KR950014592B1

KR950014592B1 - 화장료용 유산균제재

Info

Publication number: KR950014592B1
Application number: KR1019910018556A
Authority: KR
Inventors: 이호; 양승각
Original assignee: 주식회사태평양; 이능희
Priority date: 1991-10-22
Filing date: 1991-10-22
Publication date: 1995-12-11
Also published as: KR930007435A; JPH0714852B2; FR2682596B1; JPH05201828A; US5324515A; FR2682596A1

Abstract

내용 없음.

Description

화장료용 유산균제재

제1도는 본 발명에 따른 화장료용 유산균제재가 세포의 손상된 DNA의 리페어 기능을 활성화시키는 효과를 나타낸 것이다.

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

1 : 실시예 1의 파쇄액과 추출액의 2 : 1 혼합물

2 : 실시예 1의 파쇄액과 추출액의 1 : 1 혼합물

3 : 실시예1의 파쇄액과 추출액의 1 : 2 혼합물

4 : 실시예 2 의 파쇄액과 추출액의 2 : 1 혼합물

5 : 실시예 3 의 파쇄액과 추출액의 2 : 1 혼합물

6 : 시료 처리를 하지 않은 경우(대조군)

본 발명은 탈지유, 탈지분유, 또는 MRS 브로스(MRS broth) 배지, 로고사(Rogosa)브로스 배지등의 공지의 유산균 배지에 유산균을 첨가하여 배양한 세포(유산균체)를 회수하고, 회수된 세포를 세척하여 연속적으로 파쇄하고 원심 분리한 다음, 그 상등액을 취하여 그를 파쇄액으로 하고, 침전되는 셀 펠릿(Cell pellet)을 추출하여 추출액을 얻은 다음, 상기 파쇄액과 추출액을 여과하여 얻어낸 각각의 여액을 혼합한 혼합물을 함유하는 화장료용 유산균제재에 관한 것으로서, 이와 같은 유산균 제재는 활성 산소류의 소거효과가 높고, 티미딘 이량체(thymidin dimer)를 제거시키며, 세포의 손상된 DNA 수복기능을 활성화시키는 효과가 뛰어나다.

최근 세포에 대한 연구가 진척되어감에 따라 기능성 화장품에 대한 관심이 고조되고 있는데 기능성 화장품의 원료개발에 있어서 중요한 측면중의 하나는 활성 산소류의 소거이다.

활성 산소류의 작용은 지질 과산화, 단백질 변성, 핵산의 돌연변이 유발등을 기본으로 하고 있으며 이와같은 활성 산소류의 작용은 노화, 발암의 근원적 원인이 되고 있으며(Leibvitz B.E.＆ Siegel B.W, 1980, J Gerontol 35 : 45), 생체의 염증반응(William F.P et al, Proc Natl Acad Sci USA 77 : 1159 1980) 및 각종 질환과 관련되어 있다(Chikako Nishigen M.D et al, J invest. Derma 1989).

기본적으로 활성 산소는¹O₂, OH, O₂, H₂O₂등이 있으며, 이외에도 반응부산물인ROO·, RO· 등을 포함하고 있다. 이들은 생체내에서 면역기능, 생체방어, 생리활성물질 생합성등의 중요한 역할을 담당하지만 자외선, 방사선, 공해 및 각종 스트레스에 의해 과잉 생성될 경우 생체에 손상을 가져온다.

생체는 기본적으로 이들에 대한 방어 시스템(슈퍼록사이드 디스뮤타제 : SOD, 카타라제, 글루타치온 퍼록시다제)이 마련되어 있으나 노화가 시작되면 방어능이 떨어지고 각종 활성 산소류에 대한 피부 보호 능력이 멀어지게 된다. 따라서 활성 산소류를 제거해줄 필요성이 대두되어 SOD, 락토페린등이 사용 내지 개발되어 오고 있다.

하지만 SOD는 효소단백질이므로 지질에 대해 난용성이며, 안정성이 나쁘고 피부로의 투과성이 낮다는 문제가 있다. 또한, 락토페린은 우유로부터의 복잡한 추출공정을 거쳐야 한다는 단점이 있다.

한편, 활성 산소 제거와 관련해서 화장품 개발에 있어서 주목되고 있는 측면은 손상된 DNA의 리페어(repair) 기능을 활성화하는 것이다.

DNA는 생체내 기능정보를 가지고 있으면서 생명현상과 관련된 중요기능을 수행하고 있으며, 항상 외부로부터 손상위험에 노출되어 있으나, 생체는 리페어 시스템(repair system)이 존재해서 이러한 위험으로부터 보호되고 있다.

그러나, 노화 및 외부로부터의 지속적인 자극은 이런 회복기능을 저하시키며 이는 세포의 노화촉진, 암화, 기타 여러 가지 질병을 야기시킨다(V. A Bohr et al, 1989, laboratory investlgation 6l(2) : 143).

특히 UV으로부터의 과도한 노출은 티미딘 이량체를 형성케 하고, 이는 세포파괴 혹은 유전적 기능의 상실을 유발시키는 직접적인 원인이 된다.

이러한 측면에서 식물추출액, 프라센타 추출액, 방선균 추출액 기타 항돌연변이제들이 개발되고 있으나 방선균 추출액 및 식물 유래의 물질은 동물성보다 친화성이 낮고, 부작용을 유발시키며 프라센타 추출액은 생산성이 제한적이다.

본 출원인은 이미 기능성 화장품의 원료 개발에 노력하여, 탈지유로부터 보습효과가 뛰어난 화장품 원료를 얻어낼 수 있음을 밝혀내었고(대한민국 특허출원 제79-1389호). 또한 탈지유 또는 탈지분유에 금속이온과 단백질 분해효소 및 유산균을 첨가하여 배양한 후 유산균을 분리하고 특정의 처리를 하면 보습 효과와 유해산소 소거 효과가 뛰어난 화장품 원료를 얻어낼 수 있음을 밝혀낸 바 있다(대한민국 특허출원 제90-6419호) 그러나 이와 같은 화장품 원료들은 손상된 DNA의 리페어 기능의 활성화가 미흡하며, 특히 특허출원 제90-6419호에 기재된 화장료용 유산균 배양액의 제조 과정에서는 분리된 유산균을 파쇄한 액중 상등액만을 취하기 때문에 비경제적이며 그 효과면에서도 불충분한 면이 없지 않다.

따라서 본 발명의 목적은 안정한 저분자로서 피부와 친화성이 높고 부작용이 없는 물질로서 활성 산소 제거기능이 높고, 티미딘 이량체를 제거시키며, DNA 리페어 기능을 활성화시켜 주는 효과를 갖는 물질을 개발하는 것이다.

이와같은 목적을 달성하기 위해서 연구한 결과, 탈지유, 탈지분유, 또는 MRS 브로스 배지, 로고사 브로스 배지등의 공지의 유산균 배지에 유산균을 첨가하여 배양한 세포(유산균체)를 회수하고, 회수된 세포를 세척하여 연속적으로 파쇄하고 원심 분리한 다음, 그 상등액을 취한 파쇄액과, 침전되는 셀 펠릿을 추출한 추출액이 활성 산소 소거효과가 높고, 티미딘 이량체를 제거시키며, DNA 리페어 기능을 활성화시키는 효과가 뛰어남을 알아내어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 탈지유, 탈지분유, 또는 MRS 브로스 배지, 로고사 브로스 배지등의 공지의 유산균 배지에 유산균을 첨가하여 배양한 세포(유산균체)를 회수하고, 회수된 세포를 세척하여 연속적으로 파쇄하고 원심분리한 다음, 그 상등액을 취하여 그를 파쇄액으로 하고, 침전되는 셀 펠릿을 추출하여 추출액을 얻은 다음, 상기 파쇄액과 추출액을 여과하여 얻어낸 각각의 여액의 혼합물을 함유하는 화장로용 유산균제재에 관한 것이다.

본 발명의 화장료용 유산균 제재에 대해 상세히 기술하면 아래와 같다.

본 발명에서 유산균 제재는 인체의 장내에 상재하면서 인체에 유익한 활동을 하고 있는 유산균을 탈지유, 탈지분유, 또는 MRS 브로스 배지, 로고사 브로스 배지등의 공지의 유산균 배지에서 대량 배양하고 여기서 얻은 균체를 파쇄하여 그 상등액을 취한 파쇄액과, 침전되는 셀 펠릿을 물 또는 용매 추출한 추출액으로부터 얻을 수 있다.

본 발명에서의 유산균 제재라 함은 균체를 파쇄한 파쇄 상등액의 여액과 침전되는 셀 펠릿을 물 또는 용매 추출하여 얻은 추출액의 여액과의 혼합물을 의미 한다.

본 발명에 사용되는 유산균은 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus)를 포함하는 락토바실러스(Lactobacillus)와 스트렙토코커스(Streptococcus)에 속하는 유산균이다.

본 발명을 더욱 구체적으로 상술하면 다음과 같다.

탈지유, 탈지분유 또는 유산균용 배지를 멸균한 뒤 유산균을 1∼5%되게 접종시키고 35∼45℃에서 20∼50시간 발효시킨 후 원심분리(6000g, 30분)하여서 유산균 균체를 얻고 이것을 생리 식염수(0.9% NaCL) 또는 50mM 인산칼륨 완충액(potassium phosphate buffer, pH7.5)로서 수회 세척한다. 세척된 균체는 다이노 밀(Dyno Mil1)을 이용(직경 0.lmm의 glass bead, 3000 rpm)하거나 문헌에 기재된 방법(Brian Austin et al, 1981, Manual of methods for general bacteriology published by ASM)에 의해 파쇄시킨다. 파쇄된 현탁액은 원심분리(15000g, 30분)를 통하여 상등액을 얻어서 이를 파쇄액으로 한다. 침전된 셀 펠릿은 수거해서 건조중량의 20∼50배의 물 또는 적당히 희석한 에탄올, 메탄올등의 극성 유기용매를 가해서 실온에 방치하거나(2∼5일), 가열추출(30분∼3시간)하여 추출액을 얻는다. 이들 파쇄액과 추출액을 분자량 한계 10000달톤(dalton)의 울트라 필터(ultra filter)를 통과시켜서 여액을 얻고 각각의 여액을 일정 혼합비로 혼합한다.

이렇게 하여 얻은 유산균 제재는 활성 산소 소거 효과, 티미딘 이량체 제거 효과, 및 세포의 손상된 DNA 리페어 기능을 활성화시키는 효과가 뛰어나다.

이와 같은 파쇄액의 여액 및 추출액의 여액의 혼합물은 단독으로 사용할 수 있고, 활성 산소류의 소거 효과를 더욱 높이기 위해서 여기에 만니톨, 플라보노이드등의 저분자 환성 산소류 소거제를 첨가하여 사용할수도 있다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.

[실시예 1]

10% 탈지분유 1ι에 중성 프로테아제 1종(역가 8000(pu) cas.f.r/g)을 1.0% 첨가하여 45℃에서 30분간 반응시켜 만든 배지를 공지의 방법으로 멸균한 뒤, 냉각시키고 락토바실러스 불가리커스(L. bulgaricus)를 접종하여 40℃ 부근에서 48시간 배양시킨 후 원심분리(6000g, 20분)하여 세포를 회수한다.

회수된 세포는 0.9% NaCL 용액에 10%의 농도로서 현탁한 뒤 다이노밀(3000r. p .m, 직경 0.lmm glass bead)로써 3ι/hr되게 연속적으로 파쇄시킨다. 파쇄된 현탁액은 원심분리(15000g, 30분)하여 그 상등액을 취하여 파쇄액을 얻고, 침전된 셀 펠릿을 회수해서 건조중량의 20배의 물을 가해서 끓는 물에서 3시간 동안추출하여 추출액을 얻는다. 얻어진 파쇄액과 추출액을 각각 분자량 한계 10,000달톤의 울트라필터(NMWC 10000)를 통과시켜 각각 250ml, 150m1의 여액을 얻는다.

[실시예 2]

MRS 브로스 배지에 스트렙토코커스 써모필터스(s.thermophilus)를 접종한 뒤 실시예1과 같은 조건하에서 파쇄액을 얻고, 침전된 셀 펠릿을 건조 중량의 30배의 70% 에탄올을 가해서 끓는 물에서 2시간 동안 추출하여 추출액을 얻는다. 파쇄액 및 추출액을 실시예1과 같이 여과해서 각각 200ml, 80m1의 여액을 얻는다.

[실시예 3]

로고사 브로스 배지에 락토바실러스 헬버티커스(L. helveticus)를 접종한 뒤 실시예1과 같은 조건하에서 파쇄액을 얻고 침전된 셀 펠릿을 건조 중량의 30배의 50% 메탄올을 가해서 실온에서 3일간 방치하여 추출액을 얻는다. 파쇄액 및 추출액을 실시예1과 같이 여과해서 각각 180ml, 120ml의 여액을 얻는다.

[비교예]

15% 탈지분유 중성 프로테아제 1종(역가 7000(pu)cas.f.f/g)을 3.0% 첨가시켜 40℃에서 2시간 반응시킨 후멸균하고, 락토바실러스 불가리커스(L bulgaricus)를 3.0% 접종시켜 40℃ 부근에서 35시간 발효 후 원심분리를 통해(6000g, 10분) 상등액을 얻고 회수된 Cel1 50mM를 인산칼륨 완충액(pH7.3) 속에서 20000lb/㎡ 압력으로 French pressure cel1을 통해 파쇄시키고 원심분리를 통해(6000g, 10분) 상등액을 얻어서 전의 상등액과 혼합한 후 분자량 한계 10,000달톤의 울트라필터(NMWC 10000UF)를 통과시켜 여액 1ι를 얻는다.

[시험예. 1]

실시예 1,2,3에서 얻은 파쇄액과 추출액을 각각 1:1, 1:2 및 2:1의 혼합물로 혼합하여 얻은 혼합물과 비교예에서 얻은 상등액(파쇄액)에 대해서 다음의 시험법에 의해서 슈퍼록사이드 애니온 라디칼의 소거 효과를 측정하였다.

슈퍼록사이드 애니온 라디칼(superoxide anion radical)을 소거하는 효과는 잔틴옥시다제(xanthin oxidase)를 이용한 효소 측정법에 의해 측정한다.

0.5M 인산칼륨(potassium phosphate) 완충액 200㎕

16% 트리톤(triton) X-100 100㎕

10mM E.D.T.A 10㎕

1.2mM NTC 300㎕

XOD(lUnit/ml) 10㎕

이상의 시약을 혼합하고 시료를 200㎕ 넣은 뒤 하이포잔틴(hypoxanthin) 100㎕를 가한 다음 소량의 물을 넣고 37℃에서 20분간 반응시킨다. 반응종로 후에 A₅₄₀에서 흡광도를 측정하고 생성된 슈퍼록사이드 라디칼을 50% 저해하는 SOD 활성을 1unit로 잡는다 측정치는 2번 반복한 실험결과를 평균한다.

상기 시험의 결과를 표1에 나타내었다.

[표 1]

O₂ ^-소거효과

a : NTC의 환원에 대한 저해율

b : 1Unit ; O^- ₂를 50% 저해하는데 필요한 SOD의 양(1Unit=150ng)

파쇄액과 추출액의 혼합물은 각각 높은 활성을 나타내었고 특히 2 : 1의 혼합물은 상승효과를 나타내었다.

[시험예. 2]

시험예1에서와 같은 시료에 대해서 다음의 시험법에 의해서 손상된 DNA의 수복활성 효과를 측정하였다.

동물 세포에 자외선을 조사해서 생성된 티미딘 이량체는 자체내 수복 기구에 의해서 리페어되는데, 리페어 기능이 높을수록 티미딘 흡수율이 증가한다. 이 흡수율을 측정하는 것을 UDS(unscheduled DNA synthe-sis)라 하고 그 방법은 아래와 같다.

사람의 상피세포에서 그래스 커버슬립(glass coverslip)을 이용하여 분리한 케라티노사이트(keratinocyte)를 KGM 배지에서 24시간 배양시킨다. 배양된 세포는 필립스 G15 T8 저미사이달 벌브(germicidal bulb)로서 10J/㎡되게 10분간 조사하고 2.5mM 하이드록시우레아(hydroxyurea)와 10㎕ Ci/m1³H-티미딘을 넣어서 3시간 동안 배양한다. 이때 시료를 넣고 대조군은 넣지 않는다. 0.lmM 냉 티미딘을 가해서 1시간뒤 세포를 고정하고 코니카(Konica) NR-M₂에멀전으로 코우팅한다. 4℃에서 1주일간 방치한 뒤 짐사(giemsa) 용액으로 염색하고 리퀴드-신틸레이션 스펙트로스코피(iquid-scintillation spectros-copy)로서 검출한다. UDS는 100개의 비 S상의 핵(non S phase nuclei)에서의 그레인(grain)수를 카운팅하여 측정한다. 측정치는 3번 반복한 실험결과를 평균한다.

상기 시험의 결과를 제1도에 나타내었다. 제1도에 나타난 바와 같이, 본 발명의 유산균 제재인 실시예1,2,3의 파쇄액과 추출액의 혼합물은 각각 좋은 효과를 나타내었다.

Claims

탈지유, 탈지분유, 또는 MRS 브로스 배지, 로고사(Rogosa) 브로스 배지 등의 공지의 유산균 배지에 유산균을 첨가하여 배양한 세포(유산균제)를 회수하고, 회수된 세포를 생리 식염수 또는 인산칼륨 완충액으로 세척하여 연속적으로 파쇄하고 원심 분리한 다음, 그 상등액을 취하여 그를 파쇄액으로 하고, 침전되는 셀 펠릿(Cell pellet)을 추출하여 추출액을 얻은 다음, 상기 파쇄액과 추출액을 여과하여 얻어낸 각각의 여액을 혼합한 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 화장료용 유산균 제재.
제1항에 있어서, 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus)와 스트렙토코커스(streptococcus)에 속하는 유산균인 것을 특징으로 하는 화장료용 유산균 제재.
제1항에 있어서, 추출액은 셀 펠릿을 물, 또는 메탄올, 에탄올 등의 극성이 높은 유기 용매의 희석액으로 추출한 것임을 특징으로 하는 화장료용 유산균 제재.
제1항에 있어서, 파쇄액 및 추출액의 여액은 각각 분자량 한계 10,000달톤의 울트라 필터를 통과시켜 여과한 다음 얻어낸 것임을 특징으로 하는 화장료용 유산균 제재.
제1항에 있어서, 만니톨, 플라보노이드 등의 저분자 활성산소류 소거제가 추가로 함유되어 있음을 특징으로 하는 화장료용 유산균제재.