CS270355B1 - Způsob stanoveni aktivity protaolytických enzymů a prostředek ka stanoveni této. aktivity - Google Patents

Abstract

gešenl sa týká způsobu stanoveni aktivity protoolytických enzymů v čistých a technických preparátech, v biologickém aatoriálu, například v tělních tekutinách, zejména v krvi nabo moči. Podstata řeěení spočívá v tom, že aa zkoumaný vzorek a obsahem proteolytického enzyau uvádí va styk s peptidickým deriváte· p-fsnylsndiaminu obacného vzorca I ve vodném prostředí o hodnotou pH 5' až 10. štěpná reakce so zastaví úpravou pH na hodnotu 0,1 až 4 za přídavku sloučeniny obecného vzorce W-CHO. Po proběhlé p raakci so vzniklé zbarveni analyticky vyhodnotí.

Description

CS 270 355 B1 1

Vynález se týká způsobu stanoveni aktivity proteolytických enzymů v čistých atechnických preparátech, v biologickém materiálu, napřiklad v tělních tekutinách, zejmé-na v krvi nebo moči; vynález se také týká prostředku ks stanoveni aktivity proteolytic-kých enzymů.

Oak je známo, má rychlý a jednoduchý průkaz aktivity proteolytických enzymů,zejména v biologickém materiálu,’význam v humánni i veterinární medicíně, předeváimjako ukazatel popřipadě poručené biologické rovnováhy, déle v biotechnologických proce-sech (napřiklad při produkci bakteriálních proteináz), při kontrole procesů používají-cích proteinázy, v zemédéletvi, v potravinářském průmyslu a v daláich odvětvích. V novějši době ee v oboru průkazu proteolytických enzymů významně uplatnily synte-tické chromogenni substráty na bázi peptidických derivátů p-nitroanilinu (popřipadě sjiným chromoforem v molekule substrátu). Použitelnost těchto substrátů je založena naskutečnosti, že proteolytické enzymy ve vhodně uspořádaném reakčnlm systému je ětěplza uvolněni p-nitroanilinu, který systém charaktericky zbarvit tohoto zbarveni, res-pektive jeho intenzity, lze analyticky využitj v nejjednodušším případě alespoň k prů-kazu proteolytického enzymu ve zkoumaném materiálu, za definovaných podmínek a s vhodnýmpřístrojovým vybavením potom i ke kvantitativnímu stanoveni aktivity daného enzymu.

Zbarveni, které po štěpeni proteolytickými enzymy poskytuji chromogenni substrátyna bázi peptidických derivátů p-nitroanilinu, je žlutého charakteru. V případech, kdyreakční systém je sám žlutě zabarven nebo aktivita enzymu Je nízká, nelze substrátyna bázi p-nitroanilidů vůbec použit k průkazu proteinázy.

Byly proto hledány takové syntetické chromogenni substráty, které by neměly uvede-né nevýhody a které by naopak byly výhodné k analýze méně čistých vzorků a navíc umož-ňovaly rychlý a jednoduchý (orientační, ecreeningový) průkaz ve stižených podmínkáchpraxe, a to i méně kvalifikovanému personálu. Nově syntetizované peptidické derivátyp-fenylendiaminu, ve kterých jsou vestavěny peptidické zbytky specificky reagující surčitými proteolytickými enzymy nebo skupinou těchto enzymů, poskytuji za podmínekpodrobně popsaných níže, intenzívni zbarveni, převážně červeného odstínu, které mož-nosti průkazu a stanoveni proteolytických enzymů podstatně usnadňuji.

Vynález se týká způsobu stanoveni aktivity proteolytických enzymů v čistých a tech-nických preparátech, v biologickém materiálu, například v tělních tekutinách, zejménav krvi nebo moči, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se zkoumaný vzorekβ obsahem proteolytického enzymu uvádí ve styk s peptidickým derivátem p-fenylendia-minu obecného vzorce 1 A - B - C - O - CONH - - N CH - W (X), kde značí A atom vodíku, zbytek kyseliny pyroglutamové, karboxyalkankarbonylovou skupinu se4 až 6 atomy uhlíku, B zbytek glycinu, alaninu, prolinu nebo nulu, C zbytek glycinu, alaninu, prolinu nebo nulu, popřípadě histidinu, o zbytek alaninu, valinu, leucinu, fenylalaninu, tyrosinu, lysinu nebo argininu, w šestičlenné aromatické Jádro nebo pětičlenné heterocyklické jádro obsahující kys- lík nebo dusík Jako heteroatom, přičemž tato Jádra jsou substituována alespoňjednou nitroskupinou, dimethylaminoskupinou, hydroxyskupinou nebo metoxyskupinounebo kombinacemi těchto eubstituentů, ve vodném prostředí s hodnotou pH 5 až 10, probíhající štěpná reakce se zastaví úpra- vou pH na hodnotu nižši než 4, za předchozího současného nebo následného přídavku slou-

čeniny obecného vzorce XXI w

CHO (III) 2 CS 270 355 B1 kde W znáči totéž co ve vzorci I, potom se po proběhlé reakcí vzniklé zbarveni analy-ticky vyhodnotí. Toto vyhodnoceni lze podle okolnosti a požadavků provádět kolorime-tricky nebo spektrofotometricky, popřípadě vizuálně srovnáním se standardem nebo ihistochemicky.

Princip způsobu stanoveni podle vynálezu lze schematicky znázornit takto:

V prvém stupni probíhá hydrolytická reakce působením proteinázy ve vodném prostředi s hodnotou pH 5 až 10 (podle povahy enzymu), při teplotě 20 až 37 °C. Vodné prostředi může tvořit vhodný pufr nebo systém pufrůi Je možná také přísada látek, které pro-vedeni analyzy vhodně ovlivňuji (tensidy, polymery). Ve druhém stupni, který probíháve stejném prostředí a při stejné teplotě jako etupeň prvý a začíná snížením hodnotypH reakčniho systému pod hodnotu 4, se štěpením uvolněný monosubstituovaný derivátp-fenylendiaminu uvádí do reakce s aldehydem obecného vzorce III, který se může při-dávat předem, nebo současně s acidifikačnim činidlem, nebo také po něm. Touto reakcivzniklý disubstituovaný derivát p-fenylendiaminu vytvoř! intenzivní zbarveni, převážněčerveného odstínu. Toto zbarveni Je etálé po dostatečně dlouhou dobu, takže je lzeněkterou ze známých metod analyticky vyhodnotit, jak již bylo řečeno výše. Intenzitazbarveni je úměrná aktivitě enzymu v analyzovaném materiálu. Specifita a citlivost 1. stupně reakce (hydrolyza) Je dána vhodně volenou sekvencí aminokyselin substrátu(A-B-C-D-) s ohledem k analyzovanému enzymu. Také chromoforový zbytek ovlivňuje ště-pitelnost substrátu daným enzymem a vzhledem k odpovídajícímu p-nitroanilidu je vněkterých případech vyšší, v jiných nižší. Druhý stupeň reakce je vysoce specifickýa citlivý, takže je možno prokázat i velmi malá množství enzymu ve zkoumaném vzorku.Při realizaci druhého stupně nemusí být aldehyd obecného vzorce III, který slouží kvytvořeni zbarveného produktu, totožný s aldehydem, Jehož zbytek Je součásti moleku-ly výchozího peptidického derivátu p-fenylendiaminu obecného vzorce I, tzn., že vý-znamy substituentů mohou být rozdílné. Která alternativa se zvolí, zálež! na možnos-tech uživatele. □al< již bylo řečeno. Je možné způsob stanoveni podle vynálezu realizovat za znač-ně variabilních podmínek, od Jednoduchého vytvořeni barevného produktu na papírovéfólii, na mikrotitračni destičce, ve zkumavce a podobně, až po exaktní výsledky, zís-kané pomoci přístrojového vybaveni. Obzvlášl výhodný je však ten způsob, kterému sez praktických důvodů pro jednoduchost a rychlost dává v určitých případech přednost,tJ. použiti indikačních prostředků, obsahujících, podle povahy sledovaného proteoly-tického enzymu, některou ze sloučenin obecného vzorce I. Indikační prostředky jsouznámé a používané, Jejich tvar, materiál, ze kterého jsou zhotoveny a Jejich prosto-rové uspořádáni se voli podle potřeby. Přednost máji především takové indikační pro-středky, které Jsou levné, snadno dostupné a dobře přizpůsobitelné v co nejširšimrozsahu způsobu stanoveni podle vynálezu, zhotovené z vhodného materiálu s kapilár-ními vlastnostmi, který musí být netečný Jak k látkám obecného typu I, tak i mezipro-duktům, zkoumaným vzorkům s obsahem proteináz, činidlům a prostředí, ve kterém se sta-noveni provádí.

Dalším význakem tohoto vynálezu Je tedy prostředek ke stanoveni aktivity proteo- lytických enzymů, jehož podstata spočívá v tom, že sestává z netečného organického CS 270 355 B1 3 nebo anorganického materiálu e kapilárními vlastnostmi, obsahujícího peptidický deri-vát p-fenylendiaminu obecného vzorce I jako chromogenní substrát, činidlo udržujícípH systému na hodnotě 5 až 10, činidlo snižující hodnotu pH systému pod 4 a slouče-ninu obecného vzorce III v množství nejméně jednoho ekvivalentu, vztaženo na slouče-ninu obecného vzorce I. Prostředek ke stanoveni aktivity proteináz podle vynálezu, ob-vykle vs formě nasákavého materiálu, například papíru, umožňuje při vhodném substrátua citlivé detekci produktu vysoce citlivý průkaz proteolytických enzymů a také i vícekomponent současně (a? již enzymatické nebo nesnzymatické povahy), umožňuje použit ví-ce enzymů lokalizovaných v biologickém materiálu (na přiklad leukocytech) k jednomuzáměru. Oeho zásadní výhoda tkví v tom, že ke zhodnoceni výsledku analýzy nsni nutnězapotřebí přístrojového zařízení, Předevělm je cenný tam, kde jde o rychlý screening.Produkt, který Je výsledkem reakci, ilustrovaných schématy 1) a 2), Je natolik inten-zívně zbarvený, že k vyhodnoceni postačí srovnáni s chromatickým standardem.

Způsob podle vynálezu lze obměnit a zjednodušit například tak, že se poslední stu-peň syntézy látky obecného vzorce I provádí in šitu, a to tak, že se výchozí peptidic-ký derivát p-nitroanilinu redukuje, výhodně chloridem clnatým v kyselině chlorovodi-vé a podrobí reakci a aldehydem vzorce III, který se může použit v přebytku, potřeb-ném pro reakci, probíhající po ukončeni hydrolýzy substrátu enzymem. □sou známy, vyráběny a v praxi používány reagenčnl fólie pro stanoveni protei-náz-esteráz uvolněných z leukocytů, používané k průkazu lsukocytů v biologickém mate-riálu, který je založen na esterolytických vlastnostech proteináz. Například některékomerčně dostupné fólie obsahují peptid-arylesteryj při aplikaci se odštěpený fenolnebo pyrol kopuluje s diazosolí na více nebo méně zbarvenou sloučeninu. Oále je známzpůsob průkazu trypsinu pomoci kolagenu s vázaným barvivém, nebo chymotrypsinu (čs.autorské osvědčení č. 217 802). Oiný způsob (USA pat. spis č. 4 156 916) je založen nakopulaci aromatických aldehydů (například benzaldehydu a jeho substitučních derivátů)s aromatickými aminy, například 2-naftylaminu, za tvorby sloučeniny stanovitelné fluo-rometricky.

Ve srovnání se známými způsoby je způsob podle vynálezu specifičtější a mnohdycitlivější, při použiti indikačního prostředku jednoduchý,'rychlý, spolehlivý, s vel-mi širokou aplikační oolasti, zahrnující mnoho oborů (zdravotnictví, zemědělství, po-travinářský průmysl). Užitečnost a výhodnost průkazu proteináz v biologických materiálech plyne z násle-dujících příkladů: Přítomnost leukocytů v moči poukazuje na patologický procee v urogenitálnim trak-tu. Namístě pracného a nepřesného určováni počtu leukocytů pomoci mikroskopu (nezahr-nuje rozpadlé leukocyty) poskytuje způsob, který Je předmětem vynálezu, rychlou infor-maci o jejich počtu (prokazatelnost je ,3 až 5 leukocytů v 1 ul). Přítomnost leukocy-tárnich proteináz v lavážni tekutině plic indikuje patologický proces v plicích. Pří-tomnost leukocytárních enzymů v mléce, nebo přítomnost alfa^-antitrypsinu, poukazujena zánětlivý proces (mastitis) v mlékotvorných orgánech u skotu i lidi.

Způsob podle vynálezu umožňuje rychlou kontrolu biotechnologických procesů, přikterých jsou produkovány proteinázy pro průmyslové účely (například proteinázy produ-kované v Bacilus subtilis). Způsob umožňuje i rychlý průkaz porušené rovnováhy koagu-lačniho, fibrinolytického a kininy produkujícího systému v krvi, umožňuje průkaz uro-kinázy v moči a mnoha dalších. Bližší podrobnosti způsobu podle vynálezu vyplývají znásledujících příkladů provedeni, které tento způsob pouze ilustruji, ale nijak neome-zuji. Přiklad 1 a) Příprava substrátu pro trypsin. 100 ml roztoku (0,01 mol/1) pGlu-His-Arg-p-nitroanilidu ve vodě je smícháno se 100 ml 4 CS 270 355 B1 0,1 mol/1 SnCl2 rozpuštěného v 1 mol/1 HC1 a směs Je ponechána reagovat cca 1 hpři teplotě místnosti. Potom Je do reakčnl směsi přidáno 20 ml 0,1 mol/1 p-dime-tylaminobsnzaldehydu rozpuštěného v metanolu a mícháno 1 až 2 h. Reakčnl směsi Jepak upraveno pH na hodnotu 8,2, čímž se vysrážl Sn2+a Sn4+ ve formě svých hydroxi"dů, které se oddělí centrifugaci. V roztoku Je přítomný pGlu-His-Arg-CONH-CgHg-N«>CH-CgH5-N(CH3)2 - substrát pro trypsin a nezreagovaný aldsJíyd, který byl přidánv nadbytku. b) Příprava reagenčnl fólie a JeJi použiti ke stanoveni trypsinu. Získaný roztok substrátu Je přímo použit k nasyceni reagenčniho proužku. Reagenčnlproužek mflže být papír prostý reaktivních skupin, nebo organická syntetická tkani-na (vliee, vlizelin), eventuálně anorganický intaktni materiál používaný pro chro-matograflcké účely. Proužek Je nasycen vhodným pufrem (Tris pH 8,‘2 obsahující0,025 mol/1 CaCl2. Do reagenčniho proužku je eventuálně dále přidán 0,05 mol/1p-dlmetylamlnobenzaldehyd v 50% metanolu a fólie Je vysušena. Trypsin Je přivedendo styku se substrátem na fólii a po hyxrolyze (1 až 5 min) je barva vyvolána oky-selením (HC1, kyselina citrónová) za vzniku látky IV. Přídavkem kyseliny je součas-ně zastavena hydrolytická reakce, což umožňuje relativně přesné zjištěni zabarve-ni, a tlm 1 áktivity. Zbarveni 3e odečítá po 30 až 60 sec. c) Pro přípravu reagenčniho proužku lze s výhodou použit čisté substance (substrát - Ize které Je připraven 0,01 až 0,005 mol/1 roztok. Reagenčnl fólie, do které bylpředtím umístěn pufr. Je nasycena roztokem látky I - substrátem. Po hydrolýze jezbarveni vyvoláno přídavkem reagens, které obsahuje 0,05 mol/1 p-dimetylaminobenzaldehydu (vyvolá červené zbarveni) nebo p-dimetylamlnocinamaldehydu (vyvolá modrézbarveni) v 1 mol/1 kyeellně chlorovodíkové.

Namísto reagenčniho proužku lze použit také mikrotltračnich destiček a vzniklýreakčnl produkt rozpustit přídavkem organického rozpustidla, s výhodou metanolu, avzniklé zbarveni hodnotit měřením absorbance při 405 nm pomoci vhodného přístroje. Přiklad 2

Postupuje se jako v přikladu la. Připravený substrát pGlu-His-Arg-p-fenylendiamin-derivát p-dimetylaminobenzaldehydu Je použit pro spektrofotometrické stanoveni akti-vity trypsinu. Hydrolýzou odštěpený monosubstituovaný derivát p-fenylendlaminu absor-buje maximálně při 405 až 420 nm. Přiklad 3

Postupuje se Jako v přikladu 1, když jako výchozí látka pro přípravu substrátu kprůkazu leukocytárni elastázv slouží Glt-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilid. Prvá konden-zace je proveden s p-dimetylaminobenzaldehydem a po hydrolýze je produkt kondenzováns p-dimetylaminocinamaldehydem na modře zbarvenou látku. pH při hydrolýze je 7,2 až 7,4 udržované fosfátovým pufrem. Přiklad 4

Poetupuje se jako v přikladu 1, přičemž Jako výchoz! látky pro přípravu substrá-tu ke stanoveni trombinu Je použito Z-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilidu (fosfátový pufr0,1 mol/1 pH 8,2) a prvé kondenzační látky p-dimetylaminobenzaldehydu. Po hydrolýzeje produkt kondenzován s p-dimetylaminocinamaldehydem na modrý produkt. Substrát slou-ží ke stanoveni některých koagulačnich parametrů (trombin generační test) a spolu sdalšími reagencismi (tromboplastinem, kefalinem, Ca2+) k průkazu koagulačnich fakto-rů VII a II.

Claims (2)

1. CS 270 355 B1 5 Přiklad 5 Postupuje es Jako v přikladu 1, když Jako výchozi látky Je použito p-nitroanilidue aminokyselinou sekvenci specifickou pro koagulačni faktor X, například Bz-Ile-Glu--Arg-. Průkaz faktoru X Je proveden po Jeho aktivaci Jedem zmije.Russel, kefalinem aCa2+. Substrát Je připraven pomoci p-dimetylaminobenzaldehydu a průkaz po hydrolýze Jeproveden pomoci p-dimetylamlnocinamaldehydu. Přiklad 6 Postupuje se Jako v přikladu 1, když Jako výchozí látky Je použito H-D-Pro-Phe--Arg-p-nitroanilidu, hydrolýza je provedena plaswatickým kvallikreinem při pH 8,2(0,1 mol/1 fosfát). Kondenzace po hydrolýze Je provedená s”p-di»etyláminocinamerdehy-dem, zatímco příprava substrátu s p-dimetylaminobenzaldehydem. Substrát umožňuje stano-veni prekallikreinu v lidské krevní plasmé po jeho aktivaci vhodným aktivátorem (napří-klad Hageman Faktor fragmentem, dextransulfátem a podobné). Přiklad 7 Postupuje se jako v přikladu 1, přičemž Jako výchozi látky je použito Suc-GiyGlyPhe--p-nitroanilidu, aby se získal substrát k průkazu chymotrypsinu. Prvá kondenzace je pro-vedena za použiti p-dimetylaminobenzaldahydu, druhá kondenzace potom p-dimetylaminocin-amaldehydu. Příklad 8 10 ul 0,005 mol/1 Glt-Ala-AlaLeu-p-nitroanllidu je na reagenčnim proužku přivede-no do styku s 10 ul roztoku neutrální proteinázy z Bacillua subatilis při pH 7,4 (fos-fát 0,1 mol/1) po dobu 2 až 5 min. Hydrolýzou uvolněný p-nitroanilin (žlutý) je přemě-něn na modrý produkt přídavkem reagens složeného z 0,05 mol/1 chloridu clnatáho a0,01 mol/1 p-dimetylaminocinamaldahydu v 1 mol/1 HC1. Vzniklá zbarveni ja hodnocenostejným způsobem jako v předcházejících příkladech. pRedmSt VYNÁLEZU

   1. Způsob stanoveni protaolytlckých enzymů v preparátech, v biologickém materiálu,například v krvi a moči, vyznačující se tim, že se zkoumaný roztok s obsahem proteo-lytického enzymu uvádí ve styk s pepťidlckým derivátem p-fenylendiaminu obecného vzor-ce I A-B-C-D-CONH- -N-CHW (I) kde značí A atom vodíku, zbytek kyseliny pyroglutamová, karboxyalkankarbonylovou skupinu se 4 až 6 atomy uhlíku, B zbytek glycinu, alaninu, prolinu nebo nulu, C zbytek glycinu, alaninu, prolinu nebo nulu, popřípadě histidinu, □ zbytek alaninu, valinu, leucinu, fenylalaninu, tyrosinu, lysinu nebo argininu W šestičlenná aromatická jádro nebo pětičlenná heterocyklická jádro obsahující kys- lík nebo dusík jako heteroatom, přičemž tato jádra jsou substituována alespoň jednou nitroskupinou, dimetylaminoskupinou, hydroxyskupinou nebo metoxyskupinou, ve vodném prostředí s hodnotou pH 5 až 10, probíhající hydrolytické reakce se zastaví úpravou pH na hodnotu 0,1 až 4 za přídavku sloučeniny obecného vzorce III 6 CS 270 355 B1 W - CHO (III). kde W znáči totéž co ve vzorci I, potom se po proběhlé reakci vzniklé zbarveni analy-ticky vyhodnoti.
2. 2. Prostředek ke stanoveni aktivity proteolytických enzymů podle bodu 1, vyznaču-jící se tím, že sestává z inertního materiálu s kapilárními vlastnostmi, například pa-pír, organická syntetická tkanina, silikagel obsahujíc! peptldický derivát p-fenylen-diaminu obecného vzorce I jako chromogennl substrát, tlumič udržující pH systému na hod-notě 5 až 10, například tri9, fosfátový pufr, činidlo pro sníženi hodnoty pH systému ,na 0,1 až 4, například kyselinu chlorovodíkovou, citrónovou a sloučeninu obecného vzor-ce III v množství alespoň jednoho ekvivalentu, vztaženo na sloučeninu obecného vzorce I.