CH617946A5

CH617946A5 -

Info

Publication number: CH617946A5
Application number: CH1693874A
Authority: CH
Inventors: Hermann Erich Dr Karges
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1973-12-21
Filing date: 1974-12-19
Publication date: 1980-06-30
Also published as: DK670374A; US3985620A; LU71531A1; IL46310A0; IT1027847B; IL46310A; IE40559L; BE823771A; DE2363854C3; FR2255600B1; DE2363854A1; ATA1021274A; ES432961A1; DE2363854B2; FR2255600A1; SE7415983L; JPS5098893A; AT355225B; SE7807953L; NL7416360A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Substrats zur Proteinasebestimmung. Das so hergestellte Substrat eignet sich insbesondere zur Verwendung in gefärbten Lösungen, beispielsweise in haemoglobin-oder chloro-phyllhaltigen Medien.

Für die Proteinasebestimmung wird in der Literatur eine grosse Zahl von Verfahren beschrieben, die sich im wesentlichen in zwei Gruppen einteilen lassen, nämlich einerseits solche, bei denen hochmolekulare Eiweisskörper gespalten werden und andererseits solche, die auf einer Hydrolyse von niedermolekularen Substanzen, wie Estern und Amiden, beruhen. Bei der zweiten Gruppe besitzen die Spaltprodukte häufig eine veränderte Lichtabsorption gegenüber dem intakten Substrat. Die Änderung der Lichtabsorption beim Absorptionsmaximum der Spaltprodukte wird hierbei meist als ein Mass für die Enzymaktivität verwendet. Üblicherweise wird angenommen, dass die Wirkung der Proteinase auf hochmolekulare Substrate im gleichen Sinne wie am niedermolekularen Material verläuft. Diese Voraussetzung ist jedoch in komplexen Systemen, die neben den Enzymen auch Inhibitoren enthalten, beispielsweise im Blut, nicht gegeben.

Mit hochmolekularen Substraten, wie Haemoglobin, Gelatine oder Casein, kann man die proteolytische Wirkung einer Lösung korrekt bestimmen. Sie haben aber den Nachteil,

dass sie nach der Inkubationszeit mit dem Enzym durch Fällung von den Abbauprodukten getrennt und anschliessend häufig noch mittels empfindlicher chemischer Reaktionen nachgewiesen werden müssen. Dadurch ergeben sich grosse Fehlerbreiten bei diesen Aktivitätsmessungen. Darüber hinaus treten bei beiden Gruppen von Bestimmungsmethoden beträchtliche Mängel dann zutage, wenn die Messverfahren eine optische Ablesung erfordern und die proteinasehaltige Lösung eine mit dem Messbereich interferierende eigene Absorption zeigt.

Es ist schon versucht worden, hochmolekulare Substrate mittels reaktiven Farbstoffen einzufärben und die hydrolytische Proteinasewirkung durch Messung der abgespaltenen Farbstoffmenge photometrisch zu bestimmen [Liter.: H. Rinderknecht et al., Clin. Chim. Acta 21 (1968) 197—203]. Diese Methode hat jedoch den Nachteil, dass ihre Empfindlichkeit bei Verwendung von gefärbtem Hautpulver wesentlich von dessen Partikelgrösse beeinflusst wird.

Es wurde nun gefunden, dass man ein hochempfindliches festes Substrat zur Proteinasebestimmung erhält, wenn ein Substratprotein in feiner Verteilung in oder auf der Oberfläche eines festen Trägers kovalent gebunden und mit Reaktivfarbstoffen eingefärbt ist. Durch die feine Verteilung werden die hochmolekularen Substrate für die zu bestimmenden Proteinasen sehr gut zugänglich, und die Spaltung des Substrats führt zu einer von der Enzymaktivität abhängigen Freisetzung des daran gekoppelten Farbstoffes.

Ein derartiges Substrat wird erfindungsgemäss hergestellt, indem man ein Substratprotein und einen festen Träger oder ein zur Bildung des festen Trägers dienendes Monomer derart aufeinander einwirken lässt, dass das Substratprotein

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in dem Träger oder auf dessen Oberfläche in feiner Verteilung kovalent gebunden wird, und dass man das erhaltene Produkt mit einem Reaktivfarbstoff einfärbt.

Als Substratproteine für die Durchführung des erfin-dungsgemässen Verfahrens eignen sich alle durch Proteinasen spaltbaren Proteine — insbesondere Haemoglobin, Casein, Fibrinogen oder Kollagen sowie deren Um- oder Abwandlungsprodukte, wie Hitzefibrin, a-Casein, Gelatine, ferner wiedervernetzte Hydrolyseprodukte dieser Verbindungen, beispielsweise wiedervernetzte Polypeptide aus abgebauter Gelatine, welche nach dem DP 1 118 792 hergestellt und als Haemaccel® (Warenzeichen der Behringwerke AG) im Handel sind.

Als Träger für diese Substrate eignen sich vor allem Copolymere aus einem aktive Gruppen enthaltenden Monomer, d. h. einem solchen, das aktive Gruppen, wie die Carbonsäureanhydrid- oder die Isothiocyanat-Gruppierung, enthält, und einem keine aktiven Gruppen enthaltenden Monomer, z. B. eine Äthenverbindung. Als aktive Gruppen enthaltende Monomere eignen sich insbesondere Maleinsäureoder Crotonsäureanhydrid sowie Allylisothiocyanat, als keine aktiven Gruppen enthaltende Monomere z. B. Propylen, Acrylamid oder Butadien.

Aus Gründen der Einfachheit werden im folgenden die aktive Gruppen enthaltenden Monomere als aktive Monomere und die keine aktiven Gruppen enthaltenden Monomere als inaktive Monomere bezeichnet.

Die Copolymere können aus aktivem und inaktivem Monomer in beliebigen Mengenverhältnissen bestehen. Entsprechend können Monomereinheiten des aktiven Monomers zu 0,01 bis 99,99 Mol.-% im Polymerisat enthalten sein. Das Copolymer aus Maleinsäureanhydrid und Acrylamid wird vorteilhaft weniger als etwa 6 Mol.-°/o Maleinsäureanhydrid, das Copolymer aus Maleinsäureanhydrid und Butadien weniger als etwa 90 Mol.-°/o Maleinsäureanhydrid enthalten, während das Copolymer aus Maleinsäureanhydrid und Propylen vorteilhaft aus etwa 50 % Maleinsäureanhydrid und 50 o/o Propylen besteht. Soll ein besonders hoher Anteü an aktiven Gruppen vorliegen, so lässt sich auch ein Homopolymer des aktiven Monomers, beispielsweise des Maleinsäureanhydrids als Trägermaterial für das Substrat-Protein einsetzen.

Der Träger wird sodann mit dem Substratprotein derart zur Umsetzung gebracht, so dass die aktiven Gruppen beider Partner kovalente Bindungen miteinander eingehen. Die Art der Reaktion und der dabei entstehenden kovalenten Bindung hängt naturgemäss von dem Charakter der in Reaktion tretenden aktiven Gruppen ab. Beispielsweise können unter entsprechenden Additions- oder Kondensationsreaktionen Peptid-, Harnstoff-, Thioharnstoff-, Ester-, Acetal- oder Ätherbindungen geknüpft werden.

Sollten im Trägermaterial überschüssige aktive Gruppen zurückbleiben, die nicht mit den Substratproteinen in Reaktion getreten sind, so können diese gewünschtenfalls durch geeignete niedermolekulare Reagentien, z. B. Säureanhydridgruppen durch ein Amin, wie Hexamethylendiamin, abgebunden werden.

Weitere Möglichkeiten zur Bindung in oder an einen inerten Träger (z. B. Polyacrylamid, Polyamid) bestehen in der Einführung von reaktionsfähigen Gruppen, wie Isothio-cyanat, reaktionsfähigen Doppelbindungen, Diazoniumgrup-pen, Azogruppen oder reaktionsfähigen Halogenen in die Substratproteine, die anschliessend nach den üblichen chemischen Methoden mit dem Träger umgesetzt werden. Ist der Träger seinerseits mit reaktionsfähigen Gruppen ausgestattet, so lässt sich das Substrat sinngemäss, wie vorstehend gezeigt, daran binden.

Die Auswahl des Reaktionsfarbstoffes richtet sich allgemein nach dem bevorzugten Verwendungsbereich des Substrats. Für die Messung der Protenase im Blut oder haemo-globinhaltigen Medien — insbesondere Organextrakten — werden vorzugsweise Farbstoffe verwendet, deren Absorptionsmaximum im Wellenlängenbereich > 600 nm liegt, da hierbei eine Beeinflussung durch die Eigenabsorption des Haemoglobins stark zurücktritt. Besonders geeignet ist hierbei das im Handel erhältliche Remazol® (Remazol® = reg. Warenzeichen der Farbwerke Hoechst AG) türkisblau B [C. I. (= Colour Index) Reactive blue 77]. Andere Farbstoffe, die zur Substratfärbung geeignet sind, sind Procion®* türkisblau H 7 G (C. I. Reactive blue 3), Remazol® schwarz RL (C. I. Reactive black 31), Cibacron®** türkisblau G-E (C. I. Reactive blue 7), Cibacron® türkisblau FGF-P (C. I. 74 460, Reactive blue 15), um einige Beispiele herauszugreifen.

* Procion® = reg. Warenzeichen der ICI ** Cibacron® = reg. Warenzeichen der Ciba AG

Bei chlorophyllhaltigen Pflanzenextrakten kann man Farbstoffe wählen, die mindestens ein mit dem Pflanzengrün nicht interferierendes Absorptionsmaximum haben, z. B. Remazol® brilliantrot FB (C. I. Reactive red 104), Remazol® brilliant-rot BB (C. I. Reactive red 21).

Zur Einfärbung des auf oder in dem Träger kovalent gebundenen Substrats werden allgemein pH- und Temperaturbedingungen gewählt, wie sie vom Farbstoffhersteller empfohlen werden. Nach der Reaktion des Farbstoffes mit dem Substrat wird zweckmässigerweise der überschüssige Farbstoff unter Kontrolle der Extinktion in dem entsprechenden Absorptionsmaximum ausgewaschen. Ein nach diesem Verfahren hergestelltes festes Substrat zur Proteinase-Bestim-mung ist um den Faktor 5 bis 100 empfindlicher als die nach dem Stand der Technik eingefärbten hochmolekularen Substrate.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Substrats zur Messung von Proteinaseaktivitäten. Nach Inkubation der proteinasehaltigen Lösungen mit dem gefärbten trägergebundenen Substrat, die bei 0° C—80° C je nach der Temperaturempfindlichkeit der zu bestimmenden Proteinase durchgeführt werden kann — vorzugsweise werden Temperaturen von 20—40° C angewendet — wird der leicht zentrifu-gierbare und filtrierbare Träger abgetrennt und der freigesetzte Farbstoff in dessen Absorptionsmaximum gemessen. Die dabei erhaltene Extinktion ist in weitem Bereich linear von der zu messenden Proteinaseaktivität abhängig. Extinktionen ausserhalb des linearen Bereichs können durch Verdünnung der Enzymlösung vermieden werden. Durch die kovalente Bindung des Substratproteins an den Träger und des Farbstoffes an das Substratprotein ist das Substrat in weiten pH-Bereichen (pH 2—pH 12) während der für den Test benötigten Zeit stabil. Während adsorptiv am Träger angelagerte Substrate durch Änderung des Salzmilieus oder Anwesenheit von Proteinen, z. B. Albumin, leicht abgelöst werden, erlaubt das Substrat gemäss der Erfindung die Verwendung verschiedener Puffersysteme, je nachdem welches für die Messung der betreffenden Proteinase als optimal angesehen wird.

Die erfindungsgemäss erhältlichen Substrate sind geeignet, Proteinasen mit einer bei bekannten Substraten bisher nicht beobachteten Empfindlichkeit zu bestimmen, so z. B. Trypsin, Chymotrypsin, Kollagenase, Bromelain, Ficin oder Pronase. Die Herstellung des Substrats und dessen Verwendung zur Bestimmung von Proteinasen, insbesondere im Blut, Gewebe- und Pflanzenextrakten, ist in den nachstehenden Beispielen beschrieben.

Beispiel 1

400 mg eines pulverförmigen Polymerisats aus Maleinsäureanhydrid und Propylen im Molverhältnis 1:1 werden in

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10 ml 0,2 M Phosphatpuffer pH 7,5 angeteigt und in einem Kältebad aus Eiswassergemisch mit dem gleichen Phosphatpuffer auf 20 ml aufgefüllt. Eine Lösung von 120 mg Hu-manfibrinogen in 12 ml 0,15 M NaCl-Lösung wird zugefügt. Sodann werden zur Verschliessung der überschüssigen Anhydridgruppen 8 ml Hexamethylendiamin hinzugefügt. Der Ansatz wird über Nacht gerührt, abdekantiert und das Gel dreimal mit je 40 ml 0,9°/oiger Kochsalzlösung gewaschen. Nach diesem Auswaschen nicht-gebundenen Fibrinogens wird das Gel in 75 ml eines Trinatriumphosphatpuffers, der 720 mg Na3PC>4 • 12 H2O enthält, suspendiert und unter Zusatz von 360 mg Remazol® türkisblau B (C. I. Reactive blue 77) 3 Stunden bei 40° C in einem Wasserbad gerührt. Anschliessend wird das Gel durch Zentrifugation niedergeschlagen, mit 400 ml einer 0,9%igen Kochsalzlösung bei 80° C aufgerührt und danach wiederum zentrifugiert. Dieser Waschvorgang zur Entfernung des überschüssigen, nicht kovalent gebundenen Farbstoffes wird insgesamt 10 mal wiederholt, wobei die ersten beiden Waschungen mit einer Kochsalzlösung durchgeführt werden, die auf 100 ml 0,2 ml einer 2 n Natronlauge enthält. Die folgenden 5 Waschungen erfolgen mit Kochsalzlösung ohne Zusatz. Die 8. Waschung wird mit Kochsalzlösung durchgeführt, die auf 100 ml 0,5 g Rinderalbumin enthält. Die Waschlösung für die letzten beiden Waschungen enthält keine Zusätze. Danach wird abermals zentrifugiert und die Ausbeute bestimmt. Es werden 1,2 g feucht gewogenes Substrat erhalten. Für die Herstellung einer Substratpräparation zur Bestimmung von Plasmin wird der Niederschlag in 3,6 ml eines 0,1 M Natriumeitratpuffers vom pH-Wert 7,4 suspendiert.

Das auf diese Weise erhaltene Proteinasesubstrat kann direkt zur Aktivitätsbestimmung verwendet werden.

Gleich gute Werte werden erhalten, wenn das Substrat zur Lagerung lyophilisiert und unmittelbar vor der Verwendung in der entsprechenden Menge Wasser resuspendiert wird.

Beispiel 2

150 mg Fibrinogen vom Rind in 20 ml 0,15 M NaCl werden mit 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,6 und anschliessend portionsweise mit 15 mg Maleinsäureanhydrid versetzt und eine halbe Stunde bei Zimmertemperatur reagieren gelassen. Das so erhaltene Maleoylfibrinogen wird in einem Polymerisationsansatz nach L. Ornstein (Annal. N. Y. Acad. Sei. 121, 321, 1964) mit Acrylamid copolymerisiert. Für den Polymerisationsansatz werden die von Ornstein vorgeschlagenen Lösungen A und C sowie eine Ammoniumperoxydi-sulfatlösung folgender Zusammensetzung verwendet:

Lösung A:

48 ml In HCl

36,3 g Trishydroxymethylaminomethan 0,46 ml TEMED = Tetraäthylmethyl-äthylendiamin ad 100 ml destilliertes Wasser

Lösung C:

(nach Ornstein, abgewandelt)

30 g Acrylamid 1,5 g Methylenbisacrylamid ad 100 ml destilliertes Wasser

Ammoniumperoxidisulfat:

l%ige Lösung in destilliertem Wasser

Die Copolymerisation von 25 ml der oben erhaltenen Maleoylfibrinogenlösung wird durch Zusatz von 5 ml der Lösung A, 6,25 ml der Lösung C und 1,25 ml Ammonium-

peroxydisulfatlösung eingeleitet und durch einstündiges Stehenlassen bei Zimmertemperatur vollendet. Danach wird das Gel mit 80 ml 0,9°/oiger Kochsalzlösung überschichtet und mit einem Laborhomogenisator (Ultra Turrax) zerkleinert. Das Produkt wird zentrifugiert und mit der gleichen Menge einer 0,9%igen Kochsalzlösung gerührt, darauf abermals abzentrifugiert und der Rückstand in 24 ml eines Trinatriumphosphatpuffers, der 0,9 g Trinatriumphosphat enthält, suspendiert. Dazu werden 0,45 g Remazol® türkisblau B (C. I. Reactive blue 77) gegeben. Die Mischung wird 3 Stunden bei 40° C gerührt. Der überschüssige Feststoff wird sodann wie in Beispiel 1 ausführlich dargestellt, ausgewaschen, wobei für einen Wasch Vorgang jeweils 240 ml einer 0,9%igen Kochsalzlösung und ggf. die in Beispiel 1 angeführten Zusätze verwendet werden.

Beispiel 3

3 g Haemoglobin vom Pferd werden in 300 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,4 gelöst und mit 900 mg pulverisiertem Maleinsäureanhydrid versetzt. Anschliessend wird noch eine halbe Stunde gerührt. Das dabei entstandene Maleoylhaemo-globin wird entsprechend Beispiel 2 mit Acrylamid zu einem 5%igen Acrylamidgel copolymerisiert. Für die Polymerisation werden die in Beispiel 2 angegebenen Lösungen nach Ornstein in folgenden Mengenverhältnissen eingesetzt:

Zu 300 ml der Maleoylhaemoglobinlösung werden 60 ml der Lösung A nach Ornstein, 75 ml der Lösung C und 15 ml der l°/oigen Ammoniumperoxydisulfatlösung gegeben.

Nach 1 Stunde bei Zimmertemperatur wird das Gel mit 900 ml 0,9°/oiger Kochsalzlösung überschichtet und mit einem Laborhomogenisator (Ultra Turrax) zerkleinert. Das Copolymerisat wird zentrifugiert und mit dem gleichen Volumen einer 0,9%igen Kochsalzlösung kurz gerührt, danach zentrifugiert und der Rückstand in 450 ml eines Trinatriumphosphatpuffers, der 10,8 g Na3P04 • 12 H2O enthält, suspendiert und bei 25° C mit 5,4 g Remazol® türkisblau B (C. I. Reactive blue 77) 18 Stunden gerührt. Der überschüssige Farbstoff wird wie in Beispiel 1 beschrieben, ausgewaschen, wobei in der angegebenen Reihenfolge jeweils 4,5 1 der Waschlösung eingesetzt werden.

Beispiel 4

1 g Fibrinogen wird in 100 ml 0,2 M Phosphatpuffer pH 7,4 gelöst und mit 10,4 g (10 ^1) Crotonsäureanhydrid umgesetzt. Das beim Stehen des Ansatzes gebildete Croto-nylderivat des Fibrinogens wird entsprechend Beispiel 2 mit Acrylamid bei pH 8,5 zu einem 4%igen Gel copolymerisiert. Hierzu werden 100 ml der Crotonylfibrinogenlösung mit den in Beispiel 2 beschriebenen Polymerisationslösungen nach Ornstein umgesetzt, wobei hier 25 ml Lösung A, 20 ml Lösung C und 5 ml Ammoniumperoxydisulfat zugegeben werden. Nach 1 Stunde wird das Gel mit 300 ml 0,9°/oiger Kochsalzlösung überschichtet, mit einem Laborhomogenisator zerkleinert, anschliessend zentrifugiert, einmal mit Kochsalzlösung gewaschen, abermals zentrifugiert und in 150 ml eines Trinatriumphosphatpuffers, der 1 g Trinatriumphosphat enthält, suspendiert und mit 0,5 g Remazol® türkisblau B (C. I. Reactive blue 77) bei 40° C umgesetzt. Der überschüssige Farbstoff wird gemäss Beispiel 1 unter Verwendung von jeweils 1,5 Liter der Waschlösung ausgewaschen.

Beispiel 5

10 g Gelatine werden in 0,1 M Phosphatpuffer pH 8,5 bei 60° C gelöst und bei etwa 30° C mit 56,5 fA (58,5 mg) Allylisothiocyanat umgesetzt. Es entsteht das Allylisothio-harnstoffderivat. Dieses wird entsprechend Beispiel 2 mit Acrylamid bei pH 8,5 zu einem 4°/oigen Gel copolymerisiert. Hierzu werden 100 ml einer 10°/oigen Allylisothioharnstoff-

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Gelatine-Lösung mit den in Beispiel 2 angeführten Lösungen nach Ornstein umgesetzt, wobei hier 25 ml Lösung A, 20 ml Lösung C und 5 ml Ammoniumperoxydisulfatlösung zur Anwendung gelangen. Nach 1 Stunde wird das Gel mit 300 ml 0,9°/oiger Kochsalzlösung überschichtet, mit einem Laborho- 5 mogenisator zerkleinert, zentrifugiert, einmal mit Kochsalzlösung gewaschen, abermals zentrifugiert und in 150 ml eines Trinatriumphosphatpuffers, der 9,2 g Trinatriumphosphat enthält, suspendiert und mit 4,6 g Remazol® türkisblau B (C. I. Reactive blue 77) bei 40° C umgesetzt. Der überschüs- io sige Farbstoff wird gemäss Beispiel 1 unter Verwendung von jeweils 1,5 Liter der Waschlösung ausgewaschen.

Beispiel 6 15

100 ml Haemaccel® mit einem Eiweissgehalt von 10 °/o werden mit 100 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 8,5 gemischt und mit 56,5 mg Maleinsäureanhydrid bei 30° C umgesetzt. Das maleoylierte Haemaccel wird gemäss Beispiel 2 mit Acrylamid bei pH 8,5 zu einem 4%igen Gel copolymerisiert. 20 Hierzu werden 200 ml der Maleoyl-Haemaccel-Lösung mit den in Beispiel 2 beschriebenen Polymerisationslösungen nach Ornstein umgesetzt, wobei hier 50 ml Lösung A, 40 ml Lösung C und 10 ml Ammoniumperoxydisulfatlösung zugegeben werden. Nach 1 Stunde wird das Gel mit 600 ml 25 0,9°/oiger Kochsalzlösung überschichtet, mit einem Laborhomogenisator zerkleinert, zentrifugiert, einmal mit Kochsalzlösung gewaschen, abermals zentrifugiert und in 300 ml eines Trinatriumphosphatpuffers, der 9,2 g Trinatriumphosphat enthält, suspendiert und mit 4,6 g Remazol® türkisblau B 30 (C. I. Reactive blue 77) bei 40° C umgesetzt. Der überschüssige Farbstoff wird gemäss Beispiel 1 unter Verwendung von jeweils 3 Liter der Waschlösung ausgewaschen.

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Beispiel 7

1 g Casein wird in 0,1 M Citratpuffer pH 7,4 zu einer 10%igen Lösung gelöst. Bei Zimmertemperatur werden 0,2 ml Polyäthylenglycol-«,<w-di-(sulfophenyl-4-isothiocyanat) mit ei-40 nem Molekulargewicht zwischen 1000 und 6000 zugesetzt und bis zum Erstarren gerührt. Nach 1 Stunde wird das Gel zerkleinert. Nach Auswaschen des nicht gebundenen Proteins mit 2 X 50 ml eines 0,5 M Citratpuffers pH 7,4 wird das Gel zentrifugiert und in 50 ml eines Trinatriumphos- 45 phatpuffers, der 1 g Trinatriumphosphat enthält, suspendiert und mit 0,5 g Remazol® brilliantrot FB (C. I. Reactive red 104) versetzt und 3 Stunden bei 40° C gehalten. Der über617 946

schüssige Farbstoff wird gemäss Beispiel 1 unter Verwendung von jeweils 1 Liter Waschlösung ausgewaschen.

Beispiel 8

600 mg a-Casein werden in 0,05 M Trispuffer pH 7,5, der 0,09 M NaCl enthält, zu einer 3°/oigen Lösung gelöst und 1 Stunde auf 80° C erhitzt. Nach Abkühlen auf 30° C werden 0,15 ml Polyäthylenglycol-a,oj-di-(sulfophenyl-4-iso-thiocyanat) mit einem Molekulargewicht zwischen 500 und 1000 zugesetzt und das Gemisch bis zum Erstarren gerührt. Nach 1 Stunde wird das Gel zerkleinert und das nicht gebundene Protein mit 2 X 100 ml eines 0,1 M Citratpuffers pH 7,4 ausgewaschen, zentrifugiert und in 200 ml eines Trinatriumphosphatpuffers, der 600 mg Trinatriumphosphat enthält, suspendiert. Zu dieser Suspension werden 300 mg Procion® türkisblau H 7 G (C. I. Reactive blue 3) zugesetzt, 30 Minuten bei 40° C gehalten und anschliessend noch 30 Minuten auf 80° C erhitzt. Nach dem Abkühlen wird der überschüssige Farbstoff gemäss Beispiel 1 unter Verwendung von jeweils 200 ml Waschlösung ausgewaschen.

Versuch 1

Zu 50 mg eines aus Suspension in phys. Kochsalz gefriergetrockneten Substrats nach Beispiel 2 werden 2 ml aqua dest. und 2 ml 0,1 molaren Citratpuffers pH 7,4 pipettiert und der Ansatz 5 Minuten bei Zimmertemperatur gelassen. Anschliessend wird mit einem Glasstab eine homogene Suspension hergestellt und diese 5 Minuten bei 37° C im Wasserbad inkubiert. 2 ml Citratblut von einem Patienten unter Fibrinolysetherapie werden sofort nach der Abnahme aus der Armvene zum Substrat gegeben und der Ansatz gut durchgemischt. Es wird 15 Minuten bei 37° C unter 3-maligem Umschütteln inkubiert. Der Abbau wird nach 15 Minuten durch Zusatz von 1 ml einer verdünnten Lösung des Kunitz Trypsin-Inhibitors mit 500 KIE/ml gestoppt. Nach Abschleudern des Substrats durch 10 Minuten Zentrifugation bei 3000 UpM in einer Laborzentrifuge wird der klare Überstand abgehebert und bei 665 nm im Spektralfotometer gemessen. Anhand einer Eichkurve lässt sich die Plasminaktivi-tät ablesen. Für einen Patienten nach 10 Minuten Fibrinolysetherapie ergab sich z. B. eine AE 665 nm von 0,235 OE. Aus einer Eichkurve, die mit Hilfe definierter Mengen Plasmin erstellt wurde und die als Fig. 1 beigefügt ist, liest man eine Piasminaktivität von 0,16 Einheiten nach Remmert & Cohen für diesen Zeitpunkt ab.

Unter Abänderung der Versuchsbedingungen lassen sich beispielsweise folgende Enzyme bestimmen:

Enzym Substrat* Puffer pH Inkubations- Inkubations temperatur dauer

Trypsin

Haemaccel

0,05 M Tris

8,0

37° C

15 Minuten

Chymotrypsin

Gelatine

0,05 M Phosphat

7,5

37° C

15 Minuten

Kollagenase

Kollagen

0,1 M Citrat

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37° C

30 Minuten

Bromelain

Casein

0,1 M Acetat

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40° C

30 Minuten

Ficin

Haemoglobin

0,05 M Tris

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40° C

20 Minuten

Pronase

Casein

0,06 M Borat

9,0

40° C

10 Minuten

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"• Träger und Farbstoff können im Rahmen der Erfindung beliebig gewählt werden.

Versuch 2

Vergleich der Empfindlichkeit des erfindungsgemäss hergestellten Substrats mit einem dem Stand der bisherigen Technik entsprechenden Handelsprodukt, hergestellt aus dem denaturierten Kollagen der Kuhhaut, an welcher ein blauer Farbstoff gebunden ist, beim jeweiligen Absorptionsmaximum. Als Enzym wird Trypsin (Serva, 2 X krist.) verwendet. Der Abbau wird in 0,05 M Tris pH 7,8 bei 37° C 15 Minuten durchgeführt und mit einem Proteinaseinhibitor gestoppt. Das Volumen des Reaktionsansatzes betrug 6 ml.

Trypsinmenge

Substrat I

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AE 595 nm

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Wie aus den Vergleichszahlen ersehen werden kann, ist das erfindungsgemäss hergestellte Substrat wesentlich emp-15 findlicher als das Substrat des Standes der Technik.

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1 Blatt Zeichnungen

Claims

617 946 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung eines Substrats zur Proteinasebestimmung, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Substratprotein und einen festen Träger oder ein zur Bildung des festen Trägers dienendes Monomer derart aufeinander einwirken lässt, dass das Substratprotein in dem Träger oder auf dessen Oberfläche in feiner Verteilung kovalent gebunden wird, und dass man das erhaltene Produkt mit einem Reaktivfarbstoff einfärbt.

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Substratprotein Haemoglobin, Casein, Fibrinogen, Kollagen oder ein Umwandlungsprodukt eines dieser Proteine verwendet.

3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Träger ein Homopolymer eines aktive Gruppen enthaltenden Monomers verwendet.

4. Verfahren nach Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die aktive Gruppen enthaltenden Monomere Maleinsäureanhydrid, Crotonsäureanhydrid oder Allyliso-thiocyanat sind.

5. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Träger ein Copolymer aus einem aktive Gruppen enthaltenden Monomer und einem keine aktiven Gruppen enthaltenden Monomer verwendet.

6. Verfahren nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die aktive Gruppen enthaltenden Monomere Maleinsäureanhydrid, Crotonsäureanhydrid oder Allyliso-thiocyanat sind,

7. Verfahren nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die keine aktiven Gruppen enthaltenden Monomere Propylen, Acrylamid oder Butadien sind.

8. Verfahren nach den Patentansprüchen 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als Träger ein Copolymer aus Ma-leinsäureanhydrid und Acrylamid mit einem Anteil von bis zu 6 Mol-°/o Maleinsäureanhydrid verwendet.

9. Verfahren nach den Patentansprüchen 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als Träger ein Copolymer aus Maleinsäureanhydrid und Butadien mit einem Anteil von bis zu 90 Mol.-fl/o Maleinsäureanhydrid verwendet.

10. Verfahren nach den Patentansprüchen 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als Träger ein Copolymer aus gleichen Teilen Maleinsäureanhydrid und Propylen verwendet.

11. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Träger ein Homopolymer aus Maleinsäureanhydrid verwendet.

12. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Reaktivfarbstoff einen solchen mit einem Absorptionsmaximum im Wellenbereich > 600 nm verwendet.

13. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Träger aus einem Copolymerisat eines aktive Gruppen enthaltenden Monomers mit einem aktive Gruppen aufweisenden Substratprotein unter Bildung kovalenter Bindungen umsetzt und anschliessend das Reaktionsprodukt mit einem Reaktivfarbstoff einfärbt.

14. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Träger, der keine aktiven Gruppen enthält, mit einem Substratprotein unter Zuhilfenahme eines aktive Gruppen liefernden Stoffes umsetzt und das erhaltene Reaktionsprodukt anschliessend mit einem Reaktivfarbstoff einfärbt.

15. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in das Substratprotein reaktive Gruppen einführt und dieses sodann mit einem keine reaktive Gruppen enthaltende Monomer copolymerisiert.

16. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein mit aktiven Gruppen ausgestattetes lösliches Polymer mit dem Substratprotein vernetzt.

17. Substrat zur Proteinasebestimmung, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1.

18. Verwendung eines Substrats nach Patentanspruch 17 zur Messung der Proteinaseaktivität in Lösungen.

19. Verwendung nach Patentanspruch 18 zur Messung der Proteinaseaktivität in gefärbten Lösungen.