BG61082B2 - Ензимен метод за определяне на антибиотици съдържащи бета-лактамов пръстен - Google Patents
Ензимен метод за определяне на антибиотици съдържащи бета-лактамов пръстен Download PDFInfo
- Publication number
- BG61082B2 BG61082B2 BG094327A BG9432791A BG61082B2 BG 61082 B2 BG61082 B2 BG 61082B2 BG 094327 A BG094327 A BG 094327A BG 9432791 A BG9432791 A BG 9432791A BG 61082 B2 BG61082 B2 BG 61082B2
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- enzyme
- acid
- antibiotic
- substrate
- sample
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 124
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 title claims description 31
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 title claims description 22
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 50
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims abstract description 46
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 37
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 26
- -1 phenylacetyl Chemical group 0.000 claims abstract description 23
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 claims abstract description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 9
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 claims abstract description 4
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims abstract description 4
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims abstract description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 107
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 107
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 62
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 59
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 45
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 45
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 45
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 31
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 claims description 29
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 25
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 24
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 21
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 20
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 9
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 claims description 9
- 125000003460 beta-lactamyl group Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 claims description 9
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 claims description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 7
- 241000187362 Actinomadura Species 0.000 claims description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 6
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 claims description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N D-histidine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N 0.000 claims description 5
- 229930195721 D-histidine Natural products 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 5
- QWCKQJZIFLGMSD-GSVOUGTGSA-N D-alpha-aminobutyric acid Chemical compound CC[C@@H](N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-GSVOUGTGSA-N 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 claims description 4
- 229930028154 D-arginine Natural products 0.000 claims description 4
- FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N D-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N 0.000 claims description 4
- 229930182818 D-methionine Natural products 0.000 claims description 4
- COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N D-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N 0.000 claims description 4
- 229930182832 D-phenylalanine Natural products 0.000 claims description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N D-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N 0.000 claims description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-SCSAIBSYSA-N D-valine Chemical compound CC(C)[C@@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-SCSAIBSYSA-N 0.000 claims description 4
- 229930182831 D-valine Natural products 0.000 claims description 4
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N cephalosporin C Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N 0.000 claims description 4
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N D-Serine Chemical compound OC[C@@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 3
- 229930195711 D-Serine Natural products 0.000 claims description 3
- 229930182827 D-tryptophan Natural products 0.000 claims description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 3
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims description 3
- WCYWZMWISLQXQU-UHFFFAOYSA-N methyl Chemical compound [CH3] WCYWZMWISLQXQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229930195708 Penicillin V Natural products 0.000 claims description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 2
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 claims description 2
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 claims description 2
- FUBBGQLTSCSAON-PBFPGSCMSA-N cefaloglycin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)COC(=O)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 FUBBGQLTSCSAON-PBFPGSCMSA-N 0.000 claims description 2
- 229950004030 cefaloglycin Drugs 0.000 claims description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 2
- UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N oxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=CC=CC=C1 UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N 0.000 claims description 2
- 229960001019 oxacillin Drugs 0.000 claims description 2
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940056367 penicillin v Drugs 0.000 claims description 2
- BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N phenoxymethylpenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)COC1=CC=CC=C1 BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 2
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 claims 1
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 claims 1
- 102000030899 Serine-Type D-Ala-D-Ala Carboxypeptidase Human genes 0.000 abstract description 2
- 108010004832 Serine-Type D-Ala-D-Ala Carboxypeptidase Proteins 0.000 abstract description 2
- 125000000988 D-alanyl group Chemical group N[C@@H](C(=O)*)C 0.000 abstract 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 abstract 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 76
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 21
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 description 15
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 11
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000012916 chromogenic reagent Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 7
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 5
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 5
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 5
- UQLLWWBDSUHNEB-CZUORRHYSA-N Cefaprin Chemical compound N([C@H]1[C@@H]2N(C1=O)C(=C(CS2)COC(=O)C)C(O)=O)C(=O)CSC1=CC=NC=C1 UQLLWWBDSUHNEB-CZUORRHYSA-N 0.000 description 4
- 102000004674 D-amino-acid oxidase Human genes 0.000 description 4
- 108010003989 D-amino-acid oxidase Proteins 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 229960004350 cefapirin Drugs 0.000 description 4
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- GANZODCWZFAEGN-UHFFFAOYSA-N 5-mercapto-2-nitro-benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(S)=CC=C1[N+]([O-])=O GANZODCWZFAEGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N flavin adenine dinucleotide Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]([C@H](O)[C@@H]1O)O[C@@H]1CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C2=NC(=O)NC(=O)C2=NC2=C1C=C(C)C(C)=C2 VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N 0.000 description 3
- 235000019162 flavin adenine dinucleotide Nutrition 0.000 description 3
- 239000011714 flavin adenine dinucleotide Substances 0.000 description 3
- 229940093632 flavin-adenine dinucleotide Drugs 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dimethoxybenzidine Chemical compound C1=C(N)C(OC)=CC(C=2C=C(OC)C(N)=CC=2)=C1 JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXDRERIMPLZLU-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-2-methylbutanoic acid Chemical compound CC(O)C(C)C(O)=O VEXDRERIMPLZLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HFUWQLKNDPPTKF-IMJSIDKUSA-N [(2S)-2-aminopropanoyl] (2S)-2-aminopropaneperoxoate Chemical compound N[C@@H](C)C(=O)OOC([C@@H](N)C)=O HFUWQLKNDPPTKF-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N benzaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1 HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 2
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 2
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 2
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- OQEBIHBLFRADNM-WDCZJNDASA-N (2r,3s,4r)-2-(hydroxymethyl)pyrrolidine-3,4-diol Chemical compound OC[C@H]1NC[C@@H](O)[C@H]1O OQEBIHBLFRADNM-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHNPOQXWAMXPTA-UHFFFAOYSA-N 3-methylbut-2-enamide Chemical compound CC(C)=CC(N)=O WHNPOQXWAMXPTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MERLDGDYUMSLAY-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-aminophenyl)disulfanyl]aniline Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1SSC1=CC=C(N)C=C1 MERLDGDYUMSLAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USSIQXCVUWKGNF-UHFFFAOYSA-N 6-(dimethylamino)-4,4-diphenylheptan-3-one Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(CC(C)N(C)C)(C(=O)CC)C1=CC=CC=C1 USSIQXCVUWKGNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002012 Aerosil® Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010075409 Alanine carboxypeptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DEFJQIDDEAULHB-QWWZWVQMSA-N D-alanyl-D-alanine Chemical group C[C@@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C)C([O-])=O DEFJQIDDEAULHB-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- BNVWPGLCPXQMDU-DMTCNVIQSA-N N[C@H](C)C(=O)ON[C@@H](C)C(=O)O Chemical compound N[C@H](C)C(=O)ON[C@@H](C)C(=O)O BNVWPGLCPXQMDU-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 241001282135 Poromitra oscitans Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 102000005488 Thioesterase Human genes 0.000 description 1
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 1
- 206010048232 Yawning Diseases 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- XIURVHNZVLADCM-IUODEOHRSA-N cefalotin Chemical compound N([C@H]1[C@@H]2N(C1=O)C(=C(CS2)COC(=O)C)C(O)=O)C(=O)CC1=CC=CS1 XIURVHNZVLADCM-IUODEOHRSA-N 0.000 description 1
- 229960000603 cefalotin Drugs 0.000 description 1
- 229940106164 cephalexin Drugs 0.000 description 1
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 1
- 125000001271 cephalosporin group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- LQOLIRLGBULYKD-JKIFEVAISA-N cloxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=CC=CC=C1Cl LQOLIRLGBULYKD-JKIFEVAISA-N 0.000 description 1
- 229960003326 cloxacillin Drugs 0.000 description 1
- 229940075614 colloidal silicon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000007859 condensation product Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 239000012442 inert solvent Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 208000004396 mastitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N para-ethylbenzaldehyde Natural products CCC1=CC=C(C=O)C=C1 QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 108020002982 thioesterase Proteins 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/825—Actinomadura
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
Abstract
Методът се състои от следните етапи: 1) инкубация на биологичната течност с d-аланил-d-аланин-карбоксипептидаза, разтворим продукт на астinомаdurа r39; 2) инкубация на получената смес с разтвор на субстрат, представляващ тиоестер с формула , в която r1 е бензоил, фенилацетил или n -ацетил-l-лизилов остатък, r2 е глицил или d-аланил и r3 е водород или метил; 3) определяне на количеството на получената в етап 2) 2-меркаптоалканова киселина и 4) сравнение на определената в етап 3) стойност с еталон. 14 претенции
Description
Настоящото изобретение се отнася до нов, бърз и чувствителен ензимен метод за определяне на антибиотици с β-лактамов пръстен в биологични течности, както и до приложението му.
Понастоящем антибиотиците са много широко прилагани не само като терапевтични агенти при лечение на инфекциозни болести, предизвикани от бактерии, но също така и като агенти за консервиране на храни и като добавки в храната на животните, стимулиращи растежа им. Нараства необходимостта от определяне на присъствието на антибиотици в много ниски концентрации в сложни биологични течности като мляко, урина, кръв, серум, слюнка, екстракт от месо, ферментационни течности или водни буферирани среди.
Производството на мляко е подходящ пример. Известно е използването на пеницилин за лечение на някои инфекциозни болести по млекодайните животни, например мастит. Или поради очевидни медицински причини, млякото предназначено за консумация от хората, трябва по принцип да бъде свободно от всякакви следи на антибиотици. Концентрации на пеницилина от 0,005 U.I./ml или по-малки, могат да имат негативно влияние по време на производство на млечни продукти като сирене, кисело мляко и др. В някои страни официалните норми изискват концентрацията на антибиотик да не превишава 0,004 U.I./ml.
Необходимостта от бързо и точно определяне на концентрацията на пеницилина в млякото, получено от животните, още в самите ферми е доказана.
Отдавна са известни микробиологични методи, които позволяват определянето на относително ниски концентрации Η3β^8^3Μ0вите антибиотици в биологичните течности. Тези методи се основават на измерване на инхибирането на растежа на микроорганизмите, чувствителни към антибиотиците в присъствие на проба от биологичната течност. Тези методи изискват много време и сложна техника, като в най-добрия случай, времето, необходимо за получаване на резултата, е около 2 до 3 часа, което на практика е недопустимо.
Известен е бърз микробиологичен метод за определяне наличието на антибиотици в биологичните течности, в частност в млякото /1/. Съгласно този метод, проба от изследваната течност се инкубира от една страна с 5 клетки или части от клетки на микроорганизъм, силно чувствителен към антибиотиците, в частност Bacillus stearothermophilus и от друга страна с антибиотик, белязан с радиоактивен елемент или ензим. В процеса на инкубация, ан10 тибиотикът, евентуално присъстващ в пробата, и белязаният антибиотик се конкурират в процеса на фиксиране върху рецепторите на клетките или частите от клетки. След това се определя количеството на белязания антибиотик, 15 който се е фиксирал върху клетките или частите от клетки, като това показва присъствието (или не) на антибиотик, като е известно, че количествата на фиксирания белязан антибиотик е обратно пропорционално на концентрацията на антибиотика в пробата.
Според авторите на изобретението този метод би позволил да се определят достатъчно ниски концентрации на антибиотика като 0,01 U.I./ml, достигащи даже 0,001 U.I./ml за малко по-малко от 15 min.
Основен недостатък на посочения метод е фактът, че за достигане на този резултат задължително е необходимо да се прибегне до белязан с радиоактивен елемент (|4С или 1И1) антибиотик, който се дозира с помощта на специален апарат, например сцинтилационен брояч. Освен това работата с радиоактивните продукти, дори в много ниски концентрации не е напълно лишена от опасност за човека, провеждащ анализа.
В пример 2 на това изобретение се описва вариант на този метод, съгласно който се използва антибиотик, белязан с ензим антибиотик и, в който се определя количеството на белязания антибиотик чрез визуален колориметричен метод. Този вариант, обаче, не позволява определянето на концентрации по-ниски от 0,05 U.I./ml в млечната проба. Този метод е по-малко чувствителен и следователно помалко интересен.
В практиката съществуват също така тестове, базирани на използването на едновидови или поливидови антитела. Известно е, че тестовете могат да се провеждат като се излиза от класическите техники за имунобиологична диагностика (ELISA, аглутинация на латекс, радиоимунобиологичен метод и др.).
Като пример за този вид тест може да се цитира SPOT TEST продукт на ANGENICS (САЩ).
Недостатъци на този тип тестове са тяхната сложност и ограничено приложение. Високата специфичност на антителата позволява разпознаването само на членовете на едно семейство, структурно-свързани с това, което е избрано за имунизация. Това е особено трудно за семейството на β-лактамите.
Известен е също така ензимен метод, позволяващ определянето на ниски концентрации от антибиотик с β-лактамов пръстен в човешки серум и в мляко /2/.
Този метод (наричан по-долу “Метод на J-M. Frere”) не изисква използването на радиоактивни продукти, налагащи прилагането на усложнени измерителни апарати, въпреки, че се характеризира с голяма бързина и забележителна точност. Той се базира на използването на специфичен ензим, в случая разтворим, екзоцелуларен О-аланил-О-аланин-карбоксипептидаза, продукт на Actinomadura R39 (старо наименование Streptomyces R39). В даденото по-долу описание този ензим се нарича ензим R39 и притежава специфична активност да хидролизира крайните D-аланилD-аланинови групи на различните пептиди с освобождаване на D-аланин.
Друга важна характеристика на ензим R39 се дължи на факта, че той реагира с антибиотиците с β-лактамов пръстен, което води много бързо до получаването на еквимоларен ензимно-антибиотичен комплекс, който е в голяма степен неактивен и необратим.
В метода на J-M. Frere се използват тези продукти на ензим R39 за определяне на много ниски концентрации на антибиотици с β-лактамов пръстен. Този метод се състои от три съществени етапа.
В първия етап определено количество от течната проба за изпитание се инкубира с определено количество от ензим R39. Инкубирансто се провежда при условия, позволяващи на β-лактамовия антибиотик, евентуално присъстващ в пробата, да реагира с ензима и да образува еквимолен ензимно-антибиотичен комплекс, който е неактивен и необратим.
Във втория етап определено количество от субстрата, например Να,Νε-диацетил-Е-лизил-О-аланил-О-аланин, се инкубира с получения в първия етап продукт при условия, поз воляващи хидролизата на субстрата от ензима, като се получава количество D-аланин, отговарящо на остатъчната активност на ензим R39, който не се е свързал с антибиотика в първия стадий.
В третия етап се определя количеството на получения D-аланин. Ясно е, че количеството на получения във втория етап D-аланин зависи от остатъчната активност на ензима и е обратно пропорционално на количеството на наличния в пробата антибиотик.
В метода на J-M. Frere количеството на D-аланина се определя чрез ензимен метод. Същият се основава на две свързани ензимни реакции. При първата реакция D-аланинът се окислява до пирогроздена киселина с помощта на D-аминокиселина-оксидаза (в присъствие на нейния коензим, флавин-аденин-динуклеотид); в същото време се образува количество, отговарящо на водородния прекис, произлизащ от кислорода на въздуха. При втората реакция полученият водороден прекис се използва за окисление на о-дианизидина с помощта на пероксидазата. Получава се кафяво оцветяване, чиято интензивност е пропорционална на количеството на D-аланина.
Това позволява определянето на D-аланина чрез колориметричен метод, визуално или чрез измерване на оптичната плътност със спектрофотометър (Аллах = 460 пш).
Приготвяйки серия от проби с определена концентрация на антибиотика и прилагайки този метод, може да се получи калибровъчна крива, която свързва процента на остатъчната ензимна активност на ензим R39 с концентрацията на антибиотика.
За да се получи количествена стойност на концентрацията на антибиотика в пробата, се работи точно по същия начин и концентрацията на антибиотика се определя от тази калибровъчна крива.
Това количествено изчисление изисква използването на спектрофотометър.
Но за да се определи дали концентрацията на антибиотика надхвърля или не определена критична стойност, не е необходимо използването на спектрофотометър или някакъв подобен измерителен апарат.
Достатъчно е предварително да е известно при каква критична концентрация на антибиотика, активността на ензим R39 е напълно премахната или иначе казано - при как3 ва концентрация на антибиотика не се образува D-аланин и, следователно, няма оцветяване. Познавайки тази критична концентрация, ясно е, че може чрез обикновена визуална оценка на резултата от изследването да се установи дали дадена проба съдържа или не концентрация на антибиотика по-висока или по-ниска от критичната концентрация. Чрез този метод, без да се използва специален апарат, може бързо и точно да се определи концентрацията на антибиотик в млякото.
Освен това методът позволява определянето на относително ниски концентрации на β-лактамов антибиотик в млякото и в човешкия серум. Така например, излизайки от млечна проба с обем около 20 μΐ и инкубирайки я с 3 pmol ензим R39 е възможно количествено да се определят (използвайки спектрофотометьр) ниски концентрации на пеницилин 0,02 U.I./ ml мляко и качествено чрез описания по-горе визуален метод концентрации по-високи от 0,09 U.I./ml мляко за по-малко от 1 час.
Недостатъците на J-M. Frere са следните. Той е с незадоволителна чувствителност за биологични течности (мляко, слюнка, серум и др.). Тя може да се повиши чрез намаляване количеството на използвания ензим R39, но това води до увеличаване продължителността на реакцията както в първия, така и във втория етап на метода. Възможно е да се увеличи обемът на пробата, която ще се инкубира с ензим R39, но в този случай трябва да се увеличи времето на реакцията в първия етап на метода.
За съжаление, не е възможно по този начин да се повиши чувствителността на метода на J-M. Frere, в частност в случая на сложни течности с биологичен произход. Установено е, че е невъзможно реализирането на подходящо определяне, когато обемът на биологичната проба надвишава определен критичен обем, който зависи от природата на биологичната течност. Така в случая на мляко и серум, когато обемът на пробата, който се подлага на инкубиране, надвишава обем от ± 50 μΐ се наблюдава, че количеството на получения окислен о-дианизидин е силно намалено.
При изследване на урина не може да се определи никаква ензимна активност дори при използването на много малки обеми на пробата, например 10μ1. Невъзможно е прилагането на този метод за определяне на антибиотици в урината.
Предполага се, че биологичните течности съдържат субстанции, които инхибират действието на използваните при този метод ензими. Това означава, че използването на големи обеми проби може да се проведе в найдобрия случай само за сметка на повишаване на количеството на реактивите, най-малко пропорционално на увеличаването на обема.
Това все пак не е за препоръчване, като се знаят високите цени на използваните ензими, в частност D-аминокиселина-оксидазата и нейния кофактор флавин-адениндинуклеотид.
Известна е версия на метода на J-M. Frere под търговското име “Penzym”. Този тест принципно се използва като тест за подбор на млякото, постъпващо в млекопреработващите предприятия.
Тестът се провежда на два етапа: в първия етап 50 μΐ мляко се инкубират с 1,5 pmol ензим R39 в продължение на 5 min при 47°С. След това във втория етап, всички реактиви, позволяващи определянето на остатъчната ензимна активност, в случая субстрата Να,Νεдиацетил-Т-лизил-0-аланил-0-аланин, D-аминокиселина-оксидаза, флавин-аденин-динуклеотид, пероксидаза и хромогенният реактив се добавят в средата за инхибиране и сместа се инкубира в продължение на 15 min при 47°С. В процеса на инкубиране, с помощта на цветна скала, жълто оцветяване, произлизащо от розово, индикира наличието на антибиотици с β-лактамов пръстен при концентрации, повисоки от 0,017 U.I./ml мляко. Обратно, наличието на розово оцветяване показва отсъствието на антибиотици (интензивно розово оцветяване) , наличието на антибиотици с концентрация до 0,017 U.I./ml, като интензитетът на получения розов цвят е обратно пропорционален на концентрацията на антибиотик.
Благодарение на този тест визуално могат да бъдат определени достатъчно ниски концентрации на антибиотик в млякото, достигащи до 0,017 U.I./ml за 20 min.
Тази оптимизирана версия на метода на J-M. Frere притежава чувствителност и бързина, които не позволяват приложението й в страни, в които законодателството изисква изключително ниски концентрации на антибиотик, например от порядъка 0,004 U.I./ml или като бърз тест, позволяващ на изкупва телите на мляко да осъществяват проверка във фермата за по-малко от 5 min.
Подобряването на чувствителността и намаляването на времето за получаване на резултата трябва да отговарят на изискванията, посочени по-горе. Тестът се прилага върху много малки обеми проби и изисква известен опит в техниката на микродозиране, за да бъде проведен коректно. С цел да се избегнат всички проблеми, свързани с приложението на теста, провеждан изцяло в присъствието на биологична течност, е предложен метод, в който ензим R39 е имобилизиран върху неразтворим във вода носител, в частност върху поли(М,1Чдиметилакриламидна) смола. Този метод, който е описан в /3/ съдържа следните основни етапи:
(1) имобилизираният върху носителя ензим се инкубира в присъствие на биологична течност;
(2) имобилизираният ензим се отделя от биологичната течност и се промива;
(3) остатъчната активност на ензим R39 се определя колориметрично по отношение на образувания D-аланин, като се излиза от пептиден субстрат с помощта на система от реактиви, включващи D-аминокиселина оксидаза и неговия кофактор, пероксидаза и хромогенен реактив чрез визуално отчитане на резултата или с помощта на спектрофотометьр.
Предимствата на метода са следните. Няма никаква интерференция на биологичната течност с използваните ензими за количественото определяне на D-аланина, тъй като биологичната течност е вече отделена в етап (2); могат да се проведат отлични определяния върху обеми проба, достигащи до 5 ml; чувствителността е значително по-голяма и този метод позволява визуално определяне на концентрации на пеницилин G, по-големи от 0,002 U.I./ ml в мляко.
Методът има и недостатъци - като всички методи, изискващи етап на сепарация, възпроизводимостта на резултатите е по-лоша, отколкото при метод в хомогенна фаза; какъвто и да е използваният метод на сепарация, той налага повишаване на продължителността и сложността; въпреки, че методът позволява чрез визуално отчитане една повишена чувствителност, можеща да достигне до 0,002 U.I./ ml пеницилин G, времето за получаване на този резултат е твърде дълго (поне 30 min), за да може този метод да се използва за бързо определяне в момента на изкупуване на млякото от фермата; цената е завишена в сравнение с тест, прилаган в хомогенна фаза.
Техническо и икономическо значение има метод, който не притежава посочените недостатъци на известните методи и в частност на метода на J-M. Frere или на методите, които са негови производни като теста “Penzym” или този, описан в /3/. Необходимо е създаване на метод, при който бързо да се получава резултатът, например за 5 min или по-малко; значително да се повиши чувствителността, позволяваща приложението му в страни, в които законодателството е много строго и изисква концентрации на антибиотик не превишаващи 0,004 U.I./ml; да се определят много малки обеми проба 1 ml или повече, което може лесно да се извърши и от неспециалисти; да е с ниска цена и опростено приложение.
Методът съгласно настоящето изобретение има следните предимства: използва се специален субстрат от тиоестерен тип за ензим R39 по такъв начин, че чрез хидролиза се образува съединение, съдържащо свободна SHгрупа, която може да бъде определена чрез прост колориметричен метод, който е по-евтин, без да са необходими ензими, чието действие се обърква от съставките на биологичната течност; провеждане на хидролиза на субстрата от ензим в присъствие на аминокиселина с D-конфигурация или глицин, активиращ значително тази хидролиза.
Задача на настоящето изобретение е създаването на нов ензимен метод за определяне на антибиотици с -лактамов пръстен в биологични течности, съдържащ следните етапи:
(1) инкубиране на биологичната течност с О-аланил-О-аланин карбоксипептидаза, разтворим продукт на Actinomadura R39, като тази инкубация се води при условия, позволяващи на β-лактамовия антибиотик, евентуално присъстващ в биологичната течност, да реагира с ензима, образувайки еквимолен ензимноантибиотичен комплекс, който е неактивен и необратим;
(2) инкубиране на получената в края на етап (1) смес с разтвор на субстрат при условия, позволяващи хидролизата на субстрата, като се получава съединение, чието количество е пропорционално на остатъчната ензимна активност;
I (3) определяне количеството на образуваното в етап (2) съединение;
(4) сравнение на определената в етап (3) стойност с еталон за получаване на концентрацията на антибиотика в биологичната течност. 5 Методът се характеризира с това, че инкубирането в етап (2) се провежда със субстрат, който представлява тиоестер с обща формула:
R. - R, - СН - СООН 10 к
в която Rj е бензоилов, фенилацетилов или Иа-ацетил-Ь-лизилов радикал, R2 е глицилов или D-аланилов радикал и R3 е водоро- 15 ден атом или метилов радикал, по такъв начин, че да се образува чрез хидролиза 2-меркаптоалканилова киселина с формула
HS - СН - СООН
I *3 (II) в която R3 има даденото по-горе значение и в присъствие на аминокиселина, която активира хидролизата на субстрата от ензима, 25 като аминокиселината се подбира между аминокиселина с D-конфигурация и глицин.
В процеса на изследванията е установено, че ензимът R39 проявява специфична хидролизна активност по отношение на тиоестерни- 30 те връзки на някои съединения, съдържащи крайна тиоестерна група и в частност хидролизна активност по отношение на тиоестерите с обща формула I. Този факт е изненадващ, тъй като не е известен пример на D-аланил-О- 35 аланин карбоксипептидаза, която действа като тиоестераза. Заявителят използва предимствата, които дава това неочаквано свойство на ензим R39, за да създаде нов, no-съвършен метод за определяне на антибиотици с β-лакта- 40 мов пръстен в биологични течности.
За разлика от известните методи в изобретението се използва като субстрат за ензим R39 тиоестер с обща формула I, който образува чрез хидролиза 2-меркаптоалканилова ки- 45 селина с обща формула II. Този нов субстрат има предимства в технологично и в икономическо отношение. 2-меркаптоалканиловата киселина с формула II, получена от този субстрат, и чието количество е пропорционално на оста- 50 тъчната активност на ензим R39, може да бъде регистрирана чрез обикновен колориметричен метод, който не се нуждае от ензими като Dаминокиселина оксидаза и нейния коензим. Освен значително понижение на себестойността се премахва един от основните недостатъци на метода на J-M. Frere, тъй като съставките на биологичната течност не взаимодействат с реактивите за колориметричното определяне, които са съставени от обикновени химически реактиви, между които отсъстват ензими.
Чрез метода съгласно изобретението директно може да се изследват биологичните течности; не е необходимо да се отделят предварително от пробите, подложени на изследване веществата, които биха могли да нарушат колориметричното определяне. Освен това, тъй като определянето на остатъчната активност на ензима не се влияе от факторите, налични в биологичните течности, е възможно също да се работи с обеми на пробите от биологичните течности, достигащи до 10 ml. Методът съгласно изобретението позволява следователно, да се работи с по-големи обеми, като по този начин става възможно изпълнението му от лица с по-ниска квалификация.
Освен това тъй като е възможно да се работи с по-големи обеми, методът съгласно изобретението позволява достигането на значително по-голяма чувствителност. Както се вижда по-долу в примерите, с него е възможно визуалното определяне на количества от порядъка на 0,004 U.I. пеницилин G на милилитър мляко за 15 min; възможно е, използвайки цветна скала, да се достигнат ниски концентрации, достигащи 0,002 U.l./ml.
Изненадващо бе установено, че добавянето на аминокиселина с D-конфигурация и глицин повишава значително скоростта на реакцията на хидролиза на субстрата от тиоестерен тип с формула I под влияние на ензима. Изследванията в тази област показват, че много аминокиселини с D-конфигурация, както и глицинът могат да играят ролята на активатор на реакцията на хидролиза на тиоестера. Между най-добрите активатори са D-аланин, D-метилнин, D-аргинин, D-фенилаланин, Dсерин, D-хистидин, D-валин, D-триптофан и D-2-аминобутирова киселина.
Ако активността на ензим R39 се изразява в единици на милиграм ензим, една единица ензим, хидролизираща 1 pmol субстрат на минута при 47°С, установено е, че актив6
1.1 1НЯ I IIII ността на ензим R39 спрямо [(Н-бензил-Оаланил)тио]оцетна киселина, използвана като субстрат, е равна на 8 единици в отсъствие на D-аланин и на 320 единици в присъствие на D-аланин. Така в присъствие на този активатор скоростта на хидролиза на субстрата от ензим R39 е 40 пъти по-висока.
Установено е, че нито една аминокиселина, притежаваща L-конфигурация, не е в състояние да активира хидролизата на субстрата.
Съгласно изобретението хидролизата на субстрата от тиоестерен тип в етап (2) се осъществява в присъствие на аминокиселина с Dконфигурация, която активира хидролизата на въпросния субстрат от ензим R39. Това измерване позволява да се спечели време при реализиране на метода. Така се достига до лесно определяне на концентрация на пеницилин G 0,016 U.I. на милилитьр мляко за 5 min. За сравнение тестът “Penzym” изисква около 15 min за получаване на същия резултат. Обратно на известните методи, методът съгласно изобретението е особено подходящ за бърз анализ в момента на събиране на млякото от фермите, още повече, че приложението му е просто и не изисква усложнена апаратура.
Установено е, че методът съгласно изобретението може да се приложи успешно не само за определяне на антибиотици в млякото, но също така и в други биологични течности като серум, урина, слюнка, месни екстракти, ферментационни течности, буферирани водни разтвори и др. Основно предимство на настоящето изобретение е, че то позволява бързото изследване за много кратко време (5 min) на концентрации на β-лактамов антибиотик от порядъка на 0,016 U.I./ml и за малко по-продължително време (15 min) на много ниски концентрации на β-лактамов антибиотик от порядъка на 0,004 U.I./ml или по-малки, без да е необходимо прибягването до специален апарат за анализ, без да се използва сложна технология, която изисква прилагане на метода на сепарация.
Антибиотиците, чиято концентрация може да бъде определена чрез метода съгласно изобретението, принадлежат към групата на антибиотиците, които се характеризират с присъствието на β-лактамов пръстен в молекулата си, т.е. всички пеницилини и цефалоспорини. Като пеницилини могат да се прилагат бензилпеницилин (пеницилин G), ампицилин, феноксиметилпеницилин, карбеницилин, метилцилин, оксацилин, клоксацилин и др. Като цефалоспорини могат да се използват цефалоспорин С, цефалоглицин, цефалотин, 5 цефалексин, цефапирин и др.
Особено добри резултати се получават с пеницилин G.
В етап (1) на метода съгласно изобретението, определен обем проба от биологич10 ната течност се инкубира с определено количество ензим R39. Както е посочено по-горе, възможно е да се работи с големи обеми от пробата. За определено количество ензим R39, повишавайки обема на пробата, се повишава 15 чувствителността на метода. Може да се избере обем на пробата в зависимост от желаната чувствителност. Например за мляко, би могло чувствителността на метода да се адаптира към фиксираните законодателни норми на страните, 20 където ще се използва или към изискванията на млечната промишленост.
Същият ефект може също така да бъде получен за определен обем биологична течност, намалявайки количеството на ензим R39 (при25 мер 2 по-долу). Все пак, в този случай трябва пропорционално да се увеличи не само продължителността на етап (1), но и продължителността на етап (2) на метода.
На практика изборът на количеството на ензим R39 и използваната биологична течност ще зависи от една страна от начина на приложението на метода и от друга страна от чувствителността или бързината, която се цели.
Така например, ако методът съгласно изобретението се прилага за определяне замърсяването на млякото във фермата, се работи с големи обеми проба, за да може да се осъществи по-лесно анализа, за предпочитане се избират обеми между 1 и 10 ml. За осъществяването на метода в лаборатория, съоръжена с материали за микродозиране, обеми на пробата между 50 μΐ и 1 ml са напълно подходящи.
Освен това изборът на количеството на ензима и на биологичната течност в голяма степен зависи от желаната чувствителност.
Така например в лабораторни условия, когато могат да бъдат използвани малки обеми и, когато се желае чувствителност 0,01 U.I./ ml се подбира количество на ензима от порядъка на един pmol и обем на биологичната течност от порядъка на 50 μ 1. Ако се желае получаването на чувствителност респективно 0,005
Ί .1 Ш1 IIUIIIII и 0,0025 U.I./ml се използват обеми на биологичната течност респективно 100 и 200 ц1 без да се променя количеството на ензима.
Отличната чувствителност, бързината и точността на метода съгласно изобретението са резултат от една страна на специфичните характеристики на ензим R39 и от друга страна на метода, използван за определянето на остатъчната активност на ензим R39.
Ензимът R39 изключително бързо образува неактивен, еквимолен ензимно-антибиотичен комплекс, който е изключително стабилен, тъй като веднъж образуван, той се разлага много бавно. Например времето на полуразпадане на образувания комплекс между ензим R39 и пеницилин G е около 70 h при 37°С. Отличната ензимна активност се изразява в много бърза хидролиза на крайната група на субстрата от тиоестерен тип с формула I под влияние на специфичен активатор.
Посочените предимства на ензим R39 го правят предпочитан пред D-аланил-О-аланин карбоксипептидазите. На практика, тъй като времето за разлагане на ензимно-антибиотичния комплекс е безкрайно по-голямо от общата продължителност, която е необходима респективно за образуването на комплекса и за измерването на остатъчната ензимна активност, не е за учудване, че резултатите от определянето са погрешни поради освобождаването на активен ензим вследствие преждевременното разлагане на ензимно-антибиотичния комплекс.
Когато се изпитват известните D-аланилD-аланин карбоксипептидази, с изключение на ензим R39, не съществува друг, който да отговаря на тези условия; т.к. скоростта на образуване на комплекса е 10 пъти по-ниска, стабилността на ензимно-антибиотичния комплекс е абсолютно недостатъчна, скоростта на хидролиза на субстрата е много по-малка (това е точно случая на всички ендоцелуларни карбоксипептидази, свързани с бактериалната мембрана).
Ензим R39 е специфична, разтворима екзоцелуларна О-аланил-О-аланин карбоксипептидаза, която се екстрахира от Actinomadura R39, когато се култивира този микроорганизъм (заявен на 10 юли 1981 г. в Института Пастьор в Париж под номер 1-127) в подходяща среда.
За приложението на метода съгласно изобретението, този ензим трябва да бъде много чист. Неговото получаване и пречистване може да се осъществи съгласно методи, описани в /4/. Този ензим в чисто състояние е търговски достъпен от UCB-Bioproducts S.A. (Белгия).
Ензим R39 притежава отлична стабилност; той понася високи температури, дости5 гащи до 60°С. Ето защо инкубирането на биологичната течност с ензим R39 може да се проведе без затруднения в температурен интервал между 20 и 50°С. За предпочитане е тази температура да е около 47°С. При тези 10 условия продължителността на инкубирането, което е тясно свързано с времето, необходимо за образуването на неактивен еквимолен ензимно-антибиотичен комплекс е много кратко. Повишаване на температурата на инкубира15 не има за резултат понижаване на продължителността и обратно. Възможно е да се намали продължителността на определение съгласно метода, като се повиши температурата.
В етап (2) на метода съгласно изобретението сместа, получена в етап (1), се инкубира с определено количество субстрат от тиоестерен тип с формула I в разтвор в присъствие на глицин или аминокиселина с D-конфигурация, които активират хидролизата на субстрата от ензима. В курса на този етап, частта от ензима, която не се консумира при образуването на ензимно-антибиотичния комплекс в етап (1) се използва за провеждане на хидролизата на тиоестерния субстрат с формула I. При тази реакция на хидролиза се получава определено количество на 2-меркаптоалканиловата киселина с формула II, което е пропорционално на остатъчната активност на ензим R39.
Тиоестерите с формула I са нови съединения, с изключение на [(N-бензил-глицил) тио] -оцетната киселина, която е познато съединение /5/.
Тиоестерите с формула I могат да бъдат получени чрез подходящ метод, при който протичат само желаните реакции. Най-често се провежда кондензация в инертен разтворител като хлороформ, дихлорметан, етилацетат или диметилформамид на киселина с формула III, предварително активирана, например под формата на смесени анхидриди или активни естери с 2-меркаптоалканилова киселина с формула II съгласно следната реакционна схема.
R,R,OH + HS-CH-COOH— —> (I)
I (III) R3 (II) !1 ЛШ III!
в която Rp R2 и R3 имат значенията, посочени по-горе.
Като пример на тиоестери с формула I, които могат да бъдат използвани като субстрат могат да бъдат цитирани [(М-бензил-О-аланил)тио]-пропионова киселина, [(N-фенилацетил-О-аланил) тио]-оцетна киселина, [(Να-ацетил-Ь-лизил-О-аланил)тио] -оцетна киселина и т.н. Все пак [(М-бензил-О-аланил)-тио]-оцетната киселина дава най-добри резултати.
Като примери на аминокиселини с Dконфигурация, които могат да бъдат свързани като активатори към споменатите по-горе субстрати, могат да бъдат цитирани D-аланин, D-метионин, D-аргинин, D-фенилаланин, D- 15 серин, D-хистидин, D-валин, D-триптофан и D-2-аминобутирова киселина.
Съгласно една предпочитана форма на изобретението D-аланинът се свързва с [(Nбензил-О-аланил) тио]-оцетната киселина, използвана като субстрат.
Количествата на използваните субстрат и активатор не са критични, тъй като се работи в условия на насищане на ензима от субстрата.
Условията, които трябва да се съблюда- 25 ват по време на този етап са същите, както тези за етап (1), дадени по-горе. Инкубирането може да се проведе в температурния интервал между 30 и 50°, за предпочитане около 47°С. Продължителността на инкубирането с фрак- 30 цията от неактивирания ензим R39 трябва да бъде най-малко достатъчна за образуване на измеримо количество от 2-меркаптоалканилова киселина с формула II. За температура 47°С тази продължителност може да варира между 35 няколко секунди и 10 min в зависимост от количеството на ензима и обема на пробата. Тази продължителност може да бъде намалена чрез повишаване температурата на инкубиране или обратно, увеличена чрез понижаване на температурата на инкубиране. Всъщност желателно е да се повиши температурата на инкубиране във всички случаи, когато скоростта на определянето е важен фактор.
С цел да се запази оптимална ензимна активност, инкубационната среда трябва да има стойност на pH между 7 и 8,5. Обикновено се поддържа стойност на pH около 8, осъществявайки инкубирането в среда на подходящ буфер.
В етап (3) на метода съгласно изобрете- 50 нието се определя количеството на 2-меркаптоалканиловата киселина с формула II, която се образува в етап (2).
Определянето на 2-меркаптоалканиловата киселина с формула II може да се извърши по познат метод. От значение е само той да 5 бъде бърз, по-евтин и да се определя само 2меркаптоалканиловата киселина с формула II между всички други продукти, налични в изпитваната биологична течност.
Ето защо, предпочита се колориметрич10 но определяне с помощта на реактив, който предизвиква оцветяване вследствие на реакцията със свободната SH група на 2-меркаптоалканиловата киселина.
Този хромогенен реактив може да бъде подбран между химическите реактиви, които обикновено се използват в този вид реакции, например 5,5'-дитио-бис(2-нитробензоена) киселина, продуктите на кондензацията на 4,4'дитио-бис (фениламин) с бензалдехиди, систе20 мата фенантролин Fe444 и др.
Предпочитан хромогенен реактив 5,5'дитио-бис(2-нитробензоена) киселина, наричан също така реактив на Ellman, който предизвиква жълто оцветяване не дължащо се на 2-нитро-5-меркаптобензоената киселина, образувана при обменната реакция с SH групата на 2-меркаптоалканиловата киселина, като интензитетът на това оцветяване е директно зависим от количеството на 2-меркаптоалканиловата киселина.
Все пак за някои приложения е за предпочитане да се използва червено оцветяване, което е резултат на реакцията на фенантролина със свободните SH групи в присъствие на катиона Fe444.
Количеството на хромогенния реактив, който се използва, е пропорционално на количеството на образуваната 2-меркаптоалканилова киселина. Предпочита се да се работи 40 при условия, при които моларното количество от хромогенния реактив е в малък излишък по отношение на максималното моларно количество на 2-меркаптоалканиловата киселина, способна да се образува в етап (2) на метода.
Ензим R39 трябва задължително да присъства още от началото на етап (2) на метода, както и субстратът и активаторът. Възможно е активаторът да бъде добавен в началото на етап (2), а хромогенния реактив - в началото на етап (1), или етап (2) или само в края на етап (2). Съгласно един предпочитан начин за реализация, в етап (1) на метода се инкубира
I
J III .11 IIUUI I
II разтвор на ензим R39 c проба от мляко в присъствие на активатор, в етап (2) се добавя субстратът и хромогенният реактив и се изпълняват етапи (2) и (3) едновременно при условия, идентични с тези, дадени по-горе за етап (2).
В етап (4) на метода, определената в етап (3) стойност се сравнява с еталон, за да се получи концентрацията на антибиотика в биологичната течност.
Количественото определяне на концентрацията на антибиотик може да се осъществи съгласно представения по-долу метод.
Най-напред се приготвя серия от проби на биологичната течност, съдържащи познати концентрации на β-лактамовия антибиотик.
Тази серия освен, че съдържа проби, включващи нарастваща концентрация на антибиотика, съдържа и две проби на биологичната течност, свободни от антибиотици.
След това всички проби се обработват по еднакъв начин, следвайки етапи (1), (2) и (3) на метода съгласно изобретението.
За една от пробите без антибиотик, разтворът на ензима, използван в етап (1), се замества със същото количество вода. В този случай в края на етап (3) се получава разтвор, който съдържа всички реактиви, с изключение на ензим R39. Тъй като ензим отсъства, в етап (2) не се образува 2-меркаптоалканилова киселина с формула (II) и като следствие хромогенният реактив, в случая 5,5'-дитио-бис(2-нитробензоената) киселина не води до оцветяване. Тази проба ще бъде наричана по-долу “бяла проба”.
Другата проба без антибиотик дава много интензивно жълто оцветяване. Тъй като пробата е без антибиотик, ензимът R39 не се активира в етап (1) и се образува максимално количество на 2-меркаптоалканиловата киселина с формула (2), (отговарящо на общото количество използван ензим R39) и максимално количество 5-меркапто-2-нитробензоена киселина и вследствие се образува интензивно жълто оцветяване. Тази проба ще бъде наричана по-нататък “свидетел”.
От само себе си се разбира, че когато пробите съдържат молно количество антибиотик, по-ниско от молното количество на използвания ензим R39, само част от този ензим ще бъде инактивиран от антибиотика в етап (1); в тези случаи се образува количество от 2-меркаптоалканиловата киселина с формула (II), отговарящо на остатъчната активност на частта от ензима, която не е била инактивирана от антибиотика и, следователно едно количество, отговарящо на 5-меркапто-2-нитробензоена5 та киселина. В тези случаи се получава също жълто оцветяване, но с по-слаб интензитет от този на свидетеля.
На края, когато пробите, съдържащи молно количество на антибиотика, равно или 10 по-голямо от молното количество на използвания ензим R39, ензимът ще бъде изцяло инактивиран от антибиотика в етап (1); не би се образувала 2-меркаптоалканилова киселина с формула (II) и хромогенният реактив би 15 останал непроменен. В тези случаи се получава оцветяване, идентично на това, което се получава при бялата проба.
С цел по-голяма прецизност чрез спектрофотометьр се определя оптичната плътност на получените оцветявания при всички проби, включително бялата проба и свидетеля.
Тъй като се намира определена стойност за оптичната плътност за бялата проба, е необходимо тази стойност да се извади от тази, намерена за свидетеля и другите проби.
Излизайки от стойностите на получените оптични плътности, се изчислява процентът остатъчна активност на ензим R39 за всяка проба. Този процент е равен на отношението, умножено по сто, между стойностите на оптичната плътност, намерени за определена проба и свидетеля.
След това се получава графиката, на абсцисата на която е концентрацията на антибиотика, а на ординатата - процента на остатъчната активност на ензим R39. Получава се права линия, която сече ординатата в точка, отговаряща на пробата-свидетел (100% остатъчна ензимна активност) и абсцисата в точка, отговаряща на проба, съдържаща количество антибиотик равно на молното количество ензим R39 (0% остатъчна ензимна активност). Така получената графика представлява еталон, който позволява определянето на неизвестни концентрации на β-лактамов антибиотик в проба от биологична течност. За тази цел пробата се обработва по идентичен начин, следвайки етапи (1), (2) и (3) съгласно изобретението; измерва се оптичната плътност на полученото оцветяване със спектрофотометьр; изважда се стойността на оптичната плътност, получена за бялата проба; изчислява се процен20
1.1 lll.lt I mil I тът остатъчна ензимна активност по същия начин, както по-горе и се получава концентрацията на антибиотик в пробата, използвайки еталона.
Така количествено може да се определят достатъчно ниски концентрации на антибиотик, достигащи 0,002 U.I./ml в биологичните течности за 15 min.
Този метод изисква в някои случаи предварително избистряне на биологичната течност, за да се използва спектрофотометьр и е необходимо да се провежда в лабораторни условия. Когато се желае единствено да се определи дали концентрацията на антибиотик надвишава или не някаква стойност (например в случай на мляко максимална концентрация, изисквана от официалните норми), не е необходимо да се използва спектрофотометьр. Това изисква предварително да се дадат някакви обяснения.
Както видяхме по-горе, калибрационната крива пресича абсцисата в точка, отговаряща на проба, съдържаща количество антибиотик равно на молното количество на използвания ензим R39. При тази критична концентрация на антибиотик процентът на остатъчната ензимна активност е 0, тъй като в края на етап (3) на метода съгласно изобретението се получава оцветяване идентично на това, получено при бялата проба.
Над тази критична концентрация се получава оцветяване, идентично на това на бялата проба, тъй като процентът на остатъчната ензимна активност е винаги 0. Обратно, под тази критична концентрация се получава жълто оцветяване, тъй като все още съществува някаква остатъчна ензимна активност.
Следователно, базирайки се единствено за наблюдаваното оцветяване в края на етап (3) на метода, може директно да се изчисли за една проба дали концентрацията на антибиотик надвишава или не критичната концентрация.
Достатъчно е предварително да е известна критичната концентрация, за да може след това, без да се прибягва до спектрофотометьр, бързо да се определи дали една проба съдържа концентрация на β-лактамов антибиотик, която надвишава (или не) тази критична концентрация. За тази цел пробата се обработва по идентичен начин, следвайки етапи (1), (2) и (3) на метода съгласно изобретението и след това само се наблюдава полученото оцветяване; ако то отговаря на това на бялата проба, кон центрацията на антибиотик е най-малко равна на критичната концентрация; ако обратно т.е. жълто, концентрацията на антибиотик е по-ниска от критичната.
Така е възможно да се определи визуално и с положителност, дали пробите съдържат повече или по-малко от 0,004 U.I. антибиотик/ml биологична течност за 15 min.
Използвайки освен това една цветна скала, съдържаща променлива интензивност на жълтото оцветяване в зависимост от концентрацията на антибиотик, е възможно полуколичественото определяне на междинни концентрации между 0 U.I./ml и критичната концентрация. Така при едно приложение, когато критичната концентрация е 0,004 U.I./ml, е възможно определянето на концентрации от 0,002 U.I./ml без затруднение.
Този метод със или без цветна скала е напълно подходящ за серийно изследване на млечни проби дори извън лабораторията, например във фермата и то от неквалифициран персонал.
Методът за количествено и качествено определяне на антибиотик съгласно настоящето изобретение ще бъде обяснен подробно по-долу с помощта на изменението на цвета с 5,5'дитио-бис(2-нитробензоена) киселина. Използвайки този метод с други хромогенни реактиви, единствено наблюдаваното оцветяване ще бъде различно.
Друг предмет на настоящето изобретение е да създаде методика за приложението на метода съгласно изобретението, т.е. за определяне на антибиотици с β-лактамов пръстен в биологична течност.
Тази методика включва по-специално:
(1) определено количество D-аланил-Оаланин карбоксипептидаза, разтворим продукт на Actinomadura R39 (ензим R39);
(2) определено количество субстрат, който е тиоестер с обща формула
R.-R,-S-CH-COOH
I (I) R3 в която R, представлява бензоилов, фенилацетилов или Να-ацетил-и-лизилов радикал, Rj - глицилов или D-аланилов радикал и R3 е водороден атом или метилов радикал;
(3) определено количество аминокиселина с D-конфигурация или глицин;
(4) реактив, позволяващ определянето на 2-меркаптоалканиловата киселина с формула
HS-CH-COOH в която R3 има същото значение, както даденото по-горе;
(5) евентуално еталон по отношение на който получените с реактивите (1), (2), (3) и 10 (4) резултати могат да бъдат сравнявани.
Съгласно един предпочитан начин на реализиране, субстратът е [(ГЧ-бензоил-О-аланил)тио] оцетна киселина. Аминокиселината с D-конфигурация е D-аланин и реактивът (4) е 15 5,5'-дитио-бис (2-нитробензоена) киселина.
Съгласно един още по-предпочитан начин на реализиране, субстратът и реактивът, позволяващ определянето на 2-меркаптоалканиловата киселина са смесени под формата на 20 таблетка с подходящи ексципиенти, използвани обикновено при формиране на таблетки.
Що се отнася до еталона, възможно е да се включи графика, показваща връзката между концентрациите на антибиотик и процента 25 на остатъчната активност на ензим R39. Може също така да се проведат количествени определяния, както бе описано по-горе. Тази графика не винаги е задължителна. Когато методиката служи за определяне единствено дали кон- 30 центрацията на антибиотик надвишава или не някаква граница, в начина на приложение трябва да се обозначи единствено при каква концентрация на антибиотик се наблюдава изменение на оцветяването след обработка на про- 35 бата съгласно метода.
Следващите по-долу примери илюстрират изобретението, без да го ограничават,
Пример 1.
Този пример показва, че с метода съг- 40 ласно изобретението бързо се определят много ниски концентрации на пеницилин G в мляко.
Приготвя се серия от проби от по 50 MI мляко, съдържащи известни концентрации на пеницилин G, както и две проби (бяла и сви- 45 детел) по 50 μΐ мляко, не съдържащи пеницилин G.
Към всяка проба (проба свидетел + проби, съдържащи пеницилин G) се добавят 1,5 pmol ензим R39, разтворен в 10 μΐ буфер на Hepes 50 0,5 М (pH 8), съдържащ NaCl 0,5 М и MgCl2 0,25 М и 20 μΙ воден разтвор, съдържащ 50 mg/ml D-аланин. За бялата проба ензим R39, разтворен в буфера на Hepes се заменя с 10 μΐ буфер на Hepes 0,5 М (pH 8), съдържащ NaCl 0,5 М и MgCl2 0,25 М (Hepes - 4-хидроксиетил-1 -пиперазинетансулфонова киселина). Сместа се инкубира при 47°С в продължение на 4 min.
След това се добавят 5 μΐ воден разтвор, съдържащ 5 mg/ml [(N-бензоил-О-аланил) тио] оцетна киселина и 10 μΐ разтвор на фосфатен буфер (pH 8, КН2РО4 + К2НРО4), съдържащ 2 mg/ml 5,5'-дитио-бис (2-нитробензоена) киселина и сместа се инкубира при 47°С в продължение на 1 min.
Полученото при различните проби оцветяване се наблюдава и получените резултати са дадени в таблица I.
Таблица I
| Проба | Концентрация на пеницилин G (U.l./ml) | Оцветяване |
| свидетел | 0 | жълто-много |
| интензивно | ||
| 1 | 0,004 | жълто-интензивно |
| 2 | 0,008 | жълто-умерено |
| 3 | 0,012 | жълто-бледо |
| 4 | 0,016 | бяло |
| 5 | 0,020 | бяло |
| 6 | 0,025 | бяло |
| бяла | ||
| проба | 0 | бяло |
От таблица I се вижда, че за концентрация за пеницилин G, равна или по-висока от 0,016 U.l./ml, се получава бяло оцветяване, идентично на полученото за бялата проба, докато под тази концентрация се появява жълто оцветяване, което става толкова по-интензивно, колкото е по-ниска концентрацията на пеницилин G, като се достига до много интензивно жълто оцветяване, отговарящо на концентрация 0 на пеницилин G (проба свидетел).
Ясно се вижда, че методът съгласно изобретението позволява за 5 min да се определи визуално дали млечната проба съдържа концентрация на пеницилин G 0,016 U.l./ml или повече, което прави методът отличен за бързо изследване на мляко в млекопреработващо предприятие или във ферма.
Пример 2.
Този пример илюстрира чувствителността на метода съгласно изобретението.
Работи се както в пример 1, с изключение на това, че към пробите се добавят 0,4 pmol ензим R39 (вместо 1,5 pmol). Първото инкубиране продължава 10 min (вместо 4 min) и второто определяне продължава 5 min (вместо 1 min).
Получените резултати са представени в таблица II.
Таблица II
| Проба | Концентрация на пеницилин G (U.I./ml) | Оцветяване |
| свидетел | 0 | жълто много интензивно |
| 1 | 0,001 | жълто интензивно |
| 2 | 0,002 | жълто умеренс |
| 3 | 0,003 | жълто бледо |
| 4 | 0,004 | бяло |
| 5 | 0,005 | бяло |
| 6 | 0,008 | бяло |
| 7 бяла | 0,010 | бяло |
| проба | 0 | бяло |
От данните в таблицата се вижда, че, прилагайки метода съгласно изобретението, е възможно визуалното определяне на концентрации най-малко 0,004 U.I./ml мляко за 15 min. Освен това, използвайки цветна скала, дори е възможно да се определят концентрации, по-ниски от 0,02 U.I./ml. Този метод позволява да се определи дали млякото съдържа концентрация на антибиотик, надвишаваща (или не) официалните норми, дори в страни, където тези норми са много строги.
Пример 3.
Приложение на метода съгласно изобретението за измерване на концентрации на антибиотик в по-значителни обеми проби. Работи се както в пример 1, с изключение на това, че пробите съдържат 3 ml мляко (вместо 50 μΐ).
Към всяка проба се добавят 24 pmol ензим R39, разтворен в 150 μΐ буфер на Hepes
0,5М (pH 8) (вместо 1,5 pmol) и 600 μΐ воден разтвор на D-аланин, съдържащ 100 mg/ml Dаланин.
Първата инкубация се провежда за 10 min (вместо 4 min) и след това се добавят 120 μΐ воден разтвор на [(М-бензоил-О-аланил)тио] оцетна киселина (вместо 5 μΐ) и 120 μΐ разтвор на фосфатен буфер (pH 8), съдържащ 5 mg/ml 5,5'-дитио-бис (2-нитробензоена) киселина.
Втората инкубация продължава 5 min (вместо 1 min).
Получените резултати са представени в таблица III.
Таблица III
| Проба | Концентрация на пеницилин G (U.I./ml) | Оцветяване |
| свидетел | 0 | жълто-много |
| интензивно | ||
| 1 | 0,002 | жълто-умерено |
| 2 | 0,003 | жълто-бледо |
| 3 | 0,004 | бяло |
| 4 | 0,006 | бяло |
| бяла | ||
| проба | 0 | бяло |
От данните в таблицата се вижда, че методът съгласно изобретението позволява да се определи визуално при големи обеми проба (3 ml) наличието на 0,004 U.I. пеницилин G/ ml мляко за 15 min. Той може лесно да бъде изпълнен от неквалифициран персонал.
Същите резултати се получават, когато се приложи методът съгласно изобретението за определяне на концентрацията на пеницилин G в проби от 1 ml мляко.
Пример 4.
Приложение на метода съгласно изобретението с други субстрати различни от [(Nбензоил-О-аланил)-тио] оцетна киселина. Методът се прилага по същия начин, както в пример 3. След първата инкубация се добавят 120 μΐ воден разтвор, съдържащ 5 mg/ml [(N-фенилацетил-0-аланил)тио] оцетна киселина.
Получените резултати са представени в таблица IV.
lllll IIUIII
Таблица IV
| Проба | Концентрация на пеницилин G (U.I./ml) | Оцветяване |
| свидетел 1 2 бяла проба | 0 0,003 0,006 0 | жълто-много интензивно жълто-бледо бяло бяло |
От данните в таблицата се вижда, че методът съгласно изобретението може да бъде при- 15 ложен успешно, използвайки [(N-фенилацетилD-аланил) тио] оцетна киселина като субстрат.
Пример 5.
Приложение на метода съгласно изобретението, използвайки като активатор на хидролизата на субстрата от ензима различни аминокиселини с D-конфигурация или глицин.
Методът се провежда по същия начин, както в пример 3. Водният разтвор, съдържащ 100 mg/ml D-аланин (опит I) се замества с воден разтвор, съдържащ 100 mg/ml Dфенилаланин (опит II), D-серин (опит III), D-хистидин (опит IV), D-метионин (опит V), D-2-аминобутирова киселина (опит VI) или с воден разтвор, съдържащ 200 mg/ml глицин (опит VII).
Получените резултати са представени в таблица V.
Таблица V
| Опит | Проба | Концентрация на пеницилин G (U.I./ml) | Оцветяване |
| свидетел | 0 | ||
| I | жълто-много интензивно | ||
| II | жълто-много интензивно | ||
| III | жълто-много интензивно | ||
| IV | жълто-много интензивно | ||
| V | жълто-много интензивно | ||
| VI | жълто-много интензивно | ||
| VII | жълто-много интензивно | ||
| 1 | 0,003 | ||
| I | жълто-бледо | ||
| II | жълто-бледо | ||
| III | жълто-бледо | ||
| IV | жълто-бледо | ||
| V | жълто-бледо | ||
| VI | жълто-бледо | ||
| VII | жълто-бледо | ||
| 2 | 0,006 | ||
| I | бяло | ||
| II | бяло | ||
| III | бяло | ||
| IV | бяло | ||
| V | бяло | ||
| VI | бяло | ||
| VII | бяло | ||
| бяла |
| 1 | проба | 0 | бяло |
| 11 | бяло | ||
| III | бяло | ||
| IV | бяло | ||
| V | бяло | ||
| VI | бяло | ||
| VII | бяло |
От данните в таблицата се вижда, че най-общо аминокиселините с D-конфигурация и глицинът са подходящи за приложение на изобретението.
Пример 6.
Приложение на метода съгласно изобретението за определяне на цефапирин, антибиотик от групата на цефалоспорините, в мляко.
Методът се провежда по същия начин, както в пример 3, но пробите от 3 ml мляко съдържат известни концентрации на цефапирин. Получените резултати са представени в таблица VI.
Таблица VI
| Проба | Концентрация на цефапирин gg/ml | Оцветяване |
| свидетел | 0 | жълто-много |
| интензивно | ||
| 1 | 0,002 | жълто-умерено |
| 2 | 0,003 | жълто-бледо |
| 3 | 0,004 | бяло |
| 4 | 0,006 | бяло |
| бяла | ||
| проба | 0 | бяло |
От данните в таблицата се вижда, че методът съгласно изобретението позволява визуалното определяне на наличието на 0,004 gg/ ml цефапирин в мляко за 15 min.
Пример 7.
Приложение на метода съгласно изобОсвен това след второто инкубиране с продължителност 5 min, пробите се центрофу15 гират и остатъците се разтварят 10 пъти с вода.
След това се измерва със спектрометър при 410 nm оптичната плътност.
Получените резултати са представени в таблица VII.
2Q Стойностите на оптичната плътност, представени в таблица VII, са получени след изваждане на стойността на оптичната плътност за бялата проба от намерената за пробата свидетел и за останалите проби.
Таблица VII
| 30 | Проба | Концентрация на пеницилин G (U.I./ml) | Оптична плътност (при 410 nm) |
| свидетел | 0 | 435 | |
| 1 | 0,002 | 226 | |
| 2 | 0,003 | 175 | |
| 35 | 3 | 0,004 | 49 |
| 4 бяла | 0,006 | 15 | |
| проба | 0 | 0 |
От данните в таблицата се вижда, че е възможно, използвайки спектрофотометър, да се определят количествено много ниски концентрации на пеницилин G (до 0,002 U.I./ml) в серумната проба.
Пример 8.
В този пример субстратът и реактивът, позволяващ определянето на 2-меркаптоалкаретението за определяне на ниски концентрации на пеницилин G в серум. Работи се, както в пример 3, но пробата от 3 ml мляко се замества с проби от по 3 ml серум, включващи познати концентрации на пеницилин G.
ниловата киселина са смесени под формата на таблетки.
Методът се реализира по същия начин, както в пример 3, като след първата инкубация с продължителност 10 min се добавя таб15
I
1.1,11. шии летка, съдържаща 600 pg [(М-бензоил-О-аланил)тио] оцетна киселина и 600 pg 5,5'-дитиобис(2-нитробензоена) киселина.
Общият състав на таблетката е следния в тегл.%: субстрат + реактив 4, полиетиленг- 5 ликол 6000 3, авицел* 27, амидон 10, лактоза 55, аеросил** 0,5 и магнезиев стеарат 0,5.
* - микрокристална целулоза ** - колоиден силициев двуокис Получените резултати са представени в 10 таблица VIII.
Таблица VIII
| Проба | Концентрация на пеницилин G (U.I./ml) | Оцветяване |
| свидетел | 0 | жълто-интен- |
| зивно | ||
| 1 | 0,002 | жълто-умерено |
| 2 | 0,003 | жълто-бледо |
| 3 | 0,004 | бяло |
| 4 | 0,006 | бяло |
| бяла | ||
| проба | 0 | бяло |
От данните в таблицата се вижда, че е възможно приложението на метода съгласно изобретението, смесвайки субстрата и реактива 30 за определянето на 2-меркаптоалканиловата киселина под формата на таблетка, което е предимство, както в практическо отношение, така и във връзка със стабилността на реактивите.
Claims (13)
1. Ензимен метод за определяне на антибиотици, съдържащи β-лактамов пръстен в биологични течности, включващ следните етапи: 40 (1) инкубация на биологичната течност с О-аланил-О-аланин-карбоксипептидаза, разтворим продукт на Actinomadura R39, която се провежда при условия, позволяващи наР-лактамовия антибиотик, евентуално присъстващ в 45 течността, да реагира с ензима, образувайки еквимолекулен ензимно-антибиотичен комплекс, който е неактивен и в голяма степен необратим;
(2) определено количество субстрат, 25 представляващ тиоестер с обща формула
R[-R2-S-CH-COOH
30 в която R3 има същото значение както по-горе и евентуално еталон, по отношение на който експерименталните резултати с реактиви (1), (2), (3) и (4) могат да се сравняват.
2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че субстратът е [(N-бензоил-О-аланил)тио] оцетна киселина.
(2) инкубация на получената смес след завършване на етап (1) с разтвор на субстрата 50 при условия, позволяващи хидролизата на субстрата от ензима, като се получава съединение, чието количество е пропорционално на остатъчната ензимна активност;
3. Метод съгласно претенции 1 или 2, характеризиращ се с това, че аминокиселината се избира между D-аланин, D-метионин, D-аргенин, D-фенилаланин, D-серин, D-хистидин, D-валин, D-триптофан и D-2-аминобутирова киселина.
(3) определяне количеството на образуваното в етап (2) съединение;
4. Метод съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че аминокиселината е D-аланин.
(4) сравнение на определената в етап (3) стойност с еталон за получаването на концентрацията на антибиотика в биологичната течност, характеризиращ се с това, че инкубацията в етап (2) се осъществява със субстрат, представляващ тиоестер с обща формула
R(-R2-S-CH-COOH R3 в която R, е бензоилов, фенилацетилов или 1Ча-ацетил-Ь-лизилов радикал, R2 е глицилов или D-аланилов радикал и R3 е водороден атом или метилов радикал, така че чрез хидролиза да се получи 2-меркаптоалканова киселина с формула
HS-CH-COOH R3 в която R3 има същото значение, както по-горе, и в присъствие на аминокиселина, активираща хидролизата на субстрата от ензима, като аминокиселината се избира между аминокиселина с D-конфигурация и глицин.
5. Метод съгласно претенции от 1 до 4, характеризиращ се с това, че етапите (2) и (3) се провеждат едновременно.
6. Метод съгласно претенции от 1 до 5, характеризиращ се с това, че биологичната течност се избира между мляко, серум, урина, слюнка, месни екстракти, ферментационни течности и буферирани водни разтвори.
7. Метод съгласно претенции от 1 до 6, характеризиращ се с това, че антибиотикът за определяне е избран между бензилпеницилин, ампицилин, фсноксиметилпеницилин, карбеницилин, метицилин, оксацилин, хлоксацилин, цефалоспорин С, цефалоглицин, цефалотин, цефалексин и цефапирин. 5
8. Метод съгласно претенции от 1 до 7, характеризиращ се с това, че количеството на 2-меркаптоалкановата киселина с формула
HS-CH-COOH
I се определя чрез инкубация на получената в етап (2) смес с 5,5'-дитио-бис(2-нитробензоена) киселина, така че да се получи 15 оцветяване, чиито интензитет е функция на количеството на 2-меркаптоалкановата киселина.
9. Набор за определяне на антибиотици, съдържащи β-лактамов пръстен в биологична течност, характеризиращ се с това, че включ- 20 ва (1) определено количество D-аланил-Оаланин-карбоксипептидаза разтворим продукт от Actinomadura R39;
10. Набор съгласно претенция 9, характеризираш се с това, че субстратът е {(Nбензоил-О-аланил)тио] -оцетна киселина.
11. Набор съгласно претенции 9 или 10, характеризиращ се с това, че аминокиселината с D-конфигурация е избрана между Dаланин, D-метионин, D-аргинин, D-фенилаланин, D-серин, D-хистидин, D-валин, D-триптофан и D-аминобутирова киселина.
12, характеризиращ се с това, че реактивът (4) е 5,5’-дитиобис (2-нитробензоена) киселина.
14. Набор съгласно претенции от 1 до
12. Набор съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че аминокиселината с D конфигурация е D-аланин.
13. Набор съгласно претенции от 1 до
13, характеризиращ се с това, че субстратът и реактив (4) са смесени под формата на таблетка.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB909009692A GB9009692D0 (en) | 1990-04-30 | 1990-04-30 | An enzymatic method of determining beta-lactam ring antibiotics |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG61082B2 true BG61082B2 (bg) | 1996-10-31 |
Family
ID=10675235
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG094327A BG61082B2 (bg) | 1990-04-30 | 1991-04-29 | Ензимен метод за определяне на антибиотици съдържащи бета-лактамов пръстен |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5246830A (bg) |
| EP (1) | EP0468946B1 (bg) |
| JP (1) | JP2823382B2 (bg) |
| AT (1) | ATE124998T1 (bg) |
| AU (1) | AU636482B2 (bg) |
| BG (1) | BG61082B2 (bg) |
| CA (1) | CA2040180C (bg) |
| CZ (1) | CZ280282B6 (bg) |
| DE (1) | DE69111149T2 (bg) |
| DK (1) | DK0468946T3 (bg) |
| ES (1) | ES2075414T3 (bg) |
| FI (1) | FI97151C (bg) |
| GB (1) | GB9009692D0 (bg) |
| GR (1) | GR3017235T3 (bg) |
| HU (1) | HU214926B (bg) |
| IE (1) | IE69037B1 (bg) |
| NO (1) | NO302664B1 (bg) |
| NZ (1) | NZ237950A (bg) |
| PL (1) | PL169360B1 (bg) |
| PT (1) | PT97511B (bg) |
| SK (1) | SK279176B6 (bg) |
| YU (1) | YU48050B (bg) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100614632B1 (ko) * | 1997-10-07 | 2006-08-22 | 네오젠 코포레이션 | 액체 유제품내의 분석물질을 결정하기 위한 검정 장치 |
| US6143513A (en) * | 1999-06-23 | 2000-11-07 | Biacore Ab | Method and kit for detecting betalactam-containing compounds |
| PL385415A1 (pl) * | 2008-06-11 | 2009-12-21 | Marek Ciesielski | Sposób wykrywania bakteriooporności, zestaw diagnostyczny oraz zastosowanie oznaczania obecności leku i/lub produktów jego rozpadu |
| US9689021B2 (en) * | 2011-10-14 | 2017-06-27 | Université de Liège | Method for measuring beta-lactam antibiotics |
| CN111830015B (zh) * | 2019-04-18 | 2022-12-09 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 一种定量检测抗生素的方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2824863A (en) * | 1952-11-14 | 1958-02-25 | Ciba Pharm Prod Inc | Acylmercapto compounds |
| US4166825A (en) * | 1978-08-17 | 1979-09-04 | Abbott Laboratories | Chromogenic substrates |
| CA1185881A (en) * | 1982-02-01 | 1985-04-23 | Jacques Degelaen | ENZYMATIC PROCESS FOR THE DETERMINATION OF .beta.-LACTAM ANTIBIOTICS |
| US4806478A (en) * | 1984-10-17 | 1989-02-21 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Dry enzyme formulations containing D-amino acid oxidase |
| US4686182A (en) * | 1984-10-17 | 1987-08-11 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Method and kit for detecting antibiotics in a liquid sample |
-
1990
- 1990-04-30 GB GB909009692A patent/GB9009692D0/en active Pending
-
1991
- 1991-04-10 CA CA002040180A patent/CA2040180C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-26 PL PL91290061A patent/PL169360B1/pl unknown
- 1991-04-26 ES ES91870070T patent/ES2075414T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-26 JP JP3096762A patent/JP2823382B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-04-26 DE DE69111149T patent/DE69111149T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-26 US US07/692,355 patent/US5246830A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-26 AT AT91870070T patent/ATE124998T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-04-26 AU AU76226/91A patent/AU636482B2/en not_active Ceased
- 1991-04-26 NZ NZ237950A patent/NZ237950A/en unknown
- 1991-04-26 DK DK91870070.9T patent/DK0468946T3/da active
- 1991-04-26 EP EP91870070A patent/EP0468946B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-29 BG BG094327A patent/BG61082B2/bg unknown
- 1991-04-29 PT PT97511A patent/PT97511B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-04-29 NO NO911692A patent/NO302664B1/no unknown
- 1991-04-29 IE IE143391A patent/IE69037B1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-04-29 HU HU911441A patent/HU214926B/hu not_active IP Right Cessation
- 1991-04-29 FI FI912054A patent/FI97151C/fi active
- 1991-04-30 SK SK1246-91A patent/SK279176B6/sk unknown
- 1991-04-30 YU YU78391A patent/YU48050B/sh unknown
- 1991-04-30 CZ CS911246A patent/CZ280282B6/cs not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-08-30 GR GR950402344T patent/GR3017235T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH11502101A (ja) | 電気化学発光検定 | |
| JP2809537B2 (ja) | リステリア属の細菌を同定する方法及び媒質 | |
| WO1989003889A1 (en) | Detection of microbial beta-lactamase | |
| JP2011509680A (ja) | クロストリジウム・ディフィシルを検出及び／又は同定する方法 | |
| BG61082B2 (bg) | Ензимен метод за определяне на антибиотици съдържащи бета-лактамов пръстен | |
| US4546076A (en) | Enzymatic process for the determination of beta-lactam antibiotics | |
| JPH06125791A (ja) | 乳清及び乳清含有物質中の細菌数を測定するための方法及び分析キット | |
| JPS6156098A (ja) | 抗微生物活性物質の検出用試薬および検出方法 | |
| JP7083663B2 (ja) | ジンジパインを産生する微生物又はジンジバリス菌を検出する方法及びキット | |
| EP0325472B1 (en) | Composition for testing periodontal diseases | |
| US3990946A (en) | Substrate for the determination of desoxy-ribonuclease | |
| Thorogood et al. | An evaluation of the Penzym® assay: a rapid method for the detection of β‐lactam antibiotics in milk | |
| Baker | A sensitive procedure for screening microorganisms for the presence of penicillin amidase | |
| SU1041568A1 (ru) | Реагент дл определени аденозин-5-трифосфата | |
| SU1497218A1 (ru) | Способ определени активности гликогенфосфорилазы | |
| JPH0662893A (ja) | Ｅ．ｃｏｌｉの迅速検出法 | |
| JP2002510504A (ja) | プロテイナーゼ基質として酵素を用いるプロテイナーゼ定量法 | |
| Coulet et al. | Luminescence in biosensor design | |
| JPS6146117B2 (bg) | ||
| JPH119298A (ja) | 細菌を検出する方法 | |
| JPH01148198A (ja) | サルコシンの定量法 |