SU1693050A1 - Способ получени иммобилизованной глюкозоизомеразы - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности, а именно к способу получени  иммобилизованных ферментов, и может быть использовано в пищевой промышленности дл  получени  глюкозно-фруктозного сиропа. Цель изобретени  - повышение активности препарата иммобилизованной глюкозоизомеразы и упрощение процесса. Способ заключаетс  в иммобилизации внутриклеточной глюкозоизомеразы , выделенной из Streptomyces rublginosus на фенолформальдегидном носителе с пористостью 1,1-1,2 см3/г с алифатическими аминогруппами в количестве 4,6-8,3 мг-экв/r при соотношении фермент: носитель 2100-2200 ЕД на 1 г носител , причем дл  дополнительного повышени  активности при иммобилизации ввод т сернокислый магний в концентрации 5ИО - 10 М. Способ позвол ет увеличить активность целевого продукта в 1,5-2 раза, а также упростить процесс. 1 з.п. ф-лы, 1 табл. ё

Description

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности, а именно к способам получени  иммобилизованных ферментов, и может быть использовано в пищевой промышленности дл  получени  глюкозофруктозных сиропов из крахмзлсо- держащего сырь .

Известен способ получени  иммобилизованной глюкозоизомеразы путем сшивани  биомассы продуцента глюкозоизомеразы, предварительно обработанной поверхностно-активными веществами, глутаровым альдегидом 1.

Однако из-за недоступности внутриклеточного фермента дл  субстрата активность иммобилизованной глюкозоизомеразы невысока и составл ет 245-278 ЕД/r препарата .

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому  вл етс  способ получени  иммобилизованной глюкозоиэомеразы путем культивировани  микроорганизмов Streptomyces rubiginosus с внутриклеточной глюкозоизомеразой, выделени  внутриклеточного фермента, ультрафильтрации, кристаллизации, повторного растворени  фермента и иммобилизации его на предварительно гидратированном носителе, содержащем ДЭАЭ-целлюлозу, полистирол и оксид титана. Активность получаемого иммобилизованного препарата составл ет в среднем 850 ЕД/г 2.-

Недостатками известного способа  вл ютс  недостаточно высока  активность препарата и многостадийность процесса.

О

ю со

о ел о

Цель изобретени  - повышение активности препарата иммобилизованной глюко- зоизомеразы и упрощение процесса.

При предлагаемом способе культивируют микроорганизмы Streptomyces rublginosus внутриклеточной глюкозоизо- меразой, выдел ют внутриклеточный фермент, провод т ультрафильтрацию и затем осуществл ют иммобилизацию глюкозоизомеразы на фенолформальде- гидном носителе с пористостью 1,1-1,2 см /г с алифатическими аминогруппами в количестве 4,6-8,3 мг-экв/г, причем в процессе иммобилизации вместе с глюкозоизо- меразой к носителю может быть добавлен сернокислый магний.

Способ позвол ет повысить активность иммобилизованной глюкозоизомеразы в 1,5-2 раза, а при иммобилизации в присутствии сернокислого магни  активность дополнительно возрастает на 18-20%. Кроме того, исключаютс  стадии кристаллизации, повторного растворени  фермента, а также предварительна  гидратаци  носител , что упрощает процесс.

Пример 1. Культивирование продуцента глюкозоизомеразы Streptomyces rubiginosus ATCC 21175 провод т в ферментере емкостью 10 л при коффициенте заполнени  0,5. Дл  ферментера готов т 5 л питательной среды, дл  чего в ферментер заливают 4 л воды, загружают 0,15 кг глюкозы , 0,08 кг кукурузного экстракта, 0,004 кг аммони  фосфорнокислого двузамещенно- го, 0,003 кг марганца сернокислого, 0,001 кг пеногасител , объем довод т до 5 л водой. Смесь перемешивают до полного растворени  компонентов и стерилизуют при 125°С в течение 40 мин, после стерилизации довод т рН до 6,3 аммиаком. Внос т посевной материал в количестве 0,5 л и начинают культивирование продуцента при 30°С и расходе воздуха 0,65 м на 1 м3 среды в 1 мин. Через 20 ч, когда содержание глюкозы в среде достигнет уровн  10 г/л, провод т подпитку 0,5 л 60%-ного стерильного раствора глюкозы. К концу ферментации через 80 ч после инокул ции величина активности внутриклеточного фермента достигает 50 ЕД/мл. Культуральную жидкость в количестве 5 л центрифугируют при охлаждении, при этом получают 3,0 кг биомассы с влажностью 90 %. К биомассе прибавл ют 3.0 л М раствора сернокислого магни , охлаждают смесь в лед ной бане. Разрушение биомассы ультразвуком осуществл ют в течение 1,5-2 мин (частота ультразвука 22 кГц). Активность глюкозоизомеразы после разрушени  клеток и выхода фермента в раствор составл ет 380 ЕД/мл суспензии. Разрушенную биомассу центрифугируют при охлаждении . Внутриклеточна  глюкозоизоме- раза, освобожденна  из клеток, остаетс  в надосадочной жидкости, количество кото- рой составл ет 4,5 л, активность глюкозоизомеразы в растворе 85 ЕД/мл. После ультрафильтрации активность глюкозоизомеразы в ультраконцентрате составл ет 800 ЕД/мл, общее количество ультраконцентрата 0.4 л. К 0,4 л ультраконцентрата добавл ют 0,15 кг фенолформальдегидного носител  пористостью (1,2 см3/г с алифатическими аминогруппами, количество аминогрупп 4,6 мг-экв/г). Иммобилизацию

глюкозоизомеразы на носителе продолжают в течение 20 ч при 4-6°С при соотношении фермента и носител  2100 ЕД на 1 г.

Активность полученного имобилизован- ного препарата составл ет 1600 ЕД/г.

П р и м е р 2. Процесс осуществл ют по примеру 1 с той разницей, что используют штамм СЗ, а при иммобилизации к раствору фермента предварительно добавл ют сернокислый магний в количестве 5-10 М, при

этом активность составл ет 1650 ЕД/г препарата . Пористость носител  1,1 см /г, количество аминогрупп 6,8 мг-экв/г, а соотношение фермент: носитель 2160 ЕД на 1 г носител .

П р и м е р 3. Способ осуществл ют, как описано в примере 2, добавл   сернокислый магний в количестве, 1,0 М. Пористость носител  1,3 см°/г. количество аминогрупп 8,3 мг-экв/г, а соотношение

фермент: носитель 2200 ЕД на 1 г носител . Активность целевого продукта 1900 ЕД/г.

Использование концентрации сернокислого магни  меньше чем М не дает эффекта, а увеличение концентрации выше

10 М не приводит к дальнейшему увеличению активности иммобилизованного препарата .

В таблице 1 показано, как вли ют пористость носител  и количество аминогрупп в

нем на активность целевого продукта. Из этих данных следует, что при предложенном способе могут быть использованы носители с пористостью 1,1-1,3 см /г при содержании аминогруппы 4,6-8,3 мг-экв/г носител . Соотношение фермент: носитель может варьировать от 2100 до 2200 Ед на 1 г носител .

Таким образом, использование предложенного способа позвол ет увеличить ак- 5 тивность целевого продукта в 1,5-2 раза (от 670-900 до 1600-1900 ЕД/г), а также упростить процесс за счет исключени  р да стадий . Введение ионов магни  в процессе иммобилизации приводит к дополнительному увеличению активности на 18-20%.

Claims (2)

1. Формула изобретени  1. Способ получени  иммобилизованной глюкозоизомеразы, включающий культивирование продуцента Streptomyces rubiginosus, отделение клеток, их разрушение , выделение глюкозоизомеразы,ультрафильтрацию и ее иммобилизацию на нерастворимом носителе, отличающий- с   тем, что, с целью повышени  активности препарата иммобилизованной глюкозоизо

   меразы и упрощени  процесса, в качестве носител  используют фенолформальдегид- ный носитель с пористостью 1,1-1,2 см /г, содержащий алифатические аминогруппы в количестве 4,6-8,3 мг-экв/г.
2. 2. Способ по п. 1,отличающийс  тем, что при иммобилизации к ультраконцентрату глюкозоизомеразы добавл ют сернокислый магний в количестве 5-10 - М.