JPH07107972A - 可溶性フラボノイド類の製造方法 - Google Patents
可溶性フラボノイド類の製造方法Info
- Publication number
- JPH07107972A JPH07107972A JP5256141A JP25614193A JPH07107972A JP H07107972 A JPH07107972 A JP H07107972A JP 5256141 A JP5256141 A JP 5256141A JP 25614193 A JP25614193 A JP 25614193A JP H07107972 A JPH07107972 A JP H07107972A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- activity
- cyclodextrin
- flavonoids
- reaction
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】アルカリ耐性のサイクロデキストリン合成酵素
を用いて、フラボノイド類を効率よく水に可溶化する方
法を開発することを目的とする。 【構成】フラボノイド類をｐＨ８以上のアルカリ域で、
あるいは／およびサイクロデキストリンを加えて、可溶
化し、サイクロデキストリン合成酵素、特にバチルス属
の菌株Ａ２−５ａから採取された、アルカリ域で高活性
を有する、サイクロデキストリン合成酵素で糖転移させ
ることにより、フラボノイド類の配糖体を生成して、中
和後も沈澱を生ずることのない、可溶化フラボノイド類
を製造する。
を用いて、フラボノイド類を効率よく水に可溶化する方
法を開発することを目的とする。 【構成】フラボノイド類をｐＨ８以上のアルカリ域で、
あるいは／およびサイクロデキストリンを加えて、可溶
化し、サイクロデキストリン合成酵素、特にバチルス属
の菌株Ａ２−５ａから採取された、アルカリ域で高活性
を有する、サイクロデキストリン合成酵素で糖転移させ
ることにより、フラボノイド類の配糖体を生成して、中
和後も沈澱を生ずることのない、可溶化フラボノイド類
を製造する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、フラボノイド類をアル
カリ域で、あるいは／およびサイクロデキストリンを加
えて、水に可溶化し、アルカリ域でサイクロデキストリ
ン合成酵素を用いて糖転移反応させて、可溶性のフラボ
ノイド類を製造する方法に関する。
カリ域で、あるいは／およびサイクロデキストリンを加
えて、水に可溶化し、アルカリ域でサイクロデキストリ
ン合成酵素を用いて糖転移反応させて、可溶性のフラボ
ノイド類を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来技術】従来からビタミンＰとして知られているヘ
スペリジンおよびルチンなどのフラボノイド類は、血管
透過性の増大を抑制するという薬理的作用を有すること
から、抗高血圧剤、出血性疾患予防剤等として利用され
ている。また、大部分のフラボノイド類は、紫外線の吸
収作用を有すること、および緑色植物のフラボノイド類
はラジカルスカベンジャー作用を有することから、これ
らフラボノイド類は化粧品および食品等に機能性添加物
として利用することが期待される。
スペリジンおよびルチンなどのフラボノイド類は、血管
透過性の増大を抑制するという薬理的作用を有すること
から、抗高血圧剤、出血性疾患予防剤等として利用され
ている。また、大部分のフラボノイド類は、紫外線の吸
収作用を有すること、および緑色植物のフラボノイド類
はラジカルスカベンジャー作用を有することから、これ
らフラボノイド類は化粧品および食品等に機能性添加物
として利用することが期待される。
【０００３】フラボノイド類は、現在、約３，０００種
類が知られており柑橘類中に多量に存在することから、
原料を容易に、かつ安価に入手し得るにも係わらず、そ
の利用が非常に限られてくる。それはフラボノイド類の
大部分はアルコールなどの親水性有機溶媒には溶解され
るものの、水には僅かに溶解するかまたは全く溶解しな
いことによる。
類が知られており柑橘類中に多量に存在することから、
原料を容易に、かつ安価に入手し得るにも係わらず、そ
の利用が非常に限られてくる。それはフラボノイド類の
大部分はアルコールなどの親水性有機溶媒には溶解され
るものの、水には僅かに溶解するかまたは全く溶解しな
いことによる。
【０００４】そこで、フラボノイド類の溶解性を改善す
る試みがなされている。例えば、フラボノイド類を親水
基を有する化合物と反応させることによって、水溶性を
向上させる工夫がなされた。例えば、特公昭２５−１６
７７号には、フラボノイド類の一種であるルチンにアミ
ノ基を有する脂肪族化合物を作用させて溶解度を上げる
方法が開示されており、特公昭２９−１２８５号ではル
チンにロンガリットを作用させて亜硫酸化合物として水
溶性を増加させる方法が開示されている。しかし、これ
らの方法では、生成されたアミノ化合物、亜硫酸化合物
は生理活性が失われており、さらに毒性を有するなどの
問題を有している。
る試みがなされている。例えば、フラボノイド類を親水
基を有する化合物と反応させることによって、水溶性を
向上させる工夫がなされた。例えば、特公昭２５−１６
７７号には、フラボノイド類の一種であるルチンにアミ
ノ基を有する脂肪族化合物を作用させて溶解度を上げる
方法が開示されており、特公昭２９−１２８５号ではル
チンにロンガリットを作用させて亜硫酸化合物として水
溶性を増加させる方法が開示されている。しかし、これ
らの方法では、生成されたアミノ化合物、亜硫酸化合物
は生理活性が失われており、さらに毒性を有するなどの
問題を有している。
【０００５】これら失活や毒性の問題を解決するため
に、例えば、特公昭５４−３２０７３号に開示されるよ
うに、フラボノイド類であるルチンあるいはエスクリン
に糖転移酵素を作用させて配糖体として水溶性を増加さ
せる方法が用いられているが、これら配糖体の生成率は
低く、高純度の配糖体を得るためには、例えば、特公昭
５８−５４７９９号に記載のように多孔性合成吸着剤な
どを用いて、他の水溶性糖類を除去するという複雑な工
程が必要である。
に、例えば、特公昭５４−３２０７３号に開示されるよ
うに、フラボノイド類であるルチンあるいはエスクリン
に糖転移酵素を作用させて配糖体として水溶性を増加さ
せる方法が用いられているが、これら配糖体の生成率は
低く、高純度の配糖体を得るためには、例えば、特公昭
５８−５４７９９号に記載のように多孔性合成吸着剤な
どを用いて、他の水溶性糖類を除去するという複雑な工
程が必要である。
【０００６】近年、サイクロデキストリン合成活性、糖
転移活性および澱粉分解活性の３つの活性を有するサイ
クロデキストリン合成酵素を使用してフラボノイド類の
水溶性を向上させることが注目されている。他方、酵素
反応を十分に行うため、フラボノイド類をアルカリ域で
溶解する必要があるが、これらの酵素の大部分は、アル
カリ域では活性がなくなることが知られており、その利
用はｐＨ６〜７の範囲に限られている。従って、これら
の酵素を中性域で単独で使用するだけでは高い効率で水
可溶性フラボノイド類を得ることができなかった。
転移活性および澱粉分解活性の３つの活性を有するサイ
クロデキストリン合成酵素を使用してフラボノイド類の
水溶性を向上させることが注目されている。他方、酵素
反応を十分に行うため、フラボノイド類をアルカリ域で
溶解する必要があるが、これらの酵素の大部分は、アル
カリ域では活性がなくなることが知られており、その利
用はｐＨ６〜７の範囲に限られている。従って、これら
の酵素を中性域で単独で使用するだけでは高い効率で水
可溶性フラボノイド類を得ることができなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、アルカリ耐
性のサイクロデキストリン合成酵素を用いて、フラボノ
イド類を効率よく水に可溶化する方法を開発することを
目的とする。本発明の他の目的は、アルカリ域で効率よ
くサイクロデキストリンを合成し得る酵素を提供するこ
とである。
性のサイクロデキストリン合成酵素を用いて、フラボノ
イド類を効率よく水に可溶化する方法を開発することを
目的とする。本発明の他の目的は、アルカリ域で効率よ
くサイクロデキストリンを合成し得る酵素を提供するこ
とである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明の可溶性のフラボ
ノイド配糖体の製造方法は、フラボノイド類の配糖体を
生成して、中和後も沈澱を生ずることのない、可溶性の
フラボノイド配糖体を製造する方法であって、そのフラ
ボノイド類をｐＨ８以上のアルカリ域で、あるいは／お
よびサイクロデキストリンを加えて、可溶化する工程、
およびアルカリ域でサイクロデキストリン合成酵素で糖
転移させる工程を包含しており、そのことによって上記
目的が達成される。
ノイド配糖体の製造方法は、フラボノイド類の配糖体を
生成して、中和後も沈澱を生ずることのない、可溶性の
フラボノイド配糖体を製造する方法であって、そのフラ
ボノイド類をｐＨ８以上のアルカリ域で、あるいは／お
よびサイクロデキストリンを加えて、可溶化する工程、
およびアルカリ域でサイクロデキストリン合成酵素で糖
転移させる工程を包含しており、そのことによって上記
目的が達成される。
【０００９】本発明はまた、澱粉分解活性、糖転移活
性、およびサイクロデキストリン合成活性を有し、至適
ｐＨが５．０〜６．０、安定ｐＨが６．０〜９．０、お
よびＳＤＳ−ポリアクリロアミドゲル電気泳動で測定し
た分子量が約８０，０００である、好アルカリ性バチル
ス属の菌株Ａ２−５ａ（ＦＥＲＭ Ｐ−１３８６４）か
ら採取された、サイクロデキストリン合成酵素に関し、
この酵素を用いることにより、上記目的が達成される。
性、およびサイクロデキストリン合成活性を有し、至適
ｐＨが５．０〜６．０、安定ｐＨが６．０〜９．０、お
よびＳＤＳ−ポリアクリロアミドゲル電気泳動で測定し
た分子量が約８０，０００である、好アルカリ性バチル
ス属の菌株Ａ２−５ａ（ＦＥＲＭ Ｐ−１３８６４）か
ら採取された、サイクロデキストリン合成酵素に関し、
この酵素を用いることにより、上記目的が達成される。
【００１０】フラボノイドとは、二つのフェニル基がピ
ラン環あるいは、それに近い構造の三つの炭素原子を介
して結合している物質群の総称である。
ラン環あるいは、それに近い構造の三つの炭素原子を介
して結合している物質群の総称である。
【００１１】本発明で使用し得るフラボノイド類は、水
に難溶性のすべてのフラボノイド類を包含するが、特に
ヘスペリジン、エリオシトニン、ナリンギン、ネオヘス
ペリジン、ルチン、ジオスミン、リナリン、ポンシリ
ン、プルニン、ヘスペレチン−７−グルコシドなどであ
る。本発明では、フラボノイド類の溶解方法の第１段階
として、フラボノイド類がアルカリ域で水に対する溶解
性が向上すること、および／またはサイクロデキストリ
ン（以下「ＣＤ」という）との包接化合物を形成するこ
とによって可溶化し得る。
に難溶性のすべてのフラボノイド類を包含するが、特に
ヘスペリジン、エリオシトニン、ナリンギン、ネオヘス
ペリジン、ルチン、ジオスミン、リナリン、ポンシリ
ン、プルニン、ヘスペレチン−７−グルコシドなどであ
る。本発明では、フラボノイド類の溶解方法の第１段階
として、フラボノイド類がアルカリ域で水に対する溶解
性が向上すること、および／またはサイクロデキストリ
ン（以下「ＣＤ」という）との包接化合物を形成するこ
とによって可溶化し得る。
【００１２】第１段階で、アルカリ域およびＣＤを用い
る溶解工程を使用する場合、先に、溶液をアルカリ性と
し、続いてＣＤを添加し得るが、各工程を同時に進行す
ることもできる。
る溶解工程を使用する場合、先に、溶液をアルカリ性と
し、続いてＣＤを添加し得るが、各工程を同時に進行す
ることもできる。
【００１３】フラボノイド類は、水酸化ナトリウム、ア
ンモニア、水酸化カリウムなどを用いて、アルカリ域で
溶解され得る。この時のｐＨは８以上であればよい。好
ましくは、ｐＨ８〜１１の範囲であり、より好ましくは
ｐＨ９〜１０である。
ンモニア、水酸化カリウムなどを用いて、アルカリ域で
溶解され得る。この時のｐＨは８以上であればよい。好
ましくは、ｐＨ８〜１１の範囲であり、より好ましくは
ｐＨ９〜１０である。
【００１４】ＣＤは、フラボノイド類と包接化合物を形
成することにより、フラボノイド類を可溶化する。ＣＤ
は、市販のものを用い得るが、デンプンにサイクロデキ
ストリン合成酵素（以下「ＣＧＴａｓｅ」という）すな
わち、1,4-α-D-Glucan: 4-α-D-(1,4-glucano)-transf
erase(E.C. 2.4.1.19)を作用させることによっても形成
され得る。ここで生成されるＣＤは、グルコースが６〜
８個、α−１，４結合で環状に結合した物質で、グルコ
ースが６，７，８個のものをそれぞれα−ＣＤ、β−Ｃ
Ｄ、γ−ＣＤという。本工程には、α−、β−、および
γ−ＣＤを用いることができるがβ−ＣＤがより好まし
い。
成することにより、フラボノイド類を可溶化する。ＣＤ
は、市販のものを用い得るが、デンプンにサイクロデキ
ストリン合成酵素（以下「ＣＧＴａｓｅ」という）すな
わち、1,4-α-D-Glucan: 4-α-D-(1,4-glucano)-transf
erase(E.C. 2.4.1.19)を作用させることによっても形成
され得る。ここで生成されるＣＤは、グルコースが６〜
８個、α−１，４結合で環状に結合した物質で、グルコ
ースが６，７，８個のものをそれぞれα−ＣＤ、β−Ｃ
Ｄ、γ−ＣＤという。本工程には、α−、β−、および
γ−ＣＤを用いることができるがβ−ＣＤがより好まし
い。
【００１５】ＣＤを用いるフラボノイド類の可溶化は、
ＣＤをフラボノイド類と混合し、ホモミキサーなどのホ
モジナイザーで５，０００〜１０，０００ｒｐｍで、２
〜１０分間することで達成され得る。この時、温度は、
室温から９０℃までを選択し得るが、好ましくは４０〜
９０℃である。６０℃以上では、２００ｒｐｍ、６０分
間という弱い撹拌条件でも包接可能である。
ＣＤをフラボノイド類と混合し、ホモミキサーなどのホ
モジナイザーで５，０００〜１０，０００ｒｐｍで、２
〜１０分間することで達成され得る。この時、温度は、
室温から９０℃までを選択し得るが、好ましくは４０〜
９０℃である。６０℃以上では、２００ｒｐｍ、６０分
間という弱い撹拌条件でも包接可能である。
【００１６】第２段階では、ＣＧＴａｓｅを用いて、糖
転移を行い、フラボノイド類を配糖化することによっ
て、中和およびＣＤ除去後も沈澱を生じることのない可
溶化フラボノイド類の製造を行う。
転移を行い、フラボノイド類を配糖化することによっ
て、中和およびＣＤ除去後も沈澱を生じることのない可
溶化フラボノイド類の製造を行う。
【００１７】本発明における、フラボノイド類の配糖体
は、ＣＧＴａｓｅによる転移反応を利用して生産され
る。
は、ＣＧＴａｓｅによる転移反応を利用して生産され
る。
【００１８】本発明に用いる酵素はＣＧＴａｓｅであれ
ばいずれのものでも使用し得る。ＣＧＴａｓｅは、澱粉
に作用してグルコース６〜８個からなるＣＤを合成する
活性の他に、ＣＤおよび澱粉の存在下で適当なアクセプ
ターに作用させると、ＣＤおよび澱粉などがドナーとな
って、グルコースをアクセプターに転移する活性を有す
る。本発明はアルカリ域での反応を有するのでアルカリ
域で不安定なものを用いるとフラボノイド配糖体の収量
が著しく減少する。従って、アルカリ耐性の酵素を用い
る方が好ましい。特に好ましいのは後述の好アルカリ性
バチルス属の菌体が生産する耐アルカリ性酵素である。
ばいずれのものでも使用し得る。ＣＧＴａｓｅは、澱粉
に作用してグルコース６〜８個からなるＣＤを合成する
活性の他に、ＣＤおよび澱粉の存在下で適当なアクセプ
ターに作用させると、ＣＤおよび澱粉などがドナーとな
って、グルコースをアクセプターに転移する活性を有す
る。本発明はアルカリ域での反応を有するのでアルカリ
域で不安定なものを用いるとフラボノイド配糖体の収量
が著しく減少する。従って、アルカリ耐性の酵素を用い
る方が好ましい。特に好ましいのは後述の好アルカリ性
バチルス属の菌体が生産する耐アルカリ性酵素である。
【００１９】ここで、アクセプターとは、非還元末端に
グルコースを持つ化合物をいい、本発明においてはフラ
ボノイド類のことである。また、ドナーとしてのＣＤ
は、前記と同様、グルコースが６〜８個、α−１，４結
合で環状に結合した物質であり得る。また、本工程では
α−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤの混合物もその単体に換
えて合成し得、溶解のために使用し得る。
グルコースを持つ化合物をいい、本発明においてはフラ
ボノイド類のことである。また、ドナーとしてのＣＤ
は、前記と同様、グルコースが６〜８個、α−１，４結
合で環状に結合した物質であり得る。また、本工程では
α−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤの混合物もその単体に換
えて合成し得、溶解のために使用し得る。
【００２０】ＣＧＴａｓｅによる転移反応は、基質と酵
素量、反応温度などにより、適宜選択されるが、フラボ
ノイド類に糖転移するときの条件は、アルカリ域で行う
こと以外は常法によるものと変わらない。反応温度は、
２０〜７５℃であることが好ましい。ドナーの濃度は、
０．１〜３０重量％、好ましくは１〜２０重量％であ
る。アクセプターの濃度は、０．１〜５重量％、好まし
くは０．５〜２重量％である。本酵素の濃度は、０．１
〜１００ユニット／ｍｌとなるようにすることが好まし
い。反応時間は酵素活性が持続する限り長いほどよい。
反応は１００℃で５分間加熱することにより停止する。
素量、反応温度などにより、適宜選択されるが、フラボ
ノイド類に糖転移するときの条件は、アルカリ域で行う
こと以外は常法によるものと変わらない。反応温度は、
２０〜７５℃であることが好ましい。ドナーの濃度は、
０．１〜３０重量％、好ましくは１〜２０重量％であ
る。アクセプターの濃度は、０．１〜５重量％、好まし
くは０．５〜２重量％である。本酵素の濃度は、０．１
〜１００ユニット／ｍｌとなるようにすることが好まし
い。反応時間は酵素活性が持続する限り長いほどよい。
反応は１００℃で５分間加熱することにより停止する。
【００２１】生成されたフラボノイド配糖体は、溶解性
が著しく向上しているので、中和あるいは／およびＣＤ
除去後も沈澱を生ずることのない可溶性のフラボノイド
である。
が著しく向上しているので、中和あるいは／およびＣＤ
除去後も沈澱を生ずることのない可溶性のフラボノイド
である。
【００２２】アルカリ域で高活性を有するＣＧＴａｓｅ 本発明は、またアルカリ域で高活性を保持する新規のＣ
ＧＴａｓｅに関する。このＣＧＴａｓｅを用いることに
より、上記フラボノイド類の可溶化が著しく促進され
る。
ＧＴａｓｅに関する。このＣＧＴａｓｅを用いることに
より、上記フラボノイド類の可溶化が著しく促進され
る。
【００２３】以下に、本発明のＣＧＴａｓｅの特性につ
いて詳述する。本酵素はアルカリ性の培地で生育する、
バチルス属の菌株Ａ２−５ａ（以下「本菌株」という）
の培養物から採取し、精製される。本菌株は、本発明者
らによって、土壌から分離された新菌株である。本菌株
の菌学的性質を以下に示す。なお、特に記載のない限
り、培養温度は３０℃、培地のｐＨは１０．３である。
いて詳述する。本酵素はアルカリ性の培地で生育する、
バチルス属の菌株Ａ２−５ａ（以下「本菌株」という）
の培養物から採取し、精製される。本菌株は、本発明者
らによって、土壌から分離された新菌株である。本菌株
の菌学的性質を以下に示す。なお、特に記載のない限
り、培養温度は３０℃、培地のｐＨは１０．３である。
【００２４】（菌学的性質） １．形態学的性質 （１）細胞の形および大きさ （０．４〜０．６）×（２．０〜３．０）μmの桿菌で
ある。
ある。
【００２５】（２）胞子を有する。
【００２６】（３）グラム染色は陽性である。
【００２７】２．生育状況 （１）ｐＨ６．８での生育（普通寒天培地）では微弱で
ある。
ある。
【００２８】（２）ｐＨ１０．３での生育は良好であ
る。
る。
【００２９】３．生理学的性質 （１）カタラーゼの生成は陽性である。
【００３０】４．運動性 （１）運動性を有する。
【００３１】以上の結果をバージーのマニュアル第２巻
（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ ｍａｎｕａｌｏｆ Ｓｙｓｔｅｍ
ａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．２．１
９８６）と照合して、本菌株をバチルスに属する細菌と
同定した。
（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ ｍａｎｕａｌｏｆ Ｓｙｓｔｅｍ
ａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．２．１
９８６）と照合して、本菌株をバチルスに属する細菌と
同定した。
【００３２】（培養条件）本菌株の培養条件は特別であ
る必要はなく、通常の培地をｐＨ１０に調整したものが
用いられる。この培地は例えば、modified II-medium a
gar plates（K. Horikoshi and T. Akiba, in "Alkalop
hilic Microorganisms", Japan Scientific Societies
Press, Tokyo, 1982, pp.9-10に記載）であり得る。炭
素源としては、澱粉、ＣＤ、グルコース、グリセリンお
よびスクロースなどを使用し得る。窒素源としては、ポ
リペプトン、肉エキス、大豆蛋白および総合アミノ酸な
どを使用し得る。無機塩類としては、ＮａＣｌ、Ｋ2Ｈ
ＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4およびＭｇＳＯ4などを使用し得
る。その他必要に応じてコーンスティプリカーなどの天
然物およびビタミン類などの微量栄養素を加え得る。例
えば、１％ＣＤ、０．５％ポリペプトン、０．５％イー
ストエキストラクト、４％コーンスティプリカー、０．
１％Ｋ2ＨＰＯ4、０．０２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１％
Ｎａ2ＣＯ3、ｐＨ１０．３の培地が好適に用いられる。
る必要はなく、通常の培地をｐＨ１０に調整したものが
用いられる。この培地は例えば、modified II-medium a
gar plates（K. Horikoshi and T. Akiba, in "Alkalop
hilic Microorganisms", Japan Scientific Societies
Press, Tokyo, 1982, pp.9-10に記載）であり得る。炭
素源としては、澱粉、ＣＤ、グルコース、グリセリンお
よびスクロースなどを使用し得る。窒素源としては、ポ
リペプトン、肉エキス、大豆蛋白および総合アミノ酸な
どを使用し得る。無機塩類としては、ＮａＣｌ、Ｋ2Ｈ
ＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4およびＭｇＳＯ4などを使用し得
る。その他必要に応じてコーンスティプリカーなどの天
然物およびビタミン類などの微量栄養素を加え得る。例
えば、１％ＣＤ、０．５％ポリペプトン、０．５％イー
ストエキストラクト、４％コーンスティプリカー、０．
１％Ｋ2ＨＰＯ4、０．０２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１％
Ｎａ2ＣＯ3、ｐＨ１０．３の培地が好適に用いられる。
【００３３】ｐＨ８．５〜１１．０、好ましくはｐＨ
９．５〜１０．５、培養温度は２５〜３７℃で１〜７日
間、好ましくは３日間好気的に撹拌または、振盪しなが
ら培養を行う。本酵素は菌体外に分泌されるため培地中
から回収される。
９．５〜１０．５、培養温度は２５〜３７℃で１〜７日
間、好ましくは３日間好気的に撹拌または、振盪しなが
ら培養を行う。本酵素は菌体外に分泌されるため培地中
から回収される。
【００３４】（本酵素の採取方法）上記培養液から本酵
素を採取、精製するために、既知の精製方法が単独また
は、併用して用いられ得る。例えば、上記培養液を濾過
または、遠心分離にかけて菌体を除去し、濾液または、
上清液を得る。この濾液または、上清液を必要に応じて
濃縮し、限外濾過または透析を行う。さらに、硫安など
により塩析した後、透析し、次いで、澱粉吸着、イオン
交換クロマトグラフィー、ゲル濾過などを単独または、
組み合わせて用いることにより精製を行う。
素を採取、精製するために、既知の精製方法が単独また
は、併用して用いられ得る。例えば、上記培養液を濾過
または、遠心分離にかけて菌体を除去し、濾液または、
上清液を得る。この濾液または、上清液を必要に応じて
濃縮し、限外濾過または透析を行う。さらに、硫安など
により塩析した後、透析し、次いで、澱粉吸着、イオン
交換クロマトグラフィー、ゲル濾過などを単独または、
組み合わせて用いることにより精製を行う。
【００３５】（酵素の性質）本酵素は、次の理化学的性
質を有する。
質を有する。
【００３６】１．作用 本酵素はサイクロデキストリン合成酵素に属するもの
で、サイクロデキストリン合成酵素の持つ３つの活性、
つまりサイクロデキストリン合成活性、糖転移活性およ
び澱粉分解活性を有する（S.Kitahama, in "Handbook o
f Amylase and Related Enzymes", ed. The Amylase Re
search Society of Japan, 1988, pp.154-164, Pergamo
n Press.）。
で、サイクロデキストリン合成酵素の持つ３つの活性、
つまりサイクロデキストリン合成活性、糖転移活性およ
び澱粉分解活性を有する（S.Kitahama, in "Handbook o
f Amylase and Related Enzymes", ed. The Amylase Re
search Society of Japan, 1988, pp.154-164, Pergamo
n Press.）。
【００３７】２．力価測定法 （１）サイクロデキストリン合成活性 ２．５％可溶性澱粉溶液（２０ｍＭ酢酸バッファーでｐ
Ｈ５．５に調整）をあらかじめ４０℃に設定した恒温槽
にいれ、次に、この溶液に本酵素を加えて反応を開始さ
せる。６０分間の反応の後、１００℃、５分間の加熱に
よって反応を停止させる。この反応溶液を５０ｍＭ酢酸
バッファー（ｐＨ５．５）で５倍に希釈した後、１０ユ
ニットのグルコアミラーゼで４０℃で１６時間処理した
反応液中のＣＤの総量をＨＰＬＣ（Ａｍｉｎｅｘ ＨＰ
Ｘ−４２Ａ）で分析する。
Ｈ５．５に調整）をあらかじめ４０℃に設定した恒温槽
にいれ、次に、この溶液に本酵素を加えて反応を開始さ
せる。６０分間の反応の後、１００℃、５分間の加熱に
よって反応を停止させる。この反応溶液を５０ｍＭ酢酸
バッファー（ｐＨ５．５）で５倍に希釈した後、１０ユ
ニットのグルコアミラーゼで４０℃で１６時間処理した
反応液中のＣＤの総量をＨＰＬＣ（Ａｍｉｎｅｘ ＨＰ
Ｘ−４２Ａ）で分析する。
【００３８】上記の条件で１分間に１マイクロモルのＣ
Ｄを生成し得る酵素量をサイクロデキストリン合成活性
の１単位とする。
Ｄを生成し得る酵素量をサイクロデキストリン合成活性
の１単位とする。
【００３９】なお、ＨＰＬＣ（Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−
４２Ａ）の分析条件は以下のとおりである。
４２Ａ）の分析条件は以下のとおりである。
【００４０】カラム : Aminex HPX-42A (BioRad) 溶出液 : H2O 流速 : 0.4 ml/min カラム温度 : 80℃ 検出法 : RI （２）糖転移活性 ドナーとして１．２％可溶性澱粉、アクセプターとして
０．１％サリシンを含む基質溶液（２０ｍＭ酢酸バッフ
ァーでｐＨ５．５に調整）をあらかじめ４０℃に設定し
た恒温槽にいれ、次いで、この基質溶液に本酵素を加え
て反応を開始させる。１０分間の反応の後、１００℃、
５分間の加熱によって反応を停止させる。この時、本酵
素を添加しないものをブランクとして調製し、同様の操
作を行う。この反応溶液を１０ユニットのグルコアミラ
ーゼで４０℃で１６時間処理し、生成したサリシンをＨ
ＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析する。
０．１％サリシンを含む基質溶液（２０ｍＭ酢酸バッフ
ァーでｐＨ５．５に調整）をあらかじめ４０℃に設定し
た恒温槽にいれ、次いで、この基質溶液に本酵素を加え
て反応を開始させる。１０分間の反応の後、１００℃、
５分間の加熱によって反応を停止させる。この時、本酵
素を添加しないものをブランクとして調製し、同様の操
作を行う。この反応溶液を１０ユニットのグルコアミラ
ーゼで４０℃で１６時間処理し、生成したサリシンをＨ
ＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析する。
【００４１】配糖化活性は配糖化率で表した。
【００４２】
【数１】
【００４３】なお、ＨＰＬＣ（ＯＤＳ）の分析条件は以
下のとおりである。
下のとおりである。
【００４４】カラム : ODS 溶出液 : MeOH/H2O = 25/75 流速 : 0.5 ml/min カラム温度 : 60℃ 検出法 : UV270 （３）澱粉分解活性 １．５％可溶性澱粉溶液（２０ｍＭ酢酸バッファーでｐ
Ｈ５．５に調整）を予め４０℃に設定した恒温槽にい
れ、次いで、この溶液に本酵素を加えて反応を開始させ
る。１０分間の反応の後、この反応溶液（０．２５ｍ
ｌ）に０．５ｍｌの０．５Ｎ ＨＣｌ（５：１、ｖ／
ｖ）溶液を添加し反応を停止させる。この反応液０．１
ｍｌをとり、０．００５％Ｉ2および０．０５％ＫＩを
含有する溶液を加え、撹拌し室温に２０分間放置する。
この溶液の６６０ｎｍにおける吸光度を測定する（この
値をＡとする）。このとき本酵素を添加しないものをブ
ランクとして調製し、同様の操作を行う（この値をＢと
する）。
Ｈ５．５に調整）を予め４０℃に設定した恒温槽にい
れ、次いで、この溶液に本酵素を加えて反応を開始させ
る。１０分間の反応の後、この反応溶液（０．２５ｍ
ｌ）に０．５ｍｌの０．５Ｎ ＨＣｌ（５：１、ｖ／
ｖ）溶液を添加し反応を停止させる。この反応液０．１
ｍｌをとり、０．００５％Ｉ2および０．０５％ＫＩを
含有する溶液を加え、撹拌し室温に２０分間放置する。
この溶液の６６０ｎｍにおける吸光度を測定する（この
値をＡとする）。このとき本酵素を添加しないものをブ
ランクとして調製し、同様の操作を行う（この値をＢと
する）。
【００４５】
【数２】
【００４６】上記の式より得られる値をもって、澱粉分
解活性の１単位とする。
解活性の１単位とする。
【００４７】３．至適ｐＨおよび安定ｐＨ 可溶化澱粉に本酵素を作用させたときのサイクロデキス
トリン合成活性、可溶性澱粉をドナーとし、サリシンを
アクセプターとしたときの糖転移活性、および可溶性澱
粉を基質としたときの加水分解活性の至適ｐＨはそれぞ
れｐＨ５．０〜６．０である。本発明の酵素は、図１に
示すように、ｐＨ９．０以上で至適ｐＨにおける活性の
約５０％を保持している。すなわち、本酵素はアルカリ
域で安定である。安定ｐＨの測定は、本酵素をＢｒｉｔ
ｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ２−１
３）を用いてそれぞれ所望のｐＨに調整し、４０℃で２
時間静置し、その後、酢酸バッファーを用いてｐＨ５．
５に戻し、澱粉分解活性を測定し、その残存活性を求め
た。至適ｐＨ５．５での酵素活性を１００として図２に
示す。これによれば、本酵素の安定ｐＨは、６．０〜
９．０であり、ｐＨ５．０、ｐＨ１０．０でも至適ｐＨ
の約８０％の活性を保持している。
トリン合成活性、可溶性澱粉をドナーとし、サリシンを
アクセプターとしたときの糖転移活性、および可溶性澱
粉を基質としたときの加水分解活性の至適ｐＨはそれぞ
れｐＨ５．０〜６．０である。本発明の酵素は、図１に
示すように、ｐＨ９．０以上で至適ｐＨにおける活性の
約５０％を保持している。すなわち、本酵素はアルカリ
域で安定である。安定ｐＨの測定は、本酵素をＢｒｉｔ
ｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ２−１
３）を用いてそれぞれ所望のｐＨに調整し、４０℃で２
時間静置し、その後、酢酸バッファーを用いてｐＨ５．
５に戻し、澱粉分解活性を測定し、その残存活性を求め
た。至適ｐＨ５．５での酵素活性を１００として図２に
示す。これによれば、本酵素の安定ｐＨは、６．０〜
９．０であり、ｐＨ５．０、ｐＨ１０．０でも至適ｐＨ
の約８０％の活性を保持している。
【００４８】４．作用適温の範囲 本酵素の澱粉分解活性に対する温度の効果を検討するた
めに種々の温度での澱粉分解活性を測定した。図３に示
す結果は、本酵素の至適温度が５０〜５５℃であること
を示している。また、本酵素の安定性に対する温度の効
果を検討するために、溶液のｐＨを考慮の上、種々の温
度での澱粉分解活性を測定した。測定は、本酵素をＢｒ
ｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ
５．５、７．０および１０．０）中で、１０分間、種々
の温度でインキュベートし、上記ヨウ素法によって澱粉
分解活性を測定した。図４に示すように、ｐＨ７．０に
おいて３０〜５５℃で安定した活性を有し、１ｍＭ Ｃ
ａＣｌ2の添加により至適温度は約５℃向上し、７０℃
でも至適温度時の約６０％の活性を保持する。
めに種々の温度での澱粉分解活性を測定した。図３に示
す結果は、本酵素の至適温度が５０〜５５℃であること
を示している。また、本酵素の安定性に対する温度の効
果を検討するために、溶液のｐＨを考慮の上、種々の温
度での澱粉分解活性を測定した。測定は、本酵素をＢｒ
ｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ
５．５、７．０および１０．０）中で、１０分間、種々
の温度でインキュベートし、上記ヨウ素法によって澱粉
分解活性を測定した。図４に示すように、ｐＨ７．０に
おいて３０〜５５℃で安定した活性を有し、１ｍＭ Ｃ
ａＣｌ2の添加により至適温度は約５℃向上し、７０℃
でも至適温度時の約６０％の活性を保持する。
【００４９】５．失活の条件 １００℃において１５分間処理すると完全に失活する。
【００５０】６．精製方法 培養液から菌体を除去した培養上清に澱粉を加え、４℃
で１６時間撹拌する。これをカラムにつめ、カラムを洗
浄した後、３３ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4で本酵素を溶出す
る。次いで、溶出液をＱ−セファロースカラムにかけ、
０．４Ｍ ＮａＣｌでカラムを洗浄した後、０．４〜１
Ｍ ＮａＣｌで溶出し、活性画分を収集し、精製酵素と
する。この画分は、ＳＤＳ−ポリアクリロアミドゲル電
気泳動を行うと、図５に示すように単一バンドを示す。
で１６時間撹拌する。これをカラムにつめ、カラムを洗
浄した後、３３ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4で本酵素を溶出す
る。次いで、溶出液をＱ−セファロースカラムにかけ、
０．４Ｍ ＮａＣｌでカラムを洗浄した後、０．４〜１
Ｍ ＮａＣｌで溶出し、活性画分を収集し、精製酵素と
する。この画分は、ＳＤＳ−ポリアクリロアミドゲル電
気泳動を行うと、図５に示すように単一バンドを示す。
【００５１】７．分子量 精製したＣＧＴａｓｅの分子量は図５に示すように、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動においては、約
８０，０００、またゲル濾過（ＨＰＬＣ）をＴＳＫ Ｇ
ｅｌ Ｇ３０００ ＳＷカラム（東ソー）を使用し、
０．３Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸緩衝液を用い
て４０℃、流速０．７ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、２８０ｎ
ｍの吸収で検出した。これにより求められた分子量は、
図６に示すように、約７０，０００である。
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動においては、約
８０，０００、またゲル濾過（ＨＰＬＣ）をＴＳＫ Ｇ
ｅｌ Ｇ３０００ ＳＷカラム（東ソー）を使用し、
０．３Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸緩衝液を用い
て４０℃、流速０．７ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、２８０ｎ
ｍの吸収で検出した。これにより求められた分子量は、
図６に示すように、約７０，０００である。
【００５２】
（実施例１）ドナーとして試験区１に可溶性澱粉、試験
区２にα−ＣＤ、試験区３にβ−ＣＤ、試験区４にγ−
ＣＤ、および試験区５にＫ−１００（α−ＣＤおよびβ
−ＣＤの混合物；α−ＣＤ：β−ＣＤ＝２：１）を用
い、各ドナーをそれぞれ５重量％、およびアクセプター
としてのヘスペリジンを０．５重量％含有する溶液を塩
酸でｐＨ５に調整した基質溶液を調製した。また、ドナ
ーとして試験区６に可溶性澱粉、試験区７にα−ＣＤ、
試験区８にβ−ＣＤ、試験区９にγ−ＣＤ、および試験
区１０にＫ−１００を用い、各ドナーをそれぞれ５重量
％、およびアクセプターとしてヘスペリジンを０．５重
量％含有する溶液をＮａＯＨでｐＨ１０に調整し、ヘス
ペリジンを可溶化した基質溶液を調製した。これら試験
区１〜１０の基質溶液を予め３７℃に設定した恒温槽に
いれ、次いで、この反応溶液にＣＧＴａｓｅを２ユニッ
ト／ｍｌとなるように加えて反応を開始させた。１６時
間の反応の後、１００℃、５分間の加熱によって反応を
停止させた。この時それぞれの試験区に対してＣＧＴａ
ｓｅを添加しないものをブランクとして調製し、同様の
操作を行った。これらの反応溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ）
で分析したところ、表１および２の結果を得た。
区２にα−ＣＤ、試験区３にβ−ＣＤ、試験区４にγ−
ＣＤ、および試験区５にＫ−１００（α−ＣＤおよびβ
−ＣＤの混合物；α−ＣＤ：β−ＣＤ＝２：１）を用
い、各ドナーをそれぞれ５重量％、およびアクセプター
としてのヘスペリジンを０．５重量％含有する溶液を塩
酸でｐＨ５に調整した基質溶液を調製した。また、ドナ
ーとして試験区６に可溶性澱粉、試験区７にα−ＣＤ、
試験区８にβ−ＣＤ、試験区９にγ−ＣＤ、および試験
区１０にＫ−１００を用い、各ドナーをそれぞれ５重量
％、およびアクセプターとしてヘスペリジンを０．５重
量％含有する溶液をＮａＯＨでｐＨ１０に調整し、ヘス
ペリジンを可溶化した基質溶液を調製した。これら試験
区１〜１０の基質溶液を予め３７℃に設定した恒温槽に
いれ、次いで、この反応溶液にＣＧＴａｓｅを２ユニッ
ト／ｍｌとなるように加えて反応を開始させた。１６時
間の反応の後、１００℃、５分間の加熱によって反応を
停止させた。この時それぞれの試験区に対してＣＧＴａ
ｓｅを添加しないものをブランクとして調製し、同様の
操作を行った。これらの反応溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ）
で分析したところ、表１および２の結果を得た。
【００５３】なお、ＨＰＬＣ（ＯＤＳ）の分析条件は以
下のとおりである。
下のとおりである。
【００５４】カラム : ODS 溶出液 : AcCN/Pi buffer* = 20/80 流速 : 0.5 ml/min カラム温度 : 40℃ 検出法 : UV280 * : Pi bufferは、39mM KH2PO4,1mM Na2HPO4を含有す
る。
る。
【００５５】
【表１】
【００５６】
【表２】
【００５７】表１よりヘスペリジンの可溶化にはｐＨ５
およびｐＨ１０においてＣＤが効果があること、その中
でもβ−ＣＤが優れていること（ｐＨ５では試験区１の
８．４倍の溶解度、ｐＨ１０では１４．５倍の溶解
度）、更に、アルカリ域が有利であること（ドナーが同
じであればｐＨ１０の方が２〜４倍溶解度が向上）、ま
た、アルカリ域でＣＤに包接させることにより溶解度が
増すこと（試験区８〜１０）が明かである。
およびｐＨ１０においてＣＤが効果があること、その中
でもβ−ＣＤが優れていること（ｐＨ５では試験区１の
８．４倍の溶解度、ｐＨ１０では１４．５倍の溶解
度）、更に、アルカリ域が有利であること（ドナーが同
じであればｐＨ１０の方が２〜４倍溶解度が向上）、ま
た、アルカリ域でＣＤに包接させることにより溶解度が
増すこと（試験区８〜１０）が明かである。
【００５８】表２よりヘスペリジンの配糖化には可溶化
と同様に、アルカリ域が有利であること（ｐＨ５ではＣ
Ｄを用いても試験区１の１．５倍程度であるが、ｐＨ１
０では３〜５倍であった）、また、アルカリ域でＣＤを
包接させるとより配糖体量が増すこと（試験区８、９で
は試験区１の５倍以上）が明かである。また、ＣＤの利
用はフラボノイド類を包接し、可溶化するばかりでな
く、糖のドナーとしても利用される。
と同様に、アルカリ域が有利であること（ｐＨ５ではＣ
Ｄを用いても試験区１の１．５倍程度であるが、ｐＨ１
０では３〜５倍であった）、また、アルカリ域でＣＤを
包接させるとより配糖体量が増すこと（試験区８、９で
は試験区１の５倍以上）が明かである。また、ＣＤの利
用はフラボノイド類を包接し、可溶化するばかりでな
く、糖のドナーとしても利用される。
【００５９】（実施例２）試験区１では、ドナーとして
可溶性澱粉を５重量％、アクセプターとしてヘスペリジ
ンを０．５重量％を包含する溶液を、塩酸でｐＨ５に調
整した基質溶液を調製した。また、試験区２では可溶性
澱粉とα−ＣＤ、試験区３では可溶性澱粉とβ−ＣＤ、
試験区４では可溶性澱粉とγ−ＣＤ、試験区５では可溶
性澱粉とＫ−１００をドナーとして用い、それぞれ２．
５重量％ずつ含有し、アクセプターとしてヘスペリジン
を０．５重量％含有する溶液を水酸化ナトリウムでｐＨ
１０に調整することによって、ヘスペリジンを可溶化し
た。これらの基質溶液を予め３７℃に設定しておいた恒
温槽にいれ、次いで、この反応溶液にＣＧＴａｓｅを５
ユニット／ｍｌとなるように加えて反応を開始させた。
１６時間の反応の後、１００℃、５分間の加熱によって
反応を停止させた。この時それぞれの試験区に対してＣ
ＧＴａｓｅを添加しないものをブランクとして調製し、
同様の操作を行った。これらの反応溶液を実施例１と同
じＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析したところ、表３の結果を
得た。
可溶性澱粉を５重量％、アクセプターとしてヘスペリジ
ンを０．５重量％を包含する溶液を、塩酸でｐＨ５に調
整した基質溶液を調製した。また、試験区２では可溶性
澱粉とα−ＣＤ、試験区３では可溶性澱粉とβ−ＣＤ、
試験区４では可溶性澱粉とγ−ＣＤ、試験区５では可溶
性澱粉とＫ−１００をドナーとして用い、それぞれ２．
５重量％ずつ含有し、アクセプターとしてヘスペリジン
を０．５重量％含有する溶液を水酸化ナトリウムでｐＨ
１０に調整することによって、ヘスペリジンを可溶化し
た。これらの基質溶液を予め３７℃に設定しておいた恒
温槽にいれ、次いで、この反応溶液にＣＧＴａｓｅを５
ユニット／ｍｌとなるように加えて反応を開始させた。
１６時間の反応の後、１００℃、５分間の加熱によって
反応を停止させた。この時それぞれの試験区に対してＣ
ＧＴａｓｅを添加しないものをブランクとして調製し、
同様の操作を行った。これらの反応溶液を実施例１と同
じＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析したところ、表３の結果を
得た。
【００６０】
【表３】
【００６１】表３および実施例１の表２より、ヘスペリ
ジンの可溶化にはドナーとして可溶性澱粉とＣＤとを混
合して用いてもその重量％が同じであれば、それぞれ単
独で用いた場合と同程度の結果が得られた。更に、可溶
性澱粉とα−ＣＤまたはβ−ＣＤとの組み合わせではヘ
スペリジングルコサイドの生成量はやや増加する傾向に
あった。
ジンの可溶化にはドナーとして可溶性澱粉とＣＤとを混
合して用いてもその重量％が同じであれば、それぞれ単
独で用いた場合と同程度の結果が得られた。更に、可溶
性澱粉とα−ＣＤまたはβ−ＣＤとの組み合わせではヘ
スペリジングルコサイドの生成量はやや増加する傾向に
あった。
【００６２】（実施例３）ドナーとして可溶性澱粉を５
重量％、アクセプターとしてヘスペリジンを０．１重量
％を包含する溶液を、水酸化ナトリウムでｐＨ１０に調
整してヘスペリジンを可溶化した。この基質溶液を予め
３７℃に設定しておいた恒温槽にいれ、次いで、この反
応溶液にＣＧＴａｓｅを１ユニット／ｍｌとなるように
加えて反応を開始させた。１６時間の反応の後、１００
℃、５分間の加熱によって反応を停止させた。この反応
溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析したところ（分析条件
は実施例１に同じ）、ヘスペリジンにグルコースが１〜
１０個付加された化合物が確認された。また、1,4-α-D
-Glucan glucohydrolase(E.C. 3.2.1.3.)（以下「グル
コアミラーゼ」という）処理（３７℃で３時間反応）に
よりヘスペリジン（ヘスペリジンのアグリコン）とグル
コースとを生ずることからこの結合はα１，４−結合で
あることが解った。また、これらの配糖体の収量は７
４．５％であった。
重量％、アクセプターとしてヘスペリジンを０．１重量
％を包含する溶液を、水酸化ナトリウムでｐＨ１０に調
整してヘスペリジンを可溶化した。この基質溶液を予め
３７℃に設定しておいた恒温槽にいれ、次いで、この反
応溶液にＣＧＴａｓｅを１ユニット／ｍｌとなるように
加えて反応を開始させた。１６時間の反応の後、１００
℃、５分間の加熱によって反応を停止させた。この反応
溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析したところ（分析条件
は実施例１に同じ）、ヘスペリジンにグルコースが１〜
１０個付加された化合物が確認された。また、1,4-α-D
-Glucan glucohydrolase(E.C. 3.2.1.3.)（以下「グル
コアミラーゼ」という）処理（３７℃で３時間反応）に
よりヘスペリジン（ヘスペリジンのアグリコン）とグル
コースとを生ずることからこの結合はα１，４−結合で
あることが解った。また、これらの配糖体の収量は７
４．５％であった。
【００６３】（実施例４）ドナーとして可溶性澱粉を５
重量％、アクセプターとして難溶性フラボノイドである
ジオスミン、ナリンジン、ネオヘスペリジンおよびルチ
ンをそれぞれ０．１重量％を包含する溶液を、水酸化ナ
トリウムでｐＨ９に調整して可溶化した。この基質溶液
を予め３７℃に設定しておいた恒温槽にいれ、次いで、
この反応溶液にＣＧＴａｓｅを１ユニット／ｍｌとなる
ように加えて反応を開始させた。１６時間の反応の後、
１００℃、５分間の加熱によって反応を停止させた。こ
の反応溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析したところ（分
析条件は実施例１に同じ）、それぞれの難溶性フラボノ
イドにグルコースが１〜１０個付加された配糖化物が確
認された。また、これらの配糖化物の収量はジオスミン
は７３．４％、ナリンジンは３９．１％、ネオヘスペリ
ジンは３９．０％、ルチンは６４．５％であった。
重量％、アクセプターとして難溶性フラボノイドである
ジオスミン、ナリンジン、ネオヘスペリジンおよびルチ
ンをそれぞれ０．１重量％を包含する溶液を、水酸化ナ
トリウムでｐＨ９に調整して可溶化した。この基質溶液
を予め３７℃に設定しておいた恒温槽にいれ、次いで、
この反応溶液にＣＧＴａｓｅを１ユニット／ｍｌとなる
ように加えて反応を開始させた。１６時間の反応の後、
１００℃、５分間の加熱によって反応を停止させた。こ
の反応溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析したところ（分
析条件は実施例１に同じ）、それぞれの難溶性フラボノ
イドにグルコースが１〜１０個付加された配糖化物が確
認された。また、これらの配糖化物の収量はジオスミン
は７３．４％、ナリンジンは３９．１％、ネオヘスペリ
ジンは３９．０％、ルチンは６４．５％であった。
【００６４】
【発明の効果】本発明では、水に難溶性のフラボノイド
類を、ｐＨ８以上のアルカリ域で、あるいは／およびサ
イクロデキストリンを加えて、可溶化し、さらにサイク
ロデキストリン合成酵素を用いて、フラボノイド類を効
率よく、水に可溶化する方法を開発した。さらに、本発
明では、アルカリ域で、サイクロデキストリン合成、糖
転移および澱粉分解の高い活性を有するサイクロデキス
トリン合成酵素を提供した。
類を、ｐＨ８以上のアルカリ域で、あるいは／およびサ
イクロデキストリンを加えて、可溶化し、さらにサイク
ロデキストリン合成酵素を用いて、フラボノイド類を効
率よく、水に可溶化する方法を開発した。さらに、本発
明では、アルカリ域で、サイクロデキストリン合成、糖
転移および澱粉分解の高い活性を有するサイクロデキス
トリン合成酵素を提供した。
【図１】本発明のサイクロデキストリン合成酵素のサイ
クロデキストリン合成活性、澱粉分解活性および転移活
性に対するｐＨの効果を示す。ここで、●はサイクロデ
キストリン合成活性、○は糖転移活性、および▲は澱粉
分解活性を表す。
クロデキストリン合成活性、澱粉分解活性および転移活
性に対するｐＨの効果を示す。ここで、●はサイクロデ
キストリン合成活性、○は糖転移活性、および▲は澱粉
分解活性を表す。
【図２】本発明のサイクロデキストリン合成酵素の安定
性に対するｐＨの効果を示す。縦軸の活性値は、澱粉分
解活性を測定し、至適ｐＨ（本酵素においてはｐＨ５．
５）の活性を１００％として相対値で表す。
性に対するｐＨの効果を示す。縦軸の活性値は、澱粉分
解活性を測定し、至適ｐＨ（本酵素においてはｐＨ５．
５）の活性を１００％として相対値で表す。
【図３】本発明のサイクロデキストリン合成酵素の澱粉
分解活性に対する温度の効果を示す。縦軸の活性値は至
適温度である５０〜５５℃での平均活性を１００％とし
て相対値で表す。
分解活性に対する温度の効果を示す。縦軸の活性値は至
適温度である５０〜５５℃での平均活性を１００％とし
て相対値で表す。
【図４】本発明のサイクロデキストリン合成酵素の安定
性に対する温度の効果を示す。縦軸の活性値は、澱粉分
解活性を測定し、至適温度での活性を１００％として相
対値で表す。ここで、△はＣａＣｌ2非存在下、ｐＨ
５．５での酵素活性、▲はＣａＣｌ2非存在下、ｐＨ１
０．０での酵素活性、○はＣａＣｌ2非存在下、ｐＨ
７．０での酵素活性、および●はＣａＣｌ2存在下、ｐ
Ｈ７．０での酵素活性を表す。
性に対する温度の効果を示す。縦軸の活性値は、澱粉分
解活性を測定し、至適温度での活性を１００％として相
対値で表す。ここで、△はＣａＣｌ2非存在下、ｐＨ
５．５での酵素活性、▲はＣａＣｌ2非存在下、ｐＨ１
０．０での酵素活性、○はＣａＣｌ2非存在下、ｐＨ
７．０での酵素活性、および●はＣａＣｌ2存在下、ｐ
Ｈ７．０での酵素活性を表す。
【図５】本発明のサイクロデキストリン合成酵素のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを示す。ここで、Ｅは、精製したＣＧＴａ
ｓｅ、Ｍは、マーカー蛋白質；ミオシン（分子量２０
０，０００）、Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ
（分子量１１６，２５０）、家兎筋ホスホリラーゼｂ
（分子量９７，４００）、ウシ血清アルブミン（分子量
６６，２００）、および鶏卵白アルブミン（分子量４
５，０００）である。
Ｓ−ＰＡＧＥを示す。ここで、Ｅは、精製したＣＧＴａ
ｓｅ、Ｍは、マーカー蛋白質；ミオシン（分子量２０
０，０００）、Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ
（分子量１１６，２５０）、家兎筋ホスホリラーゼｂ
（分子量９７，４００）、ウシ血清アルブミン（分子量
６６，２００）、および鶏卵白アルブミン（分子量４
５，０００）である。
【図６】本発明のサイクロデキストリン合成酵素のゲル
濾過（ＨＰＬＣ）時の保有時間と溶出する分子の分子量
を示す。●はサイクロデキストリン合成酵素を表す。○
1〜○5は以下のマーカー蛋白質を表す。 ○1：酵母グルタメートデヒドロゲナーゼ （分子量２
９０，０００） ○2：ブタ心臓ラクテートデヒドロゲナーゼ（分子量１
４２，０００） ○3：酵母エノラーゼ （分子量
６７，０００） ○4：酵母アデニレートキナーゼ （分子量
３２，０００） ○5：馬心臓チトクロームＣ （分子量
１２，４００）
濾過（ＨＰＬＣ）時の保有時間と溶出する分子の分子量
を示す。●はサイクロデキストリン合成酵素を表す。○
1〜○5は以下のマーカー蛋白質を表す。 ○1：酵母グルタメートデヒドロゲナーゼ （分子量２
９０，０００） ○2：ブタ心臓ラクテートデヒドロゲナーゼ（分子量１
４２，０００） ○3：酵母エノラーゼ （分子量
６７，０００） ○4：酵母アデニレートキナーゼ （分子量
３２，０００） ○5：馬心臓チトクロームＣ （分子量
１２，４００）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 滝井 寛 大阪府大阪市西淀川区野里１丁目30−４ (72)発明者 寺田 喜信 大阪府大阪市西淀川区野里１丁目30−４
Claims (4)
- 【請求項１】可溶性のフラボノイド配糖体の製造方法で
あって：フラボノイド類をｐＨ８以上のアルカリ域で、
あるいは／およびサイクロデキストリンを加えて、可溶
化する工程；および該アルカリ域でサイクロデキストリ
ン合成酵素で糖転移させる工程；を包含する、製造方
法。 - 【請求項２】前記フラボノイド類がヘスペリジン、エリ
オシトリン、ナリンギン、ネオヘスペリジン、ジオスミ
ン、リナリン、ポンシリン、プルニン、ヘスペレチン-7
-グルコシド、およびそれらの混合物からなる群から選
択される、請求項１に記載の製造方法。 - 【請求項３】前記サイクロデキストリン合成酵素が、好
アルカリ性バチルス属の菌株Ａ２−５ａ（ＦＥＲＭ Ｐ
−１３８６４）から採取された、アルカリ域で高活性を
有する、サイクロデキストリン合成酵素である、請求項
１に記載の製造方法。 - 【請求項４】糖質およびフラボノイド類に対し、澱粉分
解活性、糖転移活性、およびサイクロデキストリン合成
活性を有し、至適ｐＨが５．０〜６．０、安定ｐＨが
６．０〜９．０、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で測定した分子量が約８０，０００である、
好アルカリ性バチルス属の菌株Ａ２−５ａ（ＦＥＲＭ
Ｐ−１３８６４）から採取された、サイクロデキストリ
ン合成酵素。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25614193A JP3989561B2 (ja) | 1993-10-13 | 1993-10-13 | 可溶性フラボノイド類の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25614193A JP3989561B2 (ja) | 1993-10-13 | 1993-10-13 | 可溶性フラボノイド類の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07107972A true JPH07107972A (ja) | 1995-04-25 |
| JP3989561B2 JP3989561B2 (ja) | 2007-10-10 |
Family
ID=17288477
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25614193A Expired - Lifetime JP3989561B2 (ja) | 1993-10-13 | 1993-10-13 | 可溶性フラボノイド類の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3989561B2 (ja) |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11255655A (ja) * | 1997-12-09 | 1999-09-21 | Hayashibara Biochem Lab Inc | 神経機能調節剤 |
| JP2001158796A (ja) * | 1999-11-30 | 2001-06-12 | Toyo Seito Kk | α−グルコシルジオスミンの製造方法及びフラボノイド組成物 |
| JP2004238336A (ja) * | 2003-02-07 | 2004-08-26 | Sanei Gen Ffi Inc | 水易溶性包接フラボノイド類の製造方法 |
| JP2005281203A (ja) * | 2004-03-30 | 2005-10-13 | Hayashibara Biochem Lab Inc | 皮膚外用剤、ならびにグラブリジン配糖体及びその製造方法 |
| JP2007039349A (ja) * | 2005-08-01 | 2007-02-15 | Hayashibara Biochem Lab Inc | ヘスペレチン−７−β−マルトシド及びその製造方法並びにその用途 |
| JP2007284393A (ja) * | 2006-04-18 | 2007-11-01 | Toyo Seito Kk | ナリンジン組成物、その製造方法及び用途 |
| JP2008271839A (ja) * | 2007-04-27 | 2008-11-13 | Toyo Seito Kk | 水溶性フラボノイド組成物およびその製造方法、ならびに水溶性フラボノイド組成物を含む食品等 |
| JP2012041352A (ja) * | 2009-02-03 | 2012-03-01 | Sunstar Inc | ヘスペリジン含有組成物 |
| JP2017169527A (ja) * | 2016-03-25 | 2017-09-28 | 東洋精糖株式会社 | αモノグルコシルロイフォリン、αモノグルコシルロイフォリンの製造方法、αモノグルコシルロイフォリンを含むリパーゼ阻害剤、および抗糖化剤 |
| JP6421280B1 (ja) * | 2017-07-28 | 2018-11-07 | 太陽化学株式会社 | フラボノイド包接化合物の製造方法 |
| JP6616046B1 (ja) * | 2018-06-01 | 2019-12-04 | 太陽化学株式会社 | フラボノイド−シクロデキストリン包接化合物を含有する組成物 |
| CN110982865A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-10 | 浙江工业大学 | 一种碱性环糊精葡萄糖基转移酶在生产α-葡萄糖基橙皮苷中的应用 |
| WO2020090137A1 (ja) * | 2018-10-30 | 2020-05-07 | 太陽化学株式会社 | 容器詰飲料 |
-
1993
- 1993-10-13 JP JP25614193A patent/JP3989561B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11255655A (ja) * | 1997-12-09 | 1999-09-21 | Hayashibara Biochem Lab Inc | 神経機能調節剤 |
| JP2001158796A (ja) * | 1999-11-30 | 2001-06-12 | Toyo Seito Kk | α−グルコシルジオスミンの製造方法及びフラボノイド組成物 |
| JP2004238336A (ja) * | 2003-02-07 | 2004-08-26 | Sanei Gen Ffi Inc | 水易溶性包接フラボノイド類の製造方法 |
| JP2005281203A (ja) * | 2004-03-30 | 2005-10-13 | Hayashibara Biochem Lab Inc | 皮膚外用剤、ならびにグラブリジン配糖体及びその製造方法 |
| JP2007039349A (ja) * | 2005-08-01 | 2007-02-15 | Hayashibara Biochem Lab Inc | ヘスペレチン−７−β−マルトシド及びその製造方法並びにその用途 |
| JP2007284393A (ja) * | 2006-04-18 | 2007-11-01 | Toyo Seito Kk | ナリンジン組成物、その製造方法及び用途 |
| JP2008271839A (ja) * | 2007-04-27 | 2008-11-13 | Toyo Seito Kk | 水溶性フラボノイド組成物およびその製造方法、ならびに水溶性フラボノイド組成物を含む食品等 |
| JP2012041352A (ja) * | 2009-02-03 | 2012-03-01 | Sunstar Inc | ヘスペリジン含有組成物 |
| JP2017169527A (ja) * | 2016-03-25 | 2017-09-28 | 東洋精糖株式会社 | αモノグルコシルロイフォリン、αモノグルコシルロイフォリンの製造方法、αモノグルコシルロイフォリンを含むリパーゼ阻害剤、および抗糖化剤 |
| WO2019021510A1 (ja) * | 2017-07-28 | 2019-01-31 | 太陽化学株式会社 | フラボノイド包接化合物の製造方法 |
| US10519182B2 (en) | 2017-07-28 | 2019-12-31 | Taiyo Kagaku Co., Ltd. | Method for producing flavonoid inclusion compound |
| JP2019024500A (ja) * | 2017-07-28 | 2019-02-21 | 太陽化学株式会社 | フラボノイド包接化合物の製造方法 |
| JP2019134714A (ja) * | 2017-07-28 | 2019-08-15 | 太陽化学株式会社 | フラボノイド包接化合物の製造方法 |
| CN110462052A (zh) * | 2017-07-28 | 2019-11-15 | 太阳化学株式会社 | 黄酮包合化合物的制造方法 |
| US10676496B2 (en) | 2017-07-28 | 2020-06-09 | Taiyo Kagaku Co., Ltd. | Method for producing flavonoid inclusion compound |
| JP6421280B1 (ja) * | 2017-07-28 | 2018-11-07 | 太陽化学株式会社 | フラボノイド包接化合物の製造方法 |
| WO2019230013A1 (ja) * | 2018-06-01 | 2019-12-05 | 太陽化学株式会社 | フラボノイド－シクロデキストリン包接化合物を含有する組成物 |
| JP6616046B1 (ja) * | 2018-06-01 | 2019-12-04 | 太陽化学株式会社 | フラボノイド−シクロデキストリン包接化合物を含有する組成物 |
| CN112236525A (zh) * | 2018-06-01 | 2021-01-15 | 太阳化学株式会社 | 含有类黄酮-环糊精包合物的组合物 |
| US11446319B2 (en) | 2018-06-01 | 2022-09-20 | Taiyo Kagaku Co., Ltd. | Composition containing flavonoid-cyclodextrin clathrate compound |
| WO2020090137A1 (ja) * | 2018-10-30 | 2020-05-07 | 太陽化学株式会社 | 容器詰飲料 |
| JPWO2020090137A1 (ja) * | 2018-10-30 | 2021-04-08 | 太陽化学株式会社 | 容器詰飲料 |
| CN110982865A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-10 | 浙江工业大学 | 一种碱性环糊精葡萄糖基转移酶在生产α-葡萄糖基橙皮苷中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3989561B2 (ja) | 2007-10-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Spagna et al. | A simple method for purifying glycosidases: α-L-rhamnopyranosidase from Aspergillus niger to increase the aroma of Moscato wine | |
| US5141858A (en) | Method for the production of α(1→2) oligodextrans using Leuconostoc mesenteroides B-1299 | |
| CN101605905B (zh) | 类黄酮类的糖苷化方法 | |
| JPH07107972A (ja) | 可溶性フラボノイド類の製造方法 | |
| Kometani et al. | Purification and characterization of cyclodextrin glucanotransferase from an alkalophilic Bacillus species and transglycosylation at alkaline pHs | |
| Tsumuraya et al. | Structure of the water-insoluble α-D-glucan of Streptococcus salivarius HHT | |
| Zahnley et al. | Insoluble glucan formation by Leuconostoc mesenteroides B-1355 | |
| JP3078923B2 (ja) | 新規分岐シクロデキストリンおよびその製造方法 | |
| 米谷俊 et al. | Synthesis of Hesperidin Glycosides by Cyclodextrin Glucanotransferase and Stabilization of the Natural Pigments. | |
| JP3556690B2 (ja) | 糖カルボン酸の製造法及び新規糖カルボン酸 | |
| JP2863263B2 (ja) | 分岐シクロデキストリンの側鎖部分にβ―結合でガラクトシル基を転移結合させた新規ヘテロ分岐シクロデキストリン及びその製造方法 | |
| EP0560982A1 (en) | Process for producing sugar and transfusion | |
| JP3552732B2 (ja) | 新規な分岐シクロデキストリン | |
| JP2664586B2 (ja) | ポリフェノール配糖体合成能を有する酵素 | |
| JP2863262B2 (ja) | 分岐シクロデキストリンの側鎖部分にα―結合でガラクトシル基を転移結合させた新規ヘテロ分岐シクロデキストリン及びその製造方法 | |
| JP2662667B2 (ja) | アミラーゼｘ−２３およびその製造法 | |
| JP3086076B2 (ja) | 新規ガラクトシル−分岐シクロデキストリン | |
| JPH02131592A (ja) | 甘味料の製造方法 | |
| JPH0466096A (ja) | 水易溶性フラボノール配糖体の製造法 | |
| JPH0466097A (ja) | 水溶性フラボノール配糖体 | |
| JPWO2020122050A1 (ja) | シクロイソマルトテトラオース、シクロイソマルトテトラオース生成酵素とそれらの製造方法並びに用途 | |
| JP2888506B2 (ja) | 非還元末端アジド化マルトオリゴ糖及びその製造方法 | |
| JP2757946B2 (ja) | デキストラナーゼ吸着体およびその製造法 | |
| JPH11155564A (ja) | β−ＤＦＡの製造方法および使用酵素 | |
| WO1991009963A1 (en) | Procedure for producing maltodextrins and starch and maltose syrups containing cyclodextrins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040115 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040305 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040602 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20040921 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070622 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070718 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100727 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110727 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110727 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120727 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120727 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130727 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130727 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140727 Year of fee payment: 7 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |