JP3989561B2 - 可溶性フラボノイド類の製造方法 - Google Patents
可溶性フラボノイド類の製造方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、フラボノイド類をアルカリ域で、あるいは／およびサイクロデキストリンを加えて、水に可溶化し、アルカリ域でサイクロデキストリン合成酵素を用いて糖転移反応させて、可溶性のフラボノイド類を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
従来からビタミンＰとして知られているヘスペリジンおよびルチンなどのフラボノイド類は、血管透過性の増大を抑制するという薬理的作用を有することから、抗高血圧剤、出血性疾患予防剤等として利用されている。また、大部分のフラボノイド類は、紫外線の吸収作用を有すること、および緑色植物のフラボノイド類はラジカルスカベンジャー作用を有することから、これらフラボノイド類は化粧品および食品等に機能性添加物として利用することが期待される。
【０００３】
フラボノイド類は、現在、約３，０００種類が知られており柑橘類中に多量に存在することから、原料を容易に、かつ安価に入手し得るにも係わらず、その利用が非常に限られてくる。それはフラボノイド類の大部分はアルコールなどの親水性有機溶媒には溶解されるものの、水には僅かに溶解するかまたは全く溶解しないことによる。
【０００４】
そこで、フラボノイド類の溶解性を改善する試みがなされている。例えば、フラボノイド類を親水基を有する化合物と反応させることによって、水溶性を向上させる工夫がなされた。例えば、特公昭２５−１６７７号には、フラボノイド類の一種であるルチンにアミノ基を有する脂肪族化合物を作用させて溶解度を上げる方法が開示されており、特公昭２９−１２８５号ではルチンにロンガリットを作用させて亜硫酸化合物として水溶性を増加させる方法が開示されている。しかし、これらの方法では、生成されたアミノ化合物、亜硫酸化合物は生理活性が失われており、さらに毒性を有するなどの問題を有している。
【０００５】
これら失活や毒性の問題を解決するために、例えば、特公昭５４−３２０７３号に開示されるように、フラボノイド類であるルチンあるいはエスクリンに糖転移酵素を作用させて配糖体として水溶性を増加させる方法が用いられているが、これら配糖体の生成率は低く、高純度の配糖体を得るためには、例えば、特公昭５８−５４７９９号に記載のように多孔性合成吸着剤などを用いて、他の水溶性糖類を除去するという複雑な工程が必要である。
【０００６】
近年、サイクロデキストリン合成活性、糖転移活性および澱粉分解活性の３つの活性を有するサイクロデキストリン合成酵素を使用してフラボノイド類の水溶性を向上させることが注目されている。他方、酵素反応を十分に行うため、フラボノイド類をアルカリ域で溶解する必要があるが、これらの酵素の大部分は、アルカリ域では活性がなくなることが知られており、その利用はｐＨ６〜７の範囲に限られている。従って、これらの酵素を中性域で単独で使用するだけでは高い効率で水可溶性フラボノイド類を得ることができなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アルカリ耐性のサイクロデキストリン合成酵素を用いて、フラボノイド類を効率よく水に可溶化する方法を開発することを目的とする。本発明の他の目的は、アルカリ域で効率よくサイクロデキストリンを合成し得る酵素を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明の可溶性のフラボノイド配糖体の製造方法は、フラボノイド類の配糖体を生成して、中和後も沈澱を生ずることのない、可溶性のフラボノイド配糖体を製造する方法であって、そのフラボノイド類をｐＨ８以上のアルカリ域で、あるいは／およびサイクロデキストリンを加えて、可溶化する工程、およびアルカリ域でサイクロデキストリン合成酵素で糖転移させる工程を包含しており、そのことによって上記目的が達成される。
【０００９】
本発明はまた、澱粉分解活性、糖転移活性、およびサイクロデキストリン合成活性を有し、至適ｐＨが５．０〜６．０、安定ｐＨが６．０〜９．０、およびＳＤＳ−ポリアクリロアミドゲル電気泳動で測定した分子量が約８０，０００である、好アルカリ性バチルス属の菌株Ａ２−５ａ（ＦＥＲＭ Ｐ−１３８６４）から採取された、サイクロデキストリン合成酵素に関し、この酵素を用いることにより、上記目的が達成される。
【００１０】
フラボノイドとは、二つのフェニル基がピラン環あるいは、それに近い構造の三つの炭素原子を介して結合している物質群の総称である。
【００１１】
本発明で使用し得るフラボノイド類は、水に難溶性のすべてのフラボノイド類を包含するが、特にヘスペリジン、エリオシトニン、ナリンギン、ネオヘスペリジン、ルチン、ジオスミン、リナリン、ポンシリン、プルニン、ヘスペレチン−７−グルコシドなどである。
本発明では、フラボノイド類の溶解方法の第１段階として、フラボノイド類がアルカリ域で水に対する溶解性が向上すること、および／またはサイクロデキストリン（以下「ＣＤ」という）との包接化合物を形成することによって可溶化し得る。
【００１２】
第１段階で、アルカリ域およびＣＤを用いる溶解工程を使用する場合、先に、溶液をアルカリ性とし、続いてＣＤを添加し得るが、各工程を同時に進行することもできる。
【００１３】
フラボノイド類は、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化カリウムなどを用いて、アルカリ域で溶解され得る。この時のｐＨは８以上であればよい。好ましくは、ｐＨ８〜１１の範囲であり、より好ましくはｐＨ９〜１０である。
【００１４】
ＣＤは、フラボノイド類と包接化合物を形成することにより、フラボノイド類を可溶化する。ＣＤは、市販のものを用い得るが、デンプンにサイクロデキストリン合成酵素（以下「ＣＧＴａｓｅ」という）すなわち、1,4-α-D-Glucan: 4-α-D-(1,4-glucano)-transferase(E.C. 2.4.1.19)を作用させることによっても形成され得る。ここで生成されるＣＤは、グルコースが６〜８個、α−１，４結合で環状に結合した物質で、グルコースが６，７，８個のものをそれぞれα−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤという。本工程には、α−、β−、およびγ−ＣＤを用いることができるがβ−ＣＤがより好ましい。
【００１５】
ＣＤを用いるフラボノイド類の可溶化は、ＣＤをフラボノイド類と混合し、ホモミキサーなどのホモジナイザーで５，０００〜１０，０００ｒｐｍで、２〜１０分間することで達成され得る。この時、温度は、室温から９０℃までを選択し得るが、好ましくは４０〜９０℃である。６０℃以上では、２００ｒｐｍ、６０分間という弱い撹拌条件でも包接可能である。
【００１６】
第２段階では、ＣＧＴａｓｅを用いて、糖転移を行い、フラボノイド類を配糖化することによって、中和およびＣＤ除去後も沈澱を生じることのない可溶化フラボノイド類の製造を行う。
【００１７】
本発明における、フラボノイド類の配糖体は、ＣＧＴａｓｅによる転移反応を利用して生産される。
【００１８】
本発明に用いる酵素はＣＧＴａｓｅであればいずれのものでも使用し得る。ＣＧＴａｓｅは、澱粉に作用してグルコース６〜８個からなるＣＤを合成する活性の他に、ＣＤおよび澱粉の存在下で適当なアクセプターに作用させると、ＣＤおよび澱粉などがドナーとなって、グルコースをアクセプターに転移する活性を有する。本発明はアルカリ域での反応を有するのでアルカリ域で不安定なものを用いるとフラボノイド配糖体の収量が著しく減少する。従って、アルカリ耐性の酵素を用いる方が好ましい。特に好ましいのは後述の好アルカリ性バチルス属の菌体が生産する耐アルカリ性酵素である。
【００１９】
ここで、アクセプターとは、非還元末端にグルコースを持つ化合物をいい、本発明においてはフラボノイド類のことである。また、ドナーとしてのＣＤは、前記と同様、グルコースが６〜８個、α−１，４結合で環状に結合した物質であり得る。また、本工程ではα−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤの混合物もその単体に換えて合成し得、溶解のために使用し得る。
【００２０】
ＣＧＴａｓｅによる転移反応は、基質と酵素量、反応温度などにより、適宜選択されるが、フラボノイド類に糖転移するときの条件は、アルカリ域で行うこと以外は常法によるものと変わらない。反応温度は、２０〜７５℃であることが好ましい。ドナーの濃度は、０．１〜３０重量％、好ましくは１〜２０重量％である。アクセプターの濃度は、０．１〜５重量％、好ましくは０．５〜２重量％である。本酵素の濃度は、０．１〜１００ユニット／ｍｌとなるようにすることが好ましい。反応時間は酵素活性が持続する限り長いほどよい。反応は１００℃で５分間加熱することにより停止する。
【００２１】
生成されたフラボノイド配糖体は、溶解性が著しく向上しているので、中和あるいは／およびＣＤ除去後も沈澱を生ずることのない可溶性のフラボノイドである。
【００２２】
アルカリ域で高活性を有するＣＧＴａｓｅ
本発明は、またアルカリ域で高活性を保持する新規のＣＧＴａｓｅに関する。このＣＧＴａｓｅを用いることにより、上記フラボノイド類の可溶化が著しく促進される。
【００２３】
以下に、本発明のＣＧＴａｓｅの特性について詳述する。本酵素はアルカリ性の培地で生育する、バチルス属の菌株Ａ２−５ａ（以下「本菌株」という）の培養物から採取し、精製される。本菌株は、本発明者らによって、土壌から分離された新菌株である。本菌株の菌学的性質を以下に示す。なお、特に記載のない限り、培養温度は３０℃、培地のｐＨは１０．３である。
【００２４】
（菌学的性質）
１．形態学的性質
（１）細胞の形および大きさ
（０．４〜０．６）×（２．０〜３．０）μmの桿菌である。
【００２５】
（２）胞子を有する。
【００２６】
（３）グラム染色は陽性である。
【００２７】
２．生育状況
（１）ｐＨ６．８での生育（普通寒天培地）では微弱である。
【００２８】
（２）ｐＨ１０．３での生育は良好である。
【００２９】
３．生理学的性質
（１）カタラーゼの生成は陽性である。
【００３０】
４．運動性
（１）運動性を有する。
【００３１】
以上の結果をバージーのマニュアル第２巻（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ ｍａｎｕａｌｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．２．１９８６）と照合して、本菌株をバチルスに属する細菌と同定した。
【００３２】
（培養条件）
本菌株の培養条件は特別である必要はなく、通常の培地をｐＨ１０に調整したものが用いられる。この培地は例えば、modified II-medium agar plates（K. Horikoshi and T. Akiba, in "Alkalophilic Microorganisms", Japan Scientific Societies Press, Tokyo, 1982, pp.9-10に記載）であり得る。炭素源としては、澱粉、ＣＤ、グルコース、グリセリンおよびスクロースなどを使用し得る。窒素源としては、ポリペプトン、肉エキス、大豆蛋白および総合アミノ酸などを使用し得る。無機塩類としては、ＮａＣｌ、Ｋ2ＨＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4およびＭｇＳＯ4などを使用し得る。その他必要に応じてコーンスティプリカーなどの天然物およびビタミン類などの微量栄養素を加え得る。例えば、１％ＣＤ、０．５％ポリペプトン、０．５％イーストエキストラクト、４％コーンスティプリカー、０．１％Ｋ2ＨＰＯ4、０．０２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１％Ｎａ2ＣＯ3、ｐＨ１０．３の培地が好適に用いられる。
【００３３】
ｐＨ８．５〜１１．０、好ましくはｐＨ９．５〜１０．５、培養温度は２５〜３７℃で１〜７日間、好ましくは３日間好気的に撹拌または、振盪しながら培養を行う。本酵素は菌体外に分泌されるため培地中から回収される。
【００３４】
（本酵素の採取方法）
上記培養液から本酵素を採取、精製するために、既知の精製方法が単独または、併用して用いられ得る。例えば、上記培養液を濾過または、遠心分離にかけて菌体を除去し、濾液または、上清液を得る。この濾液または、上清液を必要に応じて濃縮し、限外濾過または透析を行う。さらに、硫安などにより塩析した後、透析し、次いで、澱粉吸着、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過などを単独または、組み合わせて用いることにより精製を行う。
【００３５】
（酵素の性質）
本酵素は、次の理化学的性質を有する。
【００３６】
１．作用
本酵素はサイクロデキストリン合成酵素に属するもので、サイクロデキストリン合成酵素の持つ３つの活性、つまりサイクロデキストリン合成活性、糖転移活性および澱粉分解活性を有する（S.Kitahama, in "Handbook of Amylase and Related Enzymes", ed. The Amylase Research Society of Japan, 1988, pp.154-164, Pergamon Press.）。
【００３７】
２．力価測定法
（１）サイクロデキストリン合成活性
２．５％可溶性澱粉溶液（２０ｍＭ酢酸バッファーでｐＨ５．５に調整）をあらかじめ４０℃に設定した恒温槽にいれ、次に、この溶液に本酵素を加えて反応を開始させる。６０分間の反応の後、１００℃、５分間の加熱によって反応を停止させる。この反応溶液を５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）で５倍に希釈した後、１０ユニットのグルコアミラーゼで４０℃で１６時間処理した反応液中のＣＤの総量をＨＰＬＣ（Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−４２Ａ）で分析する。
【００３８】
上記の条件で１分間に１マイクロモルのＣＤを生成し得る酵素量をサイクロデキストリン合成活性の１単位とする。
【００３９】
なお、ＨＰＬＣ（Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−４２Ａ）の分析条件は以下のとおりである。
【００４０】
カラム : Aminex HPX-42A (BioRad)
溶出液 : H2O
流速 : 0.4 ml/min
カラム温度 : 80℃
検出法 : RI
（２）糖転移活性
ドナーとして１．２％可溶性澱粉、アクセプターとして０．１％サリシンを含む基質溶液（２０ｍＭ酢酸バッファーでｐＨ５．５に調整）をあらかじめ４０℃に設定した恒温槽にいれ、次いで、この基質溶液に本酵素を加えて反応を開始させる。１０分間の反応の後、１００℃、５分間の加熱によって反応を停止させる。この時、本酵素を添加しないものをブランクとして調製し、同様の操作を行う。この反応溶液を１０ユニットのグルコアミラーゼで４０℃で１６時間処理し、生成したサリシンをＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析する。
【００４１】
配糖化活性は配糖化率で表した。
【００４２】
【数１】
【００４３】
なお、ＨＰＬＣ（ＯＤＳ）の分析条件は以下のとおりである。
【００４４】
カラム : ODS
溶出液 : MeOH/H2O = 25/75
流速 : 0.5 ml/min
カラム温度 : 60℃
検出法 : UV270
（３）澱粉分解活性
１．５％可溶性澱粉溶液（２０ｍＭ酢酸バッファーでｐＨ５．５に調整）を予め４０℃に設定した恒温槽にいれ、次いで、この溶液に本酵素を加えて反応を開始させる。１０分間の反応の後、この反応溶液（０．２５ｍｌ）に０．５ｍｌの０．５Ｎ ＨＣｌ（５：１、ｖ／ｖ）溶液を添加し反応を停止させる。この反応液０．１ｍｌをとり、０．００５％Ｉ2および０．０５％ＫＩを含有する溶液を加え、撹拌し室温に２０分間放置する。この溶液の６６０ｎｍにおける吸光度を測定する（この値をＡとする）。このとき本酵素を添加しないものをブランクとして調製し、同様の操作を行う（この値をＢとする）。
【００４５】
【数２】
【００４６】
上記の式より得られる値をもって、澱粉分解活性の１単位とする。
【００４７】
３．至適ｐＨおよび安定ｐＨ
可溶化澱粉に本酵素を作用させたときのサイクロデキストリン合成活性、可溶性澱粉をドナーとし、サリシンをアクセプターとしたときの糖転移活性、および可溶性澱粉を基質としたときの加水分解活性の至適ｐＨはそれぞれｐＨ５．０〜６．０である。本発明の酵素は、図１に示すように、ｐＨ９．０以上で至適ｐＨにおける活性の約５０％を保持している。すなわち、本酵素はアルカリ域で安定である。安定ｐＨの測定は、本酵素をＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ２−１３）を用いてそれぞれ所望のｐＨに調整し、４０℃で２時間静置し、その後、酢酸バッファーを用いてｐＨ５．５に戻し、澱粉分解活性を測定し、その残存活性を求めた。至適ｐＨ５．５での酵素活性を１００として図２に示す。これによれば、本酵素の安定ｐＨは、６．０〜９．０であり、ｐＨ５．０、ｐＨ１０．０でも至適ｐＨの約８０％の活性を保持している。
【００４８】
４．作用適温の範囲
本酵素の澱粉分解活性に対する温度の効果を検討するために種々の温度での澱粉分解活性を測定した。図３に示す結果は、本酵素の至適温度が５０〜５５℃であることを示している。また、本酵素の安定性に対する温度の効果を検討するために、溶液のｐＨを考慮の上、種々の温度での澱粉分解活性を測定した。測定は、本酵素をＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．５、７．０および１０．０）中で、１０分間、種々の温度でインキュベートし、上記ヨウ素法によって澱粉分解活性を測定した。図４に示すように、ｐＨ７．０において３０〜５５℃で安定した活性を有し、１ｍＭ ＣａＣｌ2の添加により至適温度は約５℃向上し、７０℃でも至適温度時の約６０％の活性を保持する。
【００４９】
５．失活の条件
１００℃において１５分間処理すると完全に失活する。
【００５０】
６．精製方法
培養液から菌体を除去した培養上清に澱粉を加え、４℃で１６時間撹拌する。これをカラムにつめ、カラムを洗浄した後、３３ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4で本酵素を溶出する。次いで、溶出液をＱ−セファロースカラムにかけ、０．４Ｍ ＮａＣｌでカラムを洗浄した後、０．４〜１Ｍ ＮａＣｌで溶出し、活性画分を収集し、精製酵素とする。この画分は、ＳＤＳ−ポリアクリロアミドゲル電気泳動を行うと、図５に示すように単一バンドを示す。
【００５１】
７．分子量
精製したＣＧＴａｓｅの分子量は図５に示すように、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動においては、約８０，０００、またゲル濾過（ＨＰＬＣ）をＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷカラム（東ソー）を使用し、０．３Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸緩衝液を用いて４０℃、流速０．７ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、２８０ｎｍの吸収で検出した。これにより求められた分子量は、図６に示すように、約７０，０００である。
【００５２】
【実施例】
（実施例１）
ドナーとして試験区１に可溶性澱粉、試験区２にα−ＣＤ、試験区３にβ−ＣＤ、試験区４にγ−ＣＤ、および試験区５にＫ−１００（α−ＣＤおよびβ−ＣＤの混合物；α−ＣＤ：β−ＣＤ＝２：１）を用い、各ドナーをそれぞれ５重量％、およびアクセプターとしてのヘスペリジンを０．５重量％含有する溶液を塩酸でｐＨ５に調整した基質溶液を調製した。また、ドナーとして試験区６に可溶性澱粉、試験区７にα−ＣＤ、試験区８にβ−ＣＤ、試験区９にγ−ＣＤ、および試験区１０にＫ−１００を用い、各ドナーをそれぞれ５重量％、およびアクセプターとしてヘスペリジンを０．５重量％含有する溶液をＮａＯＨでｐＨ１０に調整し、ヘスペリジンを可溶化した基質溶液を調製した。これら試験区１〜１０の基質溶液を予め３７℃に設定した恒温槽にいれ、次いで、この反応溶液にＣＧＴａｓｅを２ユニット／ｍｌとなるように加えて反応を開始させた。１６時間の反応の後、１００℃、５分間の加熱によって反応を停止させた。この時それぞれの試験区に対してＣＧＴａｓｅを添加しないものをブランクとして調製し、同様の操作を行った。これらの反応溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析したところ、表１および２の結果を得た。
【００５３】
なお、ＨＰＬＣ（ＯＤＳ）の分析条件は以下のとおりである。
【００５４】
カラム : ODS
溶出液 : AcCN/Pi buffer* = 20/80
流速 : 0.5 ml/min
カラム温度 : 40℃
検出法 : UV280
* : Pi bufferは、39mM KH2PO4,1mM Na2HPO4を含有する。
【００５５】
【表１】
【００５６】
【表２】
【００５７】
表１よりヘスペリジンの可溶化にはｐＨ５およびｐＨ１０においてＣＤが効果があること、その中でもβ−ＣＤが優れていること（ｐＨ５では試験区１の８．４倍の溶解度、ｐＨ１０では１４．５倍の溶解度）、更に、アルカリ域が有利であること（ドナーが同じであればｐＨ１０の方が２〜４倍溶解度が向上）、また、アルカリ域でＣＤに包接させることにより溶解度が増すこと（試験区８〜１０）が明かである。
【００５８】
表２よりヘスペリジンの配糖化には可溶化と同様に、アルカリ域が有利であること（ｐＨ５ではＣＤを用いても試験区１の１．５倍程度であるが、ｐＨ１０では３〜５倍であった）、また、アルカリ域でＣＤを包接させるとより配糖体量が増すこと（試験区８、９では試験区１の５倍以上）が明かである。また、ＣＤの利用はフラボノイド類を包接し、可溶化するばかりでなく、糖のドナーとしても利用される。
【００５９】
（実施例２）
試験区１では、ドナーとして可溶性澱粉を５重量％、アクセプターとしてヘスペリジンを０．５重量％を包含する溶液を、塩酸でｐＨ５に調整した基質溶液を調製した。また、試験区２では可溶性澱粉とα−ＣＤ、試験区３では可溶性澱粉とβ−ＣＤ、試験区４では可溶性澱粉とγ−ＣＤ、試験区５では可溶性澱粉とＫ−１００をドナーとして用い、それぞれ２．５重量％ずつ含有し、アクセプターとしてヘスペリジンを０．５重量％含有する溶液を水酸化ナトリウムでｐＨ１０に調整することによって、ヘスペリジンを可溶化した。これらの基質溶液を予め３７℃に設定しておいた恒温槽にいれ、次いで、この反応溶液にＣＧＴａｓｅを５ユニット／ｍｌとなるように加えて反応を開始させた。１６時間の反応の後、１００℃、５分間の加熱によって反応を停止させた。この時それぞれの試験区に対してＣＧＴａｓｅを添加しないものをブランクとして調製し、同様の操作を行った。これらの反応溶液を実施例１と同じＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析したところ、表３の結果を得た。
【００６０】
【表３】
【００６１】
表３および実施例１の表２より、ヘスペリジンの可溶化にはドナーとして可溶性澱粉とＣＤとを混合して用いてもその重量％が同じであれば、それぞれ単独で用いた場合と同程度の結果が得られた。更に、可溶性澱粉とα−ＣＤまたはβ−ＣＤとの組み合わせではヘスペリジングルコサイドの生成量はやや増加する傾向にあった。
【００６２】
（実施例３）
ドナーとして可溶性澱粉を５重量％、アクセプターとしてヘスペリジンを０．１重量％を包含する溶液を、水酸化ナトリウムでｐＨ１０に調整してヘスペリジンを可溶化した。この基質溶液を予め３７℃に設定しておいた恒温槽にいれ、次いで、この反応溶液にＣＧＴａｓｅを１ユニット／ｍｌとなるように加えて反応を開始させた。１６時間の反応の後、１００℃、５分間の加熱によって反応を停止させた。この反応溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析したところ（分析条件は実施例１に同じ）、ヘスペリジンにグルコースが１〜１０個付加された化合物が確認された。また、1,4-α-D-Glucan glucohydrolase(E.C. 3.2.1.3.)（以下「グルコアミラーゼ」という）処理（３７℃で３時間反応）によりヘスペリジン（ヘスペリジンのアグリコン）とグルコースとを生ずることからこの結合はα１，４−結合であることが解った。また、これらの配糖体の収量は７４．５％であった。
【００６３】
（実施例４）
ドナーとして可溶性澱粉を５重量％、アクセプターとして難溶性フラボノイドであるジオスミン、ナリンジン、ネオヘスペリジンおよびルチンをそれぞれ０．１重量％を包含する溶液を、水酸化ナトリウムでｐＨ９に調整して可溶化した。この基質溶液を予め３７℃に設定しておいた恒温槽にいれ、次いで、この反応溶液にＣＧＴａｓｅを１ユニット／ｍｌとなるように加えて反応を開始させた。１６時間の反応の後、１００℃、５分間の加熱によって反応を停止させた。この反応溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析したところ（分析条件は実施例１に同じ）、それぞれの難溶性フラボノイドにグルコースが１〜１０個付加された配糖化物が確認された。また、これらの配糖化物の収量はジオスミンは７３．４％、ナリンジンは３９．１％、ネオヘスペリジンは３９．０％、ルチンは６４．５％であった。
【００６４】
【発明の効果】
本発明では、水に難溶性のフラボノイド類を、ｐＨ８以上のアルカリ域で、あるいは／およびサイクロデキストリンを加えて、可溶化し、さらにサイクロデキストリン合成酵素を用いて、フラボノイド類を効率よく、水に可溶化する方法を開発した。さらに、本発明では、アルカリ域で、サイクロデキストリン合成、糖転移および澱粉分解の高い活性を有するサイクロデキストリン合成酵素を提供した。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のサイクロデキストリン合成酵素のサイクロデキストリン合成活性、澱粉分解活性および転移活性に対するｐＨの効果を示す。ここで、●はサイクロデキストリン合成活性、○は糖転移活性、および▲は澱粉分解活性を表す。
【図２】本発明のサイクロデキストリン合成酵素の安定性に対するｐＨの効果を示す。縦軸の活性値は、澱粉分解活性を測定し、至適ｐＨ（本酵素においてはｐＨ５．５）の活性を１００％として相対値で表す。
【図３】本発明のサイクロデキストリン合成酵素の澱粉分解活性に対する温度の効果を示す。縦軸の活性値は至適温度である５０〜５５℃での平均活性を１００％として相対値で表す。
【図４】本発明のサイクロデキストリン合成酵素の安定性に対する温度の効果を示す。縦軸の活性値は、澱粉分解活性を測定し、至適温度での活性を１００％として相対値で表す。ここで、△はＣａＣｌ2非存在下、ｐＨ５．５での酵素活性、▲はＣａＣｌ2非存在下、ｐＨ１０．０での酵素活性、○はＣａＣｌ2非存在下、ｐＨ７．０での酵素活性、および●はＣａＣｌ2存在下、ｐＨ７．０での酵素活性を表す。
【図５】本発明のサイクロデキストリン合成酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ここで、Ｅは、精製したＣＧＴａｓｅ、Ｍは、マーカー蛋白質；ミオシン（分子量２００，０００）、Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（分子量１１６，２５０）、家兎筋ホスホリラーゼｂ（分子量９７，４００）、ウシ血清アルブミン（分子量６６，２００）、および鶏卵白アルブミン（分子量４５，０００）である。
【図６】本発明のサイクロデキストリン合成酵素のゲル濾過（ＨＰＬＣ）時の保有時間と溶出する分子の分子量を示す。●はサイクロデキストリン合成酵素を表す。
○1〜○5は以下のマーカー蛋白質を表す。
○1：酵母グルタメートデヒドロゲナーゼ （分子量２９０，０００）
○2：ブタ心臓ラクテートデヒドロゲナーゼ（分子量１４２，０００）
○3：酵母エノラーゼ （分子量 ６７，０００）
○4：酵母アデニレートキナーゼ （分子量 ３２，０００）
○5：馬心臓チトクロームＣ （分子量 １２，４００）
【産業上の利用分野】
本発明は、フラボノイド類をアルカリ域で、あるいは／およびサイクロデキストリンを加えて、水に可溶化し、アルカリ域でサイクロデキストリン合成酵素を用いて糖転移反応させて、可溶性のフラボノイド類を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
従来からビタミンＰとして知られているヘスペリジンおよびルチンなどのフラボノイド類は、血管透過性の増大を抑制するという薬理的作用を有することから、抗高血圧剤、出血性疾患予防剤等として利用されている。また、大部分のフラボノイド類は、紫外線の吸収作用を有すること、および緑色植物のフラボノイド類はラジカルスカベンジャー作用を有することから、これらフラボノイド類は化粧品および食品等に機能性添加物として利用することが期待される。
【０００３】
フラボノイド類は、現在、約３，０００種類が知られており柑橘類中に多量に存在することから、原料を容易に、かつ安価に入手し得るにも係わらず、その利用が非常に限られてくる。それはフラボノイド類の大部分はアルコールなどの親水性有機溶媒には溶解されるものの、水には僅かに溶解するかまたは全く溶解しないことによる。
【０００４】
そこで、フラボノイド類の溶解性を改善する試みがなされている。例えば、フラボノイド類を親水基を有する化合物と反応させることによって、水溶性を向上させる工夫がなされた。例えば、特公昭２５−１６７７号には、フラボノイド類の一種であるルチンにアミノ基を有する脂肪族化合物を作用させて溶解度を上げる方法が開示されており、特公昭２９−１２８５号ではルチンにロンガリットを作用させて亜硫酸化合物として水溶性を増加させる方法が開示されている。しかし、これらの方法では、生成されたアミノ化合物、亜硫酸化合物は生理活性が失われており、さらに毒性を有するなどの問題を有している。
【０００５】
これら失活や毒性の問題を解決するために、例えば、特公昭５４−３２０７３号に開示されるように、フラボノイド類であるルチンあるいはエスクリンに糖転移酵素を作用させて配糖体として水溶性を増加させる方法が用いられているが、これら配糖体の生成率は低く、高純度の配糖体を得るためには、例えば、特公昭５８−５４７９９号に記載のように多孔性合成吸着剤などを用いて、他の水溶性糖類を除去するという複雑な工程が必要である。
【０００６】
近年、サイクロデキストリン合成活性、糖転移活性および澱粉分解活性の３つの活性を有するサイクロデキストリン合成酵素を使用してフラボノイド類の水溶性を向上させることが注目されている。他方、酵素反応を十分に行うため、フラボノイド類をアルカリ域で溶解する必要があるが、これらの酵素の大部分は、アルカリ域では活性がなくなることが知られており、その利用はｐＨ６〜７の範囲に限られている。従って、これらの酵素を中性域で単独で使用するだけでは高い効率で水可溶性フラボノイド類を得ることができなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アルカリ耐性のサイクロデキストリン合成酵素を用いて、フラボノイド類を効率よく水に可溶化する方法を開発することを目的とする。本発明の他の目的は、アルカリ域で効率よくサイクロデキストリンを合成し得る酵素を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明の可溶性のフラボノイド配糖体の製造方法は、フラボノイド類の配糖体を生成して、中和後も沈澱を生ずることのない、可溶性のフラボノイド配糖体を製造する方法であって、そのフラボノイド類をｐＨ８以上のアルカリ域で、あるいは／およびサイクロデキストリンを加えて、可溶化する工程、およびアルカリ域でサイクロデキストリン合成酵素で糖転移させる工程を包含しており、そのことによって上記目的が達成される。
【０００９】
本発明はまた、澱粉分解活性、糖転移活性、およびサイクロデキストリン合成活性を有し、至適ｐＨが５．０〜６．０、安定ｐＨが６．０〜９．０、およびＳＤＳ−ポリアクリロアミドゲル電気泳動で測定した分子量が約８０，０００である、好アルカリ性バチルス属の菌株Ａ２−５ａ（ＦＥＲＭ Ｐ−１３８６４）から採取された、サイクロデキストリン合成酵素に関し、この酵素を用いることにより、上記目的が達成される。
【００１０】
フラボノイドとは、二つのフェニル基がピラン環あるいは、それに近い構造の三つの炭素原子を介して結合している物質群の総称である。
【００１１】
本発明で使用し得るフラボノイド類は、水に難溶性のすべてのフラボノイド類を包含するが、特にヘスペリジン、エリオシトニン、ナリンギン、ネオヘスペリジン、ルチン、ジオスミン、リナリン、ポンシリン、プルニン、ヘスペレチン−７−グルコシドなどである。
本発明では、フラボノイド類の溶解方法の第１段階として、フラボノイド類がアルカリ域で水に対する溶解性が向上すること、および／またはサイクロデキストリン（以下「ＣＤ」という）との包接化合物を形成することによって可溶化し得る。
【００１２】
第１段階で、アルカリ域およびＣＤを用いる溶解工程を使用する場合、先に、溶液をアルカリ性とし、続いてＣＤを添加し得るが、各工程を同時に進行することもできる。
【００１３】
フラボノイド類は、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化カリウムなどを用いて、アルカリ域で溶解され得る。この時のｐＨは８以上であればよい。好ましくは、ｐＨ８〜１１の範囲であり、より好ましくはｐＨ９〜１０である。
【００１４】
ＣＤは、フラボノイド類と包接化合物を形成することにより、フラボノイド類を可溶化する。ＣＤは、市販のものを用い得るが、デンプンにサイクロデキストリン合成酵素（以下「ＣＧＴａｓｅ」という）すなわち、1,4-α-D-Glucan: 4-α-D-(1,4-glucano)-transferase(E.C. 2.4.1.19)を作用させることによっても形成され得る。ここで生成されるＣＤは、グルコースが６〜８個、α−１，４結合で環状に結合した物質で、グルコースが６，７，８個のものをそれぞれα−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤという。本工程には、α−、β−、およびγ−ＣＤを用いることができるがβ−ＣＤがより好ましい。
【００１５】
ＣＤを用いるフラボノイド類の可溶化は、ＣＤをフラボノイド類と混合し、ホモミキサーなどのホモジナイザーで５，０００〜１０，０００ｒｐｍで、２〜１０分間することで達成され得る。この時、温度は、室温から９０℃までを選択し得るが、好ましくは４０〜９０℃である。６０℃以上では、２００ｒｐｍ、６０分間という弱い撹拌条件でも包接可能である。
【００１６】
第２段階では、ＣＧＴａｓｅを用いて、糖転移を行い、フラボノイド類を配糖化することによって、中和およびＣＤ除去後も沈澱を生じることのない可溶化フラボノイド類の製造を行う。
【００１７】
本発明における、フラボノイド類の配糖体は、ＣＧＴａｓｅによる転移反応を利用して生産される。
【００１８】
本発明に用いる酵素はＣＧＴａｓｅであればいずれのものでも使用し得る。ＣＧＴａｓｅは、澱粉に作用してグルコース６〜８個からなるＣＤを合成する活性の他に、ＣＤおよび澱粉の存在下で適当なアクセプターに作用させると、ＣＤおよび澱粉などがドナーとなって、グルコースをアクセプターに転移する活性を有する。本発明はアルカリ域での反応を有するのでアルカリ域で不安定なものを用いるとフラボノイド配糖体の収量が著しく減少する。従って、アルカリ耐性の酵素を用いる方が好ましい。特に好ましいのは後述の好アルカリ性バチルス属の菌体が生産する耐アルカリ性酵素である。
【００１９】
ここで、アクセプターとは、非還元末端にグルコースを持つ化合物をいい、本発明においてはフラボノイド類のことである。また、ドナーとしてのＣＤは、前記と同様、グルコースが６〜８個、α−１，４結合で環状に結合した物質であり得る。また、本工程ではα−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤの混合物もその単体に換えて合成し得、溶解のために使用し得る。
【００２０】
ＣＧＴａｓｅによる転移反応は、基質と酵素量、反応温度などにより、適宜選択されるが、フラボノイド類に糖転移するときの条件は、アルカリ域で行うこと以外は常法によるものと変わらない。反応温度は、２０〜７５℃であることが好ましい。ドナーの濃度は、０．１〜３０重量％、好ましくは１〜２０重量％である。アクセプターの濃度は、０．１〜５重量％、好ましくは０．５〜２重量％である。本酵素の濃度は、０．１〜１００ユニット／ｍｌとなるようにすることが好ましい。反応時間は酵素活性が持続する限り長いほどよい。反応は１００℃で５分間加熱することにより停止する。
【００２１】
生成されたフラボノイド配糖体は、溶解性が著しく向上しているので、中和あるいは／およびＣＤ除去後も沈澱を生ずることのない可溶性のフラボノイドである。
【００２２】
アルカリ域で高活性を有するＣＧＴａｓｅ
本発明は、またアルカリ域で高活性を保持する新規のＣＧＴａｓｅに関する。このＣＧＴａｓｅを用いることにより、上記フラボノイド類の可溶化が著しく促進される。
【００２３】
以下に、本発明のＣＧＴａｓｅの特性について詳述する。本酵素はアルカリ性の培地で生育する、バチルス属の菌株Ａ２−５ａ（以下「本菌株」という）の培養物から採取し、精製される。本菌株は、本発明者らによって、土壌から分離された新菌株である。本菌株の菌学的性質を以下に示す。なお、特に記載のない限り、培養温度は３０℃、培地のｐＨは１０．３である。
【００２４】
（菌学的性質）
１．形態学的性質
（１）細胞の形および大きさ
（０．４〜０．６）×（２．０〜３．０）μmの桿菌である。
【００２５】
（２）胞子を有する。
【００２６】
（３）グラム染色は陽性である。
【００２７】
２．生育状況
（１）ｐＨ６．８での生育（普通寒天培地）では微弱である。
【００２８】
（２）ｐＨ１０．３での生育は良好である。
【００２９】
３．生理学的性質
（１）カタラーゼの生成は陽性である。
【００３０】
４．運動性
（１）運動性を有する。
【００３１】
以上の結果をバージーのマニュアル第２巻（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ ｍａｎｕａｌｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．２．１９８６）と照合して、本菌株をバチルスに属する細菌と同定した。
【００３２】
（培養条件）
本菌株の培養条件は特別である必要はなく、通常の培地をｐＨ１０に調整したものが用いられる。この培地は例えば、modified II-medium agar plates（K. Horikoshi and T. Akiba, in "Alkalophilic Microorganisms", Japan Scientific Societies Press, Tokyo, 1982, pp.9-10に記載）であり得る。炭素源としては、澱粉、ＣＤ、グルコース、グリセリンおよびスクロースなどを使用し得る。窒素源としては、ポリペプトン、肉エキス、大豆蛋白および総合アミノ酸などを使用し得る。無機塩類としては、ＮａＣｌ、Ｋ2ＨＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4およびＭｇＳＯ4などを使用し得る。その他必要に応じてコーンスティプリカーなどの天然物およびビタミン類などの微量栄養素を加え得る。例えば、１％ＣＤ、０．５％ポリペプトン、０．５％イーストエキストラクト、４％コーンスティプリカー、０．１％Ｋ2ＨＰＯ4、０．０２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１％Ｎａ2ＣＯ3、ｐＨ１０．３の培地が好適に用いられる。
【００３３】
ｐＨ８．５〜１１．０、好ましくはｐＨ９．５〜１０．５、培養温度は２５〜３７℃で１〜７日間、好ましくは３日間好気的に撹拌または、振盪しながら培養を行う。本酵素は菌体外に分泌されるため培地中から回収される。
【００３４】
（本酵素の採取方法）
上記培養液から本酵素を採取、精製するために、既知の精製方法が単独または、併用して用いられ得る。例えば、上記培養液を濾過または、遠心分離にかけて菌体を除去し、濾液または、上清液を得る。この濾液または、上清液を必要に応じて濃縮し、限外濾過または透析を行う。さらに、硫安などにより塩析した後、透析し、次いで、澱粉吸着、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過などを単独または、組み合わせて用いることにより精製を行う。
【００３５】
（酵素の性質）
本酵素は、次の理化学的性質を有する。
【００３６】
１．作用
本酵素はサイクロデキストリン合成酵素に属するもので、サイクロデキストリン合成酵素の持つ３つの活性、つまりサイクロデキストリン合成活性、糖転移活性および澱粉分解活性を有する（S.Kitahama, in "Handbook of Amylase and Related Enzymes", ed. The Amylase Research Society of Japan, 1988, pp.154-164, Pergamon Press.）。
【００３７】
２．力価測定法
（１）サイクロデキストリン合成活性
２．５％可溶性澱粉溶液（２０ｍＭ酢酸バッファーでｐＨ５．５に調整）をあらかじめ４０℃に設定した恒温槽にいれ、次に、この溶液に本酵素を加えて反応を開始させる。６０分間の反応の後、１００℃、５分間の加熱によって反応を停止させる。この反応溶液を５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）で５倍に希釈した後、１０ユニットのグルコアミラーゼで４０℃で１６時間処理した反応液中のＣＤの総量をＨＰＬＣ（Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−４２Ａ）で分析する。
【００３８】
上記の条件で１分間に１マイクロモルのＣＤを生成し得る酵素量をサイクロデキストリン合成活性の１単位とする。
【００３９】
なお、ＨＰＬＣ（Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−４２Ａ）の分析条件は以下のとおりである。
【００４０】
カラム : Aminex HPX-42A (BioRad)
溶出液 : H2O
流速 : 0.4 ml/min
カラム温度 : 80℃
検出法 : RI
（２）糖転移活性
ドナーとして１．２％可溶性澱粉、アクセプターとして０．１％サリシンを含む基質溶液（２０ｍＭ酢酸バッファーでｐＨ５．５に調整）をあらかじめ４０℃に設定した恒温槽にいれ、次いで、この基質溶液に本酵素を加えて反応を開始させる。１０分間の反応の後、１００℃、５分間の加熱によって反応を停止させる。この時、本酵素を添加しないものをブランクとして調製し、同様の操作を行う。この反応溶液を１０ユニットのグルコアミラーゼで４０℃で１６時間処理し、生成したサリシンをＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析する。
【００４１】
配糖化活性は配糖化率で表した。
【００４２】
【数１】
なお、ＨＰＬＣ（ＯＤＳ）の分析条件は以下のとおりである。
【００４４】
カラム : ODS
溶出液 : MeOH/H2O = 25/75
流速 : 0.5 ml/min
カラム温度 : 60℃
検出法 : UV270
（３）澱粉分解活性
１．５％可溶性澱粉溶液（２０ｍＭ酢酸バッファーでｐＨ５．５に調整）を予め４０℃に設定した恒温槽にいれ、次いで、この溶液に本酵素を加えて反応を開始させる。１０分間の反応の後、この反応溶液（０．２５ｍｌ）に０．５ｍｌの０．５Ｎ ＨＣｌ（５：１、ｖ／ｖ）溶液を添加し反応を停止させる。この反応液０．１ｍｌをとり、０．００５％Ｉ2および０．０５％ＫＩを含有する溶液を加え、撹拌し室温に２０分間放置する。この溶液の６６０ｎｍにおける吸光度を測定する（この値をＡとする）。このとき本酵素を添加しないものをブランクとして調製し、同様の操作を行う（この値をＢとする）。
【００４５】
【数２】
上記の式より得られる値をもって、澱粉分解活性の１単位とする。
【００４７】
３．至適ｐＨおよび安定ｐＨ
可溶化澱粉に本酵素を作用させたときのサイクロデキストリン合成活性、可溶性澱粉をドナーとし、サリシンをアクセプターとしたときの糖転移活性、および可溶性澱粉を基質としたときの加水分解活性の至適ｐＨはそれぞれｐＨ５．０〜６．０である。本発明の酵素は、図１に示すように、ｐＨ９．０以上で至適ｐＨにおける活性の約５０％を保持している。すなわち、本酵素はアルカリ域で安定である。安定ｐＨの測定は、本酵素をＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ２−１３）を用いてそれぞれ所望のｐＨに調整し、４０℃で２時間静置し、その後、酢酸バッファーを用いてｐＨ５．５に戻し、澱粉分解活性を測定し、その残存活性を求めた。至適ｐＨ５．５での酵素活性を１００として図２に示す。これによれば、本酵素の安定ｐＨは、６．０〜９．０であり、ｐＨ５．０、ｐＨ１０．０でも至適ｐＨの約８０％の活性を保持している。
【００４８】
４．作用適温の範囲
本酵素の澱粉分解活性に対する温度の効果を検討するために種々の温度での澱粉分解活性を測定した。図３に示す結果は、本酵素の至適温度が５０〜５５℃であることを示している。また、本酵素の安定性に対する温度の効果を検討するために、溶液のｐＨを考慮の上、種々の温度での澱粉分解活性を測定した。測定は、本酵素をＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．５、７．０および１０．０）中で、１０分間、種々の温度でインキュベートし、上記ヨウ素法によって澱粉分解活性を測定した。図４に示すように、ｐＨ７．０において３０〜５５℃で安定した活性を有し、１ｍＭ ＣａＣｌ2の添加により至適温度は約５℃向上し、７０℃でも至適温度時の約６０％の活性を保持する。
【００４９】
５．失活の条件
１００℃において１５分間処理すると完全に失活する。
【００５０】
６．精製方法
培養液から菌体を除去した培養上清に澱粉を加え、４℃で１６時間撹拌する。これをカラムにつめ、カラムを洗浄した後、３３ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4で本酵素を溶出する。次いで、溶出液をＱ−セファロースカラムにかけ、０．４Ｍ ＮａＣｌでカラムを洗浄した後、０．４〜１Ｍ ＮａＣｌで溶出し、活性画分を収集し、精製酵素とする。この画分は、ＳＤＳ−ポリアクリロアミドゲル電気泳動を行うと、図５に示すように単一バンドを示す。
【００５１】
７．分子量
精製したＣＧＴａｓｅの分子量は図５に示すように、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動においては、約８０，０００、またゲル濾過（ＨＰＬＣ）をＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷカラム（東ソー）を使用し、０．３Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸緩衝液を用いて４０℃、流速０．７ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、２８０ｎｍの吸収で検出した。これにより求められた分子量は、図６に示すように、約７０，０００である。
【００５２】
【実施例】
（実施例１）
ドナーとして試験区１に可溶性澱粉、試験区２にα−ＣＤ、試験区３にβ−ＣＤ、試験区４にγ−ＣＤ、および試験区５にＫ−１００（α−ＣＤおよびβ−ＣＤの混合物；α−ＣＤ：β−ＣＤ＝２：１）を用い、各ドナーをそれぞれ５重量％、およびアクセプターとしてのヘスペリジンを０．５重量％含有する溶液を塩酸でｐＨ５に調整した基質溶液を調製した。また、ドナーとして試験区６に可溶性澱粉、試験区７にα−ＣＤ、試験区８にβ−ＣＤ、試験区９にγ−ＣＤ、および試験区１０にＫ−１００を用い、各ドナーをそれぞれ５重量％、およびアクセプターとしてヘスペリジンを０．５重量％含有する溶液をＮａＯＨでｐＨ１０に調整し、ヘスペリジンを可溶化した基質溶液を調製した。これら試験区１〜１０の基質溶液を予め３７℃に設定した恒温槽にいれ、次いで、この反応溶液にＣＧＴａｓｅを２ユニット／ｍｌとなるように加えて反応を開始させた。１６時間の反応の後、１００℃、５分間の加熱によって反応を停止させた。この時それぞれの試験区に対してＣＧＴａｓｅを添加しないものをブランクとして調製し、同様の操作を行った。これらの反応溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析したところ、表１および２の結果を得た。
【００５３】
なお、ＨＰＬＣ（ＯＤＳ）の分析条件は以下のとおりである。
【００５４】
カラム : ODS
溶出液 : AcCN/Pi buffer* = 20/80
流速 : 0.5 ml/min
カラム温度 : 40℃
検出法 : UV280
* : Pi bufferは、39mM KH2PO4,1mM Na2HPO4を含有する。
【００５５】
【表１】
【表２】
表１よりヘスペリジンの可溶化にはｐＨ５およびｐＨ１０においてＣＤが効果があること、その中でもβ−ＣＤが優れていること（ｐＨ５では試験区１の８．４倍の溶解度、ｐＨ１０では１４．５倍の溶解度）、更に、アルカリ域が有利であること（ドナーが同じであればｐＨ１０の方が２〜４倍溶解度が向上）、また、アルカリ域でＣＤに包接させることにより溶解度が増すこと（試験区８〜１０）が明かである。
【００５８】
表２よりヘスペリジンの配糖化には可溶化と同様に、アルカリ域が有利であること（ｐＨ５ではＣＤを用いても試験区１の１．５倍程度であるが、ｐＨ１０では３〜５倍であった）、また、アルカリ域でＣＤを包接させるとより配糖体量が増すこと（試験区８、９では試験区１の５倍以上）が明かである。また、ＣＤの利用はフラボノイド類を包接し、可溶化するばかりでなく、糖のドナーとしても利用される。
【００５９】
（実施例２）
試験区１では、ドナーとして可溶性澱粉を５重量％、アクセプターとしてヘスペリジンを０．５重量％を包含する溶液を、塩酸でｐＨ５に調整した基質溶液を調製した。また、試験区２では可溶性澱粉とα−ＣＤ、試験区３では可溶性澱粉とβ−ＣＤ、試験区４では可溶性澱粉とγ−ＣＤ、試験区５では可溶性澱粉とＫ−１００をドナーとして用い、それぞれ２．５重量％ずつ含有し、アクセプターとしてヘスペリジンを０．５重量％含有する溶液を水酸化ナトリウムでｐＨ１０に調整することによって、ヘスペリジンを可溶化した。これらの基質溶液を予め３７℃に設定しておいた恒温槽にいれ、次いで、この反応溶液にＣＧＴａｓｅを５ユニット／ｍｌとなるように加えて反応を開始させた。１６時間の反応の後、１００℃、５分間の加熱によって反応を停止させた。この時それぞれの試験区に対してＣＧＴａｓｅを添加しないものをブランクとして調製し、同様の操作を行った。これらの反応溶液を実施例１と同じＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析したところ、表３の結果を得た。
【００６０】
【表３】
表３および実施例１の表２より、ヘスペリジンの可溶化にはドナーとして可溶性澱粉とＣＤとを混合して用いてもその重量％が同じであれば、それぞれ単独で用いた場合と同程度の結果が得られた。更に、可溶性澱粉とα−ＣＤまたはβ−ＣＤとの組み合わせではヘスペリジングルコサイドの生成量はやや増加する傾向にあった。
【００６２】
（実施例３）
ドナーとして可溶性澱粉を５重量％、アクセプターとしてヘスペリジンを０．１重量％を包含する溶液を、水酸化ナトリウムでｐＨ１０に調整してヘスペリジンを可溶化した。この基質溶液を予め３７℃に設定しておいた恒温槽にいれ、次いで、この反応溶液にＣＧＴａｓｅを１ユニット／ｍｌとなるように加えて反応を開始させた。１６時間の反応の後、１００℃、５分間の加熱によって反応を停止させた。この反応溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析したところ（分析条件は実施例１に同じ）、ヘスペリジンにグルコースが１〜１０個付加された化合物が確認された。また、1,4-α-D-Glucan glucohydrolase(E.C. 3.2.1.3.)（以下「グルコアミラーゼ」という）処理（３７℃で３時間反応）によりヘスペリジン（ヘスペリジンのアグリコン）とグルコースとを生ずることからこの結合はα１，４−結合であることが解った。また、これらの配糖体の収量は７４．５％であった。
【００６３】
（実施例４）
ドナーとして可溶性澱粉を５重量％、アクセプターとして難溶性フラボノイドであるジオスミン、ナリンジン、ネオヘスペリジンおよびルチンをそれぞれ０．１重量％を包含する溶液を、水酸化ナトリウムでｐＨ９に調整して可溶化した。この基質溶液を予め３７℃に設定しておいた恒温槽にいれ、次いで、この反応溶液にＣＧＴａｓｅを１ユニット／ｍｌとなるように加えて反応を開始させた。１６時間の反応の後、１００℃、５分間の加熱によって反応を停止させた。この反応溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析したところ（分析条件は実施例１に同じ）、それぞれの難溶性フラボノイドにグルコースが１〜１０個付加された配糖化物が確認された。また、これらの配糖化物の収量はジオスミンは７３．４％、ナリンジンは３９．１％、ネオヘスペリジンは３９．０％、ルチンは６４．５％であった。
【００６４】
【発明の効果】
本発明では、水に難溶性のフラボノイド類を、ｐＨ８以上のアルカリ域で、あるいは／およびサイクロデキストリンを加えて、可溶化し、さらにサイクロデキストリン合成酵素を用いて、フラボノイド類を効率よく、水に可溶化する方法を開発した。さらに、本発明では、アルカリ域で、サイクロデキストリン合成、糖転移および澱粉分解の高い活性を有するサイクロデキストリン合成酵素を提供した。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のサイクロデキストリン合成酵素のサイクロデキストリン合成活性、澱粉分解活性および転移活性に対するｐＨの効果を示す。ここで、●はサイクロデキストリン合成活性、○は糖転移活性、および▲は澱粉分解活性を表す。
【図２】本発明のサイクロデキストリン合成酵素の安定性に対するｐＨの効果を示す。縦軸の活性値は、澱粉分解活性を測定し、至適ｐＨ（本酵素においてはｐＨ５．５）の活性を１００％として相対値で表す。
【図３】本発明のサイクロデキストリン合成酵素の澱粉分解活性に対する温度の効果を示す。縦軸の活性値は至適温度である５０〜５５℃での平均活性を１００％として相対値で表す。
【図４】本発明のサイクロデキストリン合成酵素の安定性に対する温度の効果を示す。縦軸の活性値は、澱粉分解活性を測定し、至適温度での活性を１００％として相対値で表す。ここで、△はＣａＣｌ2非存在下、ｐＨ５．５での酵素活性、▲はＣａＣｌ2非存在下、ｐＨ１０．０での酵素活性、○はＣａＣｌ2非存在下、ｐＨ７．０での酵素活性、および●はＣａＣｌ2存在下、ｐＨ７．０での酵素活性を表す。
【図５】本発明のサイクロデキストリン合成酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ここで、Ｅは、精製したＣＧＴａｓｅ、Ｍは、マーカー蛋白質；ミオシン（分子量２００，０００）、Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（分子量１１６，２５０）、家兎筋ホスホリラーゼｂ（分子量９７，４００）、ウシ血清アルブミン（分子量６６，２００）、および鶏卵白アルブミン（分子量４５，０００）である。
【図６】本発明のサイクロデキストリン合成酵素のゲル濾過（ＨＰＬＣ）時の保有時間と溶出する分子の分子量を示す。●はサイクロデキストリン合成酵素を表す。
○1〜○5は以下のマーカー蛋白質を表す。
○1：酵母グルタメートデヒドロゲナーゼ （分子量２９０，０００）
○2：ブタ心臓ラクテートデヒドロゲナーゼ（分子量１４２，０００）
○3：酵母エノラーゼ （分子量 ６７，０００）
○4：酵母アデニレートキナーゼ （分子量 ３２，０００）
○5：馬心臓チトクロームＣ （分子量 １２，４００）
Claims (3)
- 糖質およびフラボノイド類に対し、澱粉分解活性、糖転移活性、およびサイクロデキストリン合成活性を有し、至適ｐＨが５．０〜６．０、安定ｐＨが６．０〜９．０、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した分子量が約８０，０００である、好アルカリ性バチルス属の菌株Ａ２−５ａ（ＦＥＲＭ Ｐ−１３８６４）から採取された、サイクロデキストリン合成酵素。
- 可溶性のフラボノイド配糖体の製造方法であって：
フラボノイド類をｐＨ８以上のアルカリ域で、あるいは／およびサイクロデキストリンを加えて、可溶化する工程；および
該サイクロデキストリンまたは澱粉の存在下で、該アルカリ域でサイクロデキストリン合成酵素で糖転移させる工程；
を包含し、該サイクロデキストリン合成酵素が、請求項１に記載のサイクロデキストリン合成酵素である、製造方法。 - 前記フラボノイド類がヘスペリジン、エリオシトリン、ナリンギン、ネオヘスペリジン、ジオスミン、リナリン、ポンシリン、プルニン、ヘスペレチン-7-グルコシド、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２に記載の製造方法。
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