JPH0694473B2

JPH0694473B2 - β−グルコシルルブソサイド及その製造方法及これを利用した甘味料

Info

Publication number: JPH0694473B2
Application number: JP63150209A
Authority: JP
Inventors: 寿美雄北畑; 治田中; 滋綿野; 弘石川
Original assignee: 北海道糖業株式会社; 大阪市
Priority date: 1988-06-20
Filing date: 1988-06-20
Publication date: 1994-11-24
Anticipated expiration: 2009-11-24
Also published as: JPH01319494A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）この発明は、新規なルブソサイド配糖体及その製造方法
及これを利用した甘味料に関するものである。

（従来の技術）近年、人工甘味料であるサッカリン、ズルチン、チクロ
等が安全性の点から、一般食品への使用が禁止、または
規制される傾向にある。一方では、近年砂糖のとりすぎ
による健康上の影響が問題にされはじめたことから、よ
り安全な天然甘味料の開発が熱望されている。

これに対して、南米パラグアイ原産のキク科植物である
ステビアからはカウレン系ジテルペン配糖体ステビオサ
イドが得られるが、このステビオサイドは砂糖と異な
り、低カロリーの甘味料であり、しかも甘味度は砂糖の
約145倍と高く、砂糖に替わる甘味料として注目されて
いる。

（発明が解決しようとする問題点）しかし、ステビオサイドの甘味の質には、若干の苦味、
嫌味があり、更に残味が長く尾を引くという欠点がある
ため、αまたはβ−グルコシル転移酵素でグルコシル化
することにより、これらの欠点を改善した製品が生産さ
れているが、いまだ充分な成果を収めるに至っていな
い。

一方、中国南部広西、広東地方に野生するバラ科キイチ
ゴ属の灌木、甘葉懸鈎子の葉からはルブソサイドが得ら
れるが、このルブソサイドは下記構造式（Ｉ）で示すよ
うに、その骨格がステビオサイドと同じジテルペン系甘
味配糖体である。

（式中β−gluc:β−グルコシル基）このルブソサイドには甘味度においてステビオサイドに
劣り、しかも味質においてステビオサイド同様、苦味、
嫌味があるなどの欠点があるが、その反面ステビア中に
存在する甘味物質は、ステビアサイド以外にも６種類の
構造の異なる甘味物質が存在するのに対し、甘葉懸鈎子
の葉中にはルブソサイド１種類しか存在せず、ルブソサ
イドを単離しやすいという特長がある。

本願発明者らは、この点に注目してルブソサイドを出発
原料として味質、甘味度ともに優れた甘味物質を開発す
る目的で、鋭意研究の結果、新規な物質を見出すととも
にこれらの新規物質には味質、甘味度とも優れた性質の
あることを見出したものである。

（問題点を解決するための手段）この発明に係る物質は、ルブソサイドを出発原料として
得られるルブソサイドの13位のOHにエーテル結合するβ
−グルコースの３、４、６位乃至19位のカルボキシル基
にエステル結合するβ−グルコースの３、６位の何れか
一つの位置にβ−グルコースが１位の位置で結合した構
造のβ−グルコシルルブソサイドである。

具体的には、この発明に係る物質は下記の構造式（II）
で表わされる。

（式中R₁,R_2:β−gluc,β−gluc⁶−^１β−gluc,β−glu
c²−^１β−gluc,β−gluc³−^１β−gluc,β−gluc⁴−^１
β−gluc,から選ばれた基、β−gluc:β−グルコシル基
を表わす）この発明に係るβ−グルコシルルブソサイドはルブソサ
イドとβ−グルコシル糖化合物とを含有する水溶液また
は懸濁液にβ−グルコシル転移酵素を作用させることに
よって得られる。

この発明に用いるルブソサイドは、精製されたルブソサ
イドに限定されることなく、例えば甘葉懸鈎子の抽出液
または中間精製物でも良い。

この発明に用いるβ−グルコシル糖化合物（以下、糖供
与体と記す）とはセルロース、ラミナラン、カードラ
ン、β−1,2グルカン他β結合したグルカン等が使用さ
れるが、それらの分解物であるダイマー、オリゴ糖また
はβ−グルコシル基を有する配糖体或はヘテロオリゴ糖
などでも良い。

この発明に用いるβ−グルコシル転移酵素は、β−グル
コシル糖化合物とルブソサイドを含有する水溶液に作用
させるとき、糖供与体を分解し、そのβ−グルコシル基
をルブソサイドに転移し、β−グルコシルルブソサイド
を生成するものであれば、何れでも使用可能である。

β−グルコシル転移酵素は自然界にかなり広範に存在し
ている。例えば高等植物の種子、葉、根、動物の腎臓、
肝臓、小腸、粘膜、カタツムリの消化液等に含まれてい
る。また、微生物の場合には、アクレモニウム（Acremo
nium）SP 15,アスペルギルスフミガトス（Aspergill
us fumigatus），アスペルギルスニガー（Aspergill
s niger），リゾプスソラニ（Rhizopus solani,ト
リコデルマ（Trichoderma）SP,トリコデルマロンギブ
ラチアトム（Tricoderma longibrachiatum），スクレ
ラチニアリベルチアナ（Scleratinia libertian
a），シトファガアルベンシコラ（Cytophaga arvens
icola），ストレプトマイセス（Streptomyces）SP,ロド
トルラミッタ（Rhodotorula mituta），サッカロマ
イセスラクティス（Saccharomyces lactis）等カ
ビ、殺菌、酵母等各種微生物から生産するβ−グルコシ
ル転移酵素を使用することができる。これらβ−グルコ
シル転移酵素は、前記の条件を満足するものであれば良
い。

これらβ−グルコシル転移酵素は４つに大別される。即
ちβ−1,2,β−１、3,β−1,4,β−1,6結合で転移する
酵素である。例えばアクレモニウムSP 15の生産するβ
−グルコシダーゼで反応した場合、ルブソサイドの13
位、19位にβ−1,2で転移し、リゾプスソラニの生産
するβ−グルコシダーゼで反応した場合、ルブソサイド
の13位、19位にβ−1,3で転移し、トリコデルマSPの生
産するβ−グルコシダーゼで反応した場合、ルブソサイ
ドにβ−1,4で転移し、アスペルギルスニガーの生産
するβ−グルコシルダーゼで反応した場合、ルブソサイ
ドにβ−1,6で転移することが確認できた。

この発明に使用するβ−グルコシル転移酵素の調製方法
としては、該微生物の固体培養物及液体培養物のいずれ
も使用することができるが、最近では一般に液体培養法
が主流となっている。

動植物起源のβ−グルコシダーゼを使用する場合は、公
知の方法により抽出、精製すればよく、目的に応じて粗
製、精製品の何れかを選択すればよい。

微生物起源のβ−グルコシダーゼを使用する場合、その
培養液は通常不溶物を除去した上澄液を酵素として使用
するか、菌体内酵素である場合は分離した菌体をそのま
ま使用するか、抽出して利用すれば良い。また必要に応
じて上記抽出液をさらに精製した酵素を用いてもよい。

更に、市販されている酵素剤、例えばセルロシン（上田
化学社製）、メイセラーゼ（明治製菓社製）、キタラー
ゼ（Ｋ・Ｉ化成社製）、スミチームＣ（新日本化学工業
社製）等β−グルコシル転移酵素活性を有する酵素剤を
β−グルコシル転移酵素として用いることができる。

反応に用いるルブソサイドは水に溶解させ、反応液中に
濃度を約１〜40％（W/W）とし、糖供与体は約0.5〜50％
（W/W）とすれば良い。また、反応系でのルブソサイド
に対する糖供与体の比率は使用する糖供与体によっても
異なり、0.1〜50倍の範囲でも用いられるが、好ましく
は１〜５倍の範囲である。

反応液のpHと温度は、通常pH4〜８、温度20〜70℃が適
当である。

使用酵素活性量は反応時間と密接な関係があり、通常は
５〜120時間、好ましくは５〜48時間で反応が終了する
酵素活性量にすれば良いが、これらに限定されるもので
はない。

（発明の効果）以上のような方法により、反応させて得られた液を例え
ば高速液体クロマトグラフにかけて分画、分取した後、
分取されたものを¹³C−NMRにより構造解析を行なった結
果、上記構造式（II）に示すようなβ−グルコシルルブ
ソサイドが得られることを確認した。

上記のようにして得られた反応生成物の甘味度は原体の
ルブソサイドと比較して1.2〜2.0倍となり、更に味質も
苦味、嫌味を有するルブソサイドと比べて改善されるこ
とを確認した。

したがって、このようにしてβ−グルコシルルブサイド
を生成せしめた反応溶液は、そのまま甘味料として使用
できるが、必要に応じて酵素を失活させ、濾過後、その
溶液をイオン交換樹脂、例えばＨ型強酸性イオン交換樹
脂及OH型弱塩基性イオン交換樹脂を用いて脱塩し、濃縮
してシラップ状の甘味料とするか、または乾燥、粉末化
して、粉末状の甘味料とすることもできる。

更に、脱塩した反応溶液をカラムクロマト法にて生成
し、ルブソサイドの13位のOHにエーテル結合又は19位の
COOHにエステル結合するβ−グルコースの一方又は両方
のβ−グルコースの２、３、４、６位の何れか一つの位
置にβ−グルコースが１位の位置で各々結合した構造の
β−グルコシルルブソサイドを分離採取して、これを甘
味料とすることもできる。この際、濃縮、乾燥、粉末化
は公知の方法によれば良い。

この発明により得られたβ−グルコシルルブソサイドは
甘味度が高いところから、低カロリーの飲食物、低カロ
リーの嗜好物等、いわゆる美容食、健康食、ダイエット
食の甘味付けに好適である。また、うがい薬、練り歯磨
等、虫歯予防用の経口用医薬部外品への添加にも好適で
あり、その他、医薬品も含めて従来甘味の必要とする分
野に自由に使用することができる。

（実施例）以下、実施例を挙げてこの発明を具体的に説明する。

実施例１（１）転移反応乾燥甘葉懸鈎子の葉を粗砕し、温水を加えて抽出してか
ら、濾過助剤を添加し、充分攪拌後、その液を濾過して
清浄液とした。

更に、吸着樹脂（商品名：ダイヤイオンHP−20,三菱化
成社製）にて吸着させた後、再結晶して、純度97％のル
ブソサイド（試料No.1）を調整した。

上記の方法で調製したルブソサイド3g、セロビオース45
0mgを50mM酢酸緩衝液（pH5.0）150mlにて溶解した後、
セルロシンHC（上田化学社製）を15mg添加し、40℃にて
６時間反応させた。反応後に酵素を加熱失活させた溶液
を吸着樹脂に吸着後、60％メタノールで溶出し、未反応
ルブソサイドと転移反応生成物（試料No.2）を分取し
た。さらに、この転移反応生成物をシリカゲルカラムク
トマト及び高速液体クロマトグラフにより分画、分取し
た。

（２）構造解析上記分画、単離された転移物質３点（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）
の¹³C−NMR解析により、（Ａ）（Ｂ）は下記第１、２表
に示すように受容体ルブソサイドの13位又は19位に結合
するグルコースの６位にグルコースが１分子転移した化
合物であり、（Ｃ）は下記第３表に示すようにグルコー
スが２分子転移した化合物であることが確認された。

また上記（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）についてヨウ化リチウム、
2,6−ルチジン、メタノール試薬を用いて、19位のエス
テル結合を選択的に分解し、その分解した糖部を単離精
製し、薄層クロマトにより、糖の数を調べた結果、
（Ｂ）が１個、（Ａ）（Ｃ）が２個であることを確認
し、更に高速液体クロマトグラフにより、（Ｂ）はグル
コース、（Ａ）（Ｃ）はゲンチオビオースであることを
標準物質と一致することにより確認した。即ち（Ａ）は
19位にグルコースが１分子、（Ｂ）は13位にグルコース
が１分子、（Ｃ）は13位、19位の両方にグルコースが各
々１分子転移していることになる。

以上、２点から（Ａ）は下記構造式（III）に示すよう
にルブソサイドの19位のCOOHにエステル結合するβ−グ
ルコースの６位にβ−グルコースが１位の位置で結合し
たβ−グルコシルルブソサイド、（Ｂ）は下記構造式
（IV）に示すようにルブソサイドの13位のOHにエーテル
結合するβ−グルコースの６位にβ−グルコースが１位
の位置で結合した構造のβ−グルコシルルブソサイド、
（Ｃ）は下記構造式（Ｖ）に示すようにルブソサイドの
13位のOHにエーテル結合するβ−グルコースの６位及び
19位のCOOHにエステル結合するβ−グルコースの６位の
両方にβ−グルコースが、１位の位置で各々結合した構
造のβ−グルコシルルブソサイドと構造決定した。

（３）転移反応生成物の甘味度試験試料として原体のルブソサイド（No.1）及び転移反応生
成物（No.2）の各々0.015％及び0.03％水溶液を調製
し、他に、標準溶液として砂糖の１〜６％の水溶液を0.
5％濃度段階で作製し、甘味度の比較を行なった。15名
のパネル員により室温20℃で行なった結果を第４、５表
に示す。

第４、５表の結果から、試料No.1の甘味度は0.015％水
溶液で砂糖の濃度1.5％（甘味度100倍）に相当し、0.03
％水溶液で、砂糖濃度3.5％（甘味度117倍）に相当す
る。同様に試料No.2の甘味度は、砂糖濃度の各々2.0％
及び５％に相当し、転移反応生成物の甘味度は、明らか
に1.4倍近くまで改良されたと判断される。

（４）転移反応生成物の味質試験試料No.1,2とを用いて甘味の質について比較テストを行
なった。

試料は、それぞれ３％,5％,8％の砂糖水溶液に相当する
甘味度を調製した。５％を１例に挙げれば、試料No.1は
0.045％、試料No.2は、0.032％水溶液として比較テスト
を行なった。その結果を第６表に示す。

第６表に示す結果によれば転移反応生成物は、全ての濃
度においても甘味の質は明らかに対照のルブソサイドよ
り優れていた。

参考例１（１）酵素の調製ペプトン１％、リン酸第１カリウム0.05％、リン酸第２
カリウム0.05％、硫酸マグネシウム0.05％、粉飴１％の
組成から成るpH5.0の培地を調製し、500mlの坂口フラス
コ10本に60ml宛、分注滅菌し、「アクレニウムSP15を１
白金耳づつ接種し、30℃にて48時間浸盪培養を行った。
次に滅菌した環状β−1,2グルカンを１％の濃度となる
ように添加し、更に24時間培養を行った。この培養物を
遠心分離し（5,000r.p.m.10分間）菌体を除去した。こ
の分離液に硫酸アンモニウムをその飽和濃度の約80％と
なるように加え、析出した固形分を濾別した。これを20
mM酢酸緩衝液（pH5.6）50mlに溶解しセルロースフィル
ムを用い、同緩衝液に対して透析処理を行った後にUF膜
にて濃縮し、酵素液とした。

（２）転移反応実施例１で調製した精製ルブソサイド10g、環状β−1,2
グルカン2gを50mM酢酸緩衝液（pH5.6）25mlにて溶解、
一部懸濁液とした後、上記酵素液1mlを添加し、50℃に
て20時間反応させた。反応後に、酵素を加熱失活させた
溶液を実施例１と同じく処理して転移反応生成物（Ａ）
（Ｂ）（Ｃ）を分画、分取した。

（３）構造解析実施例１と同様に、反応生成物（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）をヨ
ウ化リチウム、2,6−ルチジン、メタノール試薬を用い
て19位のエステル結合を選択的に分解し、生成した糖部
を薄層クロマトグラフ及び高速液体クロマトグラフによ
り分析したところ、反応生成物（Ａ）からはグルコース
が、また（Ｂ）（Ｃ）からはソフォロースが生成したこ
とが確認された。更に、19位のエステル結合を選択的に
分解して生成したゲニンを含む方の断片を薄層クロマト
グラフで分析したところ、（Ａ）及び（Ｃ）からはステ
ビオールビオシドが、また（Ｂ）からはステビオールモ
ノシドが生成したことが確認された。

（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の¹³C−NMR解析の結果、（Ａ）
と（Ｃ）の13位にエーテル結合するグルコースの２位の
炭素のケミカルシフトが低磁場に、また（Ｂ）と（Ｃ）
の19位にエステル結合するグルコースの２位の炭素のケ
ミカルシフトが低磁場に、各々シフトしていることが確
認された。

以上から判断して、（Ａ）はルブソサイドの13位のOHに
エーテル結合するβ−グルコースの２位にβ−グルコー
スが１位の位置で結合したβ−グルコシルルルブソサイ
ドであることを確認した。

（Ｂ）はルブソサイドの19位のCOOHにエステル結合する
β−グルコースの２位にβ−グルコースが１位の位置で
結合した構造のβ−グルコシルルブソサイドであること
を確認した。

また、（Ｃ）は、ルブソサイドの13位のOHにエーテル結
合するβ−グルコースの２位及び19位のCOOHにエステル
結合するβ−グルコースの２位の両方にβ−グルコース
が１位の位置で各々結合した構造のβ−グルコシルルブ
ソサイドであることを確認した。

この分画前の転移反応生成物混合物について、甘味度、
甘味質を調べたところ、実施例１とは若干の甘味の差が
あるものの、ほぼ同程度であり、味質も苦味もなく、ま
ろやかな味質に改善された。

実施例２ 1gのカードランを0.1N−NaOHに溶解し、120mlとした溶
液に実施例１で調製した調製ルブソサイド3gを加えて溶
解し、更に100mM酢酸緩衝液（pH5.0）30mlを加えて150m
lとしてからキタラーゼＣ（Ｋ・Ｉ化成社製）20mgを添
加し、40℃にて40時間反応させた。反応後に酵素を加
熱、失活させた溶液を実施例１と同じ処理して転移反応
生成物（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）を分画、分取した。

（１）構造解析実施例１と同様に、反応生成物（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）をヨ
ウ化リチウム、2,6−ルチジン、メタノール試薬を用い
て19位のエステル結合を選択的に分解し、生成した糖部
を薄層クロマトグラフ及び高速液体クロマトグラフによ
り分析したところ、反応生成物（Ａ）からはグルコース
が、また（Ｂ）と（Ｃ）からはラミナリビオースが生成
したことを、標準物質と一致することにより確認した。

更に、19位にエステル結合を選択的に分解して生成した
ゲニンを含む方の断片を薄層クロマトグラフで分析した
ところ、（Ａ）及び（Ｃ）からの生成物はステビオール
ビオシドとほぼ同じ位置にスポットを生じたことによ
り、13位にエーテル結合するグルコースに１分子のグル
コースが結合していることが示唆された。また（Ｂ）か
らの生成物はステビオールモノシドであることが確認さ
れた。

（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の¹³C−NMR解析の結果、（Ａ）と
（Ｃ）の13位に結合するグルコースの３位の炭素のケミ
カルシフトが低磁場に、また（Ｂ）と（Ｃ）の19位にエ
ステル結合するグルコースの３位の炭素のケミカルシフ
トが低磁場に、各々シフトしていることが確認された。

以上から判断して、（Ａ）はルブソサイドの13位のOHに
エステル結合するβ−グルコースの３位にβ−グルコー
スが１位の位置で結合したβ−グルコシルルブソサイド
であることを確認した。

（Ｂ）はルブソサイドの19位のCOOHにエステル結合する
β−グルコースの３位にβ−グルコースが１位の位置で
結合した構造のβ−グルコシルルブソサイドであること
を確認した。

（Ｃ）は、ルブソサイドの13位のOHにエーテル結合する
β−グルコースの３位及び19位のCOOHにエステル結合す
るβ−グルコースの３位の両方にβ−グルコースが１位
の位置で各々結合した構造のβ−グルコシルルブソサイ
ドであることを確認した。

この分画前の転移反応生成物混合物について甘味度、甘
味質を調べたところ、実施例１とは若干の甘味度の差が
あるものの、ほぼ同程度であり、味質も苦味もなく、ま
ろやかな味質に改善された。

実施例３実施例１で調製した精製ルブソサイド10g、セロビオー
ス10gを50mM酢酸緩衝液（pH5.0）30mlに懸濁させたから
メイセラーゼ（明治製菓社製）1.5gを添加し、40℃にて
40時間反応させた。反応後に酵素を加熱、失活させた溶
液を実施例１と同じ処理して転移反応生成物を分取した
転移反応生成混合物について甘味度、味質を調べたとこ
ろ、実施例１とほぼ同じ傾向であった。

実施例４実施例１で調製した精製ルブソサイド10g、セロビオー
ス5gを50mM酢酸緩衝液（pH5.0）30mlに懸濁させてか
ら、スミチウム（新日本化学工業社製）200mgを添加
し、50℃にて20時間反応させた。反応後に酵素を加熱、
失活させた溶液を実施例１と同様に処理して転移反応生
成物（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）を分画、分取した。

（１）構造解析実施例１と同様に、反応生成物（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）をヨ
ウ化リチウム、2,6−ルチジン、メタノール試薬を用い
て19位のエステル結合を選択的に分解し、生成した糖部
を薄層クロマトグラフ及び高速液体クロマトグラフによ
り分析したところ、反応生成物（Ａ）からはグルコース
が、また（Ｂ）と（Ｃ）からはセロビオースが生成した
ことを、標準物質と一致することにより確認した。

更に、19位のエステル結合を選択的に分解して生成した
ゲニンを含む方の断片を薄層クロマトグラフで分析した
ところ、（Ａ）及び（Ｃ）からの生成物はステビオール
ビオシドとほぼ同じ位置にスポットを生じたことによ
り、13位にエーテル結合するグルコースに１分子のグル
コースが結合していることが示唆された。また（Ｂ）か
らの生成物はステビオールモノシドであることが確認さ
れた。

（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の¹³C−NMR解析の結果、（Ａ）と
（Ｃ）の13位に結合するグルコースの３位の炭素のケミ
カルシフトが低磁場に、また（Ｂ）と（Ｃ）の19位にエ
ステル結合するグルコースの４位の炭素のケミカルシフ
トが低磁場に、各々シフトしていることが確認された。

以上から判断して、（Ａ）はルブソサイドの13位のOHに
エステル結合するβ−グルコースの４位にβ−グルコー
スが１位の位置で結合したβ−グルコシルルブソサイド
であることを確認した。

（Ｂ）はルブソサイドの19位のCOOHにエステル結合する
β−グルコースの４位にβ−グルコースが１位の位置で
結合した構造のβ−グルコシルルブソサイドであること
を確認した。

（Ｃ）は、ルブソサイドの13位のOHにエーテル結合する
β−グルコースの４位及び19位のCOOHにエステル結合す
るβ−グルコースの４位の両方にβ−グルコースが１位
の位置で各々結合した構造のβ−グルコシルルブソサイ
ドであることを確認した。

この分画前の転移反応生成物混合物について甘味度、甘
味質を調べたところ、実施例１とは若干の甘味度の差が
あるものの、ほぼ同程度であり、味質も苦味もなく、ま
ろやかな甘味に改善された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者石川弘大阪府茨木市水尾３―９―710 ニチモグリーンタウン茨木

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ルブソサイドの13位のOHにエーテル結合す
るβ−グルコースの３、４、６位乃至19位のカルボキシ
ル基にエステル結合するβ−グルコースの３、６位の一
方又は両方にβ−グルコースが１位の位置で結合した構
造のβ−グルコシルルブソサイド。
【請求項２】ルブソサイドとβ−グルコシル糖化合物と
を含有する水溶液又は懸濁液にβ−グルコシル転移酵素
を作用させることを特徴とするルブソサイドの13位のOH
にエーテル結合するβ−グルコースの３、４、６位乃至
19位のカルボキシル基にエステル結合するβ−グルコー
スの３、６位の一方又は両方にβ−グルコースが１位の
位置で結合した構造のβ−グルコシルルブソサイドの製
造方法。
【請求項３】ルブソサイドとβ−グルコシル糖化合物と
を含有する水溶液又は懸濁液にβ−グルコシル転移酵素
を作用させて得られたルブソサイドの13位のOHにエーテ
ル結合するβ−グルコースの３、４、６位乃至19位のカ
ルボキシル基にエステル結合するβ−グルコースの３、
６位の一方又は両方にβ−グルコースが１位の位置で結
合した構造のβ−グルコシルルブソサイド、またはこれ
を主成分とする甘味料。