NO302664B1 - Enzymatisk prosess for bestemmelse av <beta>-lactamantibiotika - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en ny, hurtig og

følsom enzymatisk prosess for bestemmelse av |3-lactamantibiotika i en biologisk væske. Den angår også et testsett som anvendes for utførelse av denne prosess.

For tiden er antibiotika vidt anvendt ikke bare som terapeutiske midler ved behandling av infektiøse sykdommer forårsaket av bakterier, men også som næringsmiddelkonser-veringsmidler og som vekststimulerende additiver til dyrefor. Det er derfor et stadig økende behov for å være i stand til å påvise nærvær av antibiotika, selv i meget lave konsentrasjoner, i komplekse biologiske væsker slik som melk, urin, blod, serum, spytt, kjøttekstrakter, fermenteringsvæsker og bufredé/vandige media.

Melkeproduksjonen er et eksempel på dette. Det er velkjent å anvende penicillin for å behandle visse infektiøse sykdommer i melkekveg, for eksempel mastitis. Av selvsagte medisinske årsaker må melk beregnet for matforbruk prinsipielt være fri for ethvert spor av antibiotika. På den annen side kan penicillinkonsentrasjoner på 0,005 IU/ml eller mindre ha skadelige effekter under fremstilling av melk-baserte produkter slik som ost eller yogurt. Ennvidere må i visse land konsentrasjoner av antibiotikum ikke overskride 0,004 IU/ml.

Det er derfor nødvendig å være i stand til å bestemme, hurtig og nøyaktig, konsentrasjonen av penicilliner i melk produsert av kveg, og fortrinnsvis å være i stand til å gjøre dette direkte på stedet på •gården.

Mikrobiologiske prosesser som muliggjør bestemmelse

av relativt lave konsentrasjoner av (3-lactamantibiotika i biologiske væsker, har eksistert i lang tid. Disse prosesser innbefatter observering av graden til hvilken vekten av mikro-organismer som er følsomme overfor antibiotika, inhiberes i nærvær av en prøve av den biologiske væske. Disse prosesser er imidlertid tidskrevende og krever et høyt nivå av teknisk dyktighet, og i beste fall kan det ta 2 til 3 timer før et resultat erholdes, hvilket ikke er tillatelig i praksis.

Mer nylig er en hurtig mikrobiologisk prosess blitt foreslått for påvisning av nærværet av antibiotika i en biologisk væske, nærmere bestemt melk (se US-patentskrift 4 239 852).

I henhold til denne metode inkuberes den væskeprøve som skal undersøkes på den ene side, sammen med celler eller celledeler av en mikroorganisme som er meget følsom overfor antibiotika, nærmere bestemt Bacillus stearothermophilus, og på den annen side med et antibiotikum merket med et radioaktivt element eller med et enzym. Under inkuberingen konkurrerer antibiotikum, hvis dette er tilstede i prøven, med det merkede antibiotikum for binding til reseptorseter på cellene eller celledelene. Deretter bestemmes mengdene av merket antibiotikum som er blitt bundet til cellene eller celledelene. Dette tilveiebringer en indikasjon på nærværet (eller fravær) av antibiotika, da mengden av testet, merket antibiotikum er omvendt proporsjonal med konsentrasjonen av antibiotikum i prøven.

I henhold til forfatteren av dette US-patentskrift kan denne prosess påvise antibiotikumkonsentrasjoner så lave som 0,01 IU/ml eller til og med 0,001 IU/ml i melk, på mindre enn 15 minutter.

Hovedulempen ved denne prosess er imidlertid at for

å oppnå dette resultat er det nødvendig å anvende et antibiotikum merket med et radioaktivt element (^C eller "^^1) , hvis mengde må bestemmes med hjelp av en spesialapparatur slik som for eksempel en scintillasjonsteller. Ennvidere er det ikke fullstendig uten fare for den person som utfører analysen å håndtere slike radioaktive materialer, selv i meget små mengder.

Riktignok beskriver eksempel 2 i dette US-patentskrift en annen utførelsesform av denne prosess hvori et enzymmerket antibiotikum anvendes og hvori mengden av merket antibiotikum bestemmes ved en visuell kolorimetrisk metode. Imidlertid kan denne variant bare påvise hvorvidt det er mer (eller mindre) enn 0,05 IU/ml penicillin i en prøve av melk. Denne prosess er derfor betydelig mindre følsom og følgéiig meget mindre anvendbar.

Det er også kommersielle tester basert på anvendelse av monoklonale eller polyklonale antistoffer. Som kjent kan tester fremstilles på basis av konvensjonelle teknikker av immunologisk diagnose (ELISA, agglutinering med latex, radio- immunologiske metoder og lignende). Som et eksempel på denne type av test kan nevnes "sPOiTTESTEN". som markedsføres av

ANGENICS (USA).

Ulempene ved denne .type av test er at de er generelt meget komplekse og fremfor alt at de bare kan anvendes for å påvise et meget begrenset antall antibiotika. Denne sistnevnte ulempe resulterer fra den høye spesifisitet av antistoffene;

de kan gjenkjenne bare antibiotika som er strukturelt lik det valgte for immuniseringen. Dette er særlig vanskelig når det gjelder 3-lactamantibiotika.

Det er også en kjent enzymatisk prosess, for påvisning av lave konsentrasjoner av p-lactamantibiotika i humaiiserum og i melk (J-M. FRERE et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18, (1980, nr. 4), 506-510).

Denne prosess (heretter angitt som "J-M. FRERE - prosessen") er mer interessant da den ikke nødvendiggjør anvendelse ase-radioaktive, materialer som krever avansert måleapparatur, og ved at den samtidig er meget hurtig og bemerkel-sesverdig aktiv. Denne prosess er basert på anvendelse av et spesifikt enzym, dvs. det løselige eksocellulære D-alanyl-D-alanincarboxypeptidase, som produseres av Actinomadura R39 (tidligere kalt Streptomyces R39). I foreliggende beskrivelse vil dette enzym bli betegnet som "enzym R39". Dette enzym utviser en spesifikk aktivitet for hydrolysering av D-alanyl-D-alanin-endegrupper av forskjellige peptider med frigivelse av det terminale D-alanin.

Et annet viktig karakteristisk trekk ved enzym R39 er at det reagerer med p-lactamantibiotika for å danne meget hurtig et inaktivt, hovedsakelig irreversibelty ekvimolekylært enzym-antibiotikumkompleks.

I J-M. FRERE-prosessen anvendes disse egenskaper ved enzym R39 for å bestemme meget lave konsentrasjoner av [3-lactamantibiotika. Metoden omfatter tre essensielle trinn.

I det første trinn inkuberes et bestemt volum av en prøve av den væske som skal undersøkes med en bestemt mengde av enzym R39. Inkuberingen utføres under betingelser som muliggjør at 3-'lactamantibiotikum, hvis dette er tilstede i prøven, får reagere med enzymet for å danne et inaktivt, hovedsakelig irreversibelt, ekvimolekylært enzym-antibiotikumkompleks.

I det andre trinn inkuberes en bestemt mengde av substrat, f.eks. N cx , N<£->diacetyl-L-lysyl-D-alanyl-D-alanin,

med produktet erholdt i det første trinn, under betingelser som muliggjør at substratet blir hydrolysert av enzymet, under dannelse av en mengde av D-alanin svarende til den gjenværende enzymatiske aktivitet av enzym R39 som ikke er blitt kompleks-dannet med antibiotikum i det første trinn.

I det tredje trinn bestemmes mengden av det således dannede D-alanin. Fagmannen vil lett forstå at mengden av D-alanin dannet i det andre trinn, avhenger av restaktiviteten av enzymet og er derfor omvendt proporsjonal med mengden av antibiotikum tilstedeværende i prøven.

I J-M. FRERE-prosessen bestemmes mengden av D-alanin ved en enzymatisk metode. Denne er basert på to koblede enzymatiske reaksjoner. I den første reaksjon oxyderes D-alanin til pyruvsyre ved hjelp av D-aminosyreoxydase (i nærvær av dets ko-enzym, f lavin — adenin-dinue.leotid) ; samtidig dannes en tilsvarende mengde av hydrogenperoxyd fra atmosfærisk oxygen. I den andre reaksjon anvendes det dannede hydrogenperoxyd til

å oxydere o-dianisidin ved hjelp av peroxydase. En brun farv-ning dannes hvis intensitet avhenger av mengden av D-alanin.

Dette gjør det derfor mulig å bestemme mengden av D-alanin ved en kolorimetrisk metode, enten visuelt eller ved måling av den optiske densitet med et spektrofotometer (A maks = 460 nm).

Det er således mulig ved fremstilling av en serie

av prøver med en kjent antibiotisk konsentrasjon, og ved anvendelse av denne prosess, å nedtegne en standard kurve som relaterer den prosentvise restenzymatiske aktivitet av enzym R3 9 til antibiotikumkonsentrasjonen.

For å oppnå en kvantitativ indikasjon av antibiotikumkonsentrasjonen i en prøve, utføres nøyaktig den samme prosedyre, og antibiotikumkonsentrasjonen bestemmes ved å referere til denne standardkurve. Selvsagt krever denne kvantitative evaluering anvendelse av et spektrofotometer.

Imidlertid er det ikke noe behov for et spektrofotometer eller lignende måleapparatur for å bestemme hvorvidt eller ikke den antibiotiske konsentrasjon overskrider en viss kritisk verdi.

Det er tilstrekkelig på forhånd å kjenne den kritiske antibiotiske konsentrasjon ved hvilken aktiviteten av enzymet R39 totalt undertrykkes, eller med andre ord, den antibiotiske konsentrasjon ved hvilken ikke noe D-alanin dannes og hvor følgelig ingen fargning oppstår. Ved å kjenne denne kritiske konsentrasjon er det selvsagt at det er mulig ved en enkel visuell inspeksjon av resultatet av bestemmelsen, å bedømme hvorvidt eller ikke en gitt prøve inneholder en antibiotisk konsentrasjon som er lavere eller høyere enn angitte, kritiske konsentrasjon. Det er derfor innlysende at ved anvendelse av denne prosess kan en indikasjon av den antibiotiske konsentrasjon i melk hurtig og nøyaktig erholdes, uten å ty til et spesialinstrument.

Ennvidere gjør denne prosess det mulig å bestemme relativt lave konsentrasjoner av p-lactamantibiotikum i melk og i humant serum. Således er det for eksempel mulig ut fra melkeprøver på ca. 2 0 mikroliter i volum og inkubering av disse med 3 picomol av enzym R39, kvantitativt å bestemme (under anvendelse av et spektrofotometer) konsentrasjoner av penicillin så lave som 0,02 IU/ml melk, mens konsentrasjoner på mer enn 0,09 IU/ml melk kvalitativt kan bestemmes ved den ovenfor beskrevne visuelle metode, i løpet av mindre enn 1 time.

Imidlertid har J-M. FRERE-prosessen flere alvorlige ulemper. For det første er følsomheten av J-M. FRERE-prosessen utilstrekkelig, i særdeleshet når det gjelder biologiske væsker (melk, spytt, serum og lignende). Det er riktig at denne føl-somhet kan økes enten ved redusering av mengden av enzym R39, men dette vil øke reaksjonstiden både i første og andre trinn ved prosessen, eller ved å øke volumet av prøven som må inkuberes med enzym R39, og i dette tilfelle må reaksjonstiden i

i første trinn ved prosessen økes. Uheldigvis kan følsomheten av J-M. FRERE-prosessen ikke økes på denne måte, i særdeleshet ikke når det gjelder komplekse væsker av biologisk opprinnelse. Det er virkelig blitt funnet at en viktig bestemmelse ikke kan realiseres når volumet av prøven av den biologiske væske overskrider en viss kritisk verdi, hvilken varierer med arten av den biologiske væske. I tilfelle av melk og serum, er det funnet at når prøvevolumet for inkuberingen overskrider ca. 50 ul, vil mengden av oxydert o-dianisidin som dannes, være sterkt redusert. Sluttelig når det gjelder urin, påvises ingen enzymatisk aktivitet i det hele tatt, selv ved anvendelse av prøvevolumer så lave som 10 ul. Det er derfor umulig å anvende denne prosess for bestemmelse av antibiotika i urinen.

Det er antatt at de biologiske væsker inneholder substanser som inhiberer virkningen av de anvendte enzymer i J-M. FRERE-prosessen. I praksis betyr dette således at store prøvevolumer bare kan anvendes under de beste omstendigheter på bekostning av økede mengder av reaktanter som er minst propor-sjonale med økningen av volumet. Dette er klart uønsket i lys av de høye kostnader av de anvendte enzymer, i særdeleshet D-aminosyreoxidase og dets kofaktor, flavin-adenin-dinucleotid.

En forbedret versjon av J-M. FRERE-prosessen markeds-føres i form av en test som bærer varemerket "Penzym". Denne test anvendes hovedsakelig som screeningstest for melk som kommer til meieriene.

Testen utføres i to trinn. I det første trinn inkuberes 50 pl melk med 1,5 picomol av enzym R39 i 5 minutter ved 47° C. I det andre trinn tilsettes deretter alle reagenser for bestemmelse av gjenværende enzymatisk aktivitet, dvs. substratet . N CX ,N £-diacetyl-L-lysyl-D-alanyl-D-alanin, D-amino-syreoxidasen, flavin-adenin-dinucleotid, peroxidase og den kromogene reagens tilsettes inkuberingsmediet, og det hele inkuberes i 15 minutter ved 47° C. Etter endt inkubering indikeres ved sammenligning med et fargekart, en gul farqe fri for lyserødt nærvær av 3-lactamantibiotika ved en konsentrasjon høyere enn 0,017 IU/ml melk. På den annen side indikerer nærvær av den lyserøde farge enten fravær av antibiotika

(en intens lyserød farge) eller nærvær av antibiotika i konsentrasjoner av opp til 0,017 IU/ml, idet intensiteten av den erholdte lyserøde farge er omvendt proporsjonal med antibioti-kumkonsentras jonen .

Takket være denne test kan antibiotikumkonsentrasjoner i melk så lave som 0,017 IU/ml visuelt bestemmes i løpet av 20 minutter.

Imidlertid har til og med denne forbedrede versjon

av J-M. FRERE-prosessen følsomhets- og hurtighetskarakteristika som ikke tillater dens bruk hverken i land hvis lover tillater bare ekstremt lave antibiotikumkonsentrasjoner, for eksempel 0,004 IU/ml, eller som en ultrahurtig test for å

sette melkebonden i stand til å utføre testene på gården i løpet av mindre enn 5 minutter.

Økningen av følsomheten og reduksjonen av respons-tiden av Penzym-testen er gj-enstand for de samme begrensninger som allerede er angitt ovenfor med hensyn til J-M. FRERE-prosessen. I tillegg utføres denne test på meget små prøvevolumer og krever derfor en viss erfaring for at mikroprøveteknikker skal utføres riktig.

For å unngå alle problemene forbundet ved anvendelse av en test utført fullstendig i nærvær av den biologiske væske, er en prosess også blitt foreslått hvori enzymet R39 immobili-seres på en vann-uløselig bærer, i særdeleshet på en poly-(N,N-dimethylakrylamid)-harpiks. Denne prosess er beskrevet i US-patentskrift 4 546 076, og omfatter følgende tre trinn: (1) enzymet immobilisert på bæreren, inkuberes i nærvær av den biologiske væske; (2) det immobiliserte enzym separeres deretter fra den biologiske væske og vaskes; (3) den gjenværende aktivitet av enzym R39 bestemmes ved en kolorimetrisk bestemmelse av D-alanin dannet fra peptidsubstratet under anvendelse av et system av reagenser omfattende en D-aminosyreoxidase og dens kofaktor, en peroxidase og et kromogent reagens, idet resultatet erholdes enten ved en enkel visuell inspeksjon eller ved hjelp av et spektrofotometer. Denne prosess har et utall fordeler: det er ikke lenger noen interferens mellom den biologiske væske og enzymene anvendt for bestemmelse av D-alanin, da den biologiske væske allerede er blitt fjernet trinn (2) i prosessen-;

glimrende bestemmelser kan foretas på meget større prøve-volumer. opp til 5 ml; og

følsomheten er meget større da prosessen kan anvendes for å bestemme visuelt konsentrasjoner av penicillin G på mer enn 0,002 IU/ml melk.

Imidlertid har denne prosess også ulemper:

som ved alle prosesser som krever et separas jonstrinn, er reproduserbarheten av resultatene ikke så gode som i en homogen-faseprosess;

uansett hvilken separasjonsmetode som anvendes, er det uunn-gåelige resultat en økning i varighet og kompleksitet ved

prosessen;

selv om denne prosess muliggjør at en høy følsomhet kan erholdes ved enkel visuell inspeksjon, og som kan gå opp .

til 0,002 IU penicillin G pr. ml, er tiden nødvendig for å oppnå dette resultat, klart for lang (minst 30 minutter)

for at denne prosess skal kunne anvendes for hurtig bestemmelse når melk oppsamles på gården; og

kostnadene er meget høyere enn kostnadene for en homogen fasetest.

Det vil representere en betydelig teknisk og økonomisk fordel å ha til disposisjon en prosess fri for de forskjellige ulemper ved de kjente prosesser, i særdeleshet J-M. FRERE-prcses-sen. eller prosessene avledet derfra, slik som "Penzym"-testen eller prosessen beskrevet i US-patentskrift 4 546 076.

Med andre ord er et mål ved foreliggende oppfinnelse

å tilveiebringe en prosess som gir en kombinasjon av fordelaktige egenskaper, fordi: resultatet tilveiebringes meget hurtig, for eksempel i løpet av 5 minutter eller mindre;

følsomheten er meget høy, noe som muliggjør at prosessen kan anvendes i land hvor lovene er meget strenge og som krever at antibiotikakonsentrasjonen i melk ikke skal overskride 0,004 IU/ml eller mindre;

bestemmelser kan utføres på store prøvevolumer på 1 ml eller mer, som således muliggjør en lett utøvelse av prosessen av ulært personell;

prosessen er billig og meget enkel i bruk.

Disse mål oppnås ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som adskiller seg ved følgende essensielle karakteristika: (1) anvendelse av et spesielt thioester-type substrat for enzym R39 for således å danne ved hydrolyse en forbindelse inneholdende en fri SH-gruppe som kan bestemmes ved en enkel, billig kolorimetrisk metode, uten behov for enzymer hvis aktivitet forstyrres av komponentene av den biologiske væske; (2) utførelse av hydrolysen av substratet med enzymet i nærvær av D-aminosyre eller glycin, som hovedsakelig aktiverer denne hydrolyse.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer derfor en ny enzymatisk prosess for bestemmelse av (3-lactamantibiotika i en biologisk væske, hvilken er kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: (1) inkubering av den biologiske væske med lselig D-alanyl-D-alanin-carboxypeptidase produsert av Actinomadura R39, hvilken inkubering utføres under betingelser som muliggjør at |3-lactamantibiotikum, hvis tilstedeværende i den angitte væske, får reagere med enzymet for å danne et inaktivt og hovedsakelig irreversibelt,, ekvimolekylært enzym-antibiotikumkompleks; (2) inkubering av blandingen erholdt ved slutten av trinn (1) med en substratløsning under betingelser som muliggjør at substratet hydrolyseres av enzymet, hvilket substrat er en thioester av den generelle formelhvoriRbetegner et benzoyl-, fenylacetyl- eller Na-acetyl-L-lysylradikal,Rbetegner et glycyl- eller D-alanylradikal, og Rer et hydrogenatom eller et methylradikal, som danner ved hydrolyse, en 2-mercaptoalkansyre av

formelen hvori R., har den ovenfor angitte betydning,

i en mengde proporsjonal med den rest-enzymatiske aktivitet, hvilken inkubering ytterligere utføres i nærvær av en D-aminosyre eller av glycin, som aktiverer hydrolysen

av substratet med enzymet; (3) bestemmelse av mengden av 2-mercaptoalkansyre av formel II dannet i trinn (2), og (4) sammenligning av verdien bestemt i trinn (3) med en standard, under dannelse av konsentrasjonen av antibiotikum i den biologiske væske.

Under forskningsarbeidet innen dette område er det

funnet at enzym R39 har en spesifikk hydrolyseaktivitet på thioesterbindinger av visse forbindelser som har en terminal thioestergruppe, og nærmere bestemt har en hydrolyseaktivitet på thioesteren som har generell formel I angitt ovenfor.

Denne oppdagelse er overraskende i seg selv da- det såvidt søke-ren vet, ikke er noe kjent eksempel i den kjente teknikk på

et D-alanyl-D-alanin-carboxypeptidase som også virker som eii thioesterase. Man har dratt fordel av denne uventede egenskap av enzym R39 for å utvikle en ny forbedret enzymatisk prosess for bestemmelse av (3-lactam-antibiotika i biologiske væsker.

I motsetning til J-M. FRERE-prosessen og lignende prosesser beskrevet tidligere, er substratet for enzym R39 anvendt ifølge oppfinnelsen, en thioester med generell formel I, som ved hydrolyse danner en 2-mercaptoalkansyre med formel II som angitt ovenfor. Dette nye substrat tilveiebringer utal-lige fordeler, både teknologisk og økonomisk. 2-mercaptoalkansyren for formel II dannet fra dette substrat (og hvis mengde er proporsjonal med restaktiviteten av enzym R39), kan bestemmes ved en enkel kolorimetrisk metode som ikke lenger krever enzymer slik som D-aminosyreoxidase og dens koenzym. Ved siden av en tydelig reduksjon av kostnadene, er ett av hovedproblemene ved J-M. FRERE-prosessen overvunnet, da det ikke lenger er noen mulig interferens mellom komponentene av den biologiske væske og reagensene ved den kolorimetriske bestemmelse, det sistnevnte er enkle kjemiske reagenser og ikke enzymer. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen muliggjør derfor at bestemmelsen kan utføres direkte på den ubearbeidede biologiske væske som sådan, og det er ikke lenger nødvendig for prøver at disse frigis på forhånd fra hvilke som helst substanser som ville kunne for-styrre den koiorimetriske bestemmelse.

Da ennvidere bestemmelsen av restenzymaktivitet ikke lenger influeres av faktorer tilstedeværende i de biologiske væsker, er det også mulig å arbeide med prøver av biologisk væske som har et volum av opp til 10 ml. Prosessen ifølge foreliggende oppfinnelse kan derfor anvendes på store volumer og er således enda enklere å utføre av ufaglærte personer.

Da det ennvidere er mulig å arbeide på store prøve-volumer, gjør fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen det mulig å oppnå en meget høy følsomhet. Som det vil bli vist heretter i eksemplene, gjør fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen det mulig å bestemme visuelt og enkelt mengder i størrelses-orden 0,004 IU penicillin g pr. ml melk i løpet av 15 minutter. Det er til og med mulig under henvisning til et fargekart, å bestemme konsentrasjoner så lave som 0,002 IU/ml.

Ennvidere er det overraskende funnet at tilsetning av en D-aminosyre eller glycin betydelig øker graden av hydro-lysereaksjonen av thioester-typesubstratet av formel I under innflytelsen av enzymet. Foreliggende forskningsarbeide innen dette område har vist at et antall D-aminosyrer såvel som glycin kan ha en aktiverende effekt på thioesterhydrolyse-reaksjonen. Blant de beste aktivatorene 'kan nevnes D-alanin, D-methionin, D-arginin, D-fenylalanin, D-serin, D-histidin, D-valin, D-tryptofan og D-2-aminosmørsyre.

Hvis for eksempel aktiviteten av enzym R39 uttrykkes i enheter pr. mg enzym (en enhet av enzym hydrolyserer 1 mikro-mol substrat pr. minutt ved 4 7° C), er det blitt funnet at aktiviteten av enzym R39, under anvendelse av [(N-benzoyl-D-alanyl)thio]-eddiksyre som substrat, er lik 8 enheter i fravær av D-alanin og 320 enheter i nærvær av D-alanin. Med andre ord er graden av hydrolyse av substratet ved enzym R39 i nærvær av denne aktivator 40 ganger høyere. På den annen side er det også blitt funnet at ingen aminosyre med L-konfigurasjon er i stand til å aktivere hydrolysen av substratet.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det derfor essensielt at hydrolysen av thioester-typesubstratet i trinn (2) utføres i nærvær av en D-aminosyre, som aktiverer hydrolysen av substratet med enzym R39. Denne forholdsregel gjør det mulig å spare betydelig tid ved utførelse av prosessen. Ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er det på denne måte lett å bestemme en penicillin G-konsentrasjon på 0,016 IU pr. ml melk i løpet av 5 minutter. Sammenlignings-vis krever "Penzym"-testen ca. 15 minutter for å oppnå det samme resultat. I motsetning til de kjente prosesser er derfor fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen særlig attraktiv for hurtig antibiotikum-bestemmelse når melk oppsamles på gården, spesielt da den er enkel å bearbeide og krever ikke avansert apparatur.

Ennvidere er det også funnet at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes med hell for bestemmelse av antibiotikum ikke bare i melk, men også i andre biologiske væsker slik som serum, urin, spytt, kjøttekstrakt, fermenteringsvæsker, bufrede, vandige løsninger og lignende.

Hovedfordelen ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er derfor at den kan anvendes enten for å påvise konsentrasjoner av (3-lactam-antibiotika i størrelsesordenen rundt 0,016 IU/ml i løpet av meget kort tid (5 minutter), eller for å påvise meget lave konsentrasjoner av p-lactamantibiotika i størrelsesordenen 0,004 IU/ml eller mindre, i løpet av betydelig lengre tid (15 minutter), uten å kreve spesiell analyt-tisk apparatur og uten behov for å ha tilgang til en kompleks teknologi som krever en separasjonsprosess.

Antibiotikaene hvis konsentrasjoner kan bestemmes under anvendelse av fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen, tilhører gruppen av antibiotika som erkarakterisert vednærvær av en |3-lactamring i deres molekyl, dvs. som regel alle penicilliner og cefalosporiner. Eksempler på penicilliner som kan nevnes, innbefatter benzylpenicillin (penicillin G) , ampicillin, fenoxymethylpenicillin, carbenicillin, methicillin, oxacillin, cloxacillin og lignende. Som eksempler på cefalosporiner kan nevnes cefalosporin C, cefaloglycin, cefalothin, cefalexin, cefapirin og lignende. Særlig fordelaktige resultater er blitt oppnådd med penicillin G.

I trinn (1) i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen inkuberes et bestemt volum av en prøve av den biologiske væske med en bestemt mengde enzym R39.

Som ovenfor forklart er det mulig å arbeide med meget store prøvevolumer. For en gitt mengde av enzym R39 vil ved økning av volumet av prøven, følsomheten av prosessen øke parallelt. Ved eksempelvis fordobling av volumet av prøven fordobles følsomheten, ved tredobling av volumet av prøven tredobles følsomheten også videre. Volumet av prøven kan derfor velges til å tilveiebringe den ønskede følsomhet. Når det gjelder melk, kan for eksempel følsomheten ved prosessen tilpasses til de standarder som er vedtatt ved lov i landet hvor de anvendes, eller til kravene satt av meieriindustrien.

Den samme effekt for et gitt volum av biologisk væske kan oppnås ved reduksjon av mengdene av enzym R39 (som i eksempel 2 i det etterfølgende). I dette tilfelle må imidlertid ikke bare varigheten av trinn (1), men også varigheten av trinn (2) av prosessen, økes proporsjonalt.

I praksis vil valget av mengder av enzym R39 og av biologisk væske som skal anvendes, avhenge på den ene side» av på hvilken måte prosessen utføres, og på den annen side av den ønskede følsomhet eller hurtighet.

Hvis for eksempel fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes for bestemmelse av forurensningen av melk på gården, er det foretrukket å arbeide med store prøvevolumer for lettere manipulering. Volumer mellom 1 og 10 ml er foretrukket. Hvis prosessen utføres i et laboratorium med mikroprøveutstyr, vil prøvevolumer på mellom 50 ul og 1 ml fortrinnsvis være egnet.

Valget av mengdene av enzym og biologisk væske som anvendes, vil ennvidere avhenge hovedsakelig av den krevede følsomhet. I for eksempel laboratoriet hvori små volumer kan anvendes og hvor en følsomhet på 0,01 IU/ml kreves, vil den valgte mengde av enzym være ca. 1 picomol og volumet av biologisk væske vil være ca. 50 ul. For å oppnå en følsomhet på 0,005 og 0,0025 IU/ml vil volumet av biologisk væske bli øket til 100 ul og 200 ul, uten forandring av mengde av enzym.

Den glimrende følsomhet, hurtigheten og nøyaktig-

heten ved fremgangsmåten . ifølge oppfinnelsen resulterer fra bestemte karakteristika av enzym R39 på den ene side, og fra prosessen anvendt ved påvisning av restaktivitet av enzym R39

på den annen side.

Enzym R39 erkarakterisert ved: ekstremt hurtig dannelse av et inaktivt ekvimolekylært.enzym-antibiotikumkompleks;

ekstraordinær stabilitet av angitte kompleks, fordi når det er dannet, brytes det bare ned meget langsomt. Eksempelvis er halveringstiden av komplekset dannet mellom enzym R39 og penicillin G, ca. 70 timer ved 37° C; og

en glimrende enzymatisk aktivitet, vist ved meget hurtig hydrolyse av endegruppen av thioester-typesubstratet av formel I, under innflytelse av en spesifikk aktivator.

Takket være disse tre karakteristika inntar enzym R39 en priviligert stilling sammenlignet med de andre D-alanyl-D-alanin-carboxypeptidaser identifisert hittil. Da tiden for nedbrytning av enzym-antibiotikumkomplekset er betydelig større enn den totale tid som kreves henholdsvis for dannelse av komplekset og for måling av restenzymatisk aktivitet, er det ikke noen fare for at resultatene ved bestemmelsen vil bli ødelagt ved frigivelse av fritt aktivt enzym på grunn av for tidlig nedbrytning av enzym-antibiotikumkomplekset.

Når D-alanyl-D-alanin-carboxypeptidasen kjent hittil vurderes, adskilt fra enzym R39, oppfyller ingen av disse betingelsene perfekt. Enten er graden av dannelse av komplekset -ca, ti ganger langsommere, eller stabiliteten av enzym-antibiotikumkomplekset er fullstendig utilstrekkelig, eller graden av hydrolyse av substratet altfor langsom (dette er tilfelle blant annet med alle membran-bundne, endocellulære carboxypeptidaser). Enzym R39 er den spesifikke, løselige, eksocellulære D-alanyl-D-alanin-carboxypeptidase som utskilles av Actinomadura R39, når denne mikroorganisme (deponert 10. juli 1981 ved Pasteur-instituttet i Paris,

under deponeringsnummer 1-127) dyrkes i et egnet dyrknings-medium.

For å utføre fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen må enzymet selvsagt være hovedsakelig rent. Dets fremstilling og rensing kan utføres i henhold til metodene beskrevet i litteraturen (se i denne forbindelse artikkelen av J-M. FRERE et al., Biochem. J. 143, (1974), 233 - 240, med tittelen "Molecular Weight, Amino Acid. Composition andPhysicochemical Properties of the Exocellular DD-Carboxypeptidase-Transpeptidase of Streptomyces R39"). Imidlertid er dette enzym i ren form for tiden kommersielt tilgjengelig idet det kan erholdes fra UCB-BIOPRODUCTS S.A. (Belgia).

Enzym R39 utviser en glimrende stabilitet; det motstår høye temperaturer opp til 60° C. Det er av denne årsak at inkuberingen av den biologiske væske med enzym R39 kan ut-føres uten vanskelighet innen et temperaturområde på fra 20 til 50° C. Den foretrukne inkuberingstemperatur er nær 47° C. Under disse betingelser er inkuberingstiden, som er nært beslektet med den tid som kreves for å danne det inaktive ekvimolære enzym-antibiotikumkompleks, meget kort. En økning i inkuberingstemperaturen vil ha den effekt at den redusrer inkuberingstiden og vice versa. Det er derfor mulig å forkorte varigheten av fremgangsmåten ved økning av temperaturen.

I trinn (2) i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen inkuberes blandingen erholdt ved slutten av trinn (1) med en bestemt mengde av thioester-typesubstrat av formel I i oppløs-ning, i nærvær av glycin eller en D-aminosyre, som aktiverer hydrolysen av dette substrat ved enzymet. Under dette trinn anvendes fraksjonen av enzymet som ikke var forbrukt ved dan-nelsen av enzym-antibiotikumkomplekset i trinn (1) ved fremgangsmåten for å hydrolysere thioestersubstratet av formel I. Denne hydrolysereaksjon vil gi en mengde av 2-mercaptoalkansyre av formel II som er proporsjonal med restaktiviteten av enzym R39.

Thioestrene av formel I er nye forbindelser, bortsett fra [(N-benzoylglycyl)thio]-eddiksyre som er kjent fra US-patentskrift 2 824 863.

Thioestrene av formel I kan fremstilles ved en kon-vensjonell prosess under anvendelse av i og for seg kjente reaksjoner. Som en generell regel kondenseres en syre av formel III, på forhånd aktivert, f.eks. i form av blandede anhydrider eller i form av aktive estere, i et inert løsnings-middel slik som kloroform, diklormethan, ethylacetat eller dimethylformamid, med en 2-mercaptoalkansyre av formel II i henhold til følgende ligning: hvori R^, R2og R^har de tidligere angitte betydninger.

Som eksempler på thioestere av formel I som kan anvendes som substrat, kan nevnes [(N-benzoyl-D-alanyl)thio]-eddiksyre, 2-[(N-benzoyl-D-alanyl)thio]-propionsyre, [(N-fenylacetyl-D-alanyl)thio]-eddiksyre, [(N Of-acetyl-L-lysyl-D-alanyl)-thio]-eddiksyre og lignende. Imidlertid gir [(N-benzoyl-D-alanyl) thio] -eddiksyre de beste resultater.

Som ikke-begrensende eksempler på D-aminosyrer som kan assosieres som aktivatorer med substratene nevnt ovenfor, kan nevnes D-alanin, D-methionin, D-arginin, D-fenylalanin, D-serin, D-histidin, D-valin, D-tryptofan og D-2-aminosmørsyre.

I henhold til en særlig foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen assosieres D-alanin med [(N-benzoyl-D-alanyl)-thio ]-eddiksyre anvendt som substrat.

Mengdene av nødvendig substrat og aktivator er ikke kritiske, forutsatt at prosessen utføres under betingelser ved enzymmetning av substratet.

Driftsbetingelsene som skal observeres under trinn (2), er hovedsakelig de samme som de som er angitt for trinn (1). Irikuberingen kan utføres innen et temperaturområde på fra 20 til 50° C, fortrinnsvis ved en temperatur nær 47° C.Inkuberingstiden med den ikke-inaktiverte fraksjon av enzym R39 må være minst tilstrekkelig til å danne en målbar mengde av 2-mercaptoalkansyre av formel II. Ved en inkubasjonstemperatur på 47° C kan denne tid variere fra mellom noen få sekunder til 10 minutter avhengig av mengden av enzym tilstedeværende og volumet av prøven. Denne tid kan reduseres ved økning av inkubasjonstemperaturen, eller motsatt, økes ved reduksjon av inkubasjonstemperaturen. Det er derfor også fordelaktig å øke temperaturen ved denne inkubering i alle tilfeller hvor hurtigheten ved bestemmelsen er en viktig faktor.

For å oppnå optimal enzymatisk aktivitet, må inkuberingsmediet fortrinnsvis ha en pH-verdi på fra 7 til 8,5. Vanligvis opprettholdes pH på ca. 8,0 ved utførelse av inkuberingen i en egnet buffer.

I trinn (3) ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen bestemmes mengden av 2-mercaptoalkansyre av formel II dannet i trinn (2).

Bestemmelsen av 2-mercaptoalkansyre av formel II kan utføres ved en hvilken som helst kjent metode, bare forutsatt at- metoden er hurtig, billig og er spesifikk for 2-mercaptoalkansyren av formel II for utelukkelse av alle andre produkter som er til stede i den væske som undersøkes.

Av denne grunn er den foretrukne metode kolorimetrisk bestemmelse med et reagens som produserer en farge ved omset-ning med den frie SH-gruppe av 2-mercaptoalkansyren.

Det kromogene reagens kan velges blant kjemiske reagenser normalt anvendt for denne type av reaksjon, slik som for eksempel 5,5<1->dithiobis(2-nitrobenzoe)syre, kondensasjonsprodukter av 4,4<1->dithiobis(fenylamin) med benzaldehyder, et fenanthrolin-Fe<+++->system og lignende.

Et foretrukket kromogent reagens er 5,5<1->dithiobis-(2-nitrobenzoe)-syre, også kalt Ellmans-reagens . som frem-kaller en gul farge basert på 2-nitro-5-mercaptobenzoesyre, dannet ved en utbytningsreaksjon med SH-gruppen av 2-mercaptoalkansyren. Intensiteten av fargen er således direkte en funksjon av mengden av 2-mercaptoalkansyren.

For enkelte anvendelsesområder kan det imidlertid være fordelaktig å anvende en rød farge fremkalt ved reak-sjonen mellom fenanthrolin og fri SH-grupper i nærvær av Fe -kationer.

Mengden av kromogent reagens som skal anvendes, vil avhenge av mengden av 2-mercaptoalkansyre dannet i den bestemte anvendelse• Det foretrekkes at driftsbetingelsene i er slik at den molare mengde av kromogent reagens er ubetyde-lig i overskudd av den maksimale molare mengde av 2-mercaptoalkansyren som kan dannes i trinn (2) ved metoden.

Det skal bemerkes at enzym R3 9 nødvendigvis må være til stede fra begynnelsen av trinn (1) i prosessen. Likeledes5må substratet og aktivatoren nødvendigvis være til. stede fra begynnelsen av trinn (2). Imidlertid kan aktivatoren tilsettes ved begynnelsen av trinn (1), og også det kromogene reagens kan tilsettes ved begynnelsen enten av det første eller andre trinn, eller bare ved slutten av det andre trinn. I en foretrukket utførelsesform, i trinn (1) i prosessen, inkuberes enzym R39-løsningen sammen med melkeprøven i nærvær av aktivatoren, i trinn (2) tilsettes substrat og det kromogene reagens, og trinn (2) og (3) utføres samtidig under hovedsakelig samme betingelser som de som er angitt ovenfor for trinn (2).

I trinn (4) ved fremgangsmåten sammenlignes verdien bestemt i trinn (3) med en standard for å oppnå konsentrasjonen av antibiotikum i den biologiske væske.

Den kvantitative bestemmelse av antibiotikakonsentrasjonen kan utføres ved følgende metode.

Først fremstilles en serie av prøver av den biologiske væske, hver inneholdende en kjent konsentrasjon av lactamantibiotikumet.

Denne serie vil inneholde i tillegg til et visst antall prøver inneholdende økede antibiotikakonsentrasjoner, to prøver av biologisk væske fri for antibiotikum.

Deretter behandles alle disse prøver på en nøyaktig identisk måte, ved å følge trinn (1), (2) og (3) i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. For en av de antibiotikum-frie prøver erstattes imidlertid enzymløsningen anvendt i trinn (1), med et identisk volum av vann. I dette bestemte tilfelle inneholder derfor løsningen erholdt ved slutten av trinn (3), alle reagensene bortsett fra enzym R39. På grunn av fravær av enzymet, vil ikke noe 2-mercaptoalkansyre derfor bli dannet i trinn (2), og følgelig vil det kromogene reagens, dvs. for eksempel 5,51-dithiobis(2-nitrobenzoe)syren ikke gi noen .farge. Dette eksempel vil heretter bli kalt "blindprøve".

I motsetning vil den andre antibiotikum-frie prøve gi en uttalt gul-fargning. Da prøven ikke inneholder antibiotikum, vil enzym R39 ikke bli inaktivert i trinn (1);

og en maksimal mengde av 2-mercaptoalkansyre av formel II vil dannes (svarende til den totale aktivitet av det anvendte enzym R39) og følgelig vil det bli en maksimal mengde av 5-mercapto-2-nitrobenzoesyre, resulterende i en uttalt gul-fargning. Denne prøve vil heretter bli kalt "kontrollprøven".

Det skal også forståes at når prøvene inneholder en molar mengde av antibiotika som er mindre enn den molare mengde av enzym R39 som anvendes, vil bare en fraksjon av dette enzym bli inaktivert av antibiotikumet i trinn (1); og i disse tilfeller vil mengden av 2-mercaptoalkansyre av formel II som dannes, tilsvare restaktiviteten av enzymfraksjonen som ikke er blitt inaktivert av antibiotikumet, og følgelig vil det også være en tilsvarende mengde av 5-mercapto-2-nitrobenzoesyre. I disse tilfeller vil en gulfargning også bli fremkalt, men dens intensitet vil være mindre enn den som observeres med kontrollprøven.

Når sluttelig prøvene inneholder en molar mengde av antibiotikum lik eller større enn den molare mengde av enzym R39 som anvendes, vil enzymet bli fullstendig inaktivert av antibiotikumet under trinn (1); ikke noe 2-mercaptoalkansyre av formel (2) vil bli dannet, og følgelig vil det kromogene reagens forbli uforandret. I disse tilfeller vil en fargning identisk med den som observeres med blindprøven, bli erholdt.

For å oppnå en nøyaktig bestemmelse måles denne optiske densitet av fargningene erholdt respektivt med alle prøvene, innbefattende blindprøven og kontrollprøven, med et spektrofotometer. Da en viss optisk densitetsverdi også finnes for blindprøven, er det nødvendig å subtrahere denne verdi fra den som finnes for kontrollprøven og for de andre prøver.

Fra de resulterende optiske densitetsverdier beregnes den prosentvise restaktivitet (av enzym R39) for hver prøve. Denne prosent er lik forholdet, multiplisert med 100, av den optiske densitetsverdi funnet for en gitt prøve med den optiske densitetsverdi funnet for kontrollprøven.

En kurve kan deretter nedtegnes som viser konsen-trasjonene av antibiotikum på abscissen og den prosentvise restaktivitet av enzym R39 på ordinaten.

En rett linje erholdes som gjennnomskjærer respektivt ordinaten ved et punkt svarende til kontrollprøven (100 % rest-enzymatisk aktivitet) og abscissen ved et punkt svarende til prøven inneholdende en mengde av antibiotikum lik den molare mengde av enzym R39 som anvendes (0 % rest-enzymatisk aktivitet).

Den resulterende kurve utgjør en "standardkurve"

for bestemmelse av en ukjent konsentrasjon av Ø-lactam-antibiotikum i en prøve av den biologiske væske anvendt for å fremstille kurven. For dette formål behandles prøvene igjen på en identisk måte, ved å følge trinn (1), (2) og (3) ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen; den optiske densitet av den erholdte farging måles med spektrofotometer, den optiske densitetsverdi sem finnes for blindprøven, subtraheres derfra, den prosentvise rests enzymatiske aktivitet beregnes på den ovenfor angitte type og antibiotikakonsentrasjonen i prøven erholdes ved referanse til standardkurven.

Det er således mulig kvantitativt å bestemme antibiotikumkonsentasjoner så lave som 0,002 IU/ml i en biologisk væske i løpet av 15 minutter.

I enkelte tilfeller krever imidlertid fremgangsmåten at den biologiske væske klares slik at et spektrofotometer kan anvendes. Prinsipielt må dette utføres i et laboratorium. Hvis det er ønsket bare å bestemme hvorvidt eller ikke konsentrasjonen av antibiotikum overskrider en viss terskel (for eksempel i melk en maksimal konsentrasjon bestemt av standarder), er det imidlertid ikke nødvendig å anvende et spektrofotometer.

Denne metode krever imidlertid en viss forhånds-kunnskap.

Som vist ovenfor, skjærer standardkurven abscissen

ved et punkt svarende til en prøve inneholdende en mengde av antibiotikum lik den molare mengde av enzym R39 som anvendes. Ved denne kritiske antibiotikumkonsentrasjon er den prosentvise rests enzymatiske aktivitet null, da en hvit fargning identisk med den av blindprøven erholdes ved slutten av trinn (3) ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Over denne kritiske konsentrasjon er fargningen også identisk med den av blindprøven, da den prosentvise rests enzymatiske aktivitet fremdeles er null. Under denne kritiske konsentrasjon erholdes derimot gulfargning fordi det fremdeles er en viss prosent rest-enzymatisk aktivitet.

Det er derfor mulig enkelt på basis av fargningen observert ved sluttrinn (3) i fremgangsmåten, å bestemme direkte hvorvidt eller ikke antibiotikakonsentrasjonen i en prøve overskrider den angitte kritiske konsentrasjon.

Derfor er det tilstrekkelig å kjenne angitte kritiske konsentrasjon på forhånd for å være i stand til å bestemme hurtig, uten anvendelse av spektrofotometer, hvorvidt en prøve inneholder en konsentrasjon av |3-lactamantibiotikum som (eller som ikke) overskrider denne kritiske konsentrasjon. For dette formål behandles denne prøve på en identisk måte ved å følge trinn (1), (2) og (3) ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, etterfulgt enkelt ved observasjon av den erholdte fargning; hvis fargningen svarer til den av blindprøven, vil konsentrasjonen av antibiotikum være minst lik den kritiske konsentrasjon. Hvis derimot fargningen er null, vil konsentrasjonen av antibiotikum være under den kritiske konsentrasjon.

Det er således mulig, visuelt og med sikkerhet, å bestemme hvorvidt prøver inneholder mer eller mindre enn 0,00 4 IU antibiotikum pr. ml biologisk væske, og gjøre dette innen 15 minutter.

Ennvidere vil det være mulig ved anvendelse av et fargekart som viser variasjonen i intensitet av den resulterende gulfargning som en funksjon av antibiotikumkonsentrasjonen, å semi-kvantitativt bestemme mellomliggende konsentrasjoner mellom 0,1 IU/ml og den kritiske konsentrasjon. Eksempelvis i en anvendelse hvor den kritiske konsentrasjon er 0,004 IU/ml, vil det være mulig, i det minste uten spesielle vanskeligheter, å bestemme en konsentrasjon på 0,002 IU/ml.

Denne prosess, med eller uten et fargekart, er derfor perfekt egnet for undersøkelse av en serie av melkeprøver, til og med utenfor laboratoriet, for eksempel på gården av utrenet personell.

Metoden ifølge den foreliggende oppfinnelse for kvantitativ og kvalitativ bestemmelse av antibiotikumkonsentrasjonen er nå blitt forklart i detalj med henvisning til i særdeleshet fargeforandringen fremkalt av 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoe),syre. Fagmannen vil imidlertid lett forstå at hvis kromogene reagenser anvendes ved denne prosess, vil bare den observerte farge være forskjellig.

Et ytterligere mål ved foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe et testsett som kan anvendes for utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, dvs. som kan anvendes ved bestemmelse av et p-lactamantibiotikum i en biologisk væske/ kjennetegnet ved at angitte test omfatter: (1) en bestemt mengde av løselig D-alanyl-D-alanin-carboxypeptidase produsert av Actinomadura R39 (enzym R39); (2) en bestemt mengde av et substrat som er en thioester av den generelle formelhvoriRbetegner et benzoyl-, fenylacetyl- eller Naacetyl-L-lysylradikal,betegner et glycyl- eller D-alanylradikal, ogRg er et hydrogenatom eller et methylradikal, (3) en bestemt mengde av en D-aminosyre eller glycin, (4) et reagens som muliggjør bestemmelse av 2-mercaptoalkansyre med formelenhvori Rhar den ovenfor angitte betydning, og (5) hvis hensiktsmessig, en standard med hvilken resultatene av testene utført med reagens (1), (2), (3) og (4) kan sammenlignes.

I henhold til en foretrukket utførelsesform er substratet [(N-benzoyl-D-alanyl)thio]-eddiksyre, D-aminosyren er D-alanin og reagens (4) er 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoe)syre.

I henhold til en særlig foretrukket utførelsesform er substratet og reagenset som muliggjør bestemmelse av 2-mercaptoalkansyre, kombinert i form av en tablett i forbindelse med vanlig anvendte, egnede tabletteringseksipienter. Som standard kan en standardkurve av antibiotikum-konsentras jonen mot den prosentvise restaktivitet av enzym R39 være innbefattet i testsettet om hensiktsmessig.

Det er således mulig å utføre kvantitative bestemmelser som ovenfor forklart. Denne kurve er imidlertid ikke essensiell. Hvis testsettet bare skal anvendes for å bestemme hvorvidt konsentrasjonen av antibiotikum overskrider eller ikke en bestemt kritisk verdi, er det tilstrekkelig å indikere, i bruksanvisningen, konsentrasjonen av antibiotikum ved hvilken en forandring i farge observeres etter at prøven er behandlet ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

De etterfølgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

Dette eksempel viser at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjør det mulig å foreta jneget hurtig bestemmelse av lave konsentrasjoner av penicillin G i melk.

En serie på 5.0 ji 1 melkeprøver ble fremstilt inneholdende kjente konsentrasjoner av penicillin G, og to 50 ul's melkeprøver fri for penicillin G (blindprøve og kontroll).

1,5 picomol av enzym R39, oppløst i 10 \ il 0,5 M Hepes-buffer (pH = 8,0) inneholdende 0,5 M NaCl og 0,25 M MgCl2, og 20 ul av en vandig løsning inneholdende 50 mg/ml D-alanin, ble tilsatt til hver prøve (kontrollprøve + prøver inneholdende penicillin G). I blindprøven ble enzym R39 oppløst i Hepes-buffer erstattet med 10 ul 0,5 M Hepes-buffer (pH = 8,0) inneholdende 0,5 M NaCl og 0,25 M MgCl2(Hepes = 4-hydroxy-ethyl-l-piperazinethansulfonsyre). Blandingen ble inkubert ved 47° C i 4 minutter.

Deretter ble 5 ul av en vandig løsning inneholdende 5 mg/ml [(N-benzoyl-D-alanyl)thio]-eddiksyre og 10 ul av en fosfatbufferløsning (pH = 8,0; KH2P04+ K2HP04) inneholdende 2 mg/ml 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoe)syre, tilsatt, og blandingen ble inkubert ved 4 7° C i 1 minutt.

De erholdte farger i de forskjellige prøver ble deretter observert.

Resultatene erholdt er reprodusert i Tabell I.

Som Tabell I viser, erholdes ved en penicillin G-konsentrasjon lik eller over 0,016 IU/ml, en hvit farge, lik den som er erholdes for en blindprøve, mens under denne konsentrasjon dannes en gulfargning som øker i intensitet etter-som penicillin G-konsentrasjonen avtar, for å nå en meget intens gulfarging svarende til en null-konsentrasjon av penicillin G (kontrollprøve).

Det fremgår klart at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjør det mulig å bestemme visuelt hvorvidt en melkeprøve inneholder en penicillin G-konsentrasjon på 0,016 IU/ml eller mere i løpet av 5 minutter. Dette gjør fremgangsmåten særlig attraktiv for hurtig screening av melk ved meieriet eller på gården.

Eksempel 2

Dette eksempel viser at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er meget følsom.

Prosessen er eksakt den samme som i eksempel 1, bortsett fra: 0,4 picomol av enzym R39 (i stedet for 1,5 picomol) ble

tilsatt til prøvene;

den første inkubering varer i 10 minutter (i stedet for 4

minutter), og

den andre inkubering varer i 5 minutter (i stedet for 1

minutt).

De erholdte resultater er angitt i Tabell II.

Denne tabell viser at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan anvendes for visuell påvisning av konsentrasjoner av penicillin G som er minst lik 0,004 IU pr. ml melk i løpet av 15 minutter. Ennvidere er det også mulig ved referanse til et fargekart, å påvise til og med lavere konsentrasjoner slik som 0,002 IU/ml. Denne fremgangsmåte gjør det derfor mulig å bestemme hvorvidt melk inneholder en antibiotikumkonsentrasjon som overskrider (eller ikke) de fastsatte standarder, selv i land hvor disse standarder er relativt strenge.

Eksempel 3

Dette eksempel viser at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å måle antibiotikumkonsentrasjoner i store prøvevolumer.

Fremgangsmåten er den samme som i eksempel 1, bortsett fra at: prøvene inneholder 3 ml melk (i stedet for 50 ul); 24 picomol (i stedet for 1,5 picomol) av enzym R39 oppløst i 150 ul 0,5 M Hepes-buffer (pH = 8,0) og 600 ul av en vandig løsning inneholdende 100 mg/ml D-alanin, ble tilsatt til hver prøve;

den første inkubering varte i 10 minutter (i stedet for 4

minutter);

120 ul (i stedet for 5 uD av den vandige løsning av [(N-benzoyl-D-alanyl)thio]-eddiksyre og 120 ul av en fosfat-bufferløsning (pH = 8,0) inneholdende 5 mg/ml 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoe) syre ble deretter tilsatt, og

den andre inkubasjon varte i 5 minutter (i stedet for 1 minutt).

De erholdte resultater er angitt i Tabell III.

Denne tabell viser at fremgangsmåten ifølge oppfin-enlsen kan anvendes for visuell påvisning av nærvær av 0,004 IU penicillin G pr. ml melk i store prøvevolumer (3 ml) i løpet av 15 minutter. Den kan derfor utføres meget enkelt av ikke-spesialiserte personer.

De samme resultater erholdes når fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes for å måle konsentrasjoner av penicillin G i prøvevolumer med 1 ml melk.

Eksempel 4

Dette eksempel viser at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan anvendes med substrater forskjellig fra [(N-benzoyl-D-alanyl) thio]eddiksyre.

Fremgangsmåten er den samme som i eksempel 3 bortsett fra, etter den første inkubasjon, at 120 ul vandig løs-ning inneholdende 5 mg/ml [(N-fenylacetyl-D-alanyl)thio]-eddik-syre ble tilsatt.

De erholdte resultater er angitt i Tabell IV.

Denne- tabell viser at fremgangsmåten ifølge oppfin-nlsen kan utføres med hell under anvendelse av [(N-fenylacetyl-D-alanyl)thio]eddiksyre som et substrat.

Eksempel 5

Dette eksempel viser at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan utføres under anvendelse av forskjellige D-aminosyrer eller glycin som aktivatorer for hydrolysen av substratet med enzymet.

Fremangsmåten er den samme som i eksempel 3, bortsett fra at den vandige løsning inneholdende 100 mg/ml D-alanin (test I) ble erstattet med en vandig løsning inneholdende

100 mg/ml D-fenylalanin (test II), av D-serin (test III) , av D-histidin (test IV), av D-methionin (test V), av D-2-aminosmør-syre (test VI) , eller ved en vandig løsning inneholdende 200 mg/ ml glycin (test VII) .

De erholdte resultater er angitt i Tabell V.

Denne tabell viser at generelt er D-aminosyre eller glycin egnet for utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Eksempel 6

Dette eksempel illustrerer anvendelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for bestemmelse av cefapirin, et antibiotikum av cefalosporingruppen, i melk.

Fremgangsmåten er den; samme som i eksempel 3, men prøvene på 3 ml melk inneholdt kjente konsentrasjoner av cef apirin;.

De erholdte resultater er angitt i Tabell VI.

Denne tabell viser at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan anvendes for visuell påvisning av nærvær av 0,004 ug/ml cefapirin i melk i løpet av 15 minutter.

Eksempel 7

Dette eksempel illustrerer anvendelsen av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for bestemmelse av lave konsentrasjoner av penicillin G i serum.

Prosedyren ifølge eksempel 3 ble fulgt, men de 3 ml<1>s melkeprøver ble erstattet med 3 ml's serumprøver inneholdende kjente konsentrasjoner av penicillin G.

Etter den andre inkubasjonsperiode som varte i 5 minutter, ble prøvene videre sentrifugert og supernatantene ble fortynnet 10 ganger med vann.

Den optiske densitet ble deretter målt med et spektrofotometer ved 410 nm.

De erholdte resultater er angitt i Tabell VII.

Verdiene for den optiske densitet nevnt i Tabell VII, ble erholdt ved subtrahering av den optiske densitetsverdi funnet for blindprøven fra de optiske densitetsverdier funnet respektivt for kontrollprøven og for de andre prøver.

Denne tabell viser at det er mulig, ved anvendelse av et spektrofotometer, å bestemme kvantitativt meget lave konsentrasjoner av penicillin G (så lave som 0,002 IU/ml) i en prøve av serum.

Eksempel 8

I dette eksempel ble substratet og reagenset som muliggjør bestemmelse av 2-mercaptoalkansyre, kombinert i form av en tablett.

Fremgangsmåten er den samme som i eksempel 3. Etter den første inkubering i 10 minutter ble imidlertid en tablett tilsatt som inneholder 600 ug [(N-benzoyl-D-alanyl)thio]-eddik-syre og 600 ug 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoe)syre.

Denne tablett har følgende totale sammensetning (i vekt%): substrat + reagens : 4 % polyethylenglykol 6000 : 3 % Avicel: 27 % stivelseio % laktose : 55 % Aerosil: 0,5 % magnesiumstearat : 0,5 % mikrokrystallinsk cellulose kolloidalt silika

De erholdte resultater er angitt i Tabell VIII.

Denne tabell viser at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan anvendes når substratet og reagenset som muliggjør bestemmelse av 2-mercaptoalkansyre, kombineres i form av en

tablett, og dette medfører den klare fordel både på det prak-tiske plan og når det gjelder stabiliteten av reagensene.

Claims (16)

1. Enzymatisk prosess for bestemmelse av et (3-lactam-antibiotikum i en biologisk væske,karakterisert vedat den omfatter trinnene (1) inkubering av den biologiske væske med oppløselig D-alanyl-D-alanin-carboxypeptidase produsert av Actinomadura R39, hvilken inkubasjon utføres under betingelser som muliggjør at |3-lactamantibiotikumet, hvis dette er til stede i den angitte væske, får reagere med enzymet under dannelse av et inaktivt og hovedsakelig irreversibelt, ekvimolekylært enzym-antibiotikumkompleks; (2) inkubering av blandingen erholdt ved slutten av trinn (1), med en substratløsning under betingelser som muligggjør at substratet blir hydrolysert av enzymet, hvilket substrat er en thioester av generell'formel

hvori R^betegner et benzoyl-, fenylacetyl- eller R -acetyl-L-lysyl-radikal R2betegner et glycyl- eller D-alanyl-radikal, og R^er et hydrogenatom eller et methylradikal, som danner ved hydrolyse en 2-mercaptoalkansyre av formelen

hvori R^har den ovenfor angitte betydning, i en mengde proporsjonal med den rest-enzymatiske aktivitet, hvilken inkubering ytterligere utføres i nærvær av en D-aminosyre eller av glycin, som aktiverer hydrolysen av substratet med enzymet; (3) påvisning av mengden av 2-mercaptoalkansyre av formel II dannet i trinn (2); og (4) sammenligning av verdien bestemt i trinn (3) med en standard under dannelse av konsentrasjonen av antibiotikum i den biologiske væske.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat substratet er [(N-benzoyl-D-alanyl) thio]-eddiksyre.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat D-aminosyren er valgt fra gruppen bestående av D-alanin, D-methionin, D-arginin, D-fenylalanin, D-serin, D-histidin, D-valin, D-tryptofan og D-2-amino-smørsyre.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisert vedat D-aminosyren er D-alanin.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat (2) og (3) utføres samtidig.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den biologiske væske er valgt fra gruppen bestående av melk, serum, urin, spytt, kjøtt-ekstrakt, fermenteringsvæsker og bufrede,. vandige løsninger.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat det antibiotikum som skal bestemmes, er valgt fra gruppen bestående av benzylpenicillin, ampicillin, fenoxymethylpenicillin, carbenicillin, methicillin, oxacillin, cloxacillin,"cefalosporin C, cefaloglycin, cefalothin, cefalexin og cefapirin.

"8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat mengden-av 2-mercaptoalkansyre av formel II bestemmes ved inkubering av blandingen erholdt i trinn (2) med 5,5<1->dithiobis(2-nitrobenzoe)syre for å fremkalle i en fargning hvis intensitet er en funksjon av mengden av 2- mercaptoalkansyre.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat angitte standard er en standardkurve av antibiotikumkonsentrasjonen mot prosentvis i rest-enzymatisk aktivitet.

10. Testsett for bestemmelse av et [3-lactam-antibiotikum i biologisk væske, karakterisert vedat angitte test omfatter: (1) en bestemt mengde av løselig D-alanyl-D-alanin-carboxypeptidase produsert av Actinomadura R39; (2) en bestemt mengde av et substrat som er en thioester av generell formel

hvori R-, betegner et benzoyl-, fenylacetyl- eller Na-acetyl-L- lysyl-radikal, R2betegner et glycyl- eller D-alanylradikal, og R^ er et hydrogenatom eller et methylradikal, (3) en bestemt mengde av en D-aminosyre eller av glycin, (4) et reagens som muliggjør bestemmelse av en 2-mercaptoalkansyre av formelen

hvori R^har den ovenfor angitte betydning, og (5) om hensiktsmessig, en standard med hvilken resultatene av testen utført med reagensene (1) , (2) , (3) og (4), kan sammenlignes.

11. Testsett ifølge krav 10,karakterisert vedat substratet er [(N-benzoyl-D-alanyl )thio]-eddiksyre.

12. Testsett ifølge krav 10,karakterisert vedat D-aminosyren er valgt fra gruppen bestående av D-alanin, D-methionin, D-arginin, D-fenylalanin, D-serin, D-histidin, D-valin, D-tryptofan og D-2-aminosmørsyre.

13. Testsett ifølge krav 12,karakterisert vedat D-aminosyren er D-alanin.

14. Testsett ifølge krav 10,karakterisert vedat reages (4) er 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoe)syre.

15. Testsett ifølge krav 10,karakterisert vedat angitte standard er en standardkurve av antibiotikumkonsentrasjonen mot prosentvis rest-enzymatisk aktivitet.

16. Testsett ifølge krav 10,karakterisert vedat substrat og reagens (4) er kombinert i form av en tablett.