CS270355B1

CS270355B1 - A method for determining the activity of protaolytic enzymes and a composition for this. activities

Info

Publication number: CS270355B1
Application number: CS877522A
Authority: CS
Inventors: Miroslav Ing Csc Rybak; Evzen Ing Csc Kasafirek; Eva Rndr Hrboticka
Original assignee: Rybak Miroslav; Kasafirek Evzen; Hrboticka Eva
Priority date: 1987-10-19
Filing date: 1987-10-19
Publication date: 1990-06-13
Also published as: CS752287A1

Abstract

gešenl sa týká způsobu stanoveni aktivity protoolytických enzymů v čistých a technických preparátech, v biologickém aatoriálu, například v tělních tekutinách, zejména v krvi nabo moči. Podstata řeěení spočívá v tom, že aa zkoumaný vzorek a obsahem proteolytického enzyau uvádí va styk s peptidickým deriváte· p-fsnylsndiaminu obacného vzorca I ve vodném prostředí o hodnotou pH 5' až 10. štěpná reakce so zastaví úpravou pH na hodnotu 0,1 až 4 za přídavku sloučeniny obecného vzorce W-CHO. Po proběhlé p raakci so vzniklé zbarveni analyticky vyhodnotí.The invention relates to a method for determining the activity of proteolytic enzymes in pure and technical preparations, in biological materials, for example in body fluids, especially in blood or urine. The essence of the solution lies in the fact that the sample under investigation and containing a proteolytic enzyme is brought into contact with a peptide derivative of p-phenylenediamine of the general formula I in an aqueous medium with a pH value of 5' to 10. The cleavage reaction is stopped by adjusting the pH to a value of 0.1 to 4 with the addition of a compound of the general formula W-CHO. After the process, the resulting color is analytically evaluated.

Description

Vynález se týká způsobu stanovení aktivity proteolytických enzymů v čistých a technických preparátech, v biologickém materiálu, například v tělních tekutinách, zejména v krvi nebo moči; vynález se také týká prostředku ke stanoveni aktivity proteolytických enzymů.The invention relates to a method for determining the activity of proteolytic enzymes in pure and technical preparations, in biological material, for example in body fluids, in particular in blood or urine; the invention also relates to a means for determining the activity of proteolytic enzymes.

□ak je známo, má rychlý a jednoduchý průkaz aktivity proteolytických enzymů, zejména v biologickém materiálu,’význam v humánní i veterinární medicíně, především jako ukazatel popřípadě porušené biologické rovnováhy, dále v biotechnologických procesech (například při produkci bakteriálních proteináz), při kontrole procesů používajících proteinázy, v zemědělství, v potravinářském průmyslu a v dalěich odvětvích.□As is known, rapid and simple detection of proteolytic enzyme activity, especially in biological material, is important in human and veterinary medicine, primarily as an indicator of a possible disturbed biological balance, as well as in biotechnological processes (for example, in the production of bacterial proteinases), in the control of processes using proteinases, in agriculture, in the food industry and in other sectors.

V novější době se v oboru průkazu proteolytických enzymů významně uplatnily syntetické chromogenní substráty na bázi peptidických derivátů p-nitroanilinu (popřípadě s jiným chromoforem v molekule substrátu). Použitelnost těchto substrátů je založena na skutečnosti, že proteolytické enzymy ve vhodně uspořádaném reakčnim systému js ětěpi za uvolnění p-nitroanilinu, který systém charaktericky zbarví; tohoto zbarvení, rss- , pektlve jeho intenzity, lze analyticky využit; v nejjednodušším případě alespoň k průkazu proteolytického enzymu ve zkoumaném materiálu, za definovaných podmínek a s vhodným přístrojovým vybavením potom i ke kvantitativnímu atahoveni aktivity daného enzymu.In recent times, synthetic chromogenic substrates based on peptide derivatives of p-nitroaniline (or with another chromophore in the substrate molecule) have been significantly used in the field of proteolytic enzyme detection. The applicability of these substrates is based on the fact that proteolytic enzymes in a suitably arranged reaction system are responsible for the release of p-nitroaniline, which gives the system a characteristic color; this coloration, depending on its intensity, can be used analytically; in the simplest case, at least for the detection of a proteolytic enzyme in the material under investigation, under defined conditions and with appropriate instrumentation, and then for the quantitative determination of the activity of the given enzyme.

Zbarvení, které po štěpeni protsolytickými enzymy poskytuji chromogenní substráty na bázi peptidických derivátů p-nitroanilinu, je žlutého charakteru. V případech, kdy reakční systém je sám žlutě zabarven nebo aktivita enzymu je nízká, nelze substráty na bázi p~nitroanilidů vůbec použít k průkazu proteinázy.The coloration that chromogenic substrates based on peptide derivatives of p-nitroaniline provide after cleavage by proteolytic enzymes is yellow in nature. In cases where the reaction system itself is yellow in color or the enzyme activity is low, substrates based on p-nitroanilides cannot be used at all for the detection of proteinase.

Byly proto hledány takové syntetické chromogenní substráty, které by neměly uvedené nevýhody a které by naopak byly výhodné k analýze méně čiatých vzorků a navíc umožňovaly rychlý a jednoduchý (orientační, screeningový) průkaz vs stižených podmínkách praxe, a to i méně kvalifikovanému psraonálu. Nově syntetizované peptidické deriváty p-fenylendiaminu, ve kterých jsou vestavěny peptidické zbytky specificky resgujíci s určitými proteolytickými enzymy nebo skupinou těchto enzymů, poskytují za podmínek podrobně popsaných níže, intenzívni zbarveni, převážně červeného odstínu, které možnosti průkazu a stanoveni proteolytických enzymů podstatně usnadňují.Therefore, synthetic chromogenic substrates were sought that would not have the above disadvantages and would, on the contrary, be advantageous for the analysis of less abundant samples and, in addition, would allow for quick and simple (orientational, screening) detection in difficult conditions of practice, even for a less qualified practitioner. Newly synthesized peptide derivatives of p-phenylenediamine, in which peptide residues specifically reacting with certain proteolytic enzymes or a group of these enzymes are incorporated, provide, under the conditions described in detail below, an intense coloration, predominantly of a red hue, which significantly facilitates the possibilities of detection and determination of proteolytic enzymes.

Vynález se týká způsobu stanovení aktivity proteolytických enzymů v čistých a technických preparátech, v biologickém materiálu, například v tělních tekutinách, zejména v krvi nebo moči, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se zkoumaný vzorek s obsahem proteolytického enzymu uvádí ve styk s peptidickým derivátem p-fenylendiaminu obecného vzorce IThe invention relates to a method for determining the activity of proteolytic enzymes in pure and technical preparations, in biological material, for example in body fluids, in particular in blood or urine, according to the invention, the essence of which consists in bringing the examined sample containing the proteolytic enzyme into contact with a peptide derivative of p-phenylenediamine of the general formula I

A - B - C - O - CONH - - N - CH - W (I), kde značí A atom vodíku, zbytek kyseliny pyroglutamové, karboxyalkankarbonylovou skupinu se 4 až 6 atomy uhlíku, B zbytek glycinu, alaninu, prolinu nebo nulu,A - B - C - O - CONH - - N - CH - W (I), where A represents a hydrogen atom, a pyroglutamic acid residue, a carboxyalkanecarbonyl group with 4 to 6 carbon atoms, B represents a glycine, alanine, proline residue or zero,

C zbytek glycinu, alaninu, prolinu nebo nulu, popřípadě hiatidinu, o zbytek alaninu, valinu, leucinu, fenylalaninu, tyrosinu, lysinu nebo argininu, w šestičlenné aromatické jádro nebo pětičlenné heterocyklické jádro obaahujici kyslík nebo dusík jako heteroatom, přičemž tato jádra jeou substituována alespoň jednou nitroskupinou, dimethylaminoekupinou, hydroxyskupinou nebo metoxyskupinou nebo kombinacemi těchto subetituentů, ve vodném prostředí e hodnotou pH 5 až 10, probíhající štěpná reakce se zaetaví úpravou pH na hodnotu nižší než 4, za předchozího současného nebo následného přídavku sloučeniny obecného vzorce IIIC a residue of glycine, alanine, proline or zero, optionally hyatidine, o a residue of alanine, valine, leucine, phenylalanine, tyrosine, lysine or arginine, w a six-membered aromatic nucleus or a five-membered heterocyclic nucleus containing oxygen or nitrogen as a heteroatom, wherein these nuclei are substituted by at least one nitro group, dimethylamino group, hydroxy group or methoxy group or combinations of these substituents, in an aqueous medium with a pH value of 5 to 10, the ongoing cleavage reaction is stopped by adjusting the pH to a value lower than 4, with the previous simultaneous or subsequent addition of a compound of general formula III

W - CHO (III)W - CHO(III)

CS 270 355 Bl kde W znáči totéž co ve vzorci I, potom se po proběhlé reakci vzniklé zbarveni analyticky vyhodnotí. Toto vyhodnoceni lze podle okolností a požadavků provádět kolorimetricky nebo spektrofotometricky, popřípadě vizuálně srovnáním se standardem nebo i histochemicky.CS 270 355 Bl where W means the same as in formula I, then the resulting coloration after the reaction is analytically evaluated. This evaluation can be performed colorimetrically or spectrophotometrically, or visually by comparison with a standard, or even histochemically, depending on the circumstances and requirements.

Princip způsobu stanoveni podle vynálezu lze schematicky znázornit takto:The principle of the determination method according to the invention can be schematically illustrated as follows:

-N-CH-W A-B-C-D-COOH + HgN- \Qý -N-CHW ^p ' ΪΪΙ)-N-CH-W ABCD-COOH + HgN- \Qý -N-CHW ^p ' ΪΪΙ)

2) H₂N-<Q\ -N=CHW + OHC-W--\ll) ^pH 2) H ₂ N-<Q\ -N=CHW + OHC-W--\ll) ^pH

V prvém stupni probíhá hydrolytická reakce působením proteinázy ve vodném prostředí s hodnotou pH 5 až 10 (podle povahy enzymu), při teplotě 20 až 37 °C. Vodné prostředí může tvořit vhodný pufr nebo systém pufrů: je možná také přísada látek, které provedeni analyzy vhodně ovlivňují (tensidy, polymery). Ve druhém stupni, který probíhá ve stejném prostředí a při stejné teplotě jako stupeň prvý a začíná sniženim hodnoty pH reakčniho eystému pod hodnotu 4, se štěpením uvolněný monosubstituovaný derivát p-fenylendiaminu uvádí do reakce s aldehydem obecného vzorce III, který se může přidávat předem, nebo současně s acidifikačnim činidlem, nebo také po něm. Touto reakci vzniklý disubstituovaný derivát p-fenylendiaminu vytvoří intenzivní zbarveni, převážně červeného odstínu. Toto zbarveni js stálé po dostatečně dlouhou dobu, takže je lze některou ze známých metod analyticky vyhodnotit, jak již bylo řečeno výše. Intenzita zbarveni je úměrná aktivitě enzymu v analyzovaném materiálu. Specifita a citlivost 1. stupně reakce (hydrolyza) je dána vhodně volenou sekvencí aminokyselin substrátu (A-B-C-D-) s ohledem k analyzovanému enzymu. Také chromoforový zbytek ovlivňuje štěpitelnost substrátu daným enzymem a vzhledem k odpovídájícímu p-nitroanilidu je v některých případech vyšší, v jiných nižší. Druhý stupeň reakce je vysoce specifický a citlivý, takže je možno prokázat i velmi malá množství enzymu ve zkoumaném vzorku. Při realizaci druhého stupně nemusí být aldehyd obecného vzorce III, který slouží k vytvořeni zbarveného produktu, totožný s aldehydem, Jehož zbytek je součástí molekuly výchozího peptidiokého derivátu p-fenylendiaminu obecného vzorce I, tzn., že významy substituentů mohou být rozdílné. Která alternativa se zvolí, záleží na možnostech uživatele.In the first stage, the hydrolytic reaction takes place under the action of proteinase in an aqueous medium with a pH value of 5 to 10 (depending on the nature of the enzyme), at a temperature of 20 to 37 °C. The aqueous medium may be a suitable buffer or buffer system: it is also possible to add substances that suitably influence the analysis (surfactants, polymers). In the second stage, which takes place in the same medium and at the same temperature as the first stage and begins with a decrease in the pH value of the reaction system below 4, the monosubstituted derivative of p-phenylenediamine released by cleavage is reacted with an aldehyde of the general formula III, which may be added beforehand, or simultaneously with the acidifying agent, or also after it. The disubstituted derivative of p-phenylenediamine formed by this reaction forms an intense color, predominantly of a red hue. This color is stable for a sufficiently long time, so that it can be analytically evaluated by one of the known methods, as already mentioned above. The intensity of the coloration is proportional to the activity of the enzyme in the analyzed material. The specificity and sensitivity of the 1st stage of the reaction (hydrolysis) is determined by the appropriately selected sequence of amino acids of the substrate (A-B-C-D-) with respect to the analyzed enzyme. The chromophore residue also affects the cleavage of the substrate by the given enzyme and, in relation to the corresponding p-nitroanilide, it is higher in some cases and lower in others. The second stage of the reaction is highly specific and sensitive, so that even very small amounts of the enzyme in the examined sample can be detected. When implementing the second stage, the aldehyde of general formula III, which serves to form the colored product, may not be identical to the aldehyde, whose residue is part of the molecule of the starting peptide derivative of p-phenylenediamine of general formula I, i.e., the meanings of the substituents may be different. Which alternative is chosen depends on the user's capabilities.

□ak již bylo řečeno. Je možné způsob stanoveni podle vynálezu realizovat za značně variabilních podmínek, od jednoduchého vytvoření barevného produktu na papirové fólii, na mikrotitračni destičce, ve zkumavce a podobně, až po exaktní výsledky, získané pomoci přístrojového vybaveni. Obzvlášť výhodný je však ten způsob, kterému se z praktických důvodů pro jednoduchost a rychlost dává v určitých případech přednost, tj. použiti indikačních prostředků, obsahujících, podle povahy sledovaného proteolytického enzymu, některou ze sloučenin obecného vzorce I. Indikační prostředky jsou známé a používané, Jejich tvar, materiál, ze kterého jsou zhotoveny a jsjich prostorové uspořádání se volí podle potřeby. Přednost mají především takové indikační prostředky, které jsou levné, snadno dostupné a dobře přizpůsobitelné v co nejširším rozsahu způsobu stanoveni podle vynálezu, zhotovené z vhodného materiálu s kapilárními vlastnostmi, který musí být netečný jak k látkám obecného typu I, tak i meziproduktům, zkoumaným vzorkům s obsahem proteináz, činidlům a prostředí, ve kterém se stanoveni provádí.□as already stated. It is possible to implement the method of determination according to the invention under considerably variable conditions, from the simple creation of a colored product on a paper foil, on a microtiter plate, in a test tube and the like, to exact results obtained with the help of instrumentation. However, the method which is preferred in certain cases for practical reasons of simplicity and speed is particularly advantageous, i.e. the use of indicator means containing, according to the nature of the monitored proteolytic enzyme, one of the compounds of the general formula I. Indicator means are known and used. Their shape, the material from which they are made and their spatial arrangement are chosen according to the need. Preference is given to such indicator means which are inexpensive, easily available and easily adaptable to the widest possible range of the determination method according to the invention, made of a suitable material with capillary properties, which must be inert both to substances of general type I and to intermediates, to the examined samples containing proteinases, to the reagents and to the environment in which the determination is carried out.

Dalším význakem tohoto vynálezu je tedy prostředek ke stanoveni aktivity proteolytických enzymů, jehož podstata spočivá v tom, že sestává z netečného organickéhoAnother feature of the present invention is therefore a means for determining the activity of proteolytic enzymes, the essence of which lies in the fact that it consists of an inert organic

CS 270 355 Bl nebo anorganického materiálu a kapilárními vlastnostmi, obsahujícího peptidický derivát p-fenylendiaminu obecného vzorce I jako chromogenni substrát, činidlo udržující pH systému na hodnotě 5 až 10, činidlo snižujíc! hodnotu pH systému pod 4 a sloučeninu obecného vzorce III v množství nejméně jednoho ekvivalentu, vztaženo na sloučeninu obecného vzorce I. Prostředek ke stanovení aktivity proteináz podle vynálezu, obvykle ve formě nasákavého materiálu, například papíru, umožňuje při vhodném substrátu a citlivé detekci produktu vysoce citlivý průkaz proteolytických enzymů a také i více komponent současně (ať Již enzymatické nebo neenzymatické povahy), umožňuje použit více enzymů lokalizovaných v biologickém materiálu (ne přiklad leukocytech) k Jednomu záměru. Oeho zásadní výhoda tkvi v tom, že ke zhodnocení výsledku analýzy není nutně zapotřebí přístrojového zařízeni, Přsdevěím Je cenný tam, kde jde o rychlý screening. Produkt, který je výsledkem reakci, ilustrovaných schématy 1) a 2), Je natolik intenzívně zbarvený, že k vyhodnoceni poetečí srovnáni s chromatickým standardem.CS 270 355 Bl or inorganic material and capillary properties, containing a peptide derivative of p-phenylenediamine of the general formula I as a chromogenic substrate, an agent maintaining the pH of the system at a value of 5 to 10, an agent reducing the pH of the system below 4 and a compound of the general formula III in an amount of at least one equivalent, based on the compound of the general formula I. The means for determining the activity of proteinases according to the invention, usually in the form of an absorbent material, for example paper, allows, with a suitable substrate and sensitive detection of the product, highly sensitive detection of proteolytic enzymes and also multiple components simultaneously (whether enzymatic or non-enzymatic in nature), allows the use of multiple enzymes localized in biological material (e.g. leukocytes) for one purpose. Its fundamental advantage lies in the fact that no instrumentation is necessarily required to evaluate the analysis result, which is valuable where rapid screening is concerned. The product resulting from the reactions illustrated by schemes 1) and 2) is so intensely colored that it can be evaluated by comparison with a chromatic standard.

Způsob podle vynálezu lze obměnit a zjednodušit například tak, že se poslední stupeň syntézy látky obecného vzorce I provádí in situ, a to tak, že se výchozí peptidický derivát p-nitroanilinu redukuje, výhodně chloridem cínatým v kyselině chlorovodívé a podrobí reakci a aldehydem vzorce III, který ee může použit v přebytku, potřebném pro reakci, probíhající po ukončeni hydrolýzy eubetrátu enzymem.The method according to the invention can be modified and simplified, for example, by performing the last stage of synthesis of the substance of general formula I in situ, namely by reducing the starting peptide derivative of p-nitroaniline, preferably with tin(II) chloride in hydrochloric acid and subjecting it to a reaction with an aldehyde of formula III, which can be used in excess, as required for the reaction taking place after the completion of the hydrolysis of eubetrate by the enzyme.

Osou známy, vyráběny a v praxi používány reagenčnl fólie pro etanoveni proteináz-esteráz uvolněných z leukocytů, používané k průkazu leukocytů v biologickém materiálu, který Je založen na esterolytických vlastnostech proteináz. Například některé komerčně dostupné fólie obeahuji peptid-arylesteryj při aplikaci se odštěpený fenol nebo pyrol kopuluje s diazosolí na více nebo méně zbarvenou sloučeninu. Dále je znám způsob průkazu trypsinu pomocí kolagenu e vázaným barvivém, nebo chymotrypsinu (čs. autorské osvědčeni č. 217 802). Oiný způeob (USA pat. epie č. 4 155 916) Je založen na kopulaci aromatických aldehydů (například benzaldehydu a Jeho eubstitučnich derivátů) s aromatickými aminy, například 2-naftylaminu, za tvorby eloučeniny stanovitelné fluorometricky.Known, produced and used in practice reagent films for the detection of proteinase-esterases released from leukocytes, used for the detection of leukocytes in biological material, which is based on the esterolytic properties of proteinases. For example, some commercially available films contain peptide-aryl esters, during application of which the cleaved phenol or pyrrole is coupled with diazo salt to a more or less colored compound. There is also a known method for the detection of trypsin using collagen-bound dye, or chymotrypsin (Czech Patent No. 217,802). Another method (US Pat. No. 4,155,916) is based on the coupling of aromatic aldehydes (for example, benzaldehyde and its substituted derivatives) with aromatic amines, for example, 2-naphthylamine, with the formation of a compound that can be determined fluorometrically.

Ve srovnáni se známými způsoby Je způsob podle vynálezu specifičtější a mnohdy citlivější, při použití indikačního proatředku Jednoduchý,'rychlý, spolehlivý, s velmi širokou aplikační oolastí, zahrnující mnoho oborů (zdravotnictví, zemědělatvi, potravinářský průmysl).Compared to known methods, the method according to the invention is more specific and often more sensitive, when using an indicator agent. It is simple, fast, reliable, with a very wide application area, covering many fields (healthcare, agriculture, food industry).

Užitečnost a výhodnost průkazu proteináz v biologických materiálech plyne z následujících příkladů: .The usefulness and advantage of detecting proteinases in biological materials is evident from the following examples: .

Přítomnost leukocytů v moči poukazuje na patologický proces v urogenitálnim traktu. Namístě pracného a nepřesného určováni počtu leukocytů pomocí mikroskopu (nezahrnuje rozpadlé leukocyty) poskytuje způsob, který je předmětem vynálezu, rychlou informaci o jejich počtu (prokazatslnost Je ,3 až 5 leukocytů v 1 ul). Přítomnost leukocytárnich proteináz v lavážni tekutině plic indikuje patologický proces v plicích. Přítomnost leukocytárních enzymů v mléce, nebo přítomnost alfa^-antitrypsinu, poukazuje na zánětlivý proces (mastitis) v mlékotvorných orgánech u skotu i lidi.The presence of leukocytes in the urine indicates a pathological process in the urogenital tract. Instead of the laborious and inaccurate determination of the number of leukocytes using a microscope (does not include disintegrated leukocytes), the method that is the subject of the invention provides rapid information about their number (the detection is 3 to 5 leukocytes in 1 μl). The presence of leukocyte proteinases in the lung lavage fluid indicates a pathological process in the lungs. The presence of leukocyte enzymes in milk, or the presence of alpha-antitrypsin, indicates an inflammatory process (mastitis) in the milk-forming organs in cattle and humans.

Způsob podle vynálezu umožňuje rychlou kontrolu biotechnologických procesů, při kterých jsou produkovány proteinázý pro průmyslové účely (například proteinázý produkované v Bacilus subtilis). Způeob umožňuje i rychlý průkaz porušené rovnováhy koagulačniho, fibrinolytického a kininy produkujícího systému v krvi, umožňuje průkaz urokinázy v moči a mnoha dalších. Bližší podrobnosti způsobu podle vynálezu vyplývají z následujících příkladů provedeni, které tento způsob pouze ilustrují, ais nijak neomezuji.The method according to the invention enables rapid control of biotechnological processes in which proteinases for industrial purposes are produced (for example, proteinases produced in Bacilus subtilis). The method also enables rapid detection of impaired balance of the coagulation, fibrinolytic and kinin producing systems in the blood, enables detection of urokinase in urine and many others. More detailed information on the method according to the invention is provided in the following examples, which only illustrate the method and do not limit it in any way.

Přiklad 1Example 1

a) Příprava substrátu pro trypsin.a) Preparation of substrate for trypsin.

100 ml roztoku (0,01 mol/1) pGlu-His-Arg-p-nitroanilidu ve vodě je smícháno se 100 ml . CS 270 355 Bl100 ml of a solution (0.01 mol/l) of pGlu-His-Arg-p-nitroanilide in water is mixed with 100 ml of CS 270 355 Bl

0,1 mol/1 SnCl₂ rozpuštěného v 1 mol/1 HC1 a směs je ponechána reagovat cca 1 h při teplotě místnosti. Potom Je do reakční směsi přidáno 20 ml 0,1 mol/1 p-dimetylaminobenzaldehydu rozpuštěného v metanolu a mícháno 1 až 2 h. Reakční směsi je pak upraveno pH na hodnotu 8,2, čímž se vysráži Sn²⁺a Sn⁴⁺ ve formě svých hydroxidů, které se oddělí centrifugací. V roztoku je přítomný pGlu-His-Arg-C0NH-CgH₅-N«> »CH-CgHg-N(CH₃)₂ - substrát pro trypsin a nezreagovaný aldsliyd, který byl přidán v nadbytku.0.1 mol/l SnCl ₂ dissolved in 1 mol/l HCl and the mixture is left to react for about 1 h at room temperature. Then 20 ml of 0.1 mol/l p-dimethylaminobenzaldehyde dissolved in methanol is added to the reaction mixture and stirred for 1 to 2 h. The pH of the reaction mixture is then adjusted to 8.2, thereby precipitating Sn ²⁺ and Sn ⁴⁺ in the form of their hydroxides, which are separated by centrifugation. The solution contains pGlu-His-Arg-C0NH-CgH ₅ -N«> »CH-CgHg-N(CH ₃ ) ₂ - a substrate for trypsin and unreacted aldehyde, which was added in excess.

b) Příprava reagenční fólie a její použiti ke stanoveni trypsinu.b) Preparation of reagent foil and its use for the determination of trypsin.

Získaný roztok substrátu Je přímo použit k nasyceni reagenčního proužku. Reagenční proužek může být papír prostý reaktivních skupin, nebo organická syntetická tkanina (vlias, vlizelin), eventuálně anorganický intaktni materiál používaný pro chromatografické účely. Proužek je nasycen vhodným pufram (Tris pH 8,‘2 obsahující 0,025 mol/1 CaCl₂. Do reagenčního proužku Je eventuálně dále přidán 0,05 mol/1 p-dimatylaminobenzaldehyd v 50% metanolu a fólie je vysušena. Trypsin Je přiveden do styku se substrátem na fólii a po hyxrolyze (1 až 5 min) je barva vyvolána okyselením (HC1, kyselina citrónová) za vzniku látky IV. Přídavkem kyseliny je současně zastavena hydrolytická reakce, což umožňuje relativně přesné zjištění zabarveni, a tím i hktivity. Zbarveni 3e odečítá po 30 až 60 sec.The substrate solution obtained is directly used to saturate the reagent strip. The reagent strip can be paper free of reactive groups, or organic synthetic fabric (fleece, non-woven fabric), or an inorganic intact material used for chromatography purposes. The strip is saturated with a suitable buffer (Tris pH 8.2 containing 0.025 mol/l CaCl _{2 )} . 0.05 mol/l p-dimethylaminobenzaldehyde in 50% methanol is optionally added to the reagent strip and the film is dried. Trypsin is brought into contact with the substrate on the film and after hydrolysis (1 to 5 min) the color is developed by acidification (HCl, citric acid) to form substance IV. The addition of acid simultaneously stops the hydrolysis reaction, which allows a relatively accurate determination of the color, and thus the activity. The color is read after 30 to 60 sec.

c) Pro přípravu reagenčního proužku lze s výhodou použit čisté substance (substrát - I), zs které je připraven 0,01 až 0,005 mol/1 roztok. Reagenční fólie, do které byl předtím umístěn pufr, Js nasycena roztokem látky I - substrátem. Po hydrolyze Je zbarveni vyvoláno přídavkem reagens, které obsahuje 0,05 mol/1 p-dimstylaminobenzaldehydu (vyvolá červené zberveni) nebo p-dimetylaminocinamaldehydu (vyvolá modré zbarveni) v 1 mol/1 kyeelině chlorovodíkové.c) For the preparation of the reagent strip, it is advantageous to use a pure substance (substrate - I), from which a 0.01 to 0.005 mol/l solution is prepared. The reagent foil, into which the buffer was previously placed, is saturated with a solution of substance I - substrate. After hydrolysis, the color is induced by the addition of a reagent containing 0.05 mol/l p-dimethylaminobenzaldehyde (induces a red color) or p-dimethylaminocinnamaldehyde (induces a blue color) in 1 mol/l hydrochloric acid.

Namísto reagenčního proužku lze použit také mikrotitračních destiček a vzniklý reakční produkt rozpustit přídavkem organického rozpuetidla, s výhodou metanolu, a vzniklé zbarvení hodnotit měřením absorbance při 405 nm pomoci vhodného přístroje.Instead of a reagent strip, microtiter plates can also be used and the resulting reaction product dissolved by adding an organic solvent, preferably methanol, and the resulting color evaluated by measuring the absorbance at 405 nm using a suitable instrument.

Přiklad 2Example 2

Postupuje ee jako v přikladu la. Připravený subetrát pGlu-His-Arg-p-fenylendiamin-derivát p-dimetylaminobenzaldshydu je použit pro spektrofotometrické stanoveni aktivity trypsinu. Hydrolýzou odštěpený monosubstituovaný derivát p-fenylendiaminu absorbuje maximálně při 405 až 420 nm.The procedure is as in Example 1a. The prepared substrate pGlu-His-Arg-p-phenylenediamine-derivative of p-dimethylaminobenzaldehyde is used for spectrophotometric determination of trypsin activity. The monosubstituted derivative of p-phenylenediamine cleaved by hydrolysis absorbs maximally at 405 to 420 nm.

Příklad 3Example 3

Postupuje se jako v příkladu 1, když jako výchozí látka pro přípravu substrátu k průkazu leukocytárni elastázv slouží Glt-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilid. Prvá kondenzace js proveden s p-dimetylaminobenzaldehydem a po hydrolyze je produkt kondenzován s p-dimetylaminocinamaldehydem na modře zbarvenou látku. pH při hydrolýzs Je 7,2 až 7,4 udržované fosfátovým pufrem.The procedure is as in Example 1, when Glt-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide is used as the starting material for the preparation of the substrate for the detection of leukocyte elastases. The first condensation is carried out with p-dimethylaminobenzaldehyde and after hydrolysis the product is condensed with p-dimethylaminocinnamaldehyde to a blue-colored substance. The pH during hydrolysis is 7.2 to 7.4 maintained with phosphate buffer.

Příklad 4Example 4

Postupuje se Jako v příkladu 1, přičemž Jako výchozí látky pro přípravu substrátu ks stanovení trombinu je použito Z-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilidu (fosfátový pufr 0,1 mol/1 pH 8,2) a prvé kondenzační látky p-dimstylaminobenzaldehydu. Po hydrolyze Je produkt kondenzován e p-dimetylaminocinamaldehydem ne modrý produkt. Substrát slouží ke stanovení některých koagulačních parametrů (trombin generační test) a spolu s dalšími rsagsnciemi (tromboplastinem, ksfalinsm, Ca ) k průkazu koagulačních faktorů VII a II.The procedure is as in Example 1, with Z-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilide (phosphate buffer 0.1 mol/l pH 8.2) and p-dimethylaminobenzaldehyde as the first condensation agent used as the starting material for the preparation of the substrate for the determination of thrombin. After hydrolysis, the product is condensed with p-dimethylaminocinnamaldehyde to give a blue product. The substrate is used to determine some coagulation parameters (thrombin generation test) and, together with other reagents (thromboplastin, cephalin, Ca ) to detect coagulation factors VII and II.

CS 270 355 BlCS 270 355 Bl

Přiklad 5Example 5

Postupuje se jako v příkladu 1, když jako výchozí látky je použito p-nitroanilidu s aminokyselinou sekvenci specifickou pro koegulačni faktor X, například Bz-Ile-Glu-Arg-. Průkaz faktoru X je proveden po jeho aktivaci jedem zmije .Russel, kefalinem a Ca²⁺. Substrát je připreven pomoci p-dimetyleminobenzaldehydu a průkaz po hydrolýze je proveden pomoci p-dimetylaminocinamaldehydu.The procedure is as in Example 1, when p-nitroanilide with an amino acid sequence specific for coagulation factor X, for example Bz-Ile-Glu-Arg-, is used as the starting material. The detection of factor X is carried out after its activation with Russell's viper venom, cephalin and Ca ²⁺ . The substrate is prepared using p-dimethyleminobenzaldehyde and the detection after hydrolysis is carried out using p-dimethylaminocinnamaldehyde.

Přiklad 6Example 6

Postupuje se jeko v přikladu 1, když jako výchozí látky je použito H-D-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilidu, hydrolýze je provedena plaamatickým kvallikreinem při pH 8,2 (0,1 mol/1 fosfát). Kondenzace po hydrolýze je provedená 8”p-dimetýláminocinameldahydem, zatímco příprava aubstrátu a p-dimetylaminobenzaldehydem. Substrát umožňuje stanoveni prekallikreinu v lidské krevní plasmě po jeho aktivaci vhodným aktivátorem (například Hageman Faktor fragmentem, dextransulfátem a podobně).The procedure is as in Example 1, when H-D-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilide is used as the starting material, hydrolysis is carried out with plasma kallikrein at pH 8.2 (0.1 mol/l phosphate). Condensation after hydrolysis is carried out with 8”p-dimethylaminocinnamaldehyde, while the preparation of the substrate is carried out with p-dimethylaminobenzaldehyde. The substrate allows the determination of prekallikrein in human blood plasma after its activation with a suitable activator (for example, Hageman Factor fragment, dextran sulfate, etc.).

Přiklad 7Example 7

Postupuje se jako v přikladu 1, přičemž jako výchozí látky je použito Suc-GlyGlyPhe-p-nitroanilidu, aby se získal substrát k průkazu chymotrypsinu. Prvá kondenzace je provedena za použití p-dimetylaminobenzaldehydu, druhá kondenzace potom p-dimetylaminocinamaldehydu. .The procedure is as in Example 1, using Suc-GlyGlyPhe-p-nitroanilide as the starting material to obtain the substrate for the detection of chymotrypsin. The first condensation is carried out using p-dimethylaminobenzaldehyde, the second condensation then using p-dimethylaminocinnamaldehyde. .

Příklad 8 ul 0,005 mol/1 Glt-Ala-AlaLeu-p-nitroanilidu je na reagančním proužku přivedeno do styku s 10 ul roztoku neutrální proteinázy z Bacillua substilis při pH 7,4 (fosfát 0,1 mol/1) po dobu 2 až 5 min. Hydrolýzou uvolněný p-nitroanilin (žlutý) je přeměněn na modrý produkt přídavkem reagene složeného z 0,05 mol/1 chloridu cínatého a 0,01 mol/1 p-dimetylaminocinamaldehydu v 1 mol/1 HC1. Vzniklé zbarveni je hodnoceno stejným způsobem jako v předcházejících příkladech.Example 8 µl of 0.005 mol/l Glt-Ala-AlaLeu-p-nitroanilide is contacted on a reagent strip with 10 µl of a solution of neutral proteinase from Bacillus subtilis at pH 7.4 (0.1 mol/l phosphate) for 2 to 5 min. The p-nitroaniline (yellow) released by hydrolysis is converted to a blue product by the addition of a reagent consisting of 0.05 mol/l stannous chloride and 0.01 mol/l p-dimethylaminocinnamaldehyde in 1 mol/l HCl. The resulting color is evaluated in the same way as in the previous examples.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

1. A method for determining proteolytic enzymes in preparations, in biological material, for example in blood and urine, characterized in that the investigated solution containing the proteolytic enzyme is brought into contact with a peptide derivative of p-phenylenediamine of the general formula I

A-B-C-D-CONH--N-CHW (I) where A represents a hydrogen atom, a pyroglutamic acid residue, a carboxyalkanecarbonyl group with 4 to 6 carbon atoms, B represents a glycine, alanine, proline residue or zero,

C a residue of glycine, alanine, proline or zero, or histidine, □ a residue of alanine, valine, leucine, phenylalanine, tyrosine, lysine or arginine

W a six-membered aromatic nucleus or a five-membered heterocyclic nucleus containing oxygen or nitrogen as a heteroatom, wherein these nuclei are substituted with at least one nitro group, dimethylamino group, hydroxy group or methoxy group, in an aqueous medium with a pH value of 5 to 10, the ongoing hydrolysis reactions are stopped by adjusting the pH to a value of 0.1 to 4 with the addition of a compound of general formula III

CS 270 355 Bl

W - CHO (HI)» where W means the same as in formula I, then the color formed after the reaction is analytically evaluated.

2. A means for determining the activity of proteolytic enzymes according to item 1, characterized in that it consists of an inert material with capillary properties, for example paper, organic synthetic fabric, silica gel containing a peptide derivative of p-phenylenediamine of general formula I as a chromogenic substrate, a buffer maintaining the pH of the system at a value of 5 to 10, for example tris, phosphate buffer, an agent for reducing the pH of the system to 0.1 to 4, for example hydrochloric acid, citric acid and a compound of general formula III in an amount of at least one equivalent, based on the compound of general formula I.