FI66644B - Foerfarande foer immobilisering av glukosisomerasaktiva mikrobceller - Google Patents

Description

1 66644

Menetelmä glukoosi-isomeraasiaktiivisten mikrobisolujen immobilisoimiseksi 5 Keksintö koskee glukoosi-isomeraasiaktiivisten mikro bisolujen immobilisoimismenetelmää, jossa glutaarialdehydin indusoima polvmerointi suoritetaan proteiinikantaja-aineen läsnäollessa.

US-patenttijulkaisun 1 401 946 mukaisesti solujen sil-10 loituspolvmerointi on suoritettu diatsotoidun diaminoyhdis-teen, kuten 2,6-diaminopyridiini,3,6-diaminoakridiinin läsnäollessa, mainitun yhdisteen sisältäessä 1-3 heteroato-mista rengasta.

US-patenttijulkaisun 3 694 319 mukaan on käytetty ter-15 misesti käsiteltyjä Arthrobacterin kokonaisia soluja jatkuvassa menetelmässä, jossa glukoosi isomeroidaan fruktoosiksi.

DK-patenttijulkaisussa 390 521 kuvatun menetelmän mukaan Bacillus sp. NRLL 5656:n soluja käsitellään glutaarial-dehydillä, ja näin saatua polymerointituotetta käytettiin 20 glukoosin isomerointiin fruktoosiksi, jolloin mainittu iso-merointi suoritettiin jatkuvatoimisessa reaktorissa.

Kokonaiset Streptomvces-solut on immobilisoitu ioninvaihdon avulla, kuten DEAE-selluloosalla tai ECTEOLA-sellu-loosan avulla (US 3 788 945, US 3 708 397). Immobilisointi 25 voidaan suorittaa myös kollageenigeelillä, minkä jälkeen saatua seosta pintakäsitellään glutaarialdehydillä seoksen tekemiseksi liukenemattomaksi (Kolarik, M.J., Chen, B.J., Emmery, A.H. Jr., Lin, H.C., Immobilized Enzymes in Food and Microbial Processes, Pergamon Press, 71-83, 1974).

30 Solujen suora lämpökäsittely, joka suoritetaan solu- membraanin permeabiliteetin vähentämiseksi, tavallisesti saa aikaan tuotteen, jolla on polymeroiraisraenetelmän olosuhteissa alhainen aktiivisuus ja lyhyt käyttöaika. Soluja immobilisoi-vien ioninvaihtajien (esim DEAE-selluloosan) käyttö, saa ai-35 kaan substraattiliuoksen entsyymiaktiivisuuden asteittaisen häviämisen huuhtoutumalla. Sama vaikutus on havaittu, jos solut immobilisoidaan geeli-rakenteeseen, kuten esim. poly-akryyliamidiin tai kollageeniin.

2 66644

Immobilisoitujen entsyymien pysyvimmät valmisteet saadaan tavallisesti sitomalla kovaleattisesti solun membraanin pinnalla olevat reaktiiviset ryhmät. Samanlaisia menetelmiä on myös käytetty glukoosi-isomeraasin suhteen aktiivisten 5 solujen immobilisoimiseksi. Polymerointimenetelmällä, jossa käytetään diatsotoituja diamiineja, saadaan hyvä soluaktiivi-suus, mutta sitä rajoittaa käytettävien reagenssien, kuten 2,6-diaminopyridiini,3,6-diaminoakridiinin voimakas myrkyllisyys sekä syöpää synnyttävä ominaisuus. Solujen suora po-10 lymerointi, joka suoritetaan alutaarialdehydi-käsittelyllä, johtaa alhaiseen polymerointiasteeseen, mikä johtuu vapaiden, reagoivien ryhmien puuttumisesta solun pinnalla. Sen tähden ei ole mahdollista saada aikaan riittävää ristisidosrakennetta, joka tarvitaan immobilisoitavan entsyymin ja substraatin vä-15 listä kontaktia varten. Mainittu menetelmä ei takaa mahdollisuutta standardoida lopullista tuotetta.

On tunnettua käyttää albumiinia proteiinikantajana im-mobilisoitaessa glukoosi-isomeraasia glutaarialdehydin indusoiman polymeroinnin avulla (GB 1 257 263). Ei-proteiini-20 kantajia on esitetty patenttijulkaisuissa DE 2 537 670, SE-393 632, US 3 841 910 ja US 4 208 482.

On suoritettu kokeita glukoosi-isomeraasin suhteen aktiivisten solujen immobilisoimiseksi veren jakeisiin ( se on Cohnin viidenteen jakeeseen, fibriiniin) mutta tällöin ei 25 saatu valmisteita, joiden aktiivisuudet olisivat olleet hyvät (US 3 788 945, US 3 705 084) .

Keksinnön tehtävänä on tarjota glukoosi-isomeraasin suhteen aktiivisten solujen immobilisoimismenetelmä, jossa käytetään helposti saatavaa proteiinikantaja-ainetta, maini-30 tun menetelmän tuottaessa sekä erittäin aktiivisia että pysyviä valmisteita, joita tarvitaan suuren fruktoosipitoisuuden sisältävien siirappien valmistamiseen jatkuvan teknologisen menetelmän avulla.

Keksintö koskee menetelmää glukoosi-isomeraasin suhteen 35 aktiivisten mikrobisolujen immobilisoimiseksi, jolloin glutaarialdehydin indusoima polymerointi suoritetaan proteiinikanta-jan läsnäollessa. Menetelmälle on tunnusomaista, että prote-iinikantaja on veriseerumi tai veriplasma.

3 6664 4

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään glutaari-aldehydin indusoimaa glukoosi-isomeraasin suhteen aktiivisten solujen polymerointia. On havaittu, että kun glutaarialdehydin indusoima polymerointi suoritetaan proteiinikantaja-aineena 5 olevan veriseerumin tai veriplasman läsnäollessa, saadaan glukoosi-isomeraasin suhteen aktiivinen valmiste. Elävästä teuraskarjasta otetun veriseerumin tai veriplasman (se on linnuista ja kasvissyöjistä, sioista jne.) tulisi olla eläinlää-kintäterveysvaatimusten mukaista, ja se tulisi käyttää jääh-10 dytettynä, lyofilisoituna tai kuivattuna. Kahdessa toisessa tapauksessa veriseerumi tai -plasma liuotetaan veteen ja kon-sentraatio säädetään 10-20 %:iin kuiva-aineen suhteen. Poly-merointituote huuhdotaan vedellä. Sitten pesty tuote, -5 --10°C:n lämpötilassa 12 tunnin kuluessa suoritetun jäähdyttä-15 misen jälkeen, puristetaan, rakeistetaan ja kuivataan lämpötiloissa, jotka eivät ylitä 50°C, tyhjössä tai kuivassa ilmavirrassa.

Rakeistetun muodon lisäksi voidaan kuivattua valmistetta käyttää jauhetussa ja seulotussa muodossa, siten että valitaan 20 10-30 meshin jae.

Täten saadulla, immobilisoidulla valmisteella täytetään reaktiopylväs tai pylvässarja, jossa sitä käsitellään 2-3M glukoosiliuoksella, joka sisältää aktivaattoreita (se on Mg-ja Co-ioneja käytetyn entsyymin suhteen optimikonsentraatio-25 na), 45-75°C:n lämpötilassa. Substraatin täyttönopeus säädetään siten, että saavutetaan glukoosin 40 - 50-%:inen muuntaminen fruktoosiksi (se on isomeroitumisreaktion tasapainotila).

Pylvään tai pylvässarjan glukoosi-isomeraasi-aktiivisuus sekä entsyymivalmisteen käyttöaika ovat entsyymin ja substraa-30 tin välisen kontaktiajan funktio (se on pylvään virtausnopeuden funktio), ja lämpötilan, aktiivisuuden sekä käytetyn valmisteen määrän sekä aktivaattoreiden (se on magnesium- ja koboltti-ionien) funktioita. Glukoosi-isomeraasi-aktiivisuus määritetään reaktorissa Thompsonin et ai:n (US 3 788 945) ehdot-35 tamalla menetelmällä. Fruktoosiksi muuttuneen glukoosin määrä määritetään kolorimetrisesti Dischen et ai. menetelmällä tai 4 6664 4 polarimetrisesti. Tämä määritys suoritetaan toistetusti pyl-väsoperaation määrättyinä jaksoina. Pylvään aktiivisuusindek-si määritetään käyttämällä seuraavaa yhtälöä (1): A = RIE x log ^,504(0,505-1)7 5 jossa A on pylvään teho I on fruktoosiksi muuttuneen glukoosin määrä (g) 3 R on virtausnopeus (cm /min) E on pylvässarjan pylvääseen sisältyvän kansainvälisen glu-koosi-isomeraasi-aktiivisuusvksiköiden määrä.

10 Isomeroitumisreaktion tasapaino voitiin saavuttaa aino astaan, kun läsnä oli vähintään 2000 kansainvälistä glukoosi-i some raa s i-yks ikköä.

Reaktion sivutuotteet sekä tuotteen sisältämät koboltti-ja magnesium-ionit poistettiin aktiivihiilellä sekä kationin-15 vaihtajalla suoritetulla käsittelyllä. Suuren fruktoosikon-sentraation sisältävän siirapin väri-indeksi määritettiin spektrofotometrisesti käyttäen spektrofotometristä kyvettiä, jonka tilavuus oli 1 cm3, aallonpituuksilla 450 ja 600 nm.

Suuren fruktoosikonsentraation sisältävän siirapin väriyksiköt 20 määritettiin seuraavan yhtälön (2) avulla: 109/A450“A600/ B --

C

jossa B on väri-indeksi 25 Ä45o 3a A600 ova** va^on absorptiot aallonpituuksilla 450 ja 600 nm C on liuoksen konsentraatio (g/100 cm3).

Tunnettuihin, käytössä oleviin valmisteisiin verrattuna näin saaduilla immobilisoiduilla entsyymivalmisteilla on seu-raavat edut: suuri aktiivisuus immobilisoidun valmisteen g:aa 30 kohti (150-200 GlU/g); edullinen pH-optimi (7,0); korkea lämpö-stabiliteetti 45-65°C:n lämpötiloissa. Näin saadun valmisteen transformaatioteho on 1,5 GIU g:aa kohti glukoosia muuntumis-nopeuden ollessa 45-50 %.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

35 Esimerkki I

Mikrobisolujen käymisen jälkeen saatu elatusaine sentrifugoidaan ja suodatetaan. Näin suodatettu biomassa 5 66644 pestään kerran vedellä. Sentrifugoinnin ja suodatuksen jälkeen saaduilla märillä soluilla tulisi olla 10 - 12 %:n kuiva-ainesisältö. Jos esiintyy poikkeamia mainituista arvoista, veriseerumin tai veriplasman määriä säädetään so-5 pivasti. Tuoretta biomassaa sekoitetaan tuoreen veriseerumin tai veriplasman kanssa paino/tilavuus-suhteessa 1:1 - 1:10, niin että polymeroinnin jälkeen valmisteen glukoosi-isomeraasi-aktiivisuus on 150 - 200 GlU/g kuiva-ainetta. Jos esiintyy poikkeamia tästä arvosta, veriseerumin 10 tai veriplasman määrää korjataan sopivasti. Reaktioseokseen li- 3 sätään 380 - 400 cm 25-%:ista glutaarialdehydin vesiliuosta kuiva-aineen kutakin kg:aa kohti ja seosta sekoitetaan mekaanisella sekoittajalla noin 1 tunnin ajan huoneenlämpö-tilassa. Polymeraatiotuote, joka on näin saatu, suodatetaan 15 ja pestään toistetusti, kunnes huuhteluvedessä ei havaita enää keltaista väriä. Veden ylimäärä poistetaan puristamalla, valmiste jäädytetään 12 tunniksi -5 - -10°C:n lämpötilassa. Sitten valmiste sulatetaan, vesi poistetaan puristamalla, ja näin saatu huokoinen massa rakeistetaan ja kuiva-20 taan tyhjössä tai kuivassa ilmavirrassa, lämpötilassa, joka ei ylitä 50°C. Rakeistetun muodon lisäksi valmistetta voitaisiin käyttää myös jauhettuna ja 10 - 30 meshin raekokoon seulottuna.

Esimerkki II

25 Glukoosi-isomeraasin suhteen aktiivisten kokonaisten solujen polymerointi suoritetaan yhdessä veriseerumin tai plasman kanssa kuten esimerkissä I. Puristamisen jälkeen näin saatua valmistetta ei jäähdytetä, vaan pikemminkin se rakeistetaan suoraan ja kuivataan kuten on esitetty esimer-30 kissä I.

Esimerkki III

Glukoosi-isomeraasin suhteen aktiivisten solujen polymeroinnissa käytetään lyofilisoitua tai sumutuskuivattua veriseerumia tai veriplasmaa. Mainittu seerumi tai plasma 35 liuotettiin ennakolta veteen, siten että kuiva-aineen määrä 6 66644 oli 8 - 12 %. Sitä seuraavat toimenpiteet olivat samat kuin esimerkeissä I ja II.

Esimerkki IV

Glukoosi-isomeraasin suhteen aktiivisten kokonaisten 5 solujen polymerointi suoritetaan kuten esimerkeissä I, II

ja III, paitsi että veriseerumi tai veriplasma pakastettiin alustavasti. Tässä tapauksessa jäätynyt veriseerumi tai veriplasma sulatetaan lämpötiloissa, jotka eivät ylitä 55°C. Sitten määritetään kuiva-aineen määrä, ja sen jälkeen 10 kun oli suoritettu vaadittava korjaus (ks.esim.I), menetelmää jatkettiin kuten esimerkeissä I ja II.

Esimerkki V

Kuivattu iimobilisoitu valmiste upotetaan 12 tunniksi joko alukoo-sisiirappiin, jonka konsentraatio on 2-3M ja joka sisältää I5 optimi konsentraation koboltti- ja magnesiumioneja käytetyn entsyymin mukaisesti, tai veteen paino/tilavuus-suhteessa 1:10. Pylväs tai pylväiden sarja täytetään turvonneella entsyymivalmisteella ottaen huomioon, että täyttyminen tapahtuu oikein ja tasaisesti siten, ettei ilman ole mahdol-20 lista tulla mukaan. Reaktioon tarvittavan entsyymivalmisteen määrä määritetään edellä esitetyn yhtälön (1) avulla.

Glukoosisiirappi, jonka konsentraatio on 2-3M, kulkee jatkuvasti pylvään läpi. Pylvään ulostulon fruktoosi-sisältö määritetään kolorimetrisesti tai polarometrisesti.

25 Glukoosisiirapin konversio fruktoosiksi pidetään 40 - 50 %:n tasolla, niin että kun tietyn pylvään aktiivisuus putoaa 20 %:n arvon alapuolelle, pylväs korvataan uudella pylväällä. Isomeroimismenetelmän lämpötilaa suositellaan pidettävän 60 - 65°C:n alueella, jotta vältytään pylvään mahdolliselta 30 mikrobikontaminaatiolta, sekä suositellaan siirapin kuumennus suoritettavaksi etukäteen käyttölämpötilaansa. Virtausnopeutta pylväässä tai pylvässarjassa valvotaan sopivan pumpun avulla, ja se riippuu käytetyn valmisteen määrästä ja aktiivisuudesta (edellä esitetty yhtälö (1)).

35 Yksinkertaisen pylvään (se on pylvään, joka ei kuulu