HUT77748A

HUT77748A - Javított tisztítószer

Info

Publication number: HUT77748A
Application number: HU9800643A
Authority: HU
Inventors: Christopher C. Barnett; Colin Mitchinson; Scott D. Power
Original assignee: Genencor International, Inc.
Priority date: 1994-08-11
Filing date: 1995-08-09
Publication date: 1998-07-28
Also published as: PL318209A1; AU3366295A; AU686007B2; NO970609L; NZ291984A; NO970609D0; WO1996005295A2; CO4440440A1; MX9700776A; WO1996005295A3; FI970563A0; BR9508582A; JPH10504197A; CN1158637A; KR970704872A; EP0775201A2; FI970563A; CA2197203A1

Description

1994. 08. 11. (08/289,351) US

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/US95/10426

A nemzetközi közzététel száma: WO 96/05295

A találmány tárgyát új α-amiláz mutánsok képezik, amelyeknek az aminosav szekvenciája nem található meg a természetben, és ezeknek a mutánsoknak az aminosav szekvenciájában egy prekurzor α-amiláz egy vagy több aminosav csoportját, pontosabban bármelyik oxidálható aminosavat egy másik aminosavval helyettesítik. A találmány szerinti mutáns enzimek a prekurzorral összehasonlítva megváltozott oxidatív stabilitással, megváltozott pH profillal, megváltozott specifikus aktivitással és/vagy megváltozott termostabilitással rendelkeznek. A találmány tárgyát képezik a mutáns amilázokat tartalmazó detergensek és keményítő elfolyósító készítmények, valamint a mutáns amilázok alkalmazási módszerei. Különösen előnyös α-amilázok a MET197 vagy MET15 vagy TRP138 pozíciókban helyettesített Bacillus licheniformis mutáns α-amilázok, vagy az egyéb mikrobiális forrásokból (Bacillus,

Aspergillus)származó, ekvivalens egyéb a-amilázok.

pozíciókban helyettesített • · ·

63.391/SZE

S.B.G. &Κ·

Nemzetközi Szabadalmi Iroda »’7 ν.'Ί Τ:--'?· _v

- j.-j j. .ÉLÍL/.i

FELDÁNY

Javított tisztítószer

Genencor International, Inc., ROCHESTER, New York, US

Colin MITCHINSON,

Scott D. POWER,

SOUTH	SAN	FRANCISCO,	CA,	US
SOUTH	SAN	FRANCISCO,	CA,	US
SOUTH	SAN	FRANCISCO,	CA,	US

A bejelentés napja: 1995. 08. 09.

Elsőbbsége: 1994. 08. 11. (08/289,351) US

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/US95/10426

A nemzetközi közzététel száma: WO 96/05295

A jelen találmány tárgyát új α-amiláz mutánsok képezik, amelyeknek az aminosav szekvenciája nem található meg a természetben, és ezeknek a mutánsoknak az aminosav szekvenciájában egy prekurzor α-amiláz egy vagy több aminosav csoportját, pontosabban bármelyik oxidálható aminosavat egy másik aminosavval helyettesítjük. A jelen találmány szerinti mutáns enzimek megváltozott stabilitással/aktivitással rendelkeznek, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a megváltozott oxidatív stabilitást, a megváltozott pH profilt, a megváltozott specifikus aktivitást és/vagy a megváltozott termostabilitást.

Az a-amilázok (α-l,4-glükán-4-glükanohidroláz, EC3.2.1.1) leginkább véletlenszerűen hidrolizálják a keményítőben levő belső α-l,4-glükozidos kötéseket, és így kisebb molekulasúlyé malto-dextrinek keletkeznek. Az α-amilázoknak jelentős a kereskedelmi értékük, használják például a keményítő feldolgozásának induló lépésében (elfolyósítás) ; az alkoholtermelésben; tisztító anyagként detergens mátrixokban, valamint a textiliparban a keményítő méretének csökkentésére. Az α-amilázokat számos különböző mikroorganizmus termeli, beleértve a Bacillus-okatt, az Aspergillus-okat, de a legtöbb kereskedelmi forgalomban levő amiláz bakteriális forrásból származik, azaz Bacillus licheniformis-ból, Bacillus amiloliquefaciens-ből, Bacillus subtilis-ből vagy Bacillus stearothermophilus-ból. Az utóbbi években a kereskedelmi forgalomban előnyben részesített enzimeket Bacillus licheniformisszal állítják elő, a hőstabilitásuk és a teljesítőképességük miatt, legalábbis semleges és enyhén lúgos pH-n.

Korábban végeztek vizsgálatokat rekombináns DNS technikákat alkalmazva, annak tanulmányozására, hogy mely csoportok fontosak az amilázok katalitikus aktivitásához, és hogy tanulmányozzák a különböző amilázok aktív centrumában levő bizonyos aminosavak módosításának hatását [ Vihibeb, M. és mtsai: Journal of Biochemistry 107, 267-272 (1990); Hóim L. és mtsai: Protein Engineering _3< 181-191 (1990); Takase, K. és mtsai: Biochímica et Biophysica Acta 1120, 281-288 (1992); Matsui és mtsai: FEBS Letters 310 (3), 216-218 (1992)] , azt, hogy mely aminosavak fontosak a hőstabilitáshoz [Suzuki, Y. és mtsai: Journal of Biological Chemistry 264, 18933-18938 (1989)], és egy csoport ezeket a módszereket arra használta, hogy különböző hisztidin csoportok helyére mutációkat vigyen be egy Bacillus licheniformis amilázba. Az ok, amiért a hisztidin csoportokat más csoportokkal helyettesítették, az az, hogy a Bacillus licheniformis amiláz (amelyről közismert, hogy hőstabil), más hasonló Bacillus amilázokkal összehasonlítva túl sok hisztidint tartalmaz, és így az volt az elképzelés, hogy ha a hisztidint helyettesítik, akkor ez befolyásolhatja az enzim hőstabilitását [ Derclerck, N. és mtsai: Journal of Biological Chemistry 265, 15481-15488 (1990); FR 2 665 178-A1; Joyet, P. és mtsai: Bio/Technology 10, 1579-1583 (1992)] .

Kiderült, hogy az α-amilázt a hidrogénperoxid és egyéb oxidálószerek inaktiválják, pH=4 és 10,5 között. Az iparban az α-amilázokat rendkívül eltérő körülmények között használhatják, azaz például mind magas mind alacsony pH mellett, az ipari alkalmazástól függően. Az a-amilázok használhatók például keményítő elfolyósítására alacsony pH-n (pH<5,5). Másrészt viszont az amilázok használhatók kereskedelmi forgalomban levő edénytisztítókben vagy mosószerekben, amelyek gyakran tartalmaznak oxidálószereket, azaz például fehérítőt- vagy peracidokat, és amelyeket gyakran alkalmaznak sokkal lúgosabb körülmények között.

Ahhoz, hogy megváltoztassuk az amiláz enzimek stabilitását vagy aktivitásprofilját különböző körülmények között, kiderítették, hogy az oxidálható aminosavak, azaz például a metionin, triptofán, tirozin, hisztidin vagy cisztein helyettesítése vagy deléciója a prekurzorhoz hasonlítva megváltozott profillal rendelkező variáns enzimet eredményez. Mivel a jelenleg kereskedelmi forgalomban levő amilázok nem elfogadhatóak (stabilak) különböző körülmények között, ezért szükség van egy olyan amilázra, amelynek megváltoztatott stabilitása és aktivitásprofilja van. Ez a megváltoztatott stabilitás (oxidációval, hővel szemben, vagy megváltoztatott pH profil) elérhető, miközben megtartunk egy elfogadható enzimaktivitást, a vad típusú vagy prekurzor enzimmel összehasonlítva. Az ilyen mutációk bejuttatásával érintett jellemző lehet az oxidatív stabilitás megváltozása, míg megmarad a hőstabilitás, vagy fordítva. Emellett a különböző aminosavak helyettesítése egy oxidálható aminosavra az α-amiláz prekurzor szekvenciában, vagy egy vagy több oxidálható aminosav deléciója megváltozott enzimaktivitást eredményezhet egy olyan pH-η, ami eltér attól, amit optimálisnak gondolnak a prekurzor α-amiláz számára.

Másszóval, a jelen találmány szerinti mutáns enzimeknek is lehet megváltozott pH-függő teljesítmény-profiljuk, ami lehet az enzim fokozott oxidatív stabilitásának a következménye.

A jelen találmány tárgyát olyan új α-amiláz mutánsok képezik, amelyek egy α-amilázt kódoló mutáns DNS szekvencia expressziós termékei, és az elmutált DNS szekvencia egy prekurzor α-amilázból származik, egy vagy több oxidálható aminosav deléciójával vagy helyettesítésével (cseréjével). A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a mutáns abból származik, hogy a prekurzor α-amilázban egy vagy több metionin helyére más aminosavat építünk be. A jelen találmány egy másik megvalósítási módja szerint a mutánsokban egy vagy több triptofán aminosavat helyettesítünk, vagy csak önmagában, vagy ezt a helyettesítést kombináljuk egy vagy több metionin csoport helyettesítésével a prekurzor α-amilázban. Az ilyen mutáns α-amilázokat általában egy prekurzor, a természetben előforduló vagy rekombináns α-amilázt kódoló DNS szekvencia in vitro módosításával állítjuk elő, és a módosítás célja, hogy ezzel egy vagy több aminosav helyettesítésének vagy deléciójának kódolását érjük el egy prekurzor aminosav szekvenciájában .

Egy vagy több aminosavnak az aminosav szekvenciában való helyettesítése vagy deléciója egy vagy több metionin, triptofán, cisztein, hisztidin vagy tirozin helyettesítését vagy delécióját eredményezi egy ilyen szekvenciában, a legelőnyösebb, ha a megváltoztatott csoport egy metionin csoport. Az oxidálható aminosav csoportok a 20 természetes aminosav bármelyikével helyettesíthetők. Ha a kívánt hatás az, hogy változtassuk meg a prekurzor oxidatív stabilitását, akkor az aminosav csoport helyettesíthető vagy egy nem oxidálható aminosavval (azaz például alaninnal, argininnel, aszparaginnal, aszparaginsavval, glutaminsavval, glutaminnal, glicinnel, izoleucinnal, leucinnal, lizinnel, fenilalaninnal, prolinnal, szerinnel, treoninnal vagy valinnal) vagy egy másik oxidálható aminosavval (azaz például ciszteinnel, metioninnal, triptofánnal, tirozinnal vagy hisztidinnel; a felsorolás a csökkenő oxidálhatóság irányába történt). Hasonlóképpen, ha a kívánt hatás az, hogy megváltoztassuk a hőstabilitást, akkor a többi 20 természetes aminosav közül bármelyik helyettesíthető (azaz például a metionin ciszteinnel helyettesíthető). Az előnyös mutánsokban egy olyan metionin csoportot helyettesítünk, amely ekvivalens a Bacillus licheniformis α-amiláz bármelyik metionin csoportjával (+8, +15, +197, +256, +304, +366 és +438). Legelőnyösebb, ha a helyettesített metionin egy, a Bacillus licheniformis α-amiláz +197-es vagy +15-ÖS pozíciójával ekvivalens pozícióban levő metionin. A +197-es pozícióban levő metionin helyettesítésére előnyben részesített aminosav lehet az alanin (A), az izoleucin (I), a treonin (T) vagy a cisztein (C) . A +15-os pozícióban levő aminosav helyettesítésére előnyben részesített aminosav a leucin (L), a treonin (T), az aszparagin (Ν), az aszparaginsav (D), a szerin (S), a valin (V) és az izoleucin (I), jóllehet más, az előzőkben nem specifikált aminosav is megfelelő lehet. A jelen találmány két különösen előnyös mutánsa az M197T és az M15L.

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá az olyan mutánsok, amelyekben a Bacillus licheniformis a-amilázban (lásd 2. ábra) talált triptofán csoportokkal ekvivalens triptofán csoportot helyettesítjük. A helyettesítendő triptofán előnyösen a Bacillus licheniformis α-amilázban a +138-as pozícióban található csoport. Egy triptofán csoport mutációját (helyettesítését) végezhetjük önmagában, vagy egyéb oxidálható aminosav csoportok helyettesítésével kombinálva. Pontosabban, előnyös lehet, ha legalább egy triptofán helyettesítését kombináljuk legalább egy metionin helyettesítésével (például a +138/+197 kettős mutáns).

A jelen találmány szerinti α-amiláz mutánsok általában megváltozott oxidatív stabilitással rendelkeznek hidrogénperoxid és egyéb oxidálószerek, azaz például fehérítőszer vagy persavak jelenlétében, illetve még pontosabban enyhébb oxidálószerek, azaz például kloramin-T jelenlétében. A fokozott oxidatív stabilitással rendelkező mutáns enzimek hasznosak lehetnek a raktározási idő meghosszabbításában, és fehérítőszer, perborát, perkarbonát vagy persav kompatibilitást biztosítanak a tisztítószerekben alkalmazott amilázoknak. Hasonlóképpen, a redulált oxidatív stabilitás hasznos lehet olyan ipari folyamatokban, ahol az enzimaktivitás gyors és hatékony kioltására van szükség. A jelen találmány szerinti mutáns enzimek szélesebb pH tartományban lehetnek hatékonyak, míg néhány mutáns, mint például az ML15 alacsony pH értéken végzett keményítő elfolyósítás esetén mutat stabilitást, az M197T pedig magas pH-η alkalmazott tisztítószer termékekben mutat stabilitást. A jelen találmány szerinti mutánsok megváltozott hőstabilitással is rendelkezhetnek, azaz a mutáns fokozott stabilitást mutathat magas vagy alacsony hőmérsékleten. Az nyilvánvaló, hogy minden változás (növelés vagy csökkentés) a mutáns enzimatikus jellemzőjé(i)ben, a prekurzorral összehasonlítva, előnyös lehet, a mutáns α-amiláz végső felhasználásától függően.

A keményítő feldolgozásban és tisztítószerben való alkalmazás mellett a jelen találmány szerinti amiláz variánsok használhatók bármely olyan alkalmazásban, amelyekben ismert amilázokat alkalmaznak, például amiláz variánsok használhatók a textilfeldolgozásban, élelmiszeriparban, stb. Pontosabban, azt is megfontolás tárgyává tették, hogy egy variáns enzim, azaz például az M197C, amit oxidálással könnyen inaktiválni lehet, használható lehet egy olyan eljárásban, ahol arra van szükség, hogy az eljárás végén teljesen megszüntessük az amiláz aktivitást, azaz például a mélyhűtött ételek készítése során.

A jelen találmány szerinti előnyben részesített a-amiláz mutánsok egy Bacillus törzsből származnak, azaz például Bacillus licheniformis-ból, Bacillus amiloliquefaciens-ből és Bacillus stearothermophilus-ból, legelőnyösebb a Bacillus licheniformis-ből származó.

A jelen találmány tárgya a normális körülmények között Bacillus licheniformis által termelt α-amiláz új formájának előállítása. Ez az új forma, jele A4 forma, további négy alanin csoporttal rendelkezik a kiválasztott amiláz N-terminálisán (4b. ábra). Az A4 formájú α-amilázok származékai vagy mutánsai a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak. Az A4 forma származékai vagy mutánsai alatt azt értjük, hogy a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak az A4 α-amilázoknak azok a származékai, amelyek egy vagy több addicionális mutációt tartalmaznak, azaz például egy vagy több oxidálható aminosav mutációját (helyettesítés vagy deléció).

A jelen találmány tárgyát képezik azok a detergens készítmények, folyadék, gél vagy granulátum formájában, amelyek az alábbiakban ismertetett α-amiláz mutánsokat tartalmazzák.

Különösen előnyösek azok a detergens készítmények, amelyek a +197-es pozícióban megváltoztatott mutánst tartalmaznak, akár önmagukban, akár más enzimekkel, azaz például endoglikozidázokkal, cellulázokkal, proteázokkal, lipázokkal vagy egyéb amiláz enzimekkel kombinálva. Emellett az is megfontolás tárgyát képezi, hogy a jelen találmány szerinti készítmények tartalmazhatnak olyan α-amiláz mutánst, amely egynél több helyspecifikus mutációt tartalmaz.

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá a keményítő feldolgozásban, főleg a keményítő elfolyósításban alkalmazott enzimek. A jelen találmány szerinti keményítő elfolyósító készítmények előnyösen tartalmaznak egy α-amiláz mutánst, amely az M15 pozícióban szubsztitúciót vagy deléciót tartalmaz. Emellett az is megfontolás tárgyát képezi, hogy az ilyen készítmények tartalmazhatnak további, a szakterületen jártas szakember számára ismert komponenseket, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az antioxidánsokat, kalciumot, ionokat, stb.

A jelen találmány tárgyát képezik a keményítő, főleg a granulált keményítőiszap (akár nedves, akár száraz feldolgozásból származó) elfolyósífására kidolgozott eljárások. A keményítő lebontásában az első lépés általában az, hogy a kiindulási keményítőiszapot elgélesítjük, viszonylag magas hőmérsékletre (egész kb. 110 °C-ig) való melegítéssel. Miután a

keményítőiszap elgélesedett, egy α-amiláz alkalmazásával elfolyósítjuk vagy dextrinizáljuk. Az ilyen elfolyósítás körülményeit a 07/785,624 és 07/785,623 Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi bejelentésben és az 5,180,669 számú szabadalomban írják le, amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk. A keményítő elfolyósítás jelenleg alkalmazott módszere abból áll, hogy egy keményítőiszaphoz hatékony mennyiségű, a jelen találmány szerinti α-amilázt adunk, vagy csak önmagában, vagy egyéb töltőanyagokkal, azaz például egy antioxidánssal együtt, és az iszapot megfelelő ideig és hőmérsékleten reagáltatjuk a keményítő elfolyósítására.

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá a jelen találmány szerinti mutáns α-amilázokat (beleértve az A4 formát és annak mutánsait) kódoló DNS-ek, valamint a DNS-t hordozó expressziós vektorok és az ezekkel az expressziós vektorokkal transzformált gazdasejtek.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.

Az 1. ábrán a Bacillus licheniformis-ból (NCIB8061) származó α-amiláz DNS szekvenciáját láthatjuk (31. számú szekvencia) , valamint az abból következő transzlációs terméket [ Gray és mtsai: Journal of Bacteriology 166, 635-643 (1986)] .

A 2. ábrán a Bacillus licheniformis-ból (NCIB80961) származó érett α-amíláz aminosav szekvenciáját láthatjuk (32.

számú szekvencia).

A 3. ábrán a Bacillus α-amilázok elsődleges szerkezetének egymáshoz illesztése látható. A Bacillus licheniformís amilázt (Am-Lich, 33. számú szekvencia) Gray, G. és munkatársai ismertetik [Gray, G. és mtsai: Journal of Bacteriology 166, 635-643 (1986)]; a Bacillus amiloliquefaciens amilázt (AmAmylo, 34. számú szekvencia) Takkinen és munkatársai írták le [ Takkinen és mtsai: Journal of Biological Chemistry 258, 10071013 (1983)]; a Bacillus stearothermophilus amilázt (Am-Stearo,

35. számú szekvencia) Ihara, H. és munkatársai írták le [ Ihara és mtsai: J. Biochem. 98, 95-103 (1985)] .

A 4a. ábrán az érett α-amiláz M197T variáns aminosav szekvenciája látható (36. számú szekvencia).

A 4b. ábrán a Bacillus licheniformis NCIB8061-ből származó α-amiláz A4 formájának aminosav szekvenciája látható (37.

számú szekvencia). A számozás az N-terminálisról indul, a négy hozzáadott alaninnal kezdődően.

Az 5. ábrán a pA4BL plazmid látható, amelyben BLAA jelentése a Bacillus licheniformis α-amiláz génje, Pstl-től Sstlig; Amp^R jelentése a pBR322 plazmidból származó ampicillin rezisztencia gén; CAT jelentése a pC194-ből származó kloramfenikol rezisztencia gén.

A 6. ábrán a Bacillus licheniformis (38. számú szekvencia), a Bacillus subtilis (39. számú szekvencia), a Bacillus licheniformis pA4BL-ben (40. számú szekvencia) és a Bacillus licheniformis pBLapr-ben (41. számú szekvencia) levő szignálszekvencia-érett fehérje kapcsolódásokat láthatjuk.

A 7a. ábrán bizonyos α-amilázok (Spezyme AA20, M197L (A4 forma)) inaktiválódása látható, 0,88 mol/1 hidrogénperoxiddal kezelve pH=10,0 mellett 25 °C-on.

A 7b. ábrán bizonyos α-amilázok (Spezyme AA20, M197T) inaktiválódása látható, 0,88 mol/1 hidrogénperoxiddal kezelve pH=10,0 mellett 25 °C-on.

A 7c. ábrán bizonyos α-amilázok (Spezyme AA20, M15L) inaktiválódása látható, 0,88 mol/1 hidrogénperoxiddal kezelve pH=10,0 mellett 25 °C-on.

A 8. ábrán az M197X kazetta mutánsok előállításának sémája látható.

A 9. ábrán az M197X variánsok expressziója látható.

A 10. ábrán az M197X variánsok pH=5,0 értéken mutatott hőstabilitása látható, 5 mmol/1 CaCl₂ koncentráció mellett, 95 °C-on, 5 percig.

A 11a. és 11b. ábrán bizonyos amilázok mosogatógép mosószerekben való inaktiválódása látható. A 11a. ábrán bizonyos amilázok Cascade-ben (egy kereskedelmi forgalomban kapható mosogatószer) stabilitása látható 65 °C-on. A 11b.

ábrán bizonyos amilázok Sunlight-ben (kereskedelmi forgalomban levő mosogatószer) való stabilitása látható, keményítő jelenlétében illetve távollétében.

A 12. ábrán az M15X kazetta mutánsok előállításának sémája látható.

A 13. ábrán Az M15X variánsok expressziója látható.

A 14. ábrán az M15X variánsok specifikus aktivitása látható oldható keményítővel.

A 15. ábrán az M15X variánsok hőstabilitása látható 90 ‘’Con, pH=5,0, 5 mmol/1 CaCl₂ koncentráció mellett, 5 percig.

A 16. ábrán az M15 variánsok keményítőn és oldható szubsztráton mutatott specifikus aktivitása látható, valamint a folyadéksugár elfolyósítás teljesítménye pH=5,5 mellett, a vad típusú Bacillus licheniformis aktivitásának százalékában.

A 17. ábrán a Bacillus licheniformis α-amiláz (AA20 0,65 mg/ml mellett) inaktiválódása látható kloramin-T-vel pH=8,0-n, az M197A (1,7 mg/ml) és az M197L (1,7 mg/ml) variánsokkal összehasonlítva.

A 18. ábrán Bacillus licheniformis α-amiláz (AA20 0,22 mg/ml mellett) inaktiválódása látható kloramin-T-vel pH=4,0-n, az M197A (4,3 mg/ml) és az M197L (0,53 mg/ml) variánsokkal összehasonlítva.

A 19. ábrán Bacillus licheniformis α-amiláz (AA20 0,75 mg/ml mellett) reakciója látható kloramin-T-vel pH=5,0-n, az M197T/W138F (0,64 mg/ml) és az M197T/W138Y (0,60 mg/ml) kettős variánsokkal összehasonlítva.

A 20. ábrán a különböző α-amiláz többszörös mutánsok stabilitási vizsgálatainak eredményei láthatók, amelyeket egy automata mosogatógépben használt mosogatószer készítménybe (ADD) tettünk bele; a hőmérséklettartomány szobahőmérséklettől 65 °C-ig terjed.

A 21. ábrán bizonyos amiláz mutánsok stabilitása látható (a vad típushoz viszonyítva) egy automata mosogatógéphez használt mosogatószerben, szobahőmérsékleten, 0-30 napig, a vizsgált időtartam alatt megmaradt százalékos aktivitás formájában kifejezve.

A 22. ábrán bizonyos amiláz mutánsok stabilitása látható (a vad típussal összehasonlítva) egy automata mosogatógépben használt mosogatószerben 38 °C-on, 80 százalékos relatív páratartalom mellett, 0-30 nap alatt.

Az a vélemény alakult ki, hogy a keményítő elfolyósításában alkalmazott amilázok valamilyen formájú inaktiválás tárgyai lehetnek, a keményítőiszapban jelenlevő valamilyen aktivitás miatt [lásd a 07/785,624 és a 07/785,623 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés, valamint az 1993. január 19-én megadott 5,180,669 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalom] . Emellett, ha egy amilázt oxidálószerek, azaz például fehérítőszert vagy persavat tartalmazó detergensek jelenlétében használunk, akkor ez az amiláz részleges vagy teljes inaktiválását eredményezheti. Ennek következtében a jelen találmány az amilázok oxidációval szemben mutatott érzékenységének csökkentésére irányul. A jelen találmány szerinti mutáns enzimeknek megváltozhat a pH-profilja és/vagy megváltozhat a hőstabilitása, ami az enzim alacsony vagy magas pH-η megfigyelhető fokozott oxidatív stabilitásának lehet köszönhető.

A továbbiakban az α-amiláz fogalomkörbe beletartoznak mind a természetben előforduló amilázok mind a rekombináns amilázok. A jelen találmány szerint előnyben részesített amilázok a Bacillus licheniformis-ból vagy Bacillus stearothermophilus-ból származó α-amilázok, beleértve jelen leírásban ismertetett Bacillus licheniformis-ból származó aamiláz A4 formáját, valamint a gomba eredetű α-amilázokat, azaz például az Aspergillus-ból (azaz az Aspergillus oryzae-ből és Aspergillus niger-ből) származókat.

A rekombináns α-amilázok szakkifejezés egy olyan aamilázokra vonatkozik, amelyekben a természetben előforduló aamilázt kódoló DNS szekvenciáját módosítják, ezzel olyan mutáns

DNS szekvenciákat állítanak elő, amelyek az α-amiláz szekvenciában levő egy vagy több aminosav helyettesítését, inszercióját vagy delécióját kódolják. Az alkalmas módosítási módszereket az alábbiakban ismertetjük, valamint megtalálhatók a 4,760,025 és 5,185,258 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentésben, amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk.

Csaknem mindegyik, a mai napig szekvenált endo-amilázban találtak homológiákat, beleértve a növényekből, emlősökből és baktériumokból származó enzimeket is [Nakajima, R.T. és mtsai: Appl. Microbiol. Biotechnoi. 23, 355-360 (1986); Rogers, J.C.:

Biochem. Biophys. Rés. Commun. 128, 470-476 (1985)] . Néhány

Bacillus amilázban négy, különösen nagy homológiát mutató részt találtak, amit a 3. ábrán mutatunk be, amelyekben az aláhúzott részek mutatják a magas homológra területeit. Emellett a szekvenciák egymáshoz illesztését használjuk a Bacillus endoamilázok közötti kapcsolat feltérképezésére [ Feng, D.F. és Doolittle, R.F.:J. Molec. Evői. 35, 351-360 (1987)] . A relatív szekvencia homológra a Bacillus stearothermophilus. és a

Bacillus licheniformis amiláz között körülbelül 66%, Hóim és munkatársai meghatározása szerint [Hóim és mtsai: Protein Engineering 3(3), 181-191 (1990)] . A Bacillus licheniformis és a Bacillus amiloliquefaciens amilázok közötti szekvencia homológia körülbelül 81% [Hóim és mtsai: Protein Engineering _3 (3) , 181-191 (1990)] . Jóllehet a szekvencia homológia lényeges, azt általában elismerik, hogy a szerkezeti homológia is fontos az amilázok vagy egyéb enzimek összehasonlításakor. Például a gomba amilázok és a bakteriális (Bacillus) amilázok között szerkezeti homológiát figyeltek meg, ennek következtében a gomba amilázok is a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.

Egy α-amiláz mutáns aminosav szekvenciája egy prekurzor α-amiláz aminosav szekvenciájából származik. A prekurzor aamilázok közé tartoznak a természetben előforduló a-amilázok és a rekombináns α-amilázok (a meghatározás szerint). Az aamiláz mutáns aminosav szekvenciája a prekurzor a-amiláz aminosav szekvenciájából származik, a prekurzor aminosav szekvenciában levő egy vagy több aminosav helyettesítésével, deléciójával vagy inszerciój ávalA ilyen módosítás inkább a prekurzor α-amiláz aminosav szekvenciáját kódoló prekurzor DNS szekvencia módosítása, és nem a prekurzor α-amiláz enzimnek magának a módosítása. A prekurzor DNS szekvencia ilyen jellegű módosítását a jelen találmány leírásában ismertetjük, de megtalálhatók a 4,760,025 és 5,185,258 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentésben.

A Bacillus licheniformis M197, M15 és W138 pozícióinak megfelelő specifikus csoportokat azonosítjuk az alábbiakban, helyettesítés vagy deléció céljából, mivel mindegyik metionin, hisztidin, triptofán, cisztein és tirozin pozíció. Az aminosav pozíciószáma (azaz például +197) a 2. ábrán bemutatott, érett

Bacillus licheniformis α-amiláz szekvenciában használt számozásnak felel meg. A találmány oltalmi köre azonban nem korlátozódik ennek a bizonyos érett α-amiláznak (Bacillus licheniformis) a mutációjára, hanem kiterjeszti a prekurzor aamilázt tartalmazó aminosav csoportokat olyan pozíciókra is, amelyek ekvivalensek az adott, azonosított csoporttal a Bacillus licheniformis α-amilázban. Egy prekurzor α-amiláz egy csoportja (aminosava) ekvivalens egy, a Bacillus licheniformisban levő csoporttal, ha vagy homológ (azaz pozíciója megfelel a primer vagy a szekunder struktúrában levő pozíciónak), vagy analóg egy specifikus pozícióval vagy annak a csoportnak egy részével a Bacillus licheniformis α-amilázban (azaz ugyanolyan vagy hasonló funkcionális kapacitással rendelkezik ahhoz, hogy kombinálódjon, reagáljon vagy kémiailag vagy szerkezetileg kölcsönhatásba lépjen).

Ahhoz, hogy homológiát állapítsunk meg a primer struktúrával, egy prekurzor α-amilázt közvetlenül összehasonlítunk a Bacillus licheniformis α-amiláz primer szekvenciájával, de különösen azokkal az aminosav régiókkal, amelyekről ismert, hogy az összes, ismert szekvenciájú aamilázban egyformák, amint az a 3. ábrán látható. Az is lehetséges, hogy ekvivalens csoportokat határozzunk meg a tercier struktúra alapján: leírták a sertés hasnyálmirigy aamiláz [ Buisson, G. és mtsai: EMBO J. 6^ 3909-3916 (1987)] , az Aspergillus oryzae-ből származó Taka-amiláz A [ Matsuura, Y. és mtsai: J. Biochem. (Tokyo) 95, 697-702 (1984)] , és egy

Aspergillus niger-ből származó savas α-amiláz [Boel, E. és mtsai: Biochemistry 29, 6244-6249 (1990)] kristályszerkezetét, és megállapították, hogy az első kettőnek a szerkezete hasonló.

A Bacillus α-amilázok szerkezetét nem publikálták, jóllehet azt jósolják, hogy közös szuper-szekunder struktúrák vannak a glukanázok között [ McGregor, E.A. és Svensson, B.: Biochem. J. 259, 145-152 (1989)], és a Bacillus stearothermophilus enzim szerkezetét a Taka-amiláz A szerkezete alapján modellezték [Hóim L. és mtsai: Protein Engineering 3, 181-191 (1990)] . A 3. ábrán bemutatott négy erősen konzerválódott régió számos olyan csoportot tartalmaz, amelyekről közismert, hogy az aktív hely részét képezik [ Matsuura, Y. és mtsai: J. Biochem. (Tokyo) 95, 697-702 (1984); Buisson, G. és mtsai: EMBO J. 6, 3909-3916 (1987); Vihinen, M. és mtsai: J. Biochem. 107, 267-272 (1990)] , beleértve, a Bacillus licheniformis számozás szerinti Hisl05, Arg229, Asp231, His235, Glu261 és Asp328 csoportokat.

A továbbiakban az expressziós vektor szakkifejezés egy olyan DNS konstrukciónak felel meg, amely működés szempontjából hozzá van kapcsolva egy megfelelő kontroll szekvenciához, amely képes az említett DNS expresszióját megvalósítani egy megfelelő gazdaszervezetben. Ilyen kontroll szekvencia lehet például egy promoter, a transzkripció vezérléséhez, egy opcionális operátor szekvencia, hogy kontrollálja az említett transzkripciót, egy megfelelő mRNS riboszómális kötőhelyet kódoló szekvencia, és olyan szekvenciák, amelyek szabályozzák a transzkripció és transzláció terminációját. Egy előnyben részesített promoter a

Bacillus subtilis aprE promoter. A vektor lehet plazmid, fágrészecske, illetve egyszerűen egy potenciális genomiális inszert. Ha egyszer már transzformáltuk egy megfelelő gazdaszervezetbe, akkor a vektor a gazdaszervezet genomjától függetlenül replikálódhat és funkcionálhat, vagy néhány esetben maga is integrálódhat a genomba. A jelen leírásban a plazmid és vektor szakkifejezést néhány esetben felváltva alkalmazzuk, mivel jelenleg a plazmid a vektor legáltalánosabban használt formája. Szándékaink szerint azonban a találmány az expressziós vektoroknak azokra a formáira is vonatkozik, amelyek ekvivalens funkciókat látnak el, és amelyek ismertek, vagy ismertté válnak a szakirodalomban.

A jelen találmányban jól használható gazdatörzsek (vagy gazdasejtek) általában prokarióta vagy eukarióta gazdasejtek, és ide tartozik minden transzformálható mikroorganizmus, amelyben elérhető az α-amiláz expressziója. Pontosabban, az ugyanabba a fajba vagy nembe tartozó gazdatörzsek a megfelelőek, mint amelyből az α-amiláz származik, azaz például egy

Bacillus törzs. Előnyösen egy α-amiláz negatív Bacillus törzset (az α-amiláz gén kivágva) és/vagy egy α-amiláz és proteáz deléciós Bacillus törzset, azaz például a BG2473 Bacillus subtilis törzset (AamyE, Aapr, Anpr) használjuk. A gazdasejteket transzformáljuk vagy transzfektáljuk a rekombináns DNS technikával készített vektorokkal. Az ilyen transzformáit gazdasejtek képesek arra, hogy szaporodjanak bennük az a20 amilázt és variánsait kódoló vektorok, vagy expresszálják a kívánt a-amilázt.

A jelen találmány szerinti mutánsokat előnyösen a tenyészközegbe szekretáltatjuk a fermentáció során. Bármelyik megfelelő szignálszekvencia, azaz például az aprE szignálpeptid használható a szekréció eléréséhez.

Számos, a jelen találmány szerinti α-amiláz mutáns jól használható különböző detergens készítmény kiszereléséhez, főleg bizonyos mosogatószer készítményekhez, amelyek ismert oxidálószereket tartalmaznak. A találmány szerinti ot-amiláz mutánsok ismert por, folyadék vagy gél formájú detergensbe tehetők, amelyeknek a pH-ja 6,5 és 12,0 között van. Megfelelő granulált készítmények állíthatók elő, a 07/429,881, 07/533,721 és 07/957,973 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentésekben leírtak alapján, amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk. Ezek a detergens tisztítószerek tartalmazhatnak egyéb enzimeket is, azaz például ismert proteázokat, lipázokat, cellulázokat, endoglíkozidázokat vagy más amilázokat, és emellett hordozókat, stabilizálószereket és egyéb, a szakterületen jártas szakember számára ismert töltőanyagokat. Ezek az enzimek ko-granulumok vagy belekevert keverékek formájában lehetnek, vagy bármely, a szakterületen jártas szakember számára ismert formában. Továbbá a jelen találmányban megfontolás tárgyát képezi, hogy a többszörös mutánsok hasznosak lehetnek a tisztítószerekben vagy egyéb alkalmazásokban. Például egy mutáns enzim, amelyben mind a +15-ÖS mind a +197-es pozícióban változásokat generáltunk, • · * 21 jobb teljesítményt nyújthat egy tisztítószerben, vagy egy többszörös mutáns, amely változásokat tartalmaz mind a +197-es mind a +138-as pozícióban, szintén nagyobb teljesítménnyel rendelkezhet. Különösen előnyben részesítettek a mutáns enzimek a tisztítószer termékekben, főleg a mosogatószer termékekben, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az M15T/M197T; az M15S/M197T; a W138Y/M197T; az M15S/W138Y/M197T és az M15T/W138Y/M197T többszörös mutánsokat.

A jelen találmány tárgyát képezi az ismertetett mutáns aamiláz enzimek kombinációja egyéb enzimekkel (azaz proteázokkal, lipázokkal, cellulázokkal, stb.), de főleg az oxidatív stabilitással rendelkező proteázokkal. A megfelelő, oxidatíve stabil proteázok közé tartoznak a génsebészeti úton megváltoztatott proteázok, azaz például amelyeket az US Re 34606 bejelentésben írtak le, amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk, valamint a kereskedelmi forgalomban levő enzimek, azaz például a DURAZYM (Novo Nordisk), a MAXAPEM (Gist-Brocades) és a PURAFECT OXP (Genencor International, Inc.). Az ilyen proteáz mutánsok (oxidatíven stabil proteázok), és ezek közül a mutánsok közül különösen azok, amelyekben a Bacillus amiloliquefaciens M222 pozíciójával ekvivalens pozícióban levő metionint helyettesítjük, készítésének leírását megtalálhatjuk az US Re 34606 számú szabadalmi bejelentésben. Az egyéb szubtilizinekben levő ekvivalens pozíciók meghatározására megfelelő módszerek leírása megtalálható a Re 34606, EP 257,466 és USSN 212,291 számú szabadalmi bejelentésekben, amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk.

Amint az előzőkben ismertettük, a jelen találmány szerinti α-amiláz mutánsokat jól lehet használni a keményítő elfolyósításában. A keményítő elfolyósítását, és főleg a granulált keményítő szuszpenzió elfolyósítását általában semleges pH-hoz közeli pH-η és magas hőmérsékleten hajtjuk végre. Amint azt a 07/788,624 és 07/785,623 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentésben, valamint az 5,180,559 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalomban ismertetik, egy oxidáló ágens vagy bizonyos fajta inaktiváló ágens is jelen van egy tipikus elfolyósítási folyamatban, ami érintheti az enzim aktivitását; így tehát ezekben a rokon szabadalmi bejelentésekben egy antioxidánst is adnak a rendszerhez az enzim megvédése céljából.

Az előnyös elfolyósítási eljárások körülményei alapján, amelyeket a 07/788,624 és 07/785,523 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentésben és az 5,180,669 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalomban ismertetnek, nevezetesen alacsony pH-η, magas hőmérsékleten és potenciális oxidáló körülmények között az elfolyósítási eljárásokban a jelen találmány szerinti előnyben részesített mutánsok azok, amelyeknek megváltozott a pH-függő teljesítmény profiljuk (azaz alacsony pH-profil, a pH értéke <6, előnyös a pH<5,5), és/vagy megváltozott a hőstabilitásuk (azaz magas, 90-110 °C-on is működnek), és/vagy megváltozott az oxidatív stabilitásuk (azaz megnőtt az oxidatív stabilitásuk).

Tehát a jelen találmányban keményítő elfolyósításának egy javított eljárását ismertetjük, amely eljárás abból áll, hogy egy vagy száraz vagy nedves őrlési eljárásból származó granulált élesztő iszapot folyósítunk el 4 és 6 közötti pH-n, hatásos mennyiségű, a jelen találmány szerinti a-amiláz mutánst adva a keményítő szuszpenzióhoz; adott esetben hatásos mennyiségű antioxidánst vagy egyéb töltőanyagot adunk a szuszpenzióhoz, majd a szuszpenziót megfelelő ideig és hőmérsékleten reagáltatjuk a keményítő elfolyósítása céljából.

Az alábbi leírásokat példaként adjuk meg, semmiképpen sem kívánjuk ezekkel korlátozni az igénypontok által meghatározott oltalmi kört. Az alkalmazott rövidítések, különösen a háromvagy egybetűs aminosav rövidítéseket megtaláljuk a szakirodalomban [ Dalé, J.W.: Molecular Genetics of Bacteria John Wiley & Sons, Appendix B (1989)] .

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Javított, fehérítőszert tartalmazó tisztítószer, amelyben a fehérítőszert tartalmazó készítményhez mutáns aamilázt adunk, amely mutáns amiláz egy α-amilázt kódoló mutált

DNS szekvencia expressziós terméke, a mutált DNS szekvencia egy prekurzor α-amilázból származik, a Bacillus licheniformis aamiláz Μ+197-es pozíciójával ekvivalens pozícióban levő metionin helyettesítésével, valamint egy vagy több metionin vagy triptofán helyettesítésével a Bacillus licheniformis a-amiláz M+15 vagy W+138 pozíciójával ekvivalens pozícióban.
2. Az 1. igénypont szerinti javított tisztítószer, amelyben a tisztítószer egy mosogatószer készítmény.
3. Az 1. igénypont szerinti javított tisztítószer, amelyben a mutáns α-amilázt a következő csoportból választjuk:

M15T/M197T; M15S/M197T; W138Y/M197T; M15S/W138Y/M197T és

M15T/W138Y/M197T.
4. Az 1. igénypont szerinti javított készítmény, amely tartalmaz még egy mutáns proteázt, ami egy proteázt kódoló mutált DNS szekvencia expressziós terméke, és a mutált DNS szekvencia egy prekurzor proteázból származik, a Bacillus amiloliquefaciens proteáz Μ+22-es pozíciójával ekvivalens pozícióban levő metionin helyettesítésével.
5. A 4. igénypont szerinti javított tisztítószer, amelyben a mutáns proteáz tartalmaz egy helyettesítést, ami az alábbi aminosavak csoportjából származik: alanin, cisztein és szerin.

'.Λ ·» ··

105
6. A 4. igénypont szerinti javított tisztítószer, amely tartalmaz egy, az alábbi csoportból származó α-amiláz mutánst:

M15T/M197T, M15S/M197T, W138Y/M197T, M15S/W138Y/M197T és

M15T/W138/M197T, valamint tartalmaz egy, az alábbi csoportból származó proteáz mutánst: M222C, M222S és M222A.

7. A 6. igénypont szerinti javított tisztítószer, amely egy granulált készítmény.

ifj. Szentpéteri Ádám

H-li Telefoni

1 /25

10 30 50

AGCTTGAAGAAGTGAAGAAGCAGAGAGGCTATTGAATAAATGAGTAGAAAGCGCCATATC

70 90 110

GGCGCTTTTCTTTTGGAAGAAAATATAGGGAAAATGGTAC'RGTTAAAAATTCGGAATAT

130 150 170

TTATACAACATCATATGTTTCACATTGAAAGGGGAGGAGAATCATGAAACAACAAAAACG

Μ K Q Q K R

190 210 230

GCTTTACGCCCGATTGCTGACGCTGTTATTTGCGCTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGC

LYARLLTLLFAL I FLLPHSA

250 270 290

AGCAGCGGCGGCAAATCTTAATGGGACGCTGATGCAGTATTTTGAATGGTACATGCCCAA

A A A ANLNG TLMQYFEWYMPN

310 330 350

TGACGGCCAACATTGGAAGCGTTTGCAAAACGACTCGGCATATTTGGCTGAACACGGTAT

DGQHWKRLQNDS AYLAEHG I

370 390 410

TACTGCCGTCTGGATTCCCCCGGCATATAAGGGAACGAGCCAAGCGGATGTGGGCTACGG

TAVW IPPAYKGTSQA DVGYG

430 450 470

TGCTTACGACCTTTATGATTTAGGGGAGTTTCATCAAAAAGGGACGGTTCGGACAAAGTA

AYDLYDLGEFHQKG TVRTKY

490 510 530

CGGCACAAAAGGAGAGCTGCAATCTGCGATCAAAAGTCTTCATTCCCGCGACATTAACGT

GTKGELQSA IKSLHSRDINV

550 570 590 ttacggggatgtggtcatcaaccacaaaggcggcgctgatgcgaccgaagatgtaaccgc

YG DVV INHKG GADATE DVTA

610 630 650

GGTTGAAGTCGATCCCGCTGACCGCAACCGCGTAATHCAGGAGAACACCTAATTAAAGC

VEVDPADRNRVISGEHLIKA

670 690 710

CTGGACACATTTTCATTTTCCGGGGCGCGGCAGCACATACAGCGATTTTAAATGGCATTG WTHFHFPG RGSTYSDFKWHW

730 750 770

GTACCAT7TTGACGGAACCGATTGGGACGAGTCCCGAAAGCTGAACCGCATCTATAAGTT

YHFDGTDW DESRKLNR IYKF

790 810 830

TCAAGGAAAGGCTTGGGATTGGGAAGTTTCCAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGAT

QG KAW DWEVSNENGNY DYLM ifi. Szentpéteri Ádám szabadalmi ügyvivő

1A. abra az S.B.G. &K. Nemzetközi

Szabadalmi Iroda taafi.

H-1062®udapfet,Andftssydt 113. Telefon: 23

2/25

850 870 890

GTATGCCGACATCGATTATGACCATCCTGATGTCGCAGCAGAAATTAAGAGATGGGGCAC

YA D I DYDHPDVAAE IKRWGT

910 930 950

TTGGTATGCCAATGAACTGCAATTGGACGGTTTCCGTCTTGATGCTGTCAAACACATTAA WYANELQLDGFRLDAVKH IK

970 990 1010

ATTTTCTTTTTTGCGGGATTGGGTTAATCATGTCAGGGAAAAAACGGGGAAGGAAATGTT FSFLR DWVNHVR EKTGKEMF

1030 1050 1070

TACGGTAGCTGAATATTGGCAGAATGACTTGGGCGCGCTGGAAAACTATTTGAACAAAAC

T VAEYWQNDLG ALENYLN KT

1090 1110 1130

AAATTTTAATCATTCAGTGTTTGACGTGCCGCTTCATTATCAGTTCCATGCTGCATCGAC

NFNHSVFDVP LHYQFHAAST

1150 1170 1190

ACAGGGAGGCGGCTATGATATGAGGAAATTGCTGAACGGTACGGTCGTTTCCAAGCATCC

QGGGYDMR KLLNGTVVSKHP

1210 1230 1250

GTTGAAATCGGTTACATTTGTCGATAACCATGATACACAGCCGGGGCAATCGCTTGAGTC LKS VTFVDNHDTQPGQS LES

1270 1290 1310

GACTGTCCAAACATGGTTTAAGCCGCTTGCTTACGCTTTTATTCTCACAAGGGAATCTGG

TVQTWFKP LAYAFILTR ESG

1330 1350 1370

ATACCCTCAGGTTTTCTACGGGGATATGTACGGGACGAAAGGAGACTCCCAGCGCGAAAT YPQVFYG DMYG TKG DSQR Ε I

1390 1410 1430

TCCTGCCTTGAAACACAAAATTGAACCGATCTTAAAAGCGAGAAAACAGTATGCGTACGG PALKHKIEP ILKARKQYAYG

1450 1470 1490

AGCACAGCATGATTATTTCGACCACCATGACATTGTCGGCTGGACAAGGGAAGGCGACAG AQ HDYFDHHD IVGWTR EG DS

1510 1530 1550

CTCGGTTGCAAATTCAGGTTTGGCGGCATTAATAACAGACGGACCCGGTGGGGCAAAGCG S VANSGL A ALIT DGPGG AKR

1570 1590 1610

AATGTATGTCGGCCGGCAAAACGCCGGTGAGACATGGCATGACATTACCGGAAACCGTTC MYVG RQNAGETWHDITGNRS

1630 1650 1670

3GAGCCGGTTGTCATCAATTCGGAAGGCTGGGGAGAGTTTCACGTAAACGGCGGGTCGGT EPVVINSEGWGEFHV _S2^_é& _Á&n ^V szabadalmi ügyvivő lB.ábra az S.B.G. & K. Nemzetközi

Szabadalmi Iroda tágja

H-1062 Budapest, Andrássyüt 113. Telefort^^^; &24-323

3/25

1690 1710 1730

TTCAATTTATGTTCAAAGATAGAAGAGCAGAGAGGACGGATTTCCTGAAGGAAATCCGTT

S I Y V Q R *

1750 1770 1790

TTTTTATTTTGCCCGTCTTATAAATTTCTTTGATTACATTTTATAATTAATTTTAACAAA

1810 1830 1850

GTGTCATCAGCCCTCAGGAAGGACTTGCTGACAGTTTGAATCGCATAGGTAAGGCGGGGA

1870 1890 1910

TGAAATGGCAACGTTATCTGATGTAGCAAAGAAAGCAAATGTGTCGAAAATGACGGTATC

1930 1950

GCGGGTGATCAATCATCCTGAGACTGTGACGGATGAATTGAAAAAGCT

IC. ábra _rábra i ^FJGifj. Szentpéteri Ádám szabadalmi ügyvivő az S.B.G. & K. Nemzetközi

Szabadalmi Iroda taáa

H-1062 Budapest, Andrássy út 113,

Telefon: 34-24-950;fax: 3404-323

4/25

10 30 50

ANLNGTLMQYFEWYMPNDGQHWKRLQNDSAYLAEHGITAVWIPPAYKGTSQADVGYGA’

70 90 110

LYDLGEFHQKGTVRTKYGTKGELQSAIKSLHSRDIWYGDWINHKGGADATEDVTAVEY

130 150 170

DPADRNRVISGEHL1KAWTHFHFPGRGS TY SDFKWHWYHFDGTDWDES RKLNRIYKFQGK

190 210 230

AWDWEVSNENGNYDYLMYADIDYDKPDVAAEIKRWGT’WYANELQLDGFRLDAVKHIKFSF

250 270 290 jRDWR/TTHYT.EKTGKEMFTVAEYWQNDLGALENYLNKTNFNHSVFDVPLHYQFH.:

310 330 350

GYDMRKLLNGTWSKHPLKSVTFVDNHDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYAFILTP.ESGYPQ

370 390 410

VFYGDMYGTKGDSQREIPALKHKIEPILKARKQYAYGAQHDYFDHHDIVGWTREGDSSVA

430

NSGLAALITDGPGG

’.RMYVGRQNAG

450 470 'WHD ITGNRS E P WINS EGWG Ξ F H7NGG SYS IY

VQR

2. ábra ifj. Szentpéteri Ádám szabadalmi ügyvivő az S.B.G. & K. Nemzetközi

Szabadalmi Iroda tagja sH-1062 Budapest, Andráísy úo 113.

Telefon: 34^34^5¾ Fjji: 3Á-24-3/23 □a ε -a ζ?

X . 2 '³ 0* .5 y <Ί b· Ο in ο cm ω

5/25 w

Ο.

o

0)00 0 0 Q Q

ZZC

XXX

ΣΗ-Ι >>>

LLI LLl UJ LL LL LL >>>

σσσ 2Σ2 o cn cm

K’-I-HIOOO >>>

ididid hhh

XXX

Η I— P· OOO id X. X.

o> o n co

-ίσσ ι > >

UJ LLI r0X0 ωωω h- o σι μ Ύ- CM r- o i- tű

CJ CO ω

£ O_ k- t^- to to to

CD

II o

ra (D ώ

É <

(— H H000 ZZZ =J>x Z <C X <ω< < t—<

<μ<

<Hid <x< ω :I

X o H

X O IL io c

to to ,m to ^_ωω

Q-llh o

~Z t

TC

CQ

II _o >k

E <

«

E <

σσσ χσζ

LL LL LL LLI LLI LLl OOO XXX QQQ

QQQ >>>

<X>

OOO >>>

ooo >z>

QQQ <ωω σσχ ωω<χ>

ι--ΐ>OOO ^íidid >>> <<< X X CL X X Q_ >>X .to r— s

£ to

X.

]ü

X

CD

II o

>ll t<él χωο X>id < + x xX ⁼XidX idXX O id X oob *Σ> z O X O X <<< 111 OOO χ — —I LLI O (f) <ωω >IZ <XH cn< < OŰX zzz σσ<

X-J>

XXv ididjx οσσ

CM > lÜ *ΰ cc μ σ ζ^ζ XqX QzQ <<ω Ű.C.Ű. QZZ >>>

LLI LLILU >>^ <<< h-1—Q >>> QQ$ XXX I— Η Η<<Ο QQQ <<< οοο 0<0 v^id χΙΧ _ZZQ — JLL >>> >>> QQQ

ΟΟ<

ζ§§ ρ;>Σ

ΩΖΟ

Ιχ<

ωω<

ni

ΧΧ<

ωω<

*οσ <<<

ωαο σσ-ι

-ΐχ>

χχΟ θω<

ididid >>>

QQQ >>>

zzz ooo zzz

LLI LLI LLI ZWH

CZDCOQ >>>

LIJUJllI idixí^

S^üo

Ox_

C0

ΟΟ

XX

LLLL id*

Χ>

O_CCC ^ωω ididid xxx ωωω

XXX

QQQ

QQQ 1-0 OOO QQQ LL LL LL

III >>>

III ididid

XXX

QQCO ωωω >>>

I— F— I— tnzz ooo cccccc ooo

XXX

LL LL LL XXQ LL LL LL XQid μ

CM

LL LL u_l xx5 idid*

OOO χ<σ ω σω xxx >>>

XO ζσω qqQ XX⁰_I_jU_ LL LL LL ωωω LL LL LL ididX

III id id * > < —¹<<o

QqQ _i — _j XXX LL LL LL

OOO QQQ _ι_ι — σωζ

-J-J t ILJ UJ I— ZZZ <<> >>> <:<:£

Η X id 0^0 i£z — HZj ΧΧχ <<l<>> >>>

QQX XXX XXI □ QQ >>Σ 2>5

QQQ <<<

>>>

O.O.CL IIO idCCQ c/Dcnid >>2 >>_j h- h— I— OOZ ZQ t= idCCH

XXX

QQQ >>U_

0O<

OOO

OOO σσω

HCOid ωωω < < < <í <t i— io>

LL_|LL

OZ^ >u_Z

XXX

XXX >><

QQQ

XXX >>-J

ΙΟΣ zz^H xxO ζωζ ididid

ZZH χ χ X XXX <xid OOZ Qzg oog > > LLI LLI

O

CO < <O > >> l-l-H (0

Ll μ

'<o μ ο o 3 >>« —i Ρ φ έ<ω <Εέ < <

μ ο o

-J Ε a> E<cő < E É <<

μ ο ο .9 >.ί0 —I £ φ Ε<ώ <Εέ <<

μ ο o

-? Ε ω Ε<ω < Ep <<

μ ο o ~ >,(0 -J Ρ Φ

Ε<ω έ

<<

μ o < _ι ρ ,

Ι*?* < Ε ι <<

6/25 r* ο r~ cm

CO V--—

00Z 0*> oq-0 cn0QQH : Oű ** : I— H —: 000 h o eo oo rr -ν

00^ <.(/)& 000 000 00< 000 QŰQ Hl-ΙCC

a.

<

I— ω

>>>

Σ5>

qqQ

000 >->-> LL LL LL >>>

σου

000 >>>

<<< <<< _l _1 —ι 000 000 2^0 < < ΟΧ* 000 :>

:H co *T

OC >>

>>

ωσ

000

000 luluo

000

WCOH QQ> 000 LLI LLI LLI 000

LL LL LL <<< >>>

000 >> = >>> 000 000 0Q0 ZZ2 >>> 00* 000 LLI LLI UJ 000 <<<

000 *** 00 0

QQQ

100

III

QQQ ttí

L

X

2½½ l-l-h;

σσ£ >>0

HH0 <01000

0QQ

000

HOZ >*l>>> 01-10 Q Q

CQ m

000

LULUO

00ΓΓ σσ^ 00< 000 σσζ I— Η H QQQ

000 >>> <<< > > > 0UJQ *£0 < < < **_

000 000 O) zzz X 0 000 1-1-(- :< n>>: :0 = 0 HI-> : 0

O

CO

00x zzz

QLUQ >>> 0 0 0 >>>

0<<

* X J0

X o o •η _j E ω

E <0 < Εέ <<

00-Ö.

00Q *Z£

0Q<0 ***

CM

TT <00

000

00* 000 < << ZZI 0*0 00* 000 ><>

X o o .2 >^ra -J E ω

E<0 <Ec <<

rr in $

>

H

1 “] i ι CD | co ! d i 0 í £ : £ :

l______I_____- nJ

M

XI 'fű c

L

1» 'V

a.

V

N

2 <3

2 ΙΌ

CZ3

«t7/25

ANLNGTLMQ YFEWYMPNDGQHWKRLQNDS AYLAEHGI? A7W I ? ?

YKGTSQ.ÁDVG YGA YD

70 90 110

LYDLGEFHQKGTVRTKYGTKGELQSAIKSLHSRDINVYGDWZNHKGGADATEDVTAVEV

130 150 170

DPADRNRVZSGEKLIKAWTHFHFPGRGSTYSDFKWHWYHFDGTDWDESRKLNRIYEFQGK

ISO 210 230

AWDWEVSNSNGNYDYLTYADZDYDHPDVAASZKRWGTWYANELQLDGFRLDAVKHZKFSF

250 270 290

LRDVM'IHVRSKTGKSMFTVAEYWQNDLGALENYLNr’TNFI’íHSvTDVPLHYQFHAASTQGG

310 330 350

GYDMRKLLNGTWSKHPLKSVTFVDNKDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYAFILTRESGYPQ

370 390 410

VFYGDMYGTKGDSQREZPALKHKIEPILKARKQYAYGAQHDYFDHHDIVGWTREGDSSVA

430 450 470

NSGLAALZTDGPGGAKRMYVGRQNAGETWKDITGNRSEPVVTNSEGWGEFKTNGGSYSTY

VQR

4a. ábra ifj. Szentpéteri Ádám szabadalmi ügyvivő azS.B.G.S&I' ·'

Szabadi

H-1062 Budap

Telefon: 34-24-950; Fax: 34-24-323

8/25

ΑΑΑΑ

14 34 54 anlngtlmqyfewympndgqhwkrlqndsaylaehc-ztavwippaykgtscadvgygayd

74 94 114

LYGLGEFHQKGTWTKYGTKGELQSAiKSLKSRD±ÍETGGWTN74KGGADATED7TAVEV

134 154 174

DPADRNFA’ISGEKLiKA/n’HEHFPGRGSTYSDFKWHWYHFDGTDWDESRKLNRJYKEQGB;

194 214 234

ÁhOWEVSNENGNYDYL^ADIDYDHPDVAAEIERWGT/PRPNELQLDGFRLDA'yKHlKFSF

254 274 294

LEDW\TCm?.EKTGKEMFTVAEYWQNDLGALENTLNK?MFRE~SVFDV?LHYQFHAASTQGG

314 334 354

GYGMERLLNGTVVSKHPLKSVTFVDNHDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYAFILTEESGYPC

374 394 414

VFYGDMYGTKGDSQEEIPALKHKIEPILKARKQYAYGAQHDYFDHHDIVGWTREGDSSVA

434 454 474

NSGLAALITDGPGGAKRMYVGRQNAGETWHDI7GNRSEPWINSEGWGEFHVNGGSVSIY

VQR

4b. ábra ifj. Szentpéteri Ádám szabadalmi ügyvivő \ az S.B.Éj. & K. Nemzetközi /

Szabaejalihi Itoda tagja

H-1062 BudajUtÁtd^ey^t

Telefon: 34-24-950; Fax: 34-24-323
9/25

5. ábra ifj. Szentpéteri Ádán^ szabadalmi ügyvivő az S.B.C

Szaba

H-1062 Búd

Telefon: 34-24-950; Fax:
10/25

Szignál szekvencia-érett fehérje kapcsolódások:

B.licheniformís ^amiláz (Pstl) mkqqkrltarlltllfalifllphsa^aaaJanl......

N-terminális

B.subtilis alkálikus prokáz \Pstl)

MRSKTLWISLLFALTLIFTMAFSNMSA O^GKS......

N-terminális

B.licheniformís <Á~amiláz pA4BL-ben (Pstl)

MRSKTLWISLLFALTLIFTMAFSNMSA OA^AAAAN.

N-terminális

B.iichenfiormis X-amiláz pBLapr-ben

MRSKTLWISLLFALTLIFTMAFSNMSA űa|ÁN L......

N-termin ális (Pstl) jelzi a hasítási helyet a génben £

N-terminus jelzi a hasítási helyet a szignál peptid és a szekretált fehérje között

6. ábra ifj. Szentpéteri Ádám szabadalmi ügyvivői az S.B.G. & K. Nemzetközi

Szabadalmi Iroda tagjai

H-1062
11 /25

7B.

Megmaradt aktivitás

Megmaradt aktivitás

7C. ábra

Idő (perc) szabadalmi ügyvivő az S.B.G. & K. Nemzetközi

Szabadalmi Iroda tagja

H-1062 Budapest, Andrássy)úf 113.

Tvicfon: 34v2<M50i Faki 34224-37.3
12/25

ΑΑΑΑ

Μ197 Clal t I

ΑΑΑΑ

Clal Α197 EcoRV !I

LAAM12 Primer

ΑΑΑΑ

ΑΑΑΑ

BstBI

A197 EcoRV

I I

BstBI

41 bp tccrí'/

Kazetta A

BstBI

X197 EcoRV Primer LAAM14-30

X197

Nsi 5

-u eltolás

Primer LAAM13 ▼

E.coli

Átvizsgálás

Restrikciós elemzéssel

8. ábra ifj. Szentpéteri Ádám szabadalmi ügyvivő ^32Nemze^3^zí

Telefon: 34-24-950; Fax: 34-24-323

13/25

Ο) Ε

Η ο ν τΤ

ν^-^ΑΤΐυ_;11ΓΙ,Λ·5;^ι2·’ΙΛ.'.ΜΠ^Μ^ΙΜΙΐ1ΐ;ι.ν·-Γ.^ΛΙ_-^^·^Π.Η BfefeíeSfe^SwSöM’

IIWPI1 j N yu u AUL· U Ji^i rí JI'U»-?ÜiFJl- U^Fl'MI'

MET

CYS

THR

ILE

ASN

ALA

SER

VAL

GLY

ASP

GLN

GLU

PHE

PRO

HIS

TYR

LYS

TRP

ARG +j α

o ω

ü ω

<1>

σ>

Ο σ>

ο

CD

r^ td 1 tn df> 2 (X tn Ή 'tű +J -P •H Ό > fd •H > 4J 44 < (d

o ©

O un o

’T o

co o

C\j

1^ ©

Π3

Λ 'fO σ

100 ifj. Szentpéteri Ádám szabadalmi ügyvivő az S.B.G. & K. Nemzetközi

Szabadalmi Irqda tagja

H-106ÍH)idltBe& Aridrássy At 113.

TelefoftU^^ft^P&eadQ 4-323

14/25

o

TT

36%

co in co o

co in

CM o

CM <d

I

4-1 0\0 TI (0 cn G 'CÖ CŰ 4-1 £ Ή Cn > Φ -H ε 4J < Π3

MET

CYS

THR k^^^^stgasga^-fcte ^1LC in

ASN bffeife^aa wa^BL in

ALA

SER £ o

Cu

VAL S o cn

GLY f

ASP

GLN

GLU

PHE

PRO

HIS

TYR

LYS

TRP

ARG cn (Ö

G

Λ 'td ifj. Szentpéteri Ádám szabadalmi ügyvivj) az S.B.G. & K. Nemzetközi

Szabadalmi Iroda tagjlfi

H-1062
15/25 megmaradt aktivitás %-a A megmaradt aktivitás

Idő (perc)

11B. ábra ifj. Szentpéteri Ádám szabadalmi ügyvivő az S.B.G. & K. Nemzetközi

Szfibádalml Iroda tagja)

H-1062 113.

Telefon: 34-24-950; Fax: 34-24-323
16/25

Kazetta

BstBI-_UWK|- Msd ++

SnaB1

BstBI Msd

Vektor _ _

Ligálás ▼

BstBI _klK1K1 Msd hely eliminálva

-Ν Ν N+-tSnaB1

BstBI_

BstBI

NNN

NNN

Transz formálás E. coli-ba

Replikáció

SnaB1

4-4+4

SnaB1

M15 variáns

Expressziós plazmid

Az alsó szálból származó nem-expresszáló plazmid

12. ábra ifj. Szentpéteri Ádám szabadalmi ügyvivő / ³² ^KíNemzctHözi

SztebaÜalMi M>da Qtgia )

H-1062 BudápeéűJfaiá^ÍVl 13.

Telefon: 34-24-950; Fax; 34-24-323

17/25 lUUiP.’ iu uwkiutFAUu^ní i««Baag gu >i**auu^ju li^^j η,

·.:; 'rrt,. ? r,.·^ u ι·υ··Νΐ I. AiUUJAlk υΐΐ/ςι 1' $

σ c:

o

+j 44 O Λ o ζ ^ω υ

cn _ ^:° in

lg.,».jy>F·.«. imw.MWtnu'·»·! .J.l'V^liJ^¹ JJ^^U·¹'¹,

Γ,ΛΤ'Γ >,αΠΓ·*.Τ^^Ι i»JV-.7,.-7Urr,v.-u,/rn <’J

UJ

,Μ^ΙΜ,Ν n ω

—I I I

<0

X

MO n

250 o

o

CXJ o

un

O o

o in

cd 1 cn ch⁰ 2 0 cn Ή Md +J 4-1 •r4 Ό > cd Ή > 4-1 X < cd

ifi. Szentpéteri Ádám szabadalmi ügyvivő!

az S.B.G. & K. Nemzetközi ^Szabadalmi Iroda cagjj

18/25

Ε^ΟΓι^Τί»

Ρ&ΛΛ<Λ^32ώΐ3331ίΣίϋ£ί

Rr,S&?2Íj<Í3$,“;^S,t^ú'fe

ΡΚλ·5· Jna,;.- vrra.:.-r.i^.

wa«awwawi

o o

P

P o

ex.

o ω

u ω

:0

I m

cn (0

P

X!

'(d prwm^rw»w7TwprTTO?SWWTTTF»re7ajwe^»T^WTO!7SffB5SaTWTO· 'T

250 o

o