JP2757946B2 - デキストラナーゼ吸着体およびその製造法 - Google Patents

デキストラナーゼ吸着体およびその製造法

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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、デキストラナーゼを吸
着した架橋または不溶化デキストラン、およびその製造
法に関するものである。本発明の1つの態様は、エピク
ロルヒドリン、リン酸などの架橋剤で架橋した架橋デキ
ストランに、デキストラナーゼを含む溶液からデキスト
ラナーゼを吸着させ、デキストラナーゼ吸着架橋デキス
トランを得る方法であり、これは乾燥させた粉末または
粒状の形態でデキストラナーゼ製剤として使用される。
このデキストラナーゼ吸着架橋デキストランはグルタル
アルデヒドなどで固定化することができる。別の態様
は、溶媒添加により不溶化したデキストランにデキスト
ラナーゼを吸着させ、デキストラナーゼ吸着不溶化デキ
ストランを得る方法である。
【0002】
【従来の技術】従来、デキストラナーゼの分離、精製法
としては、アルコール沈澱、硫安沈澱などの通常の方法
の他に、ハイドロキシアパタイト吸着、限外濾過濃縮−
Bio−Gel A−0.5m、CM−セルロース、CM−セ
ファロースのカラムクロマトグラフィーによる分離精
製、イソプロパノール沈澱などの方法が用いられてき
た。架橋デキストランについては、一般に知られていな
いが、本発明者が従来の澱粉の架橋方法をデキストラン
の架橋に適用すること試みた結果では、架橋度を適度に
選択すれば、大部分の方法により、不溶性の架橋デキス
トランを調製できることが判明した。最近、デキストラ
ンの分解による各種イソマルトオリゴ糖の生産用とし
て、また蔗糖の摂取により生成し虫歯の原因となるデキ
ストランを分解して虫歯の発生を予防するための酵素剤
として、デキストラン分解酵素であるデキストラナーゼ
の必要性は著しく高まってきている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】しかし、一般に酵素市
販品は吸湿性粉末または冷凍乾燥品であり、不安定で分
解し易く取扱いが不便であるという欠点があった。そこ
で、このような欠点がなく、酵素活性を充分保持した製
品の開発が望まれていた。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、デキスト
ランに架橋処理し不溶性とした架橋デキストランまたは
エタノールなどの有機溶媒を加えて不溶性とした不溶化
デキストランに、デキストラナーゼ酵素を吸着させるこ
とを検討したところ、低温で攪拌するのみで該酵素が効
率的に吸着され、酵素活性を有する安定な製品が得られ
ることを見い出し、本発明を完成した。
【0005】すなわち、本発明は、(1) デキストラ
ナーゼを吸着した架橋または不溶化デキストラン、
(2) 架橋デキストランにデキストラナーゼを接触さ
せることを特徴とするデキストラナーゼ吸着架橋デキス
トランの製造法、および(3) 溶媒処理により不溶化
したデキストランに低温でデキストラナーゼを接触させ
吸着させることを特徴とするデキストラナーゼ吸着デキ
ストランの製造法を提供するものである。
【0006】デキストラナーゼは、別名α−1,6−グ
ルカン−6−グルカノヒドロラーゼと称し、デキストラ
ンのα−1,6−グルコシド結合を加水分解する酵素で
ある。デキストラナーゼには、ペニシリウム(Penicill
ium)、アスペルギルス(Aspergillus)、ベルチシリ
ウム(Verticillium)、スピカリア(Spicaria)、カ
エトミウム(Chaetomium)等の糸状菌が生産するも
の、セルビブリオ・フルバ(Cellvibrio fulva)、バ
クテロイデス(Bacteroides)、ラクトバチルス・ビフ
ィズス(Lactobacillus bifidus)等の細菌が生産する
もの、および動物の内臓(脾臓、腎臓、肝臓等)に含ま
れるもの等があるが、何れも本発明で用いることができ
る。
【0007】架橋デキストランは、デキストランに架橋
剤を反応させることにより製造することができる。デキ
ストランとしては、天然のもの(例えば分子量200〜
400万)およびその部分加水分解物(例えば分子量4
万、7万、16万等のもの)がある。架橋剤としては、
デキストランの水酸基と反応してエーテル結合またはエ
ステル結合を形成し得る官能基を2個以上、好ましくは
2個、3個または4個有する低分子無機または有機化合
物が用いられる。このような官能基としては、ハロゲン
(例えば塩素)、ヒドロキシ、エポキシ、オキソ、カル
ボキシ、不飽和結合等が含まれる。また、架橋剤の具体
例としては、エピクロルヒドリン、リン酸、アクロレイ
ン、塩化シアヌル、アジピン酸、クエン酸(無水酢酸等
の脱水縮合剤の存在下)等が含まれる。不溶化デキスト
ランは、デキストランを溶かさない溶媒、例えばメタノ
ール、エタノール、プロパノール等の低級アルコール、
アセトン等のデキストランを不溶化、沈澱させ得る任意
の有機溶媒でデキストランを処理することにより得られ
る。食品用の製品を目的とする場合は、エタノールを用
いるのが好ましい。
【0008】このように製造された架橋デキストランま
たは不溶化デキストランは、低温でデキストラナーゼを
緩かに吸着する。一例では1日で、24%、2日で54
%、3日で94%の吸着率であった。したがって、高吸
着率を達成するには長時間緩く攪拌すればよいが、短時
間で達成するには、酵素濃度を高めて1日吸着処理した
後、残存酵素を新鮮架橋デキストランに吸着させるなど
の方法が好ましい。吸着酵素は比較的安定であり、凍結
乾燥品は4℃の保存では1カ月以上失活しないが、30
℃では1週間で活性残存率は50〜30%程度に低下す
る。食品、その他のシェルフライフを延長させるために
は、より安定性の高いデキストラナーゼが望まれるが、
固定化することにより安定性は高まり、1週間、30℃
の保存で残存率は70〜60%になるので、本製品は例
えばデキストランからのオリゴ糖製造にも有利に使用で
きる。
【0009】また、デキストラン溶液にエタノールを加
えて、デキストランを不溶性にし、0℃以下とした後、
デキストラナーゼを加えて攪拌した場合にも効果的に該
酵素を吸着することができ、攪拌時間が12時間以下で
あれば、デキストランの分解を15%以下に抑えること
ができる。デキストラナーゼ吸着デキストランは濾過ま
たは遠心分離により分離することができた。なお、低温
でデキストランにデキストラナーゼを吸着させる場合、
多量の酵素を吸着させると溶解して、該酵素の単離、濃
縮ができなくなることがある。このような場合には、少
量を吸着させて、固定化しないで、デキストラン分解物
の生産、食品用途に使用できる。
【0010】さらに、上記のようにして得られた製品に
固定化剤を作用させてデキストランを固定化することが
できる。固定化剤としては一般に固定化酵素の製造に使
用されているものはすべて使用することができるが、グ
ルタルアルデヒドが広く用いられる。しかし、固定化に
よりデキストラナーゼが失活しなければどのような方法
でもよく、必要に応じて固定化基材と混合して固定化す
ることもできる。
【0011】
【発明の効果】本発明の方法によって得られるデキスト
ラナーゼ吸着架橋または不溶化デキストランは安定な不
溶性固体で取扱いが容易であるから、特に食品への利用
に有利であり、例えば、蔗糖を含む食品に添加すれば、
虫歯の原因となるデキストランを分解することができる
ので、蔗糖から生成されるデキストランが歯に付着せず
したがって、虫歯の発生を防止できる。このように、本
発明は甘味として最も優れた蔗糖を採取しても虫歯にな
らないというデキストラナーゼ製剤を提供するもので、
その利点は著しく大きくデキストラナーゼ製剤が食品と
して適当な素材であれば蔗糖を含む菓子、キャンディ
ー、ガム類に混合して虫歯防止用とすることもできる。
【0012】リン酸などの毒性の弱い架橋デキストラン
による製剤は虫歯予防用の歯磨きペーストに加えて利用
することができ、毒性試験で安全性が確認できれば食品
への混合使用も可能である。また、本発明の方法はデキ
ストラナーゼの精製法としても優れたものであり、該酵
素は一段階で純化され、精製された酵素蛋白が得られ
る。さらに、本発明のデキストラン・酵素複合体を反応
させることにより、デキストランを分解除去できるの
で、デキストラン除去剤としても使用できる。また、洗
剤に混合して、カビ類が生産する多糖を分解して色素の
沈着を防止することもでき用途は化粧品にも拡げること
ができる。
【0013】
【実施例】次に、本発明を実施例により説明する。 製造例1 エピクロルヒドリン架橋デキストランの調製 デキストラン溶液は市販デキストラン5gを30mlの水
に加え、80℃で溶解して調製した。一方、アルカリ溶
液は水酸化ナトリウム0.5gおよび硫酸ナトリウム25
gを20mlの水に溶解して調製し、本アルカリ溶液中に
デキストラン溶液を緩く攪拌しながら添加し、さらに、
エピクロルヒドリンを2〜25%濃度に滴下し、2〜3
分間緩く混合し、40℃で24時間、緩く攪拌反応し
た。本反応により不溶化したデキストランを水で2〜3
回洗浄し、4℃で保存した。このようにして調製した架
橋デキストランの形状はエピクロルヒドリン添加量によ
って表のように変化し、分子量160,000の市販デ
キストランを用いた場合、10〜15%で良好に不溶化
した。また、分子量2,000,000のデキストランを
用いた場合、5〜25%で良好に不溶化して、本架橋デ
キストランは30分以上、沸騰水中でも溶解しなかっ
た。分子量160,000のデキストランでは20〜2
5%エピクロルヒドリンの架橋でよりソフトなゲル状に
なり、分子量2,000,000のデキストランでは30
%以上でソフトなゲルとなった。
【0014】
【表1】
【0015】分子量160,000のものを用いた場
合、10〜15%架橋デキストラン(Dep10−15)の
調製において、デキストラン5gから湿潤標品が40〜
50g(水分80%)得られた。
【0016】製造例2 同様にして、従来法により、リン酸架橋デキストランを
調製した。即ち、トリメタリン酸をデキストランの1〜
10%に加え、pHを11に調整した後、45℃で1〜
6時間緩く攪拌した。反応終了後、不溶化したデキスト
ランを集め、水で洗浄した後、デキストラナーゼ吸着に
用いた。なお、不溶性となったデキストランは低温でデ
キストラナーゼの作用を受け難く、トリメタリン酸の添
加量に関わらずいずれでも本発明の方法に適用できる
が、リン酸架橋不溶性デキストランの収量はトリメタリ
ン酸添加量5%以上で顕著に上がった。また、分子量
2,000,000のデキストランを用いた方が高収量で
あった。
【0017】実施例1 製造例1で調整した架橋デキストランのうち、分子量1
60,000の市販デキストランにエピクロルヒドリン
10〜15%を添加して得られた架橋デキストラン(De
p 10−15)10gを基質とし、市販デキストラナー
ゼ[カエトミウム・アラシル(Chaetomium aracile)3
0,000単位/ml粗酵素溶液]6,000単位を含む酵
素溶液200μlと40mM酢酸緩衝液(pH5.2)9.8m
lを混合し、4℃で3日間静置したところ、供試酵素溶
液のデキストラナーゼ全活性の98%がDep 10−1
5に吸着された酵素複合体(デキストラナーゼ吸着架橋
デキストラン)を得た。上記のデキストラナーゼ活性単
位は、天野製薬(株)の表示単位で下記の測定法によって
いる。
【0018】デキストラナーゼ活性の測定法: 基質;ファルマシア製デキストランT−10の乾燥物
0.5gを蒸留水に溶解し50mlとする。 活性測定法:基質10mlと酪酸緩衝液(pH5.8)4mlを
37±0.1℃で5分間放置後、デキストラナーゼ試料
溶液1mlを加え37±0.1℃で30分間反応させ、生
成した。イソマルトースを主体とした生成還元糖をHan
es法により、澱粉液を指示薬として0.01N チオ硫
酸ナトリウム溶液で滴定することで活性測定を行う。 力価の算出;1分間に1μmolのチオ硫酸ナトリウムに
相当する還元糖を1単位として算出する。 本酵素複合体を同上の緩衝液で洗浄し、凍結乾燥させて
白色のデキストラナーゼ吸着酵素製剤(A)2.0gを得
た。また上記の酵素複合体を常法によりグルテアルデヒ
ドで固定化し、同上の緩衝液で洗浄し、凍結乾燥させて
白色のデキストラナーゼ吸着固定化酵素製剤(B)2.2g
を得た。上記(A)、(B)を30℃で一週間放置したとこ
ろ、デキストラナーゼ活性の残存率が(A)では約45%
であるのに対し、(B)は約70%であり、(B)の方が
(A)よりも安定性の高いデキストラナーゼ製剤となって
いることがわかった。
【0019】実施例2 実施例1の市販デキストランにpH10に調整したトリ
メタリン酸液を用いてリン酸架橋したもの10gを基質
として、実施例1と同様条件で白色デキストラナーゼ製
剤(デキストラナーゼ吸着架橋デキストラン)9.8gを得
た。この酵素製剤には、供試酵素溶液のデキストラナー
ゼ全活性の85%が吸着されていた。
【0020】実施例3 分子量2,000,000の10%デキストラン溶液50
mlにエタノールを50ml加えてデキストランを不溶性に
し、−5℃以下とした後、デキストラナーゼを50,0
00単位加えて15時間緩く攪拌し、デキストラナーゼ
吸着不溶化デキストランを得た。本条件での吸着率は6
5%であり、加えたデキストランの90%は可溶化せ
ず、回収することができた。本酵素複合体を低温遠心分
離機で可溶化したデキストラン溶液と分離した後、50
%の冷エタノールで洗浄し、凍結乾燥して白色のデキス
トラナーゼ製剤4.5gを得た。
【0021】 試験例1 ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mu
tans)菌株を1lのBHI培地で37℃、12時間培養
し、6,500rpmで10分間遠心分離した菌体を蒸留水
で3回水洗し、10mlの生理食塩水に懸濁した。上記菌
液にはミュータンス菌を2×1010CFU/ml含んで
いる。上記菌液0.1mlを蔗糖1%を含む0.1M KP
B溶液30mlに加え、30度の角度で表面が平滑なガラ
ス板を入れ、37℃で24時間反応させ、取り出したガ
ラス板を蒸留水で洗浄したが、ガラス板の接液部のほぼ
全面にグルカンが付着していることがフクシン染色で確
認された。グルカンの付着したガラス板を蒸留水の代り
に、実施例3の製剤0.1%の懸濁液で洗浄したとこ
ろ、グルカンの除去効果が認められた。又、蔗糖1%を
含む0.1M KPB溶液30mlに、実施例3の製剤0.
1%を加えたものでは、ガラス板へのグルカン付着抑制
効果が明確に認められた。 試験例2 実施例1で調整した製剤(B)を、市販の酵素入り洗剤に
対し0.01%添加したものの洗浄効果を比較テストし
た。試験方法は、汚れた下着(a)、成人病(糖尿)患者着
用のスボン(b)、精糖工場の目詰まり濾布(c)、精糖工場
の黒色汚れ床面(d)、風呂場の黒色に汚れたタイル(e)を
試料とし、(d)、(e)を除いた各試料は10cm×10cmに
切断したテストピースを、製剤(B)を0.01%添加し
たpH5.8、37℃、1lの温水に約2時間浸潰後、市
販の酵素入り洗剤を使用して電気洗濯機で同一条件の洗
浄を行った。(d)、(e)については、同上の製剤液をふり
かけ、5分間隔で4回ふりかけた後、布でふきとること
で行った。洗浄効果の判定は、各試料の水溶液色見本を
作成し、その色見本の2分の1、5分の1、10分の1
稀釈色見本との比較を行い、製剤(B)の0.01%添加
を行わずに同様テストを行った対照テスト品を100と
した脱色率で示した。その結果(a)150%、(b)200
%、(c)260%、(d)330%、(e)260%で、いず
れも製剤(B)を添加したものの効果が明確に認められ
た。
フロントページの続き (72)発明者 小堺 博 茨城県つくば市吾妻1丁目4番3号 (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C12N 11/00 - 11/18

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 デキストラナーゼを吸着した架橋または
    不溶化デキストラン。
  2. 【請求項2】 架橋デキストランにデキストラナーゼを
    接触させることを特徴とするデキストラナーゼ吸着架橋
    デキストランの製造法。
  3. 【請求項3】 溶媒処理により不溶化したデキストラン
    に低温でデキストラナーゼを接触させ吸着させることを
    特徴とするデキストラナーゼ吸着デキストランの製造
    法。
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