PL169360B1 - Sposób enzymatycznego oznaczania antybiotyków ß -laktamowych w plynie biologicznym PL - Google Patents

Abstract

1 Sposób enzymatycznego oznaczania antybiotyków ß -laktamowych w plynie biolo- gicznym polegajacy na tym, ze w etapie 1 plyn biologiczny inkubuje sie z rozpuszczalna D-alanylo-D-alaninokarboksypeptydaza wytworzona przez Actinomadura R39 w tempera- turze pomiedzy 20 1 50°C umozliwiajac reakcje tego enzymu z ewentualnie obecnym w plynie biologicznym antybiotykiem ß -laktamowym prowadzaca do utworzenia nieaktyw- nego i zasadniczo nieodwracalnego równomolarnego kompleksu enzym-antybiotyk, w eta- pie 2 inkubuje sie mieszanine wytworzona w etapie 1 wraz z roztworem substratu w tempe- raturze pomiedzy 20 i 50°C przy pH pomiedzy 7 a 8,5, umozliwiajac hydrolize tego substra- tu przez enzym az do wytworzenia zwiazku w ilosci proporcjonalnej do szczatkowej ak- tywnosci enzymatycznej, w etapie 3 oznacza sie ilosciowo zwiazek wytworzony w etapie 2, w etapie 4 porównuje sie wielkosc oznaczana w etapie 3 ze wzorcem i okresla sie ilosc an- tybiotyku w plynie biologicznym, znamienny tym, ze inkubacje w etapie 2 prowadzi sie z substratem stanowiacym tioester o wzorze R 1 -R2 -S-(CH/R3)-COOH, w którym R 1 ozna- cza grupe benzoilowa, fenyloacetylowa lub Na -acetylo-L-lizylowa, R2 oznacza grupe glicy- lowa lub D-alanylowa a R3 oznacza atom wodoru lub grupe metylowa, w obecnosci ami- nokwasu aktywujacego hydrolize tego substratu przez enzym, przy czym stosuje sie ami- nokwas o konfiguracji D lub glicyne i otrzymuje sie jako produkt kwas 2-merkaptoalkano- karboksylowy o wzorze HS-CH(R3)-COOH, w którym R3 ma wyzej podane znaczenie ( 1 2 ) OPIS PATENTOWY ( 1 9 ) PL (1 1 ) 169360 PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób enzymatycznego oznaczania antybiotyków (β-laktamowych w płynie biologicznym

Sposób według wynalazku odznacza się dużą czułością i szybkością wykonania

169 360

W dobie dzisiejszej antybiotyki są powszechnie stosowane nie tylko jako środki terapeutyczne do leczenia chorób zakaźnych wywołanych bakteriami, ale również jako środki konserwujące produkty spożywcze, a także jako dodatki do pożywienia zwierząt stymulujące ich wzrost Staje się więc koniecznym doskonalenie metod wykrywania obecności antybiotyków nawet w bardzo niskich stężeniach w złożonych płynach biologicznych takich jak mleko, mocz, krew, surowica, ślina, wywary z mięs, roztwory, fermentacyjne lub wodne roztwory buforowe

Przykładem może być produkcja mleka Znany jest efekt stosowania penicylin do leczenia pewnych zakaźnych chorób bydła mlecznego, takich jak zapalenie gruczołów mlecznych Z oczywistych przyczyn medycznych mleko przeznaczone do spożycia powinno być w zasadzie wolne od wszelkich śladów antybiotyków. Ponadto, stężenie penicyliny w wysokości 0,005 jednostki/ml lub mniejsze może mieć zgubny wpływ na produkcję wyrobów mleczarskich takich jak ser, jogurt i podobne Poza tym, w niektórych krajach normy dopuszczają stężenia antybiotyków me większe niż 0,004 jednostek/ml. Pożądana jest zatem możliwość oznaczania szybko i dokładnie stężenia penicyliny w mleku zwierzęcym, najlepiej już u producenta.

Znane są od dawna sposoby mikrobiologiczne oznaczania stosunkowo małych stężeń antybiotyków β-laktamowych w płynach biologicznych. Sposoby te polegają na pomiarze hamowania wzrostu drobnoustrojów reagujących na antybiotyki w obecności próbki badanego płynu biologicznego Sposoby te są jednakże czasochłonne i wymagają skomplikowanego oprzyrządowania; w najlepszym razie uzyskanie wyniku wymaga od 2 do 3 godzin czasu, co wyklucza ich stosowanie w praktyce.

Ostatnio zaproponowano szybki mikrobiologiczny sposób wykrywania antybiotyków w płynach biologicznych, zwłaszcza w mleku - opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 239 852 Według tego sposobu badaną próbkę inkubuje się z komórkami lub z częściami komórek organizmu czułego na działanie antybiotyków, zwłaszcza Bacillus stearothermophilus wraz z antybiotykiem znaczonym pierwiastkiem promieniotwórczym lub enzymem W trakcie inkubacji ewentualnie obecny w próbce antybiotyk i antybiotyk znaczony współzawodniczą w umiejscowianiu się w miejscach receptorów komórek lub ich części. Następnie oznacza się ilość znaczonego antybiotyku przyczepionego do komórek lub do części komórek, sposób ten pozwala na wykrycie obecności (lub nieobecności) antybiotyków. Ilość przyczepionego znaczonego antybiotyku jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia antybiotyku w próbce.

Sposób według opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 239 852 pozwala na wykrycie antybiotyku o tak niskim stężeniu jak 0,01 jednostek/ml, a nawet 0,001 jednostek/ml w mleku w czasie nieco krótszym niż 15 min

Główną wadą powyższego sposobu jest konieczność dysponowania antybiotykiem znaczonym pierwiastkiem promieniotwórczym (¹⁴C lub ¹²⁵I), który dozuje się za pomocą specjalnego urządzenia, takiego jak licznik scyntylacyjny Ponadto, manipulowanie nawet bardzo małymi ilościami związków radioaktywnych nie jest całkowicie pozbawione ryzyka dla osoby wykonującej analizę.

W przykładzie II cytowanego wyżej opisu podano wariant sposobu polegający na zastosowaniu antybiotyku znaczonego enzymem, w którym to wariancie oznacza się ilość znaczonego antybiotyku przy zastosowaniu kolorymetrii optycznej Wariant ten pozwala jednak na oznaczenie stężenia penicyliny powyżej 0,05 jednostek/ml w próbce mleka Sposób ten jest zatem znacznie mniej czuły i dlatego mniej korzystny

W handlu spotyka się również testy oparte o zastosowanie przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych Możliwe jest opracowanie testu opartego na klasycznej diagnostyce immunologicznej (ELISA, aglutynacja do lateksu, metoda radioimmunologiczna i podobne) Przykładowo stosuje się test o nazwie SPOT TEST, sprzedawany przez firmę Angenics (Stany Zjednoczone Ameryki) Tego typu zestawy testowe są zwykle bardzo skomplikowane, ponadto pozwalają wykrywać tylko bardzo ograniczoną ilość antybiotyków W istocie, wysoka wybiórczość przeciwciał pozwala na rozpoznawanie jedynie przedstawicieli rodziny antybiotyku wytypowanego do uodpornienia Jest to szczególnie skomplikowany problem w przypadku rodziny [^laktamów

169 360

Znany jest również sposób enzymatyczny pozwalający na oznaczanie małych stężeń antybiotyków β-laktamowych w surowicy ludzkiej i w mleku -JM Frere i wsp , Antimicrobial Agents and Chemioterapy, 18, 1980, 4, 506-510 Sposób ten (nazywany dalej sposobem JM Frere'a) jest bardziej interesujący, ponieważ nie wymaga stosowania związków radioaktywnych wymagających skomplikowanej aparatury Sposób ten jest szybki i dokładny. Polega on na stosowaniu specyficznego enzymu, w tym przypadku rozpuszczalnej egzokomórkowej D-alanylo-D-alanino-karboksypeptydazy wytwarzanej przez Actinomadura R39 (poprzednia nazwa Streptomyces R39). W mniejszym opisie enzym ten będzie określany jako enzym R39 Enzym ten posiada wybiórczą zdolność hydrolizy końcowych grup D-alanylo-D-alaninowych różnych peptydów prowadzącej do uwalniania końcowej D-alaniny

Inną ważną cechą charakterystyczną enzymu R39 jest to, że reaguje on z antybiotykami β-laktamowymi tworząc bardzo szybko nieaktywny i w dużym stopniu nieodwracalny ekwimolekularny kompleks enzym-antybiotyk.

W sposobie J.M. Frere’a wykorzystuje się te właściwości enzymu R39 do oznaczania bardzo niskich stężeń antybiotyków β-laktamowych. Postępowanie według tego sposobu składa się z trzech zasadniczych etapów.

W pierwszym etapie określoną objętość próbki do badań inkubuje się z określoną ilością enzymu R39 Inkubację prowadzi się w warunkach pozwalających ewentualnie obecnemu w próbce z antybiotykami β-laktamowemu na przereagowanie i utworzenie nieaktywnego i w dużym stopniu nieodwracalnego ekwimolekularnego kompleksu enzym-antybiotyk.

W drugim etapie określoną ilość substratu, np. N^c,N^E-dwuacetylo-L-lizylo-D-alanylo-D-alaniny inkubuje się ze związkiem wytworzonym w pierwszym etapie w warunkach pozwalających na hydrolizę substratu przez enzym w celu wytworzenia D-alaniny w ilości odpowiadającej aktywności szczątkowej enzymu R39, który nie został skompleksowany z antybiotykiem w pierwszym etapie.

W trzecim etapie oznacza się ilość wytworzonej w ten sposób D-alaniny. Jest oczywiste, ze ilość wytworzonej w drugim etapie D-alaniny zależy od aktywności szczątkowej enzymu, a zatem jest odwrotnie proporcjonalna do ilości antybiotyku obecnego w badanej próbce

W sposobie J M Frere'a oznacza się ilość D-alaniny metodą enzymatyczną Metoda ta opiera się na dwóch sprzężonych reakcjach enzymatycznych. W pierwszej reakcji D-alaninę utlenia się do kwasu pirogronowego przy pomocy D-aminokwasowej oksydazy (w obecności jej koenzymu tj dwunukleotydu flawinowo-adeninowego); równocześnie tworzy się odpowiednia ilość nadtlenku wodoru z tlenu z powietrza W drugiej reakcji wytworzony nadtlenek wodoru utlenia się za pomocą peroksydazy o-dwuanizydynowej. Wytwarza się brunatne zabarwienie, którego natężenie jest funkcją ilości D-alaniny. Pozwala to na oznaczenie ilościowe D-alaniny metodą kalorymetryczną albo optycznie, albo przez pomiar gęstości opty_cznej z pomocą spektrofotometru (/_max = 460 nm)

Przygotowując serię próbek o znanych stężeniach, a następnie stosując powyższą procedurę mozya βρο^Η^ή krzywąwzorcową przedstawiającą zaleępoś^e procentowej sżczątkowej aktywności enzymadzcznej yw^wz Rco od sręeenia entyblotyku.

W cilu ϋsśclosρcne oonsczcnla srozema uośybln]yćśr w próbce postępuje się w ten sam sposób i cenacza cio więzmu anta'bloeyka Ιογιυβ^αο ot owej kp^Acej wzoryzweC WynA ilaśdowy wymoąa a ozyw^żie zasezsywrtslo sorkcrofąeąmctπe jeknak-we w zohc s^erdzym^ ciśttrzeyle sntyaloryky wrze^zna pewną wίkUotć fotoycznu czy nez nie, nie uzst kon^enne stosowenie eptSćrofytometru lub poyuenege arządzkrna pomiztcwtgo

Wysyurcry wrzeenleJ w^zioć, ugoy jzl<im 0iyl:yrónym więg^mi antybiotyku aktywność enzymW S<39 ^t eałkowecle zuiesiona czylp mó^ry snzcseJ, yrzyJaZlm aątySletykć ucz y^<^rR3 9i j D- aianme, c eo ziu sym i dzy zm pewtra)e zabarwienn Zóąsąc etęzeąiekIśytyczoś, możny łatwo utwierdzaCc o centym wizualnie, cwy' dana barwie zuwiera antyaiuoyU o stsacniu wlrkcąym woy tee mmśjszym niz stęeeale kre^rty'case Mopra więc swyUko i dykładnie ocężić ^ęzone caSóólc^lyku w mleka nie dy spazuJąc oadsρm ezczrgźlnem wyposooenlrm

169 360

Ponadto, sposób ten pozwala na oznaczenie stosunkowo niskiego stężenia antybiotyków β-laktamowych w mleku i w surowicy ludzkiej Przykładowo, wychodząc z próbki mleka o objętości około 20 pl i inkubując ją z 3 pikomolami enzymu R39 można oznaczyć ilościowo (przy zastosowaniu spektrofotometru) takie niskie stężenia jak 0,02 jednostek/ml mleka, a jakościowo, stosując metodę wizualną opisaną powyżej, stężenia większe niż 0,09 jednostek/ml mleka, w czasie poniżej 1 godziny

Jednakże, powyżej opisany sposób J M Frere’a obarczony jest licznymi istotnymi wadami

Czułość sposobu J M Frere'a szczególnie dla płynów biologicznych (mleko, ślina, surowica) jest niewystarczająca Wprawdzie można podwyższyć czułość przez zmniejszenie ilości zastosowanego enzymu R39, lecz takie działanie wydłuża czas reakcji zarówno w pierwszym jak i w drugim etapie, lub tez zwiększa objętość próbki, którą należałoby inkubować z enzymem R39, co prowadzi do wydłużenia czasu reakcji w pierwszym etapie pomiaru

Nie jest możliwe podwyższenie czułości metody J.M Frere'a w powyższy sposób, szczególnie w przypadku złożonych płynów pochodzenia organicznego. Stwierdzono, ze niemożliwe jest przeprowadzenie odpowiedniego oznaczenia, jeśli objętość próbki płynu biologicznego przekracza pewną objętość krytyczną, która zależy od natury płynu biologicznego I tak, w przypadku mleka i surowicy, jeśli objętość próbki, którą poddaje się inkubacji przewyższa objętość około 150 μΐ obsewuije się _a ze llość wytworzonej utlenionej o-dwuianżydyrny ulega znacznemu zmniejszeniu.

W przypadku moczu nie wykrywa się żadnej aktywności enzymatycznej, nawet przy zastosowaniu tak małych objętości próbek jak 10 pl Nie jest więc możliwe oznaczanie tym sposobem antybiotyków w moczu

Przypuszcza się, ze płyny biologiczne blokują substancje, inhibitujące działanie enzymów stosowanych w tym sposobie W praktyce oznacza to, ze stosowanie dużych objętości próbek wiązałoby się z co najmniej proporcjonalnym do wzrostu objętości próbki wzrostem zużycia odczynników

Nie jest to godne polecenia, zważywszy wysokie ceny zastosowanych enzymów, w szczególności oksydazy D-aminokwasowej i będącego dla niej koreagentem dwunukleotydu flawinowo-adeninowego.

Ulepszona wersja sposobu J M Frere’a znana jest na rynku w postaci testu pod nazwą Penzym. Test ten głównie stosuje się do kontrolowania mleka dostarczanego do mleczami

Test Penzym przeprowadza się w dwóch etapach w pierwszym etapie inkubuje się 50 pl mleka z 1,5 pikomola enzymu R39 w czasie 5 minut w temperaturze 47°C Następnie, w drugim etapie, wszystkie odczynniki niezbędne do oznaczenia szczątkowej aktywności enzymatycznej, w tym przypadku substraty N“,N^!;-dwuacetylo-L-lizylo-D-alanylo-D-alanmę, oksydazę D-aminokwasową, dwunukleotyd flawinowo-adeninowy, peroksydazę i wskaźnik barwny dodaje się do mieszaniny inkubowanej i całość inkubuje się w ciągu 15 minut w temperaturze 47°C Po inkubacji porównuje się kolor mieszaniny z wzorcową skalą kolorów kolor żółty, bez śladów różowego, wskazuje na obecność antybiotyków β-laktamowych w stężeniu wynoszącym ponad 0,017 jednostek/ml mleka Odwrotnie, zabarwienie różowe wskazuje albo na nieobecność antybiotyków (intensywne zabarwienie różowe) albo na obecność antybiotyków w stężeniu wynoszącym do 0,017 jednostek/ml, intensywność zabarwienia różowego jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia antybiotyku Za pomocą tego testu można w czasie 20 minut oznaczyć tak niskie stężenia antybiotyku jak 0,017 jednostek/ml

Jednakże, nawet ulepszona wersja sposobu J M Frere’a nie nadaje się do stosowania ani w krajach, w których przepiso dopuszczajpjedynie krańcowo niekie sijeema antyoiotykćiw takie jaJj na prayklad 0 ^p004 jidn GotoWml. jąi ^ea^yn ^e akda.o acy^oln skrt ^zwalaj^y h-^(^yok^¢^^c na we-kokarne («π^οοιma w czane krótsmym niz k mmor

Podważenie czdości i skroszym nzasu on^czenia podlegają tym samym ograniczeniom, jakm πasykalklzowann pawyzcj ι-ιυ omrwlsalu zioso^u d eg Frem’a Omym tym test ten nyLonoje si^ sn ργο^-:^Χ o batyno rnotej objętości i w omząb]ru z tym. etosowamo go wyrna-gn ^wongo dośwla⁰dzema w techno mikro dorwani ą wby pąpkawnin w^zkona^c oze aczeme

169 360

W celu ominięcia wszystkich wyżej opisanych niedogodności związanych ze stosowaniem znanego testu do oznaczania antybiotyków w płynie biologicznym zaproponowano sposób, w którym stosowany do oznaczenia enzym R39 unieruchomiono na podłożu nierozpuszczalny w wodzie, a mianowicie na polimerze poli-N,N-dwumetyloakryloamidowym Sposób ten, przedstawiony w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 546 076, polega zasadniczo na przeprowadzeniu następujących trzech etapów: unieruchomiony na podłożu enzym inkubuje się w obecności płynu biologicznego, następnie unieruchomiony enzym oddziela się od płynu biologicznego; po czym oznacza się szczątkową aktywność enzymu R39 za pomocą miareczkowania kolorymetrycznego D-alaniny wytworzonej z substratu peptydowego w obecności układu reagentów zawierającego D-aminokwasową oksydazę i jej koreagent, peroksydazę oraz wskaźnik barwy i ocenia się wynik wizualnie lub przy zastosowaniu spektrofotometru

Sposób ten cechuje szereg zalet, a mianowicie:

- nie dochodzi do oddziaływania pomiędzy płynem biologicznym i enzymami stosowanymi do miareczkowania D-alaniny, ponieważ płyn biologiczny uprzednio oddziela się,

- można wykonywać doskonałe oznaczenia na większych objętościach dochodzących do 5 ml, a ponadto;

- czułość jest o wiele wyższa biorąc pod uwagę, ze sposób pozwala na wizualne określenie stężenia penicyliny G przy wartości powyżej 0,002 jednostek/ml mleka.

Sposób ten obarczony jest jednak szeregiem wad, a mianowicie:

- jak we wszystkich sposobach, które wymagają operacji rozdzielania, powtarzalność wyników jest gorsza, niż w sposobach prowadzonych w fazie homogennej;

- bez względu na stosowaną metodę rozdzielania, konieczność przeprowadzenia rozdzielania powoduje przedłużenie czasu trwania pomiaru oraz zwiększa stopień złożoności takiego oznaczenia,

- jeśli nawet można osiągnąć, stosując wyłącznie odczyt nieuzbrojonym okiem, wysoką czułość sięgającą 0,002 jednostek/ml penicyliny G, to czas niezbędny do wykonania pomiaru jest o wiele za długi (co najmniej 30 minut) na to, aby sposób ten można było stosować do szybkiej kontroli mleka podczas jego gromadzenia w gospodarstwie rolnym, poza tym koszt takiego oznaczania jest znacznie wyższy od kosztu oznaczania przy zastosowaniu fazy homogennej

Pożądane jest zatem opracowanie sposobu pozbawionego wad, którymi obarczony jest sposób J M Frere'a i inne sposoby, takie jak test Penzym lub sposób przedstawiony w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 546 076 Zatem należy opracować sposób odznaczający się następującymi zaletami

- bardzo szybkie uzyskanie wyniku na przykład w ciągu 5 minut lub nawet w czasie krótszym,

- bardzo wysoka czułość pozwalająca na stosowanie sposobu w krajach, w których przepisy są bardzo surowe i zezwalają na stężenia antybiotyków nie większe niż 0,004 jednostek/ml, a nawet mniejsze;

- możliwość wykonywania oznaczenia na próbkach o objętości 1 ml lub większej, co pozwala na łatwe wykonywanie oznaczenia przez osoby niewykwalifikowane,

- niskie koszty i prostota wykonania

Cele te zostały osiągnięte w sposobie będącym przedmiotem mniejszego wynalazku Według wynalazku stosuje się zamiast enzymu R39, jego substrat będący tioestrem specjalnego typu Po hydrolizie tworzy się związek zawierający wolną grupę SH, którą można oznaczać prostą i mało kosztowną metodą miareczkowania kolorymetrycznego bez potrzeby stosowania enzymu, którego działanie zakłócane jest przez składniki płynu biologicznego Hydrolizę substratu przeprowadza się za pomocą enzymu w obecności aminokwasu o konfiguracji D lub w obecności glicyny, które znacznie aktywują hydrolizę

Przedmiotem wynalazku jest enzymatyczny sposób oznaczania antybiotyków β-laktamowych w płynie biologicznym, w którym'

169 360

1) inkubuje się płyn biologiczny wraz z rozpuszczalną D-alanylo-D-alaninokarboksypeptydazą wytworzoną przez Actinomadura R39 w warunkach, w których zachodzi reakcja ewentualnie obecnego w płynie biologicznym antybiotyku β-laktamowego z enzymem, w wyniku której tworzy się nieaktywny i w dużej mierze, nieodwracalny ekwimolekularny kompleks enzym-antybiotyk,

2) inkubuje się mieszaninę wytworzoną pod koniec etapu (1) z roztworem substratu w warunkach, w których zachodzi hydroliza substratu prowadząca do wytworzenia związku, którego ilość jest proporcjonalna do szczątkowej aktywności enzymatycznej,

3) oznacza się ilościowo związek utworzony w etapie (2),

4) porównuje się wielkość oznaczaną w etapie (3) ze wzorcem i określa się stężenie antybiotyku w płynie biologicznym, polegający na tym, ze do inkubacji w etapie (2) stosuje się substrat będący tioestrem o wzorze R1-R.2-S-CH(R₃)-COOH (wzór 1), w którym R oznacza grupę benzoilową, fenyloacetylową lub α-acetylo-L-lizylową, R2 oznacza grupę glicylową lub D-alanylową a R3 oznacza atom wodoru lub grupę metylową W wyniku hydrolizy wytwarza się kwas 2-merkaptoalkanokarboksylowy o wzorze HS-CH(Rs)-COOH (wzór 2), w którym R3 ma znaczenie podane powyżej, przy czym inkubację prowadzi się w obecności aminokwasu aktywującego hydrolizę substratu przez enzym Jako taki aminokwas stosuje się aminokwas o konfiguracji D lub glicynę.

W trakcie badań stwierdzono, ze enzym R39 ma specyficzną zdolność hydrolizy wiązań tioestrów pewnych związków mających w swojej budowie końcowe grupy estrowe, a w szczególności zdolność hydrolizy tioestrów o wzorze 1. Odkrycie to jest zaskakujące, ponieważ nie znano dotychczas innego przykładu D-alanylo-D-alanino-karboksypeptydazy działającej równocześnie jak tioesteraza Te nieoczekiwane właściwości enzymu R39 wykorzystano do opracowania udoskonalonego enzymatycznego sposobu oznaczania antybiotyków β-laktamowych w cieczach biologicznych.

Zgodnie z wynalazkiem, w odróżnieniu od sposobu J M Frere’a od analogicznych sposobów opisanych wyżej, jako substrat enzymu R39 stosuje się tioester o wzorze 1, który po hydrolizie tworzy kwas 2-merkaptoalkanokarboksylowy o wzorze 2 Odznacza się on wieloma zaletami w sensie techn2logicznym i ekonomicznym Tak więc stężenie kwasu 2-merkaptoalkanokarboksylowego o wzorze 2 wytworzonego z substratu enzymu R39 jest proporcjonalne do aktywności szczątkowej enzymu R39 Kwas ten można odmiareczkować prostą metodą kolorymetryczną, która me wymaga stosowania enzymów takich jak oksydaza D-aminokwasowa z koenzymem Poza znacznym obniżeniem kosztów unika się jednej z podstawowych wad znanego sposobu J M Frere’a, jako że nie zachodzi żadne wzajemne oddziaływanie pomiędzy składnikami płynu biologicznego a odczynnikami do miareczkowania kolorymetrycznego Odczynniki te nie zawierają enzymów Przy zastosowaniu sposobu według wynalazku można wykonywać oznaczenia bezpośrednio w płynie biologicznym bez potrzeby oddzielania substancji od próbek, które mogłyby zakłócać przebieg miareczkowania kolorymetrycznego.

Tak więc, ponieważ składniki obecne w płynie biologicznym me mają wpływu na oznaczenie aktywności szczątkowej enzymu, możliwa jest praca z objętościami płynu biologicznego sięgającymi 10 ml Według wynalazku, oznaczenie można wykonywać na większych objętościach, co czym go łatwiejszym do wykonania przez osoby niewykwalifikowane.

Ponadto, w związku z tym, ze możliwe jest stosowanie większych objętości płynu, sposób według wynalazku cechuje dużo wyższa czułość. Jak wykazano w przykładach, można z łatwością oznaczać wizualnie ilości antybiotyku rzędu 0,004 jednostek penicyliny G w jednym miliłitrze mleka w czasie 15 minut, przy zastosowaniu wzorcowej skali kolorów można oznaczyć stężenia wynoszące 0,002 jednostek/ml

Ponadto, nieoczekiwanie okazało się, ze dodanie aminokwasu o konfiguracji D lub glicyny powoduje znaczny wzrost szybkości reakcji hydrolizy substratu typu tioester o wzorze 1 pod wpływem enzymu Prace badawcze w tej dziedzinie potwierdziły, ze wiele aminokwasów o konfiguracji D a również glicyna mogą odgrywać rolę aktywatorów reakcji hydrolizy tioestru Do najlepszych aktywatorów należą D-alanina, D-metionina, D-agnnina, D-fenyloalanina, D-seryna, D-histydyna, D-walina, D-tryptofan i kwas D-2-ammobutanowy

169 360

Tak więc, przykładowo ze względu na to, ze aktywność enzymu R39 jest wyrażona w jednostkach na miligram enzymu, przy czym jedna jednostka enzymu hydrolizie 1 mikromol substratu na minutę, w temperaturze 47°C, stwierdzono, ze aktywność enzymu R39 względem kwasu (N-bennoilo-D-αlanelo)tlooctowego stosowanego jako substrat wynosi 8 jednostek pod nieobecność D-alaniny i 320 jednostek w obecności D-alaniny. Innymi słowy, szybkość hydrolizy substratu za pomocą enzymu R39 jest w obecności tego aktywatora 40 razy większa

W przeciwieństwie do tego stwierdzono, ze żaden aminokwas o konfiguracji L nie aktywuje hydrolizy substratu

Dlatego też, zgodnie ze sposobem według wynalazku, hydrolizę substratu typu Poester prowadzi się w obecności aminokwasu o konfiguracji D, który aktywuje hydrolizę substratu w obecności enzymu R39 Skraca to znacznie czas wykonania oznaczenia; dzięki stosowaniu sposobu według wynalazku można łatwo oznaczyć stężenie 0,016 jednostek penicyliny G w 1 ml mleka w czasie 5 minut W przypadku zastosowania znanego testu Penzym oznaczenie takie wymaga 15 minut czasu. W przeciwieństwie do znanych sposobów, sposób według wynalazku jest szczególnie przydatny do szybkiego kontrolowania mleka podczas jego gromadzenia w gospodarstwie rolnym, tym bardziej, że jest on prosty i nie wymaga skomplikowanego oprzyrządowania.

Ponadto stwierdzono, ze stosując sposób według wynalazku można oznaczać antybiotyki me tylko w mleku, ale i w innych płynach biologicznych takich jak surowica, mocz, ślina, wyciągi z mięsa, ciecze fermentacyjne, wodne roztwory buforowe i podobne.

Główną zaletą sposobu według wynalazku jest to, ze pozwala on w czasie bardzo krótkim (5 minut) oznaczyć stężenie antybiotyku β-laktamowego rzędu 0,016 jednostek/ml w czasie nieco dłuższym (15 minut) oznaczyć bardzo małe stężenia antybiotyku β-laktamowego rzędu 0,004 jednostek/ml lub niższe, bez stosowania skomplikowanej technologii, która wymagałaby operacji rozdzielania

Zgodnie z wynalazkiem można oznaczać antybiotyki należące do grup antybiotyków charakteryzujących się obecnością rdzenia β-laktamowego w cząsteczce, to jest w zasadzie wszystkie penicyliny i cefalosporene. Przykładowo, spośród penicylin oznacza się benzylopen^knę (penicylinę G), ampicylinę, fenoksemztylopznicelinę, karbenicylinę, metycylinę, oksacylinę, kloksacylinę i podobne Spośród cefalosporyn oznacza się cefałosporynę C, cefaloglicynę, cefalotynę, cefalzkeens, cefαporyns i podobne.

Szczególnie korzystne wyniki uzyskano przy oznaczaniu penicyliny G.

W etapie (1) sposobu według wynalazku określoną objętość próbki płynu biologicznego inkubuje się z określoną ilością enzymu R39

Jak wyjaśniono powyżej, można stosować bardzo duże objętości próbki Dla danej ilości enzymu R39 zwiększanie objętości próbki zwiększa jednocześnie czułość oznaczenia Przykładowo, podwajając objętość próbki, podwaja się czułość, przy potrójnej objętości próbki czułość wzrasta trzykrotnie Można więc określić objętość próbki w zależności od żądanej czułości W przypadku mleka można dostosować czułość do norm prawnych kraju, w którym wykonuje się oznaczenie lub tez do wymogów przemysłu mleczarskiego

Dla danej objętości płynu biologicznego ten sam efekt można uzyskać zmniejszając ilość enzymu R39 (przykład II) W każdym razie, w tym przypadku należy proporcjonalnie przedłużyć nie tylko czas trwania etapu (1) ale również etapu (2)

W praktyce wybór ilości enzymu R39 i objętości płynu biologicznego zależy od jednej strony od sposobu wykonania oznaczenia, a z drugiej strony od czułości i szybkości oznaczenia, jaką zamierza się uzyskać

Przykładowo, w laboratorium, gdzie można posługiwać się małymi objętościami i pożądane jest uzyskanie czułości wenosn.ącej 0,01 jednostek/ml, stosuje się ilość enzymu rzędu i pikomola i objętość płynu biologicznego rzędu 50 pm Jeśli pożądane jest uzyskanie czułości wynoszącej 0,005 i 0,0025 jednostek/ml, stosuje się odpowiednio 100 pl lub 200 pl płynu nie zmieniając ilości enzymu

169 360

Zgodnie z wynalazkiem, doskonalą czułość, szybkość i precyzję oznaczenia uzyskuje się z jednej strony dzięki szczególnym własnościom enzymu R39, a z drugiej strony dzięki zastosowanej metodzie oznaczania szczątkowej aktywności enzymu R39

Enzym R39 charakteryzuje się następującymi cechami

- bardzo szybkie tworzenie ekwimolekularnego nieaktywnego kompleksu enzym-antybiotyk,

- wyjątkowa trwałość utworzonego kompleksu, który raz utworzony rozpada się bardzo wolno Przykładowo, czas półrozpadu kompleksu utworzonego między enzymem R39 i penicyliną G wynosi 70 godzin w temperaturze 37°C,

- doskonała aktywność enzymatyczna wyrażająca się bardzo szybką hydrolizą grupy końcowej substratu typu tioester o wzorze 1 pod wpływem specyficznego aktywatora

Dzięki tym trzem cechom stosowanie enzymu R39 jest korzystniejsze niż stosowanie D-alanylo-D-alaninokarboksypeptydaz, jak dotychczas. Istotnie, biorąc pod uwagę, ze czas rozkładu kompleksu enzym-antybiotyk jest nieskończenie długi w stosunku do całkowitego czasu niezbędnego do wytworzenia kompleksu i do czasu oznaczenia szczątkowej aktywności enzymatycznej, me ma obawy, ze wyniki oznaczenia mogą być zafałszowane przez uwolnienie aktywnego enzymu w następstwie przedwczesnego rozkładu kompleksu enzym-antybiotyk.

Inne znane obecnie D-alanylo-D-alanino-karboksypeptydazy za wyjątkiem enzymu R39, nie odpowiadają w pełni stawianym warunkom, a mianowicie: albo szybkość tworzenia kompleksu jest w ich przypadku dziesięciokrotnie mniejsza, albo trwałość kompleksu jest niewystarczająca lub szybkość hydrolizy substratu jest o wiele za mała (zwłaszcza w przypadku wszystkich karboksypeptydaz endokomórkowych związanych z membraną bakteryjną)

Enzym R39 jest specyficzną rozpuszczalną D-alanylo-D-alanino-karboksypeptydazą egzokomórkową wydzielaną przez Actmomadura R39, drobnoustrój hodowany w odpowiednich warunkach (zdeponowany 10 lipca 1981 w Instytucie Pasteura w Paryżu, pod numerem I-127).

Dla wykonania oznaczenia sposobem według wynalazku enzym powinien być zasadniczo czysty. Można go wytworzyć i oczyścić metodami opisanymi w literaturze (J.M Frere i wsp , Blochem J 143, (1974), 233-240, Molecular Weight, Aminoacid Composition and Physicochemical Properties of the Exocellular DD-Carboxypeptidase-Transpeptidase of Streptomyces R39) Poza tym, oczyszczony enzym R39 dostępny jest w handlu, w firmie UCB-BIOPRODUCTS S A

Enzym R39 odznacza się dużą trwałością, wytrzymuje temperatury do 60°C Dlatego tez inkubację płynu biologicznego z enzymem R39 można prowadzić bez kłopotów w zakresie temperatur 20-50°C Korzystnie prowadzi się ją w temperaturze wynoszącej około 47°C W takich warunkach czas trwania inkubacji, który jest ściśle związany z czasem niezbędnym do wytworzenia się kompleksu enzym-antybiotyk jest bardzo krótki Podwyższenie temperatury inkubacji powoduje skrócenie czasu jej trwania i odwrotnie Możliwe jest zatem skrócenie czasu trwania oznaczenia przez podwyższenie temperatury

W etapie (2) mieszaninę wytworzoną w etapie (1) inkubuje się w roztworze z określoną ilością substratu typu tioester o wzorze 1, w obecności glicyny lub aminokwasu o konfiguracji D, który aktywuje hydrolizę tego substratu przez enzym Na tym etapie, ta część enzymu, która nie została zużyta do tworzenia kompleksu enzym-antybiotyk w etapie (1) oznaczenia, wykorzystuje się do hydrolizy substratu będącego tioestrem o wzorze 1 W tej reakcji hydrolizy wytwarza się kwas 2-merkaptoalkanokarboksylowy o wzorze 2 w ilości proporcjonalnej do szczątkowej aktywności enzymu R39

Tioestry o wzorze 1 są związkami nowymi, za wyjątkiem kwasu (N-benzoilo-glicylo)tiooctowego, (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2 824 863)

Tioestry o wzorze 1 wytwarza się stosując znane reakcje w znany sposób W rozpuszczalniku obojętnym, takim jak chloroform, dwuchlorometan, octan metylu lub dwumetyloformamid kondensuje się związek o wzorze R]R₂OH (wzór 3) uprzednio zaktywowany, przykładowo w postaci zmieszanych bezwodników lub aktywnych estrów z kwasem 2-merkaptoalkanokarboksylowym o wzorze 2 w następującej reakcji

R,R₂OH + HS-CH(R₃)-COOH--> R,R2-S-CH(R₃)-COOH

We wzorach 2 i 3 R_b R21 Ri mają znac^z^i^nie podane wyżej

169 360

Przykłady tioestrów o wzorze 1, który stosuje się jako substrat, obejmują, kwas (N-benzolło-D-ałanyło)tlooctowy, kwas 2-[(N-benzoiło-D-alaayło)tlopropioaowy], kwas (N-fenyloacetyło-D-alaayło)tlOoctowy, kwas (N^a-acetylo-L-hzyło-D-alanylo)octowy i podobne Jednakże, stosowanie kwasu (N-benzollo-D-alaaylo)tlOOCtowego daje najlepsze rezultaty Niektóre przykłady aminokwasów o konfiguracji D stosowanych jako aktywatory wymienionych wyżej substratów obejmują D-alaninę, D-metioninę, D-argininę, D-fenyloalaninę, D-serynę, D-histydynę, D-walinę, D-tryptofan oraz kwas D-2-amlaobutaaowy.

W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się D-alaninę w połączeniu z kwasem (N-beazollo-D-ałanylo)tiOOCtowym stosowanym jako substrat Ilości substratu i aktywatora nie są istotne, ponieważ działa się w warunkach nasycenia enzymu substratem.

Warunki oznaczenia są identyczne z warunkami opisanymi wyżej dla etapu (1) Inkubację prowadzi się w temperaturze 20-50°C, korzystnie w temperaturze około 47°C. Czas inkubacji z rnezaktywowaną frakcją enzymu R39 powinien być co najmniej wystarczający do wytworzenia mierzalnych ilości kwasu Z-merkaptoalkanokarboksylowego o wzorze 2. Dla temperatury inkubacji 47°C, czas ten waha się od kilku sekund do 10 minut w zależności od ilości obecnego enzymu i od objętości próbki. Czas ten można skrócić przez podwyższenie temperatury inkubacji lub wydłużyć przez obniżenie jej Podwyższenie temperatury jest korzystne wówczas, gdy ważna jest szybkość oznaczenia

W celu zapewnienia optymalnej aktywności enzymu, środowisko inkubowane wykazuje pH 7-8,5. Zwykle utrzymuje się pH około 8,0, prowadząc inkubację w obecności odpowiedniego buforu

W etapie (3) oznacza się ilość kwasu 2-merkaptoalkaaokarboksylowego o wzorze 2, który wytworzony został w etapie (2).

Miareczkowanie kwasu 2-merkaptoałkaaokarboksylowego o wzorze 2 prowadzi się jakąkolwiek znaną metodą. Istotne jest jedynie to, by metoda była szybka, wygodna i aby pozwalała oznaczyć w sposób specyficzny kwas 2-merkaptoałkaaokarboksylowy w obecności wszystkich innych związków zawartych w badanym płynie.

Dlatego tez korzystnie stosuje się miareczkowanie kolorymetryczne w obecności wskaźnika kolorymetrycznego, który wytwarza zabarwienie w reakcji z wolną grupą SH kwasu 2-merkaptoałkaaokarboksyłowego

Wskaźnik ten należy do grupy odczynników używanych zwykle do tego typu oznaczeń, takich jak kwas 5,5-dwutlobis(2-mtrobeazoesowy), produkty kondensacji 4,4'-dwutlobls(feayloaminy) z aldehydem benzoesowym, układ feaaatrollaa-Fe++ i podobne.

Korzystnie stosuje się jako wskaźnik kwas 5,5'-dwutiobls(2-aitrobenzoesowy), zwany odczynnikiem Ellmana, wytwarzający zabarwienie żółte pochodzące od kwasu 2-nitro-5-merkaptobenzoesowego utworzonego w reakcji wymiany z grupą SH kwasu 2-merkaptoalkanokarboksylowego, intensywność tego zabarwienia jest zależna od ilości kwasu 2-merkaptoalkanokarboksylowego

W pewnych przypadkach może okazać się korzystne stosowanie zabarwienia czerwonego, które pochodzi od reakcji fenantroliny z wolnymi grupami SH w obecności kationów Fe”’.

Ilość wskaźnika kolorymetrycznego zależy od ilości utworzonego w danym oznaczeniu kwasu 2-merkaptoalkaaokarboksyłowego Korzystnie stosuje się nieznaczny nadmiar molowy wskaźnika kolorymetrycznego w stosunku do maksymalnej ilości molowej kwasu 2-merkaptoalkanokarboksylowego, która może powstać w etapie (2) oznaczenia

Należy zauważyć, że enzym R39 musi być koniecznie obecny od początku etapu (1) oznaczenia, substrat i aktywator muszą być obecne od początku etapu (2) Natomiast wskaźnik kolorymetryczny można dodać na początku etapu (1), jak również na początku etapu (2) lub tez dopiero na końcu etapu (2) W etapie (1) korzystnie inkubuje się roztwór enzymu R39 z próbką mleka w obecności aktywatora, w etapie (2) korzystnie dodaje się substrat i wskaźnik kolorymetryczny a następnie wykonuje się czynności z etapu (1) i (2) w warunkach zasadniczo identycznych do warunków podanych wyżej dla etapu (2)

W etapie (4) oznaczenia uzyskaną wartość w etapie (3) porównuje się ze wzorcem w celu określenia stężenia antybiotyku w płynie biologicznym

169 360

Oznaczenie ilościowe stężenia antybiotyku wykonuje się w następujący sposób.

Najpierw przygotowuje się serię płynu biologicznego zawierającego znane stężenie antybiotyku β-laktamowego. Seria ta winna zawierać obok próbek o wzrastającym stężeniu antybiotyku dwie próbki płynu biologicznego nie zawierające antybiotyków. Następnie, w kolejnych etapach (1), (2) i (3) wszystkie te próbki traktuje się identycznie, jak w sposobie oznaczania według wynalazku.

Jedną z próbek nie zawierającą enzymu w etapie (1) zastępuje się identyczną objętością wody. W tym szczególnym przypadku, na końcu etapu (3) dysponuje się roztworem, który zawiera wszystkie pozostałe odczynniki z wyjątkiem enzymu R39. W związku z nieobecnością enzymu, w etapie (2) nie tworzy się kwas 2-merkaptoalkanokarboksylowy o wzorze 2, a zatem wskaźnik kolorymetryczny nie daje żadnego zabarwienia w obecności kwasu 5,5'-dwutiobis(2-nitrobenzoesowego). Próbka taka będzie poniżej zwana próbką ślepą.

Druga próbka nie zawierająca żadnego antybiotyku, wykaże silne żółte zabarwienie Ponieważ próbka nie zawiera antybiotyku, enzym R39 me ulega dezaktywacji w etapie (1) i tworzy się maksymalna ilość kwasu 2-merkaptoalkanokarboksylowego o wzorze 2 (odpowiadająca całkowitej aktywności dodanego enzymu R39) a zatem powstaje maksymalna ilość kwasu

5-merkapto-2-nitrobenzoesowego Powstaje wówczas silne żółte zabarwienie. Próbka taka będzie poniżej zwana próbką porównawczą.

W próbkach zawierających pewną molową ilość enzymu R39, która jest mniejsza od ilości początkowej ponieważ część tego enzymu ulega dezaktywacji przez antybiotyk w etapie (1) wytworzy się pewna ilość kwasu 2-merkaptoalkanokarboksylowego o wzorze 2 odpowiadająca aktywności szczątkowej tej części enzymu, która nie uległa dezaktywacji przez antybiotyk, a co za tym idzie, powstanie odpowiadająca ilość kwasu 5-merkapto-2-nitrobenzoesowego W tym przypadku powstaje żółte zabarwienie, ale o mniejszym natężeniu niż zabarwienie próbki porównawczej

W końcu, jeśli próbki zawierają molową ilość antybiotyku równą lub większą od ilości dodanego enzymu R39, enzym zostanie całkowicie zdezaktywowany w etapie (1) przez antybiotyk; nie utworzy się zatem kwas 2-merkaptoalkanokarboksylowego o wzorze 2 i wskaźnik kolorymetryczny nie zmieni zabarwienia W tym przypadku powstanie zabarwienie identyczne jak w przypadku próbki ślepej

W celu dokładnego oznaczenia mierzy się gęstość optyczną powstałego zabarwienia wszystkich próbek, w tym próbki ślepej i porównawczej, za pomocą spektrofotometru.

Ponieważ próbka ślepa wykazuje również pewną gęstość optyczną, wartość tej gęstości odejmuje się od zmierzonych odpowiednich wartości dla próbki porównawczej i dla pozostałych próbek

Na podstawie uzyskanych w ten sposób wartości gęstości optycznych oblicza się procentową zawartość szczątkowej aktywności enzymu R39 dla każdej próbki. Wartość ta równa jest stosunkowi zmierzonej wartości gęstości optycznej badanej próbki i próbki porównawczej, pomnożonemu przez 100.

Następnie sporządza się wykres, na którym stężenie antybiotyku jest na osi rzędnych a procent aktywności szczątkowej enzymu R39 na osi odciętych.

Powstała w ten sposób prosta przecina odpowiednio oś rzędnych w punkcie odpowiadającym próbce porównawczej (100% szczątkowej aktywności enzymatycznej) i oś odciętych w punkcie odpowiadającym ilości antybiotyku równej molowej ilości enzymu R39 zastosowanej w pomiarze (0% szczątkowej aktywności enzymatycznej)

Powstały w ten sposób wykres stanowi wzorzec pozwalający na oznaczanie nieznanych stężeń antybiotyków β-laktamowych w próbce płynu biologicznego użytego do jego skonstruowania. Reasumując, według wynalazku, próbkę traktuje się identycznie w etapach (1), (2) i (3), mierzy się przy użyciu spektrofotometru gęstość optyczną powstałego zabarwienia, odejmuje się od jej wartości gęstość optyczną próbki ślepej; oblicza się sposobem podanym powyżej wartość procentową szczątkowej aktywności enzymatycznej i przy użyciu wzorca odczytuje się stężenie antybiotyku w próbce W ten sposób oznacza się ilościowo stężenia anty12

169 360 biotyków wynoszące tak mało, jak 0,002 jednostek/ml w płynie biologicznym w ciągu 15 minut

Aby możliwe było stosowanie spektrofotometru, pożądane jest w niektórych przypadkach oczyszczenie płynu biologicznego Takie oznaczenie powinno być w zasadzie przeprowadzone w laboratorium Jeśli chodzi jedynie o stwierdzenie, czy stężenie antybiotyku przekracza pewien próg (na przykład w przypadku mleka, czy zawartość antybiotyku mieści się w normie) nie jest konieczne stosowanie spektrofotometru

Jak objaśniono wyżej, prosta wzorcowa przecina oś rzędnych w punkcie odpowiadającym próbce zawierającej całą ilość molową enzymu R39 zastosowanego do oznaczenia Dla tego granicznego stężenia antybiotyku, procentowa szczątkowa aktywność enzymatyczna jest równa 0%, ponieważ w końcu etapu (3) sposobu według wynalazku uzyskuje się zabarwienie identyczne z zabarwieniem próbki ślepej

Dla wartości powyżej tego stężenia granicznego uzyskuje się identyczne zabarwienie jak dla próby ślepej, ponieważ procentowa szczątkowa aktywność enzymatyczna jest równa zeru. W przeciwieństwie do tego, dla wartości mniejszej od tego stężenia granicznego uzyskuje się zabarwienie żółte, ponieważ istnieje pewna procentowa szczątkowa aktywność enzymatyczna.

Dlatego tez, opierając się wyłącznie na zabarwieniu w końcu etapu (3) oznaczenia można wnioskować wprost, czy stężenie antybiotyku przekracza czy też nie przekracza wspomnianego stężenia granicznego

Tak więc wystarczy znać stężenie graniczne by szybko stwierdzić, bez stosowania spektrofotometru, czy próbka zawiera stężenie antybiotyku β-laktamowego przekraczające czy tez nie stężenie graniczne W tym celu próbkę traktuje się identycznie w kolejnych etapach (1), (2) i (3), a następnie stwierdza się uzyskaną barwę, jeśli jest ona taka sama jak barwa próbki ślepej, to stężenie antybiotyku jest co najmniej równe stężeniu granicznemu; jeśli natomiast barwa jest żółta, to stężenie antybiotyku jest mniejsze od stężenia granicznego

W ten sposób oznacza się wizualnie czy próbka zawiera mniej, czy tez więcej niż 0,004 jednostek antybiotyku w 1 ml płynu biologicznego w czasie 15 minut

Ponadto, stosując wzorcową skalę kolorów i biorąc pod uwagę zróżnicowanie intensywności zabarwienia żółtego możliwe jest oznaczenie półilościowe stężenia pośredniego między 0 jednostek/ml a stężeniem granicznym Tak więc w oznaczeniu, w którym stężenie krytyczne wynosi 0,004 jednostek/ml, możliwe jest oznaczenie co najmniej stężenia wynoszącego 0,002 jednostek/ml

Sposób taki doskonale nadaje się do badania serii próbek mleka, nawet poza laboratorium, na przykład w gospodarstwie wiejskim przez niewykwalifikowany personel

Sposób według wynalazku zostanie bliżej objaśniony na przykładzie zmiany barwy wywołanej przez kwas 5,5'-dwutiobis(2-mtrobznzoesowe) Jest oczywiste, że posługując się innym wskaźnikiem kolorymetrycznym zmianie ulega jedynie barwa wskaźnika

W sposobie możliwe jest zastosowanie zestawu do oznaczania antybiotyków β-laktamowych w płynie biologicznym

Zestaw zawiera określoną ilość rozpuszczalnej D-alanelo-D-alαnmokarbokeypzptyaany wytworzonej przez Actinomodura R39 (enzym R39); określoną ilość substratu w postaci tioestru o wzorze R:-R_:S-CH(R3)-COOH (wzór 1), w którym R oznacza podstawnik benzoilowy, feneloacetylowy lub N^K-acetylo-L-lizylowy, R_; oznacza podstawnik glutowy lub D-alanylowy i R3 oznacza atom wodoru lub grupę metylową

Zestaw zawiera ponadto określoną ilość aminokwasu o konfiguracji D lub glicyny, wskaźnik pozwalający na oznaczenie kwasu 2-mzrkaptoalkanokarbokeylowego o wzorze HS-CH(R3)-COOH (wzór 2), w którym R3 ma wyżej podane znaczenie oraz zawiera ewentualnie wzorzec do porównywania wyników

Korzystnie zestaw zawiera substrat w postaci kwasu (N-benzoilo-D-alαnelo)tiooctowzgo, aminokwas o konfiguracji D w postaci D-alaniny i wskaźnik w postaci kwasu 5,5'-awutiobis(2-mtrobznzoesowego)

169 360

W korzystnej postaci zestawu substrat i wskaźnik pozwalający na oznaczenie kwasu 2-merkaptoalkanokarboksylowego w połączeniu z wypełniaczami powszechnie stosowanymi do tych celów są razem uformowane w postaci tabletki

Zestaw ewentualnie zawiera wykres zależności między stężeniem antybiotyku a procentową aktywnością szczątkową enzymu R39 Zestaw taki umożliwia wykonanie oznaczenia ilościowego w sposób opisany wyżej Wykres taki nie jest niezbędny. Jeśli zestaw przeznaczony jest wyłącznie do stwierdzenia, czy stężenie antybiotyku przekracza czy tez nie przekracza pewnego stężenia granicznego, zawiera on informacje, przy jakim stężeniu antybiotyku obserwuje się zmianę zabarwienia

Wynalazek ilustrują następujące przykłady

Przykład I Przykład ten ilustruje, jak sposobem według wynalazku oznaczyć bardzo szybko małe stężenia penicyliny G w mleku

Przygotowano serię próbek o objętości 50 ml zawierających penicylinę G o znanych stężeniach oraz dwie próbki - ślepą i porównawczą.

Do każdej próbki (próbka porównawcza + próbki zawierające penicylinę G) dodano po

1,5 pikomola enzymu R39 rozpuszczonego w 10 gl 0,5 M buforu Hepes (pH =8,0) zawierającego 0,5 M NaCl i 0,25 M MgCL oraz 20 gl wodnego roztworu zawierającego 50 mg/ml D-alaniny W próbce ślepej, rozpuszczony w buforze Hepes enzym R39 zastąpiono 10 gl 0,5 M buforu Hepes (pH = 8,0), zawierającego 0,5 M NaCl i 0,25 M MgCh (Hepes = kwas 4-hydroksyetylo-1-piperazynoetanosulfonowy) Mieszaninę inkubowano w temperaturze 47°C w ciągu 4 minut.

Następnie dodano 5 gl wodnego roztworu zawierającego kwas (N-benzoilo-D-alanylo)tiooctowy i 10 gl roztworu buforu fosforanowego (pH = 8,0, KH2PO4 + K2HPO4) zwierającego 2 mg/ml kwasu 5,5'-dwutiobis(2-nitrobenzoesowego) i całość inkubowano w temperaturze 47°C w ciągu 1 minuty.

Obserwowano zabarwienia uzyskane w różnych próbkach. Uzyskane wyniki podano w tabeli 1

T abela 1

Próbka	Stężenie penicyliny G (w jednostkach/ml)	Zabarwienie
porównawcza	0	bardzo intensywne żółte
1	0,004	intensywne żółte
2	0,008	dość żółte
3	0,012	blado żółte
4	0,016	białe
5	0,020	białe
6	0,025	białe
ślepa	0	białe

Z tabeli 1 wynika, ze dla stężeń penicyliny G równych lub większych od 0,016 jednostek/ml, uzyskuje się zabarwienie białe, czyli identyczne jak dla próbki ślepej, podczas gdy dla stężeń mniejszych od tego stężenia pojawia się zabarwienie żółte, narastające wraz ze zmniejszającym się stężeniem penicyliny, aż do osiągnięcia bardzo intensywnego zabarwienia odpowiadającego zerowemu stężeniu penicyliny G (próbka porównawcza)

Sposobem według wynalazku można w ciągu 5 minut wizualnie ocenić, czy próbka mleka zawiera penicylinę G w stężeniu 0,016 jednostek/ml lub więcej, co czyni sposób według

169 360 wynalazku szczególnie przydatnym dla szybkiego badania mleka czy to w mleczarni, czy tez w gospodarstwie rolnym

Przykład II Przykład ten stanowi dowód na bardzo dużą czułość sposobu według wynalazku

Postępowano tak, jak w przykładzie I, z tą różnicą, że.

- do próbek dodano po 0,4 pikomola enzymu R39 (zamiast 1,5 pikomola),

- pierwszą inkubację prowadzono w ciągu 10 minut (zamiast 4 minut), a drugą inkubację prowadzono w ciągu 5 minut (zamiast 1 minuty)

Wyniki przedstawiono w tabeli 2

Tabela 2

Próbka	Stężenie penicyliny G (w jednostkach/ml)	Zabarwienie
porównawcza	0	bardzo intensywne żółte
1	0,001	intensywne żółte
2	0,002	dość żółte
3	0,003	blado żółte
4	0,004	białe
5	0,005	białe
6	0,008	białe
7	0,010	białe
ślepa	0	białe

Jak wynika z tabeli 2, stosując sposób według wynalazku można wzrokowo oznaczyć stężenie penicyliny G w mleku równe lub mniejsze niż 0,004 jednostek/ml mleka w czasie 15 minut Ponadto, przy zastosowaniu wzorcowej skali kolorów możliwe jest oznaczenie stężenia nawet mniejszego, takiego jak 0,002 jednostek/ml Sposób według wynalazku pozwala określić, czy mleko zawiera antybiotyki o stężeniu przekraczającym, czy też me przekraczającym normy, nawet jeśli ustalona jest norma na bardzo niskim poziomie

Przykład III Przykład ten ilustruje oznaczenie stężenia antybiotyku w większych objętościach płynu

Postępowano tak, jak w przykładzie I, z tą różnicą, że:

- próbki zawierały 3 ml mleka (zamiast 50 μΙ),

- do każdej próbki dodano po 24 pikomole enzymu R39 rozpuszczonego w 150 μl 0,5 M buforu Hepes (pH = 8,0) (zamiast 1,5 pikomola) i 600 μl wodnego roztworu D-alaniny zawierającej 100 mg/ml D-alaniny,

- czas trwania pierwszej inkubacji wynosił 10 minut (zamiast 4 minut),

- następnie dodano 120 μl wodnego roztworu kwasu (N-benzoilo-D-alanyloRiooctowego (zamiast 5 μΐ i 120 μł roztworu buforu fosforanowego /pH = 8,0/ zawierającego 5 mg/ml kwasu 5,5'-dwutiobis(2-mtrobenzoesowego),

- czas trwania drugiej inkubacji wynosił 5 minut (zamiast 1 minuty)

Wyniki przedstawiono w tabeli 3

169 360

Tabela 3

Próbka	Stężenie penicyliny G (w jednostkach/ml)	Zabarwienie
porównawcza	0	bardzo intensywne żółte
1	0,002	dosyć żółte
2	0,003	blado żółte
3	0,004	białe
4	0,006	białe
ślepa	0	białe

Jak wynika z tabeli 3, stosując sposób według wynalazku można wzrokowo oznaczyć w dużych objętościach stężenie penicyliny G w mleku równe lub mniejsze niż 0,004 jednostek/ml mleka w czasie 15 minut.

Takie same wyniki oznaczenia stężenia penicyliny G uzyskuje się przy zastosowaniu objętości mleka rzędu 1 ml.

Przykład IV. W tym przykładzie wykazano, że w sposobie według wynalazku możliwe jest stosowanie innych substratów niż kwas (N-bennoilo-D-alanelo)tiooctowe

Postępowano tak jak w przykładzie III. Jednakże, po pierwszej inkubacji, dodano 120 pl roztworu zawierającego 5 mg/ml kwasu (N-fenyloacetelo-D-alanelo)tiooctowego. Wyniki przedstawiono w tabeli 4.

Tabela 4

Próbka	Stężenie penicyliny G (wjednostkach/ml)	Zabarwienie
porównawcza	0	bardzo intensywne żółte
1	0,003	blado żółte
2	0,006	białe
ślepa	0	białe

Przykład ten dowodzi, że w sposobie według wynalazku można z powodzeniem stosować jako substrat kwas (N-feneloacetylo-D-alanelo)tlooctowe

Przykład V. Przykład ten stanowi dowód na to, ze w sposobie według wynalazku można stosować jako aktywatory hydrolizy substratu przez enzym różne aminokwasy o konfiguracji D lub glicynę. Postępowano tak jak w przykładzie III Jednakże, wodny roztwór zawierający 100 mg/ml D-alaniny (próba I) zastąpiono odpowiednio wodnym roztworem zawierającym 100 mg/ml D-fenyloalanme (próba II), D-serynę (próba III), D-h^dynę (próba IV), D-metioninę (próba V), kwas D-2-aminobutanowe (próba VI) lub wodnym roztworem zawierającym 200 mg/ml glicyny (próba VII). Wyniki przedstawiono w tabeli 5.

169 360

Tabela 5

Próba	Próbka	Stężenie penicyliny G (w jednostkach/ml)	Zabarwienie
	porównawcza	0
I			bardzo intensywne żółte
II			bardzo intensywne żółte
III			bardzo intensywne żółte
IV			bardzo intensywne żółte
V			bardzo intensywne żółte
VI			bardzo intensywne żółte
VII			bardzo intensywne żółte
	1	0,003
I			blado żółte
u			blado żółte
III			blado żółte
IV			blado żółte
V			blado żółte
VI			blado żółte
VII			blado żółte
	2	0,006
I			białe
II			białe
III			białe
IV			białe
V			białe
VI			białe
VII			białe
	ślepa	0
I			białe
II			białe
III			białe
IV			białe
V			białe
VI			białe
VII			białe

Wyniki z tabeli 5 dowodzą, ze aminokwasy o konfiguracji D lub glicyna nadają się do stosowania w sposobie według wynalazku

169 360

Przykład VI. Przykład ten ilustruje zzatosowame sppsobu według wynalazku do oznaczania cefapiryny w mleku - (antybiotyk z rodziny cefalospoiyny)

Postępowano tak jak w przykładzie III Próbki o objętości 3 ml mleka zawierały <^uaajiirynę o znanym stężeniu Uzyskane wyniki pr‘zedstawlono w 6

Tabela 6

Próbka	Stężenie cefapiryny (w μβ/ml)	Zabarwienie
porównawcza	0	bardzo intensywne żółte
1	0,002	dosyć żółte
2	0,003	blado żółte
3	0,004	białe
4	0,006	białe
ślepa	0	białe

Wyniki przedstawione w tabeli 6 dowodzą, ze stosując sposób według wynalazku można wizualnie oznaczyć w mleku cefapirynę o stężeniu 0,004 μβ/ml w ciągu 15 minut.

Przykład VII. Przykład ten ilustruje zastosowanie sposobu według wynalazku do małych stężeń penicyliny G w surowicy

Postępowano tak jak w przykładzie III, z tym ze próbki mleka o objętości 3 ml zastąpiono próbkami surowicy o objętości 3 ml zawierającymi penicylinę G o znanym stężeniu. Ponadto, po drugiej inkubacji trwającej 5 minut próbki odwirowano, a następnie warstwy wierzchnie rozcieńczono wodą W-krotnie. Następnie za pomocą spektrofotometru zmierzono gęstość optyczną próbek przy 410 nm. Uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli 7.

Wartości gęstości optycznych przedstawione w tabeli 7 obliczono odejmując od wartości gęstości optycznej zmierzonej dla próbki porównawczej i dla poszczególnych próbek wartość gęstości optycznej zmierzonej dla próbki ślepej

Tabela 7

Próbka	Stężenie penicyliny G (w jednostkach/ml)	Gęstość optyczna (przy 410 nm)
porównawcza	0	435
1	0,002	226
2	0,003	175
3	0,004	49
4	0,006	15
ślepa	0	0

Jak wynika z tabeli 7, stosując sposób według wynalazku, można za pomocą spektrofotometru oznaczyć ilościowo bardzo małe stężenie penicyliny G w surowicy (tak małe jak 0,002 jednostek/ml)

Przykład VIII W przykładzie tym substrat i wskaźnik pozwalający na oznaczenie kwasu 2-merkaptoalkanokazUoktylowego uformowano razem w postaci tabletki

169 360

Postępowano tak jak w przykładzie III, z tym ze po pierwszej inkubacji trwającej 10 minut dodano tabletkę zawierającą 600 gg kwasu (N-benzoilo-D-ałanylojtiooctowego i 600 gg kwasu 5,5'-dwutiobis(2-nitrobenzoesowego).

Skład tabletki był następujący·

Substrat + wskaźnik

Glikol polietylenowy 6000

Avicel - (mikrokrystaliczna celuloza)

Skrobia

Laktoza

Aerosil - (krzemionka koloidalna) Stearynian magnezu

22,0% wag 10,0% wag 55,0% wag. 0,5% wwa

0,55%

Uzyskane wyniki przedstawiono w tabwli 8

Tabela 8

Próbka	Stężenie penicyliny G (w jednostkach/ml)	Zabarwienie
porównawcza	0	intensywne żółte
1	0,002	dosyć żółte
2	0,003	blado żółte
3	0,004	białe
4	0,006	białe
ślepa	0	białe

Przykład ten dowodzi, że w sposobie według wynalazku możliwe jest zastosowanie do oznaczania kwasu 2-merkaptoalkanokarboksylowego substratu i wskaźnika w postaci jednej tabletki

Taka postać, zawierająca substrat i wskaźnik w postaci tabletki jest korzystna zarówno ze względu na wygodę stosowania, jak i na trwałość wskaźnika..

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz

Cena 4,00 zł

Claims (8)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób enzymatycznego oznaczania antybiotyków (β-laktamowych w płynie biologicznym polegający na tym, że w etapie 1 płyn biologiczny inkubuje się z rozpuszczalną D-alanylo-D-alaninokarboksypeptydazą wytworzoną przez ActinomaduraR39 w temperaturze pomiędzy 20 i 50°C umożliwiając reakcję tego enzymu z ewentualnie obecnym w płynie biologicznym antybiotykiem (β-laktamowym prowadzącą do utworzenia nieaktywnego i zasadniczo nieodwracalnego równomolarnego kompleksu enzym-antybiotyk, w etapie 2 inkubuje się mieszaninę wytworzoną w etapie 1 wraz z roztworem substratu w temperaturze pomiędzy 20 i 50°C przy pH pomiędzy 7 a 8,5, umożliwiając hydrolizę tego substratu przez enzym aż do wytworzenia związku w ilości proporcjonalnej do szczątkowej aktywności enzymatycznej, w etapie 3 oznacza się ilościowo związek wytworzony w etapie 2, w etapie 4 porównuje się wielkość oznaczaną w etapie 3 ze wzorcem i określa się ilość antybiotyku w płynie biologicznym, znamienny tym, ze inkubację w etapie 2 prowadzi się z substratem stanowiącym tioester o wzorze R1-R₂-S-(CH/R3)-COOH, w którym Rj oznacza grupę benzoilową, fenyloacetylową lub N“-acetylo-L-lizylową, R₂ oznacza grupę glicylową lub D-alanylową a R3 oznacza atom wodoru lub grupę metylową, w obecności aminokwasu aktywującego hydrolizę tego substratu przez enzym, przy czym stosuje się aminokwas o konfiguracji D lub glicynę i otrzymuje się jako produkt kwas 2-merkaptoalkanokarboksylowy o wzorze HS-CH(R₃)-COOH, w którym R3 ma wyżej podane znaczenie
2. 2 SposóS weóług zastrz 1, amienny tym, że jakż substrat boruje się: jevas (Tw-benzoilo-D-alanylo)tiooctowy
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze jako aminokwas o konfiguracji D stosuje się aminokwas wybrany z grupy obejmującej D-alaninę, D-metioninę, D-agrininę, D-fenyloalaninę, D-seiynę, D-h^dynę, D-walinę, D-tryptofan i kwas D-2-aminobutanogy'’.
4. 4 Sposób według zastrz 3, znamienny tym, ze jako aminokwas o konfiguracji D stosuje się D-alaninę
5. 5 Sposób według zastrz 1, albo 2, albo 4, znamienny tym, ze etapy 1 i 2 prowadzi się równocześnie.
6. 6 Sposób według zastrz 1, albo 2, albo 4, znamienny tym, ze jako płyn biologiczny stosuje się mleko, surowicę, mocz, ślinę, wywar z mięsa, ciecze fermentacyjne lub wodne roztwory buforowe.
7. 7 Sposób według zastrz 1, albo 2, albo 4, znamienny tym, że jako antybiotyk oznacza się benzelopemcylinę, ampicylinę, fenoksymetylopemcehns, karbemcelms, mztycelmę, oksacylinę, kłoksacylinę, cefaloeporens C, cefaloglicynę, cefalotynę, cefalakrynę lub cefapirynę
8. 8 Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 4, znamienny tym, ze oznacza się ilość kwasu 2-mzrkaptoalkanokarbokse'lowego o wzorze HS-CH(R3)-COOH przez inkubację mieszaniny wytworzonej w etapie 2 z kwasem 5,5^,-dwutiobis(2-mtrobenzoesowym) prowadzącą do powstania zabarwienia o intensywności zależnej od ilości kwasu 2-mzrkαptoalkanokarbokeylowego.