DE2246695B2 - Verfahren zur Herstellung von Cholesterinoxidase und Verwendung derselben zur Bestimmung von Cholesterin - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Cholesterinoxidase und Verwendung derselben zur Bestimmung von Cholesterin

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DE2246695B2
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Description

(1) das Enzympräparat mit einer spezifischen Cholesterinoxidaseaktivität von wenigstens 1 Einheit pro 5 mg Proteinstickstoff und
(2) wenigstens ein Reagens, das zur Bestimmung der Menge verwendbar ist, in welcher ein Produkt bei der Cholesterinoxidasereaktiun gebildet wird.
10. Verwendung des Enzympräparates nach Anspruch 9 in gefriergetrockneter Form, die dann in ein wäßriges Präparat der gewünschten Wirkung mit einer Pufferlösung überführt wird.
11. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, wobei der Fertigpack die Komponenten in der erforderlichen Anzahl für die gleiche Anzahl von Untersuchungen enthält.
12. Verwendung nach Ansprüchen 9 bis 11, wobei das Reagens (2) ein Reagens enthält, das zur kolorimetrischen oder fluorimetrischen Bestimmung von Wssserstoffneroxid dient.
13. Verwendung nach Ansprüchen 9 bis 12, wobei das Enzympräparat eine spezifische Cholesterinoxidaseaktivität von wenigstens 1 Einheit pro 50 μg Proteinstickstoff aufweist und bei Vorliegen in flüssiger Form eine Wirkung von wenigstens 0,5 Einheiten/ml besitzt
14. Verwendung nach Ansprüchen 9 bis 13, wobei zur Bestimmung des Gesamtcholesterins im Serum der Fertigpack als zusätzliche Komponente (3) wenigstens ein saures Reagens zur Neutralisation des verseiften Serums enthält
Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.
Die Bestimmung von Gesamtcholesterin in seiner Rolle als Indikator für Arteriosklerose und beginnende Herzkranzgefäßleiden stellt derzeit etwa 3% der Gesamtzahl von durchgeführten Untersuchungen in klinisch-chemischen Laboratorien dar. Für Großbritannien bedeutet dies derzeit etwa 1,5 Millionen Cholesterinuntersuchungen pro Jahr.
Cholesterin wird derzeit nach der Liebermann- Bur-
chard-Reaktion bestimmt, welche die Verwendung von
jo stark korrodierenden und viskosen Reagentien bedingt und daher für die Automatisierung viele Hindernisse bietet
Viele Arten von Nocardia können Cholesterin metabolisieren und insbesondere wurde von Stadtman )5 et al, J. Bio«. Chem, 206 (1954), S. 511-523, gefunden, daß eine Mycobacteriumerde befähigt ist, Cholesterin zu /d4-Cholestenon abzubauen. Das für diese Reaktion verantwortliche Enzym Cholesterindehydrogenase kann in zellfreier Form mit niedriger Aktivität erhalten werden. Die Herstellung dieser Cholesterindehydrogenase aus der gleichen Mycobacteriumerde als etwas reineres, lösliches Enzympräparat und die Bestimmung der Aktivität des Enzyms ist von Stadtman in Methods in Enzymology (1955) 1, Seiten 678—681, beschrieben worden, jedoch ist das lösliche Enzym noch von geringer Aktivität und es wurde keine wesentliche Reinigung erreicht.
Die 2 im Anspruch 1 angegebenen NCI B-Stämme besitzen eine Cholesterinoxidaseaktivität, die Choleste-
w rin in 44-Cholestenon und Wasserstoffperoxid umwandelt. Die Verwendung von Cholesterinoxidase bietet die Grundlage für die enzymatische Bestimmung von Cholesterin in Flüssigkeiten und also auch von Gesamtcholesterin, die in einfacher Weise automatisiert
« werden kann und die Schwierigkeiten der Liebermann-Burchard-Reaktion vermeidet.
Die genannten 2 Mikroorganismen, die zur sogenannten Mycobacterium rhodocrous-Gruppe gehören, werden als »rauhe« und »glatte« Stämme bezeichnet und
bo haben die Bezeichnung NCIB 10 554 und NCIB 10 555 der National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Alberdeen, erhalten. Die zwei Mikroorganismen wurden auch beim Agricultural Research Service des Uniled States Department of
b5 Agriculture, beim ARS Culture Collection Investigations Fermentation Laboratory, Peoria, Illinois, USA, hinterlegt, wo sie die Bezeichnungen NRRL 5635 bzw. NRRL 5636 erhielten.
Die morphologischen Einzelheiten über diese Mikroorganismen sind wie folgt:
Rauhe Kolonie NCIB10 554 Morphologie (Nühragar, 300C)
Grampositiv, Koryneorganismen. Kein gut entwikkeltes Mycel, jedoch rudimentäre Verästelung vorhanden. Beim Altern der Kultur erscheinen kokkenähnliche Formen. Nicht frei beweglich.
Morphologie der Kolonie (Nähragar, 5 Tage, 30° C)
Kreisförmige, flache, vollständig trockene, opake, kremigorange Kolonien. 1,5—3 mm Durchmesser.
Hefe-Dextroseagar, 5 Tage, 30° C
Kreisförmige, hochstehende, ganze, opake, schwachrosa Kolonien. Trockene verkrustete Oberfläche. 1 mm Durchmesser.
Gelatineagar
Unregelmäßige Koloniekante, hochgestellt, stumpfe, verkrustete Oberfläche, opake, schwachweiße Farbe.
Eigelb-Agarplatten
Unregelmäßige Koloniekante, hochgestellt, stumpfe, rauhe Oberfläche, opak, iederfarben.
Eigenschaften in flüssiger Kultur
Weiße Oberflächenhaut, weißer, flockenförmiger Niederschlag, der sich beim Schütteln nicht vollständig dispergiert, keine Trübung.
Physiologie Vollständig aerob Gelatinehydrolyse + Caseinhydrolyse — Stärkehydrolyse - Kovacsoxidase —
Katalase +
Urease +
Indol
Vogue-Proskauer (V-P)-Test
Methylrot -
Entaminierung von Phenylalanin — Hippurathydrolyse — Lackmusmilch alkalisch Glatte Kolonie NCIB 10 555 Morphologie (Nähragar, 300C)
Grampositiv, Koryneorganismen. Kein gut entwikkeltes Mycel, jedoch rudimentäre Verästelung vorhanden. Beim Altern der Kultur erscheinen kokkenähnliche Formen. Nicht frei beweglich.
Morphologie der Kolonie (Nähragar, 5 Tage, 300C)
Kreisförmige, ganze, konvexe, halbschleimige, opake-kremige, schwachweiße Kolonien, 0,5-2 mm Durchmesser.
Hefedextroseagar, 5 Tage, 30° C
Konvexe, ganze, glatt scheinende, halbschleimige, blaßrose Kolonien.
Gelatineagar
Konvexe, ganze, glatt scheinende, blaßweise, opake Kolonien.
,0 Eigelb-Agarplatten
Konvexe, ganze, opake, glatt scheinende Kolonien. Feuchte Oberfläche. 1 — 3 mm Durchmesser.
Eigenschaften in flüssiger Kultur
Weiße Oberflächenhaut, weißer flockenförmiger Niederschlag, der sich beim Schütteln nicht vollständig dispergiert.
Physiologie Vollständig aerob Gelatinehydrolyse + Caseinhydrolyse — Stärkehydrolyse — Kovacsoxidase —
Katalase + Indol
Voges- Proskauer (V- P)-TeSt - Methylrot — Entaminierung von Phenylalanin — Hippurathydrolyse — Lackmusmilch alkalisch Anwendung von Verbindungen als einzige Kohlenstoffquellen
Citrat +
Lactat +
Malat +
Succinat +
Kohlehydrate (sauer) In Peptonwasserzuckern war keine Säure
nachweisbar
Zucker auf Ammoniumbasis
Fructose +
Glucose +
Saccharose +
Maltose +
Glycerin +
Sorbit +
Trehalose +
Raffinose +
Dulcit +
Lactose -
Mannit -
Stärke
Arabinose — Anwendung von Verbindungen als einzige Kohlenstoffquellen
Citrat +
Lactat +
Malat +
Succinat +-
Kohlehydrate (sauer)
In Peptonwasserzuckern war keine Säure nachweisbar
Zucker auf Ammoniumbasis
Fructose -
Glucose —
Saccharose -
Maltose +
Glycerin +
Sorbit +
Trehalose —
Raffinose +
b0 Dulcit +
Xylose +
Arabinose +
Mannit — Stärke
Cholesterinoxidase wird erzeugt, indem ein Cholesterinoxidase bildender Mikroorganismus von Nocardia NCIB 10 554 oder NCIB 10 555 gezüchtet, Zellen geerntet werden und Cholesterinoxidase von den Zellen
mit einem oberflächenaktiven Mittel ohne Zellzerstörung extrahiert und gewonnen wird.
Vorzugsweise wird Cholesterinoxkiase in einer Form gewonnen, die eine spezifische A ktivität von wenigstens 1 Einheit pro 5 mg Proteinstickstoff hat Es sind jedoch leicht höhere Aktivitäten erzielbar.
Eine Einheit an Cholesterinoxidaseaktivität ist hier als diejenige Aktivität definiert, die 1 μΜοΙ (10~6 Mol} Cholesterin zu 44-Cholester.on und Wasserstoffperoxid pro Minute bei 30" C und einem pH-Wert von 7 oxidiert.
Der Mikroorganismus kann auf einem beliebigen, geeigneten Medium gezüchtet werden, bis die Zellen geerntet weiden. Vorzugsweise wird der Organismus in einem Kulturmedium gezüchtet, welches Glycerin als eine Kohlenstoffquelle umfaßt. Ein Beispiel eines Mediums ist:
(NH4)JSO4 0,2
CaCl3 · 2 H2O 0,001
FeSO4 · 7 H,0 0,001
K2HPO4 0,2
MgSO4 · 7 H:0 0,02
Glycerin 0,5
Hefeextrakt 2,0
Um die Ausfällung von gering löslichen Salzen zu vermeiden, werden die oben angegebenen Bestandteile getrennt aufgelöst und dann zu einem geeignet großen Volumen von destilliertem Wasser in der gezeigten Reihenfolge hinzugegeben. Das Medium wird dann auf das gewünschte Volumen aufgefüllt. Die bevorzugte Inkubationstemperatur beträgt etwa 29° C und der optimale pH-Wert liegt zwischen 6,0 und 7,6. Vorzugsweise wird der pH-Wert auf etwa pH = 6,7 eingeregelt.
Gesteigerte Ausbeuten an Zellen können durch Belüftung und lnbewegunghalten erhalten werden, jedoch besitzt die Kultur die Neigung zum Schäumen und hohe Raten einer Luftströmung und eines Rührens können im allgemeinen wegen eines übermäßigen Schäumens nicht angewandt werden. Eine Luftströmungsrate von 0,2 V/V/min und eine Rührergeschwindigkeit von 760 UpM ergaben ein rasches Wachstum ohne übermäßiges Schäumen. Ferner wird bevorzugt ein Antischaummittel wie Polypropylenglykol zur Steuerung des Schäumens angewandt.
Falls die Anfangsimpfung des Mikroorganismus in das Kulturmedium gering ist, kann eine Verzögerungsphase von bis zu 16 Stunden auftreten. Die Verzögerungsphase ist eine Funktion der Größe der eingeimpften Menge und es wird keine Verzögerung erhalten, falls eine Impfungsmenge von mehr als 2%, bezogen auf das 'Zellengewicht am Schluß, verwendet wird.
Die erforderliche Gesamtinkubationszeit beträgt allgemein etwa 18 bis 24 Stunden. Unter optimalen Bedingungen beträgt die Verdoppelungszeit der Kultur etwa 2 Stunden und eine Zellenernte am Schluß von wenigstens 25 g (Naßgewicht) pro 1 der Zellen (5 g Trockengewicht) kann erhalten werden. Die Kultur kann in einem kleinen Umfang in 5-1- oder 10-1-Behältern durchgeführt werden, jedoch wurden auch ausgezeichnete Ergebnisse bei größeren Ansätzen in 100-1- und 1000-l-Behältern erhalten, wobei im letzteren Fall ein 500-1-Ansatz verwendet wurde.
Die Erzeugung von Cholesterinoxidase ist mit einer Verzögerung hinter dem Zeüenwachsium verbunden.
Der Enzympegel steigt für wenigstens 2 Stunden nach dem Aufhören des Wachstums der Zellen noch weiter an. Obwohl das Enzym ChoJesterinoxidase bei Abwesenheit eines Induktionsmittels erzeugt wird, kann die > Enzymausbeute durch Induktion mit Cholesterin erhöht werden. Kleine Mengen Cholesterin können zu der Kultur als gesättigte Lösung in Aceton zugesetzt werden, bei größeren Mengen wird Cholesterin jedoch bevorzugt als Aufschlämmung in Wasser und einem
ίο Netzmittel, z. B. Polyoxyäthylenderivaten von Sorbitanhydriden, die teilweise mit Fettsäure verestert sind (Tween 80), hergestellt, und die erhaltene Aufschlämmung wird zum Aufbrechen der Cholesterinteilchen zu einer feinen Suspension vor der Zugabe zu der Kultur
r. mit Schall behandelt
Als Beispiele für die Wirkung des Induktionsmittels sei angeführt, daß 0,2 g/l Cholesterin, welche bei einer Zellkonzentration von 5 g (Naßgewicht)/1 zugegeben wurden, eine Steigerung der Enzymproduktion bei dem
in »rauhen« Stamm NCIB 10 554 in der Größenordnung von 4fachen und 13 g/l Cholesterin, bei derselben Zellkonzentration zugegeben, eine Steigerung der Enzymproduktion in der Größenordnung vom 30fachen ergaben.
r> Die Zellen können durch Zentrifugieren geerntet, d. h. gewonnen werden. Es kann gezeigt werden, daß die Zellen in dieser Stufe selbst eine Cholesterinoxidaseaktivität mit einer typischen, spezifischen Aktivität der Zellen des »rauhen« Stammes von etwa 0,5 μΜοΙ/mg/
so Stunde besitzen.
Die Cholesterinoxidaseaktivität wird erfindungsgemäß ohne Zerstörung der Zellen gewonnen. Es gibt in der Tat Anzeichen, daß sich die Cholesterinoxidase auf der Oberfläche des Organismus befindet, und es wurde
υ gefunden, daß sie mit guter Ausbeute der Aktivität unter Verwendung eines grenzflächenaktiven Mittels gewonnen werden kann. Nichtionische, grenzflächenaktive Mittel haben sich als besonders vorteilhaft herausgestellt, und sehr gute Ergebnisse wurde mit Isooctylphenoxypolyäthoxyäthanol, welches etwa 10 Mol Äthylenoxid enthält (Warenbezeichnung Triton X-100) erhalten. Im folgenden wird dieses Isooctylphenoxypolyäthoxyäthanol auch mit lOP bezeichnet.
Zur Entfernung der Cholesterinoxidase werden die Zellen in einer Lösung des grenzflächenaktiven Mittels, weiche auf einen geeigneten pH-Wert gepuffert ist, suspendiert, und die Suspension wird beispielsweise bei Zimmertemperatur heftig gerührt. Die Cholesterinoxidase wird in der überstehenden Flüssigkeit durch Entfernen der Zellen, beispielsweise durch Zentrifugieren, gewonnen. Da die Zellen bei diesem Verfahren nicht zerbrochen werden, ist die Freisetzung von Protein niedrig, z. B. etwa 100 μg/ml.
Bei Versuchen zur Extraktion mit IOP wurden 5.6 (Naßgewicht) Zellen des »rauhen« Stammes in 45 ml 0,5 M Tris'/HCl-Puffer bei einem pH von 8.0 suspendiert, der Isooctylphenoxypolyäthoxyäthanol in Konzentrationen von I1 3 und 5% enthielt. Die Suspension wurde heftig bei Zimmertemperatur gerührt und es wurden gleiche Anteile von 10 ml in Zeitabschnitten von 15 Minuten entnommen. Nach dem Entnehmen eines jeden Anteils wurde sofort mit 3500 UpM in einer Zentrifuge (Mistral 6L-Zentrifuge) zentrifugiert. Die Extrakte wurden dann auf die Cholesterinoxidaseaktivitat untersucht, wobei folgende Ergebnisse erhalten wurden.
Tabelle I
Extraktionszeit Tg Cholesterin ':·» gewonnenes
(min) oxidiert/50 ·>\Ι Produkt in der
15min überstehenden
Flüssigkeit
1% IOP (Triton X-IOO)
15
30
45
60
120
ganze Zellen
3% IOP
(Triton X-IOO)
15
30
45
60
120
ganze Zellen
5% 1OP
(Triton X-IOO)
15
30
45
60 120 ganze Zellen
30,0 35,0 35,0 37,5 36,5 53,5
36,0 35,5 38,5 38,5 41,0 52,5
34,0 37,5 38,5 38,0 41,0 54,5
56,0 65,5 65,5 70,0 68,3
68,5 67,5 73,5 73,5 78,0
62,5 69,0 71,0 70,0 75,0
Dies bedeutet, daß 70% der Aktivität der ganzen Zellen bei 1% 1OP und bis zu 78% bei 3% 1OP gewonnen werden können. Das grenzflächenaktive Mittel bleibt jedoch in der Cholesterinoxidaselösung zurück. Bei der Bestimmung von Cholesterin hat es sich herausgestellt, daß die Anwesenheit von Isooctylphenoxypolyäthoxyäthanol (Warenbezeichnung Triton X-100) vorteilhaft sein kann, daß die optimale Konzentration in dem Untersuchungsgemisch jedoch 0,25% beträgt, wobei höhere Konzentrationen hemmend wirken. Die Enzympräparation sollte daher keinen höheren Gehalt an grenzflächenaktiven Mittel besitzen als einem annehmbaren Gehalt in dem Untersuchungsgemisch entspricht Obwohl daher die beste Freisetzung bzw. Entfernung von Enzym bei 3% IOP (Triton X-IOO) erzielt werden kann, ist es besonders bevorzugt, bei einer niedrigeren Konzentration zu arbeiten, z. B. mit 1% IOP. Es kann jedoch erforderlich sein, das grenzflächenaktive Mittel zu entfernen, z. B. mittels Dialyse oder Gelfiltration oder alternativ durch Ausfällen des Proteins (Enzyms) aus der Lösung des grenzflächenaktiven Mittels.
Obwohl die durch Extraktion der Zellen mit einem grenzflächenaktiven Mittel hergestellte Cholesterinoxidasepräparation in einigen Fällen eine spezifische Aktivität und eine Wirkung haben kann, die zur Durchführung der Untersuchung ausreichend ist, ist es in den meisten Fällen erforderlich, den Extrakt zu reinigen und zu konzentrieren, bevor er praktisch bei einer Cholesterinuntersuchung angewandt werden kann, (m Falle einer fluorimetrischen Bestimmung von Wasserstoffperoxid sollte die Enzympräparation eine Wirkung von wenigstens 10~2 Einheiten/ml besitzen, um ein Ergebnis in einer für die praktische Anwendung ausreichend kurzen Zeitspanne für einen Versuch zu liefern und insbesondere sollte die Präparation, wenn die Analyse automatisch durchgeführt wird, eine Wirkung bzw. Aktivität von wenigstens 10-' und
in vorzugsweise 0,5 Einheiten/ml besitzen.
Im Fall der nichtfluorimetrischen Untersuchung sollte die Präparation eine Wirkung bzw. Aktivität von wenigstens 10-' Einheiten/ml und für eine automatisierte Analyse von wenigstens 0,5 Einheiten/ml besitzen.
ι > Die Präparation kann mit einer höheren Aktivität, z. B. 5 Einheiten/ml oder mehr, hergestellt werden, jedoch wird bei höheren Werten der Aktivität bzw. Wirkung im allgemeinen mit einem Puffer vor der Verwendung in einem Test verdünnt.
>o In allen Fällen beträgt die spezifische Cholesterinoxidaseaktivität des Präparats wenigstens 1 Einheit pro 5 mg Proteinstickstoff. Bei höheren Werten von Proteinstickstoff kann die vorhandene Proteinmenge die Untersuchungslösung zu viskos machen oder bei der Untersuchung stören. Eine spezifische Aktivität von wenigstens 1 Einheit pro 50 μg Proteinstickstoff ist besonders bevorzugt. Als besonders vorteilhafte Enzympräparation hat sich eine wäßrige Präparation mit einer spezifischen Aktivität von 1 Einheit Cholesterin-
H) oxidaseaktivität pro 28 μg Proteinstickstoff, einer Wirkung von 5 Einheiten/ml, welche 3% V/V IOP (Triton X-100) enthält herausgestellt. Diese Präparation kann zur Verwendung in einer Untersuchung beispielsweise mit 0,01 M Phosphatpuffer verdünnt werden, so
jj daß sie für eine automatisierte Analyse 0,5 Einheiten/ml oder für eine manuelle Analyse 0,1 Eiraheiten/ml enthält Die Cholesterinoxidaseaktivität aufweisende Enzympräparation muß nicht in wäßriger Form vorliegen, und sie kann beispielsweise in Form eines gefriergetrockne ten Pulvers vorliegen. Zusätzlich zu der Präparation eines löslichen, Iyophilisierten Pulvers kann das Enzym in einer konzentrierten, gepufferten Lösung oder in Suspension mit Ammoniumsulfat mit oder ohne zugesetztem Puffer vorliegen.
Obwohl mit der Cholesterinoxidase sehr wenig Protein extrahiert wird, ist im allgemeinen in dem Extrakt mit dem grenzflächenaktiven Mittel eine gewisse Katalaseaktivität vorhanden. Der Betrag der Katalaseaktivität der in der fertigen Enzympräparation
so toleriert werden kann, hängt von der zu verwendenden Untersuchungsmethode ab, wobei die Katalaseaktivität der Präparation wichtig ist wenn die Untersuchung eine Messung der erzeugten H2O2-Menge umfaßt. Bei einigen Untersuchungsmethoden, bei denen H2O2 bestimmt wird, umfassen die Verwendung von Peroxidase, und es ist in einigen Fällen möglich, begrenzte Katalasemengen mit Peroxidase auszuschalten. Zusätzlich ist es möglich, eine beliebige Konzentration an Katalase, welche wahrscheinlich in dem Extrakt mit
t>o dem grenzflächenaktiven Mittel gefunden werden kann, mit einem Inhibitor zu hemmen, z. B. mit Natriumazid Die Wirkung der Katalase auf die Empfindlichkeit bei einer Untersuchung kann wie folgt gezeigt werden. Es wurde eine Katalaselösung hergestellt, indem 20 uJ
b5 einer kristallinen Suspension von Katalase in 50 ml 0,05 M Phosphatpuffer von pH=7,0 aufgelöst wurden.
Es wurde gefunden, daß 0,5 ml dieser Katalaselösung 7,04 μΜ H2O2 bei einem letztlichen Volumen von 2£ ml
in 2,0 Minuten zersetzten. Hieraus läßt sich errechnen, daß die Katalaseaktivität der Lösung 7,04 Einheiten pro ml bei einem pH von 7,0 und 25° C betrug.
Unterschiedliche Mengen dieser Katalaselösung wurden in ein Cholesterinuntersuchungssystem eingegeben, welches 0,5 Einheiten Cholesterinoxidase in 2,0 ml enthielt, und die Verminderung der Empfindlichkeit der Untersuchung beobachtet. Die Ergebnisse waren die folgenden:
Zugesetzte Katalaseeinheiten
% Verminderung der Empfindlichkeit
95
66,4
34,3
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:
Beispiel 1
Herstellung von Cholesterinoxidase
5001 eines sterilen Wachstumsmediums wurden mit 11 einer Impfkultur von Nocardia sp. NCIB 10 554 beimpft. Das Wachstumsmedium sowohl für die Impfkultur als auch die Kultur für die Herstellung bestand aus:
g/l
Die Zugabe von 0,1% Natriumazid zu dem Reaktionsgemisch hemmte jedoch vollständig selbst die höchsten Gehalte von Katalase, wodurch eine lOO°/oige Empfindlichkeit selbst bei Anwesenheit von Katalase erzielt wurde.
Im allgemeinen sollte die Katalase jedoch aus den Präparaten entfernt oder zumindest in starkem Maße reduziert werden, beispielsweise mittels Chromatographie auf DEAE-Cellulose.
Geeignete Arbeitsweisen zur Reinigung der mittels Extraktion mit grenzflächenaktivem Mittel erhaltenen Enzympräparation und zur eventuellen Katalaseentfernung umfassen die Ausfällung mit Ammoniumsulfat und/oder chromatographische Methoden und/oder Eindampfen unter vermindertem Druck. Beispielsweise kann die Präparation durch Ausfällung mit Ammoniumsulfat oder Polyäthylenglykol konzentriert, auf einer ^ Säule eines dreidimensional vernetzten Polysaccharids (Warenbezeichnung Sephadex) entsalzt und dann einer Ionenaustauscherchromatographie unterworfen werden. In dieser Stufe kann es erforderlich sein, die Aktivität der Präparation um etwa das 15- bis 4Ofache anzuheben.
Die Konzentrierung und Reinigung kann beispielsweise durch Substrataffinität-Chromatographie durchgeführt werden. Durch Hydroxypropylierung von G-25 hergestelltes dreidimensional vernetztes Polysaccharid ^ (Sephadex LH-20) besitzt sowohl hydrophile als auch lipophile Eigenschaften und kann in polaren, organischen Lösungsmitteln, Wasser, oder Gemischen hiervon gequellt werden. Das dreidimensional vernetzte Polysaccharid LH-20 kann in mit Cholesterin gesättigtem (z. B. etwa 4,0 g/%) Äthanol gequollen werden, und eine Säule kann mit auf diese Weise präparierten LH-20 gefüllt werden. Durch Waschen der Säule mit destilliertem Wasser kann das Cholesterin gleichförmig in dem Gel verteilt werden, und die Säule kann schließlich mit 0,05 M Kaliumphosphatpuffer bei pH = 7,5 ins Gleichgewicht gesetzt werden. Eine wesentliche Reinigung der Enzympräparation kann unter Verwendung einer solchen Säule erzielt werden.
Vorzugsweise wird die Enzympräparation zuerst ω einer Ionenaustauscher-Chromatographie oder einer Substrataffinität-Chromatographie, vorzugsweise einer Chromatographie mit Hilfe von DEAE-Cellulose (schwach basische Anionenaustauscher mit Diäthylaminoäthyl als funktioneller Gruppe eines dreidimensional vernetzten Polysaccharids) unterworfen werden und dann weiter durch Ultrafiltration oder Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert werden.
(NH4J2SO4
CaCI2 · 2 H2O
FeSO4 · 7 H2O
K2HPO4
MgSO4 · 7 H2O
Glycerin
Hefeextrakt
pH
2,0
0,01
0,01
2,0
0,2
10
20
6,7
Die Kultur wurde 24 Stunden bei 30° C sich vermehren gelassen. Die Kultur wurde durch einen Rührer in Bewegung gehalten, der mit drei Turbinenimpellern ausgerüstet war und bei 250 UpM lief, wobei sterile Luft durch ein Einleitungsrohr in einer Menge von 150 l/min zugeführt wurde. Das Schäumen wurde durch intermittierende Zugabe von Polypropylenglykolantischaummittel gesteuert. Nach etwa 14 Stunden, sobald die Kultur eine Konzentration von 1 bis 2 g Trockengewicht/l erreicht hatte, wurden 600 g in 21 eines Gemisches aus einem grenzflächenaktiven Mittel (Tween 80) und Wasser (0,03 : l/V/V) suspendiertes Cholesterin zu der Kultur hinzugegeben. Während der Wachstumsphase betrug die maximale Verdopplungszeit des Wachstums etwa 2 Stunden. Nach 24 Stunden, als die Zellkonzentration etwa 6 bis 7 g Trockengewicht/l betrug, wurden die Mikroorganismen durch Durchleiten durch eine Scheibenzentrifuge mit intermittierender Entleerung bei 400 l/h gesammelt Alternativ kann natürlich auch ein vorbeschichtetes Vakuumdrehfilter verwendet werden. Die Fermentierungsdauer kann durch Impfen mit einer größeren Menge einer Impfkultur verkürzt werden.
Die geernteten Zellen wurden in 0,01 M Kaliumphosphatpuffer, pH = 7,0, der 0,5% (V/V) IOP (Triton X-IOO) enthielt, bei 10°C, so daß ein Endvolumen von 601 erhalten wurde, suspendiert Nach sanftem Rühren während 2 Stunden — wobei kürzere Zeiten bei nur geringer Verminderung der Menge von extrahiertem Enzym angewandt werden können, wurden die extrahierten Zellen durch Durchleiten durch eine Röhrenzentrifuge (Modell 6P, Sharpies) entfernt Die erhaltene, klare, überstehende Flüssigkeit wurde durch eine Säule von 51 Fassungsvermögen bei 5° C durchgeschickt, welche DE-52-Cellulose enthielt, welche zuvor mit 0,01 M Kaliumphosphatpuffer mit einem pH von 7,0, der 03% IOP (Triton X-100) enthielt, ins Gleichgewicht gesetzt worden war. Die vorhandene Cholesterinoxidase und irgendwelche vorhandene Katalase wurden von der DE-52-Cellulose zurückgehalten. Die Cholesterinoxidase wurde durch stufenweise Elution mit Kaliumphosphatpuffer von pH=7,0 mit zunehmenden Molgehalten, der 0,5% IOP (Triton X-IOO) enthielt, bei 5°C freigesetzt Irgendwelche, vorhandene Katalase blieb auf der Säule zurück.
Die an Cholesterinoxidase reichen, eluierten Fraktionen wurden durch Ultrafiltration bei 5° C unter
Il
Verwendung einer PM-30-Membran weiter konzentriert. Die erhaltene, zurückbleibende Lösung von 3 1 besaß eine Cholesterinoxidaseaktivität von 5,5 μΜοΙ Cholesterin oxidiert/ml/min bei 37° C. Die gesamte Ausbeute betrug °twa 20%. Diese kann durch Waschen der verworfenen Feststoffe in der Extraktions- und durch Auffangen einer größeren Fraktion in der Ionenaustauscherstufe erhöht werden. Die Enzymlösung wurde in flüssiger Form bei 5° C aufbewahrt, wobei Azid als Konservationsmittel hinzugesetzt wurde. Die Lösung behielt ihre Gesamtaktivität praktisch für wenigstens zwei Monate.
Die Enzympräparation besaß eine spezifische Cholesterinoxidaseaktivität von etwa 1 Einheit pro 28 μg Proteinstickstoff und eine Wirkung von etwa 5 Einheiten/ml. Die Präparation enthielt etwa 3% V/V 1OP (Triton X-100).
Beispiel 2
Ausrüstung für die Untersuchung
von freiem Cholesterin in Serum
Prinzip
Cholesterinoxidase oxidiert Cholesterin zu 44-Cholestenon unter gleichzeitiger Bildung von Wasserstoffperoxid. Das erzeugte Wasserstoffperoxid wird mit X.ylenol-orange und vierwertigem Titan in ein Chelat überführt. Die Absorption dieses rotgefärbten Komplexes wird bei 550 nm gemessen.
Reagentien
1. 0,01 M Phosphatpuffer, pH = 7,0, welcher 0,10 g/% Natriumazid enthält
2. Cholesterinoxidaselösung, 5 Einheiten (1 ml oxidiert 5 pM Cholesterin pro Minute bei pH = 7,0 und 300C), welche 3,0% V/V IOP (Triton X-100) enthält
3. Arbeits-Enzymlösung — 5 ml Cholesterinoxidaselösung werden zu 41 ml des 0,01-M-Phosphatpuff ers (1) hinzugegeben.
4. Schwefelsäure, 2N — 56 ml konzentrierte Schwefelsäure werden zu destilliertem Wasser hinzugegeben und auf 1 1 verdünnt
5. Ausgangstitanlösung, 0,001 M — 0,08 g Titandioxid werden in einen 25-ml-Erlenmeyerkolben gegeben und es werden 0,5 g Ammoniumsulfat und 2,5 ml konzentrierte Schwefelsäure hinzugegeben. Dieses Gemisch wird auf einer Heizplatte erwärmt, bis alle Bestandteile aufgelöst sind und das Gemisch farblos ist. Die Lösung wird dann abgekühlt und mit destilliertem Wasser auf 1 1 aufgefüllt
6. Ausgangsxylenolorangelösung, 0,001 M — 0,76 g Xylenolorange werden in destilliertem Wasser aufgelöst und auf 1 1 verdünnt
7. Kombiniertes Farbreagens — Ein Volumteil der Ausgangstitanlösung werden zu 0,5 Volumteilen 2 N-Schwefelsäure hinzugegeben und vermischt Ein Volumenteil der Ausgangsxylenolorangelösung und 0,5 g Polyoxyäthylenlauryläther (Warenbezeichnung Brij-35) pro 1 Reagens werden dann hinzugegeben.
8. Ein Cholesterin-Standard, der bis zu 3,0 mM pro 1 enthält, wird durch Auflösen von trockenem, reinem Cholesterin (BDH Biochemical Standard) in Isopropylalkohol hergestellt
Die Ausrüstung für 20 Untersuchungen umfaßt die beiden Reagentien A und B und eine Standard-Cholesterinlösung, die oben beschriebene Reagenslösung 8.
Reagens A — 80 ml Cholesterinoxidaselösung, hergestellt als das oben aufgeführte Reagens 3).
Reagens B — 40 ml des kombinierten Farbreagens, hergestellt als das oben beschriebene Reagens 7).
Methode
100 μΐ Serum oder Cholesterin-Standard werden zu 2,0 ml Reagens A hinzugegeben und 10 Minuten bei 370C inkubiert.
ίο Dann werden 1,0 ml Reagens B zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt, und die Inkubation bei 37°C für weitere 5 Minuten fortgeführt.
Blindwerte werden erhalten, indem Serum oder Cholesterin-Standard direkt zu einem Gemisch von 2 ml π Reagens A und 1,0 ml Reagens B hinzugegeben werden und 5 Minuten bei 37°C inkubiert wird.
Die optische Dichten der Testlösungen werden gegen die entsprechenden Blindproben bei 550 nm abgelesen.
Berechnung der Ergebnisse
mM Cholesterin für Litertest =
OD550—Standard
Äthanolisches KOH und Cyclohexan werden von dem Benutzer bereitgestellt, da ersteres instabil ist und beide in relativ großen Volumen erforderlich sind.
Methode
jo 0,2 ml Serum oder Standard werden zu 1,0 ml äthanolischem KOH hinzugegeben, und das Gemisch wird 5 Minuten bei 75° C in verschlossenen Reagenzgläsern inkubiert.
0,1 ml des verseiften Extraktes werden dann zu 1,0 ml λ 0,083 N-HCl, welche 0,3% IOP (Triton X-100) enthält d. h. Reagens A, hinzugegeben. Die Lösung wird vor der Zugabe von 1,0 ml der Arbeits-Enzymlösung, d. h. dem Reagens B, vermischt. Nach Zugabe der Cholesterinoxidase wird das Reaktionsgemisch 10 Minuten bei 37°C inkubiert
5,0 ml äthanolisches KOH werden dann hinzugefügt und das während der Reaktion gebildete 44-Cholestenon wird in 4,0 ml Cyclohexan extrahiert
Blindproben werden in ähnlicher Weise hergestellt mit der Ausnahme, daß die Arbeits-Enzymlösung erst nach Zugabe des äthanolischen KOH hinzugegeben wird.
Die optischen Dichten der Extrakte werden gegen die Blindproben bei 236 nm abgelesen.
Ferner kann bei der Ausrüstung die Enzympräparation (1) in flüssiger Form mit einer Wirkung von wenigstens 10~2 Einheit/ml vorliegen.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Ausrüstung umfaßt die Komponente (2) wenigstens ein Reagens, das an einer Reaktion teilnimmt, mittels der Wasserstoffperoxid colorimetrisch oder fluorimetrisch bestimmt werden kann.
Bei einer weiteren Ausführungsform weist die Enzympräparation (1) eine spezifische Cholesterinoxibo daseaktivität von wenigstens 1 Einheit pro 50 μg Proteinstickstoff auf und besitzt falls sie in flüssiger Form vorliegt, eine Wirkung von wenigstens 0,5 Einheiten/ml.
Bei einer weiteren Ausführungsform enthält sie eine
ί>5 Einzelmenge einer jeden Komponente, wobei die für eine Einzeluntersuchung erforderliche Menge aus dieser Einzelmenge entnommen wird.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Ausrüstung
enthält diese Einheitsdosen der Enzymkomponente (1), wovon jede wenigstens 0,05 und insbesondere 0,5 Einheiten Cholesterinoxidaseaktivität enthält.
Bei einer weiteren Ausführungsform liegen die Einheitsdosen der Enzymkomponente (1) in gefriergetrockneter oder konzentrierter Form in Einzelbehältern vor, welche mit Puffer vor jedem Test in gebrauchsfähige Form überführt werden.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Ausrüstung für die Untersuchung auf Gesamtcholesterin in Serum enthält die Ausrüstung zusätzlich zu den Komponenten (1), (2) eine weitere Komponente (3) in Form wenigstens eines sauren Reagens zur Neutralisation des verseiften Serums.
Die Ausrüstung kann zusätzlich wenigstens eine standardisierte Cholesterinlösung enthalten.
Die Enzympräparation (1) kann Peroxidase oder ein beliebiges anderes Reagens, welches bei der Durchführung der Untersuchung erforderlich und mit Cholesterinoxidase verträglich ist, enthalten.
Die Komponente (2) der Ausrüstung ist für gewöhnlich, wenn Wasserstoffperoxid colorimetrisch bestimmt werden soll, ein Sauerstoffakzeptor wie 4-Aminophenazon und Phenol oder Xylenolorange und vierwertiges Titan.
Die Komponente (3) kann verdünnte HCl oder H2SO4 sein, und falls 44-Cholestenon direkt durch die Carbonylabsorption bestimmt wird und kein Farbreagens vorliegt, kann dieses saure Reagens die einzige andere Komponente der Ausrüstung neben der Enzympräparation (1) sein.

Claims (9)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von Cholesterinoxidase durch Züchtung eines der Cholesterinoxidase erzeugenden Stämme Nocardia NCIB 10 554 und NCIB 10555, durch Ernten der Zellen, durch Extraktion der Cholesterincxidase durch Extraktion der Zellen mit einem oberflächenaktiven Mittel ohne Zellzerstörung und durch die Gewinnung des Enzyms.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als oberflächenaktives Mittel ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, insbesondere Isooctylphenoxypolyäthoxyäthanol, das etwa 10 Mol Äthylenoxid enthält, verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus in einem Medium, das Glycerin als eine Kohlenstoffquelle enthält, insbesondere bei einem pH von 6 — 8 gezüchtet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 -3, dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus in Gegenwart von Cholesterin gezüchtet wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 —4, dadurch gekennzeichnet, daß eine zellfreie Flüssigkeit mit Cholesterinoxidaseaktivität weiter durch Ionenaustauschchromatografie, insbesondere an DEAE-Cellulose gereinigt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die durch Chromatografie gereinigte Flüssigkeit weiter durch Ultrafiltration oder Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Cholesterinoxidaseaktivität in eine feste, insbesondere gefriergetrocknete Form, überführt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein Cholesterinoxidasepräparat mit einer spezifischen Aktivität von wenigstens 1 Einheit pro 5 mg Proteinstickstoff gewonnen wird.
9. Verwendung des nach einem der Ansprüche 1 —8 gewonnenen Enzympräparats zur Bestimmung von Cholesterin in einer Flüssigkeit in Form eines Fertigpacks, enthaltend
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