JPH119298A - 細菌を検出する方法 - Google Patents
細菌を検出する方法Info
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- JPH119298A JPH119298A JP18035697A JP18035697A JPH119298A JP H119298 A JPH119298 A JP H119298A JP 18035697 A JP18035697 A JP 18035697A JP 18035697 A JP18035697 A JP 18035697A JP H119298 A JPH119298 A JP H119298A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】培養時間を短縮し、微量に存在する細菌を簡便
かつ迅速に検出する方法を提供する。 【解決手段】増殖している細菌を含む可能性のある測定
系に過酸化水素を接触させるとともに、過酸化水素を受
容体とする発光試薬又は発色試薬と反応させ、その発光
強度又は発色強度によって過酸化水素の分解の有無を判
定し、それによって細菌を検出する。
かつ迅速に検出する方法を提供する。 【解決手段】増殖している細菌を含む可能性のある測定
系に過酸化水素を接触させるとともに、過酸化水素を受
容体とする発光試薬又は発色試薬と反応させ、その発光
強度又は発色強度によって過酸化水素の分解の有無を判
定し、それによって細菌を検出する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は細菌を検出する方法
に属し、特に微量の細菌の存在の位置を迅速かつ確実に
測定する方法に関する。
に属し、特に微量の細菌の存在の位置を迅速かつ確実に
測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】医薬品、化粧品、食品等の製品あるいは
人体に存在する細菌が病原性の場合、人体に感染し増殖
して病気を引き起こす原因となる。これらを予防するた
め事前に細菌検査が行われ、また発病の場合は人体に存
在する病原菌の抗生物質を検索するために感受性試験が
行われる。従来の検査方法では、寒天培地に目的とする
細菌が増殖するか否かを長時間の培養後に目視で確認し
ている。一般的な培養時間は２４時間から数日である。
そして、肉眼で細菌のコロニーあるいは皮膜が確認でき
た段階で細菌の増殖位置を検出し、その位置に分析機器
の照準を合わせて細菌の数を計測することにより、細菌
による検査対象の汚染度を評価している。
人体に存在する細菌が病原性の場合、人体に感染し増殖
して病気を引き起こす原因となる。これらを予防するた
め事前に細菌検査が行われ、また発病の場合は人体に存
在する病原菌の抗生物質を検索するために感受性試験が
行われる。従来の検査方法では、寒天培地に目的とする
細菌が増殖するか否かを長時間の培養後に目視で確認し
ている。一般的な培養時間は２４時間から数日である。
そして、肉眼で細菌のコロニーあるいは皮膜が確認でき
た段階で細菌の増殖位置を検出し、その位置に分析機器
の照準を合わせて細菌の数を計測することにより、細菌
による検査対象の汚染度を評価している。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記従
来の方法では製品の出荷期限や病人の処置決定時限まで
に間に合わないことがあり、より短時間で細菌の存在を
確認できる方法が望まれている。それ故、本発明の目的
は、培養時間を短縮し、微量に存在する細菌を簡便かつ
迅速に検出する方法を提供することである。
来の方法では製品の出荷期限や病人の処置決定時限まで
に間に合わないことがあり、より短時間で細菌の存在を
確認できる方法が望まれている。それ故、本発明の目的
は、培養時間を短縮し、微量に存在する細菌を簡便かつ
迅速に検出する方法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明の検出方法は、増殖している細菌を含む可能
性のある測定系に過酸化水素を接触させ、過酸化水素の
分解の有無に基づくことを特徴とする。
に、本発明の検出方法は、増殖している細菌を含む可能
性のある測定系に過酸化水素を接触させ、過酸化水素の
分解の有無に基づくことを特徴とする。
【０００５】多くの細菌の細胞質および細胞膜には過酸
化水素を分解するカタラーゼが存在する。従って、カタ
ラーゼを有する細菌に過酸化水素を作用させれば過酸化
水素は分解される。このため、過酸化水素の分解の有無
を知ることで、細菌の存在を知ることができる。
化水素を分解するカタラーゼが存在する。従って、カタ
ラーゼを有する細菌に過酸化水素を作用させれば過酸化
水素は分解される。このため、過酸化水素の分解の有無
を知ることで、細菌の存在を知ることができる。
【０００６】過酸化水素の分解の有無は、たとえ細菌が
微量であっても公知の技術で容易に判定できる。例え
ば、過酸化水素と反応し発光する化学発光試薬あるいは
発色する発色試薬を作用させ、その結果としての発光強
度あるいは発色強度を高感度ＣＣＤカメラあるいはデン
シトメーターで計測することにより、無発光又は無発色
ないし発光強度又は発色強度の低い部分をもって、細菌
が存在する位置であると判定できる。従って、従来のよ
うに肉眼で細菌のコロニーを観察するのと異なり、目視
できない微量の細菌であっても確認することができる。
その結果、培養時間は数時間で足り、従来のように数日
を要していたのに比べて、著しく迅速に細菌を検出する
ことができる。
微量であっても公知の技術で容易に判定できる。例え
ば、過酸化水素と反応し発光する化学発光試薬あるいは
発色する発色試薬を作用させ、その結果としての発光強
度あるいは発色強度を高感度ＣＣＤカメラあるいはデン
シトメーターで計測することにより、無発光又は無発色
ないし発光強度又は発色強度の低い部分をもって、細菌
が存在する位置であると判定できる。従って、従来のよ
うに肉眼で細菌のコロニーを観察するのと異なり、目視
できない微量の細菌であっても確認することができる。
その結果、培養時間は数時間で足り、従来のように数日
を要していたのに比べて、著しく迅速に細菌を検出する
ことができる。
【０００７】測定系は検体そのものであってもよいが、
通常は寒天培地あるいは培養液である。そして、培地中
に増殖する細菌に、過酸化水素を作用させる。その後、
発光試薬又は発色試薬を滴下又は塗布し、観察する。
通常は寒天培地あるいは培養液である。そして、培地中
に増殖する細菌に、過酸化水素を作用させる。その後、
発光試薬又は発色試薬を滴下又は塗布し、観察する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明の一実施形態（態様１）に
おいては、測定系に接触させた過酸化水素を、ペルオキ
シダーゼのように過酸化水素を受容体とする酵素を介し
て間接的に発光試薬と反応させる。反応後の発光強度を
高感度ＣＣＤカメラあるいは発光測定機器で計測するこ
とにより、細菌によって過酸化水素が分解し、その結果
として発光強度が減少することを確認する。この発光試
薬としては、ルミノールあるいはイソルミノールとその
誘導体が好ましい。
おいては、測定系に接触させた過酸化水素を、ペルオキ
シダーゼのように過酸化水素を受容体とする酵素を介し
て間接的に発光試薬と反応させる。反応後の発光強度を
高感度ＣＣＤカメラあるいは発光測定機器で計測するこ
とにより、細菌によって過酸化水素が分解し、その結果
として発光強度が減少することを確認する。この発光試
薬としては、ルミノールあるいはイソルミノールとその
誘導体が好ましい。
【０００９】また、本発明の別の実施形態（態様２）に
おいては、測定系に接触させた過酸化水素を、ペルオキ
シダーゼのような過酸化水素を受容体とする酵素を介し
て間接的に発色試薬と反応させる。反応後の発色強度を
デンシトメーター（濃度計）で計測することにより、細
菌によって過酸化水素が分解し、その結果として発色強
度が減少することを確認する。
おいては、測定系に接触させた過酸化水素を、ペルオキ
シダーゼのような過酸化水素を受容体とする酵素を介し
て間接的に発色試薬と反応させる。反応後の発色強度を
デンシトメーター（濃度計）で計測することにより、細
菌によって過酸化水素が分解し、その結果として発色強
度が減少することを確認する。
【００１０】発色試薬としては、多種のフェノール系水
素供与体やアニリン系水素供与体あるいはロイコ体が市
販されているが、発色物質である酸化生成物が著しく発
色するものとして、Ｏ−フェニレンジアミン、３，３’
−ジアミノベンジジン、２，２’−アジノージ（３−エ
チルベンズチアゾリンスルホン酸）、ロイコクリスタル
バイオレット、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニ
ル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニル
アミノナトリウム（略称ＤＡ−６４）、または１０−
（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス
（ジメチルアミノ）−フェノチアジンナトリウム（略称
ＤＡ−６７）などがある。感度の点で後２者が優れてい
る。
素供与体やアニリン系水素供与体あるいはロイコ体が市
販されているが、発色物質である酸化生成物が著しく発
色するものとして、Ｏ−フェニレンジアミン、３，３’
−ジアミノベンジジン、２，２’−アジノージ（３−エ
チルベンズチアゾリンスルホン酸）、ロイコクリスタル
バイオレット、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニ
ル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニル
アミノナトリウム（略称ＤＡ−６４）、または１０−
（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス
（ジメチルアミノ）−フェノチアジンナトリウム（略称
ＤＡ−６７）などがある。感度の点で後２者が優れてい
る。
【００１１】細菌によって過酸化水素が分解した位置と
残存する過酸化水素の位置とを識別するためには、長時
間安定に発光できる、あるいは発色できる反応系を構築
する必要がある。この点、酵素はそれらの反応を促進す
るので、酵素を利用すると好ましい。本発明の目的上、
利用する酵素は、過酸化水素を受容体とするペルオキシ
ダーゼが好ましい。
残存する過酸化水素の位置とを識別するためには、長時
間安定に発光できる、あるいは発色できる反応系を構築
する必要がある。この点、酵素はそれらの反応を促進す
るので、酵素を利用すると好ましい。本発明の目的上、
利用する酵素は、過酸化水素を受容体とするペルオキシ
ダーゼが好ましい。
【００１２】検出の手順は、例えば次のようである。寒
天培地表面に細菌を含む溶液を拡散させ、一定時間培養
する。次に寒天培地表面に一定濃度の過酸化水素を噴霧
あるいは過酸化水素の皮膜形成の処理を行い、一定時間
一定温度で放置（インキュベーション）する。更に寒天
培地表面に酵素を含む発光試薬あるいは発色試薬の皮膜
を形成し、速やかに発光強度あるいは発色強度をそれぞ
れ高感度ＣＣＤカメラあるいはデンシトメーターで計測
し、無発光あるいは無色の位置を検出確認する。また、
培養液の場合は、細菌を一定時間培養した後、一定濃度
の過酸化水素を添加混合し、一定時間インキュベーショ
ンする。そして、酵素を含む発光試薬あるいは発色試薬
を加えて、細菌を含んでいない対照培養液と比較して、
発光強度あるいは発色強度の減少を計測し、細菌の存在
を確認する。
天培地表面に細菌を含む溶液を拡散させ、一定時間培養
する。次に寒天培地表面に一定濃度の過酸化水素を噴霧
あるいは過酸化水素の皮膜形成の処理を行い、一定時間
一定温度で放置（インキュベーション）する。更に寒天
培地表面に酵素を含む発光試薬あるいは発色試薬の皮膜
を形成し、速やかに発光強度あるいは発色強度をそれぞ
れ高感度ＣＣＤカメラあるいはデンシトメーターで計測
し、無発光あるいは無色の位置を検出確認する。また、
培養液の場合は、細菌を一定時間培養した後、一定濃度
の過酸化水素を添加混合し、一定時間インキュベーショ
ンする。そして、酵素を含む発光試薬あるいは発色試薬
を加えて、細菌を含んでいない対照培養液と比較して、
発光強度あるいは発色強度の減少を計測し、細菌の存在
を確認する。
【００１３】
−実施例１（態様２による細菌の検出）− （１）操作方法 大腸菌をトリプトソイ培地で３７℃で１２時間培養し
た。
た。
【００１４】これを生理食塩水で洗浄後、生理食塩水
で希釈して菌体の濁度をマクファーランドＮｏ．０．５
のレベルに合わせた。 の菌体懸濁液をの培地とは別のトリプトソイ寒天
培地に一滴滴下し半面を塗布した。
で希釈して菌体の濁度をマクファーランドＮｏ．０．５
のレベルに合わせた。 の菌体懸濁液をの培地とは別のトリプトソイ寒天
培地に一滴滴下し半面を塗布した。
【００１５】上記温度で４時間培養した。 の寒天培地に１０ｍＭの過酸化水素の水溶液を一滴
づつ、菌体を塗布した部分と、塗布していない部分に滴
下した。 ２５℃で５分間放置（インキュベーション）した。
づつ、菌体を塗布した部分と、塗布していない部分に滴
下した。 ２５℃で５分間放置（インキュベーション）した。
【００１６】ルミノール溶液（１０ｍｇのルミノール
を１ｍｌのジメチルスルホキシドに溶解したもの）を一
滴づつ、の滴下部分に滴下した。 ペルオキシダーゼ溶液（５ｍｇのペルオキシダーゼと
１０ｍｇの牛アルブミンを１０ｍｌの０．１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ／ＨＣｌ：ｐＨ＝８．５に溶解したもの）をの滴下
部分に一滴づつ滴下した。 ３０秒後に発光強度を高感度ＣＣＤカメラで測定し
た。
を１ｍｌのジメチルスルホキシドに溶解したもの）を一
滴づつ、の滴下部分に滴下した。 ペルオキシダーゼ溶液（５ｍｇのペルオキシダーゼと
１０ｍｇの牛アルブミンを１０ｍｌの０．１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ／ＨＣｌ：ｐＨ＝８．５に溶解したもの）をの滴下
部分に一滴づつ滴下した。 ３０秒後に発光強度を高感度ＣＣＤカメラで測定し
た。
【００１７】（２）結果および考察 大腸菌を含む懸濁液塗布した寒天培地の表面には、発光
反応が検出されず、大腸菌を塗布していない表面は発光
反応が観察された。このことから、従来であればの操
作過程において寒天培地で２４時間培養しないと目視で
きなかった大腸菌の存在が、この実施例では４時間の培
養で観察され、従来法と比べて大幅な細菌検出時間の短
縮が可能になった。
反応が検出されず、大腸菌を塗布していない表面は発光
反応が観察された。このことから、従来であればの操
作過程において寒天培地で２４時間培養しないと目視で
きなかった大腸菌の存在が、この実施例では４時間の培
養で観察され、従来法と比べて大幅な細菌検出時間の短
縮が可能になった。
【００１８】−実施例２（態様１による感受性試験）− （１）操作方法 大腸菌と緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)をそれぞれ
トリプトソイ培地で１２時間３７℃で培養した。
トリプトソイ培地で１２時間３７℃で培養した。
【００１９】上記大腸菌および緑膿菌をそれぞれ生理
食塩水で洗浄し菌体溶液とした。 上記菌体溶液の濁度を生理食塩水でマクファ−ランド
Ｎｏ．５のレベルに合わせた。 の菌体懸濁液をの培地とは別のトリプトソイ寒天
培地に一滴塗布した。 上記寒天培地上に同じ直径のセフォペラゾンとゲンタ
マイシンの各抗生物質ディスクを置いた。
食塩水で洗浄し菌体溶液とした。 上記菌体溶液の濁度を生理食塩水でマクファ−ランド
Ｎｏ．５のレベルに合わせた。 の菌体懸濁液をの培地とは別のトリプトソイ寒天
培地に一滴塗布した。 上記寒天培地上に同じ直径のセフォペラゾンとゲンタ
マイシンの各抗生物質ディスクを置いた。
【００２０】上記寒天培地を３７℃で４時間培養し
た。 上記寒天培地の表面に１０ｍＭの過酸化水素を噴霧し
た。 ５分後、寒天培地の表面にルミノール溶液（５ｍｇの
ルミノールと１０ｍｇの牛アルブミンを１０ｍｌの０．
１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ：ｐＨ＝８．５に溶解したも
の）を噴霧した。 所定時間毎にＣＣＤカメラで発光強度から抗生物質に
よる菌体の生育阻止円の直径を測定した。
た。 上記寒天培地の表面に１０ｍＭの過酸化水素を噴霧し
た。 ５分後、寒天培地の表面にルミノール溶液（５ｍｇの
ルミノールと１０ｍｇの牛アルブミンを１０ｍｌの０．
１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ：ｐＨ＝８．５に溶解したも
の）を噴霧した。 所定時間毎にＣＣＤカメラで発光強度から抗生物質に
よる菌体の生育阻止円の直径を測定した。
【００２１】（２）結果および考察 ディスク内の抗生物質は、４時間経過するまでは寒天培
地に一定速度で拡散したが、その後２４時間放置しても
大きな拡散は観察されなかったことから、寒天培地上で
の抗生物質に対する感受性試験を４時間で行った。従っ
て、４時間後に測定した生育阻止円の直径を表１に示
す。
地に一定速度で拡散したが、その後２４時間放置しても
大きな拡散は観察されなかったことから、寒天培地上で
の抗生物質に対する感受性試験を４時間で行った。従っ
て、４時間後に測定した生育阻止円の直径を表１に示
す。
【００２２】
【表１】 表１に示すように、大腸菌と緑膿菌は抗生物質セファペ
ラゾンに比べてゲンタマイシンに強い感受性を示した。
この結果は、従来法の２４時間以上要した感受性試験の
結果と一致した。従って、従来２４時間を要した感受性
試験が本例では４時間程度で完了することが分かった。
ラゾンに比べてゲンタマイシンに強い感受性を示した。
この結果は、従来法の２４時間以上要した感受性試験の
結果と一致した。従って、従来２４時間を要した感受性
試験が本例では４時間程度で完了することが分かった。
【００２３】−実施例３（態様２による細菌の検出）− （１）操作方法 大腸菌を実施例１−に従って培養し、寒天培地に
塗布した。
塗布した。
【００２４】３７℃で４時間培養した。 １０ｍＭの過酸化水素を噴霧した。 ２分間上記温度でインキュベーションした。 ロイコクリスタルバイオレットの溶液（５０ｍｇのロ
イコクリスタルバイオレットをジメチルスルホキシド２
０ｍｌに溶解したもの）を噴霧した。
イコクリスタルバイオレットをジメチルスルホキシド２
０ｍｌに溶解したもの）を噴霧した。
【００２５】続いてペルオキシダーゼの溶液（１２．
５ｍｇのペルオキシダーゼを５０ｍｌの１Ｍの酢酸緩衝
液：ｐＨ＝５．０に溶解したもの）を噴霧した。 ３分後に発色強度を肉眼で観察した。
５ｍｇのペルオキシダーゼを５０ｍｌの１Ｍの酢酸緩衝
液：ｐＨ＝５．０に溶解したもの）を噴霧した。 ３分後に発色強度を肉眼で観察した。
【００２６】（２）結果および考察 大腸菌を塗布した部分は無色で、大腸菌を塗布しなかっ
た部分は青に染まった。このことから、従来であれば
の操作過程において寒天培地で２４時間培養しないと目
視できなかった大腸菌の存在が、この実施例では４時間
の培養で観察され、従来法と比べて大幅な細菌検出時間
の短縮が可能になった。また、目視で観察されることか
ら、従来法よりも簡便である。なお、測定精度を高める
ためにデンシトメーターを使用してもよい。
た部分は青に染まった。このことから、従来であれば
の操作過程において寒天培地で２４時間培養しないと目
視できなかった大腸菌の存在が、この実施例では４時間
の培養で観察され、従来法と比べて大幅な細菌検出時間
の短縮が可能になった。また、目視で観察されることか
ら、従来法よりも簡便である。なお、測定精度を高める
ためにデンシトメーターを使用してもよい。
【００２７】
【発明の効果】以上のように、本発明の検出方法は、細
菌を迅速かつ簡単に検出することができるので、製品の
出荷作業又は病人の処置決定作業に有益である。
菌を迅速かつ簡単に検出することができるので、製品の
出荷作業又は病人の処置決定作業に有益である。
Claims (6)
- 【請求項１】増殖している細菌を含む可能性のある測定
系に過酸化水素を接触させ、過酸化水素の分解の有無に
基づくことを特徴とする細菌を検出する方法。 - 【請求項２】前記過酸化水素の分解の有無は、過酸化水
素を受容体とする発光試薬又は発色試薬と反応させ、そ
の発光強度又は発色強度によって判定する請求項１に記
載の方法。 - 【請求項３】前記反応は酵素を介して行われる請求項２
に記載の方法。 - 【請求項４】前記酵素はペルオキシダーゼである請求項
３に記載の方法。 - 【請求項５】前記発光試薬はルミノール、イソルミノー
ル又はそれらの誘導体である請求項２〜４のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項６】前記発色試薬はフェノール系水素供与体、
アニリン系水素供与体又はロイコ体である請求項２〜４
のいずれかに記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18035697A JPH119298A (ja) | 1997-06-20 | 1997-06-20 | 細菌を検出する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18035697A JPH119298A (ja) | 1997-06-20 | 1997-06-20 | 細菌を検出する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH119298A true JPH119298A (ja) | 1999-01-19 |
Family
ID=16081816
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18035697A Pending JPH119298A (ja) | 1997-06-20 | 1997-06-20 | 細菌を検出する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH119298A (ja) |
-
1997
- 1997-06-20 JP JP18035697A patent/JPH119298A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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| RD05 | Notification of revocation of power of attorney |
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|
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|
| A02 | Decision of refusal |
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