CN105349611B - 食品和餐饮具中单增李斯特菌快速检测冷水凝胶试纸片及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种食品和餐饮具中单增李斯特菌快速检测冷水凝胶试纸片及其制备方法与应用，属于微生物安全检验检测技术领域。本发明利用冷水凝胶以层析滤纸为载体，将培养基成分、显色剂和冷水凝胶混合，均匀地负载到层析滤纸上，样品可均匀分布于冷水凝胶，在其表面形成鲜明的菌落特征，使单增李斯特菌实现快速准确定性、定量检测。且本专利以新型化合物(2R,3S,4R,5R,6R)‑1,2,3,4,5‑五羟基环己基‑(2‑硝基‑4‑氟苯基)磷酸酯为显色剂，与传统单增李斯特菌显色培养基相比较，其反应的灵敏度和特异性大大优于传统培养基，且耐辐照，化学稳定性更强。另外，本发明制得的试纸片成本低廉，操作方法简便，简化到一步法即可完成，且检测时间只需24～36h。

Description

食品和餐饮具中单增李斯特菌快速检测冷水凝胶试纸片及其 制备方法与应用

技术领域

本发明属于微生物安全检验检测技术领域，具体涉及一种快速检测纸片，更具体地说，本发明涉及一种专门用于食品和餐饮具中快速检测单增李斯特菌的定性和定量检测的冷水凝胶试纸片及其制备方法与应用。

背景技术

单增李斯特菌分布较广，单增李斯特菌是唯一能引起人类疾病的。单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种常见的土壤细菌，在土壤中它是一种腐生菌，以死亡的和正在腐烂的有机物为食。它也是某些食物(主要是鲜奶产品)中的一种污染物，能引起严重食物中毒。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。单增李斯特菌是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。我国已将其纳入“国家标准”。国标方法检测单增李斯特菌需要配制新鲜培养基，操作方法繁琐，成本较高，检测时间长，达不到快速一步法检测。因此，业内一直希望能有一种经济、简便、易行、快速、准确的方法和产品。

纸片法是上世纪80年代发展起来的一种快速检测食品及食品接触的物体表面、餐具、茶具中单增李斯特菌污染情况的方法。目前，国内外对单增李斯特菌检测研究较多，基于分子生物学检测方法，如PCR方法、LAMP法等；基于胶体金检测法；基于ELISA检测法；特异性显色培养法等。但上述方法需要特殊的检测设备，不便于日常现场快速检测需求。申请号为201510274726.9的专利申请公开了一种“快速检测单增李斯特菌的检测试纸及其制备和应用”，该检测试纸整体呈矩形，包括加样区，底物区及显色区三个功能区，相邻两区之间设置着流体通道，在底物区边界中设置着含有底物5-溴-4-氯-3-吲羟肌醇磷酸铵X-InP的底物层，但是该现有技术中公开的检测试纸主要用于饮用水、肉食品、乳制品、蔬菜中单增李斯特菌污染的定性检测，不能用于餐饮具表面单增李斯特菌的检测，且该检测试纸只能进行定性检测，无法满足定量检测需求。

发明内容

为了克服背景技术中所指出的问题及现有技术存在的已有检测产品和检测方法的不足，本发明的第一个目的在于提供一种专用于食品和餐饮具中快速检测单增李斯特菌并可定性、定量分析的冷水凝胶试纸片。该试纸片不仅适合于多种食品中单增李斯特菌的检测，也可用于餐饮具中单增李斯特菌的快速检测。且该试纸片检测方法操作简便易行、快速准确(一步法)，特异性强，敏感性高，成本低廉，便于基层单位特别是边沿地区及条件差的基层试验室使用。另外，本发明还提供了一种上述所述冷水凝胶试纸片的制备方法与应用。

为了实现本发明的第一个目的，发明人通过大量试验研究和不懈探索，最终获得了如下技术方案：

一种单增李斯特菌快速检测冷水凝胶试纸片，所述试纸片中含有混合培养基，所述混合培养基由基础培养基、显色剂和冷水凝胶组成，所述显色剂的名称为(2R,3S,4R,5R,6R)-1，2，3，4，5-五羟基环己基-(2-硝基-4-氟苯基)磷酸酯，分子量为398，所述显色剂的结构式如式一所示：

进一步地，上述技术方案中所述的显色剂(2R,3S,4R,5R,6R)-1，2，3，4，5-五羟基环己基-(2-硝基-4-氟苯基)磷酸酯采用如下方法制备而成，包括如下步骤：

(1)将反应物A溶于无水二异丙胺及少量无水氯仿中，得到反应物A体系，然后将所述反应物A体系置于-70～-80℃条件下冷冻；

(2)在低温-70～-80℃低温条件下，将反应物B在无水、氮气氛围中逐滴加入到反应物A体系中，剧烈搅拌，反应5.5～6.5h；

(3)将步骤(2)反应后的体系置于室温环境中，待反应体系达到室温后，继续向体系中加入溶有反应物C的无水氯仿溶液，室温继续搅拌反应12～14h，生成亚磷酸酯类物质；

(4)在步骤(3)反应后的体系中加入叔丁基过氧化氢，将亚磷酸盐氧化，并将得到的磷酸盐置于三甲胺中，在50±0.5℃条件下放置22～24h；

(5)除去三甲胺，得到粗产物后，再加入乙硫醇和三氟化硼-醚溶液进行去保护反应，最终得到的目标产物即为所述显色剂，其中，所述反应物A为1，2，3，4，5，6-六甲氧基亚甲基-肌醇，反应物B为二氯亚磷酸甲酯，反应物C为2-硝基-4-氟苯酚。

进一步地，上述技术方案中所述反应物A、反应物B、反应物C的用量摩尔比为1:1.25:2。

进一步地，上述技术方案步骤(1)中所述反应物A与无水二异丙胺的用量摩尔比为1:2.5。

上述所述显色剂在制备过程中发生的化学反应方程式如式二所示：

式二

进一步地，上述技术方案中所述基础培养基由胰蛋白胨、牛肉粉、多价胨、氯化纳、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、甘氨酸、氯化锂、苯乙醇、七叶苷组成；所述冷水凝胶由聚丙烯酸钠、黄原胶和海藻糖组成。

进一步地，上述技术方案中每升所述混合培养基中含有胰蛋白胨5.0～6.0g、牛肉粉5.0～6.0g、多价胨3.0～5.0g、氯化纳8.0～10.0g、磷酸二氢钾1.0～1.5g、磷酸氢二钠5.0～7.0g、甘氨酸8.0～10.0g、氯化锂1.0～2.0g、苯乙醇2.0～3.0g、七叶苷1.0～1.5g；显色剂(2R,3S,4R,5R,6R)-1，2，3，4，5-五羟基环己基-(2-硝基-4-氟苯基)磷酸酯2.0～2.5g；聚丙烯酸钠4.0～6.0g、黄原胶1.0～3.0g、海藻糖2.0～4.0g。

本发明的另一目的在于提供一种上述所述单增李斯特菌快速检测冷水凝胶试纸片制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)载体纸片制备：将层析滤纸剪切成5cm×5cm规格，经辐照或高压灭菌，高压灭菌后于50℃恒温真空干燥后备用；

(2)内包装袋：将耐高温的聚丙烯塑料薄膜袋，按试验要求压合成5.2cm×5.2cm规格的联袋；

(3)基础培养基配制：每升混合培养基中含有胰蛋白胨5.0～6.0g、牛肉粉5.0～6.0g、多价胨3.0～5.0g、氯化纳8.0～10.0g、磷酸二氢钾1.0～1.5g、磷酸氢二钠5.0～7.0g、甘氨酸8.0～10.0g、氯化锂1.0～2.0g、苯乙醇2.0～3.0g、七叶苷1.0～1.5g；

(4)每升培养基中含有显色剂(2R,3S,4R,5R,6R)-1,2,3,4,5-五羟基环己基-(2-硝基-4-氟苯基)磷酸酯2.0～2.5g；

(5)冷水凝胶配制：0.4～0.6％聚丙烯酸钠、0.1～0.3％黄原胶和0.2～0.4％海藻糖，所述百分比均为质量体积百分比；

(6)混合培养基配制：将基础培养基、显色剂和冷水凝胶混合均匀，加去离子水定容至1000ml，于115℃、高压条件下灭菌15min，调节pH至7.2～7.4；

(7)试纸片制作：将灭菌载体纸片依次放入灭菌的烧杯中，加入40℃～45℃的混合培养基使之淹没纸片，浸泡8～10min，使培养基充分吸附于纸片，摆放于无菌不锈钢丝网上，45℃恒温真空干燥；

(8)试纸片包装：将浸渍烘干的纸片，无菌操作装入无菌的塑膜袋内，其中5cm×5cm的纸片，每袋1张，再装入铝铀袋，封口后室温以下保存备用。

本发明的还一目的在于提供上述所述的单增李斯特菌快速检测冷水凝胶纸片的应用。

如上所述的一种单增李斯特菌快速检测冷水凝胶纸片，所述试纸片可同时适用于食品和餐饮具中单增李斯特菌的定量、定性检测。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明适用于食品和餐饮具中单增李斯特菌定量和定性检测分析，本发明利用冷水凝胶以层析滤纸为载体，将培养基成分、显色剂和冷水凝胶混合，均匀地负载到层析滤纸上，样品可均匀分布于冷水凝胶，在其表面形成鲜明的菌落特征，使单增李斯特菌的检测达到快速准确定量，可以用于单增李斯特菌菌落的计数，用于定量分析；

2、本发明适用于食品和餐饮具中单增李斯特菌快速检测，目前现有技术只有适用于食品或餐饮具的单增李斯特菌快速检测试纸，没有同时适合食品和餐饮具的单增李斯特菌快速检测试纸，而且本发明的试纸片敏感性高、特异性强、结果准确；

3、本发明检测试纸片成本低廉，操作方法简便，检测时间只需24～36h，比国标方法缩短了2～3天，简化到一步法即可完成，一般人员都能掌握操作；

4、本发明显色培养基是一类利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物的新型培养基，利用显色培养基进行微生物的筛选分离，其反应的灵敏度和特异性大大优于传统培养基；本专利以新型化合物(2R,3S,4R,5R,6R)-1,2,3,4,5-五羟基环己基-(2-硝基-4-氟苯基)磷酸酯为显色剂，与传统常用单增李斯特菌显色培养基相比较，其化学稳定性更强，耐辐照，试纸片在常温下保质期为1年时间；

5、本发明的胰蛋白胨、牛肉粉、多价胨提供氮源和甘氨酸、氯化钠等维持渗透压，冷水凝胶作为凝固剂，氯化锂抑制革兰氏阴性菌生长，抑菌剂抑制除单增李斯特菌外的革兰氏阳性菌生长，本发明的海藻糖作为冷水凝胶重要组成部分，其优点明显，海藻糖具有耐热、耐酸、高保湿性、易溶于水，同时海藻糖在高温、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下能在细菌表面能形成独特的保护膜，维持细菌生长。

附图说明

图1为本发明的冷水凝胶试纸片的成品；

图2a为本发明实施例3的干扰性试验中利用冷水凝胶试纸片检测单增李斯特菌与金黄色葡萄球菌混合菌的特异性效果图；

图2b为本发明实施例3的干扰性试验中利用冷水凝胶试纸片检测单增李斯特菌与副溶血性弧菌混合菌的特异性效果图；

图2c为本发明实施例3的干扰性试验中利用冷水凝胶试纸片检测单增李斯特菌与大肠埃希氏菌混合菌的特异性效果图；

图2d为本发明实施例3的干扰性试验中利用冷水凝胶试纸片检测单增李斯特菌与沙门氏菌混合菌的特异性效果图；

图3为本发明实施例5中冷水凝胶纸片检测呈阳性时的效果图；

图4为本发明实施例5中冷水凝胶纸片检测呈阴性时的效果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围，如未特别说明，本发明所用方法为常规技术，所用试剂均购自生化商店。

实施例1

显色剂(2R,3S,4R,5R,6R)-1,2,3,4,5-五羟基环己基-(2-硝基-4-氟苯基)磷酸酯按如下方法制备而成，包括如下步骤：

(1)将1mmol反应物A(1，2，3，4，5，6-六甲氧基亚甲基-肌醇)溶于2.5mmol无水二异丙胺及少量无水氯仿中，得到反应物A体系，然后将所述反应物A体系置于-70℃条件下冷冻；

(2)在低温-70℃条件下，将1.25mmol反应物B(二氯亚磷酸甲酯)在无水、氮气氛围中逐滴加入到反应物A体系中，剧烈搅拌，反应6h；

(3)将步骤(2)反应后的体系置于室温环境中，待反应体系达到室温后，继续向体系中加入溶有2mmol反应物C(2-硝基-4-氟苯酚)的无水氯仿溶液，室温继续搅拌反应12h，生成亚磷酸酯类物质；

(4)在步骤(3)反应后的体系中加入2mmol叔丁基过氧化氢，将亚磷酸盐氧化，并将得到的磷酸盐置于1ml三甲胺中，50℃条件下放置24h；

(5)除去三甲胺，得到粗产物后，再加入乙硫醇1ml和三氟化硼-醚溶液100ul进行去保护反应，最终得到的目标产物即为所述显色剂，其中，所述反应物A的结构式如式三所示；反应物B的结构式如式四所示，反应物C的结构式如式五所示。

实施例2

本实施例的一种单增李斯特菌快速检测冷水凝胶试纸片的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)载体纸片制备：将层析滤纸切成5cm×5cm规格，经辐照或高压灭菌(高压后于45℃恒温真空干燥)后备用；

(2)内包装袋制备：将耐高温的聚丙烯塑料薄膜袋，按试验要求压合成5.1cm×5.1cm规格的联袋；

(3)基础培养基配制(1L)：每升培养基中含有胰蛋白胨5.0～6.0g、牛肉粉5.0～6.0g、多价胨3.0～5.0g、氯化纳8.0～10.0g、磷酸二氢钾1.0～1.5g、磷酸氢二钠5.0～7.0g、甘氨酸8.0～10.0g、氯化锂1.0～2.0g、苯乙醇2.0～3.0g、七叶苷1.0～1.5g；

(4)本发明上述实施例1制得的显色剂(2R,3S,4R,5R,6R)-1,2,3,4,5-五羟基环己基-(2-硝基-4-氟苯基)磷酸酯2.0～2.5g；

(5)冷水凝胶配制(质量体积百分比)：0.4～0.6％聚丙烯酸钠、0.1～0.3％黄原胶和0.2～0.4％海藻糖；

(6)混合培养基配制：将基础培养基、显色剂(2R,3S,4R,5R,6R)-1,2,3,4,5-五羟基环己基-(2-硝基-4-氟苯基)磷酸酯和冷水凝胶混合均匀，加去离子水定容至1000mL，于115℃、高压(1×10⁵Pa)条件下灭菌15min，调节pH至7.2～7.4；

(7)试纸片制作：将灭菌载体纸片依次放入灭菌的烧杯中，加入40～45℃的混合培养基使之淹没纸片，浸泡8～10min，使培养基充分吸附于纸片，摆放于无菌不锈钢丝网上，50℃恒温真空干燥；

(8)试纸片包装：将浸渍烘干的纸片，无菌操作装入无菌的塑膜袋内，其中5cm×5cm的纸片，每袋1张，再装入铝铀袋，封口后室温以下保存备用。

本实施例制得的冷水凝胶试纸片的成品如图1所示。

实施例3快速检测试纸片的干扰性试验

同时将大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌摇瓶过夜培养，将0.5mL菌悬液8000r/min离心5min，按照十倍稀释，稀释到一定倍数(10²cfu/mL)后，依次将0.5mL大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌菌悬液与0.5mL单增李斯特菌悬液混合，重悬于1mL无菌水中，将1mL菌悬液滴加至检测纸片上，36℃±1℃培养24～36h，观察纸片上菌落的生长情况，研究其他菌对单增李斯特菌的生长是否有干扰，设置5个平行组，试验重复3次，试验结果表明，只要混合菌液中有单增李斯特菌存在时，试纸片就会出现蓝色菌落，大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌对单增李斯特菌的检测结果不造成任何干扰，其中，单增李斯特菌与金黄色葡萄球菌的混合菌的检测结果如图2a所示，单增李斯特菌与副溶血性弧菌的混合菌的检测结果如图2b所示、单增李斯特菌与大肠杆菌的混合菌的检测结果如图2c所示，单增李斯特菌与沙门氏菌的混合菌的检测结果如图2d所示。

实施例4快速检测试纸片在餐饮具检测中的应用

(1)采样：随机抽取消毒后准备使用的各类食具(碗、盘、杯等)，取样量可根据大、中、小不同饮食行业每次采样6件～10件，每件贴纸片两张，每张纸片面积25cm²(5cm×5cm)，用无菌生理盐水湿润单增李斯特菌检测用纸片后，立即贴于食具内侧表面，30s后取下，置于无菌塑料袋内，筷子以5只为一件样品，用灭菌1mL吸管吸取无菌生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端(约5cm)抹试纸片，每件样品抹拭两张，放入无菌塑料袋内；

(2)培养：将已采样的纸片置于36℃±1℃恒温培养箱中培养24h～36h，取出观察结果；

(3)结果判断：若纸片出现蓝色菌落，则为单增李斯特菌阳性，若纸片为保持白色不变，则为阴性。

实施例5快速检测试纸片在食品检测中的应用

固体和半固体样品前处理：称取25g样品，放入盛有225mL李氏增菌液(LB₁)的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL李氏增菌液(LB₁)的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。

液体样品前处理：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL李氏增菌液(LB₁)的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液，样品匀液的pH值应在6.5～7.5，必要时用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调节。(1)样品稀释：用1mL灭菌吸管吸取1:10样品匀液，注入含有9mL稀释液的试管内，振摇试管制成1:100的样品匀液，根据对样品污染状况的估计，按上述操作，一次制成10倍递增系列稀释样品匀液，每递增稀释1次，换一支1mL无菌吸管或吸头，从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min；(2)接种：选取两个稀释度进行接种，普通食品一般采用1:10和1:100这两个稀释度，饮料采用原液和1:10两个稀释度；(3)用灭菌吸管吸取1mL 1:10样品匀液加到检测纸片上(相当于接样品1g)，吸透后平放，做3个重复，再用1mL灭菌吸管吸取1mL 1:100样品匀液加到检测纸片上(相当于接样品0.1g)，做3个重复；再另取一支1mL灭菌吸管吸取1mL 1:100样品匀液加到含有小纸片的塑料袋中(相当于接样品0.01g)，做3个重复；(4)培养：将接种好的纸片(可叠放)放入36℃±1℃培养箱中培养24～36h；(5)单增李斯特菌检测结果：若纸片出现蓝色菌落，如图3所示，则为单增李斯特菌阳性；若纸片为保持白色不变，则为阴性，如图4所示。

实施例6 快速检测试纸片保质期实验

分别以本发明上述实施例1制得的(2R,3S,4R,5R,6R)-1,2,3,4,5-五羟基环己基-(2-硝基-4-氟苯基)磷酸酯和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐作为显色剂，采用实施例2的方法制备两种试纸片，然后将两种试纸片分别在高温45℃、常温25℃和低温4℃下保存，每隔一定时间周期，分别取试纸片10片，按照实施例3的方法进行测试，测试结果判定标准：以混合菌液中有单增李斯特菌存在时试纸片出现蓝色菌落判定为试纸片合格，两种显色底物保质期试验结果如表1所示，由表1的结果可以看出显色底物(2R,3S,4R,5R,6R)-1,2,3,4,5-五羟基环己基-(2-硝基-4-氟苯基)磷酸酯较显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐化学稳定性与特异性更好。

表1两种显色底物保质期试验结果

Claims (4)

1.一种单增李斯特菌快速检测冷水凝胶试纸片，所述试纸片中含有混合培养基，其特征在于：所述混合培养基由基础培养基、显色剂和冷水凝胶组成，所述显色剂的名称为（2R,3S,4R,5R,6R)-1，2，3，4，5-五羟基环己基-（2-硝基-4-氟苯基）磷酸酯，分子量为398，所述显色剂的结构式如式一所示：

式一

所述基础培养基由胰蛋白胨、牛肉粉、多价胨、氯化纳、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、甘氨酸、氯化锂、苯乙醇、七叶苷组成；

所述冷水凝胶由聚丙烯酸钠、黄原胶和海藻糖组成；

每升所述混合培养基中含有胰蛋白胨5.0～6.0 g、牛肉粉5.0～6.0 g、多价胨3.0～5.0 g、氯化纳8.0～10.0 g、磷酸二氢钾1.0～1.5 g、磷酸氢二钠5.0～7.0 g、甘氨酸8.0～10.0 g、氯化锂1.0～2.0 g、苯乙醇2.0～3.0 g、七叶苷1.0～1.5 g；显色剂（2R,3S,4R,5R,6R)-1，2，3，4，5-五羟基环己基-（2-硝基-4-氟苯基）磷酸酯2.0～2.5 g；聚丙烯酸钠 4.0～6.0 g、黄原胶1.0～3.0 g、海藻糖2.0～4.0 g。

2.根据权利要求1所述的单增李斯特菌快速检测冷水凝胶试纸片，其特征在于：所述的显色剂（2R,3S,4R,5R,6R)-1，2，3，4，5-五羟基环己基-（2-硝基-4-氟苯基）磷酸酯采用如下方法制备而成，包括如下步骤：

（1）将反应物A溶于无水二异丙胺及少量无水氯仿中，得到反应物A体系，然后将所述反应物A体系置于-70～-80℃条件下冷冻；

（2）在低温-70～-80℃低温条件下，将反应物B在无水、氮气氛围中逐滴加入到反应物A体系中，剧烈搅拌，反应5.5～6.5 h；

（3）将步骤（2）反应后的体系置于室温环境中，待反应体系达到室温后，继续向体系中加入溶有反应物C的无水氯仿溶液，室温继续搅拌反应12～14h，生成亚磷酸酯类物质；

（4）在步骤（3）反应后的体系中加入叔丁基过氧化氢，将亚磷酸盐氧化，并将得到的磷酸盐置于三甲胺中，在50±0.5℃条件下放置22～24h；

（5）除去三甲胺，得到粗产物后，再加入乙硫醇和三氟化硼-醚溶液进行去保护反应，最终得到的目标产物即为所述显色剂，其中，所述反应物A为1，2，3，4，5，6-六甲氧基亚甲基-肌醇，反应物B为二氯亚磷酸甲酯，反应物C为2-硝基-4-氟苯酚。

3.根据权利要求2所述的单增李斯特菌快速检测冷水凝胶试纸片，其特征在于：所述反应物A、反应物B、反应物C的用量摩尔比为1:1.25:2。

4.根据权利要求2所述的单增李斯特菌快速检测冷水凝胶试纸片，其特征在于：步骤（1）中所述反应物A与无水二异丙胺的用量摩尔比为1:2.5。

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