SU1157057A1 - Способ получени протеолитического фермента - Google Patents
Способ получени протеолитического фермента Download PDFInfo
- Publication number
- SU1157057A1 SU1157057A1 SU833634238A SU3634238A SU1157057A1 SU 1157057 A1 SU1157057 A1 SU 1157057A1 SU 833634238 A SU833634238 A SU 833634238A SU 3634238 A SU3634238 A SU 3634238A SU 1157057 A1 SU1157057 A1 SU 1157057A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- solution
- reagent
- enzyme
- gelation
- granules
- Prior art date
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕО ЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА, заключающийс в выращивании продуцента Nocardia sp.1 на среде м сопептонного бульона с 3%-ным содержанием глюкозы с последующим перенесением на синтетическую среду СР-1, инкубацией и высаливанием фермента сернокисльп : аммонием из культуральной жидкости, о тли чающийс тем, что, с целью упрощени процесса и увеличени выхода целевого продукта, после инкубаци суспензию клеток продудента смешивают с реагентом, вызывающим процесс гелеобразовани , до достижени содержани биомассы в реагенте 0,1-3,0%, затем в полученную смесь ввод т инициатор гелеобразовани , смесь инкубируют в течение 230 мин при 12-20°С, затем гель или его пленку фрагментируют на гранулы .размером 0,5-1,5 мм и инкубируют на синтетической среде СР-1 в течение 20-24 ч при 28-30 С, после чего отдел ют культуральную жидкость от гранул и осаждают из нее целевой продукт. 2.Способ по П.1, отличающийс тем, что в качестве реагента , вызьгоающего процесс гелеобразовани , используют 4%-ный раствор альгината натри , перекристаллиз6ванный акриламнц и 10%-ный раствор поливинилового спирта. 3.Способ по П.1, о тлич ающ и и с тем, что в качестве иници .атора гелеобразовани используют сл 0,1 М раствор CaCfcf,N,N-метиленбис о сл акрштамида и облучение ультрафиолетовыми лучами. 1
Description
Изобретение относитс к получени ферментных препаратов и может быть применено в микробиологической промышленности , медицине, гематологии, физиологии и биохимии микроорганизмов , Известен способ получени протеа иммобилизованными в ПААГ клетками Streptomyces fradiae, заключающийс в том, что суспензию клеток в физиологическом растворе включают в 5%ный полиакриламидный гель с содержанием 10% сшивки (N,N -метиленбисакриламида ) в течение 10 мин при 5°С и атмосфере газообразного азота Гель с включенными в него клетками разрезают на небольшие блоки (2-3 мм) и обрабатывают реакционной средой (0,5% крахмала, 0,5% м сного экстра та, 0,05% дрожжевого зкстракта, 0,02% , 0,01% MgSO. 7HjO) три раза по 2 ч; Дл повышени выхода фермента гранулы с клетками обрабатывают 75%-ным этанолом и использую до 30 раз 1. Однако этот способ неэкономичен вследствие получени фермента иммобипизованными клетками на дорогосто щей реакционной среде, содержащей 0,5% крахмала, 0,5% м сного экстрак та и 0,05% дрожжевого зкстракта, трудоемок вследствие проведени дополнительной обработки .гранул реакционной средой и этанолом, достаточно длителен и у целевого продукта отсутствует фибринолитическа ак тивность. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату вл етс способ получени протеолитического фермента фибринолитического действи , которы предусматривает использование проак тиномицетов (в частности, Nocardia sp.1) в качестве продуцентов фибринолитических (фибрин - основна составна часть тромба) ферментов. Продуцент выращивают на посевной среде (МПБ+3% глюкозы) в течение 3 сут, а затем на ферментационной среде (синтетическа среда СР-1) также 3 сут отдел ют клетки, а из культуральной жидкости с помощью сернокислого аммони высаливают фер . мент с последующим диализом и лиофильным высушиванием 2. Однако известный способ обладает недостаточно высоким выходом целево продукта и невысокой скоростью его получени . Кроме того, способ неэкономичен вследствие необходимости многократного выращивани посевного материала и длительности процесса и трудоемок. Цель изобретени - упрощение процесса и увеличение выхода целевого продукта. Поставленна цель достигаетс тем, что согласно способу получени протеолитического фермента, заключающемус в выращивании продуцента Nocardia sp.1 на среде м со-пептон- ного бульона с 3%-гным содержанием глюкозы с последующим перенесением на синтетическую среду СР-1, инкубацией и высаливанием фермента сернокислым аммонирм из культуральной жидкости, после инкубации суспензию клеток продуцента смешивают с реагентом , вызывающим процесс гелеобра- зовани , до достижени содержани биомассы в реагенте 0,1-3,0%, затем в полученную смесь ввод т.инициатор гелеобразовани , смесь инкубируют в течение 2-30 мин при 12-20 С, затем гель или его пленку фрагментируют на гранулы размером 0,5-1,5 мм и инкубир тот на синтетической среде СР-1 в течение 20-24 ч при 2830 С, после чего отдел ют культуральную жидкость от гранул и осаждают из нее целевой продукт. В качестве реагента, вызывающего процесс гелеобразовани , используют 4%-ный раствор альгината натри , перекристаллизованный акриламид и 10%-ный раствор поливинилового спирта . В качестве инициатора гелеобразовани используют О,1 М раствор СаСг,N,N -метиленбисакриламида и облучение ультрафиолетовыми лучами . Предлагаемый способ осуществл етс следующим образом. В среду МПБ с 3%-ньм содержанием глюкозы внос т смыв клеток Nocardia sp,1 с агаризованной среды этого же состава и культивируют 48 ч, после чего провод т процесс гелеобразовани с участием инициатора гелеобразовани , смесь инкубируют в течение 2-30 мин при 12-20°С, затем гель Или его пленку фрагментируют на гранулы размером 0,5-1,5 мм и инкубируют на синтетической среде СР-1 в течение 20-24 ч при 28-30 С, после чего отдел ют культуральную жидкость от гранул и осаждают из нее целевой продукт. Предлагаемый способ вл етс более упрощенным, так как не содержит операций обработки альгината натри карбонатом магни , обработки включе ных в ПААГ клеток реакционной средой и этанолом, насьпцени полимеризуемой смеси газообразным азотом. Прим ер 1. В среду М11Д+3% глюкозы внос т смыв клеток Nocardia sp.1 с агаризованной среды этого же состава, культивируют 48 ч при 2830°С в колбах .на 750 мл со tOO мл среды на круговых качалках (220 об/мин), после чего клетки с культуральной жнцкостью (10 мл) сме шивают с 4%-ным раствором альгината натри (10 мл) на дистиллированной воде. Смесь внос т по капл м (диаметр отверсти 1 мм) с помощью пипетки в 0,1 М раствор при ком натной температуре. Образовавшиес шарики гел диаметром 1,5 мм оставл ют в растворе хлорида кальци при с на 1-2 ч дл стабилизации. 20 мл гранул с клетками помещают в колбу на 250 мл, содержащую 50 мл среды СР-1 с 0,05 М , , и инкубирзпот при 28-30 С на круговой качалке (220 об/мин). Через 20 ч куль туральную жидкость сливают с гранул промывают их физиологическим раство ром к запивают 50 мл свежей среды СР-1 с 0,05 М СаСе Из полученной .культуральной жидкости фермент осаж дают сернокислым аммонием при насыщении 0,6-0,8, Биосинтез фермента на синтетической среде СР-1 с помощью иммобилизованных в Са-альгинатный гель клеток продуцента повтор ют мно гократно. Получают суммарный выход целевого продукта 13100 усл.ед./мл. Пример 2. Клетки продуцента , вьфащенные на МПБ+3% глюкозы, как в примере 1, отдел ют от культуральной жидкости центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 мин. Клеточную суспензию в физиологическо растворе включают в 10% ПААГ с 5%Hbw содержанием сшивающего агента К ,Н-метиленбисакриламида (МБА). Дл этого к 11 мл водного раствора, содержащего 1,9 г перекристаллизован ного акриламида (ЛА) и 0,1 г МБА, добавл ют 6 мл клеточной суспензии. 574 содержащей 600 мг биомассы, 3 мл 1%-ного водного раствора персульфата аммони и 0,4 мл К,№,к ,Н-теграметилэтилендиамина (ТЕМЭД). Полимеризацию ведут при 12-14°С в течение 2-4 мин. Полученный блок гел механически фра1ментируют пр од а вливанием через сито. Гранулы размером 0,5 мм многократно промывают декантацией физиологическим раствором дл удалени невключающихс в гель клеток и остатков компонентов полимеризационной смеси, 20 мл гранул с клетками используют дл биосинтеза фермента на среде СР-1, как описано в примере 1. Суммарный выход целевого продзпста составл ет 28764 уел,ед./мл. ПримерЗ. 10%-ный раствор поливинилового спирта в дистиллированной воде нагревают на вод ной бане до полного растворени , 10 мл охлажденного ПВС перемешивают с суспензией клеток, содержащей 150200 мг биомассы, полученной, как в примере 1, и отделенной от культуральной жидкости центрифугированием, как в примере 2. Осмесь выливают в чашку Петри (диаметр 10,5 см, слой 0,5 мм) и облучают 5-15 мин ультрафиолетовыми лучами (кварцева лампа ПРК) при комнатной температуре . Полученнзто пленку высушивают 1,5-3,0 сут, фрагментируют на кусочки размером около 1 мм. Перед фрагментацией вожможно также выдерживание пленки с клетками 9 сут при 4 С дл повьппени ферментативной активности иммобилизованных в ПВС клеток продуцента. Измельченную пленку гел с клетками помещают в колбу на 250 мл с 50 мл среды СР-1 и инкубирают 24 ч при 28-30с на качалке (220 об/мин). Затем культуральную жидкость отел ют декантацией, вьщел ют из нее ермент, как в примере 1. Гель с летками промывают физиологическим аствором и заливают свежей средой Р-1. Эти процедуры многократно потор ют . Получают суммарный выход цеевого продукта 30030 усл.ед./мл. Сравнительные данные результатов пытов по известному и предлагаемому пособам представлены в таблице, Из данных, приведенных и таблие , вццно, что суммарный выход фермента при использовании иммобилизованных клеток нокардии возрастает в 6-14,5 раз, а скорость синтеза ; фермента - в 3,5-3,9 раза по сравне нию с известным способом (свободные клетки). В предлагаемом способе происходит не только ускорение и увеличение выхода фермента, но и возрастание экономичности способа в силу того, что культзфу продуцента вщ ащивают один раз, а весь осталь157057
,ной процесс провод т на этих же, закрепленных в геле, клетках, мен ежедневно ферментационную среду определенного состава. Использование (Иммобилизованных клеток повьппает экономичность и дает возможность сократить врем , затрачиваемое на биосинтез фермента, в 2-3 раза и облегчает очистку, так как сразу получают раствор фермента, свободный от клеток продуцента.
Свободные клетки Nocardia sp.1
Клетки Nocardia sp.1 иммобилизирOBаны
28,9
100
100
Claims (3)
1 . СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕСЕЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА, заключающийся в выращивании продуцента Nocardia sp.1 на среде мясопептонного бульона с 3%-ным содержанием глюкозы с последующим перенесением на синтетическую среду СР-1, инкубацией и высаливанием фермента сернокислым аммонием из культуральной жидкости, о тли чающийся тем, что, с целью упрощения процесса и увеличения выхода целевого продукта, пос ле инкубации суспензию клеток продуцента смешивают с реагентом, вызывающим процесс гелеобразования, до достижения содержания биомассы в реагенте 0,1-3,0%, затем в полученную смесь вводят инициатор гелеобразования, смесь инкубируют в течение 230 мин при 12-20°С, затем гель или его пленку фрагментируют на гранулы .размером 0,5-1,5 мм и инкубируют на синтетической среде СР-1 в течение 20-24 ч при 28-30°С, после чего отделяют культуральную жидкость от гранул и осаждают из нее целевой продукт.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что - в качестве реагента, вызывающего процесс гелеобразования, используют 4%-ный раствор альгината натрия, перекристаллизованный «акриламид и 10%-ный раствор поливинилового спирта.
3. Способ по п.1, отлич а ю- щ и й с я тем, что в качестве инициатора гелеобразования используют 0,1 М раствор CaC^NjN' -метиленбисакрипамида и облучение ультрафиолетовыми лучами.
1 1157057 2
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU833634238A SU1157057A1 (ru) | 1983-08-11 | 1983-08-11 | Способ получени протеолитического фермента |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU833634238A SU1157057A1 (ru) | 1983-08-11 | 1983-08-11 | Способ получени протеолитического фермента |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU1157057A1 true SU1157057A1 (ru) | 1985-05-23 |
Family
ID=21078871
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU833634238A SU1157057A1 (ru) | 1983-08-11 | 1983-08-11 | Способ получени протеолитического фермента |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
SU (1) | SU1157057A1 (ru) |
-
1983
- 1983-08-11 SU SU833634238A patent/SU1157057A1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
1. Егоров Н.С., Уманова В.И. О фиоринолитической и протеолитической активности некоторых микробактерий и актиномицетов. - Прикл. биохими и микробиологи , 1966, 11, 5, 595, 2. Авторское свидетельство СССР № 493504, кл. С 12 D 13/10, 1975. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2015164C1 (ru) | Способ периодического культивирования клеток-продуцентов моноклональных антител и биологически активных веществ | |
JPS6022897B2 (ja) | 調味液の製造法 | |
EP0054800B1 (en) | Process for the production of immobilized microorganisms | |
Chibata et al. | Continuous production of L-aspartic acid: Improvement of productivity by both development of immobilization method and construction of new Escherichia coli strain | |
SU1157057A1 (ru) | Способ получени протеолитического фермента | |
US3594284A (en) | Lysostaphin fermentation with accelerated time cycle | |
US5308761A (en) | Process for acetylating seaweed alginate with pseudomonas syringae subsp. phaseoliocola | |
US3930944A (en) | Urokinase production | |
RU2085212C1 (ru) | Способ изготовления единого бруцеллезного антигена для ра, рск и рдск | |
RU2174558C1 (ru) | Способ получения l-аспарагиновой кислоты | |
SU1693050A1 (ru) | Способ получени иммобилизованной глюкозоизомеразы | |
Karube et al. | Bacteriolysis by immobilized enzymes | |
JPS60145095A (ja) | 固定化微生物によるキシリト−ルの製造法 | |
CA1132922A (en) | Production of epoxide using immobilized cells | |
SU507635A1 (ru) | Способ получени ферментов | |
RU2420581C1 (ru) | Способ получения биокатализатора, обладающего активностью в отношении синтеза цефалоспоринов-кислот | |
SU1565888A1 (ru) | Способ получени кератиназы | |
US4752584A (en) | Process for the production of inoculum for anaerobic fermentation of coenzyme B12 | |
JPS5876097A (ja) | 固定化微生物によるグルコン酸の製造法 | |
SU1070161A1 (ru) | Способ приготовлени питательной среды дл культивировани продуцентов целлюлолитических ферментов | |
JPS5988091A (ja) | 固定化菌体もしくは固定化酵素 | |
JPS585195A (ja) | 固定化微生物によるクエン酸の製造法 | |
SU1017733A1 (ru) | Способ производства лимонной кислоты | |
FI66644C (fi) | Foerfarande foer immobilisering av glukosisomerasaktiva mikrobceller | |
SU1112057A1 (ru) | Способ культивировани @ @ -продуцентов @ -амилазы |