CS270355B1 - Způsob stanoveni aktivity protaolytických enzymů a prostředek ka stanoveni této. aktivity - Google Patents

Abstract

gešenl sa týká způsobu stanoveni aktivity protoolytických enzymů v čistých a technických preparátech, v biologickém aatoriálu, například v tělních tekutinách, zejména v krvi nabo moči. Podstata řeěení spočívá v tom, že aa zkoumaný vzorek a obsahem proteolytického enzyau uvádí va styk s peptidickým deriváte· p-fsnylsndiaminu obacného vzorca I ve vodném prostředí o hodnotou pH 5' až 10. štěpná reakce so zastaví úpravou pH na hodnotu 0,1 až 4 za přídavku sloučeniny obecného vzorce W-CHO. Po proběhlé p raakci so vzniklé zbarveni analyticky vyhodnotí.

Description

Vynález se týká způsobu stanovení aktivity proteolytických enzymů v čistých a technických preparátech, v biologickém materiálu, například v tělních tekutinách, zejména v krvi nebo moči; vynález se také týká prostředku ke stanoveni aktivity proteolytických enzymů.

□ak je známo, má rychlý a jednoduchý průkaz aktivity proteolytických enzymů, zejména v biologickém materiálu,’význam v humánní i veterinární medicíně, především jako ukazatel popřípadě porušené biologické rovnováhy, dále v biotechnologických procesech (například při produkci bakteriálních proteináz), při kontrole procesů používajících proteinázy, v zemědělství, v potravinářském průmyslu a v dalěich odvětvích.

V novější době se v oboru průkazu proteolytických enzymů významně uplatnily syntetické chromogenní substráty na bázi peptidických derivátů p-nitroanilinu (popřípadě s jiným chromoforem v molekule substrátu). Použitelnost těchto substrátů je založena na skutečnosti, že proteolytické enzymy ve vhodně uspořádaném reakčnim systému js ětěpi za uvolnění p-nitroanilinu, který systém charaktericky zbarví; tohoto zbarvení, rss- , pektlve jeho intenzity, lze analyticky využit; v nejjednodušším případě alespoň k průkazu proteolytického enzymu ve zkoumaném materiálu, za definovaných podmínek a s vhodným přístrojovým vybavením potom i ke kvantitativnímu atahoveni aktivity daného enzymu.

Zbarvení, které po štěpeni protsolytickými enzymy poskytuji chromogenní substráty na bázi peptidických derivátů p-nitroanilinu, je žlutého charakteru. V případech, kdy reakční systém je sám žlutě zabarven nebo aktivita enzymu je nízká, nelze substráty na bázi p~nitroanilidů vůbec použít k průkazu proteinázy.

Byly proto hledány takové syntetické chromogenní substráty, které by neměly uvedené nevýhody a které by naopak byly výhodné k analýze méně čiatých vzorků a navíc umožňovaly rychlý a jednoduchý (orientační, screeningový) průkaz vs stižených podmínkách praxe, a to i méně kvalifikovanému psraonálu. Nově syntetizované peptidické deriváty p-fenylendiaminu, ve kterých jsou vestavěny peptidické zbytky specificky resgujíci s určitými proteolytickými enzymy nebo skupinou těchto enzymů, poskytují za podmínek podrobně popsaných níže, intenzívni zbarveni, převážně červeného odstínu, které možnosti průkazu a stanoveni proteolytických enzymů podstatně usnadňují.

Vynález se týká způsobu stanovení aktivity proteolytických enzymů v čistých a technických preparátech, v biologickém materiálu, například v tělních tekutinách, zejména v krvi nebo moči, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se zkoumaný vzorek s obsahem proteolytického enzymu uvádí ve styk s peptidickým derivátem p-fenylendiaminu obecného vzorce I

A - B - C - O - CONH - - N - CH - W (I), kde značí A atom vodíku, zbytek kyseliny pyroglutamové, karboxyalkankarbonylovou skupinu se 4 až 6 atomy uhlíku, B zbytek glycinu, alaninu, prolinu nebo nulu,

C zbytek glycinu, alaninu, prolinu nebo nulu, popřípadě hiatidinu, o zbytek alaninu, valinu, leucinu, fenylalaninu, tyrosinu, lysinu nebo argininu, w šestičlenné aromatické jádro nebo pětičlenné heterocyklické jádro obaahujici kyslík nebo dusík jako heteroatom, přičemž tato jádra jeou substituována alespoň jednou nitroskupinou, dimethylaminoekupinou, hydroxyskupinou nebo metoxyskupinou nebo kombinacemi těchto subetituentů, ve vodném prostředí e hodnotou pH 5 až 10, probíhající štěpná reakce se zaetaví úpravou pH na hodnotu nižší než 4, za předchozího současného nebo následného přídavku sloučeniny obecného vzorce III

W - CHO (III)

CS 270 355 Bl kde W znáči totéž co ve vzorci I, potom se po proběhlé reakci vzniklé zbarveni analyticky vyhodnotí. Toto vyhodnoceni lze podle okolností a požadavků provádět kolorimetricky nebo spektrofotometricky, popřípadě vizuálně srovnáním se standardem nebo i histochemicky.

Princip způsobu stanoveni podle vynálezu lze schematicky znázornit takto:

-N-CH-W A-B-C-D-COOH + HgN- \Qý -N-CHW ^p ' ΪΪΙ)

2) H₂N-<Q\ -N=CHW + OHC-W--\ll) ^pH

V prvém stupni probíhá hydrolytická reakce působením proteinázy ve vodném prostředí s hodnotou pH 5 až 10 (podle povahy enzymu), při teplotě 20 až 37 °C. Vodné prostředí může tvořit vhodný pufr nebo systém pufrů: je možná také přísada látek, které provedeni analyzy vhodně ovlivňují (tensidy, polymery). Ve druhém stupni, který probíhá ve stejném prostředí a při stejné teplotě jako stupeň prvý a začíná sniženim hodnoty pH reakčniho eystému pod hodnotu 4, se štěpením uvolněný monosubstituovaný derivát p-fenylendiaminu uvádí do reakce s aldehydem obecného vzorce III, který se může přidávat předem, nebo současně s acidifikačnim činidlem, nebo také po něm. Touto reakci vzniklý disubstituovaný derivát p-fenylendiaminu vytvoří intenzivní zbarveni, převážně červeného odstínu. Toto zbarveni js stálé po dostatečně dlouhou dobu, takže je lze některou ze známých metod analyticky vyhodnotit, jak již bylo řečeno výše. Intenzita zbarveni je úměrná aktivitě enzymu v analyzovaném materiálu. Specifita a citlivost 1. stupně reakce (hydrolyza) je dána vhodně volenou sekvencí aminokyselin substrátu (A-B-C-D-) s ohledem k analyzovanému enzymu. Také chromoforový zbytek ovlivňuje štěpitelnost substrátu daným enzymem a vzhledem k odpovídájícímu p-nitroanilidu je v některých případech vyšší, v jiných nižší. Druhý stupeň reakce je vysoce specifický a citlivý, takže je možno prokázat i velmi malá množství enzymu ve zkoumaném vzorku. Při realizaci druhého stupně nemusí být aldehyd obecného vzorce III, který slouží k vytvořeni zbarveného produktu, totožný s aldehydem, Jehož zbytek je součástí molekuly výchozího peptidiokého derivátu p-fenylendiaminu obecného vzorce I, tzn., že významy substituentů mohou být rozdílné. Která alternativa se zvolí, záleží na možnostech uživatele.

□ak již bylo řečeno. Je možné způsob stanoveni podle vynálezu realizovat za značně variabilních podmínek, od jednoduchého vytvoření barevného produktu na papirové fólii, na mikrotitračni destičce, ve zkumavce a podobně, až po exaktní výsledky, získané pomoci přístrojového vybaveni. Obzvlášť výhodný je však ten způsob, kterému se z praktických důvodů pro jednoduchost a rychlost dává v určitých případech přednost, tj. použiti indikačních prostředků, obsahujících, podle povahy sledovaného proteolytického enzymu, některou ze sloučenin obecného vzorce I. Indikační prostředky jsou známé a používané, Jejich tvar, materiál, ze kterého jsou zhotoveny a jsjich prostorové uspořádání se volí podle potřeby. Přednost mají především takové indikační prostředky, které jsou levné, snadno dostupné a dobře přizpůsobitelné v co nejširším rozsahu způsobu stanoveni podle vynálezu, zhotovené z vhodného materiálu s kapilárními vlastnostmi, který musí být netečný jak k látkám obecného typu I, tak i meziproduktům, zkoumaným vzorkům s obsahem proteináz, činidlům a prostředí, ve kterém se stanoveni provádí.

Dalším význakem tohoto vynálezu je tedy prostředek ke stanoveni aktivity proteolytických enzymů, jehož podstata spočivá v tom, že sestává z netečného organického

CS 270 355 Bl nebo anorganického materiálu a kapilárními vlastnostmi, obsahujícího peptidický derivát p-fenylendiaminu obecného vzorce I jako chromogenni substrát, činidlo udržující pH systému na hodnotě 5 až 10, činidlo snižujíc! hodnotu pH systému pod 4 a sloučeninu obecného vzorce III v množství nejméně jednoho ekvivalentu, vztaženo na sloučeninu obecného vzorce I. Prostředek ke stanovení aktivity proteináz podle vynálezu, obvykle ve formě nasákavého materiálu, například papíru, umožňuje při vhodném substrátu a citlivé detekci produktu vysoce citlivý průkaz proteolytických enzymů a také i více komponent současně (ať Již enzymatické nebo neenzymatické povahy), umožňuje použit více enzymů lokalizovaných v biologickém materiálu (ne přiklad leukocytech) k Jednomu záměru. Oeho zásadní výhoda tkvi v tom, že ke zhodnocení výsledku analýzy není nutně zapotřebí přístrojového zařízeni, Přsdevěím Je cenný tam, kde jde o rychlý screening. Produkt, který je výsledkem reakci, ilustrovaných schématy 1) a 2), Je natolik intenzívně zbarvený, že k vyhodnoceni poetečí srovnáni s chromatickým standardem.

Způsob podle vynálezu lze obměnit a zjednodušit například tak, že se poslední stupeň syntézy látky obecného vzorce I provádí in situ, a to tak, že se výchozí peptidický derivát p-nitroanilinu redukuje, výhodně chloridem cínatým v kyselině chlorovodívé a podrobí reakci a aldehydem vzorce III, který ee může použit v přebytku, potřebném pro reakci, probíhající po ukončeni hydrolýzy eubetrátu enzymem.

Osou známy, vyráběny a v praxi používány reagenčnl fólie pro etanoveni proteináz-esteráz uvolněných z leukocytů, používané k průkazu leukocytů v biologickém materiálu, který Je založen na esterolytických vlastnostech proteináz. Například některé komerčně dostupné fólie obeahuji peptid-arylesteryj při aplikaci se odštěpený fenol nebo pyrol kopuluje s diazosolí na více nebo méně zbarvenou sloučeninu. Dále je znám způsob průkazu trypsinu pomocí kolagenu e vázaným barvivém, nebo chymotrypsinu (čs. autorské osvědčeni č. 217 802). Oiný způeob (USA pat. epie č. 4 155 916) Je založen na kopulaci aromatických aldehydů (například benzaldehydu a Jeho eubstitučnich derivátů) s aromatickými aminy, například 2-naftylaminu, za tvorby eloučeniny stanovitelné fluorometricky.

Ve srovnáni se známými způsoby Je způsob podle vynálezu specifičtější a mnohdy citlivější, při použití indikačního proatředku Jednoduchý,'rychlý, spolehlivý, s velmi širokou aplikační oolastí, zahrnující mnoho oborů (zdravotnictví, zemědělatvi, potravinářský průmysl).

Užitečnost a výhodnost průkazu proteináz v biologických materiálech plyne z následujících příkladů: .

Přítomnost leukocytů v moči poukazuje na patologický proces v urogenitálnim traktu. Namístě pracného a nepřesného určováni počtu leukocytů pomocí mikroskopu (nezahrnuje rozpadlé leukocyty) poskytuje způsob, který je předmětem vynálezu, rychlou informaci o jejich počtu (prokazatslnost Je ,3 až 5 leukocytů v 1 ul). Přítomnost leukocytárnich proteináz v lavážni tekutině plic indikuje patologický proces v plicích. Přítomnost leukocytárních enzymů v mléce, nebo přítomnost alfa^-antitrypsinu, poukazuje na zánětlivý proces (mastitis) v mlékotvorných orgánech u skotu i lidi.

Způsob podle vynálezu umožňuje rychlou kontrolu biotechnologických procesů, při kterých jsou produkovány proteinázý pro průmyslové účely (například proteinázý produkované v Bacilus subtilis). Způeob umožňuje i rychlý průkaz porušené rovnováhy koagulačniho, fibrinolytického a kininy produkujícího systému v krvi, umožňuje průkaz urokinázy v moči a mnoha dalších. Bližší podrobnosti způsobu podle vynálezu vyplývají z následujících příkladů provedeni, které tento způsob pouze ilustrují, ais nijak neomezuji.

Přiklad 1

a) Příprava substrátu pro trypsin.

100 ml roztoku (0,01 mol/1) pGlu-His-Arg-p-nitroanilidu ve vodě je smícháno se 100 ml . CS 270 355 Bl

0,1 mol/1 SnCl₂ rozpuštěného v 1 mol/1 HC1 a směs je ponechána reagovat cca 1 h při teplotě místnosti. Potom Je do reakční směsi přidáno 20 ml 0,1 mol/1 p-dimetylaminobenzaldehydu rozpuštěného v metanolu a mícháno 1 až 2 h. Reakční směsi je pak upraveno pH na hodnotu 8,2, čímž se vysráži Sn²⁺a Sn⁴⁺ ve formě svých hydroxidů, které se oddělí centrifugací. V roztoku je přítomný pGlu-His-Arg-C0NH-CgH₅-N«> »CH-CgHg-N(CH₃)₂ - substrát pro trypsin a nezreagovaný aldsliyd, který byl přidán v nadbytku.

b) Příprava reagenční fólie a její použiti ke stanoveni trypsinu.

Získaný roztok substrátu Je přímo použit k nasyceni reagenčního proužku. Reagenční proužek může být papír prostý reaktivních skupin, nebo organická syntetická tkanina (vlias, vlizelin), eventuálně anorganický intaktni materiál používaný pro chromatografické účely. Proužek je nasycen vhodným pufram (Tris pH 8,‘2 obsahující 0,025 mol/1 CaCl₂. Do reagenčního proužku Je eventuálně dále přidán 0,05 mol/1 p-dimatylaminobenzaldehyd v 50% metanolu a fólie je vysušena. Trypsin Je přiveden do styku se substrátem na fólii a po hyxrolyze (1 až 5 min) je barva vyvolána okyselením (HC1, kyselina citrónová) za vzniku látky IV. Přídavkem kyseliny je současně zastavena hydrolytická reakce, což umožňuje relativně přesné zjištění zabarveni, a tím i hktivity. Zbarveni 3e odečítá po 30 až 60 sec.

c) Pro přípravu reagenčního proužku lze s výhodou použit čisté substance (substrát - I), zs které je připraven 0,01 až 0,005 mol/1 roztok. Reagenční fólie, do které byl předtím umístěn pufr, Js nasycena roztokem látky I - substrátem. Po hydrolyze Je zbarveni vyvoláno přídavkem reagens, které obsahuje 0,05 mol/1 p-dimstylaminobenzaldehydu (vyvolá červené zberveni) nebo p-dimetylaminocinamaldehydu (vyvolá modré zbarveni) v 1 mol/1 kyeelině chlorovodíkové.

Namísto reagenčního proužku lze použit také mikrotitračních destiček a vzniklý reakční produkt rozpustit přídavkem organického rozpuetidla, s výhodou metanolu, a vzniklé zbarvení hodnotit měřením absorbance při 405 nm pomoci vhodného přístroje.

Přiklad 2

Postupuje ee jako v přikladu la. Připravený subetrát pGlu-His-Arg-p-fenylendiamin-derivát p-dimetylaminobenzaldshydu je použit pro spektrofotometrické stanoveni aktivity trypsinu. Hydrolýzou odštěpený monosubstituovaný derivát p-fenylendiaminu absorbuje maximálně při 405 až 420 nm.

Příklad 3

Postupuje se jako v příkladu 1, když jako výchozí látka pro přípravu substrátu k průkazu leukocytárni elastázv slouží Glt-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilid. Prvá kondenzace js proveden s p-dimetylaminobenzaldehydem a po hydrolyze je produkt kondenzován s p-dimetylaminocinamaldehydem na modře zbarvenou látku. pH při hydrolýzs Je 7,2 až 7,4 udržované fosfátovým pufrem.

Příklad 4

Postupuje se Jako v příkladu 1, přičemž Jako výchozí látky pro přípravu substrátu ks stanovení trombinu je použito Z-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilidu (fosfátový pufr 0,1 mol/1 pH 8,2) a prvé kondenzační látky p-dimstylaminobenzaldehydu. Po hydrolyze Je produkt kondenzován e p-dimetylaminocinamaldehydem ne modrý produkt. Substrát slouží ke stanovení některých koagulačních parametrů (trombin generační test) a spolu s dalšími rsagsnciemi (tromboplastinem, ksfalinsm, Ca ) k průkazu koagulačních faktorů VII a II.

CS 270 355 Bl

Přiklad 5

Postupuje se jako v příkladu 1, když jako výchozí látky je použito p-nitroanilidu s aminokyselinou sekvenci specifickou pro koegulačni faktor X, například Bz-Ile-Glu-Arg-. Průkaz faktoru X je proveden po jeho aktivaci jedem zmije .Russel, kefalinem a Ca²⁺. Substrát je připreven pomoci p-dimetyleminobenzaldehydu a průkaz po hydrolýze je proveden pomoci p-dimetylaminocinamaldehydu.

Přiklad 6

Postupuje se jeko v přikladu 1, když jako výchozí látky je použito H-D-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilidu, hydrolýze je provedena plaamatickým kvallikreinem při pH 8,2 (0,1 mol/1 fosfát). Kondenzace po hydrolýze je provedená 8”p-dimetýláminocinameldahydem, zatímco příprava aubstrátu a p-dimetylaminobenzaldehydem. Substrát umožňuje stanoveni prekallikreinu v lidské krevní plasmě po jeho aktivaci vhodným aktivátorem (například Hageman Faktor fragmentem, dextransulfátem a podobně).

Přiklad 7

Postupuje se jako v přikladu 1, přičemž jako výchozí látky je použito Suc-GlyGlyPhe-p-nitroanilidu, aby se získal substrát k průkazu chymotrypsinu. Prvá kondenzace je provedena za použití p-dimetylaminobenzaldehydu, druhá kondenzace potom p-dimetylaminocinamaldehydu. .

Příklad 8 ul 0,005 mol/1 Glt-Ala-AlaLeu-p-nitroanilidu je na reagančním proužku přivedeno do styku s 10 ul roztoku neutrální proteinázy z Bacillua substilis při pH 7,4 (fosfát 0,1 mol/1) po dobu 2 až 5 min. Hydrolýzou uvolněný p-nitroanilin (žlutý) je přeměněn na modrý produkt přídavkem reagene složeného z 0,05 mol/1 chloridu cínatého a 0,01 mol/1 p-dimetylaminocinamaldehydu v 1 mol/1 HC1. Vzniklé zbarveni je hodnoceno stejným způsobem jako v předcházejících příkladech.

Claims (2)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Způsob stanoveni proteiolytických enzymů v preparátech, v biologickém materiálu, například v krvi a moči, vyznačující se tím, že se zkoumaný roztok s obsahem proteolytického enzymu uvádí ve styk s peptidickým derivátem p-fenylendiaminu obecného vzorce I

   A-B-C-D-CONH--N-CHW (I) kde značí A atom vodíku, zbytek kyseliny pyroglutamové, karboxyalkankarbonylovou skupinu se 4 až 6 atomy uhliku, B zbytek glycinu, aleninu, prolinu nebo nulu,

   C zbytek glycinu, alaninu, prolinu nebo nulu, popřípadě histidinu, □ zbytek alaninu, valinu, leucinu, fenylalaninu, tyrosinu, lysinu nebo argininu

   W šestičlenné aromatické jádro nebo pětičlenné heterocyklické Jádro obsahující kyslík nebo dusík jako heteroatom, přičemž tato jádra jsou substituována aleapoň jednou nitroskupinou, dimetylaminoskupinou, hydroxyskupinou nebo metoxyskupinou, ve vodném prostředí s hodnotou pH 5 až 10, probíhající hydrolytické reakce se zastaví úpravou pH na hodnotu 0,1 až 4 za přídavku sloučeniny obecného vzorce III

   CS 270 355 Bl

   W - CHO (HI)» kde W značí totéž co ve vzorci I, potom se po proběhlé reakci vzniklé zbarvení analyticky vyhodnotí.
2. 2. Prostředek ks stanovení aktivity proteolytických enzymů podle bodu 1, vyznačující se tím, že sestává z inertního materiálu s kapilárními vlastnostmi, například papír, organická syntetická tkanina, silikagel obsahujíc! peptidický derivát p-fenylendiaminu obecného vzorce I jako chromogennl substrát, tlumič udržující pH systému na hodnotě 5 až 10, například tris, fosfátový pufr, činidlo pro snížení hodnoty pH systému , na 0,1 až 4, například kyselinu chlorovodíkovou, citrónovou a sloučeninu obecného vzorce III v množství alespoň jednoho ekvivalentu, vztaženo na sloučeninu obecného vzorce I.