CN1158637A

CN1158637A - 改进的清洁组合物

Info

Publication number: CN1158637A
Application number: CN95194852A
Authority: CN
Inventors: 克里斯托弗·C·巴内特; 科林·米钦森; 斯科特·D·鲍尔
Original assignee: GENECOR INTERNATIONAL Inc
Current assignee: GENECOR INTERNATIONAL Inc; Danisco US Inc
Priority date: 1994-08-11
Filing date: 1995-08-09
Publication date: 1997-09-03
Also published as: EP0775201A2; FI970563A; AU686007B2; PL318209A1; KR970704872A; FI970563A0; NZ291984A; NO970609L; HUT77748A; AU3366295A; NO970609D0; JPH10504197A; MX9700776A; BR9508582A; CA2197203A1; WO1996005295A2; WO1996005295A3; CO4440440A1

Abstract

本发明公开了由天然存在的或重组的α-淀粉酶DNA序列而衍生的新的α-淀粉酶突变体。这些突变型α-淀粉酶一般通过对编码天然存在的或重组的α-淀粉酶DNA序列的前体进行体外修饰而得到，这些体外修饰使得前体α-淀粉酶氨基酸序列中的一个或多个易氧化氨基酸残基发生取代(置换)或缺失。这些突变型α-淀粉酶与其前体相比，改变了氧化稳定性和/或改变了pH特性范围和/或改变了热稳定性。本发明还公开了含有这种淀粉酶的洗涤剂和淀粉液化组合物，以及使用这种淀粉酶的方法。尤为优选的是对来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶的MET197或MET15或者TRP138位点的残基、或者其它微生物来源(芽孢杆菌，曲霉)的α-淀粉酶相应位点进行修饰的α-淀粉酶突变体。

Description

改进的清洁组合物

发明领域

本发明涉及具有非天然的氨基酸序列的新的α-淀粉酶突变体，这些突变体的氨基酸序列中其前体α-淀粉酶的一个或多个残基，特别是易氧化的氨基酸残基，被其它氨基酸所取代。本发明的突变酶具有改变的稳定性/活性特点，包括但不限于改变的氧化稳定性、改变的pH特性范围、改变的特异活性和/或热稳定性。

发明背景

α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)大多随机地水解淀粉的内α-1，4-糖苷键，产生小分子量的麦芽糖糊精。α-淀粉酶具有相当的商业价值，被用于淀粉加工的初始阶段(液化)；用于酒精生产；用作为洗涤剂基质中的清洁剂；以及用于纺织工业中的淀粉脱浆工艺。α-淀粉酶产生于包括芽孢杆菌属和曲霉菌属在内的广泛的微生物，而大多数商业淀粉酶产自如地衣芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，或嗜热脂肪芽孢杆菌等细菌。近年来，因其热稳定性及其至少在中性和弱碱性的pH特性范围，商业用途上优选的酶一直是来自地衣芽孢杆菌。

先前已有的研究利用DNA重组技术揭示对于淀粉酶的催化活性重要的残基和/或揭示不同淀粉酶活性位点中特定氨基酸的修饰效果(Vihine，M.etal.(1990)J.Bichem.107；267-272；Holm，L.etal.(1990)Protein Engineering 3：181-191；Takase，K.etal.(1992)Biochemica et Biphysica Acta，1120：281-288；Matsui，I.et al.(1992)Febs Letters Vol.310，No.3 pp.216-218)；以及揭示对于热稳定性重要的残基(Suzuki，Y.et al.(1989)J.Biol.Chem.264：18933-18938)；一个小组利用这种方法在一地衣芽孢杆菌淀粉酶的不同的组氨酸位点诱导突变，在组氨酸残基进行取代的基本原理是，相比较其它类似的芽孢杆菌属的淀粉酶，地衣芽孢杆菌的淀粉酶(已知是热稳定的)具有更多的组氨酸，因而，提示我们置换组氨酸可能会影响该酶的热稳定性(Declerck，N.et al.(1990)J.Biol.Chem.265：15481-15488；FR 2 665178-Al；Joyet，P.et al.(1992)Bio/Technology 10：1579-1583)。

现已发现α-淀粉酶在pH值4-10.5的条件下被过氧化氢和其它氧化剂作用而失活，如本文实施例中所描述的。商业上，α-淀粉酶可以用于极为不同的条件下，如根据其商业应用，既可以用于高pH又可以用于低pH条件。例如，α-淀粉酶可以用于淀粉液化这样的优选低pH(pH＜5.5)条件的操作工艺。另一方面，淀粉酶可用于商业上洗碗或洗衣用洗涤剂中，其常含有如漂白粉或过酸，且使用于极为碱性的条件下。

为了改变在不同条件下淀粉酶的稳定性与活性，人们发现选择性地置换、取代或缺失易氧化的氨基酸，如甲硫氨酸，色氨酸，酪氨酸，组氨酸或半胱氨酸，与前体相比较会导致突变酶的特性变化。因为现有商业可得的淀粉酶在不同条件下是不可取(不稳定)的，所以需要一种具有改变的稳定性和/或活性的淀粉酶。这种改变的稳定性(氧化性、温度或pH特性范围)，与野生型或前体酶相比，能够在保持足够的酶活性的同时达到。这种由于引入此类突变而产生的特性可以是在保持热稳定性的同时氧化稳定性的变化，或者反过来。此外，在前体淀粉酶序列中以不同的氨基酸取代易氧化的氨基酸或者缺失一个或多个易氧化的氨基酸，可以导致在某一并非对于前体α-淀粉酶来说最优化的pH值下改变的酶活性。换言之，本发明的突变酶由于增强了其氧化稳定性，该酶还可具有改变的pH特性范围。

发明概述

本发明涉及新的α-淀粉酶突变体，它是编码一种α-淀粉酶的突变DNA序列的表达产物。该突变DNA序列是通过对一种前体α-淀粉酶的一个或多个易氧化的氨基酸残基的缺失或取代(置换)而衍生得到的。在本发明的一个优选的实施方案中，以不同的氨基酸取代前体α-淀粉酶中的一个或多个甲硫氨酸残基从而获得突变体。在本发明的另一个实施方案中，突变体含有对前体α-淀粉酶中的一个或多个色氨酸的取代，或结合对一个或多个甲硫氨酸的取代。这些突变的α-淀粉酶一般通过对编码天然存在的或重组的α-淀粉酶前体DNA序列进行体外修饰而得到，这些体外修饰使得前体α-淀粉酶氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基发生取代或缺失。

对氨基酸序列中一个或多个氨基酸的取代或缺失可优选地对序列中的一个或多个甲硫氨酸，色氨酸，半胱氨酸，组氨酸或酪氨酸残基进行置换或缺失，最优选改变的残基是甲硫氨酸残基。易氧化的氨基酸残基可被其它天然存在的20种氨基酸中的任一种所置换。如果设计的效果是要改变氧化稳定性，那么该氨基酸残基可以用非氧化的氨基酸(如：丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，或缬氨酸)或者其它易氧化的氨基酸(如半胱氨酸，甲硫氨酸，色氨酸，酪氨酸或组氨酸，排列顺序从最易氧化到较易氧化)所取代。同样地，如果设计的效果是要改变热稳定性，那么可以用其它天然存在的20种氨基酸中的任一种取代(例如，可用半胱氨酸取代甲硫氨酸)。

优选的突变体含有相当于地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶中的任意一个甲硫氨酸残基(+8，+15，+197，+256，+304，+366和+438)的取代。最为优选的置换的甲硫氨酸是相当于地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中+197或+15位的甲硫氨酸。优选的置换+197位甲硫氨酸的取代氨基酸是丙氨酸(A)，异亮氨酸(I)，苏氨酸(T)和半胱氨酸(C)。优选的置换+15位甲硫氨酸的取代氨基酸是亮氨酸(L)，苏氨酸(T)，天冬酰胺(N)，天冬氨酸(D)，丝氨酸(S)，缬氨酸(V)和异亮氨酸(I)，当然其它的以上未指出的取代氨基酸也可以使用。本发明中两个特别优选的突变体是M197T和M15L。

本发明的另一个实施方案涉及的突变体含有相当于地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中的任意一个色氨酸残基的取代(见图2)。优选的所置换的色氨酸是相当于地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中+138位的色氨酸。一个色氨酸残基的突变(取代)可单独进行，或者结合其它易氧化氨基酸残基的突变进行。特别指出的是，至少一个色氨酸的取代结合至少一个甲硫氨酸的取代所进行的修饰是有利的(例如，双突变体+138/+197)。

本发明的α-淀粉酶突变体，在过氧化氢和其它氧化剂，如漂白粉或过酸，或者，特别是柔和型氧化剂如氯胺T的存在下，通常显示出改变的氧化稳定性。具有增强的氧化稳定性的突变酶能用于延长贮存寿命，以及作为与漂白粉、过硼酸盐、过碳酸盐或过酸具有相容性的淀粉酶用在洗涤剂产品中。类似地，降低的氧化稳定性对于要求快速高效地消除酶活性的工业过程是很有用的。本发明的突变酶还显示出更宽的pH特性范围，如突变体M15L显示在低pH条件淀粉液化的稳定性，再如突变体M197T在高pH的洗涤剂产品条件下显示出稳定性。本发明的突变体还显示出改变的热稳定性，突变体在高和低温度下都具有增强的稳定性。可以理解，根据突变酶所要求的最终用途，与其前体相比，突变体的酶学特性的改变(提高或降低)都可以是有利的。

除了淀粉加工和清洁用途外，本发明的变异淀粉酶可用于各种公知的使用淀粉酶的应用，例如，变异酶可用于纺织加工，食品加工，等等。特别指出的是，一种易于被氧化失活的变异酶M197C可以用于在要求加工后彻底去除淀粉酶活性的工艺中，如冷冻食品加工的应用。

本发明的优选的α-淀粉酶突变体来自芽孢杆菌属菌株，如地衣芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌，最优选的是来自地衣芽孢杆菌。

本发明的另一方面提供了正常产自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶的新形式。该新形式，称作A4型，在分泌的淀粉酶的N端具有4个附加的丙氨酸残基。(图4b)。本发明包括α-淀粉酶A4型的衍生物或突变体。就A4型的衍生物或突变体而言，其意味着本发明包括含有一个或多个其它的突变例如一个或多个易氧化氨基酸的突变(取代、置换)的A4型。

在一个组合物方案中，本发明提供了含有所述的α-淀粉酶突变体的洗涤剂组合物，其为液体的，胶状或粒状的。特别优选的洗涤剂组合物是仅含有+197位突变体的组合物，或者结合其它酶如内糖苷酶、纤维素酶、蛋白酶、脂酶或其它淀粉酶的组合物。此外，应注意的是本发明的组合物可包括具有一个以上的位点特异突变的α-淀粉酶突变体。

在另一个组合物方案中，本发明提供了用于淀粉加工及特别是淀粉液化的组合物。优选地，本发明的淀粉液化组合物含有在位点M15的取代或缺失的α-淀粉酶突变体。另外应理解的是该组合物可含有本领域的熟练技术人员所知的其它组分，包括，例如，抗氧化剂、钙、离子等。

在方法方面，本发明提供了液化淀粉特别是来自干或湿研磨加工过程的粒状淀粉浆的方法。通常，在淀粉降解加工的第一步中，淀粉浆经较高的温度(高至110℃)加热而明胶化。淀粉浆明胶化后，用α-淀粉酶使之液化和糊精化。这种液化的条件在共同拥有的美国专利申请07/785,624和07/785,623及美国专利5,180,669中有描述，这些文献引入本文作参考。本发明的液化淀粉的方法包括在淀粉浆中加入有效量的本发明的α-淀粉酶，可以是单独的也可结合其它赋型剂如抗氧化剂加入，并以合适的温度和时间作用淀粉浆使淀粉液化。

进一步，本发明还包括编码本发明的突变的α-淀粉酶(包括A4型及其衍生的突变体)的DNA序列，以及带有该DNA的表达载体和用该表达载体转化的宿主细胞。

附图的简要描述

图1：表示来自地衣芽孢杆菌(NCIB8061)的α-淀粉酶基因的DNA序列，SEQ IDNO.31，以及导出的翻译产物(描述于Gray，G.et al(1986)J.Bacter.166：635-643.)

图2：表示来自地衣芽孢杆菌(NCIB8061)的成熟α-淀粉酶的氨基酸序列，SEQ IDNO.32。

图3：表示一组芽孢杆菌属的α-淀粉酶的一级结构的对比。地衣芽孢杆菌淀粉酶(Am-Lich)，SEQ ID NO.33，描述于Gray，G.et al(1986)J.Bacter.166：635-643；解淀粉芽孢杆菌淀粉酶(Am-Amylo)，SEQ ID NO.34，描述于Takkinen，K.et al(1983)J.Biol.Chem.258：1007-1013；嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶(Am-Stearo)，SEQ ID NO.35，描述于Ihara，H.et al(1985)J.Biolchem.98：95-103。

图4a：表示成熟α-淀粉酶变异体M197T的氨基酸序列，SEQ ID NO.36。

图4b：表示来自地衣芽孢杆菌(NCIB8061)的α-淀粉酶的A4型的氨基酸序列，SEQ ID NO.37。数字编排自N末端，开始于四个附加的丙氨酸。

图5：示出质粒pA4BL，其中BLAA指地衣芽孢杆菌的淀粉酶基因，从PstI到SstI；AmpR指来自pBR322的氨苄青霉素抗性基因；CAT指来自pC194的氯霉素抗性基因。

图6：示出来自地衣芽孢杆菌38)、来自枯草芽孢杆菌39)、在pA4BL中的来自地衣芽孢杆菌(SEQ ID NO.40)和在pBLapr中的来自地衣芽孢杆菌41)的信号序列与成熟蛋白的连接部分。

图7a：示出特定淀粉酶(SpezymeAA20)和M197L(A4型)用0.88M H₂O₂在pH5.0，25℃条件下的失活作用。

图7b：示出特定淀粉酶(SpezymeAA20)和M197L(A4型)用0.88M H₂O₂，在pH10.0，25℃条件下的失活作用。

图7c：示出特定淀粉酶(SpezymeAA20)和M15L用0.88M H₂O₂在pH5.0，25℃条件下的失活作用。

图8：表示M197X盒式突变的产生的示意图。

图9：表示M197X变异体的表达。

图10：表示M197X变异体在pH5.0，5mM CaCl₂，于95℃下5分钟的热稳定性。

图11a和11b：表示在自动洗碗洗涤剂中特定的淀粉酶的失活。图11a表示Cascade^TM(一种商业可得的洗碗产品)中特定的淀粉酶在存在或不存在淀粉的条件下于65℃时的稳定性。图11b表示Sunlight^TM(一种商业可得的洗碗产品)中特定的淀粉酶在存在或不存在淀粉的条件下于65℃时的稳定性。

图12：表示M15X盒式突变的制备的示意图。

图13：表示M15X变异体的表达。

图14：表示M15X变异体对可溶淀粉的特异活性。

图15：表示M15X变异体在pH5.0，5mM CaCl₂，于90℃下5分钟的热稳定性。

图16：表示作为地衣芽孢杆菌野生型酶活性的函数的M15变异体对淀粉和可溶性底物的特异活性、以及pH5.5下喷射(jet)液化特性。

图17：表示用氯胺-T在pH8.0条件下作用时，与变异体M197A(1.7mg/ml)和M197L(1.7mg/ml)相对比，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(AA20，0.65mg/ml)的失活。

图18：表示用氯胺-T在pH4.0条件下作用时，与变异体M197A(4.3mg/ml)和M197L(0.53mg/ml)相对比，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(AA20，0.22mg/ml)的失活。

图19：表示用氯胺-T在pH5.0条件下作用时，与双变异体M197T/W138F(0.64mg/ml)和M197T/W138Y(0.60mg/ml)相对比，地衣芽孢杆菌的α淀粉酶(AA20，0.75mg/ml)的反应。

图20：表示对掺入自动洗碗洗涤剂(ADD)配制品中的不同的α-淀粉酶的多种突变体在室温及升温至65℃时所作的稳定性测试结果。

图21：表示自动洗碗洗涤剂中特定的淀粉酶突变体(与野生型相比)在室温下经0-30天后的稳定性——以一定时间后所保留的活性百分比计。

图22：表示自动洗碗洗涤剂中特定的淀粉酶突变体(与野生型相比)在38℃及相对湿度80％下经0-30天后的稳定性。

发明的详细描述

据信，用于淀粉液化的淀粉酶可因淀粉浆中的一些活性而使之变成一些失活的形式(见共同拥有的美国申请07/785,624和07/785,623和美国专利5,180,669，1993年1月19日授权，引入本文作参考)。而且，在有氧化剂存在的淀粉酶的应用中，如用于含有漂白粉或过酸的洗涤剂，会导致淀粉酶的部分或完全失活。因此本发明致力于改变淀粉酶的氧化敏感性。本发明的突变酶还可具有改变的pH范围和/或改变的热稳定性，这可能因为该酶在低或高pH条件下氧化稳定性的增强而导致。

本文所用的α-淀粉酶包括天然存在的淀粉酶以及重组的淀粉酶。本发明优选的淀粉酶是来自地衣芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，包括本文所述的衍生自地衣芽孢杆菌的A4型，以及真菌的淀粉酶如来自曲霉属的(例如米曲霉和黑曲霉)的α-淀粉酶。

重组α-淀粉酶是指，编码天然存在的α-淀粉酶的DNA序列通过修饰产生的突变DNA序列编码的淀粉酶，该突变DNA序列编码的α-淀粉酶序列中取代、插入或缺失了一个或多个氨基酸。本文公开了合适的修饰方法，也可见共同拥有的美国专利4,760,025和5,185,258，这些文献引入本文作参考。

已知在至今已测序的几乎所有内淀粉酶序列中都存在同源性，范围从植物，动物到细菌(Nakajima，R.T.et al.(1986)Appl.Microbiol.Biotechnol.23：355-360；Rogers，J.C.(1985)Biochem.Biophys.Res.Commun.128：470-476)在某些芽孢杆菌属的淀粉酶中有四个特别高度同源的区域，如图3所示，其中划线部分为高度同源的区域。进而，利用序列对比示出了芽孢杆菌属的内淀粉酶之间的关系(FengD.F和Doolittle，R.F.(1987)J.Molec.Ebil.35：351-360)。据计算，嗜热脂肪芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的淀粉酶的相关序列同源性约为66％，Holm，L.et al(1990)Protin Engineering 3(3)pp 181-191。据计算，地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的淀粉酶的相关序列同源性约为81％，Holm，L.et al文献同上。在将淀粉酶与其它酶比较时，尽管序列同源性很重要，但通常认为结构的同源性也是很重要的。例如，已提示真菌淀粉酶与细菌(芽孢杆菌属)的淀粉酶具有结构同源性，因此，真菌淀粉酶也涵盖于本发明中。

α-淀粉酶突变体具有的氨基酸序列来自其前体α-淀粉酶氨基酸序列。前体α-淀粉酶包括天然存在的α-淀粉酶和重组α-淀粉酶(如前面的定义)。α-淀粉酶突变体的氨基酸序列通过取代、缺失或插入一个或多个前体氨基酸序列中的残基而从前体淀粉酶而衍生得到。这种修饰是对编码前体淀粉酶氨基酸序列的前体DNA序列进行的，而非直接对前体淀粉酶操作。对前体DNA序列操作的适当方法包括本文公开的和共同拥有的美国专利4,760,025和5,185,258所公开的方法。

本文确定了相当于地衣芽孢杆菌淀粉酶的M197，M15和W138的用于取代或缺失的残基，如所有的甲硫氨酸、组氨酸、色氨酸、半胱氨酸和酪氨酸位点，氨基酸位点数码(如+197)是指如图2所示的成熟地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的排列数码。然而，本发明并不限于这一特定的成熟α-淀粉酶(地衣芽孢杆菌)的突变，而是扩展到含有相当于地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶所确定的特定残基的前体α-淀粉酶。如果它是同源的(即，在初级结构或高级结构上位置对应)或者与地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶特定残基或该残基部分相类似(即，具有化学上或结构上相同或相似的结合、反应或作用功能)，那么，这个前体α-淀粉酶的残基(氨基酸)就相当于地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基。

为了确认与一级结构的同源性，前体α-淀粉酶的氨基酸序列可直接与地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶一级序列比较，且特别比较在序列已知的所有α-淀粉酶中均为非变异的一组残基，如图3所示。也可通过三级结构来确定等位残基：猪胰α-淀粉酶(Buisson，G.etal.(1987)EMBO J.6：3909-3916)；来自米曲霉的高淀粉酶A(Matsuura，Y.et al.(1984)J.Biochem.(Tokyo)95：697-702)；一种来自黑曲霉的酸性α-淀粉酶(Boel，E.et al.(1990)biochemistry 29：6244-6249)的晶体结构已有报道，前两种结构相似。没有已发表的芽孢杆菌属α-淀粉酶的结构，虽然有预测其具有葡聚糖酶间的通用超二级结构(MacGregor，E.A.&Svensson，B.(1989)Biochem.J.259：145-152)。来自嗜热脂肪芽孢杆菌酶的结构与高淀粉酶A的结构类似(Holm，l.et al.(1990)Protein Engineering 3：181-191)。图3所示的四个高度保守区域含有被认为是活性位点部分的许多残基(Matsuura Y.et al.(1884)J.Biochem.(Tokyo)95：697-702；Buisson，G.et al.(1987)EMBO J.6：3909-3916；Vihinen，M.et al.(1990)J.Biochem.107：267-272)包括，按地衣芽孢杆菌的排列数码，His105；Arg229；Asp231；His235；Glu261和Asp328。

本文所用的表达载体是指这样的DNA构建物：它含有一DNA序列与调控序列相连接，而调控序列能使所述DNA在一适当的宿主中有效表达。该调控序列可包括一个起始转录的启动子，任选的控制这种转录的操纵序列，一个编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，和控制转录与翻译终止的序列。优选的启动子是枯草芽孢杆菌的aprE启动子。载体可以是质粒，噬菌体颗粒，或简单地是一潜在的基因组插入片段。一旦转化入适当的宿主，该载体可以复制并独立于宿主的基因组而具有功能，也可以，在某些例子中，整合入宿主的基因组中。在本说明书中，因为质粒是最为常用的载体形式，所以质粒与载体的概念在使用上有时可以互换。但是，本发明意在包括其它具有相当的功能并已为或将为本领域所知的各种形式的载体。

本发明所用的宿主菌株(或细胞)通常为原核或真核宿主并且包括任何能在其中进行α-淀粉酶表达的可转化的微生物。特别是，衍生α-淀粉酶的同种或同属的宿主菌株更为适合，如芽孢杆菌属。优选使用的是α-淀粉酶阴性芽孢杆菌属(基因已缺失)和/或α-淀粉酶与蛋白酶缺失的芽孢杆菌属菌株，如Bacillus subtilis菌株BG2473(△amyE，△apr，△npr)。宿主细胞被通过DNA重组技术构建的载体转化或转染。这种转化后的宿主细胞能够复制编码α-淀粉酶及其变异体(突变体)的载体，或能够表达所希望的α-淀粉酶。

优选的是本发明的突变体在发酵时分泌到培养基中。任何合适的信号序列，如aprE信号肽，可用于促进分泌。

本发明的许多α-淀粉酶突变体可以用于配成各种洗涤剂组合物，尤其是洗碗清洁组合物，特别是那些含有已知氧化剂的清洁组合物。本发明的α-淀粉酶突变体可以配成pH在6.5到12.0的公知的粉状、液体或凝胶状的洗涤剂。适当的颗粒状组合物可按共同拥有的美国专利申请07/429,881,07/533,721和07/957,973中所述制备，这些文献引入本文作参考。这些洗涤剂中的清洁组合物也可含有其它的酶，如已知的蛋白酶、脂酶、纤维素酶、内糖苷酶或其它淀粉酶，还可含有助洗剂、稳定剂或其它本领域熟练人员所知的赋型剂。这些酶的存在形式可以是共颗粒或混合物或者其它本领域熟练人员所知的形式。此外，本发明还注意到多重突变体可以用于清洁或其它应用。例如，一个在+15和+197位改变的突变酶用于清洁产品中可显示更强的特性；而含有+197和+138位改变的多重突变体可具有改进的特性。用于清洁产品尤其是用于洗碗洗涤剂配制品的特别优选的突变酶，包括但是并不限于M15T/M197T；M15S/M197T；W138Y/M197T；M15S/W138Y/M197T；和M15T/W138Y/M197T。

本发明的另一实施方案包括所述的突变α-淀粉酶与其它酶(即蛋白酶、脂酶、纤维素酶等)，优选氧化稳定的蛋白酶的结合。合适的氧化稳定的蛋白酶通常包括遗传工程化蛋白酶，例如描述于US Re 34606中的(该文献引入本文作参考)，以及商业可得的酶如DURAZYM(Novo Nordisk)，MAXAPEM(Gist-brocades)和PURAFECT OXP(GenencorInternational，Inc.)。产生这些蛋白酶突变体(氧化稳定的蛋白酶)，尤其是含有在相当于解淀粉芽孢杆菌中M222位点的甲硫氨酸取代的突变体的合适方法，在US Re34606中已有描述。确定其它枯草杆菌蛋白酶中的“相当”位点的合适方法在Re 34606，EP257，446和USSN 212，291中有所提供，这些文献引入本文作参考。

如前所述，本发明的α-淀粉酶突变体可用于淀粉的液化。淀粉液化，尤其是颗粒状淀粉浆的液化，典型地是在中性pH条件和高温条件下进行的。如在共同拥有的美国专利申请07/788,624,07/785,623和美国专利5,180,669中所述，在典型的液化过程中存在某些氧化剂或失活剂，而可能影响到该酶的活性；因此，这些相关专利申请在加工中加入了抗氧化剂以保护该酶。

基于优选的液化加工条件，如在共同拥有的美国专利申请07/788,624和07/785,623和美国专利5,180,669中所述，即在低pH、高温及可能的氧化条件下，优选的用于液化过程的本发明的突变体包括那些显示出改变的pH特性范围(即，低pH范围，pH＜6和优选地pH＜5.5)，和/或改变的热稳定性(即，高温，约90℃-110℃)，和/或改变的氧化稳定性(即，增强的氧化稳定性)的突变体。

因此，本发明提出了一个改进的淀粉液化的方法，该方法包括：在pH4到6的条件下通过加入有效量的本发明的α-淀粉酶突变体将从干或湿研磨过程得到的粒状淀粉浆进行液化；任选地在粒状淀粉浆中加入有效量的抗氧化剂或其它赋型剂；作用粒状淀粉浆适当的时间使淀粉液化。

以实施例的方式提供的下列内容并不构成本发明权利要求的范围的限制。本文所用的缩写，特别是氨基酸三字符或单字符代码描述于Dale，J.W.著“细菌的分子遗传学”，John Wiley & Sons，(1989)附录B。

实验

实施例1

地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中的甲硫氨酸残基的取代

α-淀粉酶基因(图1)克隆自地衣芽孢杆菌NCIB8061菌株，该菌株得自国立工业细菌保藏中心，Aberdeen，Scotland(Gray，G.et al.(1986)J.Bacteriology 166：635-643)。将编码信号序列的后3个残基、全长的成熟蛋白和终止区的1.72kb的PstI-SstI片段亚克隆到M13MP18。一个合成的终止子通过如下所示形式的合成寡聚核苷酸盒加入到BclI和SstI位点：BclI SstI5′ GATCAAAACATAAAAAACCGGCCTTGGCCCCGCCGGTTTTTTATTATTTTTGAGCT 3′3′ TTTTGTATTTTTTGGCCGGAACCGGGGCGGCCAAAAAATAATAAAAAC 5′

Seq ID No 1

该形式设计含有解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶的转录终止子(Wells et al.(1983)Nucleic Acid Research 11：7911-7925)。

寡聚核苷酸介导的定点诱变基本上按Zoller，M.et al.(1983)Meth.Enzymol.100：468-500的方法进行，简要地，利用表1所列的寡聚核苷酸，以M13单链DNA为模板，通过5’磷酸化的寡聚核苷酸引物诱导所希望的突变，以取代地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶中7个甲硫氨酸的每个残基。每个诱变寡聚核苷酸还引入了一个限制性内切酶位点用以筛选连入的突变子。

表1

用于取代地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中甲硫氨酸残基的诱变的寡聚核苷酸

M8A5′-T GGG ACG CTG GCG CAG TAC TTT GAA TGG T-3′ Seq ID No 2

ScaI+

M15L5′-TG ATG CAG TAC TTT GAA TGG TAC CTG CCC AAT GA-3′ Seq ID No 3

ScaI+ KpnI+

M197L5′-GAT TAT TTG TTG TAT GCC GAT ATC GAC TAT GAC CAT-3′ Seq ID No 4

EcoRV+

M256A5′-CG GGG AAG GAG GCC TTT ACG GTA GCT-3′ Seq ID No 5

StuI+

M304L5′-GC GGC TAT GAC TTA AGG AAA TTG C-3′ Seq ID No 6

AfIII+

M366A5′-C TAC GGG GAT GCA TAC GGG ACG A-3′ Seq ID No 7

NsiI+

M366Y5′-C TAC GGG GAT TAC TAC GGG ACC AAG GGA GAC TCC C-3′ Seq ID No 8

StyI+

M438A5′-CC GGT GGG GCC AAG CGG GCC TAT GTT GGC CGG CAA A-3′ Seq ID No 9

SfiI+粗体字表示寡聚核苷酸引入的变化。编码的改变在M8A形式中示出，这里+8位的甲硫氨酸(M)改变为丙氨酸(A)。划线部分表示寡聚核苷酸引入的限制性内切酶位点。

杂交双链分子用以转染E.coli mutL细胞(Kramer et al.(1984)Cell 38：879)，经噬菌斑纯化后，用RF1的限制酶切方法分析克隆。阳性克隆用双脱氧法测序确定(Sanger et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463-5467)并且将每个PstI-SstI片段亚克隆入E.coli载体，质粒pA4BL。

质粒pA4BL

按描述于美国申请860,468(Power et al.)的方法，该文献引入本文作参考，在来自pS168-1(Stahl，M.L.和Ferrari，E.(1984)J.Bacter.154：1513-1515)的aprE基因的+1位点(紧接信号切割位点的第1个氨基酸)引入一个沉默PstI位点。然后将aprE启动子和信号肽区从pJH101质粒(Ferrari，E.(1984)J.Bacter.154：1513-1515)上以HindIII-PstI片段切下，亚克隆入pUC18衍生的质粒JM102(Ferrari，E.和Hoch，J.A.(1989)Bacillus，ed.C.R.Harwood，Plenum Pub.，pp.57-72)。并插入来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的PstI-SstI片段，得到pA4BL，其含有如图6所示的aprE信号肽-淀粉酶的连接。

转化入枯草芽孢杆菌

pA4BL质粒能够在E.coli中复制并能够整合到枯草芽孢杆菌染色体上。含有各种变异体的质粒转化入枯草芽孢杆菌(Anagnostopoulos，C.和Spizizen，J.(1961)J.Bacter.81：741-746)并以Campbell-型机制(Young，M.(1984)J.Gen.Microbiol.130：1613-1621)整合到染色体上的aprE位点。枯草芽孢杆菌菌株BG2473为缺失α-淀粉酶(△ampE)和两个蛋白酶(△apr，△npr)的菌株I168的衍生菌株(Stahl，M.L.和Ferrari，E.，J.Bacter.158：411-418和美国专利5,264,366，该文献引入本文作参考)。转化后，sacU32(Hy)突变(Henner，D.J.et al.(1988)J.Bacter.170：296-300)经PBS-1介导的转导而导入(Hoch，J.A.(1983)154：1513-1515)。

对在枯草芽孢杆菌中的pA4BL表达的淀粉酶的N末端分析显示，它被加工成在分泌的淀粉酶蛋白的N末端加上4个丙氨酸(“A4型”)。这额外的4个残基并未对A4型的活性或热稳定性产生显著的降低作用，并且在某些应用中具有增强的特性。在后续的实验中，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的正确加工形式和变异体M197T以非常相似的构建方法而得到(见图6)。具体地，A4型构建物的5’端通过来自pA4BL的EcoRI-SstI片段亚克隆入M13BM20(Boehringer Mannheim)，从而得到如下所示的诱变寡聚核苷酸的编码链模板：5′-CAT CAG CGT CCC ATT AAG ATT TGC AGC CTG CGC AGA CAT GTT GCT-3′

Seq ID No 10

此引物消除了额外的4个N末端丙氨酸密码子，通过PstI位点的不存在而筛选到正确的形式。将EcoRI-SstII片段亚克隆回pA4BL载体(图5)从而得到质粒pBLapr。这时，M197T取代可以通过SstII-SstI片段从pA4BL(M197T)上移入互补的pBLapr载体得到质粒pBLapr(M197T)。对在枯草芽孢杆菌中的pBLapr表达的淀粉酶的N末端分析显示，它被加工成带有与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶相同的N-末端。

实施例2

甲硫氨酸变异体的氧化稳定性

地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶，如SpezymeAA20(可从Genencor International，Inc.商购)，在过氧化氢存在下很快失活(如7)。摇瓶培养枯草芽孢杆菌表达各种甲硫氨酸变异体，粗上清经硫酸铵分流纯化。将20％饱和硫酸铵上清提高至70％饱和硫酸铵，α-淀粉酶沉淀出，然后重新悬浮。变异体在pH5.0，25℃暴露于0.88M过氧化氢。地衣芽孢杆菌α-淀粉酶其他6个甲硫氨酸位点的变异体依然被过氧化物所氧化，而在+197位点取代的变异体(M197L)则表现出对过氧化物氧化作用的抗性(见图7)。然而，如下文详细描述的进一步的实验表明，虽然一个变异体在pH5.0 25℃时可能易于氧化，但是它在不同的条件下(即，液化)可能显示改变的/增强的特性。

实施例3

在197位点的所有可能的变异体的构建

所有M197的变异体(M197X)从A4型通过盒式诱变产生，如图8所示：

1)用定点诱变(通过M13上引物延伸)产生M197A，所用的诱变寡聚核苷酸如下：

M197A5′-GAT TAT TTG GCG TAT GCC GAT ATC GAC TAT GAC CAT-3′

EcoRV+

ClaI- Seq ID No 11这里，还插入了EcoRV位点(密码子200-201)以替代ClaI位点(密码子201-202)。

2)然后用引物LAAM12(表II)在密码子186-188处引入另一个沉默限制位点(BstBI)。

3)所得的M197A(BstBI+，EcoRV+)变异体随后亚克隆(PstI-SstI片段)人质粒pA4BL，而所得的质粒用BstBI和EcoRV酶切，通过电洗脱从琼脂糖凝胶上分离含载体的大片段。

4)每种合成的引物LAAM14-30(表II)分别与大部分互补的通用引物LAAM13(表II)退火。得到的诱变盒在+197位编码所有其余天然存在的氨基酸，将诱变盒逐个连接入上面所制备的载体片段。

表II用于盒式诱变产生M197X变异体的合成寡核苷酶LAAM12 GG GAA GTT TCG AAT GAA AAC G Seq ID No 12LAAM13 X197bs Seq ID No 13

(EcoRV) GTC GGC ATA TG CAT ATA ATC ATA GTT GCC GTT TTC ATT (BstBI)LAAM14 I197 Seq ID No 14

(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG ATC TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM15 F197 Seq ID No 15

(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG TTC TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM16 V197 Seq ID No 16

(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG GTT TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM17 S197 Seq ID No 17

(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG AGC TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM18 P197 Seq ID No 18

(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG CCT TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM19 T197 Seq ID No 19

(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG ACA TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM20 Y197 Seq ID No 20

(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG TAC TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM21 H197 Seq ID No 21

(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG CAC TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM22 G197 Seq ID No 22

(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG GGC TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM23 Q197 Seq ID No 23

(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG CAA TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM24 N197 Seq ID No 24

(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG AAC TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM25 K197 Seq ID No 25

(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG AAA TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM26 D197 Seq ID No 26

(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG GAT TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM27 E197 Seq ID No 27

(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG GAA TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM28 C197 Seq ID No 28

(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG TGT TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM29 W197 Seq ID No 29

(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG TGG TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM30 R197 Seq ID No 30

(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG AGA TAT GCC GAC (EcoRV-)

诱变盒设计在连接时消除EcoRV位点，因此，E.coli转化子的质粒可根据此单一位点的消失而筛选出。此外，盒中通用基础(bottom)链中含有一个移码和一个NsiI位点，因此，由此链衍生的转化子可通过筛选单一位点NsiI的存在而除去，从而在任何情况下均不会导致活性淀粉酶的表达。

限制性分析阳性克隆经测序确认并转化入枯草芽孢杆菌进行摇瓶培养表达(图9)。然后，每一M197X突变体的特异活性通过可溶性底物试验进行确定。以下试验方法所获得的数据列于表III。

可溶性底物试验：根据Megazyme(Aust.)Pty.Ltd.提供的终点试验试剂盒进行效率试验：将每一小瓶底物(对硝基苯基麦芽七糖，BPNPG7)溶解于10ml无菌水，再以试验缓冲液(50mM顺丁烯二酸盐缓冲液，pH6.7，5mM氯化钙，0.002％Tween20)稀释1至4倍。在一小容器中790μl的底物加入10μl的淀粉酶于25℃进行试验。75秒后，根据410nm的光吸收的变化率来测量水解率。该试验线性率最大至0.4吸收单位/分钟。

淀粉酶的蛋白浓度利用标准牛血清白蛋白通过基于Bradford，(M.(1976)Anal.Biochem.72：248)方法的Bio-Rad试验(Bio-Rad Laboratories)进行测量。

淀粉水解试验：应用了检测SpezymeAA20α-淀粉酶活性的标准方法。该方法在USSN 07/785,624的实施例1中有详细的描述。天然的淀粉遇碘呈蓝色，而当它水解成较小的糊精分子时则不呈蓝色。底物为5g/L的溶于磷酸盐缓冲液(pH6.2，42.5g/L磷酸二氢钾，3.16g/L氢氧化钠)中的可溶性Lintner淀粉。样品加入25mM的氯化钙，并于30℃孵育，以产生阴性碘显色的时间来测量活性。活性以每克或每ml的力规分(liquefons)(LU)记录，其按如下的公式计算：

LU/ml或LU/g＝(570×D)/(V×t)

这里：LU＝力规分单位

V＝样品体积(5ml)

t＝糊精化的时间(分钟)

D＝稀释倍数＝稀释体积/加入酶的ml或g

表III

特异活性(相当于AA20值的％)α-淀粉酶

可溶性底物淀粉SpezymeAA20 100 100A4型 105 115M15L(A4型) 93 94M15L 85 103M197T(A4型) 75 83M197T 62 81M197A(A4型) 88 89M197C 85 85M197L(A4型) 51 17

实施例 4

M15L变异体的鉴定

按照前面实施例的方法制备的变异体M15L并不显示出增加的淀粉酶活性(表III)，并且仍然被过氧化氢所失活(图7)。然而，它却在淀粉的喷射液化，尤其在低pH条件下，显示出增加的特性，如下面的表IV所示。

淀粉液化的典型操作是使用一个水浴加热器M103-M蒸汽喷管，它在混合仓后面配备有2.5升的延迟圈和一个终端反压阀。淀粉用一个Moyno泵加入喷管，而减至90-100psi的蒸汽由一个150psi的蒸汽管线提供。温度探头设置在水浴加热蒸汽喷管之后、反压阀之前。

淀粉浆通过谷物湿磨机获得，并在两天之内使用。用去离子水将淀粉稀释至所需的固体级别，并用2％NaOH或饱和Na₂CO₃调节淀粉的pH值。典型的液化条件为：

淀粉 32％-35％的固体

钙 40-50ppm(加入30ppm)

pH值 5.0-6.0

α-淀粉酶 12-14LU/g淀粉干基重

淀粉以约350ml/分钟引入喷管。喷管的温度保持在105-107℃。淀粉的样品从喷管蒸煮器转至95℃的第二阶段液化并保持90分钟。

第二阶段液化后，立即通过确定样品的葡萄糖效价(DE)并测试生淀粉的含量而测量淀粉液化的程度，这些都按照《谷物提纯联合会的会员公司的标准分析方法》(第六版)中描述的方法进行。通常在上述给出的条件及pH6.0的条件下进行处理后，淀粉将变化为DE值约10的液化淀粉且不含有生淀粉。以本发明的突变体进行的淀粉液化测试的结果提供在表IV中。

表IV：在淀粉液化中变异体M15L(A4型)和M15L的特性

pH 90分钟后的DESpezyme AA20 5.9 9.9M15L (A4 form) 5.9 10.4Spezyme AA20 5.2 1.2M15L (A4 form) 5.2 2.2Spezyme AA20 5.9 9.3^*M15L 5.9 11.3^*Spezyme AA20 5.5 3.25^**M15L 5.5 6.7^**Spezyme AA20 5.2 0.7^**M15L 5.2 3.65^**

^*三次实验的平均值

^**两次实验的平均值

实施例5

M25X变异体的构建

大体按照前面实施例3中描述的方法，所有的M15变异体(M15X)都通过盒式诱变在天然的地衣芽孢杆菌中产生，如图12中所概括的。

1)利用定点诱变(通过引物在M13上延伸)在M15密码子两侧引入单一的限制性位点以利于诱变盒的插入。具体地，利用下面所示的两个寡聚核苷酸，在第11-13位密码子引入一个BstBI位点并在第18-20位密码子引入一个MscI位点：M15XBstB1 5′-G ATG CAG TAT TTC GAA CTGG TAT A-3′

BstB1 Seq ID No 48M15XMsc1 5′-TG CCC AAT GAT GGC CAA CAT TGG AAG-3′

Msc1 Seq ID No 49

2)然后，通过将诱变淀粉酶(BstB1+，MSc1+)的SfiI-SstII片段亚克隆入质粒pBLapr，构建M15X盒式诱变的载体。所得到的质粒再经BstBI和MscI酶切并从聚丙烯酰胺凝胶上电洗脱分离较大的载体片段。

3)诱变盒的制备与M197X变异体的一样。将合成的寡聚核苷酸，每个编码一种第15位密码子的取代，与一通用基础引物退火。诱变盒与载体经正确的连接，MscI位点被消除，从而可利用该位点的丢失来筛选阳性转化子。通用基础引物含有单一SnaBI位点，从而可利用SnaBI位点的筛选来去除那些衍生自该通用基础引物的转化子。该引物还含有一个移码，从而可消除那些衍生自该通用基础引物的突变体的淀粉酶的表达。

合成的诱变盒列于表V，总体的盒式诱变策略示意于图12。

表V：用以盒式诱变产生M15X变异体的合成的寡聚核苷酸M15A (BstB1) C GAA TGG TAT GCT CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 50M15R (BstB1) C GAA TGG TAT CGC CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 51M15N (BstB1) C GAA TGG TAT AAT CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 52M15D (BstB1) C GAA TGG TAT GAT CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 53M15H (BstB1) C GAA TGG TAT CAC CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 54M15K (BstB1) C GAA TGG TAT AAA CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 55M15P (BstB1) C GAA TGG TAT CCG CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 56M15S (BstB1) C GAA TGG TAT TCT CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 57M15T (BstB1) C GAA TGG TAC ACT CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 58M15V (BstB1) C GAA TGG TAT GTT CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 59M15C (BstB1) C GAA TGG TAT TGT CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 60M15Q (BstB1) C GAA TGG TAT CAA CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 61M15E (BstB1) C GAA TGG TAT GAA CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 62M15G (BstB1) C GAA TGG TAT GGT CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 63M15I (BstB1) C GAA TGG TAT ATT CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 64M15F (BstB1) C GAA TGG TAT TTT CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 65M15W (BstB1) C GAA TGG TAC TGG CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 66M15Y (BstB1) C GAA TGG TAT TAT CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 67M15X (Msc1) CC GTC ATT GGG ACT ACG TAC CAT T (BstB1) Seq ID No 68

(基础链)

划线部分表示在15位的氨基酸密码子的变化

在某些情况中进行了保守取代以防新的限制性位点的引入。

实施例6

M15X变异体的小型液化试验

按实施例5的方法制备的带有M15取代的11种α-淀粉酶变异体，与SpezymeAA20(可从Genencor International，Inc.商购)对比，在一个小型液化系统中于pH5.5条件下进行液化反应并进行活性试验。小型液化系统含有一个不锈钢钢圈(直径0.25英寸，体积约350ml)配有一距离前端约12英寸的7英寸长的静态混合器，和一个在后端的30psi的反压阀。该钢圈除了两端均浸于甘油-水浴中，此浴器配有温度控制器使其保持在105-106℃。

含有酶的淀粉浆搅拌下保持悬浮，通过一个活塞驱动计量泵以70ml/min导入反应圈中。从反应圈尾部收集的淀粉被转入第二级处理(95℃90分钟)。第二级处理后立刻测定液化淀粉的DE值，如实施例4中所述。其结果见图16。

实施例7

M197X变异体的鉴定

如图9所示，M197X(A4型)变异体所表达的α-淀粉酶活性(可溶性底物试验所测量)的范围很大。通过在上清中加入2倍体积的乙醇使之沉淀并重新悬浮而对淀粉酶进行部分纯化。然后它们在含5mM氯化钙的10mM乙酸缓冲液pH5.0中，于95℃加热5分钟进行热稳定性的筛选；A4野生型在孵育后保持其28％的活性。对于M197W和M197P，我们无法从上清中回收活性蛋白。根据测序，发现M197H变异体含有第二个突变，N190K。M197L在另一实验中测试，它是热稳定性最低的变异体之一。在淀粉酶活性与热稳定性之间显示出很大的相关性，地衣芽孢杆菌淀粉酶在保持活性或增强热稳定性方面受限于其在197位所能容纳的残基：半胱氨酸和苏氨酸在这些条件下优选地具有最大的热稳定性，而丙氨酸和异亮氨酸具有中等的稳定性。然而，在+197位的其它取代导致的低热稳定性可以有利于其它的应用。此外，不同的+197位的取代可能具有其它的有利特性，如改变的pH特性范围或改变的氧化稳定性。例如，M197C变异体易于被空气氧化失活但具有增强的热稳定性。相反，与M197L变异体相比，M197T和M197A在pH5至pH10时对过氧化物的失活作用保持有抗性(图7)的同时，不仅保持高的热稳定性(图10)，还具有高活性(表III)。

实施例8

在洗涤剂配制品中的稳定性和特性

M197T(A4型)，M197T和M197A(A4型)的稳定性在自动洗碗洗涤剂(ADD)基质中进行测量。将2ppm的Savinase^TM(一种蛋白酶，可从Novo Industies商购，是一种普遍用于ADD的酶)加入到两种可商购的含有漂白粉的ADD：Cascade^TM(Procter andGamble，Ltd.)和Sunlight^TM(Unilever)，在65℃对淀粉酶变异体和Termamyl^TM(热稳定的α-淀粉酶，可得于Novo Nordisk，A/S)进行失活计时。两种情况下使用的ADD产品的浓度相当于“预浸渍”条件：每升水加14克产品(每加仑硬度7克)。正如所见到的(图11a和图11b)，两种形式的M197T变异体都比Termamyl^TM和M197A(A4型)具有大得多的稳定性，后两种在第一次试验前已失活。按下面的方法所作的测定中，在存在或不存在淀粉的条件下均可显示出其稳定性的优点。在5ml的ADD和Savinase^TM中加入淀粉酶，于试管中预热，振荡后，用可溶性底物试验测定作为时间函数的活性。标“+淀粉”的试管内壁烤有spaghetti淀粉(140℃，60分钟)。结果见图11a和图11b。

实施例9

M15X变异体的鉴定

所有的M15X变异体都在Bacillus subtilis中繁殖，其检测的表达水平见图13。淀粉酶通过20-70％的硫酸铵分流而分离并部分纯化。这些变异体对于可溶性底物的特异活性按实施例3所述方法测试(图14)。许多M15X淀粉酶的特异活性高于SpezymeAA20。通过在含有5mM氯化钙的50mM乙酸缓冲液pH5中于90℃加热淀粉酶5分钟，对变异体进行小型热稳定性试验(图15)。在试验中大多数变异体与SpezymeAA20的表现一样。测试那些在试验中显示出合理的稳定性的变异体(合理的稳定性是指保持至少60％的Spezyme^TMA20的热稳定性)对淀粉的特异活性以及在pH5.5时的液化特性。最感兴趣的那些突变体可见图16所示。M15D，N和T，以及L，在pH5.5条件下的液化中的特性超过了SpezymeAA20，并且在可溶性底物试验和淀粉水解试验中具有增加的特异活性。

总之，我们从第15位的甲硫氨酸的取代中发现，我们能提供具有增强的低pH液化特性和/或增加的特异活性的变异体。

实施例10

色氨酸对氧化的敏感性

氯胺-T(N-氯-对-甲苯磺酰亚胺钠)是一选择性氧化剂，它在中性或碱性pH条件下氧化甲硫氨酸成甲硫氨酸亚砜。在酸性pH条件下氯胺-T将对甲硫氨酸和色氨酸都进行修饰(Shechter，Y.，Burstein，Y.和Patchornik，A.(1975)biochemistry 14(20)4497-4503)。图17显示了pH8.0时氯胺-T对地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶的失活作用(AA20＝0.65mg/ml，M197A＝1.7mg/ml，M197L＝1.7mg/ml。数据表明在第197位将甲硫氨酸改变成亮氨酸或丙氨酸，α-淀粉酶的失活可得到抑制。相反，如图18所示，在pH4.0时M197A和M197L发生失活，但需较多的氯胺-T当量(图18；AA20＝0.22mg/ml，M197A＝4.3mg/ml，M197L＝0.53mg/ml；200mM乙酸钠，pH4.0)。这提示在氯胺-T介导的失活作用中色氨酸残基也有所关联。色氨酸作图(tryptic mapping)和接下来的测序显示第138位的色氨酸被氯胺-T氧化(数据未附)。为了证实这点，如下所示进行了第138位色氨酸的定点诱变。

α-淀粉酶双突变体W138和M197的制备

将一些W138变异体(F，Y和A)制备成带有M197T(按实施例3制备)的双突变体。双突变体的制备按实施例1和实施例3的方法进行。一般说来，从含有地衣芽孢杆菌α-淀粉酶M197T突变体的1.72kb编码序列(PstI-SstI)的一个M13M18克隆中制备出负链DNA。除用T4基因32蛋白质和T4多聚酶替代klenow酶外，基本上按照Zoller，M.et al.(1983)的方法，利用如下所列的引物进行定点诱变。引物除了设计的突变外，都含有单一位点以对带有适当突变的克隆进行鉴定。

第138位色氨酸变为苯丙氨酸133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143CAC CTA ATT AAA GCT TTC ACA CAT TTT CAT TTT Seq ID No 42

Hind III第138位色氨酸变为酪氨酸133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143CAC CTA ATT AAA GCT TAC ACA CAT TTT CAT TTT Seq ID No 43

Hind III

第138位色氨酸变为丙氨酸--这一引物还在第138位的上游和下游引入了单一位点。127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142C CGC GTA ATT TCC GGA GAA CAC CTA ATT AAA GCC GCA ACA CAT TTT CAT

BspE I143 144 145 146 147TTT CCC GGG CGC GGC AG Seq ID No 44

Xma I

突变体通过限制分析鉴定，且W138F和W138Y经DNA测序确定。W138A序列在单一位点BspEI和XmaI位点间有一核苷酸缺失，而其它基因序列正确。含有W138X和M197T双突变的1.37kb的SstII/SstI片段从M13MP18移至表达载体pBLapr，从而得到pBLapr(W138F，M197T)和pBLapr(W138Y，M197T)。含有单一BspEI和XmaI位点的片段克隆入pBLapr(BspEI，XmaI，M197T)，它可用于克隆带有第138位其他氨基酸取代的诱变盒。

第138位氨基酸的单突变

按照前面实施例中的通用方法，制备了一些W138的单变异体(F，Y，L，H和C)。实施例7的质粒pBLapr(W138X，M197T)中含有M197T突变的1.2kb Asp718-SstI片段被第197位是甲硫氨酸的野生型片段所置换，从而得到pBLapr(W138F)，pBLapr(W138Y)和pBLapr(BspEI，XmaI)。

利用下面的引物将合成诱变盒连接入pBLapr(BspEI，XmaI)载体，制备出突变体W138L，W138H和W138C。

第138位色氨酸变为亮氨酸CC GGA GAA CAC CTA ATT AAA GCC CTA ACA CAT TTT CAT TTT C

Seq ID No 45

第138位色氨酸变为组氨酸CC GGA GAA CAC CTA ATT AAA GCC CAC ACA CAT TTT CAT TTT C

Seq ID No 46

第138位色氨酸变为半胱氨酸CC GGA GAA CAC CTA ATT AAA GCC TGC ACA CAT TTT CAT TTT C

Seq ID No 47

双突变体M197T/W138F和M197T/W138Y与氯胺-T的反应与野生型进行对比(AA20＝0.75mg/ml，M197T/W138F＝0.64mg/ml，M197T/W138Y＝0.60mg/ml；50mM乙酸钠，pH5.0)。其结果见图19所示，第138位色氨酸的诱变使变异体对氯胺-T更具抗性。

实施例11

多重突变体的制备

按照实施例1，3，5和10的方法制备下列多重突变体：M15T/M197T；M15S/M197T；W138Y/M197T；M15S/W138Y/M197T以及M15T/W138Y/M197T。其中的某些多重突变体在前面已有示例，例如，W138Y/M197T在实施例10中制备和测试。这些多重突变体通过限制性分析鉴定。

对本发明范围中的各种多重突变体作为清洁产品(自动洗碗洗涤剂)添加剂时的特性进行了进一步的测试。这些测试详细描述如下。

稳定性测试

在硬度为7gpg的水中制备4000ppm的含有过硼酸盐和TAED的自动洗碗洗涤剂(ADD)溶液。将上面所述的淀粉酶突变体加入此ADD溶液，使得按照Ceralpha方法(Megazym(Austr.)Pty.Ltd.，Parramatta，NSW，Australia)测得的比率为0.4。一组样品保持在室温(21-23℃)30分钟(不加热)。第二组样品加入酶后从室温加热到65℃(加热)。加入酶30分钟后，测量淀粉酶突变体的活性并计算相对于加入酶时的初活性的活性比(相对活性％)。

如图20所示的结果表明，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的+197位的甲硫氨酸应加以修饰以获得在含有ADD+过硼酸盐+TAED的配制品中的稳定性。

淀粉水解试验

在硬度为7gpg的水中制备4000ppm的含有过硼酸盐和TAED的自动洗碗洗涤剂(ADD)溶液，并加入三片煮过的肘状空心面。将上面所述的某种淀粉酶突变体加入此ADD溶液，使得终浓度为5ppm活性酶。试管在50℃加热30分钟，通过二硝基水杨酸法，以一葡萄糖标准曲线测量还原糖浓度。结果见表VI

表VI

酶	还原糖浓度(g/1)	标准偏差
酶	还原糖浓度(g/1)	标准偏差	不加酶	1.64	0.12
野生型	4.97	0.30	不加酶	1.64	0.12
野生型	4.97	0.30	M15S/M197T	5.40	0.36
M15T/M197T	5.85	0.38	M15S/M197T	5.40	0.36
M15T/M197T	5.85	0.38	W138Y/M197T	6.48	0.36
M15S/W138Y/M197T	6.04	0.74	W138Y/M197T	6.48	0.36
M15S/W138Y/M197T	6.04	0.74	M15T/W138Y/M197T	6.27	0.49

表VI所示的结果表明，与不加酶和野生型α-淀粉酶的对照相比，M15T/M197T；M15S/M197T；W138Y/M197T；M15S/W138Y/M197T和M15T/W138Y/M197T具有良好的特性。

燕麦粥污渍

在碟子中评价地涂上一块烹熟的混合燕麦糊并于37℃干燥过夜。将碟子置于一个ASKO 770型洗碗机中，用10g含有5％过硼酸盐、3％TAED和11mg淀粉酶的自动洗碗洗涤剂，于45℃在“快速清洗”档清洗。碟子在玷污前、玷污后和清洗后称重，并计算所有碟子上污渍洗除的平均百分率。其数据如表VII所示。

表VII

酶	去除的污渍的％(全部碟子的平均值)
酶	去除的污渍的％(全部碟子的平均值)	野生型	61
M15S/M197T	66	野生型	61
M15S/M197T	66	M15T/M197T	71
W138Y/M197T	68	M15T/M197T	71
W138Y/M197T	68	M15S/W138Y/M197T	62
M15T/W138Y/M197T	72	M15S/W138Y/M197T	62

数据表明突变酶所提供的效益大于野生型所提供的。野生型淀粉酶在清除燕麦粥时比不含淀粉酶的ADD多提供20％的清洁效益。

实施例12

洗碗清洁组合物

将Korex自动洗碗洗涤剂配以1％(w/w)野生型和突变型淀粉酶颗粒，其中加入了5％(w/w)过硼酸盐一水合物和3％(w/w)TAED。这些配制品的样品于室温(21-23℃)或38℃及80％相对湿度条件下放置四周。结果如图21和22所示。

数据表明按Ceralpha法测量的野生型淀粉酶的活性在洗涤剂中随储存时间的增加而降低。在室温下，突变酶是完全稳定的。在38℃和80％相对湿度的条件下，所有的突变体都比野生型稳定。

将这些突变型淀粉酶配制在自动洗碗洗涤剂中的优点在于，当存在过硼酸盐和TAED时这些突变体明显比野生型更为稳定，而且在清洗时除去淀粉食品污渍方面提供了显著的操作效益。

实施例13

氧化稳定性蛋白酶/氧化稳定性淀粉酶的稳定性研究

将含有：1)野生型蛋白酶和野生型淀粉酶；或者2)按照US Re 34606所述方法制备的对漂白粉稳定的蛋白酶(GG36-M222S)和对漂白粉稳定的淀粉酶(AA20-M15T/W138Y/M197T)的酶颗粒溶于缓冲液(含有0.1M硼酸钠pH10.2和0.005％Tween80，每种酶的浓度为12.5mg)。在9ml这种溶液中加入1ml蒸馏水或者1ml 30％过氧化氢。该溶液于25℃孵育30分钟后，测量每种溶液中蛋白酶和淀粉酶的活性并以原活性的％表示。其结果如下表VIII所示。

表VIII

处理	酶	30分钟后的％活性
处理	酶	30分钟后的％活性	水水水水3％过氧化物3％过氧化物3％过氧化物3％过氧化物	野生型淀粉酶野生型蛋白酶M222S蛋白酶TYT淀粉酶野生型淀粉酶野生型蛋白酶M222S蛋白酶TYT淀粉酶	104941198814711675

数据表明一种对漂白粉稳定的淀粉酶突变体与一种对漂白粉稳定的蛋白酶突变体的结合使用，两者都在氧化敏感的氨基酸残基具有突变，可在抗漂白粉失活作用的配制品中提供蛋白酶和淀粉酶的加和效益。在漂白粉中30分钟后，对漂白粉稳定的淀粉酶与对漂白粉稳定的蛋白酶的结合使用，能保持其大部分的原有活性；而在同样的时间内，野生型酶的结合使用导致其80％的原有活性的丧失。

序列表(1)一般信息：

(i)申请人：克里斯托弗·巴内特

科林·米钦森

斯科特·D·鲍尔

(ii)发明名称：改进的清洁组合物

(iii)序列数目：68

(iv)联系地址：

(A)地址：金内克国际公司

(B)街道：180 Kimball Way

(C)城市：South San Francisco

(D)州：CA

(E)国家：美国

(F)邮政编码：94080

(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘(B)计算机类型：IBM兼容机(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS(D)软件：PatentIn Relase#1.0，#1.25版

(vi)当前申请数据

(A)申请号：

(B)申请日期：

(C)分类：

(viii)律师/代理人信息：

(A)姓名：Horn，Margaret A.

(B)注册号：33，401

(C)参考/文档号：GC220-3

(ix)电子通讯信息：

(A)电话：(415)742-7536

(B)电传：(415)742-7217(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：56碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

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(i)序列特征：

(A)长度：29碱基对

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(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

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(A)长度：34碱基对

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(i)序列特征：

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(i)序列特征：

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(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：AGCTTGAAGA AGTGAAGAAG CAGAGAGGCT ATTGAATAAA TGAGTAGAAA GCGCCATATC 60GGCGCTTTTC TTTTGGAAGA AAATATAGGG AAAATGGTAC TTGTTAAAAA TTCGGAATAT 120TTATACAACA TCATATGTTT CACATTGAAA GGGGAGGAGA ATCATGAAAC AACAAAAACG 180GCTTTACGCC CGATTGCTGA CGCTGTTATT TGCGCTCATC TTCTTGCTGC CTCATTCTGC 240AGCAGCGGCG GCAAATCTTA ATGGGACGCT GATGCAGTAT TTTGAATGGT ACATGCCCAA 300TGACGGCCAA CATTGGAAGC GTTTGCAAAA CGACTCGGCA TATTTGGCTG AACACGGTAT 360TACTGCCGTC TGGATTCCCC CGGCATATAA GGGAACGAGC CAAGCGGATG TGGGCTACGG 420TGCTTACGAC CTTTATGATT TAGGGGAGTT TCATCAAAAA GGGACGGTTC GGACAAAGTA 480CGGCACAAAA GGAGAGCTGC AATCTGCGAT CAAAAGTCTT CATTCCCGCG ACATTAACGT 540TTACGGGGAT GTGGTCATCA ACCACAAAGG CGGCGCTGAT GCGACCGAAG ATGTAACCGC 600GGTTGAAGTC GATCCCGCTG ACCGCAACCG CGTAATTTCA GGAGAACACC TAATTAAAGC 660CTGGACACAT TTTCATTTTC CGGGGCGCGG CAGCACATAC AGCGATTTTA AATGGCATTG 720GTACCATTTT GACGGAACCG ATTGGGACGA GTCCCGAAAG CTGAACCGCA TCTATAAGTT 780TCAAGGAAAG GCTTGGGATT GGGAAGTTTC CAATGAAAAC GGCAACTATG ATTATTTGAT 840GTATGCCGAC ATCGATTATG ACCATCCTGA TGTCGCAGCA GAAATTAAGA GATGGGGCAC 900TTGGTATGCC AATGAACTGC AATTGGACGG TTTCCGTCTT GATGCTGTCA AACACATTAA 960ATTTTCTTTT TTGCGGGATT GGGTTAATCA TGTCAGGGAA AAAACGGGGA AGGAAATGTT 1020TACGGTAGCT GAATATTGGC AGAATGACTT GGGCGCGCTG GAAAACTATT TGAACAAAAC 1080AAATTTTAAT CATTCAGTGT TTGACGTGCC GCTTCATTAT CAGTTCCATG CTGCATCGAC 1140ACAGGGAGGC GGCTATGATA TGAGGAAATT GCTGAACGGT ACGGTCGTTT CCAAGCATCC 1200GTTGAAATCG GTTACATTTG TCGATAACCA TGATACACAG CCGGGGCAAT CGCTTGAGTC 1260GACTGTCCAA ACATGGTTTA AGCCGCTTGC TTACGCTTTT ATTCTCACAA GGGAATCTGG 1320ATACCCTCAG GTTTTCTACG GGGATATGTA CGGGACGAAA GGAGACTCCC AGCGCGAAAT 1380TCCTGCCTTG AAACACAAAA TTGAACCGAT CTTAAAAGCG AGAAAACAGT ATGCGTACGG 1440AGCACAGCAT GATTATTTCG ACCACCATGA CATTGTCGGC TGGACAAGGG AAGGCGACAG 1500CTCGGTTGCA AATTCAGGTT TGGCGGCATT AATAACAGAC GGACCCGGTG GGGCAAAGCG 1560AATGTATGTC GGCCGGCAAA ACGCCGGTGA GACATGGCAT GACATTACCG GAAACCGTTC 1620GGAGCCGGTT GTCATCAATT CGGAAGGCTG GGGAGAGTTT CACGTAAACG GCGGGTCGGT 1680TTCAATTTAT GTTCAAAGAT AGAAGAGCAG AGAGGACGGA TTTCCTGAAG GAAATCCGTT 1740TTTTTATTTT GCCCGTCTTA TAAATTTCTT TGATTACATT TTATAATTAA TTTTAACAAA 1800GTGTCATCAG CCCTCAGGAA GGACTTGCTG ACAGTTTGAA TCGCATAGGT AAGGCGGGGA 1860TGAAATGGCA ACGTTATCTG ATGTAGCAAA GAAAGCAAAT GTGTCGAAAA TGACGGTATC 1920GCGGGTGATC AATCATCCTG AGACTGTGAC GGATGAATTG AAAAAGCT 1968(2)SEQ ID NO.32的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：483个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro1 5 10 15Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu

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(i)序列特征：

(A)长度：511个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：Met Lys Gln Gln Lys Arg Leu Tyr Ala Arg Leu Leu Thr Leu Leu Phe1 5 10 15Ala Leu Ile Phe Leu Leu Pro His Ser Ala Ala Ala Ala Ala Asn Leu

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195 200 205Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu

210 215 220Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val Ala Ala Glu Ile225 230 235 240Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln Leu Asp Gly Phe

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290 295 300Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Gln Phe305 310 315 320His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg Lys Leu Leu

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405 410 415Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr Phe Asp

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435 440 445Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly Ala Lys

450 455 460Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr Trp His Asp Ile465 470 475 480Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly Trp Gly

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(i)序列特征：

(A)长度：520个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：Met Arg Gly Arg Gly Asn Met Ile Gln Lys Arg Lys Arg Thr Val Ser1 5 10 15Phe Arg Leu Val Leu Met Cys Thr Leu Leu Phe Val Ser Leu Pro Ile

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515 520(2)SEQ ID NO.35的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：548个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链性：单链

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(ii)分子类型：蛋白质Val Leu Thr Phe His Arg Ile Ile Arg Lys Gly Trp Met Phe Leu Leu1 5 10 15Ala Phe Leu Leu Thr Ala Ser Leu Phe Cys Pro Thr Gly Arg His Ala

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(i)序列特征：

(A)长度：483个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：蛋白

(xi)序列描述：SEQ ID NO：36：Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro1 5 10 15Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu

20 25 30Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly

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340 345 350Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly

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450 455 460Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr465 470 475 480Val Gln Arg(2)SEQ ID NO.37的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：487个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：37：Ala Ala Ala Ala Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu1 5 10 15Trp Tyr Met Pro Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp

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115 120 125Arg Asn Arg Val Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His

130 135 140Phe His Phe Pro Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His145 150 155 160Trp Tyr His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn

165 170 175Arg Ile Tyr Lys Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn

180 185 190Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp

195 200 205His Pro Asp Val Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala

210 215 220Asn Glu Leu Gln Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile225 230 235 240Lys Phe Ser Phe Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr

245 250 255Gly Lys Glu Met Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly

260 265 270Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe

275 280 285Asp Val Pro Leu His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly

290 295 300Gly Tyr Asp Met Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His305 310 315 320Pro Leu Lys Ser Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly

325 330 335Gln Ser Leu Glu Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr

340 345 350Ala Phe Ile Leu Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly

355 360 365Asp Met Tyr Gly Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu

370 375 380Lys His Lys Ile Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr385 390 395 400Gly Ala Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr

405 410 415Arg Glu Gly Asp Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile

420 425 430Thr Asp Gly Pro Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn

435 440 445Ala Gly Glu Thr Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val

450 455 460Val Ile Asn Ser Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser465 470 475 480Val Ser Ile Tyr Val Gln Arg

485(2)SEQ ID NO.38的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：32个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：38：Met Lys Gln Gln Lys Arg Leu Thr Ala Arg Leu Leu Thr Leu Leu Phei 5 10 15Ala Leu Ile Phe Leu Leu Pro His Ser Ala Ala Ala Ala Ala Asn Leu

20 25 30(2)SEQ ID NO.39的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：33个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：39：Met Arg Ser Lys Thr Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu1 5 10 15Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala Ala Gly Lys

20 25 30Ser(2)SEQ ID NO.40的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：35个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：40：Met Arg Ser Lys Thr Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu1 5 10 15Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala Ala Ala Ala

20 25 30Ala Ala Asn

35(2)SEQ ID NO.41的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：32个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：蛋白

(xi)序列描述：SEQ ID NO：41：Met Arg Ser Lys Thr Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu1 5 10 15Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala Ala Asn Leu

20 25 30(2)SEQ ID NO.42的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：33碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：42：CACCTAATTA AAGCTTTCAC ACATTTTCAT TTT 33(2)SEQ ID NO.43的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：33碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：43：CACCTAATTA AAGCTTACAC ACATTTTCAT TTT 33(2)SEQ ID NO.44的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：66碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：44：CCGCGTAATT TCCGGAGAAC ACCTAATTAA AGCCGCAACA CATTTTCATT TTCCCGGGCG 60CGGCAG 66(2)SEQ ID NO.45的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：42碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

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(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：45：CCGGAGAACA CCTAATTAAA GCCCTAACAC ATTTTCATTT TC 42(2)SEQ ID NO.46的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：42碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：46：CCGGAGAACA CCTAATTAAA GCCCACACAC ATTTTCATTT TC 42(2)SEQ ID NO.47的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：42碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：47：CCGGAGAACA CCTAATTAAA GCCTGCACAC ATTTTCATTT TC 42(2)SEQ ID NO.48的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：48：GATGCAGTAT TTCGAACTGG TATA 24(2)SEQ ID NO.49的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：26碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：49：TGCCCAATGA TGGCCAACAT TGGAAG 26(2)SEQ ID NO.50的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：50：CGAATGGTAT GCTCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.51的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：51：CGAATGGTAT CGCCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.52的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：52：CGAATGGTAT AATCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.53的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID N0：53：CGAATGGTAT GATCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.54的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：54：CGAATGGTAT CACCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.55的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：55：CGAATGGTAT AAACCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.56的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：56：CGAATGGTAT CCGCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.57的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：57：CGAATGGTAT TCTCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.58的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：58：CGAATGGTAC ACTCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.59的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：59：CGAATGGTAT GTTCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.60的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：60：CGAATGGTAT TGTCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.61的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：61：CGAATGGTAT CAACCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.62的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)序列描述：SEQ ID NO：62：CGAATGGTAT GAACCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.63的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：63：CGAATGGTAT GGTCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.64的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：64：CGAATGGTAT ATTCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.65的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：65：CGAATGGTAT TTTCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.66的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：66：CGAATGGTAC TGGCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.67的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：67：CGAATGGTAT TATCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.68的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：68：CCGTCATTGG GACTACGTAC CATT 24

Claims

1、一种改进的含漂白粉的清洁组合物，所述的改进包括在该含漂白粉的清洁组合物中加入一种突变型α-淀粉酶，该突变型α-淀粉酶为一编码α-淀粉酶的突变DNA序列的表达产物，该突变DNA序列是通过对一种前体α-淀粉酶的相当于地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的M+197位的甲硫氨酸进行取代并对相当于地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的M+15或W+138位的一个或多个甲硫氨酸或色氨酸进行取代而得到的。

2、如权利要求1所述的改进的清洁组合物，其中该清洁组合物为一洗碗清洁组合物。

3、如权利要求1所述的改进的清洁组合物，其中突变型α-淀粉酶选自由M15T/M197T； M15S/M197T； W138Y/M197T； M15S/W138Y/M197T 和M15T/W138Y/M197T组成的一组。

4、如权利要求1所述的改进的清洁组合物，进一步包括一种突变型蛋白酶，该突变型蛋白酶为一编码蛋白酶的突变DNA序列的表达产物，该突变DNA序列是通过对一种前体蛋白酶的相当于解淀粉芽孢杆菌蛋白酶的M+222位的甲硫氨酸进行取代而得到的。

5、如权利要求4所述的改进的清洁组合物，其中突变型蛋白酶含有选自由丙氨酸、半胱氨酸和丝氨酸组成的一组的取代。

6、如权利要求4所述的改进的清洁组合物，含有选自由M15T/M197T；M15S/M197T；W138Y/M197T；M15S/W138Y/M197T和M15T/W138Y/M197T组成的一组的一个α-淀粉酶突变体，以及一个选自由M222C，M222S和M222A组成的一组的一个蛋白酶突变体。

7、如权利要求6所述的改进的清洁组合物，其为颗粒状组合物。