JP2001510054A - リステリア属病原性細菌検出用培養培地およびこの細菌の同定方法 - Google Patents

リステリア属病原性細菌検出用培養培地およびこの細菌の同定方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、リステリア属の病原性細菌を直接同定するための栄養寒天培養培地に関し、この培地はホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩＰＬＣ）によって特異的に切断される合成色素原基質を含有する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、リステリ属の病原性細菌の研究、単離、計数および直接同定を可能
にする培養培地ならびにこの培地を用いる方法に関する。
【０００２】 細菌リステリア・モノサイトジェネス（Listeria monocytogenes）の単離およ
び同定は、農食物衛生学および医学的細菌学のモニターにおける主要な問題であ
る。リステリア属細菌の中で、種モノサイトジェネスのみがヒトに病原性である
ことが知られている。リステリアの他の種は病原性でないか、または動物のみに
病原性である。これは特にリステリア・イヴァノヴィ（Listeria ivanovii）の 場合にそうである。さらに、バクテリオシンを使用することによってリステリア
・モノサイトジェネスの増殖を阻害することが可能であることが知られている。
例えば、特許出願ＥＰ ３２６ ０６２は、ペディオコッカス・アシディラクテ
ィシ（Pediococcus acidilactici）起源のバクテリオシンを用いるリステリア・
モノサイトジェネスの阻害法を記載している。
【０００３】 リステリア．モノサイトジェネスによる汚染経路は、しばしば食物起源である
。従って、農食物経路の端から端まで（原料から製造施設の環境を通過して消費
が意図される完成品まで）をリステリア・モノサイトジェネスの検出に供するこ
とが必要である。
【０００４】 ヒトにおける細菌状態の診断状況においては、リステリア・モノサイトジェネ
スを、病原体でないリステリア属の他の細菌の中から識別することも同様に重要
である。
【０００５】 リステリア種の検出および単離は、従来、選択培養培地を使用して実施されて
いる。Ｏｘｆｏｒｄ（Ｃｕｒｔｉｓら， Ｌｅｔｔ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ． （１９８９）， ８， ８５−９８頁）およびＰａｌｃａｍ（Ｖａ
ｎ Ｎｅｔｔｅｎら， Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． （１９８８）
， ６， １８７−１８８頁）選択培地が現在最も使用されている。これらの培
地は、リステリア属の全ての種の検出を可能にする。従って、モノサイトジェネ
ス種の所属を確立するためには、観察された代表的なコロニーを、補助的同定（
顕微鏡試験および／または生化学的試験および／または免疫学的試験および／ま
たは遺伝学的試験）に供しなければならない。しかし、リステリア・モノサイト
ジェネスの同定に必要な補助的操作は分析の長さおよび費用を増加させる。これ
らの操作は、多数の試薬および適格人員の使用を必要とする。さらに、同定に供
されるコロニーの回収は不確かであり、補助的操作はしばしば間違いのもとであ
るか、または少なくともより低い正確さおよび信頼性の原因である。これは特に
単離培地上のリステリア・モノサイトジェネスのコロニーが、リステリアの他の
種によって形成されるコロニーに比較して非常に少ない場合にそうである。
【０００６】 特許出願ＥＰ ４９６ ６８０は、リステリア・モノサイトジェネスをリステ
リア属の他の細菌から識別する細菌学的分析法を記載している。
【０００７】 この方法によれば、グリシンアミノペプチダーゼによって加水分解され得る色
素原基質または蛍光原基質を含む同定培地を使用する。使用する培地に、その化
学的変換によって分析しようとする試料中に存在するリステリア種の特徴付けを
可能にする発酵基質および／または還元可能基質および／または酵素的に加水分
解可能な基質（α−マンノシダーゼの基質のような）を含有させることも可能で
ある。
【０００８】 さらに、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩＰＬＣ）
の特異的ホスファチジルイノシトール活性を示すことによって、リステリアの病
原性種であるリステリア・モノサイトジェネスおよびリステリア・イヴァノヴィ
を、他のリステリアから識別することも可能であることが知られている。
【０００９】 事実、ＰＩＰＬＣが、リステリア属の病原性種（リステリア・モノサイトジェ
ネスおよびリステリア・イヴァノヴィのような）の培養培地中に分泌されている
ことが示されている（Ｌｅｉｍｅｉｓｔｅｒ−Ｗａｃｈｔｅｒら， Ｍｏｌ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． （１９９１） ５（２）， ３６１−３６６頁； Ｊ．
Ｍｅｎｇａｕｄら， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． （１９９１） ５（
２）， ３６７−３７２頁、およびＧｏｌｄｆｉｎｅら， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ （１９９２） ６０（１０）， ４０５９−４０
６７頁）。これら２つの病原性種を間接的方法によって同定することが可能であ
ることも知られている（Ｎｏｔｅｒｍａｎｓら， Ａｐｐ． ａｎｄ Ｅｎｖ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （１９９１）， 第５７巻 第９号， ２６６６
−２６７０頁）。Ｎｏｔｅｒｍａｎｓらによって提唱された方法によれば、試験
しようとするリステリアの株（事前に単離されている）を、ＴＹ（トリプトン酵
母エキス）寒天の表面上にスポットとして接種する。２４〜４８時間３７℃でイ
ンキュベートした後、第２の寒天層をペトリ皿に注ぐ。この第２の層は、アガロ
ース、クロラムフェニコールおよびＬ−α−ホスファチジルイノシトール（ＰＩ
ＰＬＣの天然基質）を含有する。次いでディッシュを再度３７℃でインキュベー
トし、５日間観察する。従って、この方法は、株の単離、寒天上へのスポットと
しての接種およびＰＩＰＬＣ基質を含有する寒天の第２の層の分配のようないく
つかの工程を必要とする。さらに、この方法によって、ヒトに病原性であるリス
テリア・モノサイトジェネス細菌を、上記で示したようにヒトに病原性でないリ
ステリア・イヴァノヴィ細菌から識別することはできない。
【００１０】 本発明の主題は、単一工程でのリステリア属の病原性細菌の同定を可能にする
培地である。
【００１１】 より詳細には、本発明は、リステリ属の病原性種の研究、単離、計数および直
接同定を可能にする特異的培養培地に関し、この培地はＰＩＰＬＣによって特異
的に切断される合成色素原基質、詳細には５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リルホスファチジルミオイノシトールを含有する。この色素原基質は、好ましく
は塩形態、例えば、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウム塩形態で使用され
る。塩の中でアンモニウム５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルミオイノシ
トール−１−イルホスフェートが好ましい。
【００１２】 本発明による培地は、一方で着色コロニーを形成するリステリア・モノサイト
ジェネスおよびリステリア・イヴァノヴィ、ならびに他方でコロニーが着色しな
いリステリアの他の種の間の直接的な区別を可能にする。
【００１３】 本発明の好ましい実施方法によれば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ルホスファチジルミオイノシトールを使用することによって、青色コロニーを形
成する種リステリア・モノサイトジェネスおよびリステリア・イヴァノヴィの検
出が可能になり、リステリアの他の種は着色しないままである。
【００１４】 優先的には、本発明による栄養寒天培養培地は、遊離形態または塩形態の５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールを１００
〜５００ｍｇ／ｌの濃度、好ましくは１５０〜３００ｍｇ／ｌの濃度で含有する
。
【００１５】 本発明において使用する栄養寒天培養培地は、リステリア種の増殖を可能にし
なければならない。例えば、ペプチド、デンプン、塩化ナトリウムおよび寒天か
ら作製され、当業者に周知のＣｏｌｕｍｂｉａ寒天を使用することが可能である
。
【００１６】 本発明は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノ
シトールまたはその塩の１つの、リステリア属の病原性種、詳細には細菌リステ
リア・モノサイトジェネスの研究、単離、計数および直接同定を可能にする特異
的培養培地の製造のための使用にも関する。
【００１７】 驚くべきことに、血液またはその誘導体（例えば、血漿または血清のような）
を培養培地に添加することによって、非常に明確な色を有する陽性ＰＩＰＬＣコ
ロニーを得ることが可能になることも見出された。
【００１８】 本発明は、リステリア属の病原性種、詳細には細菌リステリア・モノサイトジ
ェネスの研究、単離、計数および直接同定を可能にする特異的栄養寒天培養培地
にも関し、この培地は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジル
ミオイノシトールまたはその塩の１つおよび血液またはその誘導体の１つ（好ま
しくは血清）を含有する。
【００１９】 本発明による培地における血液またはその成分の割合は、培養培地１リットル
当り２０〜８０ｍｌ、より特定すると４０〜６０ｍｌ、好ましくは５０ｍｌであ
り得る。１００〜２００ｍｇ／ｍｌの濃度の５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリルホスファチジルミオイノシトールまたはその塩の１つおよび１リットルの
培地当り４０〜６０ｍｌの割合の血清を含有する培養培地が好ましい。
【００２０】 カオリンまたはシリカのような粉状薬剤の培養培地への添加は、ＰＩＰＬＣの
コロニーの培養物の陽性着色の増感に寄与し、従って試験の判断をより容易にす
る。
【００２１】 好ましくは、粉状薬剤を、血清を用いて作製された培養培地に添加する。
【００２２】 ＰＩＰＬＣによって特異的に切断される合成色素原基質としての５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールまたはその塩の１
つ、血清および粉状薬剤（カオリンまたはシリカのような）を含有する、本発明
による栄養寒天培養培地も本発明の一部である。
【００２３】 栄養寒天培養培地における粉状薬剤の濃度は使用する薬剤の性質に依存し、５
〜３０ｇ／ｌ、好ましくは１５〜２５ｇ／ｌで変動し得る。
【００２４】 本発明によれば、培養培地は、リステリア・イヴァノヴィによっては代謝され
得るが、リステリア・モノサイトジェネスによっては代謝され得ない炭水化物（
例えばキシロースのような）も含有し得る。そのような炭水化物を５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールまたはその塩の１
つを含有する培養培地へ添加すると、一方で純粋な青色のコロニーを形成するリ
ステリア・モノサイトジェネス、および他方で薄い青色から緑色のコロニーを形
成するリステリア・イヴァノヴィ、ならびに最後にコロニーが着色しないリステ
リアの他の種の間の区別が可能になる。リアステリア・モノサイトジェネスによ
って代謝されるいくつかの炭水化物は、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（第６版 − １９９５）ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ Ｗ
ａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ． ３４３−３４４頁に記載されている。
【００２５】 本発明は、リステリア・モノサイトジェネスの研究、単離、計数および直接同
定を可能にする特異的栄養寒天培養培地にも関し、この培地はＰＩＰＬＣによっ
て特異的に切断される合成色素原基質としての５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドリルホスファチジルミオイノシトールまたはその塩の１つ、血液誘導体（好
ましくは血清）、粉状薬剤（カオリンまたはシリカのような）およびリステリア
・イヴァノヴィによっては代謝または発酵され得るが、リステリア・モノサイト
ジェネスによっては代謝または発酵され得ない炭水化物（好ましくはキシロース
）を含有する。
【００２６】 培養培地におけるリステリア・イヴァノヴィによっては代謝され得るが、リス
テリア・モノサイトジェネスによっては代謝され得ない炭水化物の濃度は５〜１
５ｇ／ｌの間で変動し得、もちろん使用する炭水化物に依存する。
【００２７】 本発明による培養培地は、ｐＨ指示薬も含有し得る。ｐＨ指示薬としては、微
生物学において現在使用されているもの（例えば、アリザリンスルホン酸、メチ
ルレッド、クロロフェノールレッド、リトマス、ブロモクレゾールパープル、ブ
ロモフェノールレッド、ブロモキシレノールブルー、アリザリン、ブロモチモー
ルブルー、フェノールレッドなど）に言及することが可能である。もちろん、ｐ
Ｈ指示薬は調整した濃度で培養培地において使用しなければならない。後者は指
示薬の性質に依存し、５０〜３００ｍｇ／ｌで変動し得る。異なるｐＨ指示薬の
中で、フェノールレッドを使用することが好ましい。この指示薬は、リステリア
・モノサイトジェネスとリステリア・イヴァノヴィとの間の区別をさらに改善す
る。培地が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシ
トールまたはその塩の１つを含有する場合、コロニーはそれぞれ、リステリア・
モノサイトジェネスについては指示薬の変色なしに純粋な青色であり、リステリ
ア・イヴァノヴィについては薄い青色で黄色円に囲まれ、この現象は指示薬の変
色に関連する。
【００２８】 本発明によれば、好ましい培地は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホ
スファチジルミオイノシトールまたはその塩の１つ、血液誘導体（好ましくは血
清）、粉状薬剤（カオリンまたはシリカのような）、リステリア・イヴァノヴィ
によっては代謝され得るが、リステリア・モノサイトジェネスによっては代謝さ
れ得ない炭水化物（好ましくはキシロース）およびｐＨ指示薬（フェノールレッ
ドのような）を含有する栄養寒天培養培地である。
【００２９】 他方、ＰＩＰＬＣ活性はリステリア・モノサイトジェネスおよびリステリア・
イヴァノヴィに排他的に存在するのではない。この酵素活性は特に、バチルス（
Bacillus）（Ｇｒｉｆｆｉｔｈら， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． （１
９９１） １９７， ４９３−５０２頁）およびクロストリディウム（Clostrid
ium）（Ｔａｇｕｃｈｉら， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ ． （１９７８）， １８６， １９６−２０１頁）の特定の種において見出さ
れる。さらに、培養培地上での顕著な雑菌叢（細菌または酵母）の発達は、競合
現象によって、リステリア・モノサイトジェネスの検出に有害であり得る。従っ
て、偽陽性（リステリア・モノサイトジェネス以外の細菌によって形成される青
色コロニー）または偽陰性（他の汚染物の顕著な発達によるリステリア・モノサ
イトジェネスのコロニーの青色着色のマスキング）の危険性を排除するためには
、妨害微生物の増殖を阻害することが望ましい。これらの現象を回避するために
は、リステリア種がさほど感受性ではないかまたは非感受性である抗菌剤および
／または抗真菌剤を用いて培養培地を作製することが推奨される。これらの薬剤
を単独でか、または組合せて使用することができる。これらの薬剤の中で、例え
ば、塩化リチウム、塩酸アクリフラビン、ナリジクス酸、ポリミキシンＢ、セフ
ォタン、硫酸コリスチン、ホスホマイシン、セフタジジム、モキサラクタム、シ
クロヘキシミドおよびアムホテリシンＢに言及することが可能である。
【００３０】 ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールま
たはその塩の１つ、血液誘導体（好ましくは血清）、粉状薬剤（カオリンまたは
シリカのような）、リステリア・イヴァノヴィによっては代謝され得るが、リス
テリア・モノサイトジェネスによっては代謝され得ない炭水化物（好ましくはキ
シロース）、ｐＨ指示薬（特にフェノールレッドのような）および抗菌剤または
抗真菌剤を含有する栄養寒天培養培地も本発明の一部である。
【００３１】 本発明は、リステリア属の病原性細菌の同定方法にも関する。この方法は： − リステリア属の病原性細菌を含有しそうな試料を、ＰＩＰＬＣ特異的色素原
基質を含有する寒天培養培地上に接種する工程、 − 上記試料を接種した培養培地をインキュベートする工程、および − 基質の特徴的着色によってリステリア属の病原性細菌の存在を決定する工程
を包含する。リステリア属の病原性細菌を含有しそうな試料を、粗形態で接種す
るか、または上記で定義するような培養培地上に接種する前に事前に希釈するか
または事前に濃縮する。
【００３２】 本発明の好ましい実施態様によれば、試験しようとする粗試料を培養する。こ
の試料を栄養寒天培養培地上で、希釈するか、または１つ以上の濃度相に供して
おく。この栄養寒天培養培地は、ＰＩＰＬＣによって特異的に切断される合成色
素原基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシ
トールまたはその塩の１つ）、血液誘導体（血清のような）、粉状薬剤（カオリ
ンまたはシリカのような）、リステリア・イヴァノヴィによっては代謝され得る
が、リステリア・モノサイトジェネスによっては代謝され得ない炭水化物（好ま
しくはキシロース）、場合によってはｐＨ指示薬（特にフェノールレッドのよう
な）および抗菌剤または抗真菌剤を含有する。リステリア・モノサイトジェネス
の存在は、そのコロニーの特徴的な着色によって決定される。
【００３３】 下記の実施例は本発明を例示するためのものであって、本発明を限定するもの
ではない。
【００３４】実施例１ ：リステリア病原体、他のリステリア種および妨害物質の間の識別 培養培地の製造培地１：基本培地 ・Ｃｏｌｕｍｂｉａ寒天 ３９ｇ／ｌ ・塩化リチウム １０ｇ／ｌ ・セフタジジム* ２０ｍｇ／ｌ ・モキサラクタム* ２０ｍｇ／ｌ ・ポリミキシンＢ* ２０ｍｇ／ｌ ：アムホテリシンＢ* ３ｍｇ／ｌ* ：熱感受性成分
【００３５】 培地２：基本培地＋５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミ
オイノシトール この培地のｇ／ｌでの組成は培地１の組成と同一であるが、培地２はさらに３
００ｍｇ／ｌのアンモニウム塩形態の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
ホスファチジルミオイノシトール（Ｂ−７４０４ ５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリルミオイノシトール−１−イルホスフェートアンモニウム塩、Ｂｉｏ
ｓｙｎｔｈ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含有する。
【００３６】 各培地の製造を以下のように実施する： − 非熱感受性成分を浸透水中に溶解する。 − 混合物を加熱して沸騰させる。 − 必要であれば、ｐＨを７．３＋／−０．２に調整する。 − ９５ｍｌ／フラスコの割合でフラスコ中に分配する。 − フラスコを１２０℃で１５分間オートクレーブにかける。 − 寒天を約４７℃に冷却した後、滅菌溶液中の熱感受性成分を添加する。 −オートクレーブにかけた培地を滅菌ペトリ皿（直径９０ｍｍ）に１５〜２０ｍ
ｌ／ディッシュの割合で分配する。
【００３７】 試験株 試験した株は以下のとおりである：リステリア種 ： リステリア・モノサイトジェネス リステリア・イヴァノヴィ リステリア・イノキュア（Listeria innocua） リステリア・シーリゲリ（Listeria seeligeri） リステリア・ウェルシメリ（Listeria welshimeri）妨害物質 ： バチルス・セレウス（Bacillus cereus） スタフィロコッカス・オーレウス（Staphylococcus aureus） キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）
【００３８】 培養−インキュベーション−読み取り 株をトリプト−カゼイン−ソヤ（Trypto-Caseine-Soja）ブロス中で継代培養 し、次いで３７℃でインキュベートする。 １８時間インキュベートした後、ブロスを「トリプトン塩」希釈剤（１／１０
０のトリプトンペプトンおよび８．５／１０００の塩化ナトリウムから作製する
）中で希釈し；１０6〜１０7細胞／ｍｌの懸濁物を得る。
【００３９】 各懸濁物について、１μｌの滅菌ループ、培地１のディッシュおよび培地２の
ディッシュを用いる単離によって接種を実施する。ディッシュを３７℃でインキ
ュベートする。２４時間および４８時間インキュベートした後、ディッシュを読
み取る。読み取りは、各々の培地において各々の株によって形成されるコロニー
の色の観察からなる。得られた結果を表Ｉに示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】 培地２は、病原性および非病原性リステリア種の識別を可能にする。さらに、
選択補助物は、細菌バチルス・セレウスおよびスタフィロコッカス・オーレウス
（培養培地において潜在的に偽陽性）の阻害を可能にする。
【００４２】実施例２ ：病原性リステリア種と他のリステリア種との間の識別 培養培地の製造 培地２：基本培地＋５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミ
オイノシトール 培地２は実施例１に記載のとおりである。 培地３：基本培地＋５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミ
オイノシトール 培地３の組成は上記の培地２の組成と同一であるが、この培地は３００ｍｇ／
ｌ（培地２）ではなく、１５０ｍｇ／ｌのアンモニウム塩形態の５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールを含有する。 培地４：基本培地＋５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミ
オイノシトール＋血液 培地４の組成は培地３の組成と同一であるが、この培地はさらに５０ｍｌ／ｌ
のウマ血液を含有する。培地の製造のために、血液を熱感受性成分として扱う。
培地５：基本培地＋５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミ
オイノシトール＋血清 培地５の組成は培地４の組成と同一であるが、この培地は血液ではなく５０ｍ
ｌ／ｌのウマ血清を含有する。 培地６：基本培地＋５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミ
オイノシトール＋血清＋シリカ 培地６の組成は培地５の組成と同一であるが、この培地はさらに２０ｇ／ｌの
シリカ（非熱感受性成分）を含有する。 各培地の製造を実施例１に記載のように実施する。
【００４３】 試験株 試験した株は以下のとおりである：リステリア種 ： リステリア・モノサイトジェネス リステリア・イヴァノヴィ リステリア・イノキュア リステリア・シーリゲリ リステリア・ウェルシメリ
【００４４】 培養−インキュベーション−読み取り 培養、インキュベーションおよび読み取りについては、方法は実施例１に記載
のとおりであった。得られた結果を表ＩＩに示す。
【００４５】
【表２】
【００４６】 表ＩＩの結果は、試験の特定の正確な読み取りを実施するためには、すなわち
病原性リステリア種と非病原性リステリアとの間の良好な区別を得るためには、
血液、血清または血清とシリカとの混合物を用いて培養培地を作製することが望
ましいことを示す。培地への血液、血清または血清とシリカとの混合物の添加は
、陽性ＰＩＰＬＣコロニーの青色着色を強力に増感し、従って培養培地における
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールの濃
度の非常に有意な低下を可能にする。
【００４７】実施例３ ：リステリア・モノサイトジェネスと他のリステリア種（リステリア・
イヴァノヴィを含む）との間の識別 培養培地の製造 培地６：基本培地＋５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミ
オイノシトール＋血清＋シリカ 培地６は実施例２に記載のとおりである。 培地７：基本培地＋５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミ
オイノシトール＋血清＋シリカ＋キシロース 培地７の組成はこの実施例に記載の培地６の組成と同一であるが、この培地は
さらに１０ｇ／ｌのキシロース（培地の製造のために熱感受性成分であるとみな
される成分）を含有する。 培地８：基本培地＋５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミ
オイノシトール＋血清＋シリカ＋キシロース＋フェノールレッド 培地８の組成は上記の培地７の組成と同一であるが、この培地はさらに８０ｍ
ｇ／ｌのフェノールレッド（非熱感受性成分）を含有する。 各培地の製造を実施例１に記載のように実施する。
【００４８】 試験株 試験した株は以下のとおりである：リステリア種 ： リステリア・モノサイトジェネス リステリア・イヴァノヴィ リステリア・イノキュア リステリア・シーリゲリ
【００４９】 培養−インキュベーション−読み取り 培養、インキュベーションおよび読み取りについては、方法は実施例１に記載
のとおりであった。得られた結果を表ＩＩＩに示す。
【００５０】
【表３】
【００５１】 （−）：着色指示薬の変色なし。寒天はコロニー周囲で赤のまま（−キシロース
株）。 （＋）：着色指示薬変色。コロニー周囲で黄色円（＋キシロース株）。
【００５２】 表ＩＩＩの結果は、好ましくはフェノールレッドと組合せてキシロースを培養
培地に添加することによって、リステリア・モノサイトジェネスとリステリアの
全ての他の種（特にリステリア・イヴァノヴィ）との間の区別が可能になったこ
とを示す。
【００５３】実施例４ ：本発明による方法の実施 Ｌｉｓｔｅｒｉａ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
Ｐａｓｔｅｕｒ Ｐａｒｉｓ）から供給されるリステリア属２１４株を培地８上
で試験した。
【００５４】 以下の種に対応する株を使用した： リステリア・イノキュア１２株 リステリア・シーリゲリ１０株 リステリア・ウェルシメリ１０株 リステリア・イヴァノヴィ１０株 リステリア・グレイ（Listeria grayi）１株 リステリア・モノサイトジェネス１７１株
【００５５】 培養、インキュベーションおよび読み取りについては、方法は実施例１に記載
のとおりであった。
【００５６】 リステリア・モノサイトジェネスの全ての株が同定され、リステリア・イヴァ
ノヴィの全ての株が同定され、偽陽性の結果は同定されなかった。
【００５７】 この実験は、本発明による方法の特異性および信頼性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B063 QA07 QA18 QQ06 QR58 QR66 QR69 QR75 QR82 QS08 QS36 QX01 4B065 AA01X BB15 BB25 BB37 BC36 BC47 BD22 BD32 CA46

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 リステリア属の病原性細菌の直接同定を可能にする栄養寒天
    培養培地であって、該培地はホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼ
    Ｃ（ＰＩＰＬＣ）によって特異的に切断される合成色素原基質を含有する培養培
    地。
  2. 【請求項２】 色素原基質が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホス
    ファチジルミオイノシトールまたはその塩の１つである、請求項１記載の培養培
    地。
  3. 【請求項３】５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオ
    イノシトールまたはその塩の１つが１００〜５００ｍｇ／ｌの濃度、好ましくは
    １５０〜３００ｍｇ／ｌの濃度である、請求項２記載の培養培地。
  4. 【請求項４】 血液またはその誘導体の１つ、好ましくは血清をさらに含有
    する、請求項１〜３のいずれか１項記載の培養培地。
  5. 【請求項５】 血液またはその誘導体の割合が培養培地１リットル当り２０
    〜８０ｍｌ、より特定すると４０〜６０ｍｌ、好ましくは５０ｍｌである、請求
    項４記載の培養培地。
  6. 【請求項６】 カオリンまたはシリカのような粉状薬剤をさらに含有する、
    請求項１〜５のいずれか１項記載の培養培地。
  7. 【請求項７】 粉状薬剤の濃度が５〜３０ｇ／ｌ、好ましくは１５〜２５ｇ
    ／ｌである、請求項６記載の培養培地。
  8. 【請求項８】 リステリア・イヴァノヴィによっては代謝され得るが、リス
    テリア・モノサイトジェネスによっては代謝され得ない炭水化物をさらに含有す
    る、請求項１〜７のいずれか１項記載の培養培地。
  9. 【請求項９】 リステリア・イヴァノヴィによっては代謝され得るが、リス
    テリア・モノサイトジェネスによっては代謝され得ない炭水化物がキシロースで
    ある、請求項８記載の培養培地。
  10. 【請求項１０】 炭水化物の濃度が５〜１５ｇ／ｌである、請求項８または
    ９記載の培養培地。
  11. 【請求項１１】 ｐＨ指示薬、好ましくはフェノールレッドをさらに含有す
    る、請求項１〜１０のいずれか１項記載の培養培地。
  12. 【請求項１２】 ｐＨ指示薬の濃度が５０〜３００ｍｇ／ｌである、請求項
    １１記載の培養培地。
  13. 【請求項１３】 好ましくは塩化リチウム、塩酸アクリフラビン、ナリジク
    ス酸、ポリミキシンＢ、セフォタン、硫酸コリスチン、ホスホマイシン、セフタ
    ジジム、モキサラクタム、シクロヘキシミドおよびアムホテリシンＢの中から選
    択される１つ以上の抗菌剤および／または抗真菌剤をさらに含有する、請求項１
    〜１２のいずれか１項記載の培養培地。
  14. 【請求項１４】 リステリア属の病原性細菌の同定方法であって： − リステリア属の病原性細菌を含有しそうな試料を、請求項１〜１３のいずれ
    か１項記載のＰＩＰＬＣ特異的色素原基質を含有する寒天培養培地上に接種する
    工程、 − 該試料を接種した培養培地をインキュベートする工程、および − 基質の特徴的着色によってリステリア属の病原性細菌の存在を決定する工程
    を包含する方法。
  15. 【請求項１５】 病原性細菌を含有しそうな試料を請求項１〜１３のいずれ
    か１項記載の培養培地上に接種する前に事前に濃縮する、請求項１４記載の方法
    。
  16. 【請求項１６】 ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジル
    ミオイノシトールまたはその塩の１つの、リステリア細菌の研究、単離、計数お
    よび直接同定を可能にする寒天培養培地の製造のための使用。
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