてしまうことがある。
ナッカム及びベルゾフスキー（Nachum and Berzofsky；
J. Clin. Microbiol., 759-763, 1985）は、正常尿は１
ml当り２０ngに達する量の遊離エンドトキシンを有する
ことがあり、この濃度は１ml当り１０３個のグラム陰性
菌の存在を示すことになることを発見した。ゲル化試験
での結果はこれらの発見を裏付けるものである。このバ
ックグラウンドは本出願人の発明の試験管／試験具−法
に影響を与えない。
本発明の試験管／試験具フォーマットはこれらのエンド
トキシン濃度には感度を示さないようにされた条件下で
行われる。
Ｂ．試験管／試験具−法 本発明は、非希釈尿試料１ml当り１０４個の細菌に対し
て感度を有する、細菌尿のスクリーニング法を提供す
る。本方法は非希釈尿試料を、ライセート及び第一緩衝
液を含む試験管に加え、混合し、次いでこの混合物を試
料１ml当り１０４個のグラム陰性菌細胞の存在に対して
前記ライセートを活性化するのに十分な時間インキュベ
ートすることを含む。エンドトキシンとの接触後のＬＡ
Ｌカスケードによる凝固酵素の生成をここでは活性化と
呼ぶ。第二緩衝液及び合成ペプチド気質を包含せしめた
担体マトリックスからなる試験具を、活性化された試験
管内混合物と接触させる。次に試験具を取出し、試験具
の検出しうる応答を測定する。発蛍光性又は発色性脱離
基を含む合成基質を用いることができる。しかしなが
ら、試験結果を、次に反射率により、目視的にもまた計
器的にも測定することができるので、好ましい検出可能
な応答は色である。
ライセートの濃度、インキュベーションの時間及び温度
を調整することにより、正常なバックグラウンド細菌濃
度もしくは１０３細胞/ml を検出することなく、尿試料
１ml当り１０４のグラム陰性菌に対して感度を有するよ
うに測定を行うことができる。１０４個の細胞について
有意の結果を得るためには清浄な中間流採取尿試料を用
いるべきである。
１．試験管 ａ．ライセート ライセートはアソシエーツ・オブ・ケープ・コッド（As
sociates of Cape Cod）から、凍結乾燥された形で得る
ことができる。試験管内のライセートの量は、試料を試
験管に添加した後、調製された試験管内混合物１ml当り
約３．５〜７mgの濃度となるのに十分な程高いものでな
ければならない。
ｂ．二価陽イオン ライセートカスケードの活性化のためには二価陽イオン
が必要である。市販されているライセート調製物は、ラ
イセートを活性化するのに十分な量のカルシウムイオン
を安定剤として含有する。場合により更に別の陽イオン
を添加するのが望ましい場合もある。二価陽イオンはカ
ルシウム、マグネシウム、ストロンチウム及びマンガン
の陽イオンから選択することができるが、カルシウム陽
イオンが好ましい。もし陽イオンを含まないライセート
調製物を用いる場合には二価陽イオンの添加すべきであ
る。
ｃ．第一緩衝液 第一緩衝液はpHを６．３から７．５の範囲に保ち得るも
のでなければならない。このpH範囲は、エンドトキシン
がライセートの酵素カスケードを活性化するのに最適な
pH範囲であり、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウムを
用いて、活性化工程のための好ましい第一緩衝液を調製
することができる。このような適切な第一緩衝液の選択
は本開示に与えられた技量内のことである。
２．試験管／試験具−法のための試験具 試験具は、活性化されたライセートにより開裂されうる
発色性又は発蛍光性脱離基を含む合成ペプチド基質及び
試験管内混合物と接触した際、pHを８．０から８．９の
範囲に保ちうる第二緩衝液を包含せしめた担体マトリッ
クスからなる。場合により開裂基を安定化することがで
きる酸性ポリマー及び／又は二価陽イオン基の包含せし
めることもできる。
ａ．担体マトリックス 担体マトリックスは、必須成分に対して実質的に不活性
で、多孔性であり及び／又は尿試料に対して吸収性であ
る限り、必須成分を包含せしめることができるものなら
ばいずれの物質でもよい。「担体マトリックス」という
表現は、水又は他の生理学的液体に接触させた際、不溶
でありかつその構造は完全にもとのままを保つような吸
水性又は非吸水性マトリックスのいずれをも指す。好ま
しい担体マトリックスは、紙、通常はワットマン、クリ
フトン、ニュージャージー（Whatman, Clifton,N. J.)
から入手できるもののような高級ロ紙である。
包含は、担体マトリックスに基質及び第二緩衝液を包含
せしめるような浸漬、塗布又は噴霧等の任意の方法によ
っても行うことができる。これは基質及び第二緩衝液を
含む水溶液に紙担体マトリックスを含浸せしめ、次いで
乾燥することにより行うことができる。乾燥は包含組成
物に悪影響を及ぼさない任意の方法、通常は空気炉によ
って行うことができる。乾燥された紙は次に裁断され、
次いで支持体部材、例えば、硬質又は半硬質ポリスチレ
ンフィルム細片の一端に貼付けることができる。ポリス
チレン上への紙の貼付はスリーエム・カンパニー、セン
トポール、ミネソタ（３M Co., St. Paul, Minnesota)
から市販されているもののような両面粘着テープを用い
て行うことができる。支持体部材は便利な把手となり試
験具を使い易くする。
ｂ．合成基質 天然のカスケード終点の形成、ゲル化が細菌尿の検出に
用いられているが、光散乱の測定用の高価な装置を用い
てはじめて定量結果が得られる。この装置が高価なため
に現在利用しうる試験法は定期的に行われるスクリーニ
ングには適切でないものになっている。更に光散乱法の
感度は１ml当り細胞１０５個と報告されている。
容易に判別しうる比色性又は蛍光測定性終点をもたらす
ことができる合成基質を用いることがより望ましく、多
くの発色性又は発蛍光性ＬＡＬ基質がエンドトキシンＬ
ＡＬ試験用に市販されており本発明により提供されるス
クリーニング法に用いることができる。
ＬＡＬ用の発蛍光性基質は、ペニンスラ・ラボラトリー
ズ、ベルモント、カリフォルニア（Peninsula Labs. Be
lmont, California)から入手することができ、この基質
は脱離基としてＮ−メチルクマリンを含有する。尿の元
々の蛍光性バックグラウンドがこの試験に必要とされる
感度に有意の障害をおこすにはあまりに低いので、これ
らは尿試料に用いることができる。
発光性合成基質は特に好ましく、これは比較的簡単なか
つ安価な計器測定によっても、又は使用者に用意された
適切な色チャートとの比較により、更により便利な目視
によっても色を測定することができる故である。市販さ
れているただ一つの発色性基質は、活性化されたライセ
ートにより開裂する際、黄色を呈するｐ−ニトロアニリ
ンを脱離基として含有する。驚いたことに、黄色終点が
呈されるにも拘らず、これらの脱離基としてｐ−ニトロ
アニリンを含有する基質を用いて試験管／試験具フォー
マットにおける尿試験体についての所望の感度に達する
のに成功している。しかしながら、臨床尿、例えば、高
比重尿は高度に着色しているので、黄色以外のある色を
呈することができる合成基質を用いるのが好ましい。
有用な発色性基質は、一般式： Ｂ−（Ａ１)n−Ａ２−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｉ 式中、ａ）ｎは整数０又は１であり； ｂ）Ａ１はバリン又はロイシンであり； ｃ）Ａ２はロイシン又はセリンであり； ｄ）Ｇｌｙはグリシンであり； ｅ）Ａｒｇはアルギニンであり； ｆ）Ｂは末端アミノ酸の閉塞基であり； 及び ｇ）Ｉは発色性指示基である で示される。
閉塞基としては、ｔ−ブチルオキシカルボニル、アセチ
ル、ベンゾイル又はトシルが好ましく、ｔ−ブチルオキ
シカルボニル（ｔＢＯＣ）が特に好ましい。他の同等の
アミノ酸配列を有するものを用いることができるが、一
般に開裂可能脱離基に隣接してグリシン−アルギニン配
列を有するものが好ましい。
好ましい発色性指示基は、Ｉが式： 式中、ａ）Ｙはヒドロキシ基又はアミド基であり； ｂ）Ｘは硫黄、窒素又は酸素から選ばれたものであり； ｃ）Ｒ１は低級アルキル、アリール基、アミド基又はシ
アノ基であり； 及び ｄ）Ｒ２は単一又は複数個の水素、低級アルキル、アリ
ール又は好ましくは塩素、ニトロ等の電子吸引性基の同
一又は異なる基である で示されるＩ１又はＩ２から選択されるものである。
指示基はＹを介してアルギニンを連結して、ライセート
の活性化で形成された凝固酵素の働きにより開裂しうる
アミド結合又はエステル結合を形成する。
低級アルキル基は炭素数１〜４のアルキル基である。低
級アルキルの意味に含まれるものとしては、メチル、エ
チル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、sec
−ブチル及びtert−ブチル基がある。これらの基は、置
換によりアミド結合又はエステル結合の酵素開裂を妨害
しないという条件で置換されていてもされていなくても
よい。
用語「アリール」は、合成有機化学者に周知の普通の意
味を有し、すなわち、芳香族炭化水素から１個の原子の
除去により誘導される有機基、例えば、ベンゼンから誘
導されるフェニルである。かかる置換基もまた、いずれ
の置換基も凝固酵素によるエステル結合又はアミド結合
の酵素開裂を妨害しないという条件で置換されていても
よいし非置換でもよい。これらの基質は一般にアルギニ
ン特異性プロテアーゼ類に対する基質である。しかしな
がら、尿中の前記プロテアーゼ類の濃度は極めて低いの
で細菌尿性試験の感度に悪影響を与えることはない。
特に好ましい発色性基質は、 であり、前記式中、指示基Ｉ及び連結基Ｙが３−アミノ
インドールを形成するものである。
３−アミノインドール基質を用いる場合には、比色応答
をなすためにカップリング成分を試験具に包含せしめな
ければならない。適切なカップリング成分はジアゾニウ
ム化合物、例えば、２−メトキシ−４−モルホリノベン
ゼンジアゾニウムクロリド、２，４−ジクロロベンゼン
ジアゾニウム、２，６−ジクロロベンゼンジアゾニウ
ム、５−クロロ−２−メトキシベンゼンジアゾニウム
（ファーストレッドＲＣ）及び２，３′−ジメチルアゾ
ベンゼンジアゾニウム（ファーストレッドＧＢＣ）であ
る。ジアゾ塩、２−メトキシ−４−モルホリノベンゼン
ジアゾニウムクロリド（ＭＭＢＤ）が好ましい。このよ
うに調製され本発明の方法で用いられる試験具は１ml当
り１０４個の細菌細胞を含む尿試料と接触させると桃色
に変化した。細菌濃度が１ml当り１０６個の細菌の場合
にはワイン色を呈した。
ｄ．第二緩衝液 第二緩衝液は、pHを８．０から８．９までの範囲に保つ
ことができなければならない。このpH範囲は、凝固酵素
が合成基質に作用するために最適なpH範囲である。好ま
しい緩衝液はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
〔一般にトリス（ＴＲＩＳ）として知られている〕であ
る。
ｅ．酸性ポリマー 試験管／試験具−法を用いて、色が安定した試験を行う
ために、開裂した脱離基を安定化することができる酸性
ポリマーを担体マトリックスに包含せしめることができ
る。適切な化合物としては商標Gantrez の名でジーエ
ーエフ、ニューヨーク、ニューヨーク、（GAF, New Yor
k, N. Y.）から入手可能なメチルビニルエーテル及びマ
レイン酸のような化合物が挙げられる。Gantrez で前
処理された紙担体中において、好ましい３−アミノイン
ドール基質がジアゾニウム塩と共に用いられると、紫色
の終点が得られ、これは数日間安定である。
ｆ．二価陽イオン 場合により追加の二価陽イオンを担体に包含せしめるこ
とができる。ライセートの活性段階で用いたものと類似
の陽イオンもまたこの点で用いることができる。カルシ
ウムイオンが好ましい。
３．使用 清浄な中間流採取尿試料の一部を、第一緩衝液及び調製
された試験管内混合物１ml当り約３．５〜約７mgの最終
濃度になるのに十分な量のライセートを含む試験管に添
加する。試験管内混合物をライセートを活性化するのに
十分な時間インキュベートする；次いですでに述べたよ
うにして包含せしめた試験具をインキュベートした混合
物と接触させる。接触させた試験具を取出し、次いで開
裂脱離基の濃度を目視により又は計器を用いて測定す
る。普通の殺菌操作が用いられるが試料の前処理は不要
である。
必要な活性化時間は望ましい試験感度により左右される
であろう。試料１ml当り１０４個の細菌に対して感度を
示す試験は、単に１０５個の細菌に対して感度を示すに
過ぎない状態よりもより長いインキュベーション時間を
要するであろう。しかしながら活性化時間はバックグラ
ウンドに対して感度を示してしまう程長くしてはならな
い。活性化は室温におけるよりも温度を高めた方がより
迅速におこるであろう。非希釈尿１ml当り１０４個のE.
coliに対して感度を示す試験を提供するためには、例
えば、アソシエーツ・オブ・ケープ・コッドから得られ
るライセートを用いて、３７℃で１５分間又は室温（２
５℃）で４５分間インキュベートすることが活性化には
必要である。尿１ml当り１０５個の細菌に対して感度を
示す試験は２５℃で３０分間のインキュベーション時間
により得ることができる。所望の感度を示すのに必要な
時間及び温度の決定はこの開示により与えられたことを
もとにして当業者の技量により行われる事柄である、 開裂脱離基の濃度は試験具を活性化された試験管内混合
物と接触させてから２〜５分以内に測定することができ
る。３−アミノインドール基質及びジアゾニウム化合物
が、３−アミノインドール脱離基のための安定剤での前
処理が施されていない担体中に包含されている場合、反
応がおこった試験具を２５％（容量）の酢酸溶液中に浸
漬することにより、発現した色を安定化することができ
る。
試験管／試験具フォーマットは、市販されている試験に
ついて報告されているものより、尿試料中のグラム陰性
菌の存在に対してより高い感度の試験を提供する。加え
て、この試験は室温インキュベーションを用いたとして
も１時間未満で行うことができる。
次の実施例は実施された実験について述べている。実施
例は本発明を説明するために役立つがその範囲を制限す
るものとして解釈されるべきものではなく、その範囲は
特許請求の範囲によってのみ定義される。当業者は組成
物の成分及び反応パラメーターについて、望ましいよう
に変更、置き換え及び変化させることができるであろ
う。
実施例 次の省略形が用いられる： ｇ グラム mmol ミリモル mM ミリモル濃度 ml ミリリットル μ１ マイクロリットル ℃ 摂氏 mp 融点 ｔ−ＢＯＣ tert−ブチルオキシカルボニル ＤＭＦ ジメチルホルムアミド Ａｒｇ アルギニン Ｌｅｕ ロイシン Ｇｌｙ グリシン Ｌ− 左旋性 ＭＳ 質量分析 ＦＡＢ 高速原子衝撃（ＭＳとして） 〔α〕22 D ２２℃における、ナトリウム５８９８Åの
Ｄ線の波長での旋光度 ＣＢｚ カルボベンジルオキシ psi １平方インチ当りのポンド（１psi は１平方
センチメートル当り０．０７０４キログラムの圧力に相
当する） 1 ．標準物の調製 E. coli 斜面培養（slant ）は、ザ・クオリティ・アシ
ュアランス・デパートメント・オブ・エイムズ・ディビ
ジョン（the Quality Assurance Department of Ames D
ivision）、マイルス研究所（Miles Laboratories, In
c.）から入手した。養分肉汁１０mlに E．coliを接種
し、３７℃で１６〜１８時間インキュベートした。この
成長時間により通常貯蔵肉汁１ml当り約１０10個の E．
coliが生成する。実際の E．coli濃度は肉汁を７〜８倍
に希釈し、次いで各希釈物１００μ１を血液寒天平板上
で画線培養を行うことにより測定した。各微生物は１個
の集落（colony）を生成するので、希釈物１００μ１中
の微生物の数は、一晩３７℃でインキュベーションを行
った後寒天上に現われる集落を計測することにより得ら
れる。
計量された貯蔵肉汁を用いてＬＡＬ試験用に適切な E．
coli希釈物を調製し、１週間以内に用いた。この操作に
より、成長及び／又は細胞死中の剥離を防いで、貯蔵肉
汁中の遊離エンドトキシンの量を一定のものに確保する
ことができた。
2．好ましい発色性基質の調製 合成に用いた全てのアミノ酸は左旋性配置を有してい
た。
３−アミノインドール（Ｉ） 冷却器、乾燥管及び添加ロートを備えた２５０ml丸底フ
ラスコに１５分間アルゴンを吹き込んだ。次にナトリウ
ム（１．３ｇ、５７mmol、新たに小片に刻んだもの）及
び無水エタノール１０mlを丸底フラスコに入れ、次い
で、無水エタノール９mlを滴下した。無水エタノールの
添加が終了し反応混合物の穏やかな還流がおさまったと
ころで反応混合物を加熱して１５分間穏やかに還流させ
た。次に加熱源を除去し、次いでインドール（５ｇ、４
５mmol）を添加した。すべてのインドールが溶解するま
で反応混合物を撹拌した。使用に先立ち無水炭酸カリウ
ム上で乾燥したイソアミルニトリル（１２ml、８９mmo
l）を３０分間に亘って滴下した。反応混合物を室温で
アルゴン下に一晩撹拌した。
反応混合物を濃縮してアルコールを除去し、次いで蒸留
水（１００ml）を添加した。得られた混合物を加熱沸騰
させた。アルゴン下で、蒸留水１２５ml中の水酸化カリ
ウム（３０ｇ、５４０mmol）及び亜二チオン酸ナトリウ
ム（２３ｇ、１３２mmol）の溶液を滴加した。暗緑色固
体が分離しはじめ、次いでこの溶液はより淡い色に変り
最終的に黄色になった。水酸化カリウム／亜二チオン酸
ナトリウム溶液の添加後、蒸留水１００mlを添加し、次
いで反応混合物を加熱して１０分間沸騰させた。暗緑色
固体をアルゴン下で熱溶液からろ別した。アルゴン下で
冷却すると黄色ろ液から平板形の黄色結晶が分離した。
黄色結晶を収集し、次いで熱水から再結晶すると淡いベ
ージュ色の針状結晶（Ｉ）２．７ｇ（収率４８％）が得
られた。
mp １２０℃（暗色に変化した） ＭＳ（ＦＡＢ、Ｍ+ ＝１３２，１００％） ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ （II） アルゴン下で、無水ジメチルホルムアミド２５モル中の
ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−ロイシン（５ｇ、２０mmol）及びＮ−
ヒドロキシスクシンイミド（２．３ｇ、２０mmol）の溶
液を氷浴中で冷却した。ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド（４．５ｇ、２２mmol）を添加し、次いで反応混合物
を氷浴中で３時間撹拌した。蒸留水４８ml中のグリシン
（１．５ｇ、２０mmol）及び炭酸水素ナトリウム（３．
４ｇ、４００mmol）の溶液を添加し、次いで得られた混
合物を放置して徐々に室温まで暖め、次いで一晩撹拌し
た。分離してきた白色固体をろ別し、次いでろ液を６規
定の塩酸を用いてpH３に調整した。次に溶液を酢酸エチ
ルで２回抽出した。酢酸エチル抽出物を無水硫酸マグネ
シウム上で乾燥し、次いでまず回転蒸発器で次に高真空
下で濃縮した。濃縮物は油状残渣８ｇとなった。シリカ
ゲル１７０ｇ及び溶離溶媒としてＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３
ＯＨ／ＮＨ４ＯＨ（８０／２０／２ 容量比）を用いる
フラッシュ・クロマトグラフィを行うと白色固体のｔ−
ＢＯＣ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙのアンモニウム塩２．７３
ｇが得られた。このアンモニウム塩約２．３ｇを蒸留水
２０ml中に溶解し、次いで溶液を６規定塩酸を用いてpH
３に調整した。遊離酸を酢酸エチルで２回（全量１００
ml）抽出した。酢酸エチル溶液を硫酸マグネシウム上で
乾燥し、濃縮すると白色固体（II）２．１ｇが得られ
た。
mp １１６〜１１７．５℃ ＭＳ（ＦＡＢ、Ｍ＋１＝２８９） 〔α〕22 D ＝−２８．２゜（Ｃ＝１．１５，ＣＨ３Ｏ
Ｈ） 質量分析 Ｃ13Ｈ24Ｎ２Ｏ５として 計算値：Ｃ，５４．１５；Ｈ，８．３９；Ｎ，９．７１ 実験値：Ｃ，５４．２６；Ｈ，８．３７；Ｎ，９．６２ Ｎα−ＣＢｚ−Ｎω−ニトロ−Ｌ−Ａｒｇ−３−インド
リルアミド（III） アルゴン下で、無水ジメチルホルムアミド８２ml中のＮ
α−ＣＢｚ−Ｎω−ニトロ−Ｌ−アルギニン（１３．４
ｇ、３７．８mmol）及びトリエチルアミン（５．３ml、
３７．８mmol）の溶液をメタノール−ドライアイス浴中
で−２０℃まで冷却した。イソブチルクロロホルメイト
（５ml、３７．８mmol）を添加し、次いで反応混合物を
−２０℃で４５分間撹拌した。次に３−アミノインドー
ル（２．８０ｇ、２１．２mmol）を添加し、次いで得ら
れた混合物を放置して徐々に室温まで暖め一晩撹拌し
た。蒸留水を反応混合物に添加し、５％炭酸水素ナトリ
ウムをpH９に達するまで添加した。次にこの溶液を酢酸
エチル（２５０ml）で２回抽出した。酢酸エチル抽出物
を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濃縮すると淡褐緑
色の油状残渣が得られた。この油状物質をシリカゲル１
７０ｇ及び溶離溶媒としてＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ
（９５：５ 容量比）を用いるフラッシュ・クロマトグ
ラフィにかけた。ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨから再結晶
すると白色結晶（III）５．１８ｇ（収率５３％）が得
られた。
mp ２０２〜２０３℃ ＭＳ（ＦＡＢ、Ｍ＋１＝４６８） 〔α〕22 D ＝＋１３．１゜（Ｃ＝１．０８，ＤＭＦ） 質量分析 Ｃ22Ｈ25Ｎ７Ｏ５として 計算値：Ｃ，５６．５２；Ｈ，５．３９；Ｎ，２０．９
７ 実験値：Ｃ，５６．３２；Ｈ，５．４０；Ｎ，２０．７
７ Ｌ−Ａｒｇ−３−インドリルアミド・２ＨＯＡｃ （I
V） 穏やかに加熱しながらＮα−ＣＢｚ−Ｎω−ニトロ−Ｌ
−Ａｒｇ−３−インドリルアミド（０．９３ｇ、２０mm
ol）を無水エタノール２５ml及び氷酢酸２５mlに溶解す
ると淡黄色溶液が得られた。次に１０％の炭素担持パラ
ジウム（Ｐｄ／Ｃ、５００mg）を添加し、次いでこの混
合物を水素ガス５０psi （１立方センチメートル当り
３．５２キログラム）下で１５時間水素添加した。混合
物をろ過し、次いでろ液を濃縮すると淡緑色油状残渣が
得られた。シリカゲル６３ｇ及び溶離溶媒としてＣＨ２
Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ（１：１ 容量比）を用いるフラッ
シュ・クロマトグラフィにかけると淡褐色固体（IV）３
００mgが得られた。（収率３７％） ＭＳ（ＦＡＢ、Ｍ＋１＝２８９） 質量分析 Ｃ14Ｈ20Ｎ６Ｏ・２ＨＯＡｃ・３Ｈ２Ｏとし
て 計算値：Ｃ，４６．７５；Ｈ，７．４１；Ｎ，１８．１
７ 実験値：Ｃ，４６．７３；Ｈ，７．１２；Ｎ，１７．９
３ ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ａｒｇ−３−イ
ンドリルアミド （Ｖ） アルゴン下で、無水ジメチルホルムアミド１．６ml中の
ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−Ｌｅｕ−グリシン（１５８mg、０．５
５mmol）及びトリエチルアミン（０．０７７ml、０．５
５mmol）の溶液をメタノール−ドライアイス氷浴中で−
２０℃まで冷却した。イソブチルクロロホルメート
（０．０７０ml、０．５５mmol）を添加し、次いで得ら
れる混合物を−２０℃で２５分間撹拌した。無水ジメチ
ルホルムアミド１．１ml中のＬ−Ａｒｇ−３−インドリ
ルアミド・２ＨＯＡｃ（２００mg、０．４９mmol）及び
トリエチルアミン（０．０７０ml、０．４９mmol）の溶
液を添加し、次いで得られた反応混合物を放置して徐々
に室温まで暖め、次いで一晩撹拌した。蒸留水を反応混
合物に添加し、次いでこの溶液を５％水酸化ナトリウム
を用いてpH７．２に調整した。次にこの溶液を濃縮する
と油状残渣が得られ、これを溶離溶媒としてＣＨ２Ｃｌ
２／ＣＨ３ＯＨ／ＮＨ４ＯＨ（８０：２０：５ 容量
比）を用いるフラッシュ・クロマトグラフィにかけ、次
いでＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏから再結晶すると白色固体
（Ｖ）２００mg（収率６７％）が得られた。
mp １２５℃（軟化） ＭＳ（ＦＡＢ、Ｍ＋１＝５５９） 〔α〕22 D ＝−２５．２゜（Ｃ＝１．０６，ＣＨ３Ｏ
Ｈ） 高分解能質量スペクトル（陽イオン型） Ｃ27Ｈ42Ｎ８Ｏ５＋１として 計算値：５５９．３３５５９ 実験値：５５９．３３５６３ 3．試験管／試験具フォーマット １００μｌの尿試料を用いて行う試験管／試験具−法に
用いるのに適切な試験管は、１００mlリン酸塩緩衝液５
０ml及びジ・アソシエーツ・オブ・ケープ・コッド、ウ
ッズ・ホール、マサチューセッツ（the Associates of
Cape Cod, Woods Hole, MA）から入手したライセート
１．７mgを試験管に加えることにより調製した。ワット
マン（Whattman）３１ ＥＴ紙を、ジーエーエフ、ニュ
ーヨーク、ニューヨーク（GAF, New York, N. Y. )から
得た、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンでpH８
ないし９に緩衝化されたGantrezＡＮ−１１９の２％(w/
w) 水溶液中に浸漬した。次にこの紙を空気炉中５０℃
で１０分間乾燥した。前処理を施した乾燥紙を、１０mM
カルシウムイオン、１mMインドール基質（Ｖ）及び０．
２４mM２−メトキシ−４−モルホリノベンゼンジアゾニ
ウムクロリドを含む、pH８．７に緩衝化された溶液中に
浸漬した。二回包含せしめた紙を再び５０℃で乾燥し
た。
清浄な中間流採取尿試料１００μｌを試験管に入れ、次
いで調製された試験管内混合物を３７℃で１５分間イン
キュベートした。２回乾燥−含浸を行った紙片を把手と
してのプラスチック支持体上に貼付けて形成した試験具
を、インキュベートした試験管内混合物に浸漬し、次い
で取出した。混合物との接触２分後に、反応がおこった
試験具の色の発現を読取った。結果はグラフとして第１
図に示してある。このフォーマットは１ml当り１０４個
の細胞を検出することができる。試験具は E．coli濃度
が１ml当りの細胞数が１０６個まで増加すると暗紫色だ
った。色の発現は約２分後に実質的に停止した。試験管
内混合物を２５℃（室温）で４５分間インキュベートし
た場合匹敵する結果が得られた。担体としてイートン
（Eaton)及びダイクマン（Dikeman)２０５紙を用いて匹
敵する感度（１０４）が得られた。
本発明の精神又は範囲を逸脱することなしに多くの、上
記したような本発明の修正及び変更がなされてもよいこ
とは明らかである。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の試験管／試験具−法で集めたデータ
を示すグラフである。試験具は、脱離基として３−アミ
ノインドールを含む発色性ＬＡＬ基質及び色安定化ポリ
マーを用いて調製された。グラフは、波長λに対するパ
ーセント反射率％Ｒをコンピューターによりプロットし
たものである。試験具の色の発現は、１ml当り E．coli
の細胞１０４個を含むようにされた陰性尿試料を用いて
調製した試験管内混合物との接触後４５秒毎に監視し
た。 点線は、接触直後（時間＝０）の試験具の反射率を示
す。断続線は、４５及び９０秒後の反射率を示す。重な
っている実線は、１３５及び２２５秒の間の反射率を示
す。試験具からのパーセント反射率は色量が増すにつれ
て減少する。第１図は安定した色に１３５秒（約２分）
以内に達することを示している。このグラフは実施例
３．の結果を反映したものである。

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】尿試料中のグラム陰性細菌の存在を１０４
    細胞／mlの検出感度で測定するためのグラム陰性菌のス
    クリーニング法であって、 （ａ）測定すべき非希釈尿試料を、カブトガニ・アメボ
    サイト・ライセート（horseshoe crab amebocyte lysat
    e）及びpHを６．３から７．５の範囲に保ち得る第一緩
    衝液を含む試験管に添加して試験管内混合物を調製し、
    この際ライセートの濃度は調製された試験管内混合物１
    ミリリットル当り少なくとも３．５ミリグラムであり； （ｂ）試験管内混合物を、ライセートを活性化するのに
    十分な時間インキュベートし； （ｃ）試験具を、活性化された試験管内混合物と接触さ
    せ、ここで前記試験具は活性化されたライセートにより
    開裂されうる発色性又は発蛍光性脱離基を含む合成ペプ
    チド基質及びpHを８．０から８．９の範囲に保ち得る第
    二緩衝液を包含せしめた担体マトリックスからなり； （ｄ）接触させた試験具を取出し；次いで （ｅ）開裂した脱離基の濃度を測定する 各工程からなることを特徴とするスクリーニング法。
  2. 【請求項２】ライセートが、リムルス・アメボサイト・
    ライセートである請求項１記載のスクリーニング法。
  3. 【請求項３】担体マトリックスが、更に二価陽イオンを
    包含している請求項１記載のスクリーニング法。
  4. 【請求項４】インキュベーションに先立って試験管に二
    価陽イオンが更に添加される請求項１記載のスクリーニ
    ング法。
  5. 【請求項５】二価陽イオンが、カルシウム、マグネシウ
    ム、ストロンチウム及びマンガンの陽イオンから選ばれ
    る請求項３記載のスクリーニング法。
  6. 【請求項６】二価陽イオンが、カルシウムである請求項
    ５記載のスクリーニング法。
  7. 【請求項７】脱離基が発色性である請求項１記載のスク
    リーニング法。
  8. 【請求項８】発色性脱離基が３−アミノインドールであ
    り、担体マトリックスが更にジアゾニウム塩を包含して
    いる請求項１記載のスクリーニング法。
  9. 【請求項９】担体マトリックスが、メチルビニルエーテ
    ル及び無水マレイン酸の共重合体から選択された酸性ポ
    リマーを用いて前処理を施されている請求項８記載のス
    クリーニング法。
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