FI97151C - Entsymaattinen menetelmä -laktaamiantibioottien määrittämiseksi - Google Patents

Description

• 1 97151

Entsymaattinen menetelmä β-laktaamiantifaioottien määrittämiseksi. - Enzymatisk process för determinering av β-laktam-antibiotika.

Esillä oleva keksintö koskee uutta, nopeaa ja herkkää entsymaattista menetelmää β-laktaamiantibioottien määrittämiseksi biologisesta nesteestä. Se koskee niinikään testipakkausta, jota voidaan käyttää tämän menetelmän suorittamiseksi.

Nykyään sen ohella, että antibiootteja käytetään varsin laajalti terapeuttisina aineina bakteerien aiheuttamien tartuntatautien hoitamiseksi, niitä käytetään niinikään elintarvikkeiden säilytysaineina sekä eläinrehussa kasvua stimuloivina lisäaineina. Tämän vuoksi on olemassa alati kasvava tarve pystyä toteamaan antibioottien läsnäolo, hyvin alhaisienkin pitoisuuksien, kompleksisista biologisista nesteistä kuten maito, virtsa, veri, seerumi, sylki, liha-uutteet, fermentointinesteet tai puskuroidut vesipohjaiset väliaineet.

Maidon tuotanto on esimerkki tästä. Penisilliinien käyttö on todellakin hyvin tuttua meijerikarjän tiettyjen tarttuvien sairauksien hoidossa, esim. utaretulehduksen hoidossa. Kuitenkin ilmeisistä lääketieteellisistä syistä ihmisten käyttöön tarkoitettu maito ei periaatteessa saa sisältää lainkaan anti-* bioottijäämiäkään. Toisaalta penisilliinipitoisuuksilla 0,005 l.U.:ta/ml tai vähemmän voi olla haitallisia vaikutuksia maitopohjaisten tuotteiden, kuten juuston tai jogurtin valmistuksessa. Lisäksi tietyissä maissa lain sallima ylin antibioottipi-toisuus on 0,004 I.U.:ta/ml.

Tämän vuoksi on kyettävä määrittämään nopeasti ja tarkasti penisilliinien pitoisuus karjan tuottamasta maidosta, jolloin tämä on edullisesti kyettävä suorittamaan välittömästi tuotantopaikalla asianomaisella tilalla.

2 97151

Mikrobiologisia menetelmiä, joilla kyetään määrittämään suhteellisen alhaisia fl-laktaamiantibioottien pitoisuuksia biologisista nesteistä, on ollut käytettävissä jo pitkään. Näissä menetelmissä tarkkaillaan, missä määrin antibiooteille herkkien mikro-organismien kasvu estyy biologisisesta nesteestä otetun näytteen läsnä ollessa. Kuitenkin nämä menetelmät ovat aikaaviepiä ja edellyttävät korkeatasoista teknistä taitavuutta; parhaassa tapauksessa tuloksen saaminen voi kestää noin 2 - 3 tuntia, mikä ei käytännössä ole hyväksyttävissä.

Nyttemmin on esitetty nopea mikrobiologinen menetelmä antibioottien läsnäolon toteamiseksi biologisesta nesteestä, tarkemmin ottan maidosta (kts. US-patenttijulkaisu nro 4 239 852).

Tämän menetelmän mukaan tutkittavaa nestenäytettä inkuboidaan toisaalta solujen tai soluosien antibiooteille hyvin herkästä mikro-organismista, tarkemmin ottaen Bacillus stearothermophi-• luksesta. kanssa ja toisaalta antibiootin kanssa, joka on leimattu radioaktiivisella ryhmällä tai entsyymillä. Inkuboin-nissa antibiootti, mikäli sitä näytteessä esiintyy, kilpailee leimatun antibiootin kanssa sitoutumisesta reseptorikeskuksiin solujen tai soluosien pinnalla. Jälkeenpäin leimatun antibiootin se määrä, joka on kiinnittynyt soluihin tai soluosiin, mää-·; ritetään. Tällöin saadaan osoitus antibioottien läsnäolosta (tai puuttumisesta), koska kiinnittyneen leimatun antibiootin määrä on kääntäen verrannollinen antibiootin pitoisuuteen näytteessä.

Tämän US-patenttijulkaisun laatijan mukaan tällä menetelmällä voidaan todeta niinkin alhaisia antibioottipitoisuuksia kuin 0,01 I.U.:ta/ml, tai jopa 0,001 I.U.:ta/ml maidosta, hieman alle 15 minuutissa.

Tämän menetelmän tärkeä huono puoli on kuitenkin, että tämän 3 97151 tuloksen saamiseksi on välttämättä käytettävä antibioottia, joka on leimattu radioaktiivisella ryhmällä (14C tai 125I), jonka määrä on määritettävä käyttämällä erikoislaitteita, kuten esimerkiksi tuikelaskijaa. Lisäksi tällaisten radioaktiivisten materiaalien, pieninäkään määrinä, käsittely ei ole täysin vailla vaaroja analyysia suorittavalle henkilölle.

Myönnettäköön, että tämän US-patenttijulkaisun esimerkissä 2 kuvataan tämän menetelmän toista suoritusmuotoa, jonka mukaan käytetään entsyymillä leimattua antibioottia ja jonka mukaan leimatun antibiootin määrä määritetään visuaalisella kolori-metrisellä menetelmällä. Kuitenkin tällä muunnoksella kyetään toteamaan vain, sisältääkö maitonäyte enemmän (tai vähemmän) kuin 0,05 I.U.:ta/ml penisilliiniä. Tätä menetelmää pidetään siksi vähemmän herkkänä ja siten paljon vähemmän käyttökelpoisena.

Löytyy niinikään kaupallisia testejä, jotka perustuvat mono-. klonaalisten tai polyklonaalisten vasta-aineiden käyttöön. Itse asiassa tunnetusti voidaan valmistaa testejä, jotka perustuvat immunologisen diagnoosin tavanomaisiin tekniikoihin (ELISA, agglutinaatio lateksiin, radioimmunologiset menetelmät ja vastaavat). Esimerkkinä tämän kaltaisesta testistä voidaan mainita SPOT-testi, jota markkinoi Angenics (USA).

Tämän tyyppisten testien huonoja puolia on, että ne ovat yleensä hyvin mutkikkaita ja ennen muuta, että niitä voidaan käyttää vain hyvin rajallisen määrän antibiootteja toteamiseksi. Tämä viimemainittu huono puoli on seurausta vasta-aineiden korkeasta spesifisyydestä; niillä voidaan tunnistaa vain antibiootteja, jotka ovat rakenteellisesti samankaltai-siä kuin immunoinnissa käytetty. Tämä on erityisen merkityksellistä β-laktaamiantibioottien kohdalla.

Tunnetaan niinikään entsymaattinen menetelmä alhaisten β- 4 97151 laktaamiantibioottipitoisuuksien toteamiseksi ihmisseerumista ja maidosta (J-M. FRERE et ai., Antimicrobial Agents and Chemotherapy UL (1980, No. 4), 506 - 510).

Tämä menetelmä (jota kutsutaan tästä eteenpäin "J-M. FRERE-menetelmäksi") on kiinnostavampi, koska se ei edellytä radioaktiivisten materiaalien käyttöä, jotka vaatisivat hienostunutta mittauslaitteistoa, jolloin samanaikaisesti se samoin on hyvin nopea ja huomattavan tarkka. Tämä menetelmä perustuu spesifisen entsyymin käyttöön, eli liukoisen solunulkoisen D-alanyyli-D-alaniinikarboksipeptidaasin käyttöön, jota tuottaa Actinomadura R39 (jota kutsuttiin aiemmin Streptomvces R39:ksi). Esillä olevassa patenttiselityksessä tätä entsyymiä kutsutaan nimellä "entsyymi R39". Tällä entsyymillä on spesifinen aktiivisuus, jonka puitteissa se hydrolysoi D-alanyyli-D-alaniinipäätyryhmiä erilaisista peptideistä vapauttaen päässä sijaitsevan D-alaniinin.

* Entsyymin R39 toinen tärkeä ominaispiirre on, että se reagoi β- laktaamiantibioottien kanssa muodostaen inaktiivisen, oleellisesti irreversiibelin ekvimolekulaarisen entsyymi-antibiootti-kompleksin.

J-M. FRERE-menetelmässä entsyymin R39 näitä ominaisuuksia *: käytetään hyvin alhaisten pitoisuuksien fl-laktaamiantibiootteja « määrittämiseksi. Menetelmä käsittää kolme oleellista vaihetta.

Ensimmäisessä vaiheessa määrättyä näytetilavuutta tutkittavasta nesteestä inkuboidaan tietyn määrän entsyymiä R39 kanssa. Inku-bointi suoritetaan olosuhteissa, joissa fl-laktaamiantibiootti, mikäli näyte sitä sisältää, voi reagoida entsyymin kanssa muodostaen inaktiivisen, oleellisesti irreversiibelin ekvimolekulaarisen entsyymi-antibioottikompleksin.

Toisessa vaiheessa määrättyä määrää substraattia, esim. N®,N·- 5 97151 diasetyyli-L-lysyyli-D-alanyyli-D-alaniinia, inkuboidaan ensimmäisessä vaiheessa saadun tuotteen kanssa olosuhteissa, joissa entsyymi kykenee hydrolysoimaan substraatin, jolloin muodostu D-alaniinia määrä, joka vastaa entsyymin R39 entsymaattista jäännösaktiivisuutta, joka ei ole kömpieksoitunut antibioottiin ensimmäisessä vaiheessa.

Kolmannessa vaiheessa määritetään täten muodostuneen D-alaniinin määrä. Alan ammattilaiset ymmärtänevät vaikeuksitta, että toisessa vaiheessa muodostuneen D-alaniinin määrä on riippuvainen entsyymin jäännösaktiivisuudesta ja on siten kääntäen verrannollinen näytteen sisältämään antibioottimää-rään.

J-M. FRERE-menetelmässä D-alaniinin määrä määritetään entsy-maattisella menetelmällä. Tämä perustuu kahteen, toisiinsa kytkettyyn entsymaattiseen reaktioon. Ensimmäisessä reaktiossa D-alaniini hapetetaan palorypälehapoksi käyttäen D-aminohappo-oksidaasia (koentsyyminsä, flaniivi-adeniini-dinukleotidin, läsnä ollessa); samanaikaisesti muodostuu ilmakehähapesta vastaava määrä vetyperoksidia. Toisessa reaktiossa muodostunutta vetyperoksidia käytetään o-dianisidiinin hapettamiseksi peroksidaasia käyttäen. Muodostuu ruskea väri, jonka (väri-) intensiteetti on riippuvainen D-alaniinin määrästä.

*: Täten on mahdollista määrittää D-alaniinin määrä kolorimetri- sellä menetelmällä, joko visuaalisesti tai mittaamalla optinen tiheys spektrofotometrillä (lambda-maks. = 460 nm).

Täten on mahdollista valmistamalla sarja näytteitä, joiden antibioottipitoisuus tunnetaan, sekä käyttämällä tätä menetelmää muodostaa standardikuvaaja, jossa entsyymin R39 entsymaattisen jäännösaktiivisuuden prosentuaalinen osuus on esitetty antibioottipitoisuuden funktiona.

6 97151

Kvantitatiivisen osoituksen näytteen antibioottipitoisuudesta saamiseksi suoritetaan täsmälleen sama menettely ja antibioot-tipitoisuus määritetään käyttäen apuna tätä standardikuvaajaa.

Luonnollisesti tämä kvantitatiivinen arviointi edellyttää spektrofotometrin käyttöä.

Kuitenkaan spektrofotometriä tai vastaavaa mittalaitetta ei tarvita sen määrittämiseksi, ylittääkö antibioottipitoisuus jonkin tietyn kriittisen rajan vai ei.

Riittää, kun edeltäpäin tiedetään se kriittinen antibiootti-pitoisuus, jossa entsyymin R39 aktiivisuus tulee täysin suppressoiduksi, toisin sanoen, antibioottipitoisuus, jossa D-alaniinia ei enää muodostu lainkaan eikä väriä siten kehity. Kun tämä kriittinen pitoisuus tunnetaan ilmeisesti kyetään määritystulosta yksinkertaisesti visuaalisesti tarkastelemalla päättelemään, sisältääkö jokin tietty näyte antibioottipitoi-suuden, joka ylittää tai alittaa mainitun kriittisen pitoisuuden, vai eikö se sitä sisällä. Siksi ilmeistä on, että käyttämällä tätä menetelmää voidaan saada osoitus antibioottipitoisuudesta maidossa nopeasti ja tarkasti erikoislaitteita käyttämättä.

Edelleen tällä menetelmällä on mahdollista määrittää fi-lak-I taamiantibiootin suhteellisen alhaisia pitoisuuksia maidosta ja ihmisseerumista. Täten esimerkiksi on mahdollista lähtien tilavuudeltaan noin 20 μΐ maitonäytteistä ja inkuboimalla niitä 3 pikomoolin entsyymiä R39 kanssa määrittää kvantitatiivisesti (spektrofotometriä käyttäen) maidon niinikin alhaisia penisil-liinipitoisuuksia kuin 0,02 I.U.:ta/ml, kun taas maidon pitoisuudet, jotka ylittävät 0,09 I.U.:ta/ml, voidaan määrittää kvalitatiivisesti edellä kuvatulla visuaalisella menetelmällä alle yhdessä tunnissa.

il . ik i a.Mi 11·«· 7 97151

Kuitenkin J-M. FRERE-menetelmäl1ä on useita vakavia huonoja puolia. Ensinnäkin J-M. FRERE-menetelmän herkkyys on riittämätön, etenkin kun kyseessä ovat biologiset nesteet (maito, sylki, seerumi ja vastaavat). On totta, että tätä herkkyyttä voitaisiin parantaa joko vähemtämällä käytettyä entsyymin R39 määrää, jolloin tämä kuitenkin nostaisi reaktioaikaa menetelmän sekä ensimmäisessä että toisessa vaiheessa, tai nostamalla näytetilavuutta, jota on inkuboitava entsyymin R39 kanssa, jolloin tässä tapauksessa reaktioaikaa menetelmän ensimmäisessä vaiheessa olisi nostettava. Valitettavasti J-M. FRERE-menetelmän herkkyyttä ei voida parantaa tällä tavalla, etenkään kun kyseessä ovat kompleksiset, alkuperältään biologiset nesteet. Itse asiassa on todettu, ettei kunnollista määritystä voida suorittaa, jos biologisesta nesteestä otetun näytteen tilavuus ylittää tietyn kriittisen arvon, joka vaihtelee biologisen nesteen luonteen mukaan. Täten maidon tai seerumin kyseessä ollen, kun inkuboitava näytetilavuus ylittää noin 50 μΐ, todetaan, että muodostuneen hapettuneen o-dianisidiinin määrä alenee voimakkaasti. Lopuksi virtsan kyseessä ollen ei todeta mitään entsymaattista aktiivisuutta silloinkaan, kun käytetään niinkin alhaisia näytetilavuuksia kuin 10 μΐ. Tämän vuoksi ei ole mahdollista käyttää tätä menetelmää antibioottien määrittämiseksi virtsasta.

Oletetaan, että biologiset nesteet sisältävät aineita, jotka inhiboivat J-M. FRERE-menetelmässä käytettyjen entsyymien vaikutusta. Täten käytännössä tämä merkitsee, että suuria näytetilavuuksia voidaan käyttää vain kaikkein suotuisimmissa olosuhteissa, jolloin hintana on käytettyjen reagenssimäärien kohottaminen ainakin suhteessa tilavuuden kasvuun. Tämä on selvästi epätoivottavaa, kun otetaan huomioon käytettyjen . .·. entsyymien korkea hinta, etenkin D-aminohappo-oksidaasin ja sen kofaktorin, flaviini-adeniini-dinukleotidin.

Parannettua muunnosta J-M. FRERE-enetelmästä markkinoidaan 8 97151 testin muodossa, jonka kauppanimi on "Penzym". Tätä testiä käytetään pääasiassa meijereihin saapuvan maidon seulontates-tinä.

Testi suoritetaan kahdessa vaiheessa. Ensimmäisessä vaiheessa 50 μΐ maitoa inkuboidaan 1,5 pikomoolin entsyymiä R39 kanssa 5 minuutin ajan 47 °C:ssa. Sitten toisessa vaiheessa kaikki reagenssit entsymaattisen jäännösaktiivisuuden määrittämiseksi, eli substraatti Ne'N*_diasetyyli-L-lysyyli-D-alanyyli-D-alanii-ni, D-aminohappo-oksidaasi, flaviini-adeniini-dinukleotidi, peroksidaasi ja kromogeeninen reagenssi, lisätään inkubointi-väliaineeseen ja seosta inkuboidaan 15 minuutin ajan 47 °C:ssa. Inkuboinnin päätyttyä vertaamalla värikarttaan keltainen väri, joka ei vivahda vaaleanpunaiseen, osoittaa B-laktaamiantibioot-teja esiintyvän maidossa 0,017 I.U.:ta/ml ylittävänä pitoisuutena. Toisaalta vaaleanpunainen väri osoittaa joko, ettei antibiootteja ole läsnä (voimakas vaaleanpunainen väri), tai että antibiootteja on läsnä korkeintaan pitoisuutena 0,017 . I.U.:ta/ml, jolloin saadun vaaleanpunaisen värin intensiteetti on kääntäen verrannollinen antibioottipitoisuuteen.

Tämän testin ansiosta maidosta voidaan määrittää niinkin alhaisia antibioottipitoisuuksia kuin 0,017 I.U.:ta/ml visuaalisesti 20 minuutissa.

Kuitenkin myös tällä J-M. FRERE-menetelmän parannetulla muunnoksella on herkkyys- ja nopeusominaisuuksia, jotka eivät salli sen käyttöä sen paremmin maissa, joissa laki sallii vain äärimmäisen alhaisia antibioottipitoisuuksia, esim. 0,004 I.U.:ta/ml, kuin ultranopeana testinäkään, jolla meijerituot-tajan olisi mahdollista suorittaa testit tilallaan alle 5 minuutissa.

Herkkyyden nostoon ja vastauksen saantiin kuluvan ajan lyhentämiseen kohdistuvat Penzym-testissä samat rajoitukset kuin jo il Uit I I I lii 9 97151 mainittiin edellä J-M. FRERE-enetelmän yhteydessä. Lisäksi tämä testi suoritetaan käyttäen hyvin pieniä näyteti1avuuksia, jolloin se edellyttää siten jonkin verran kokemusta mikromääri-tystekniikoista tullakseen oikein suoritettua.

Kaikkien niiden ongelmien välttämiseksi, jotka liittyvät testin käyttöön, joka suoritetaan kokonaisuudessaan biologisen nesteen läsnä ollessa, on esitetty myös menetelmä, jossa entsyymi R39 on immobi1isoitu ei-vesiliukoiseen kantajaan, etenkin poly(N,N-dimetyyliakryyliamidiJhartsiin. Tämä menetelmä julkistetaan US-patenttijulkaisussa nro 4 546 076, ja se käsittää seuraavat 3 vaihetta: (1) tukeen immobilisoitua entsyymiä inkuboidaan biologisen nesteen läsnä ollessa; (2) immobilisoitu entsyymi erotetaan sitten biologisesta nesteestä ja pestään; (3) entsyymin R39 jäännösaktiivisuus määritetään kolorimetri-senä määrityksenä mittaamalla peptidisubstraatista muodostunut D-alaniini käyttäen reagenssisysteemiä, joka käsittää D-amino-oksidaasin ja sen kofaktorin, peroksidaasin ja kromogeenisen reagenssin, jolloin tulos saadaan joko yksinkertaisesti visuaalisesti havainnoimalla tai spektrofoto-metriä käyttäen. Tällä menetelmällä on lukuisia etuja: - biologinen neste ja D-alaniinimäärityksessä käytetyt entsyymit eivät enää joudu kosketuksiin keskenään, koska biologinen neste on jo poistettu menetelmän (2) vaiheessa; - erinomaisia määrityksiä voidaan tehdä suuremmista, aina 5 ml:n näytetilavuuksista; ja - herkkyys on huomattavasti parempi, koska menetelmää voidaan käyttää 0,002 I.U.:ta/ml ylittävien penisilliini-G-pitoisuuk- * sien määrittämiseksi visuaalisesti maidosta.

Kuitenkin menetelmällä on niinikään huonoja puolia: 97 757 10 - kuten kaikissa menetelmissä, jotka edellyttävät erotusvai-hetta, tuloksien toistettavuus ei ole yhtä hyvä kuin menetelmällä, joka suoritetaan homogeenisessa faasissa; - mitä tahansa erotusmenetelmää käytetäänkin, väistämätön seuraus on keston piteneminen ja menetelmän mutkikkuusasteen kohoaminen; - vaikka tällä menetelmällä voidaan päästä korkeaan herkkyyteen yksikertaisesti visuaalisesti havainnoimalla, ja vaikka sillä saadaan määritettyä 0,002 I.U.:ta/ml penisilliini-G:tä, tämän tulokseen saamiseen tarvittava aika on selvästi liian pitkä (ainakin 30 minuuttia), jotta tätä menetelmää voitaisiin käyttää nopeaan toteamiseen maitoa tuotantotilalla kerättäessä; ja - lisäksi kustannukset ovat huomattavasti korkeammat kuin ne olisivat homogeenisessa faasissa suoritettavassa testissä.

Se, että käytössä olisi menetelmä, jolla ei olisi alan aiempien menetelmien, erityisesti J-M. PRERE-menetelmän tai siitä saatujen menetelmien, kuten "PenzymM-testin tai US-patentti-selityksessä 4 546 076 kuvatun menetelmän, erilaisia huonoja puolia, edustaisi huomattavaa teknistä ja kustannuksellista edistysaskelta.

Toisin sanoen esillä olevan keksinnön päämääränä on antaa • φ • käyttöön menetelmä, joka tarjoaa yhdistelmän edullisia ominaisuuksia, sillä: - tulos saadaan hyvin nopeasti, esim. 5 minuutissa tai tätä lyhyemmässä ajassa; - herkkyys on varsin korkea, mikä mahdollistaa menetelmän käytön myös maissa, joissa laki on hyvin ankara edellyt-täessään, että maidon antibioottipitoisuuden ei tulisi ylittää 0,004 I.U.:ta/ml, tai sitä alhaisempaa arvoa; - määritykset voidaan suorittaa suurista, 1 ml:n tai sitä suuremmista näytetilavuuksista, jolloin menetelmän suoritus alan koulutusta vailla olevien henkilöiden toimesta on helppoa; t.

11 97151 - menetelmä on käytössä kustannuksiltaan edullinen ja hyvin yksinkertainen suorittaa.

Nämä päämäärät saavutetaan esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä, jolle ovat tunnusomaisia seuraavat oleelliset ominaispiirteet: (1) entsyymille R39 käytetään erityistä tioesterityyppistä substraattia, jolloin hydrolyysissa muodostuu vapaan SH-ryhmän sisältävä yhdiste, joka voidaan määrittää yksinkertaisella, kustannuksiltaan edullisella kolorimetrisellä menetelmällä ilman, että tarvitaan entsyymejä, joiden aktiivisuutta biologisen nesteen ainesosat häiritsisivät; (2) substraatin hydrolyysi entsyymillä suoritetaan D-aminohapon tai glysiinin läsnä ollessa, jotka aktivoivat tätä hydro-lyysiä huomattavasti.

Esillä oleva keksintö antaa siten käyttöön uuden entsymaattisen menetelmän β-laktaamiantibioottien määrittämiseksi biologisesta nesteestä, jolloin menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: (1) biologista nestettä inkuboidaan liukoisen D-alanyyli-D-alaniinikarboksipeptidaasin kanssa, jonka on tuottanut Actinomadura R39. jolloin mainittu inkubointi suoritetaan olosuhteissa, joissa mainitun nesteen mahdollisesti sisältämä β-laktaamiantibiootti voi reagoida entsyymin kanssa « * muodostaen inaktiivisen ja oleellisesti irreversiibelin ekvimolekulaarisen entsyymi-antibioottikompleksin; (2) vaiheen (1) päätteeksi saatua seosta inkuboidaan substraatti liuoksen kanssa olosuhteissa, joissa entsyymi voi hydrolysoida substraattia, jolloin mainittu substraatti on tioesteri, jonka yleinen kaava on: R -R -S-CH-COOH (I) 1 2 As jossa 12 97151

Ri on bentsoyyli-, fenyyliasetyyli- tai N«~asetyyli-L-lysyy-liradikaali, R2 on glysyyli- tai D-alanyyliradikaali, ja R3 on vetyatomi tai metyyliradikaali, josta substraatista muodostuu sen hydrolyysissä 2-merkapto-alkaanihappoa, jonka kaava on: HS-CH-COOH (II)

R

3 jossa Ra määritellään kuten edellä, määrä, joka on verrannollinen entsymaattiseen jäännösak-tiivisuuteen, jolloin mainittu inkubointi suoritetaan edelleen D-aminohapon tai glysiinin läsnä ollessa, mikä aktivoi substraatin hydrolyysia entsyymillä; (3) vaiheessa (2) muodostuneen kaavan (II) mukaisen 2-merkapto-alkaanihapon määrä määritetään; ja (4) vaiheessa (3) määritettyä arvoa verrataan standardiin antibiootin pitoisuuden biologisessa nesteessä saamiseksi.

Tutkimustyömme puitteissa tällä alueella totesimme, että entsyymillä R39 on spesifistä hydrolyysiaktiivisuutta tiettyjen, päätytioesteriryhmän käsittävien yhdisteiden tioeste-risidoksien suhteen, ja että sillä tarkemmin ottaen on hydro-; lyysiaktiivisuutta edellä mainitun yleisen kaavan (I) mukaisten tioesterien suhteen. Tämä havainto on sinänsä yllättävä, koska parhaan tietämyksemme mukaan alan aiemman teknisen tason puitteissa ei tunneta yhtään esimerkkiä D-alanyyli-D-alaniini-karboksipeptidaasista, joka toimisi myös tioesteraasina. Olemme hyödyntäneet entsyymin R39 tämän odottamattoman ominaisuuden . kehittääksemme uuden, aiempaa paremman entsymaattisen menetelmän fl-laktaamiantibioottien määrittämiseksi biologisista nesteistä.

Vastoin kuin J-M. FRERE-enetelmässä ja vastaavissa, edellä Ί «U» I Hi ' < 13 97151 kuvatuissa menetelmissä tämän keksinnön mukaan käytetty entsyymi R39 on tioesteri, jonka yleinen kaava on I, ja joka muodostaa hydrolyysissa edeltävän kaavan II mukaisen 2-merkaptoalkaanihapon. Tätä uutta substraattia käyttämällä saadaan lukuisia etuja, sekä teknisiä että taloudellisia. Itse asiassa kaavan II mukainen 2-merkaptoalkaanihappo, joka muodostuu tästä substraatista (ja jonka määrä on verrannollinen entsyymin R39 jäännösaktiivisuuteen) voidaan määrittää yksinkertaisella koiorimetrisellä menetelmällä, joka ei enää edellytä sellaisia entsyymejä kuten D-aminohappo-oksidaasi ja sen koentsyymi. Huomattavan kustannussäästön ohella yksi J-M. FRERE-menetelmän pääasiallisista haitoista vältetään täten, koska enää mitään kanssakäymistä biologisen nesteen ainesosien ja koiorimetrisen määrityksen reagenssien, jotka ovat yksinkertaisia kemiallisia reagensseja eivätkä entsyymejä, välillä ei voi tapahtua. Tämän vuoksi esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä määritys voidaan suorittaa suoraan käsittelemättömästä biologisesta nesteestä sellaisenaan; näytteistä ei enää jouduta etukäteen poistamaan erilaisia mahdollisia aineita, jotka voisivat häiritä kolorimetristä määritystä.

Edelleen, koska entsymaattisen jäännösaktiivisuuden määritykseen eivät enää vaikuta biologisissa nesteissä esiintyvät tekijät, on niinikään mahdollista työskennellä biologisilla • nestenäytteillä, joiden tilavuus on aina 10 ml. Esillä olevan keksinnön mukaista menetelmää voidaan siten käyttää suuremmilla tilavuuksilla ja sen suorittaminen alan koulutusta vailla olevien henkilöiden toimesta on siten yhä helpompaa.

Lisäksi, koska voidaan työskennellä suuremmilla näytetilavuuk-silla, esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä on mahdollista päästä huomattavasti aiempaa parempaan herkkyyteen. Kuten osoitetaan jäljempänä esimerkeissä esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä on mahdollista määrittää visuaalisesti ja helposti suuruusluokkaa 0,004 I.U.:ta/ml penisilliini- 14 97151 G:tä olevia määriä maidosta 15 minuutissa. Värikarttaa käyttämällä on onnistutaan mahdollisesti jopa toteamaan niinkin alhaisia pitoisuuksia kuin 0,002 I.U.:ta/ml.

Edelleen olemme yllättäen todenneet, että D-aminohapon tai glysiinin lisääminen nostaa huomattavasti kaavan I mukaisen tioesterityyppisen substraatin hydrolyysireaktion nopeutta entsyymillä. Tutkimustyömme tällä alueella on osoittanut, että lukuisilla D-aminohapoilla sekä glysiinillä voi olla aktivoiva vaikutus tioesterin hydrolyysireaktioon. Parhaimpina aktivaat-toreina voidaan mainita D-alaniini, D-metioniini, D-arginiini, D-fenyylialaniini, D-seriini, D-histidiini, D-valiini, D-tryptofaani ja D-2-aminovoihappo.

Täten esimerkiksi jos entsyymin R39 aktiivisuus ilmaistaan yksiköissä yksikköä milligrammassa entsyymiä (yksi entsyymi-yksikkö hydrolysoi 1 mikromoolin substraattia minuutissa 47 °C:ssa), on todettu, että entsyymin R39 aktiivisuus [(N-bentsoyyli-D-alanyyli)tio]etikkahappoa substraattina käytettäessä on 8 yksikköä D-alaniinin puuttuessa ja 320 yksikköä D-alaniinin läsnä ollessa. Toisin sanoen tämän aktivaattorin läsnä ollessa entsyymin R39 substraatin hydrolyysinopeus on 40 kertaa korkeampi. Toisaalta on niinikään todettu, ettei mikään aminohappo, jolla on L-konfiguraatio, kykene aktivoimaan substraatin hydrolyysiä.

Tämän vuoksi esillä olevan keksinnön mukaan oleellista on, että tioesterityyppisen substraatin hydrolyysi vaiheessa (2) suoritetaan D-aminohapon läsnä ollessa, joka aktivoi entsyymin R39 substraatin hydrolyysiä. Itse asiassa tämä toimenpide mahdol-\ listaa huomattavan ajansäästön menetelmäsuorituksessa. Tällä tavalla esillä olevan keksinnön mukaista menetelmää käyttämällä on penisilliini-G-pitoisuuden 0,016 I.U.:ta/ml määritys maidosta 5 minuutissa helppoa. Vertailun vuoksi "Penzym"-testi vaatii noin 15 minuuttia samaan tulokseen pääsemiseksi. Alan 15 97151 aiemman teknisen tason mukaisiin menetelmiin nähden vastakkaisesti tämän keksinnön mukainen menetelmä on siten erityisen kiinnostava nopeaan antibioottimääritykseen maidosta tätä tilalla kerättäessä, erityisesti, koska sen käyttö on yksinkertaista eikä edellytä hienostuneita laitteita.

Lisäksi olemme myös todenneet, että esillä olevan keksinnön mukaista menetelmää voidaan menestyksekkäästi soveltaa antibioottien määritykseen ei ainoastaan maidosta vaan myös muista biologisista nesteistä kuten seerumista, virtsasta, syljestä, 1ihauutteista, fermentointinesteistä, puskuroiduista vesi-liuoksista sekä muista samankaltäisistä.

Esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän keskeinen etu on siten se, että sitä voidaan käyttää joko suuruusluokkaa noin 0,016 I.U.:ta/ml olevien fl-laktaamiantibioottipitoisuuksien toteamiseksi hyvin lyhyessä ajassa (5 minuuttia) tai hyvin alhaisten, suuruusluokkaa 0,004 I.U.:ta/ml olevien tai sitä alhaisempienkin B-laktaamiantibioottipitoisuuksien toteamiseksi jonkin verran pitemmässä ajassa (15 minuuttia) ilman, että tarvitaan erityisiä analyysilaitteita tai että olisi välttämättä turvauduttava erotusoperaatiota edellyttävään mutkikkaaseen teknologiaan.

Antibiootit, joiden pitoisuuksia voidaan määrittää käyttämällä keksinnön mukaista menetelmää, kuuluvat antibioottien ryhmään, " joille on tunnusomaista fl-laktaamirenkaan esiintyminen molekyylissä, eli säännön mukaisesti kaikki penisilliinit ja kefalo-sporiinit. Esimerkkeinä mainittavia penisilliinejä ovat bentsyylipenisilliini (penisilliini-G), ampisilliini, fenoksi-metyylipenisilliini, karbenisil1iini, metisilliini, oksasil-liini, kloksasilliini ja muut samankaltaiset. Esimerkkeinä kefalosporiineista mainittakoon kefaiosporiini-C, kefaloglysii-ni, kefalotiini, kefaleksiini, kefapiriini ja vastaavat. Erityisen suotuisia tuloksia on saatu penisilliini-G:llä.

« 97151

Esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän (1) vaiheessa määrättyä näyteti1avuutta biologisesta nesteestä inkuboidaan määrätyn määrän entsyymiä R39 kanssa.

Kuten edellä selostettiin, hyvin suurilla näytetilavuuksilla työskentely on mahdollista. Tiettyä määrää entsyymiä R39 kohden nostamalla näyteti1avuutta menetelmän herkkyys nousee vastaavasti. Esimerkiksi kaksinkertaistamalla näytetilavuus, herkkyys kaksinkertaistuu, kolminkertaistamalla näytetilavuus, herkkyys kolminkertaistuu jne. Näytetilavuus voidaan siten valita haluttua herkkyyttä silmälläpitäen. Esimerkiksi maidon kohdalla menetelmän herkkyys voidaan sovittaa asianomaisen käyttömaan lain asettamien standardien mukaiseksi tai meijeriteollisuuden vaatimuksien mukaiseksi.

Sama vaikutus tietyllä tilavuudella biologista nestettä voidaan saada vähentämällä entsyymin R39 määrää (kuten jäljempänä esimerkissä 2). Tässä tapauksessa ei kuitenkaan ainoastaan vaiheen (1) kestoa vaan samoin menetelmävaiheen (2) kestoa on nostet-• tava suhteessa.

Käytännössä käytettävien entsyymi R39 -määrien ja biologisen nesteen määrien valinta riippuu toisaalta tavasta, jolla menetelmä suoritetaan, ja toisaalta halutusta herkkyydestä tai nopeudesta.

Täten esimerkiksi jos keksinnön mukaista menetelmää käytetään maidon kontaminaation määrittämiseksi tuotantotilalla, työskennellään edullisesti suurilla näytetilavuuksilla käsittelyn helpottamiseksi. Edullisia ovat tilavuudet 1 - 10 ml. Jos menetelmä suoritetaan laboratoriossa mikromäärityslaitteistoa käyttäen, varsin soveliaita ovat näyteti1avuudet 50 μΐ - 1 ml.

Lisäksi käytettyjen entsyymin ja biologisen nesteen määrien valinta riippuu oleellisesti halutusta herkkyydestä. Täten il I ta.i ue rt ia· 17 97151 esimerkiksi laboratoriossa, joissa voidaan käyttää pieniä tilavuuksia ja joissa edellytetään 0,01 I.U.:n/ml herkkyyttä, valittu entsyymimäärä on noin 1 pikomoolia ja biologisen nesteen tilavuus on noin 50 μΐ. Herkkyyteen 0,005 ja vastaavasti 0,0025 I.U.:ta/ml pääsemiseksi biologisen nesteen tilavuus nostetaan arvoon 100 μΐ ja vastaavasti 200 μΐ entsyymi-määrää muuttamatta.

Keksinnön mukaisen menetelmän erinomainen herkkyys, nopeus ja tarkkuus ovat seurausta toisaalta entsyymin R39 nimenomaisista ominaisuuksista ja toisaalta menetelmästä, jota käytetään entsyymin R39 jäännösaktiivisuuden määrittämiseksi.

Itse asiassa entsyymille R39 on tunnusomaista: - inaktiivisen ekvimolekulaarisen entsyymi-antibioottikomp-leksin muodostuksen äärimmäinen nopeus: - mainitun kompleksin poikkeuksellinen stabiilisuus, sillä muodostuttuaan se hajoaa vain hyvin hitaasti. Esimerkiksi entsyymin R39 ja penisilliini-G:n välille muodostuneen • kompleksin puoliintumisaika on noin 70 tuntia 37 °C:ssa; ja - erinomainen entsyymiaktiivisuus, minkä osoittaa kaavan (I) mukaisen tioesterityyppisen substraatin päätyryhmän hyvin nopea hydrolyysi spesifisen aktivaattorin läsnä ollessa.

Näiden kolmen tunnuspiirteen ansiosta entsyymillä R39 on etu- ' oikeutettu asema verrattuna muihin tähän mennesssä tunnistet-« tuihin D-alanyyli-D-alaniinikarboksipeptidaaseihin. Itse asiassa koska entsyymi-antibioottikompleksin hajoamisaika on äärettömästi suurempi kuin vastaavasti kompleksin muodostamiseksi ja entsymaattisen jäännösaktiivisuuden mittaamiseksi tarvittava kokonaisaika, ei ole vaaraa, että määritystuloksia vääristäisi vapaan aktiivisen entsyymin vapautuminen, joka seuraisi entsyymi-antibioottikompleksin ennenaikaisesta hajoamisesta .

18 97151

Arvosteltaessa muita tällä hetkellä tunnettuja D-alanyy1i-D-alaniinikarboksipeptidaaseja entsyymi R39 pois sulkien mikään niistä ei täydellisesti täytä näitä ehtoja. Itse asiassa joko kompleksin muodostusnopeus on suunnilleen 10 kertaa hitaampaa tai sitten entsyymi-antibioottikompleksin stabiilisuus on täysin riittämätön tai substraatin hydrolyysinopeus on aivan liian alhainen (näin on asialaita mm. kaikkien membraaniin sitoutuneiden soiunsisäisten karboksipeptidaasien kohdalla). Entsyymi R39 on spesifinen, liukoinen solunulkoinen D-alanyyli-D-alaniinikarboksipeptidaasi, jota erittää Actinomadura R39 viljeltäessä tätä mikro-organismia (joka talletettiin 10. heinäkuuta 1981 Pasteur-instituuttiin Pariisissa, jossa sen hakunumero on 1-127) sopivassa kasvualustassa.

Keksinnön mukaisen menetelmän suorittamiseksi entsyymin on luonnollisesti oltava huomattavan puhdasta. Sen valmistus ja puhdistaminen voidaan suorittaa kirjallisuudessa kuvattujen menetelmien mukaan [tässä yhteydessä kts. J-M. FREERE et ai. julkaisu Biochem. J. 143 (1974) 233 - 240, jonka otsikko on "Molecular Weight, Amino Acid Composition and Physicochemical Properties of the Exocellular DD-Carboxypeptidase-Transpeptidase of Streptomyces R39" (suom. "Solunulkoisen Streptomvces R39 -DD-karboksipeptidaasi-transpeptidaasin molekyy1ipaino, aminohappokoostumus ja fysikokemial1iset ominaisuudet")]. Kuitenkin tätä entsyymiä puhtaassa muodossa on . tällä hetkellä kaupallisestikin saatavana; sitä on saatavissa valmistajalta UCB-Bioproducts S.A., Belgia.

Entsyymin R39 stabiilisuus on erinomainen; se sietää korkeita lämpötiloja aina 60 °C;seen asti. Juuri tästä syystä biologisen nesteen inkubointi entsyymillä R39 voidaan suorittaa vaikeuksitta lämpötiloissa 20 - 50 °C. Edullinen inkubointilämpötila on noin 47 °C. Itse asiassa näissä olosuhteissa inkubointiaika, joka liittyy likeisesti aikaan, joka tarvitaan inaktiivisen ekvimolekulaarisen entsyymi-antibioottikompleksin muodostuk-

» IM 1 »Iti I11.B

19 97151 seen, on hyvin lyhyt. Inkubointi1ämpöti1 an nosto saa aikaan inkubointiajän lyhentämisen ja päinvastoin. Tämän vuoksi on mahdollista lyhentää menetelmän kestoa lämpötilaa nostamalla.

Keksinnön mukaisen menetelmän vaiheessa (2) vaiheen (1) päätteeksi saatua seosta inkuboidaan määrätyn määrän kaavan (I) mukaista tioesterityyppistä substraattia kanssa liuoksessa, kun läsnä on glysiiniä tai D-aminohappoa, joka aktivoi tämän substraatin hydrolyysin tällä entsyymillä. Tämän vaiheen aikana se osuus entsyymistä, joka ei ole kulunut entsyymi-antibiootti-kompleksin muodostukseen menetelmävaiheessa (1), käytetään kaavan (I) mukaisen tioesterityyppisen substraatin hydrolyy-siin. Tässä hydrolyysireaktiossa muodostuu kaavan (II) mukaista 2-merkaptoalkaanihappoa määrä, joka on verrannollinen entsyymin R39 jäännösaktiivisuuteen.

Kaavan (I) mukaiset tioesterit ovat uusia yhdisteitä, lukuunottamatta [(N-bentsoyyliglysyyli)tio]etikkahappoa, joka tunnetaan US-patenttijulkaisusta nro 2 824 863.

Kaavan (I) mukaiset tioesterit voidaan valmistaa tavanomaisella menetelmällä käyttäen sinänsä tunnettuja reaktioita. Yleissääntönä kaavan (III) mukainen happo, joka on edeltäkäsin aktivoitu, esim. seka-anhydridien muotoon tai aktiivisten esterien muotoon, kondensoidaan inertissä 1iuottimessa, kuten kloro-törmissä, dikloorimetaanissa, etyyliasetaatissa tai dimetyyli-formamidissa kaavan (II) mukaiseen 2-merkaptoalkaanihappoon seuraavan reaktioyhtälön mukaan: R a OH + HS-CH-COOH -> (I)

1 2 I

, R ‘ 3 (III) (II) ♦ « jossa Ri, R2 ja Rs määritellään kuten edellä.

20 97151

Esimerkkeinä kaavan (I) mukaisista tioestereistä, joita voidaan käyttää substraatteina, mainittakoon [(N-bentsoyyli-D-alanyy-li)tio]etikkahappo, 2-[(N-bentsoyyli-D-alanyyli)tio]propioni-happo, [N-(fenyyliasetyyli-D-alanyyli)tio]etikkahappo, [(ΝΛ-asetyyli-L-lysyyli-D-alanyyli)tio]etikkahappo ja muut samankaltaiset. Kuitenkin parhaat tulokset saadaan [(N-bentsoyyli-D-alanyyli ) tio 3etikkahapol1 a.

Ei-rajaavina esimerkkeinä D-aminohapoista, jotka voidaan yhdistää aktivaattoreina edellä mainittuihin substraatteihin, voidaan mainita D-alaniini, D-metioniini, D-arginiini, D-fenyy-lialaniini, D-seriini, D-histidiini, D-valiini, D-tryptofaani ja D-2-aminovoihappo.

Keksinnön erityisen edullisen suoritusmuodon mukaan D-alniini yhdistetään substraattina käytettyyn [(N-bentsoyyli-D-alanyy-li)tio]etikkahappoon.

Tarvittavat substraatti- ja aktivaattorimäärät eivät ole kriittisiä edellyttäen, että menetelmä suoritetaan olosuhteissa, joissa entsyymi on kyllästynyt substraatilla.

Vaiheen (2) aikana noudatettavat työskentelyolosuhteet ovat oleellisesti samat kuin esitettiin edellä vaiheelle (1). Inkubointi voidaan suorittaa lämpötiloissa 20 - 50 °C, « edullisesti noin 47 °C:n lämpötilassa. Entsyymin R39 ei-inaktivoidun osuuden inkubointiajän on oltava vähintään riittävä mittauskelpoisen määrän kaavan (II) mukaista 2-merkaptoalkaanihappoa muodostamiseksi. Inkubointilämpötilassa 47 °C tämä aika saattaa vaihdella muutamasta sekunnista 10 minuuttiin riippuen läsnä olevasta entsyymimäärästä sekä näytetilavuudesta. Tätä aikaa voidaan lyhentää nostamalla inkubointilämpötilaa, tai päinvastoin pidentää inkubointi-lämpötilaa laskemalla. Tämän vuoksi on samoin edullista nostaa tämän inkuboinnin lämpötilaa kaikissa tapauksissa, joissa mää- 21 97151 ritysnopeus on tärkeä tekijä.

Optimaalisen entsyymiaktiivisuuden ylläpitämiseksi inkubointi-väliaineen pH-arvon tulisi edullisesti olla 7 - 8,5. Tavallisesti pH pidetään lukemassa noin 8,0 suorittamalla inkubointi sopivassa puskurissa.

Esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän vaiheessa (3) vaiheessa (2) muodostuneen 2-merkaptoalkaanihapon määrä määritetään.

Kaavan (II) mukaisen 2-merkaptoalkaanihapon määritys voidaan suorittaa millä tahansa tunnetulla menetelmällä edellyttäen ainoastaan, että kyseinen menetelmä on nopea, hinnaltaan kohtuullinen sekä spesifinen kaavan (II) mukaiselle 2-merkap-toalkaanihapolle siten, että pois suljetuiksi tulevat kaikki muut määritettävässä nesteessä esiintyvät tuotteet.

Tästä syystä edullinen menetelmä on koiorimetrinen määritys reagenssi1 la, joka tuottaa värin reagoidessaan 2-merkaptoalkaanihapon vapaan SH-ryhmän kanssa.

Kromogeeninen reagenssi voidaan valita tämän tyyppiseen reaktioon normaalisti käytetyistä kemiallisista reagensseista, kuten esimerkiksi 5,5'-ditiobis(2-nitrobentsoehappo), 4,4'-ditiobis(fenyyliamiinin) ja bentsaldehydin kondensaatiotuot-teet, fenantroliini-Fe+++_systeemi ja vastaavat.

Edullinen kromogeeninen reagenssi on 5,5’-ditiobis(2-nitro-bentsoe)happo, jota kutsutaan myös Ellmanin reagenssiksi ja . joka tuottaa keltaisen värin, joka perustuu 2-nitro-5-merkapto-bentsoehappoon, jota muodostuu vaihtoreaktiossa 2-merkaptoal-kaanihapon vapaan SH-ryhmän kanssa. Väri-intensiteetti on täten suoraan 2-merkaptoalkaanihapon määrän funktio.

22 97151

Joissakin sovellutuksissa saattaa kuitenkin olla edullista käyttää punaista väriä, joka muodostuu fenantroliinin ja vapaiden SH-ryhmien välisessä reaktiossa Fe+^-kationien läsnä oliessa.

Käytettävä kromogeenisen reagenssin määrä on riippuvainen kyseisessä nimenomaisessa sovellutuksessa muodostuneen 2-mer-kaptoalkaanihapon määrästä. Edullisesti työskentelyolosuhteet ovat sellaiset, että kromogeenisen reagenssin määrä mooleina on hieman suurempi kuin 2-merkaptoalkaanihapon se suurin mahdollinen moolimäärä, joka voi muodostua menetelmän mukaisessa vaiheessa (2).

Huomattakoon, että entsyymiä R39 on välttämättä oltava läsnä menetelmävaiheen (1) alusta. Samoin substraattia ja aktivaat-toria on välttämättä oltava läsnä vaiheen (2) alusta. Kuitenkin aktivaattori voidaan lisätä vaihetta (1) aloitettaessa ja samoin kromogeeninen reagenssi vodiaan lisätä joko 1. tai 2.

. vaiheen alussa tai vasta vaiheeen (2) lopussa. Edullisessa suoritusmuodossa menetelmävaiheessa (1) entsyymi R39 -liuosta sekä maitonäytettä inkuboidaan aktivaattorin läsnä ollessa, vaiheessa (2) substraatti ja kromogeeninen reagenssi lisätään ja vaiheet (2) ja (3) suoritetaan samanaikaisesti oleellisesti samoissa olosuhteissa kuin mainittu edellä vaiheelle (2).

Menetelmän vaiheessa (4) vaiheessa (3) määritettyä arvoa verrataan standardiin antibiootin pitoisuuden biologisessa nesteessä saamiseksi.

Antibioottipitoisuuden kvantitatiivinen määritys voidaan : suorittaa seuraavalla menetelmällä.

Ensin biologisesta nesteestä valmistetaan sarja näytteitä, joista kukin sisältää tunnetun pitoisuuden β-laktaamianti-bioottia.

23 97151 Tämä sarja sisältää tietyn lukumäärän näytteitä ohella, joissa antibioottipitoisuus kasvaa, biologisesta nesteestä kaksi näytettä, jotka eivät sisällä antibioottia.

Seuraavaksi kaikkia näitä näytteitä käsitellään tarkalleen samalla tavalla esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän vaiheiden (1), (2) ja (3) puitteissa. Kuitenkin toisessa näytteistä, jotka eivät sisällä antibioottia, vaiheessa (1) käytetty entsyymi 1iuos korvataan samalla tilavuudella vettä. Tässä nimenomaisessa tapauksessa tämän vuoksi vaiheen (3) päätteeksi saatu neste sisältää kaikki reagenssit paitsi ei entsyymiä R39. Koska entsyymi puuttuu, vaiheessa (2) ei siten muodostu 2-merkaptoalkaanihappoa, jolloin kromogeeninen reagenssi, eli esim. 5,5'-ditiobis(2-nitrobentsoe)happo, ei anna mitään väriä. Tätä näytettä kutsutaan tästä eteenpäin "sokeaksi kokeeksi".

Vastakkaisesti tähän nähden toinen näyte, joka ei sisällä antibioottia, tuottaa selvän keltaisen värin. Itse asiassa koska näyte ei sisällä antibioottia, entsyymiä R39 ei inak-tivoidu vaiheessa (1), jolloin muodostuu maksimaalinen määrä kaavan (II) mukaista 2-merkaptoalkaanihappoa (joka vastaa käytetyn entsyymin R39 kokonaisaktiivisuutta), jolloin edelleen läsnä on maksimaalinen määrä 5-merkapto-2-nitrobentsoe-happoa ja seurauksena on selvä keltainen väri. Tätä näytettä kutsutaan tästä eteenpäin "verrokkinäytteeksi".

Huomattakoon niinikään, että silloin, kun näytteet sisältävät antibioottia moolimäärän, joka alittaa entsyymin R39 käytetyn moolimäärän, vain jokin osuus tästä entsyymistä inaktivoituu antibiootin vaikutuksesta vaiheessa (1); näissä tapauksissa täten muodostuneen kaavan (II) mukaisen 2-merkaptoalkaanihapon määrä vastaa sen entsyymiosuuden jäännösaktiivisutta, jota antibiootti ei ole inaktivoinut, jolloin tästä seuraten läsnä on niinikään vastaava määrä 5-merkapto-2-nitrobentsoehappoa.

24 97151 Näissä tapauksissa kehittyy samoin keltainen väri, mutta sen intensiteetti on pienempi kuin verrokkinäytteellä havaittu.

Lopuksi silloin, kun näytteet sisältävät antibioottia mooli-määrän, joka on sama tai korkeampi kuin entsyymin R39 käytetty moolimäärä, antibiootti inaktivoi entsyymin täysin vaiheessa (1); tällöin kaavan (II) mukaista 2-merkaptoalkaanihappoa ei muodostu, jolloin tästä seurauksena kromogeeninen reagenssi jää ennalleen. Näissä tapauksissa saadaan siten väri, joka on identtinen sokealla kokeella havaittuun nähden.

Tarkan määrityksen saamiseksi kaikista näytteistä, mukaan lukien sokeasta kokeesta ja verrokkinäytteestä, saatujen värien optinen tiheys mitataan spektrofotometri11ä. Koska myös sokeasta kokeesta saadaan tietty optisen tiheyden lukema, tämä arvo on vähennettävä arvoista, jotka saadaan verrokkinäytteelle ja vastaavasti muille näytteille.

Saaduista optisen tiheyden arvoista lasketaan kullekin näytteelle prosentuaalinen jäännösaktiivisuus (entsyymille R39). Tämä prosentuaalinen osuus on sama kuin tietystä näytteestä saadun optisen tiheyden ja verrokkinäytteestä saadun optisen tiheyden välinen suhde kerrottuna sadalla.

Sitten tulisi piirtää kuvaaja, jossa esitetään abskissana antibioottipitoisuudet ja entsyymin R39 prosentuaalinen jäännösaktiivisuus ordinaattana.

Saadaan suora viiva, joka leikkaa vastaavasti ordinaatan pisteessä, joka vastaa verrokkinäytettä (100-%:inen entsyymin * jäännösaktiivisuus), ja abskissan pisteessä, joka vastaa näytettä, joka sisältää antibioottia määrän, joka on sama kuin käytetty entsyymin R39 moolimäärä (0 %:n entsymaattinen jäännösaktiivisuus) .

25 97151

Saatu kuvaaja muodostaa "standardikuvaajän" fl-laktaamianti-biootin tuntemattoman pitoisuuden määrittämiseksi biologisesta nesteestä otetusta näytteestä, jota nestettä käyttäen kuvaaja on muodostettu. Tässä tarkoituksessa näytteitä käsitellään tarkalleen samalla tavalla seuraten esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän vaiheita (1), (2) ja (3); saadun värin optinen tiheys mitataan spektrofotometri11ä ja sokeasta kokeesta saatu optisen tiheyden arvo vähennetään saadusta lukemasta, minkä jälkeen entsymaattisen jäännösaktiivisuuden prosentuaalinen osuus lasketaan yllä kuvatulla tavalla ja näytteen antibioottipitoisuus saadaan vertaamalla standardi-kuvaajaan.

Täten on mahdollista määrittää kvantitatiivisesti niinkin alhaisia antibiottipitoisuuksia kuin 0,002 I.U.:ta/ml biologista nestettä 15 minuutissa.

Kuitenkin joissakin tapauksissa tämä menetelmä edellyttää . biologisen nesteen kirkastamista spektrofotometrin käyttöä silmällä pitäen. Periaatteessa siksi se on suoritettava laboratoriossa. Kuitenkin jos tarkoituksena on määrittää ainoastaan, ylittääkö antibiootin pitoisuus tietyn kynnyksen vai ei (esimerkiksi maidon kohdalla lakisäädöksien asettaman maksimipitoisuuden), spektrofotometrin käyttö ei ole välttämätöntä.

Tämä menetelmä vaatii kuitenkin hieman etukäteisselostusta.

Kuten edellä esitettiin, standardikuvaaja leikkaa abskissan pisteessä, joka vastaa näytettä, joka sisältää antibioottia ; määrän, joka on sama kuin käytetty entsyymin R39 moolimäärä. Tässä kriittisessä antibioottipitoisuudessa entsymaattisen jäännösaktiivisuuden prosentuaalinen osuus on nolla, sillä esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän vaiheen (3) lopussa saadaan valkea väri, joka on sama kuin sokean kokeen 97151 26 antama väri.

Tämän kriittisen pitoisuuden yläpuolella väri on samoin identtinen sokeasta kokeesta saatuun nähden, sillä entsymaattisen jäännösaktiivisuuden prosentuaalinen osuus on edelleen nolla. Vastakkaisesti tähän nähden tämän kriittisen pitoisuuden alapuolella saadaan keltainen väri, sillä läsnä on edelleen tietty prosentuaalinen osuus entsyymin jäännösaktiivisuutta.

Tämän vuoksi on mahdollista yksinkertaisesti menetelmävaiheen (3) lopussa havaitun värin perusteella määrittää suoraan, ylittääkö näytteen antibioottipitoisuus mainitun kriittisen pitoisuuden vai ei.

Tämän vuoksi jos mainittu kriittinen pitoisuus tunnetaan edeltäpäin, se riittää näytteen mahdollisen tämän kriittisen pitoisuuden ylittävän (tai sitä ei ylittävän) β-laktaamiantibiootti-pitoisuuden nopeaan määritykseen spektrofotometriä käyttämättä. Tässä tarkoituksessa tätä näytettä käsitellään identtisellä tavalla esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän vaiheita (1)/ (2) ja (3) seuraten, minkä jälkeen yksinkertaisesti tarkastellaan saatua väriä; jos väri vastaa sokean kokeen väriä, antibiootin pitoisuus on vähintään sama kuin kriittinen pitoisuus. Jos toisaalta väri on keltainen, antibiootin pitoisuus on ·, alle kriittisen pitoisuuden.

Täten on mahdollista määrittää visuaalisesti ja varmuudella, sisältävätkö näytteet yli vai alle 0,004 I.U.tta antibioottia millilitrassa biologista nestettä, ja tehdä tämä 15 minuutin kuluessa.

Lisäksi on mahdollista käyttämällä värikarttaa, josta näkyy saatavan keltaisen värin intensiteetin vaihtelu antibiootti-pitoisuuden funktiona, määrittää puolikvantitatiivisesti 0 (= nolla) I.U.:ta/ml ja kriittisen pitoisuuden välisiä pitoi 27 97151 suuksia. Esimerkiksi sovellutuksessa, jossa kriittinen pitoisuus on 0,004 I.U.:ta/ml, on mahdollista - ainakin ilman erityistä vaikeutta - määrittää pitoisuus 0,002 I.U.:ta/ml.

Tämä menetelmä, värikartan kanssa tai ilman sitä, on siksi erinomaisen sovelias maitonäytesarjän tutkimiseksi myös laboratorion ulkopuolella, esimerkiksi tuotantotilalla alan koulutusta vailla olevien henkilöiden toimesta.

Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä antibioottipitoi-suuden kvantitatiiviseksi ja kvalitatiiviseksi määrittämiseksi on nyt selostettu yksityiskohtaisesti viitaten tarkemmin väri-muutokseen, joka saadaan 5,5'-ditiobis(2-nitrobentsoe)hapolla. Kuitenkin alan ammattilaiset ymmärtänevät helposti, että jos tässä menetelmässä käytetään muita kromogeenisia reagensseja, vain todettu väri on erilainen.

Esillä olevan keksinnön toinen päämäärä on antaa käyttöön testipakkaus, jota käyttäen esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorittaa, eli jota käyttämällä voidaan määrittää β-laktaamiantibiootti biologisesta nesteestä.

Testipakkaus käsittää nimenomaisesti: (1) tietyn määrän liukoista D-alanyyli-D-alaniinikarboksi- .· peptidaasia, jonka on tuottanut Actinomadura R39 (entsyymi R39); (2) tietyn määrän substraattia, joka on tioesteri, jonka yleinen kaava on: VVS-CH-C0°H (I)

K

jossa

Ri on bentsoyyli-, fenyyliasetyyli- tai Ntt-asetyyli-L-lysyyliradikaali; 28 97151 R2 on glysyyli- tai D-alanyyliradikaali; ja R3 on vetyatomi tai metyyliradikaali; (3) tietyn määrän D-aminohappoa tai glysiiniä; (4) reagenssin, jolla voidaan määrittää 2-merkaptoalkaanihappo, jonka kaava on:

HS-CH-COOH (ID

a3 jossa R3 määritellään kuten edellä; ja (5) mikäli tarpeen standardin, jota käyttämällä reagensseja (1), (2), (3) ja (4) käyttäen suoritettujen testien tuloksia voidaan verrata keskenään.

Edullisen suoritusmuodon mukaan substraatti on [(N-bentsoyy-li-D-alanyyli)tio]etikkahappo, D-aminohappo on D-alaniini ja reagenssi (4) on 5,5'-ditiobis(2-nitrobentsoe)happo.

Erityisen edullisen suoritusmuodon mukaan substraatti sekä 2-merkaptoalkaanihapon määrityksen mahdollistava reagenssi yhdistetään tabletiksi yhdessä tavanomaisesti käytettyjen, tarkoituksenmukaisten tabletointiapuaineiden kanssa.

Testipakkaukseen voidaan mikäli tarpeellista sisällyttää standardiksi standardikuvaaja, jossa on antibioottipitoisuus entsyymin R39 jäännösaktiivisuuden prosentuaalisen osuuden funktiona. Täten on mahdollista suorittaa kvantitatiivisia määrityksiä edellä selostettuun tapaan. Tämä kuvaaja ei kuitenkaan ole välttämätön. Itse asiassa jos testipakkausta on määrä käyttää vain sen määrittämiseksi, ylittääkö antibiootin pitoisuus tietyn kriittisen arvon vai ei, riittää, jos käyttöohjeissa ilmoitetaan antibiootin se pitoisuus, jossa värimuutos havaitaan sen jälkeen, kun näytettä on käsitelty tämän keksinnön mukaisella menetelmällä.

: Il I l.lil mut 29 97151

Seuraavat esimerkit esitetään esillä olevan keksinnön havainnoii istamiseksi.

Esimerkki 1 Tämä esimerkki osoittaa, että keksinnön mukaisella menetelmällä on mahdollista suorittaa alhaisten penisil1iini-G-pitoisuuksien hyvin nopea määritys maidosta.

Valmistetaan sarja 50 μΐ maitonäytteitä, jotka sisältävät tunnettuja pitoisuuksia penisilliini-G:tä, ja kaksi 50 μΐ maitonäytettä, jotka eivät sisällä penisilliini-G:tä (sokea koe ja verrokkinäyte).

Kaikkiin näytteisiin (verrokkinäyte sekä penisi11iini-G:tä sisältävät näytteet) lisätään 1,5 pikomoolia entsyymiä R39, joka on liuotettu 10 plraan 0,5 M Hepes-puskuria (pH 8,0), jossa on pitoisuudet 0,5 M NaCl ja 0,25 M MgCl2, sekä 20 pl:aan vesiliuosta, jossa on 50 mg/ml D-alaniinia. Sokeassa kokeessa Hepes-puskuriin liuotettu entsyymi R39 korvataan 10 plrlla 0,5 M Hepes-puskuria (pH = 8,0), jossa on pitoisuudet 0,5 M NaCl ja 0,25 M MgCl2 (Hepes = 4-hydroksietyyli-l-piperatsiinietaanisul-fonihappo). Seosta inkuboidaan 47 °C:ssa 4 minuuttia.

Sitten lisätään 5 μΐ vesiliuosta, jossa on 5 mg/ml [(N-bentsoyyli-D-alanyyli)tio]etikkahappoa, ja 10 μΐ fosfaat-tipuskuriliuosta (pH = 8,0; KH2PO4 + K2HPO4), jossa on 2 mg/ml 5,5’-ditiobis(2-nitrobentsoe)happoa, ja seosta inkuboidaan 47 °C:ssa 1 minuutin ajan.

Sitten tarkastellaan eri näytteisiin kehittyneitä värejä.

Saadut tulokset esitetään taulukossa I.

30 97151 TAULUKKO I Penisilliini-G-pitoisuus Näyte _(I .U. /ml)_ Väri

Verrokki 0 hyvin voimakkaan keltainen 1 0,004 voimakkaan keltainen 2 0,008 keskikeltäinen 3 0,012 vaaleankeltainen 4 0,016 valkea 5 0,020 valkea 6 0,025 valkea

Sokea koe 0 valkea

Kuten nähdään taulukosta 1, penisilliini-G-pitoisuudessa, joka on 0,016 I.U.:ta/ml tai tämän yli, saadaan valkea väri, joka vastaa sokeasta kokeesta saatua, kun taas tämän pitoisuuden alapuolella kehittyy keltainen väri, jonka intensiteetti kasvaa penisilliini-G-pitoisuuden laskiessa päätyen hyvin voimakkaaseen keltaiseen väriin, joka vastaa penisilliini-G:n pitoisuutta nolla (verrokkinäyte).

Selvää on, että keksinnön mukaisella menetelmällä on mahdollista määrittää visuaalisesti 5 minuutissa, sisältääkö maito-näyte penisilliini-G:tä pitoisuuden 0,016 I.U.:ta/ml vai enemmän- Tämä tekee menetelmästä erityisen kiinnostavan maidon nopeaan seulontaan meijerissä tai tuotantotilalla.

Esimerkki 2 Tämä esimerkki osoittaa, että keksinnön mukainen menetelmä on hyvin herkkä.

Menetelmä on tarkalleen sama kuin esimerkissä 1 lukuunottamatta, että: - näytteisiin lisätään 0,4 pikomoolia entsyymiä R39 (eikä 1,5 pikomoolia); 31 97151 - ensimmäinen inkubointi kestää 10 minuuttia (eikä 4 minuuttia); ja - toinen inkubointi kestää 5 minuuttia (eikä 1 minuutin).

Saadut tulokset esitetään taulukossa II.

TAULUKKO II

Penisil1iini-G-pitoisuus Näyte _ f I.U. /ml)_ Väri

Verrokki 0 hyvin voimakkaan keltainen 1 0,001 voimakkaan keltainen 2 0,002 keskikeltäinen 3 0,003 vaaleankeltainen 4 0,004 valkea 5 0,005 valkea 6 0,008 valkea 7 0,010 valkea

Sokea koe 0 valkea Tästä taulukosta ilmenee, että keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää vähintään 0,004 I.U.:n/ml penisilliini-G-pitoisuuksien visuaaliseksi toteamiseksi maidosta 15 minuutissa. Lisäksi värikarttaan vertaamalla on samoin mahdollista todeta alhaisempiakin pitoisuuksia, kuten 0,002 I.U.:ta/ml. Tämän vuoksi tätä menetelmää käyttämällä on mahdollista määrittää, sisältääkö maito antibioottia pitoisuuden, joka ylittää lain sallimat standardit (tai ei ylitä niitä), myös maissa, joissa nämä standardit ovat suhteellisen ankarat.

«

Esimerkki 3 Tämä esimerkki osoittaa, että esillä olevan keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää antibioottipitoisuuksien mittaamiseksi suurehkoista näytetilavuuksista.

32 97151

Menetelmä on sama kuin esimerkissä 1 lukuunottamatta, että: - näytteet sisältävät 3 ml maitoa (eivätkä 50 μΐ); - 24 pikomoolia (eikä 1,5 pikomoolia) entsyymiä R39 liuotettuna 150 μΐίθθη 0,5 M Hepes-puskuria (pH = 8,0) ja 600 μΐ vesiliuosta, jossa on 100 mg/ml D-alaniinia, lisätään kuhunkin näytteeseen; - ensimmäinen inkubointi kestää 10 minuuttia (eikä 4 minuuttia); - 120 μΐ (eikä 5 μΐ) [(N-bentsoyyli-D-alanyyli)tio]etikkahapon vesiliuosta sekä 120 μΐ fosfaattipuskuriliuosta (pH = 8,0), jossa on 5 mg/ml 5,5’-ditiobis(2-nitrobentsoe)happoa, lisätään tämän jälkeen: ja - toinen inkubointi kestää 5 minuuttia (eikä 1 minuutin).

Saadut tulokset esitetään taulukossa III.

TAULUKKO III

Penisilliini-G-pitoisuus Näyte _(I .U. /ml)_ Väri

Verrokki 0 hyvin voimakkaan keltainen 1 0,002 keskikeltäinen 2 0,003 vaaleankeltainen : 3 0,004 valkea • « 4 0,006 valkea

Sokea koe 0 valkea Tästä taulukosta ilmenee, että keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää 0,004 l.U.:n penisilliini-G:tä millilitraa ·' maitoa kohden läsnä olon visuaaliseksi toteamiseksi suurehkoista näytetilavuuksista (3 ml) 15 minuutissa. Menetelmän voivat siten hyvin helposti suorittaa alan erikoiskoulutusta vailla olevat henkilöt.

Samat tulokset saadaan käytettäessä keksinnön mukaista mene-

Λ : IB i lii H I ί ! SI

33 97151 telmää penisilliini-G-pitoisuuksien mittaamiseksi 1 ml:n maitonäyteti1avuuksista.

Esimerkki 4 Tämä esimerkki osoittaa, että keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää muidenkin substraattien kuin [(N-bentsoyyli-D-alanyyli)tio]etikkahapon kanssa.

Menetelmä on sama kuin esimerkissä 3 lukuunottamatta, että ensimmäisen inkuboinnin jälkeen lisätään 120 μΐ vesiliuosta, jossa on 5 mg/ml [(N-fenyy1iasetyy1i-D-alanyy1i)tiojetikka-happoa.

Saadut tulokset esitetään taulukossa IV.

TAULUKKO IV

Penisil1iini-G-pitoisuus Näyte _(I .U. /ml)_ Väri

Verrokki 0 hyvin voimakkaan keltainen 1 0,003 vaaleankeltainen 2 0,006 valkea

Sokea koe 0 valkea Tästä taulukosta ilmenee, että keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorittaa menestyksekkäästi käyttäen substraattina [(N-fenyy1iasetyy1i-D-alanyy1i)tio]etikkahappoa.

Esimerkki 5 Tämä esimerkki osoittaa, että keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorittaa käyttäen eri D-aminohappoja tai glysiiniä aktivaattoreina substraatin hydrolyysil1 e entsyymillä.

34 97151

Menetelmä on sama kuin esimerkissä 3 lukuunottamatta, että vesiliuos, joka sisältää 100 mg/ml D-alaniinia (koe I), korvataan vastaavasti vesiliuoksella, jossa on 100 mg/ml D-fenyylialaniinia (koe II), D-seriiniä (koe III), D-histidiiniä (koe IV), D-metioniinia (koe V), D-2-aminovoihappoa (koe VI), tai vesiliuoksella, joka sisältää 200 mg/ml glysiiniä (koe VII).

Saadut tulokset esitetään taulukossa V.

TAULUKKO V

Penisilliini-G-pitoisuus Koe Näyte _(I .U. /ml)_ Väri I Verrokki 0 hyvin voimakkaan keltainen II hyvin voimakkaan - keltainen III hyvin voimakkaan keltainen IV hyvin voimakkaan keltainen V hyvin voimakkaan . keltainen • < VI hyvin voimakkaan keltainen VII hyvin voimakkaan keltainen 1 0,003 I vaaleankeltainen II vaaleankeltainen III vaaleankeltainen IV vaaleankeltainen V vaaleankeltainen il !· · »uin nia 35 97151 TAULUKKO V (jatk.)

Penisilliini-G-pitoisuus Koe Nävte _(I .U . /ml) _ Väri VI vaaleankeltainen VII vaaleankeltainen 2 0,006 I valkea II valkea III valkea IV valkea V valkea VI valkea VII valkea

Sokea koe 0 • I valkea II valkea III valkea IV valkea V valkea VI valkea . VII valkea Tästä taulukosta ilmenee, että yleensä ottaen D-aminohapot tai glysiini soveltuvat keksinnön mukaisen menetelmän suoritukseen.

Esimerkki 6 Tämä esimerkki havainnollistaa keksinnön mukaisen menetelmän käyttöä kefapiriinin, joka on kefalosporiiniryhmään kuuluva antibiootti, määritykseen maidosta.

36 97151

Menetelmä on sama kuin esimerkissä 3, mutta 3 ml:n maitonäyt-teet sisältävät tunnettuja pitoisuuksia kefapiriiniä.

Saadut tulokset esitetään taulukossa VI.

TAULUKKO VI

Kefapiriinipitoisuus Näyte _(uq/ml)_ Väri

Verrokki 0 hyvin voimakkaan keltainen 1 0,002 keskikeltäinen 2 0,003 vaaleankeltainen 3 0,004 valkea 4 0,006 valkea

Sokea koe 0 valkea Tästä taulukosta ilmenee, että keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää 0,004 mikrogramman/ml kefapiriiniä läsnä olon visuaaliseksi toteamiseksi maidosta 15 minuutissa.

Esimerkki 7 Tämä esimerkki havainnollistaa keksinnön mukaisen menetelmän soveltamista alhaisten penisilliini-G-pitoisuuksien määrittämiseksi seerumista.

Seurataan esimerkin 3 menettelyä, mutta 3 ml:n maitonäytteet korvataan 3 ml:n seeruminäytteillä, jotka sisältävät tunnettuja pitoisuuksia penisilliini-G:tä.

Lisäksi toisen, 5 minuuttia kestävän inkuboinnin jälkeen näytteet sentrifugoidaan ja supernatantteja laimennetaan lOx vedel1ä.

Sen jälkeen mitataan optinen tiheys spektrofotometri11ä 410 37 97151 nm:n aallonpituudella.

Saadut tulokset esitetään taulukossa VII.

Taulukossa VII esitetyt optisen tiheyden arvot saadaan vähentämällä sokeasta kokeesta mitattu optisen tiheyden arvo optisen tiheyden arvoista, jotka saadaan verrokkinäytteestä ja vastaavasti muista näytteistä.

TAULUKKO VII

Penisilliini-G-pitoisuus Optinen tiheys

Koe Näyte _(I .U. /ml)_ (410 nm:ssä)

Verrokki 0 435 1 0,002 226 2 0,003 175 3 0,004 49 4 0,006 15 «

Sokea koe 0 0 Tästä taulukosta ilmenee, että spektrofotometriä käyttämällä on mahdollista määrittää kvantitatiivisesti hyvin alhaisia peni-silliini-G:n pitoisuuksia (niinkin alhaisia kuin 0,002 I.U.:ta/ml) seeruminäytteestä.

t ·

Esimerkki 8 Tässä esimerkissä substraatti sekä 2-merkaptoalkaanihapon määrityksen mahdollistava reagenssi yhdistetään tabletin muotoon.

Menetelmä on sama kuin esimerkissä 3. Kuitenkin ensimmäisen, 10 minuuttia kestävän inkuboinnin jälkeen lisätään tabletti, joka sisältää 600 pg [(N-bentsoyyli-D-alanyyli)tio]etikkahappoa ja 600 ug 5,5'-ditiobis(2-nitrobentsoe)happoa.

38 97151 Tämän tabletin kokonaiskoostumus (paino-%:eina) on seuraava:

Substraatti + reagenssi 4 %

Polyetyleeniglykoli-6000 3 %

Avicel* 27 % Tärkkelys 10 %

Laktoosi 55 %

Aerosil** 0,5 %

Magnesiumstearaatti 0,5 % * mikrokiteinen selluloosa ** kolloidinen piidioksidi

Saadut tulokset esitetään taulukossa VIII.

TAULUKKO VIII

Penisilliini-G-pitoisuus Nävte _( I .U. /ml )_ Väri

Verrokki 0 hyvin voimakkaan keltainen 1 0,002 keskikeltäinen 2 0,003 vaaleankeltainen 3 0,004 valkea 4 0,006 valkea ; Sokea koe 0 valkea • · Tästä taulukosta ilmenee, että tämän keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää (myös silloin), kun substraatti ja 2-merkaptoalkaanihapon määrityksen mahdollistava reagenssi on yhdistetty tabletin muotoon; tämä suo selvän edun sekä ·’ käytännön tasolla että reagenssien stabii1isuuden kannalta.

ii - ia i n» » i

Claims (10)

39 97151

1. Entsymaattinen menetelmä β-laktaamiantibiootin määrittämiseksi biologisesta nesteestä, joka menetelmä käsittää seuraa- vat vaiheet: (1) biologista nestettä inkuboidaan liukoisen D-alanyyli-D-alaniinikarboksipeptidaasin kanssa, jonka on tuottanut Actinomadura R39. jolloin mainittu inkubointi suoritetaan olosuhteissa, joissa mainitun nesteen mahdollisesti sisältämä β-laktaamiantibiootti voi reagoida entsyymin kanssa muodostaen inaktiivisen ja oleellisesti irreversiibelin ekvimolekulaarisen entsyymi-antibioottikomplek-sin; (2) vaiheen (1) päätteeksi saatua seosta inkuboidaan subst-raattiliuoksen kanssa olosuhteissa, joissa entsyymi voi hydrolysoida substraattia muodostaen yhdistemäärän, joka on verrannollinen entsymaattiseen jäännösaktiivisuuteen, (3) vaiheessa (2) muodostuneen yhdisteen määrä määritetään; ja (4) vaiheessa (3) määritettyä arvoa verrataan standardiin antibiootin pitoisuuden biologisessa nesteessä saamiseksi, tunnettu siitä, että inkubointivaiheessa (2) suoritetaan substraatilla, joka on tioesteri, jonka yleinen kaava on: R1'2_S"CH_C00H (I) R3 jossa R-l on bentsoyyli-, fenyyliasetyyli- tai N“-asetyyli-L-lysyyliradikaali; R2 on glysyyli- tai D-alanyyliradikaali, ja R3 on vetyatomi tai metyyliradikaali, josta substraatista muodostuu sen hydrolyysissa 2-mer-kapto-alkaanihappoa, jonka kaava on: « 40 97151 HS-CH-COOH (II) R3 jossa R3 on määritelty edellä; ja aminohapon läsnäollessa, mikä aktivoi substraatin hydrolyysia entsyymillä, joka aminohappo on D-aminohappo tai glysiini;

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että substraatti on [(N-bentsoyyli-D-alanyyli)tio]etik-kahappo.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että D-aminohappo valitaan ryhmästä, jonka muodostavat D-alaniini, D-metioniini, D-arginiini, D-fenyylialaniini, D-seriini, D-histidiini, D-valiini, D-tryptofaani ja D-2-ami-no-voihappo.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että D-aminohappo on D-alaniini.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan (II) mukaisen 2-merkaptoalkaanihapon määrä • määritetään inkuboimalla vaiheessa (2) saatua seosta 5,5'-di- tiobis(2-nitrobentsoe)hapon kanssa värin saamiseksi, jonka intensiteetti on 2-merkaptoalkaanihapon määrän funktio.

6. Testipakkaus β-laktaamiantibiootin määrittämiseksi biologisesta nesteestä jollakin patenttivaatimuksen 1-5 mukaisella menetelmällä, tunnettu siitä, että se käsittää: (1) tietyn määrän liukoista D-alanyyli-D-alaniinikarboksipep-tidaasia, jonka on tuottanut Actinomadura R39: (2) tietyn määrän substraattia, joka on tioesteri, jonka yleinen kaava on: 41 97151 R1"R2‘S"CH'C00H (D R3 jossa R-l on bentsoyyli-, fenyyliasetyyli- tai N“-asetyyli-L-lysyyliradikaali ; R2 on glysyyli- tai D-alanyyliradikaali,- ja R3 on vetyatomi tai metyyliradikaali; (3) tietyn määrän D-aminohappoa tai glysiiniä; (4) reagenssin, jolla voidaan määrittää 2-merkaptoalkaanihap-po, jonka kaava on: HS-CH-COOH (II) R3 jossa R3 määritellään kuten edellä; ja (5) mikäli tarpeen standardin, jota käyttämällä reagensseja (1), (2), (3) ja (4) käyttäen suoritettujen testien tu loksia voidaan verrata keskenään.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että substraatti on [(N-bentsoyyli-D-alanyyli) tio]etikkahappo.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että D-aminohappo on D-alaniini.

9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että reagenssi (4) on 5,5'-ditiobis(2- - nitrobentsoe)happo.

10. Patenttivaatimuksen 6 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että substraatti ja reagenssi (4) on yhdistetty tabletin muotoon. 42 97151