CZ280282B6 - Enzymatický způsob stanovení antibiotik s beta-laktamovým jádrem - Google Patents
Enzymatický způsob stanovení antibiotik s beta-laktamovým jádrem Download PDFInfo
- Publication number
- CZ280282B6 CZ280282B6 CS911246A CS124691A CZ280282B6 CZ 280282 B6 CZ280282 B6 CZ 280282B6 CS 911246 A CS911246 A CS 911246A CS 124691 A CS124691 A CS 124691A CZ 280282 B6 CZ280282 B6 CZ 280282B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- antibiotic
- enzyme
- biological fluid
- substrate
- acid
- Prior art date
Links
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 title claims abstract description 57
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 title claims abstract description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 106
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims description 19
- 125000003460 beta-lactamyl group Chemical group 0.000 title claims description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims abstract description 85
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 81
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims abstract description 76
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 57
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 32
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 26
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims abstract description 25
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 claims abstract description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 241000187362 Actinomadura Species 0.000 claims abstract description 10
- 102000030899 Serine-Type D-Ala-D-Ala Carboxypeptidase Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108010004832 Serine-Type D-Ala-D-Ala Carboxypeptidase Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 66
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 53
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 53
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 53
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 34
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 claims description 31
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 28
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 26
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 23
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- -1 phenylacetyl Chemical group 0.000 claims description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 13
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 claims description 13
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 10
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 10
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 10
- OEJDVGZWJKPUDA-MRVPVSSYSA-N 2-[(2r)-2-benzamidopropanoyl]sulfanylacetic acid Chemical group OC(=O)CSC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C1=CC=CC=C1 OEJDVGZWJKPUDA-MRVPVSSYSA-N 0.000 claims description 9
- HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N D-histidine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N 0.000 claims description 7
- 229930195721 D-histidine Natural products 0.000 claims description 7
- FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N D-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N 0.000 claims description 7
- 229930182818 D-methionine Natural products 0.000 claims description 7
- COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N D-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N 0.000 claims description 7
- 229930182832 D-phenylalanine Natural products 0.000 claims description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N D-Serine Chemical compound OC[C@@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 claims description 6
- 229930028154 D-arginine Natural products 0.000 claims description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-SCSAIBSYSA-N D-valine Chemical compound CC(C)[C@@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-SCSAIBSYSA-N 0.000 claims description 6
- XIURVHNZVLADCM-IUODEOHRSA-N cefalotin Chemical compound N([C@H]1[C@@H]2N(C1=O)C(=C(CS2)COC(=O)C)C(O)=O)C(=O)CC1=CC=CS1 XIURVHNZVLADCM-IUODEOHRSA-N 0.000 claims description 6
- 229960000603 cefalotin Drugs 0.000 claims description 6
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N cephalosporin C Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N 0.000 claims description 6
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 6
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 6
- 229930195711 D-Serine Natural products 0.000 claims description 5
- QWCKQJZIFLGMSD-GSVOUGTGSA-N D-alpha-aminobutyric acid Chemical compound CC[C@@H](N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-GSVOUGTGSA-N 0.000 claims description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N D-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N 0.000 claims description 5
- 229930182831 D-valine Natural products 0.000 claims description 5
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 5
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 5
- WCYWZMWISLQXQU-UHFFFAOYSA-N methyl Chemical compound [CH3] WCYWZMWISLQXQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 5
- 229930182827 D-tryptophan Natural products 0.000 claims description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 4
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- LEVJVKGPFAQPOI-UHFFFAOYSA-N phenylmethanone Chemical compound O=[C]C1=CC=CC=C1 LEVJVKGPFAQPOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 claims description 3
- 229930195708 Penicillin V Natural products 0.000 claims description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 3
- FUBBGQLTSCSAON-PBFPGSCMSA-N cefaloglycin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)COC(=O)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 FUBBGQLTSCSAON-PBFPGSCMSA-N 0.000 claims description 3
- 229950004030 cefaloglycin Drugs 0.000 claims description 3
- 229940106164 cephalexin Drugs 0.000 claims description 3
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 claims description 3
- 229960003326 cloxacillin Drugs 0.000 claims description 3
- LQOLIRLGBULYKD-JKIFEVAISA-N cloxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=CC=CC=C1Cl LQOLIRLGBULYKD-JKIFEVAISA-N 0.000 claims description 3
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 claims description 3
- 229960001019 oxacillin Drugs 0.000 claims description 3
- UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N oxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=CC=CC=C1 UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N 0.000 claims description 3
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940056367 penicillin v Drugs 0.000 claims description 3
- BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N phenoxymethylpenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)COC1=CC=CC=C1 BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 3
- SLAMLWHELXOEJZ-UHFFFAOYSA-N 2-nitrobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O SLAMLWHELXOEJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 claims description 2
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 claims 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 69
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 55
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 24
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 19
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 14
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 11
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 9
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 8
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- UQLLWWBDSUHNEB-CZUORRHYSA-N Cefaprin Chemical compound N([C@H]1[C@@H]2N(C1=O)C(=C(CS2)COC(=O)C)C(O)=O)C(=O)CSC1=CC=NC=C1 UQLLWWBDSUHNEB-CZUORRHYSA-N 0.000 description 5
- 229960004350 cefapirin Drugs 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 5
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 5
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 4
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 4
- VFUPLKGPCOIXET-SECBINFHSA-N 2-[(2r)-2-[(2-phenylacetyl)amino]propanoyl]sulfanylacetic acid Chemical compound OC(=O)CSC(=O)[C@@H](C)NC(=O)CC1=CC=CC=C1 VFUPLKGPCOIXET-SECBINFHSA-N 0.000 description 3
- GANZODCWZFAEGN-UHFFFAOYSA-N 5-mercapto-2-nitro-benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(S)=CC=C1[N+]([O-])=O GANZODCWZFAEGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 3
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N flavin adenine dinucleotide Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]([C@H](O)[C@@H]1O)O[C@@H]1CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C2=NC(=O)NC(=O)C2=NC2=C1C=C(C)C(C)=C2 VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N 0.000 description 3
- 235000019162 flavin adenine dinucleotide Nutrition 0.000 description 3
- 239000011714 flavin adenine dinucleotide Substances 0.000 description 3
- 229940093632 flavin-adenine dinucleotide Drugs 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- ZTKQHJHANLVEBM-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoic acid Chemical compound C1=2C=C(C)C(NCC)=CC=2OC2=CC(=NCC)C(C)=CC2=C1C1=CC=CC=C1C(O)=O ZTKQHJHANLVEBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dimethoxybenzidine Chemical compound C1=C(N)C(OC)=CC(C=2C=C(OC)C(N)=CC=2)=C1 JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 2
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 2
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZLLFKMLNHKUVOF-UHFFFAOYSA-N 2-(2-benzamidoacetyl)sulfanylacetic acid Chemical compound OC(=O)CSC(=O)CNC(=O)C1=CC=CC=C1 ZLLFKMLNHKUVOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZWNWWNCNMZXLEN-VEDVMXKPSA-N 2-[(2r)-2-benzamidopropanoyl]sulfanylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)SC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C1=CC=CC=C1 ZWNWWNCNMZXLEN-VEDVMXKPSA-N 0.000 description 1
- PZTWBYCZTVLVPV-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCCC1CNCCN1CCS(O)(=O)=O PZTWBYCZTVLVPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MERLDGDYUMSLAY-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-aminophenyl)disulfanyl]aniline Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1SSC1=CC=C(N)C=C1 MERLDGDYUMSLAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002012 Aerosil® Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 125000000030 D-alanine group Chemical group [H]N([H])[C@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 1
- DEFJQIDDEAULHB-QWWZWVQMSA-N D-alanyl-D-alanine Chemical compound C[C@@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C)C([O-])=O DEFJQIDDEAULHB-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- DEFJQIDDEAULHB-UHFFFAOYSA-N N-D-alanyl-D-alanine Natural products CC(N)C(=O)NC(C)C(O)=O DEFJQIDDEAULHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 102000005488 Thioesterase Human genes 0.000 description 1
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 108010056243 alanylalanine Proteins 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 150000003935 benzaldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000012916 chromogenic reagent Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000008119 colloidal silica Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 239000007859 condensation product Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229940021746 d- serine Drugs 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 239000012442 inert solvent Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 208000004396 mastitis Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229940088644 n,n-dimethylacrylamide Drugs 0.000 description 1
- YLGYACDQVQQZSW-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylprop-2-enamide Chemical compound CN(C)C(=O)C=C YLGYACDQVQQZSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001937 non-anti-biotic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229940093429 polyethylene glycol 6000 Drugs 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000007420 radioactive assay Methods 0.000 description 1
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 108020002982 thioesterase Proteins 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/825—Actinomadura
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
Abstract
Řešení se týká enzymatického způsobu stanovení antibiotik s betalaktamovým jádrem v biologické tekutině zahrnující 1/ inkubaci uvedené biologické tekutiny s rozpustnou D-alanyl-D-alanin-karboxypeptidázou produkovanou mikroorganismem Actinomadura R39, přičemž se tato inkubace provádí za podmínek umožňujících reakci antibiotika s beta-laktamovým kruhem, případně přítomného v uvedené biologické tekutině, s enzymem za vzniku inaktivního a v podstatě ireversibilního ekvimolekulárního komplexu enzym-antibiotikum, 2/ inkubaci směsi získané v prvním stupni s roztokem substrátu za podmínek umožňujících hydrolýzu uvedeného substrátu enzymem za vzniku sloučeniny, jejíž množství je úměrné zbytkové enzymatické účinnosti, 3/ stanovení množství sloučeniny vytvořené ve stupni 2 a 4/ srovnání hodnoty stanovené ve třetím stupni s etalonem za účelem zjištění koncentrace antibiotika v biologické tekutině. Podstata navrženého řešení spočívá v tom, že se inkubace ve druhém stupni provádí za použití substŕ
Description
Způsob enzymatického stanovení antibiotik s beta-laktamovým jádrem a souprava pro stanovení antibiotik
Oblast techniky
Vynález se týká nového způsobu enzymatického stanovení antibiotik s beta-laktamovým jádrem v biologické tekutině, který je rychlý a citlivý. Vynález se rovněž týká testovací soupravy, která je použitelná pro provádění způsobu podle vynálezu.
Dosavadní stav techniky
V současné době se antibiotika ve velmi široké míře používají nejenom jako terapeuticky účinné látky při léčení infekčních chorob, vyvolaných bakteriemi, ale také jako konzervační prostředky v potravinách a jako přísady v krmných směsích pro výživu zvířat, stimulující jejich růst. Čím dál tím víc se jeví potřebným detekovat přítomnost antibiotik, a zejména velmi nízkou koncentraci antibiotik, v komplexních biologických tekutinách, jakými jsou například mléko, moč, krev, sérum, sliny, masové extrakty nebo fermentační tekutiny, nebo ve vodných pufrovaných prostředích.
Výroba mléka je toho typickým příkladem. Je velmi dobře známo, že se k léčení některých infekčních chorob dobytka, produkujícího mléko, například při léčení mastitidy, používají peniciliny. Nicméně z evidentních lékařských důvodů musí být mléko, určené pro konzumaci lidmi, principiálně prosté i stop antibiotik. Ostatně koncentrace penicilinu 0,005 U.I./ml nebo méně mohou mít za následek určité problémy při výrobě produktů, odvozených z mléka, například při výrobě sýrů nebo jogurtu. Kromě toho nařizují zákonné normy některých zemí koncentrace antibiotik, nepřesahující hodnotu 0,004 U.I./ml.
Ukazuje se tedy nezbytným moci rychle a přesně stanovit koncentraci penicilinů v mléce, produkovaném dobytkem, a to s výhodou již přímo na farmě.
Již dlouho existují mikrobiologické postupy, které umožňují stanovit relativně nízké koncentrace antibiotik s beta-laktamovým jádrem v biologických tekutinách. Tyto postupy jsou založené na změření inhibice růstu mikroorganismů, citlivých na antibiotika, v přítomnosti vzorku testované biologické tekutiny. Nicméně tyto postupy vyžaduji mnoho času a relativně značné technické vybavení. V nej lepším případě se doba, potřebná k získání výsledků, pohybuje od asi 2 do 3 hodin, což je v praxi nepřijatelné.
V nedávné minulosti byl navržen rychlý mikrobiologický postup detekce přítomnosti antibiotik v biologické tekutině, zejména v mléce, který je popsán v americkém pat. spisu 4 239 852.
Podle této metody se vzorek biologické tekutiny, ve kterém má být stanovena případná přítomnost antibiotika, inkubuje jednak s buňkami nebo částmi buněk mikroorganismu, velmi citlivého na antibiotika, například mikroorganismu Bacillus stearothermophilus, a jednak s antibiotikem, značeným radioaktivním izotopem nebo enzymem. V průběhu uvedené inkubace soupeří antibiotikum,
-1CZ 280282 B6 případně obsažené ve vzorku, a značené antibiotikum při obsazování receptorových míst uvedených buněk nebo částí buněk. Potom se stanoví množství značeného antibiotika, fixovaného na uvedených buňkách nebo částech buněk; to pak ukáže na přítomnost (nebo nepřítomnost) antibiotika ve vzorku, přičemž platí, že množství fixovaného značeného antibiotika je nepřímo úměrné koncentraci antibiotika ve vzorku.
Podle autora tohoto patentu umožňuje tento způsob detekovat koncentrace antibiotika v mléce 0,01 U.I./ml, nebo dokonce 0,001 U.I./ml a to v době o málo kratší než 15 minut.
Hlavní nedostatek tohoto postupu však spočívá v tom, že k dosažení tohoto výsledku je nezbytné použít antibiotikum, značené radioaktivním izotopem (14C nebo 125J), které je nutné dávkovat pomocí speciálního dávkovacího zařízení, kterým je například scintilační počítač. Kromě toho manipulace s radioaktivním materiálem, i když jde pouze o velmi malé množství, vždy představuje pro personál, který stanovení provádí, určité riziko.
Je sice pravda, že v příkladu 2 provedení tohoto patentu je popsána varianta výše uvedeného radioaktivního stanovení, při které se používá antibiotikum, značené enzymem, a pří které se množství značeného antibiotika stanovuje vizuální colorimetrickou metodou, avšak tato varianta umožňuje pouze stanovit, zda je ve vzorku mléka přítomno více (nebo méně) než 0,05 U.I./ml penicilinu. Tato varianta je tedy výrazně méně citlivější a tudíž i mnohem méně zaj ímavá.
Komerčně jsou rovněž dostupné testy, založené na použití monoklonálních nebo polyklonálních protilátek. Ve skutečnosti je známé, že tyto testy mohou být provedeny za použití klasických imunologických diagnostických technik (ELISA, aglutinace v latexu, radioimunologická metoda, atd.). Jakožto příklad testů tohoto typu lze uvést SPOT-test, který je komerčně dostupný u firmy ANGENICS (US).
Nevýhody testů tohoto typu spočívají ve skutečnosti, že jsou obecně velmi složité a že umožňují detekovat pouze velmi omezený počet antibiotik. Vysoká specifičnost použitých protilátek umožňuje pouze ty členy skupiny antibiotik, které jsou specifické pro protilátky, použité k imunizaci. To je zejména choulostivý problém v případě skupiny beta-laktamů.
Rovněž je znám enzymatický způsob, umožňující stanovit nízké koncentrace antibiotik s beta-laktamovým jádrem v lidském séru a v mléce (J.-M. Frere a kol., Antimicrobial Agent and Chemotherapy, 18 (1980, č. 4), 506-510).
Tento způsob (dále nazývaný jako způsob J-M. Frere) je zajímavější, protože při jeho provádění není zapotřebí použití radioaktivních látek, vyžadujících relativné nákladné technické vybavení, a vzhledem ke skutečnosti, že jde o velmi rychlé a pozoruhodné přesné stanovení. Tento způsob je založen na použití specifického enzymu, kterým je v daném případě exocelulární rozpustná D-alanyl-D-alanin-karboxypeptidáza, která je produkována mikroorganismem Actinomadura R 39 (dříve Streptomyces R 39).
-2CZ 280282 B6
V následujícím popisu bude tento enzym označován jako enzym R39. Tento enzym má specifickou aktivitu hydrolyzovat koncové skupiny D-alanyl-D-alanin různých peptidů, což je provázeno uvolněním koncového D-alaninu.
Další důležitá charakteristika enzymu R39 spočívá v tom, že reaguje s antibiotiky s beta-laktamovým jádrem za velmi rychlého vzniku inaktivního a v podstatě ireverzibilního ekvimolekulárního komplexu enzym-antibiotikum.
Při způsobu J-M. Frere se využívá uvedených vlastností enzymu R 39 pro stanovení velmi nízkých koncentrací antibiotik s beta-laktamovým jádrem. Tento způsob má tři základní stupně.
V prvním stupni se stanovený objem vzorku tekutiny, ve kterém má být stanoven případný obsah antibiotika, inkubuje se stanoveným množstvím enzymu R39. Tato inkubace se provádí za podmínek, umožňujících reakci případně přítomného antibiotika ve vzorku s uvedeným enzymem za vzniku inaktivního a v podstatě ireverzibilního ekvimolekulárního komplexu enzym-antibiotikum.
Ve druhém stupni se společné s produktem, získaným v prvním stupni, inkubuje stanovené množství substrátu, kterým je například Nal^a, NePsllon-diacetyl-L-lysyl-D-alanyl-D-alanin, za podmínek, umožňujících hydrolýzu substrátu enzymem za vzniku takového množství D-alaninu, které odpovídá zbytkové aktivitě enzymu R39, který nebyl vázán do komplexu s antibiotikem v prvním stupni.
Ve třetím stupni se potom stanoví takto vytvořené množství D-alaninu. Je snadno pochopitelné, že množství D-alaninu, vytvořeného v uvedeném druhém stupni, závisí na zbytkové aktivitě uvedeného enzymu, přičemž toto množství je nepřímo úměrné množství antibiotika, přítomného v měřeném vzorku.
Při způsobu J-M.Frere se toto množství D-alaninu stanovuje enzymatickou metodou. Toto stanovení spočívá ve dvou sdružených enzymatických reakcích. Při první reakci se D-alanin oxiduje na kyselinu pyrohroznovou pomocí D-aminoacid-oxydázy (v přítomnosti jejího koenzymu, kterým je flavin-adenin-dinukleotid); současně se vytvoří odpovídající množství peroxidu vodíku ze vzdušného kyslíku. Při druhé reakci se takto vytvořený peroxid vodíku použije pro oxidaci o-dianisidinu pomocí peroxydázy. Vytvoří se hnědé zbarvení, jeho intenzita odpovídá množství D-alaninu.
To tedy umožňuje stanovit množství D-alaninu colorimetrickou metodou, a to bud vizuálně, nebo měřením optické hustoty spektrofotometrem (lambda max. = 460 nm).
Jestliže se připraví série vzorků známé koncentrace a jestliže se tyto vzorky použijí při výše uvedeném způsobu, potom je možné vynést kalibrační křivku, znázorňující závislost procentuální zbytkové enzymatické aktivity enzymu R39 na koncentraci antibiotika v testovaném vzorku.
Za účelem získáni kvantitativního údaje koncentrace antibiotika v měřeném vzorku se při stanovení této koncentrace v měřeném
-3CZ 280282 B6 vzorku postupuje přesně stejným způsobem a hledaná koncentrace se potom snadno odečte z uvedené kalibrační křivky.
Toto kvantitativní stanovení koncentrace antibiotika ve vzorku však jednoznačně vyžaduje použití spektrofotometru.
Nicméně při stanovení, při kterém se pouze jedná o zjištění, zda koncentrace antibiotika ve vzorku přesahuje či nikoliv určitou kritickou hodnotu, není nezbytné používat uvedený spektrofotometr nebo j iný obdobný měřicí přístroj.
V tomto případě stačí předběžné znát, při které kritické koncentraci antibiotika je aktivita enzymu R39 zcela potlačena, nebo jinak řečeno, při které koncentraci antibiotika se již netvoří D-alanin a tudíž již nedochází k uvedenému hnědému zbarvení. Jestliže tedy známe uvedenou kritickou koncentraci, potom je zřejmé, že je možné například pouhým vizuálním posouzením výsledku stanovení posoudit, zda daný vzorek obsahuje koncentraci antibiotika vyšší nebo nižší, než je uvedená kritická koncentrace. Je tedy zřejmé, že tímto způsobem lze i bez zvláštního přístrojového vybavení rychle a přesně stanovit, zda mléko obsahuje přípustnou nebo nepřípustnou koncentraci antibiotika.
Kromě toho tento způsob umožňuje stanovit relativné nízké koncentrace antibiotik s beta-laktamovým jádrem v mléce a v lidském séru. Tak například, jestliže se vychází ze vzorků mléka o objemu asi 20 μΐ a jestliže se tyto vzorky inkubují se 3 pikomoly enzymu R39, potom je možné stanovit kvantitativně (za použití spektrofotometru) koncentrace penicilinu v mléce, rovné až 0,02 U.I./ml; kvantitativné je rovněž možné stanovit za použití výše popsané vizuální metody koncentraci penicilinu v mléce, vyšší než 0,09 U.I./ml. Výsledky obou stanovení jsou k dispozici v době kratší než je jedna hodina.
Nicméně i uvedený způsob J-M.Frere má některé výrazné nedostatky.
Především citlivost způsobu J-M.Frere je zejména v případě stanovení antibiotik v biologických tekutinách (mléko, sliny, sérum a podobně) nedostatečná. Je sice pravda, že tuto citlivost je možné zvýšit bud snížením použitého množství enzymu R39, což má ale za následek prodloužení reakční doby jak v prvním, tak i ve druhém stupni uvedeného způsobu, nebo zvětšení objemu vzorku, který je třeba inkubovat uvedeným enzymem R39, přičemž v tomto případě je třeba prodloužit reakční dobu v prvním stupni uvedeného stanovení.
Bohužel však není možné zvyšovat citlivost způsobu J-M.Frere tímto způsobem zejména v případě komplexních tekutin biologického původu. Ve skutečnosti bylo konstatováno, že je nemožné provést vhodné stanovení v případě, že objem vzorku biologické tekutiny přestoupil určitý kritický objem, který je závislý na charakteru uvedené biologické tekutiny. V případě mléka a séra lze v případě, kdy objem vzorku, určený k inkubaci, překračuje objem ± 50 μΐ, pozorovat, že množství vytvořeného oxidovaného o-dianisidinu je silně sníženo.
-4CZ 280282 B6
Konečně v případě moče se nedetekuje žádná enzymatická aktivita a to dokonce ani v případě, kdy se použijí tak malé vzorky, jako 10 μΐ. Proto je tedy nemožné použít tento způsob pro stanovení antibiotik v moči.
Předpokládá se, že biologické tekutiny obsahují látky, které inhibují účinek enzymů, použitých při tomto způsobu stanovení. Prakticky to znamená, že použití velkých objemů vzorků jde v nejlepších případech na úkor zvýšení množství reagencií, které je při nejmenším úměrné zvětšenému objemu.
Proto takové zvětšování objemu vzorků nelze doporučit zejména vzhledem k tomu, že použité enzymy, zejména D-aminoacid-oxydáza a její kofaktor flavin-adeni-dinukleotid, jsou velmi drahé.
Komerčně dostupná je rovněž zlepšená verze způsobu J-M.Frere; tato verze má formu testu, nesoucího označení Penzym. Tento test je hlavně používán jako třídicí vstupní test pro mléko, které je přiváženo do mlékáren.
Tento test se provádí ve dvou stupních. V prvním stupni se 50 μΐ mléka inkubuje s 1,5 pikomolu enzymu R39 po dobu 5 minut při teplotě 47 °C. Ve druhém stupni se potom do inkubačního prostředí přidají všechny reakční složky, umožňující stanovit zbytkovou enzymatickou aktivitu, tj. v daném případě substrát Nal^a, Nepsilon-diacetyl-L-lysyl-D-alanyl-D-alanin , D _ no a c i d - o χγ dá z a, flavin-adenin-dinukleotid, peroxydáza a chromogenní reakční složka, načež se takto získaná směs potom inkubuje po dobu 15 minut při teplotě 47 eC. Po ukončení inkubace se zbarvení srovná s barevným vzorníkem, přičemž žluté zbarvení beze stop růžové znamená přítomnost antibiotik s beta-laktamovým jádrem v koncentraci vyšší, než 0,017 U.I./ml mléka. Naopak růžové zbarvení znamená bučí nepřítomnost antibiotik (intenzivní růžové zbarvení), nebo přítomnost antibiotik v koncentraci nejvýše rovné 0,017 U.I./ml, přičemž intenzita růžového zbarvení je nepřímo úměrná koncentraci antibiotika, přítomného ve vzorku mléka.
Díky tomuto testu je možné vizuálně stanovit koncentraci antibiotik v mléce tak nízkých hodnot, jako je koncentrace 0,017 U.I./ml, a to během 20 minut.
Nicméně ani tato optimalizovaná verze způsobu J-M.Frere nemá rychlost a citlivost, které by umožňovaly její použití bud v zemích, ve kterých zákonné normy povolují pouze extrémně nízké koncentrace antibiotik, například koncentrace 0,004 U.I./ml, nebo jako ultra-rychlé metody stanovení, která by producentům mléka umožňovala provést test mléka na stanovení přítomnosti antibiotik ještě na farmě v době kratší než 5 minut.
Zvýšení citlivosti a snížení času odezvy jsou spojeny s nedostatky, které již byly diskutovány v předcházející části popisu v souvislosti s popisem způsobu J-M.Frere. Kromě toho, tento test je prováděn s velmi malými objemy vzorků a vyžaduje tedy určitou zkušenost s mikrodávkovací technikou, neboť přesnost dávkování je zde zárukou přesných výsledků.
-5CZ 280282 B6
Za účelem vyvarování se všech těchto problémů, spojených s použitím kapalné formy enzymu, byl rovněž navržen způsob, při kterém je enzym R39 imobilizován na nosiči, nerozpustném v.e vodě, zejména na poly/N,N-dimetylakrylamidové/pryskyřici. Tento způsob je předmětem amerického patentu 4 546 076 a sestává ze tří následujících stupňů:
1/ enzym, imobilizovaný na nosiči, se inkubuje v přítomnosti biologické tekutiny;
2/ imobilizovaný enzym se potom oddělí od biologické tekutiny a promyje;
3/ stanoví se zbytková aktivita enzymu R39 kolorimetrickým stanovením D-alaninu, vytvořeného z peptidového substrátu pomocí reakčního systému, obsahujícího D-aminoacid-oxydázu a její kofaktor, peroxydázu a chromogenní reakční složku, přičemž se výsledek vizuálně odečítá pomocí spektrofotometru.
Tento způsob stanovení má několik výhod:
nedochází zde k žádné interferenci biologické tekutiny s enzymy, použitými pro stanovení D-alaninu, poněvadž biologická tekutina se odstraní již ve druhém stupni stanovení;
je možné dosáhnout znamenitých výsledků i při použití velkých objemů vzorků, například objemů, dosahujících až 5 ml; a
- dosahuje se zde značně vyšší citlivosti stanovení vzhledem k tomu, že tento způsob umožňuje vizuálně stanovit koncentrace penicilinu G až 0,002 U.I./ml mléka.
Nicméně i tento způsob má některé nevýhody:
jako u všech způsobů, které vyžadují separační stupeň, je dosahováno nižší reprodukovatelnosti výsledků než v případě způsobů, prováděných v homogenní fázi;
ať se použije jakékoliv separační metody, vždy to má nevyhnutelně za následek prodloužení doby, nezbytné ke stanovení, a zvýšení složitosti stanovení;
- i když tento způsob umožňuje dosáhnout vizuálním odečítáním výsledků vysoké citlivosti, dosahující až 0,002 U.I./ml penicilinu G, je čas nezbytný k získání tohoto výsledku ještě příliš dlouhý k tomu (alespoň 30 minut), aby mohl být tento způsob použit pro rychlé ohodnocení mléka při jeho sběru hned na farmě;
a navíc je cena tohoto stanovení, výrazně vyšší než cena testu, prováděného v homogenní fázi.
Výrazným technickým a hospodářským pokrokem by tedy bylo, kdyby byl k dispozici způsob stanovení antibiotik v biologických tekutinách, který by neměl nedostatky dosud známých stanovení antibiotik v biologických tekutinách, zejména nedostatky uvedeného způsobu J-M.Frere a způsobů, které jsou od tohoto způsobu
-6CZ 280282 B6 odvozeny, zejména způsobu stanovení Penzym a způsobu stanovení, který je popsán v americkém patentu 4 546 076. Jinými slovy, by bylo vhodné vyvinout způsob stanovení antibiotik v biologických tekutinách, který by měl souhrn výhodných vlastností, což znamená , že
- by bylo možné získat výsledek stanovení velmi rychle, například během 5 minut nebo v době ještě kratší;
by se dosahovalo vysoké citlivosti stanovení, což by umožnilo použití tohoto způsobu stanovení i v zemích, ve kterých zákonné normy nepřipouští koncentrace antibiotik, přesahující koncentraci 0,004 U.I./ml, nebo koncentraci ještě nižší;
- by bylo možné provádět stanovení s objemy vzorků 1 ml nebo s vyššími objemy, což by umožňovalo provádět toto stanovení nespecializovaným personálem;
- by byl způsob stanovení nenákladný a velmi jednoduchý.
Podstata vynálezu
Těchto cílů se dosáhne způsobem podle vynálezu, který se hlavně vyznačuje:
1/ použitím speciálního substrátu thioesterového typu pro enzym R39, který umožňuje to, že se hydrolýzou vytvoří sloučenina, obsahující volnou skupinu SH, která může být stanovena jednoduchou a nenákladnou kolorimetrickou metodou, aniž by bylo zapotřebí použit enzymy, jejichž účinek je rušen složkami biologické tekutiny;
a
2/ prováděním hydrolýzy substrátu enzymem v přítomnosti aminokyseliny konfigurace D nebo glycinu, které aktivují uvedenou hydrolýzu.
Předmětem vynálezu je enzymatický způsob stanovení antibiotik s betalaktamovým jádrem v biologické tekutině, zahrnující následující stupně:
1/ inkubaci uvedené biologické tekutiny s rozpustnou D-alanyl-D-alanin-karboxypeptidázou, produkovanou mikroorganismem Actinomadura R39, přičemž se tato inkubace provádí za podmínek, umožňujících reakci antibiotika s beta-laktamovým kruhem, případně přítomného v uvedené biologické tekutině, s enzymem za vzniku inaktivního a v podstatě ireverzibilního ekvimolekulárního komplexu enzym-antibiotikum;
2/ inkubaci směsi, získané v prvním stupni, s roztokem substrátu za podmínek, umožňujících hydrolýzu uvedeného substrátu enzymem za vzniku sloučeniny, jejíž množství je úměrné zbytkové enzymatické účinnosti;
3/ stanovení množství sloučeniny, vytvořené ve stupni 2 a
-7CZ 280282 B6
4/ srovnání hodnoty, stanovené ve třetím stupni, s etalonem za účelem zjištění koncentrace antibiotika v biologické tekutině, jehož podstata spočívá v tom, že se , inkubace ve druhém stupni provádí se substrátem, kterým je thioester obecného vzorce R1R2S“CH_COOH ve kterém
R-^ znamená benzoylový zbytek, fenylacetylový radikál nebo Nal^a-acetyl-L-lysylový radikál,
R2 znamená glycylový radikál nebo D-alanylový radikál a
R3 znamená atom vodíku nebo metylový radikál, tak, že hydrolýzou vznikne kyselina 2-merkaptoalkanová obecného vzorce
HS-CH-COOH ve kterém R3 má výše uvedený význam, přičemž se inkubace provádí v přítomnosti aminokyseliny, která aktivuje hydrolýzu substrátu enzymem, přičemž uvedená aminokyselina je zvolena ze skupiny, zahrnující aminokyseliny s konfigurací D a glycin.
Způsob podle vynálezu je výhodně charakterizován tím, že substrátem je kyselina [/N-benzoyl-D-alanyl/thio]octová.
Způsob podle vynálezu je výhodně charakterizován tím, že aminokyselina je zvolena ze skupiny, zahrnující D-alanin, D-methionin, D-arginin, D-fenylalanin, D-serin, D-histidin, D-valin, D-tryptofan a kyselina D-2-aminomáselná.
| Způsob | podle vynálezu | je výhodné | charakterizován | tím, | že |
| aminokyselinou je D-alanin. | |||||
| Způsob | podle vynálezu | je výhodné | charakterizován | tím, | že |
| stupně 2 a 3 | se provádí současné. | ||||
| Způsob | podle vynálezu | je výhodně | charakterizován | tím, | že |
zahrnující mléko, sérum, tekutiny a pufrované biologická tekutina se zvolí ze skupiny, moč, sliny, masové extrakty, fermentační vodné roztoky.
Způsob podle vynálezu je výhodně charakterizován tím, že antibiotikum, které má být stanoveno, se zvolí ze skupiny, zahrnující benzylpenicilin, ampicilin, fenoxymetylpenicilin, karbeni-8CZ 280282 B6 cilin, methicilin, oxacilin, cloxacilin, cefalosporin C, cefaloglycin, cefalothin, cefalexin a cefapirin.
Způsob podle vynálezu je výhodně charakterizován tím, že množství kyseliny 2-merkaptoalkanové obecného vzorce
HS-CH-COOH se stanoví inkubací směsi, získané ve stupni 2, s kyselinou 5,5’-dithiobis/2-nitrobenzoové/ za vzniku zbarvení, jehož intenzita je funkcí množství kyseliny 2-merkaptoalkanové.
Předmětem vynálezu je rovněž souprava pro stanovení antibiotik s beta-laktamovým jádrem v biologické tekutině, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje:
1/ stanovené množství rozpustné D-alanyl-D-alaninkarboxypeptidázy, produkované mikroorganismem Actinomadura R39;
2/ stanovené množství substrátu, kterým je thioester obecného vzorce r1“r2“s ch cooh ve kterém
R^ znamená benzoylový radikál, fenylacetylový radikál nebo Nalf a_acety-^_L_^ysy-£OVý Γ3<ϋ]ζ^1,
R2 znamená glycylový radikál nebo D-alanylový radikál a
R3 znamená atom vodíku nebo methylový radikál;
3/ stanovené množství aminokyseliny s konfigurací D nebo glycin;
4/ reakční složku, umožňující stanovit kyselinu 2-merkaptoalkanovou obecného vzorce
HS-CH-COOH ve kterém R3 má výše uvedený význam a
5/ případně etalon, se kterým mohou být srovnány výsledky testů, provedené se složkami 1, 2, 3 a 4.
-9CZ 280282 B6
Souprava podle vynálezu je výhodně charakterizována tím, že substrátem je kyselina [/N-benzoyl-D-alanyl/thio]octová.
Souprava podle vynálezu je výhodně charakterizována tím, že aminokyselina s konfigurací D je zvolena, ze skupiny, zahrnující D-alanin, D-methionin, D-arginin, D-fenylalanin, D-setin, D-histidin, D-valin, D-tryptofan a kyselinu D-2-aminomáselnou.
Souprava podle vynálezu je výhodně charakterizována tím, že aminokyselinou s konfigurací D je D-alanin.
Souprava podle vynálezu je výhodně charakterizována tím, že reakční složkou 4 je kyselina 5,5'-dithiobis/2-nitrobenzoová/.
Souprava podle vynálezu je výhodně charakterizována tím, že substrát a reakční složka 4 jsou·sdruženy ve formě tablety.
V průběhu výzkumných prací v této oblasti bylo nové zjištěno, že enzym R39 má specifickou aktivitu hydrolyzovat thioesterové vazby některých sloučenin, majících koncovou thioesterovou skupinu, a zejména specifickou aktivitu hydrolyzovat thioestery výše uvedeného obecného vzorce I. Tento objev je sám o sobě překvapivý, neboť podle současných znalostí nebyl dosud znám ani jeden příklad D-alanyl-D-alanin-karboxypeptidázy, fungující rovněž jako thioesteráza. Na zjištění této neočekávané vlastnosti enzymu R39 je založen nový zdokonalený enzymatický způsob stanovení antibiotik s beta-laktamovým kruhem v biologických tekutinách.
Na rozdíl od způsobu stanovení podle J-M.Frere-a a analogických výše popsaných stanovení se při způsobu podle vynálezu jako substrát pro enzym R39 používá thioester obecného vzorce I, ze kterého hydrolýzou vzniká kyselina 2-merkaptoalkanová výše uvedeného obecného vzorce II. Tento nový substrát přináší četné výhody jak z technologického, tak i ekonomického hlediska. Kyselina 2-merkaptoalkanová obecného vzorce II, vytvořená z uvedeného substrátu (a jejíž množství je úměrné zbytkové aktivitě enzymu R39), může být totiž stanovena jednoduchou kolorimetrickou metodou, která nevyžaduje enzymy jako D-aminoacid-oxydáza a její koenzym. Kromě výrazného snížení nákladů se rovněž dosáhne potlačení jednoho z hlavních nedostatků způsobu podle Frere-a tím, že zde již nedochází k žádné interferenci mezi složkami biologické tekutiny a činidly, používanými při kolorimetrickém stanovení, přičemž tato činidla jsou tvořena jednoduchými chemickými sloučeninami, prostými enzymů.
Způsobem podle vynálezu je tedy možné provést přímé stanovení antibiotik v samotné biologické tekutině; není tedy již nezbytné předběžné odstraňovat ze vzorků, určených pro stanovení, látky, které by mohly rušit kolorimetrické stanovení.
Dále vzhledem k tomu, že stanovené zbytkové aktivity již není ovlivňováno faktory, přítomnými v biologických tekutinách, je možné pracovat s objemy vzorků biologických tekutin až do ml. Způsob podle vynálezu tedy umožňuje provádět stanovení antibiotik za použití podstatné větších objemů vzorků, což činí vlastní stanovení snadnějším, přičemž toto stanovení může být
-10CZ 280282 B6 provedeno i personálem, který nebyl pro toto stanovení speciálně školen.
Navíc vzhledem k tomu, že je možné pracovat s většími objemy, má způsob stanovení podle vynálezu mnohem vyšší citlivost. Jak to bude ukázáno dále v příkladech provedení, umožňuje způsob podle vynálezu snadno vizuálně stanovit množství asi 0,004 U.I. penicilinu G v mililitru mléka během 15 minut; rovněž je možné srovnáním s barevnou škálou dosáhnout stanovení koncentrace antibiotika až 0,002 U.I./ml.
Kromě toho bylo s překvapením zjištěno, že přídavek aminokyseliny konfigurace D nebo glycinu má za následek výrazné zvýšení rychlosti hydrolýzy substrátu, tvořeného thioesterem obecného vzorce I vlivem uvedeného enzymu. Výzkumné práce v této oblasti ukázaly, že několik aminokyselin konfigurace D, stejně jako glycin mohou hrát úlohu aktivátoru hydrolýzy uvedeného thioesteru. Mezi nej lepší aktivátory tohoto typu lze uvést:
D-alanin, D-methionin, D-arginin, D-fenylalanin, D-serin, D-histidin, D-valin,
D-tryprofan a kyselina D-2-aminomáselná.
Jestliže se tedy například aktivita enzymu R39 vyjádří v jednotkách na miligram enzymu, přičemž tato enzymová jednotka hydrolyzuje při teplotě 47 °C 1 mikromol substrátu za minutu, potom bylo zjištěno, že aktivita enzymu R39 vůči kyselině [/N-benzoyl-D-alanyl/thio]octové, použité jako substrát, je rovna 8 jednotkám v nepřítomnosti D-alaninu a 320 jednotkám v přítomnosti D-alaninu. Jinými slovy, v přítomnosti tohoto aktivátoru se rychlost hydrolýzy substrátu působením enzymu R39 zvýší 4Okřát.
Naproti tomu bylo zjištěno, že žádné z aminokyselin, majících konfiguraci L, není schopna aktivovat uvedenou hydrolýzu substrátu.
Proto je při způsobu podle vynálezu důležité, aby hydrolýza substrátu thioesterového typu ve stupni 2/ byla provedena v přítomnosti aminokyseliny konfigurace D, které aktivuje hydrolýzu uvedeného substrátu enzymem R39. Toto opatření umožňuje dosáhnout při stanovení značné časové úspory. Takto je možné způsobem podle vynálezu snadno stanovit koncentraci penicilinu G 0,016 U.I. v mililitru mléka během 5 minut. Pro srovnání lze připomenout, že test Penzym vyžaduje k získáni stejného výsledku času asi 15 minut. Na rozdíl od dosud známých způsobů je způsob stanovení podle vynálezu tedy obzvláště přitažlivý pro rychlé stanovení antibiotik v mléce přímo na farmě v okamžiku, kdy se toto mléko získává dojením, a to tím spíše, že se jedná o jednoduché stanovení, které nevyžaduje žádné dokonalejší přístrojové vybavení.
Kromě toho bylo zjištěno, že způsob podle vynálezu může být s úspěchem aplikován nejen pro stanovení antibiotik v mléce, ale
-11CZ 280282 B6 také i v jiných biologických tekutinách, jakými jsou například sérum, moč, sliny, masové extrakty, fermentační tekutiny a vodné pufrováné roztoky.
Prvořadou výhodou způsobu podle vynálezu je tedy to, že umožňuje bud stanovit ve velmi krátkém-čase (5 minut) koncentrace antibiotika s beta-laktamovým jádrem asi 0,016 U.I./ml, nebo stanovit v čase poněkud delším (15 minut) velmi nízké koncentrace antibiotika s beta-laktamovým jádrem asi 0,004 U.I./ml nebo koncentrace ještě nižší a to bez použití zvláštního analytického přítrojového vybavení a komplexní technologie.
Antibiotika, jejichž koncentrace může být stanovena způsobe^ podle vynálezu, patří ke skupině antibiotik, která jsou charakterizována přítomností beta-laktamového jádra v jejich molekule, což v podstatě zahrnuje všechny peniciliny a cefalosporiny. Jakožto příklady těchto penicilinů lze uvést:
benzylpenicilin (penicilín G), ampicilin, fenoxymetylpenicilin, karbenicilin, methicilin, oxacilin a cloxacilin.
Jakožto příklady uvedených cefalosporinů lze uvést: cefalosporin C, cefaloglycin, cefalothin, cefalexin a cefapirin.
Obzvláště příznivých výsledků se dosáhne při stanovení penicilinu G.
Ve stupni 1/ způsobu podle vynálezu se stanovený objem vzorku biologické tekutiny inkubuje se stanoveným množstvím enzymu R39.
Jak to již bylo vysvětleno výše, je možné pracovat s velkými objemy vzorků. Při daném množství enzymu R39 se zdvojnásobením obejmu vzorku zdvojnásobí i citlivost způsobu stanovení. Tak například zdvojnásobením objemu vzorku se zdvojnásobí i citlivost stanovení; ztrojnásobením objemu vzorku se ztrojnásobí i citlivost stanovení, atd. Objem vzorku může být tedy zvolen v závislosti na požadované citlivosti stanovení. Tak například v případě mléka lze citlivost stanovení upravit podle norem, udávajících přípustnou koncentraci antibiotika v mléku v té či oné konkrétní zemi, nebo podle požadavků mlékárenského průmyslu.
Stejného účinku lze rovněž dosáhnout v případě, kdy se při daném objemu vzorku biologické tekutiny zmenší množství enzymu
R39 (viz dále uvedený příklad 2). Nicméně v tomto případě je nezbytné úměrně prodloužit i dobu trvání nejen stupně 1/, ale i stupně 2/ způsobu stanovení podle vynálezu.
-12CZ 280282 B6
V praxi budou zvolená množství enzymu R39 a biologické tekutiny záviset jednak na způsobu, jakým bude stanovení provedeno, a jednak na požadované citlivosti nebo požadované rychlosti stanovení .
Tak například, jestliže má být způsob stanovení podle vynálezu použit pro stanovení kontaminace mléka antibiotikem přímo na farmě, potom se dává přednost práci s velkými objemy vzorku, aby bylo při stanovení dosaženo snadnější manipulace se vzorky a činidly. S výhodou se volí objemy vzorků mezi 1 a 10 mililitry. Při provádění způsobu stanovení podle vynálezu v laboratoři, vybavené pomůckami pro mikrodávkování, dokonale vyhovují objemy vzorků v rozmezí mezi 50 mikrolitry a 1 mililitrem.
Jinak zvolená množství enzymu a biologické tekutiny budou v podstatě záviset na požadované citlivosti stanovení. Tak například, je-li stanovení prováděno v laboratoři, kde může být manipulováno s malými objemy, a je-li žádoucí, aby bylo dosaženo citlivosti stanovení 0,01 U.I./ml, potom se enzym použije v množství asi 1 pikomolu a objem biologické tekutiny činí asi 50 mikrolitrů. Jestliže je žádoucí získat citlivost stanovení 0,005 a 0,0025 U.I./ml, potom se použije objem biologické tekutiny 100 mikrolitrů, resp. 200 mikrolitrů, aniž by se přitom měnilo množství použitého enzymu.
Znamenitá citlivost, rychlost a přesnost způsobu stanovení antibiotik v biologických tekutinách podle vynálezu je důsledkem mimořádných vlastností uvedeného enzymu R39 a metody, použité pro stanovení zbytkové aktivity tohoto enzymu R39.
Ve skutečnosti je tento enzym R39 charakterizován:
extrémně rychlou tvorbou ekvimolekulárního komplexu enzym-antibiotikum, mimořádnou stabilitou tohoto komplexu, přičemž, jakmile se tento komplex vytvoří, rozkládá se jen velmi pomalu; pro ilustraci lze uvést, že poločas rozpadu komplexu, vytvořeného sloučením enzymu R39 a penicilinu G, činí při teplotě 37 ’C asi 70 hodin, znamenitou enzymatickou aktivitou, projevující se rychlou hydrolýzou koncové skupiny substrátu thioesterového typu obecného vzorce I za působení specifického aktivátoru této hydrolýzy.
Díky těmto třem vlastnostem zaujímá uvedený enzym privilegovanou pozici vzhledem k až -alanin-karboxypeptidázám. Vzhledem k tomu, plexu enzym-antibiotikum je nekonečně delší, která je zapotřebí pro vytvoření tohoto komplexu a jeho zbytkové enzymatické aktivity, ' - výsledky stanovení budou zkresleny zpětným uvolněním z komplexu v důsledku předčasného rozkladu komplexu antibiotikum.
dosud identifikovaným D-alanyl-Dže doba rozkladu komnež celková doba, l pro změření není třeba se obávat, že enzymu enzymJestliže se tedy zkoumají D-alanyl-D-alanin-karboxypeptidázy, které jsou až dosud známé a které nezahrnuji uvedený enzym
-13CZ 280282 B6
R39, potom se dochází k závěru, že žádný z těchto enzymů nemá výše uvedené vlastnosti; ve skutečnosti mají tyto enzymy desetkrát menší rychlost tvorby komplexu enzym-antibiotikum, jejich stabilita komplexu enzym-antibiotikum je naprosto nedostatečná a rychlost, s jakou hydrolyzují substrát, je velmi malá (to je zejména případ všech endocelulárních karboxypeptidáz, vázaných na bakteriální membránu).
Enzym R39 je specifická rozpustná exocelulární D-alanyl-D-alanin-karboxypeptidáza, která je vylučována mikroorganismem Actinomadura R39 v případě, že je tento mikroorganismus kultivován na vhodném živném prostředí. Tento mikroorganismus byl uložen
10. července 1981 ve sbírce Pasteurova ústavu (institut Pasteur) v Paříži pod číslem 1-127.
Pro použití při způsobu stanovení antibiotik podle vynálezu musí být tento enzym evidentně v podstatě čistý. Jeho příprava a čištění mohou být provedeny metodami, které jsou popsány v odborné literatuře (tohoto tématu se týká článek J-M. Frere-a a kol., Biochem. J. 143 (1974), 233-240, uvedený pod titulem Molecular Weight, Aminoacid Composition and Physicochemical Properties of the Exocellular DD-Carboxypeptidase-Transpeptidase of Streptomyces R39). Kromě toho je tento enzym v čistém stavu nyní komerčně dostupný; je možné ho získat u firmy UCB-Bioproducts
S.A. (Belgie).
Enzym R39 má znamenitou stabilitu; snáší teploty až do 60 ’C. Vzhledem k tomu může být inkubace biologické tekutiny s enzymem R39 prováděna bez potíží v teplotním intervalu od 20 do 50 C. S výhodou se používá inkubační teploty blízké 47 ’C. Za těchto podmínek je inkubační doba, která je úzce spojena s časem, nezbytným pro vytvoření ekvimolekulárního inaktivního komplexu enzym-antibiotikum, velmi krátká. Zvýšení uvedené inkubační teploty bude mít za následek zkrácení inkubační doby. Dobu stanovení je tedy možné zkrátit zvýšením uvedené inkubační teploty.
Ve stupni 2/ způsobu stanovení podle vynálezu se směs, získaná ve stupni 1/, inkubuje se stanoveným množstvím substrátu thioesterového typu pbecného vzorce I v roztoku v přítomnosti glycinu nebo aminokyseliny konfigurace D, který, resp. která aktivuje hydrolýzu uvedeného substrátu enzymem. V průběhu tohoto stupně je frakce enzymu, která nebyla spotřebována pro vytvoření komplexu enzym-antibiotikum ve stupni 1/, využita pro provedení hydrolýzy substrátu thioesterového typu obecného vzorce I. Touto hydrolyzační reakcí se vytvoří určité množství kyseliny 2-merkaptoalkanové obecného vzorce II, přičemž toto množství je úměrné zbytkové enzymatické aktivitě enzymu R39.
Uvedené thioestery obecného vzorce I jsou novými sloučeninami s výjimkou kyseliny [/N-benzoyl-glycyl/thio]octové, která je známou sloučeninou (viz patent US 2 824 863).
Thioestery obecného vzorce I mohou být připraveny konvenčním způsobem, který zahrnuje pouze o sobě známé reakce. Zpravidla se v inertním rozpouštědle, jakým je chloroform, dichlormetan, octan etylnatý nebo dimetylformamid, kondenzuje kyselina obecného vzorce III, která byla předběžně aktivována a nachází se například ve formě směsného anhydridu nebo aktivního esteru, s kyselinou
-14CZ 280282 B6
2-merkaptoalkanovou obecného vzorce II podle následujícího schématu:
R1R20H + HS-CH-COOH --------------------> (i) (III) (II) ve kterém R^, R2 a R3 mají výše uvedený význam.
Jako příklady thioesterů obecného vzorce I, použitelných při stanovení podle vynálezu jako substrát, lze uvést:
kyselinu [/N-benzoyl-D-alanyl/thio]octovou, kyselinu 2-[/N-benzoyl-D-alanyl/thio]propionovou, kyselinu [/N-fenylacetyl-D-alanyl/thio]octovou, kyselinu [/Nalfa-acetyl-L-lysyl-D-alanyl/thio]octovou.
Nicméně nej lepších výsledků se dosáhne pomocí kyseliny [/N-benzoyl-D-alanyl/thio]octové.
Jako neomezující příklady aminokyselin konfigurace D, které mohou být přidány k výše uvedeným substrátům jako aktivátory hydrolýzy těchto substrátů, lze uvést:
D-alanin, D-methionin, D-arginin, D-fenylalanin, D-serin, D-histidin, D-valin, D-tryptofan a kyselinu 2-aminomáselnou.
Podle výhodného provedení způsobu stanovení podle vynálezu se ke. kyselině [/N-benzoyl-D-alanyl/thio]octové, použité jako substrát, přidá jako aktivátor D-alanin.
Použitá množství substrátu a aktivátoru nejsou kritickými parametry způsobu stanovení podle vynálezu v případě, že se pracuje za podmínek nasycení enzymu uvedeným substrátem.
Pracovní podmínky, které je nutné dodržet v průběhu tohoto stupně, jsou v podstatě stejné jako podmínky, které již byly uvedeny výše pro provádění stupně 1/ stanovení podle vynálezu. Inkubace může být provedena v teplotním intervalu od 20 do 50 °C, s výhodou při teplotě blízké 47 ’C. Inkubační doba, v průběhu které se substrát inkubuje s enzymem R39, respektive s jeho částí , která nebyla deaktivována vstupem do komplexu enzym-antibiotikum, musí být alespoň dostatečná pro vytvoření měřitelného množství kyseliny 2-merkaptoalkanové obecného vzorce II. Pro inkubační teplotu 47 ’C se tato inkubační doba může pohybovat v intervalu mezi několika sekundami a 10 minutami, a to podle množství přítomného enzymu a objemu vzorku biologické tekutiny.
-15CZ 280282 B6
Tato inkubační doba může být zkrácena zvýšením inkubační teploty, nebo naopak prodloužena snížením inkubační teploty. Rovněž je snaha zvýšit inkubační teplotu ve všech případech, kdy je rozhodujícím faktorem rychlost stanovení antibiotika v biologické tekutině.
Za účelem zachování optimální enzymatické aktivity použitého enzymu by inkubační prostředí mělo mít výhodné hodnotu pH mezi 7 a 8,5. Obvykle se udržuje hodnota pH blízká hodnotě 8,0 tím, že se inkubace provádí v prostředí, které je vhodným způsobem pufrováno.
Ve stupni 3/ způsobu stanovení podle vynálezu se stanoví množství kyseliny 2-merkaptoalkanové obecného vzorce II, vytvořené v průběhu stupně 2/.
Stanovení kyseliny 2-merkaptoalkanové obecného vzorce II může být provedeno libovolnou vhodnou o sobě známou metodou. Je pouze důležité, aby tato metoda byla rychlá a málo nákladná a aby umožňovala specificky stanovit kyselinu 2-merkaptoalkanovou obecného vzorce II s vyloučením všech ostatních produktů, které jsou přítomné v biologické tekutině, určené pro stanovení obsahu antibiotika. S výhodou se proto používá kolorimetrické stanovení, prováděné pomocí činidla, které reakcí s volnou skupinou SH kyseliny 2-merkaptoalkanové produkuje charakteristické zbarvení.
Toto chromogenní činidlo může být zvoleno ze skupiny, zahrnující chemická činidla, která se obvykle používají pro tento typ reakce; sem patří například kyselina 5,5’-dithiobis/2-nitrobenzoová), kondenzační produkty 4,4'-dithiobis/fenylaminu/ s benzaldehydy a systém fenanthrolin-Fe+++.
Výhodným chromogenním činidlem je kyselina 5,5'-dithiobis/2-nitrobenzoová/, která je rovněž nazývána Ellmanovým činidlem a která produkuje žluté zbarvení, tvořené kyselinou 2-nitro-5-merkaptobenzoovou, vytvořenou výměnnou reakcí se skupinou SH kyseliny 2-merkaptoalkanové; intenzita tohoto zbarvení je přímo funkci množství kyseliny 2-merkaptoalkanové.
Nicméně při některých aplikacích může být výhodné použít červené zbarvení, které je produkováno reakcí fenanthrolinu s volnými skupinami SH v přítomnosti kationtů Fe+++.
Množství použitého chromogenního činidla bude funkcí množství kyseliny 2-merkaptoalkanové. S výhodou se pracuje za podmínek, kdy molární množství chromogenního činidla je v mírném přebytku vzhledem k maximálnímu molárnímu množství kyseliny 2-merkaptoalkanové, které může být vytvořeno ve stupni 2/ způsobu stanovení podle vynálezu.
Je třeba zdůraznit, že enzym R39 musí být nezbytné přítomen od samotného počátku stupně 1/ způsobu stanovení podle vynálezu;
stejné tak substrát a aktivátor hydrolýzy musí být nezbytně přítomny na počátku stupně 2/. Nicméně je možné přidat aktivátor již na počátku stupně 1/ a stejně tak je možné přidat chromogenní činidlo již na počátku stupně 1/, nebo na počátku stupně 2/ a nebo na konci stupně 2/. Podle výhodného provedení způsobu sta-16CZ 280282 B6 noveni podle vynálezu se na počátku stupně 1/ a v průběhu tohoto stupně inkubuje roztok enzymu R39 se vzorkem mléka v přítomnosti aktivátoru a ve stupni 2/ se přidá substrát a chromogenní činidlo, přičemž stupeň 2/ a stupeň 3/ se provedou současně za podmínek, které jsou v podstatě stejné jako podmínky, které byly uvedeny výše pro stupeň 2/.
Ve stupni 4/ způsobu stanovení podle vynálezu se hodnota, stanovená ve stupni 3/, porovná s etalonem za účelem stanovení koncentrace antibiotika v biologické tekutině.
Kvantitativní stanovení koncentrace antibiotika může být provedeno následující metodou.
Nejdříve se připraví série vzorků biologické tekutiny, které obsahují známé koncentrace antibiotika s betalaktamovým kruhem. Tato série vzorků bude kromě určitého počtu vzorků, obsahujících rostoucí koncentraci antibiotika, obsahovat také dva vzorky biologické tekutiny, které antibiotikum neobsahují. Potom se tyto vzorky zpracují zcela identickým způsobem ve stupních 1/, 2/ a 3/ způsobu podle vynálezu.
V případě jednoho ze vzorků biologické tekutiny, neobsahujících antibiotikum, se použitý roztok enzymu nahradí ve stupni 1/ identickým objemem vody. V tomto specifickém případě se tedy na konci stupně 3/ získá roztok, který obsahuje všechny reakční složky s výjimkou enzymu R39. Vzhledem k tomu, že enzym zde chybí, nedojde ke tvorbě kyseliny 2-merkaptoalkanové obecného vzorce II ve stupni a v důsledku toho ani chromogenní činidlo, kterým je v daném případě kyselina 5,5’-dithiobis/2-nitrobenzoová/, neposkytne zbarvení. Tento vzorek bude dále označován jako slepý vzorek.
Druhý ze vzorků biologické tekutiny naopak vytvoří uvedené žluté zbarvení. V případě, že je vzorek biologické tekutiny prostý antibiotika, není enzym R39 deaktivován ve stupni 1/ a dojde tedy k vytvoření maximálního množství kyseliny 2-merkaptoalkanové obecného vzorce II (toto množství odpovídá celkové enzymatické aktivitě enzymu R39, který byl pro stanovení použit), a tedy i k tvorbě maximálního množství kyseliny 5-merkapto-2-nitrobenzoové a v důsledku toho i k vytvoření maximálního žlutého zbarvení. Tento vzorek bude dále označován jako referenční vzorek .
Je rovněž zřejmé, že jestliže vzorky biologické tekutiny obsahují molární množství antibiotika, které je nižší, než molární množství použitého enzymu R39, potom bude jen část tohoto enzymu inaktivována antibiotikem ve stupni 1/; v těchto případech se tedy vytvoří určité množství kyseliny 2-merkaptoalkanové obecného vzorce II, které bude odpovídat zbytkové enzymatické aktivitě té části enzymu, která nebyla inaktivována antibiotikem, a tudíž i odpovídající množství kyseliny 5-merkapto-2-nitrobenzoové. V těchto případech tedy dojde ke vzniku žlutého zbarvení, které však má menší sytost než zbarvení, vytvořené v referenčním vzorku.
Konečné v případech, kdy vzorky biologické tekutiny obsahují molární množství antibiotika, které je rovné nebo vyšší než
-17CZ 280282 B6 molární množství použitého enzymu R39, bude enzym zcela inaktivován antibiotikem v průběhu stupně 1/; nedojde tedy k vytvoření kyseliny 2-merkaptoalkanové obecného vzorce II a chromogenní činidlo tedy zůstane nezměněné. V těchto případech se. tedy získá zbarvení, odpovídající zbarvení slepého vzorku.
Za účelem dosažení přesného stanovení se změří spektrofotometrem optická hustota zbarvení všech vzorků, včetně slepého a referenčního vzorku.
Vzhledem k tomu, že i v případě slepého vzorku se získá určitá hodnota optické hustoty, je třeba tuto hodnotu odečíst od hodnot, získaných pro referenční vzorek a pro ostatní vzorky.
Z takto získaných hodnot optické hustoty se potom vpočte procentuální zbytková aktivita (enzymu R39) pro každý vzorek biologické tekutiny. Tato procentuální zbytková aktivita je rovna poměru optické hustoty daného vzorku k optické hustotě referenčního vzorku, násobenému stem. Získané hodnoty se potom vynesou do grafu, ve kterém jsou na ose úseček vyneseny koncentrace antibiotika, zatímco na ose pořadnic jsou vyneseny procentuální zbytkové aktivity enzymu R39. Získá se přímka, která protíná osu úseček v bodě, odpovídajícím referenčnímu vzorku (100% zbytková enzymatická aktivita) a osu pořadnic v bodě, odpovídajícím vzorku, který obsahuje molární množství antibiotika, rovné molárnímu množství použitého enzymu R39 (0% zbytková enzymatická aktivita).
Takto získaný graf tvoří etalon, který umožňuje stanovit neznámou koncentraci antibiotika s beta-laktamovým jádrem ve vzorku biologické tekutiny, která byla použita pro získání tohoto etalonu. Za tímto účelem je třeba vzorek s neznámou koncentrací antibiotika zpracovat přesně stejným způsobem ve stupních 1/, 2/ a 3/ způsobu stanovení podle vynálezu; potom se spektrofotometrem změří optická hustota rezultujícího zbarvení; od této optické hustoty se odečte optická hustota, nalezená pro slepý vzorek; vypočte se procentuální zbytková aktivita enzymu způsobem, který byl popsán výše, a koncentrace antibiotika ve vzorku se stanoví podle uvedeného etalonu.
Tímto způsobem je možné kvantitativně stanovit během 15 minut tak nízké koncentrace antibiotika, jako 0,002 U.I./ml biologické tekutiny.
Nicméně tato metoda v některých případech vyžaduje předběžné vyčeření biologické tekutiny, aby bylo možné použít spektrofotometr, což vede k tomu, že stanovení musí být v podstatě provedeno v laboratoři. Jestliže je třeba pouze stanovit, jestli koncentrace antibiotika v biologické tekutině přesahuje nebo nikoliv určitou prahovou hodnotu (například v případě mléka maximálně přípustnou hodnotu, stanovenou zákonem té či oné země), potom není nezbytné používat spektrofotometr. To však vyžaduje několik předběžných vysvětlení.
Jak to již bylo uvedeno výše, protíná kalibrační křivka osu pořadnic v bodě, odpovídajícím vzorku, obsahujícímu molární množství antibiotika, rovné molárnímu množství použitého enzymu R39.
Při této kritické koncentraci antibiotika je procentuální zbytková enzymatická aktivita rovna 0 %, protože se na konci stupně 3/
-18CZ 280282 B6 způsobu stanovení podle vynálezu získá stejné zbarvení jako zbarvení, získané v případě slepého vzorku.
Při koncentraci vyšší, než je tato kritická koncentrace antibiotika v biologické tekutině, se rovněž získá zbarvení, které je stejné jako zbarvení, získané pro slepý vzorek, nebot zbytková procentuální aktivita je stále rovna 0 %. Naopak při koncentraci antibiotika v biologické tekutině nižší, než je uvedená kritická koncentrace antibiotika, se získá žluté zbarvení, neboť zde zbyla ještě určitá zbytková enzymatická aktivita.
Jestliže se tedy výsledek stanovení zakládá pouze na zjištění, zda na konci stupně 3/ způsobu stanovení podle vynálezu vznikne či nikoliv uvedené žluté zbarvení, potom lze na základě tohoto zjištění přímo určit, zda koncentrace antibiotika v biologické tekutině přesahuje či nikoliv uvedenou koncentraci.
Stačí tedy znát předem uvedenou kritickou koncentraci, aby potom mohlo být stanoveno bez použití spektrofotometru a velmi rychle, zda vzorek biologické tekutiny obsahuje koncentraci antibiotika s beta-laktamovým jádrem, která přesahuje či nikoliv tuto kritickou koncentraci. Za tímto účelem se takový vzorek biologické tekutiny zpracuje přesně stejným způsobem ve stupních 1/, 2/ a 3/ způsobu stanovení podle vynálezu, načež se jednoduše pozoruje, zda vznikne uvedené zbarvení; jestliže toto zbarvení odpovídá zbarvení slepého vzorku, potom koncentrace antibiotika ve vzorku je alespoň rovná uvedené kritické koncentraci; jestliže vznikne žluté zbarvení, potom je koncentrace antibiotika ve vzorku biologické tekutiny nižší, než uvedená kritická koncentrace antibiotika.
Takto je možné vizuálně a s jistotou stanovit, zda vzorky biologické tekutiny obsahují více nebo méně než 0,004 U.I. antibiotika v jednom mililitru biologické tekutiny a to během 15 minut. Kromě toho použitím barevné škály, reprodukující změnu intenzity žlutého zbarvení v závislosti na koncentraci antibiotika v biologické tekutině bude možné semikvantitativné stanovit koncentrace antibiotika v koncentračním rozmezí, vymezeném nulovou koncentrací antibiotika a kritickou koncentrací antibiotika. V případě, kdy uvedená kritická koncentrace činí 0,004 U.I./ml, bude možné stanovit bez zvláštních obtíží koncentraci 0,002 U.I./ml.
Tato metoda, jak s použitím barevné škály, nebo bez použití barevné škály, tedy dokonale vyhovuje pro sériové testy vzorků mléka, a to dokonce i mimo laboratoř, například prováděné přímo na farmě nespecializovaným personálem.
Způsob kvantitativního a kvalitativního stanovení koncentrace antibiotika podle vynálezu byla v předcházejícím textu detailně vysvětlena za použití barevné změny, produkované kyselinou 5,5'-dithiobis/2-nitrobenzoovou/. Nicméně je snadno pochopitelné, že při uvedeném stanovení je možné použít i další chromogenní činidla, přičemž výsledné zbarvení bude samozřejmě odlišné.
Dalším předmětem vynálezu je souprava pro stanovení antibiotik v biologických tekutinách způsobem podle vynálezu. Tato souprava zejména osbahuje:
-19CZ 280282 B6
1/ stanovené množství rozpustné D-alanyl-D-alaninkarboxypeptidázy, produkované mikroorganismem Actinomadura R39;
2/ stanovené množství substrátu, kterým je thioester obecného vzorce
R,-Rn-S-CH-COOH
I R3 ve kterém
R^ znamená benzoylový radikál, fenylacetylový radikál nebo Na^^a-acetyl-L-lysylový radikál,
R2 znamená glycylový radikál nebo D-alanylový radikál a
R3 znamená atom vodíku nebo methylový radikál,
3/ stanovené množství aminokyseliny s konfigurací D nebo glycin,
4/ reakční složku, umožňující stanovit kyselinu 2-merkaptoalkanovou obecného vzorce
HS-CH-COOH ve kterém
R3 má výše uvedený význam a
5/ popřípadě graf, znázorňující zbytkovou procentuální aktivitu enzymu, vyprodukovaného Actinomadura R39, jako funkci koncentrace antibiotika, nebo barevnou škálu, u které dochází ke změně intenzity zabarvení v závislosti na koncentraci antibiotika, se kterými mohou být srovnány výsledky testů, provedené se složkami 1, 2, 3 a 4.
Podle výhodného provedení vynálezu je substrátem kyselina [/N-benzoyl-D-alanyl/thio]octová, aminokyselinou s konfigurací D je D-alanin a činidlem 4/ je kyselina 5,5'-dithiobis/2-nitrobenzoová/.
Podle obzvláště výhodného provedení vynálezu jsou substrát a reakční složka, umožňující stanovení kyseliny 2-merkaptoalkanové, sdruženy ve formě tablety společně s pomocnými látkami, které se obvykle používají při tabletování.
Do soupravy jako určitý etalon může být tedy zabudován graf, na kterém je graficky vynesen vztah mezi koncentracemi antibiotika a zbytkovými procentuálními aktivitami enzymu R39. Takto je možné provádět kvantitativní stanovení antibiotik v biologických tekutinách způsobem, který byl vysvětlen v předcházejícím textu.
Tento graf však není vždy nezbytný. V případě, kdy tato souprava má sloužit pouze ke zjištěni, zda koncentrace antibiotika přesa-20CZ 280282 B6 huje či nikoliv určitou hranici, potom stačí v návodu uvést, při které koncentraci antibiotika lze po zpracování vzorku způsobem podle vynálezu pozorovat změnu barvy.
Za účelem bližšího objasnění vynálezu je v následující části popisu uvedeno několik konkrétních příkladů jeho provedení, které mají pouze ilustrativní charakter a vlastní rozsah vynálezu, daný formulací patentových nároků, nikterak neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Tento příklad provedení ukazuje, že způsob podle vynálezu umožňuje velmi rychlé stanovení nízkých koncentrací penicilinu G v mléku.
Připraví se série vzorků mléka, majících objem 50 mikrolitrů a obsahujících známé koncentrace penicilinu G, stejně jako dva vzorky (slepý a referenční) mléka, mající objem 50 mikrolitrů a neobsahující penicilín G.
Ke každému vzorku (referenční vzorek + vzorky, obsahující penicilín G) se přidá 1,5 pikomolu enzymu R39, rozpuštěného v 10 mikrolitrech 0,5M Hepes-pufru (pH = 8,0), obsahujícího 0,5M koncentraci chloridu sodného a 0,25M koncentraci chloridu hořečnatého, a 20 mikrolitrů vodného roztoku, obsahujícího 50 mg/ml D-alaninu. V případě slepého vzorku je enzym R39, rozpuštěný v Hepes-pufru, nahrazen 10 mikrolitry 0,5M Hepes-pufru (pH = 8,0), obsahujícího 0,5M koncentraci chloridu sodného a 0,25M koncentraci chloridu hořečnatého (Hepes = kyselina 4-hydroxyethyl-l-piperazinetansulfonová). Tato směs se potom inkubuje při teplotě 47 C po dobu 4 minut.
Potom se přidá 5 mikrolitrů vodného roztoku, obsahujícího 5 mg/ml kyseliny [N-benzoyl-D-alanyl/thio]octové a 10 mikrolitrů roztoku fosfátového pufru (pH = 8,0, KH2PO4 + K2HPO4), obsahujícího 2 mg/ml kyseliny 5,5’-dithiobis/2-nitrobenzoové) a takto získaná směs se potom inkubuje při teplotě 47 *C po dobu 1 minuty.
Potom se pozoruje získané zbarvení jednotlivých vzorků. Získané výsledky jsou reprodukovány v následující tabulce I.
-21CZ 280282 B6
Tabulka I
| Vzorek | Koncentrace penicilinu G (v U.I./ml) | Zbarvení |
| referenční | 0 | velmi intensivní žlutá |
| 1 | 0,004 | intenzivní žlutá |
| 2 | 0,008 | střední žlutá |
| 3 | 0,012 | bledě žlutá |
| 4 | 0,016 | bílá |
| 5 | 0,020 | bílá |
| 6 | 0,025 | bílá |
| slepý | 0 | bílá |
Z výše uvedené tabulky I je zřejmé, že při koncentraci penicilinu G, rovné nebo vyšší než 0,016 U.I./ml, se získá bílé zbarvení, které je stejné jako zbarvení slepého vzorku, zatímco při nižších koncentracích se získá žluté zbarvení, které je čím dál tím intenzivnější s klesající koncentrací penicilinu G až k dosažení velmi intenzivního žlutého zbarvení, odpovídajícího nulové koncentraci penicilinu G (referenční vzorek).
Je tedy zřejmé, že způsob stanovení podle vynálezu umožňuje během pěti minut stanovit vizuálně, zda vzorek mléka obsahuje koncentraci penicilinu G, rovnou 0,016 U.I./ml nebo koncentraci vyšší, což činí tento způsob stanovení přitažlivým pro rychlé roztřídění mléka buď v mlékárně, nebo přímo na farmě.
Příklad 2
V tomto příkladu bude ukázáno, že způsob stanovení podle vynálezu je velmi citlivý.
Opakuje se přesně postup podle příkladu 1 s výjimkou, že: se ke vzorkům přidá 0,4 pikomolu enzymu R39 (namísto 1,5 pikomolu);
první inkubace trvá 10 minut (namísto 4 minut) a druhá inkubace trvá 5 minut (namísto 1 minuty).
Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce II.
Tabulka II
| Vzorek | Koncentrace penicilinu G (v U.I./ml) | Zbarvení |
| referenční | 0 | velmi intenzivní žlutá |
| 1 | 0,001 | intenzivní žlutá |
| 2 | 0,002 | střední žlutá |
| 3 | 0,003 | bledé žlutá |
| 4 | 0,004 | bílá |
| 5 | 0,005 | bílá |
| 6 | 0,008 | bílá |
| 7 | 0,010 | bílá |
| slepý | 0 | bílá |
-22CZ 280282 B6
Tato tabulka ukazuje, že při použití způsobu podle vynálezu je možné v mléku vizuálně detekovat koncentrace penicilinu G, alespoň rovné 0,004 U.I./ml mléka, a to během 15 minut. Kromě toho při použití barevné škály je možné detekovat ještě nižší koncentrace, jako například koncentraci 0,002 U.I./ml. Tento způsob tedy umožňuje stanovit, zda mléko obsahuje koncentraci antibiotika, která přesahuje (nebo nikoliv) zákonné normy dokonce v zemích, kde jsou tyto normy velmi přísné.
Příklad 3
Tento příklad ukazuje, že způsob podle vynálezu může být použit pro stanovení koncentrace antibiotik ve velkých objemech vzorků.
Opakuje se přesně postup podle příkladu 1 s výjimkou, že:
- vzorky jsou tvořeny 3 mililitry mléka (namísto 50 mikrolitry);
- se ke každému vzorku přidá 24 pikomolů enzymu R39, rozpuštěného ve 150 mikrolitrech 0,5M Hepes-pufru (pH = 8,0) (namísto
1,5 pikomolů), a 600 mikrolitrů vodného roztoku D-alaninu, obsahujícího 100 mg/ml D-alaninu;
první inkubace trvá 10 minut (namísto 4 minut);
se potom přidá 120 mikrolitrů vodného roztoku kyseliny [/N-benzoyl-D-alanyl/thio]octové (namísto 5 mikrolitrů), a 120 mikrolitrů roztoku fosfátového pufru (pH = 8,0), obsahujícího 5 mg/ml kyseliny 5,5’-dithiobis/2-nitrobenzoové/; a
- druhá inkubace trvá 5 minut (namísto 1 minuty).
Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce III.
Tabulka III
| Vzorek | Koncentrace penicilinu G (v U.I./ml) | Zbarvení |
| referenční | 0 | velmi intenzivní žlutá |
| 1 | 0 | střední žlutá |
| 2 | 0,003 | bledé žlutá |
| 3 | 0,004 | bílá |
| 4 | 0,006 | bílá |
| slepý | 0 | bílá |
Tato tabulka ukazuje, že způsobem podle vynálezu lze ve velkých objemech vzorků (3 ml) vizuálně detekovat přítomnost 0,004
U.I. penicilinu G/ml mléka, a to během 15 minut. Toto stanovení tedy může být velmi snadno provedeno i nespecializovaným personálem.
-23CZ 280282 B6
Stejné výsledky se získají vynálezu použije pro stanovení cích, tvořených 1 ml mléka.
i v případě, kdy se způsob podle koncentrací penicilinu G ve vzorPříklad 4
Tento příklad ukazuje, že způsob podle vynálezu může být použit i ve spojitosti s jinými substráty, než je kyselina [/N-benzoyl-D-alanyl/thio]octová.
Způsob stanovení se provádí stejně jako v příkladu 3. Avšak po první inkubaci se přidá 120 mikrolitrů vodného roztoku, obsahujícího 5 mg/ml kyseliny [/N-fenylacetyl-D-alanyl/thio]octové.
Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce IV.
Tabulka IV
| Vzorek | Koncentrace penicilinu G (v U.I./ml) | Zbarvení |
| referenční | 0 | velmi intenzivní žlutá |
| 1 | 0,003 | bledě žlutá |
| 2 | 0,006 | bílá |
| slepý | 0 | bílá |
Tato tabulka ukazuje, že způsob podle vynálezu může být s úspěchem použit ve spojitosti s kyselinou [/N-fenylacetyl-D-alanyl/thio]octovou, použitou jako substrát.
Příklad 5
Tento příklad ukazuje, že způsob stanovení antibiotik v biologických tekutinách může být úspěšně použit i tehdy, kdy se jako aktivátory hydrolýzy substrátu enzymem použijí různé aminokyseliny s konfigurací D nebo glycin.
Postup stanovení je zde stejný, jako postup popsaný v příkladě 3. Nicméně vodný roztok, obsahující 100 mg/ml D-alaninu (test I) je zde nahražen vodným roztokem, obsahujícím 100 mg/ml D-fenylalaninu (test II), D-serinu (test III), D-histidinu (test IV), D-methioninu (test V), kyseliny D-2-aminomáselné (test VI), nebo vodným roztokem, obsahujícím 200 mg/ml glycinu (test VII).
Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce V.
-24CZ 280282 B6
Tabulka V
| Test Vzorek | Koncentrace penicilinu G (v U.I./ml) | Zbarvení |
| referenční | 0 | velmi intenzivní žlutá |
| I | velmi intenzivní žlutá | |
| II | velmi intenzivní žlutá | |
| III | velmi intenzivní žlutá | |
| IV | velmi intenzivní žlutá | |
| v | velmi intenzivní žlutá | |
| VI | • | velmi intenzivní žlutá |
| VII | velmi intenzivní žlutá | |
| 1 | 0,003 | |
| I | bledě žlutá | |
| II | bledě žlutá | |
| III | bledě žlutá | |
| IV | bledě žlutá | |
| v | bledě žlutá | |
| VI | bledě žlutá | |
| VII | bledě žlutá | |
| 2 | 0,006 | |
| I | bílá | |
| II | bílá | |
| III | bílá | |
| IV | bílá | |
| v | bílá | |
| VI | bílá | |
| VII | bílá | |
| slepý | 0 | |
| I | bílá | |
| II | bílá | |
| III | bílá | |
| IV | bílá | |
| v | bílá | |
| VI | bílá | |
| VII | bílá |
Tato tabulka ukazuje, že aminokyseliny s konfigurací D a glycin jsou obecně vhodné pro provádění způsobu podle vynálezu.
Příklad 6
Tento příklad ilustruje použití způsobu podle vynálezu pro stanovení cefapirinu (antibiotikum skupiny cefalosporinů) v mléce.
Postupuje se stejně jako v příkladu 3, přičemž však 3 ml vzorky mléka obsahují známé koncentrace cefapirinu.
Získané výsledky jsou uvedené v následující tabulce VI.
-25CZ 280282 B6
Tabulka VI
| Vzorek | Koncentrace cefapirinu (v U.I./ml) | Zbarvení |
| referenční | 0 | velmi intenzivní žlutá |
| 1 | 0,002 | středně žlutá |
| 2 | 0,003 | bledě žlutá |
| 3 | 0,004 | bílá |
| 4 | 0,006 | bílá |
| slepý | 0 | bílá |
Tato tabulka ukazuje, že způsob podle vynálezu umožňuje detekovat vizuálně přítomnost 0,004 μ9/ιη1 cefapirinu v mléce během 15 minut.
Příklad 7
Tento příklad ilustruje použití způsobu podle vynálezu pro stanovení nízkých koncentrací penicilinu G v séru.
Postupuje se stejně jako v příkladu 3, přičemž se však 3 ml vzorky mléka nahradí 3 ml vzorky séra, obsahujícími známé koncentrace penicilinu G. Kromě toho se po druhé inkubaci, trvající 5 minut, vzorky odstředí a supernatanty se lOkrát zředí vodou. Potom se měří optická hustota spektrofotometrem při 410 nm.
Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce VII. Hodnoty optické hustoty, uvedené v tabulce VII, jsou získané po odečtení optické hustoty slepého vzorku od optických hustot referenčního vzorku a ostatních vzorků.
Tabulka VII
| Vzorek | Koncentrace penicilinu G (v U.I./ml) | Optická hustota (při 410 nm) |
| referenční | 0 | 435 |
| 1 | 0,002 | 226 |
| 2 | 0,003 | 175 |
| 3 | 0,004 | 49 |
| 4 | 0,006 | 15 |
| slepý | 0 | 0 |
Tato tabulka ukazuje, že je možné za použití spektrofotometru kvantitativné stanovit velmi nízké koncentrace penicilinu G (tak nízké jako 0,002 U.I./ml) ve vzorku séra.
Příklad 8
V tomto příkladu jsou substrát a reakční složka, umožňující stanovení kyseliny 2-merkaptoalkanové, sdruženy ve formě tablety.
-26CZ 280282 B6
Způsob stanovení se provádí stejně jako v příkladu 3. Avšak pro první inkubaci, trvající 10 minut, se přidá tableta, která obsahuje 600 mikrogramů kyseliny [/N-benzoyl-D-alanyl/thio]octové a 600 mikrogramů kyselina 5,5'-dithiobis/2-nitrobenzoové/. Tato tableta má následující celkové složení (v hmotnostních procen-
| • • substrát+reakční složka | 4 % | |
| polyetylenglykol 6000 | 3 | % |
| Avicel+ | 27 | % |
| škrob | 10 % | |
| laktóza | 55 | % |
| Aerosil++ | 0,5 % | |
| stearát hořečnatý | 0,5 % |
+) mikrokrystalická celulóza ++) koloidní silika.
Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce VIII.
Tabulka VIII
| Vzorek | Koncentrace penicilinu G (v U.I./ml) | Zbarvení |
| referenční | 0 | intenzivní žlutá |
| 1 | 0,002 | středně žlutá |
| 2 | 0,003 | bledé žlutá |
| 3 | 0,004 | bílá |
| 4 | 0,006 | bílá |
| slepý | 0 | bílá |
Tato tabulka ukazuje, že je možné použít způsob podle vynálezu za podmínek, kdy substrát a reakční složka jsou sdruženy ve formě tablety. Jedná se o reakční složku, umožňující stanovení kyseliny 2-merkaptoalkanové. Toto uspořádáni představuje výhodu jak po stránce manipulace s reakčními složkami, tak i po stránce stability reakčních složek.
Claims (14)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob enzymatického stanovení antibiotik s β-laktamovým jádrem v biologické tekutině, zahrnující následující stupně:a) inkubaci uvedené biologické tekutiny s rozpustnou D-alanyl-D-alanin-karboxypeptidázou, produkovanou mikroorganismemActinomadura R39, přičemž se tato inkubace provádí za podmínek, umožňujících reakci antibiotika s β-laktamovým kruhem, popřípadě přítomného v uvedené biologické tekutině,-27CZ 280282 B6 s enzymem za vzniku inaktivního a v podstatě ireverzibilního ekvimolekulárního komplexu enzym-antibiotikum,b) inkubaci směsi, získané na výstupu z prvního stupně, s roztokem substrátu za podmínek, umožňujících hydrolýzu uvedeného substrátu enzymem za vzniku sloučeniny, jejíž množství je úměrné zbytkové enzymatické účinnosti,c) stanovení množství sloučeniny, vytvořené ve stupni 2 ad) srovnání hodnoty, stanovené ve třetím stupni, s etalonem za účelem zjištění koncentrace antibiotika v biologické tekutině, vyznačující se tím, že se inkubace ve druhém stupni provádí se substrátem, kterým je thioester obecného vzorce r^-r2-s-ch-cooh ve kterémR-^ znamená benzoylový radikál, fenylacetylový radikál nebo Nalfa_acetyi-L-lysylOVý radikál,R2 znamená glycylový radikál nebo D-alanylový radikál aR3 znamená atom vodíku nebo metylový radikál, tak, že hydrolýzou vznikne kyselina 2-merkaptoalkanová obecného vzorceHS-CH-COOH I R3 ve kterém R3 má výše uvedený význam, přičemž se inkubace provádí v přítomnosti aminokyseliny, která aktivuje hydrolýzu substrátu enzymem, přičemž uvedená aminokyselina je zvolena ze skupiny, zahrnující aminokyseliny s konfigurací D a glycin.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že substrátem je kyselina [/N-benzoyl-D-alanyl/thio]octová.
- 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že aminokyselina je zvolena ze skupiny, zahrnujícíD-alanin, D-methionin, D-arginin, D-fenylalanin, D-serin, D-histidin, D-valin, D-tryptofan a kyselinu D-2-aminomáselnou.-28CZ 280282 B6
- 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že aminokyselinou je D-alanin.
- 5. Způsob tím, podle nároků 1 až 4, vyznačující že stupně 2 a 3 se provádějí současně.
- 6.Způsob podle nároků 1 až 5, v y z n tím, že biologická tekutina se zvolí ze mléko, sérum, moč, sliny, masové extrakty, ny a pufrováné vodné roztoky.ačující se skupiny, zahrnující fermentační tekuti-
- 7. Způsob . podle nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že antibiotikum, které má být stanoveno, se zvolí ze skupiny, zahrnující benzylpenicilin, ampicilin, fenoxymetylpenicilin, karbenicilin, methicilin, oxacilin, cloxacilin, cefalosporin C, cefaloglycin, cefalothin, cefalexin a cefapirin.
- 8. Způsob podle nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že množství kyseliny 2-merkaptoalkanové obecného vzorceHS-CH-COOH ve kterémR3 má význam uvedený výše, se stanoví inkubací směsi, získané ve stupni 2, s kyselinou 5,5'-dithiobis/2-nitrobenzoovou/ za vzniku zbarvení, jehož intenzita je funkcí množství kyseliny 2-merkaptoalkanové.
- 9. Souprava pro stanovení antibiotik s β-laktamovým jádrem v biologické tekutině, vyznačující se tím, že obsahuje:a) stanovené množství rozpustné D-alanyl-D-alaninkarboxypeptidázy, produkované mikroorganismem Actinomadura R 39,b) stanovené množství substrátu, kterým je thioester obecného vzorceR1-R2-S-CH-COOH ve kterémR-^ znamená benzoylový radikál, fenylacetylový radikál neboNalfa-acetyi-L-lysylOVý radikál,R2 znamená glycylový radikál nebo D-alanylový radikál aR3 znamená atom vodíku nebo metylový radikál,-29CZ 280282 B6c) stanovené množství aminokyseliny s konfigurací D nebo glycin,d) reakční složku, umožňující stanovit kyselinu 2-merkaptoalkanovou obecného vzorceHS-CH-COOH ve kterémR3 má výše uvedený význam a popřípadě graf, znázorňující zbytkovou procentuální aktivitu enzymu, vyprodukovaného Actinomadura R39, jako funkci koncentrace antibiotika, nebo barevnou škálu, u které dochází ke zrněné intenzity zabarvení v závislosti na koncentraci antibiotika, se kterými mohou být srovnány výsledky testů, provedené se složkami 1, 2, 3 a 4.
- 10.Souprava podle nároku 9, vyznačující se tím, že substrátem je kyselina [/N-benzoyl-D-alanyl/thio]octová.
- 11.Souprava podle nároků 9 a 10, vyznačující se tím, že aminokyselina s kongigurací D je zvolena ze skupiny, zahrnující D-alanin, D-methionin, D-arginin, D-fenylalanin, D-serin, D-histidin, D-valin, D-tryptofan a kyselinu D-2-aminomáselnou.
- 12.Souprava podle nároku 11, vyznačující se tím, že aminokyselinou s konfigurací D je D-alanin.
- 13.Souprava podle nároků 9 až tím, že reakční složkou -nitrobenzoová/.12, vyznačující se4 je kyselina 5,5’-dithiobis/2-
- 14.Souprava podle nároků 9 až 13, vyznačující se tím, že substrát a reakční složka 4 jsou sdruženy ve formě tablety.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB909009692A GB9009692D0 (en) | 1990-04-30 | 1990-04-30 | An enzymatic method of determining beta-lactam ring antibiotics |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS9101246A2 CS9101246A2 (en) | 1991-11-12 |
| CZ280282B6 true CZ280282B6 (cs) | 1995-12-13 |
Family
ID=10675235
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS911246A CZ280282B6 (cs) | 1990-04-30 | 1991-04-30 | Enzymatický způsob stanovení antibiotik s beta-laktamovým jádrem |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5246830A (cs) |
| EP (1) | EP0468946B1 (cs) |
| JP (1) | JP2823382B2 (cs) |
| AT (1) | ATE124998T1 (cs) |
| AU (1) | AU636482B2 (cs) |
| BG (1) | BG61082B2 (cs) |
| CA (1) | CA2040180C (cs) |
| CZ (1) | CZ280282B6 (cs) |
| DE (1) | DE69111149T2 (cs) |
| DK (1) | DK0468946T3 (cs) |
| ES (1) | ES2075414T3 (cs) |
| FI (1) | FI97151C (cs) |
| GB (1) | GB9009692D0 (cs) |
| GR (1) | GR3017235T3 (cs) |
| HU (1) | HU214926B (cs) |
| IE (1) | IE69037B1 (cs) |
| NO (1) | NO302664B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ237950A (cs) |
| PL (1) | PL169360B1 (cs) |
| PT (1) | PT97511B (cs) |
| SK (1) | SK279176B6 (cs) |
| YU (1) | YU48050B (cs) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL134939A (en) * | 1997-10-07 | 2004-05-12 | Ucb Sa | Standard for testing substances dissolved in aqueous milk product |
| US6143513A (en) * | 1999-06-23 | 2000-11-07 | Biacore Ab | Method and kit for detecting betalactam-containing compounds |
| PL385415A1 (pl) * | 2008-06-11 | 2009-12-21 | Marek Ciesielski | Sposób wykrywania bakteriooporności, zestaw diagnostyczny oraz zastosowanie oznaczania obecności leku i/lub produktów jego rozpadu |
| EP2766735B1 (en) * | 2011-10-14 | 2017-02-01 | Université de Liège | Method for measuring beta-lactam antibiotics |
| CN111830015B (zh) * | 2019-04-18 | 2022-12-09 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 一种定量检测抗生素的方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2824863A (en) * | 1952-11-14 | 1958-02-25 | Ciba Pharm Prod Inc | Acylmercapto compounds |
| US4166825A (en) * | 1978-08-17 | 1979-09-04 | Abbott Laboratories | Chromogenic substrates |
| CA1185881A (en) * | 1982-02-01 | 1985-04-23 | Jacques Degelaen | ENZYMATIC PROCESS FOR THE DETERMINATION OF .beta.-LACTAM ANTIBIOTICS |
| US4806478A (en) * | 1984-10-17 | 1989-02-21 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Dry enzyme formulations containing D-amino acid oxidase |
| US4686182A (en) * | 1984-10-17 | 1987-08-11 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Method and kit for detecting antibiotics in a liquid sample |
-
1990
- 1990-04-30 GB GB909009692A patent/GB9009692D0/en active Pending
-
1991
- 1991-04-10 CA CA002040180A patent/CA2040180C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-26 ES ES91870070T patent/ES2075414T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-26 EP EP91870070A patent/EP0468946B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-26 AT AT91870070T patent/ATE124998T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-04-26 AU AU76226/91A patent/AU636482B2/en not_active Ceased
- 1991-04-26 DK DK91870070.9T patent/DK0468946T3/da active
- 1991-04-26 NZ NZ237950A patent/NZ237950A/en unknown
- 1991-04-26 DE DE69111149T patent/DE69111149T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-26 JP JP3096762A patent/JP2823382B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-04-26 PL PL91290061A patent/PL169360B1/pl unknown
- 1991-04-26 US US07/692,355 patent/US5246830A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-29 HU HU911441A patent/HU214926B/hu not_active IP Right Cessation
- 1991-04-29 NO NO911692A patent/NO302664B1/no unknown
- 1991-04-29 PT PT97511A patent/PT97511B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-04-29 BG BG094327A patent/BG61082B2/bg unknown
- 1991-04-29 IE IE143391A patent/IE69037B1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-04-29 FI FI912054A patent/FI97151C/fi active
- 1991-04-30 CZ CS911246A patent/CZ280282B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-04-30 YU YU78391A patent/YU48050B/sh unknown
- 1991-04-30 SK SK1246-91A patent/SK279176B6/sk unknown
-
1995
- 1995-08-30 GR GR950402344T patent/GR3017235T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4014745A (en) | Application of luciferase assay for ATP to antimicrobial drug susceptibility | |
| US4740459A (en) | Fluorescence assay for microbial beta-lactamase | |
| US5998128A (en) | Use of porphyrins in instrumental detection methods | |
| US4965193A (en) | Detection of microbial beta-lactamase | |
| JPH0530995A (ja) | リステリア属の細菌を同定する方法及び媒質 | |
| JP2001510054A (ja) | リステリア属病原性細菌検出用培養培地およびこの細菌の同定方法 | |
| US8404460B2 (en) | Method for detecting and/or identifying Clostridium difficile | |
| US4239852A (en) | Antibiotic detection method | |
| US4546076A (en) | Enzymatic process for the determination of beta-lactam antibiotics | |
| CZ280282B6 (cs) | Enzymatický způsob stanovení antibiotik s beta-laktamovým jádrem | |
| JPS6156098A (ja) | 抗微生物活性物質の検出用試薬および検出方法 | |
| US4239745A (en) | Antibiotic detection method | |
| JP2011504373A (ja) | 細菌の検出および／または同定のための培地 | |
| US5565328A (en) | Measurement of color reactions by monitoring a change of fluorescence | |
| Chen et al. | Rapid, inexpensive method for specific detection of microbial beta-lactamases by detection of fluorescent end products | |
| US5089394A (en) | Neisseria detection system | |
| Baker | A sensitive procedure for screening microorganisms for the presence of penicillin amidase | |
| SU1497218A1 (ru) | Способ определени активности гликогенфосфорилазы | |
| FR2928655A1 (fr) | Procede de detection en temps reel de microorganismes dans un milieu de culture liquide par lyse cellulaire. | |
| Chen et al. | Enhancement of fluorescence development of end products by use of a fluorescence developer solution in a rapid and sensitive fluorescent spot test for specific detection of microbial beta-lactamases | |
| JPS587279B2 (ja) | 抗生物質の検出方法 | |
| WO2024038466A1 (en) | Biological medium composition and assay for antimicrobial susceptibility testing | |
| EP0569578A1 (en) | Method of enhancing hybridization signals in growth media | |
| JPH06269298A (ja) | 乳酸菌の迅速判定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20080430 |