PL84464B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest papierek wskazni¬ kowy do wykrywania i oznaczania aktywnosci gamma-glutamylotranspeptydazy o numerze syste¬ matycznym E.C.2.3.2.2.Gamma-glutamylotranspeptydaza jest enzymem wystepujacym w wielu tkankach i plucach ustrojo¬ wych ludzi, zwierzat oraz w wielu drobnoustro¬ jach. Oznaczenie aktywnosci tego enzymu w suro¬ wicy i moczu jest powszechnie wykorzystane w praktyce klinicznej przy diagnostyce niektórych schorzen watroby, trzustki, serca itp., a test na wy¬ krycie jego obecnosci ma znaczenie w róznicowaniu bakterii.Do oznaczenia aktywnosci gamma-glutamylor- transpeptydazy stosuje -sie obecnie chromogenne substraty jak: 7-L-glutamylo- a- i -/)-naftyloamidy, 7-L-glutamylo-p-nitroanilid ' lub y-DL-glutamylo- anilid.Dotychczasowy sposób oznaczania aktywnosci te¬ go enzymu polega na inkubacji substratu z bada¬ nym materialem, a uwolniona w reakcji enzyma¬ tycznej naftyloamine, p-nitroaniline lub aniline oznacza sie kolorymetrycznie lub fluorymetrycznie.Sposób ten jest klopotliwy, poniewaz wymaga kaz¬ dorazowo przygotowania roztworu substratu, co jest mozliwe dopiero po ogrzaniu.Po ochlodzeniu do temperatury pokojowej z re¬ guly stosunkowo szybko z roztworu wypadaja krysztaly substratu. Poza tym dluzsze lub kilka¬ krotne ogrzewanie substratu powoduje jego czes- ciowa hydrolize, w wyniku czego uwalnia sie od¬ powiednia amina (naftyloamina, p-nitroanilina lub anilina) co zwieksza odczyn barwy próby kontrol¬ nej utrudniajace dokladne oznaczenie aktywnosci enzymu.Oprócz tego dozowanie roztworu substratu do ba¬ danego roztworu jest niezbyt dokladne z powodu strat substratu zwiazanych z jego szybka krystali¬ zacja w pipecie, a takze zwilzalnoscia scianek pi¬ pety i probówki co zmniejsza dokladnosc oznacza¬ nia aktywnosci gamma-glutamylotranspeptydazy.Okazalo sie, ze uzycie bibuly nasyconej substra- tem i buforem calkowicie eliminuje koniecznosc uprzedniego rozpuszczania substratu w podwyzszor nej temperaturze oraz wyklucza straty zwiazane z jego dozowaniem.Tak wiec do wykrywania i oznaczania gamma- -glutamylotranspeptydazy mozna korzystnie stoso¬ wac papierek wskaznikowy wedlug wynalazku, który stanowi bibule nasycona chromogenowym substratem bedacym substancja wskaznikowa oraz buforem utrzymujacym pozadane pH podczas po¬ miaru, najkorzystniej w granicach pH 8,6—9,0. Ko¬ rzystnie jest, aby bibula nasycona byla równiez aktywatorem, zwlaszcza glicyloglicyna, gdyz pozwa¬ la to na mniejsze zuzycie chromogenowego sub¬ stratu.W celu wytworzenia papierka wskaznikowego postepuje sie zgodnie z wynalazkiem w sposób na¬ stepujacy. Bibule nasycona roztworem substratu 84 4643 chromogenowego w lotnym kwasie, najkorzystniej w kwasie solnym, a nastepnie po wysuszeniu na¬ syca sie ja buforem utrzymujacym pH w granicach przydatnych przy prowadzeniu pomiaru, najko- rzystniej 8,6—9,0 z dodatkiem aktywatora.Oczywiste jest, ze zastosowanie innego nosnika, niz bibula na przyklad innego tworzywa nasiakli- wego, a obojetnego chemicznie w stosunku do sto¬ sowanych substancji wskaznikowych, buforów, ak¬ tywatorów i oznaczonego enzymu, nie wykracza po¬ za zakres niniejszego wynalazku.Nalezy nadmienic, ze za pomoca papierków wskaznikowych wedlug wynalazku mozna wykony¬ wac w sposób prosty i szybki rutynowe wykrywa¬ nie i oznaczanie aktywnosci gamma-glutamylo- transpeptydazy w warunkach laboratoriów klinicz¬ nych oraz lecznictwa otwartego przy znacznym za¬ oszczedzeniu drogich odczynników.Przyklad I. Papierki wskaznikowe wykonano w sposób nastepujacy: Pasek bibuly Whatman No 3 (wymiary 10X58 cm) nasycono 13 ml 0,025 m y-L-glutamylo-p-nitroani- lidu rozpuszczonego w 0,3 n kwasie solnym. Po dokladnym wysuszeniu w temperaturze pokojowej bibule nasycono 13 ml 2,5 m buforu Tris HC1 o pH 8,8 z dodatkiem 0,05 m glicyloglicyny. Po wyschnie¬ ciu bibule pocieto na krazki o srednicy 1 cm. Na¬ stepnie przeprowadzono oznaczenie aktywnosci gamma-glutamylotranspeptydazy. Do 0,4 ml wody destylowanej lub soli fizjologicznej dodano jeden krazek, po czym inkubowano 10—30 minut w 37°.Reakcje enzymatyczna rozpoczeto przez dodanie 0,1 ml surowicy krwi lub moczu, po czym inkubo¬ wano w 37° przez 60 min. Po dodaniu 3 ml 10% kwasu octowego uwolniona w reakcji enzymatycz¬ nej p-nitroaniline oznaczono kolorymetrycznie mie¬ rzac ekstynkcje przy 410 nm. Ilosc p-nitroaniliny wyznaczono z krzywej standardowej sporzadzonej przy uzyciu czystej substancji.W wypadku wykrywania aktywnosci enzymu do 0,5 ml badanego roztworu (np. zawiesina bakterii) dodano jeden krazek i inkubowano 3 godziny w 37°. Zólta barwa próbki swiadczy o obecnosci enzymu.Przyklad II. Papierki wskaznikowe wykona¬ no w sposób nastepujacy: Pasek bibuly jak w przykladzie I, nasycono 13 ml 0,1 m 7-L-glutamylo-a-naftyloamidu rozpusz¬ czonego w 0,3 m , kwasie solnym i po wysuszeniu w temperaturze pokojowej bibule nasycono 13 ml [464 4 2,5 m buforu Tris/HCl pH 8,8 z dodatkiem 0,1 m glicyloglicyny. Po wysuszeniu bibule pocieto na krazki o srednicy 1 cm. Nastepnie przeprowadzono oznaczenie aktywnosci enzymu. Do 0,4 ml wody lub soli fizjologicznej dodano 1 krazek i po inku¬ bacji przez 30 min. w 37° reakcje enzymatyczna roz¬ poczeto przez dodanie 0,1 ml surowicy krwi lub in¬ nego badanego materialu. Po dalszych 30 min. in¬ kubacji reakcje enzymatyczna przerwano dodajac 3 ml 0,02% tetraazowanej o-dwuanizydyny rozpusz¬ czonej w 10% kwasie octowym.W celu wytworzenia niebiesko-fiolkowego barw¬ nika roztwór inkubowano w 37° przez 60 min.Uwolniona w reakcji enzymatycznej a-naftyloamine oznaczono przez pomiar ekstynkcji przy 570 nm.Do kolorymetrycznego oznaczania naftyloaminy uwolnionej w reakcji enzymatycznej mozna takze uzyc 1% roztwór p-dwumetyloaminobenzaldehydu w 40% kwasie octowym. W tym przypadku powsta- jacy w ciagu 2—3 min. zólty barwnik oznacza sie przy 440 nm.Przyklad III. Pasek bibuly nasycono 0,1 m y-L-glutamyloanilidem w 0,2 m kwasie solnym i po wysuszeniu bibule wysycono 2,5 m buforem Tris (HC1 z dodatkiem 0,1 m glicyloglicyny). Krazki bi¬ buly uzyto do oznaczenia enzymu jak podano w przykladzie II, a uwolniona aniline oznacza sie kalorymetryczna metoda Brattona i Marshalla lub reakcja z p-dwumetyloaminobenzaldehydem. PL

Claims (3)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Papierek wskaznikowy do wykrywania i ozna- czania aktywnosci gamma-glutamylotranspeptyda¬ zy, znamienny tym, ze stanowi bibule nasycona chromogenowym substratem oraz aktywatorem en¬ zymu i buforem utrzymujacym pozadane pH pod¬ czas pomiaru. 40 2. Sposób wytwarzania papierka wskaznikowego do wykrywania i oznaczania gamma-glutamylo¬ transpeptydazy, znamienny tym, ze bibule nasyca sie roztworem chromogennego substratu takim jak
2. 2. L- lub DL- y-glutamylo-«-naftyloamidem, ^-anili- 45 dem lub -p-nitroanilidem w lotnym kwasie, ko¬ rzystnie w kwasie solnym, suszy sie a nastepnie nasyca sie buforem zawierajacym aktywator.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze 50 jako aktywator stosuje sie korzystnie glicyloglicyne, zas jako bufor o pH od 8—9 stosuje sie trójhydro- ksymetyloaminometan — HC1 lub fosforan potasu. RSW Zakl. Grai. W-wa, Srebrna 18, z. 419-780 Cena 10 zl — 130+20 egz. PL