MXPA00003806A - Variantes de proteasa substituidas con pliegues multiples, con una carga de la red alterada para su uso en detergentes - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a nuevas variantes de proteasa derivadas de las secuencias de ADN de las proteasas no humanas recombinantes o que están presentes de manera natural. Las variantes de proteasa son obtenidas por modificación (in Vitro) de una secuencia de ADN precursora que codifica la proteasa recombinante o que estápresente de manera natural para generar la substitución de una pluralidad de residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de una proteasa precursora. Se proporcionan variantes de proteasa que contienen substituciones de los aminoácidos en una o más posiciones de los residuos de modo que la substitución altere la carga en esta posición para hacer a la carga más negativa o menos positiva comparado con una proteasa precursora y por consiguiente la variante de proteasa es más efectiva en un sistema de concentración baja del detergente que una proteasa precursora. También se proporcionan variantes de proteasa que contienen substituciones de los aminoác idos en una o más posiciones del residuo de modo que la substitución altere la carga en esta posición para hacer a la carga más positiva o menos negativa comparado con una proteasa precursora y por consiguiente la variante de proteasa es más efectiva en un sistema de concentración elevada del detergente que una proteasa precursora.

Description

VARIANTES DE PROTEASA SUBSTITUIDAS CON PLIEGUES MÚLTIPLES, CON UNA CARGA DE LA RED ALTERADA PARA SU USO EN DETERGENTES Antecedentes de la Invención Las serina proteasas son un subgrupo de carbonil hidrolasas. Las mismas comprenden una clase diversa de enzimas que tienen un intervalo amplio de especificidades y funciones biológicas. Stroud, R. Sic. Amer. , 131:74-88. A pesar de su diversidad funcional, la maquinaria catalítica de las serina proteasas ha sido aproximada por al menos dos familias de enzimas genéticamente distintas: 1) Las subtilisinas y 2) las serina proteasas bacterianas homologas y relacionadas con la quimiotripsina de mamíferos (por ejemplo, la tripsina y la tripsina S. gresius) . Estas dos familias de serina proteasas muestran mecanismos remarcablemente similares de catálisis. Kraut, J. (1977), Annu. Rev. Biochem., 46:331-358. Además, aunque la estructura primaria no está relacionada, la estructura terciaria de estas dos familias de enzimas lleva conjuntamente a una triada catalítica conservada de aminoácidos que consisten de serina, histidina y aspartato. Rßf.119514 Las subtilisinas son proteasas de serina (aprox. PM 27,500) las cuales son secretadas en cantidades grandes de una variedad amplia de las especies de Bacillus y otros microorganismos. La secuencia de proteínas de la subtilisina ha sido determinada de al menos nueve diferentes especies de Bacillus. Markland, F.S., et al. (1983), Hoppe-Seyler' s Z. Physiol. Chem. 364:1537-1540. La estructura cristalográfica tridimensional de las subtilisinas del Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis y varias variantes naturales de B. lentus han sido reportadas. Estos estudios indican que aunque la subtilisina no está relacionada genéticamente con las serina proteasas de mamífero, la misma tiene una estructura del sitio activo similar. Las estructuras cristalinas por rayos X de la subtilisina que contienen inhibidores de péptidos unidos covalentemente (Robertus, J.D., et al. (1972), Biochemistry, 11:2439-2449) o complejos del producto (Robertus, J.D., et al. (1976), J. Biol. Chem., 251:1097-1103) también han provisto información con respecto al sitio activo y substrato putativo o supuesto que se une a la hendidura de la subtilisina. Además, un gran número de estudios de modificación ha sido reportados para la subtilisina; Svendsen, B. (1976), Carlsberg Res. Commun., 41:237-291; Markland, F.S. Id.) así como al menos un reporte en donde la cadena lateral de la metionina en el residuo 222 de la subtilisina fue convertido por el peróxido de hidrógeno a metionina-sulfóxido (Stauffer, D. C, et al. (1965), J. Biol. Chem., 244:5333-5338) y una mutagénesis específica para el sitio, extensa, ha sido llevada a cabo (Wells y Estell (1988) TIBS 13:291-297). Un asunto común en el desarrollo de una variante de proteasa para su uso en una formulación detergente es la variedad de condiciones de lavado que incluyen formulaciones detergentes variables que una variante de proteasa podría ser utilizada en la misma. Por ejemplo, las formulaciones detergentes utilizadas en diferentes áreas tienen diferentes concentraciones de sus componentes relevantes presentes en el agua de lavado. Por ejemplo, un sistema detergente Europeo tiene típicamente de manera aproximada 4500-5000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado mientras que un sistema detergente japonés típicamente tiene aproximadamente 667 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. En América del Norte, particularmente los Estados Unidos de América, un sistema detergente típicamente tiene aproximadamente 975 ppm de los componentes detergentes presentes en el agua de lavado. • Sorprendentemente, un método para el diseño racional de una variante de proteasa para su uso en un sistema de concentración baja de detergente, un sistema de concentración elevada de detergente, y/o un sistema de concentración intermedia de detergente así como para su uso en la totalidad de los tres tipos de sistemas de concentración de detergente, ha sido desarrollado.

Breve Descripción de la Invención Es un objeto aquí proporcionar variantes de proteasa que contienen substituciones de los aminoácidos en una o más posiciones de los residuos de modo que la substitución altere la carga en esta posición para hacer a la carga más negativa o menos positiva comparado con una proteasa precursora y por consiguiente la variante de proteasa es más efectiva en un sistema de concentración baja de detergente que una proteasa precursora. Un sistema de concentración baja del detergente es un sistema de lavado que tiene menos de aproximadamente 800 ppm de los componentes detergentes presentes en el agua de lavado. Es otro objeto aquí proporcionar variantes de proteasa que contienen substituciones de los aminoácidos en una o más posiciones de los residuos de modo que la substitución altere la carga en esta posición para hacer a la carga más positiva o menos negativa comparado con una proteasa precursora y por consiguiente la variante de proteasa es más efectiva en el sistema de concentración elevada de detergente que una proteasa precursora. Un sistema de concentración elevada del detergente es un sistema de lavado que tiene un valor mayor que aproximadamente 2000 ppm de los componentes de detergente presentes en el agua de lavado. Es otro objeto aquí proporcionar variantes de proteasa que contienen substituciones de los aminoácidos en una o más posiciones de los residuos de modo que las substituciones alteren la carga en esta posición para hacer a la carga más positiva o menos negativa comparado con la proteasa precursora y por consiguiente la variante de proteasa es más efectiva en un sistema de concentración intermedia del detergente que una proteasa precursora. Un sistema de concentración intermedia del detergente es un sistema que tiene entre aproximadamente 800 ppm y aproximadamente 2000 ppm de los componentes detergentes presentes en el agua de lavado. Es otro objeto de aquí proporcionar variantes de proteasa que contienen substituciones de los aminoácidos en una o más posiciones de los residuos, de modo que la substitución altere la carga en esta posición para hacer a la carga más negativa o menos positiva comparado con una proteasa precursora y por consiguiente la variante de proteasa es más efectiva en un sistema de concentración intermedia de detergente que una proteasa precursora. Un sistema de concentración intermedia del detergente es un sistema de lavado que tiene entre aproximadamente 800 ppm hasta aproximadamente 2000 ppm de los componentes detergentes presentes en el agua de lavado . Es un objeto adicional proporcionar secuencias de ADN que codifican tales variantes de proteasa, así como los vectores de expresión que contienen tales secuencias de ADN variables. Todavía adicionalmente, otro objeto de la invención es proporcionar células huésped transformadas con tales vectores, así como células huésped las cuales son capaces de expresar tal ADN ara producir variantes de proteasa ya sea intracelular o extracelular ente . Se proporciona además una composición de limpieza que comprende una variante de proteasa de la presente invención. Adicionalmente, se proporciona una alimentación de animal que comprende una variante de proteasa de la presente invención. También se proporciona una composición para el tratamiento de un material textil que comprende una variante de proteasa de la presente invención.

Se proporciona además un método de producción de una variante de proteasa que es más efectivo en un sistema de concentración baja, intermedia y elevada del detergente que una proteasa precursora que incluye: a) substituir un aminoácido en una o más posiciones del residuo en donde la substitución altera la carga en esta posición para hacer a la carga más positiva o menos negativa comparado con la proteasa precursora; b) substituir un aminoácido en una o más posiciones de los residuos en donde la substitución altera la carga en esta posición para hacer a la carga más negativa o menos positiva comparado con la proteasa precursora; c) probar la variante para determinar su efectividad en un sistema de concentración alta, media y baja del detergente comparado con la proteasa precursora; y d) repetir los pasos a) - c) cuando sea necesario para producir una variante de proteasa que es más efectiva en un sistema de concentración alta, media y baja del detergente que una proteasa precursora en donde los pasos a) y b) se puede hacer en cualquier orden.

Breve Descripción de los Dibujos Las Figuras 1 A-C muestran el ADN y la secuencia de aminoácidos para la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens y un mapa de restricción parcial de este gene. La Figura 2 muestra los residuos de aminoácidos conservados entre las subtilisinas del Bacillus amyloliquefaciens (BPN)' y Bacillus lentus (del tipo silvestre) . Las Figuras 3A y 3B muestran la secuencia de aminoácidos para cuatro subtilisinas. La línea superior representa la secuencia de aminoácidos de la subtilisina, de la subtilisina del Bacillus amyloliquefaciens (algunas veces referido también como el BPN' de subtilisina) . La segunda línea muestra la secuencia de aminoácidos de la subtilisina del Bacillus subtilis. La tercera línea muestra la secuencia de aminoácidos de la subtilisina de B. licheniformis. La cuarta línea muestra la secuencia de aminoácidos de la subtilisina a partir del Bacillus lentus (también referida como la subtilisina 309 en PCT WO89/06276) . El símbolo* denota la ausencia de los residuos de aminoácidos específicos cuando se compara con el BPN' de subtilísina.

Descripción Detallada de la Invención Como se señaló anteriormente, ciertas geografías tienen ciertas condiciones de lavado y, como tales, un uso diferentes de los tipos de detergentes. Por ejemplo, el Japón utiliza un sistema de concentración baja de detergente mientras que Europa utiliza un sistema de concentración elevada de detergente. Como se describió previamente, los Estados Unidos de América utilizan un sistema de concentración intermedia de detergente. Se ha encontrado que diferentes variantes de proteasa funcionan óptimamente en estas formulaciones detergentes diferentes. Sin embargo, como resultado de estas observaciones, se podría esperar que fuera imposible encontrar una proteasa que podría trabajar bien en la totalidad de los tres tipos de detergentes. Sorprendentemente, este no es el caso. Un método para diseñar racionalmente una variante de proteasa que va a ser utilizada en un sistema de concentración baja del detergente o un sistema de concentración elevada del detergente o aún un sistema de concentración intermedia de detergente así como uno que trabaje en la totalidad de los tres sistemas de concentración del detergente, ha sido desarrollado.

Se ha encontrado que para producir una variante de proteasa que es más eficaz en un sistema de concentración baja del detergente, es necesario reemplazar el (los) residuo (s) cargados positivamente ya sea con residuo (s) cargado (s) negativamente o con residuo (s) neutrales y/o residuo (s) neutrales con residuo (s) cargado (s) negativamente. En contraste, se señala que para producir una variante de proteasa que es más eficaz en un sistema de concentración elevada del detergente, es necesario reemplazar el (los) residuo (s) cargado (s) negativamente ya sea con residuo (s) .cargado (s) positivamente o residuo (s) neutral (es) y/o residuo (s) neutral (es) con residuo (s) cargado (s) positivamente. Además, se ha encontrado que muchas de las variantes de proteasa útiles en el sistema de concentración baja del detergente y/o el sistema de concentración elevada del detergente también son efectivas en un sistema de concentración intermedia del detergente. Equilibrando o compensando estos cambios, es posible producir una variante de proteasa que trabaja bien en los sistemas de concentración baja del detergente, los sistemas de concentración baja e intermedia del detergente, sistemas de concentración intermedia y elevada del detergente, sistemas de concentración elevada del detergente, o en la totalidad de los tres sistemas de concentración del detergente. La carga electrostática de cualquier cadena lateral de aminoácidos ionizable con una función acida o básica se supone en una solución acuosa que es una función del pH. Los residuos ácidos Glu y Asp, en un proceso en equilibrio, pierden un protón por la disociación entre pH 3 y 6 por lo cual adquieren una carga negativa. De un modo similar, His, Lys y Arg se desprotonan gradualmente entre pH 5 y 8, pH 8.5 y 11.5, y pH 11 y 14, respectivamente, por lo cual pierden una carga positiva. El protón de Tyr OH se disocia crecientemente entre pH 8.5 y 11.5, por lo cual Tyr adquiere una carga negativa. El intervalo de disociación para la terminal o extremo de carboxi es pH 1 a 4, produciendo una carga negativa, "y para la terminal amino es de pH 8 a 11, acompañado por la pérdida de una carga positiva. El intervalo de disociación para las cadenas laterales de aminoácidos dada aquí son los valores promedio para muchas proteínas pero las mismas se sabe que van a ser afectadas por configuraciones estructurales inusuales en algunas proteínas. El efecto acumulativo de todas las cargas determina si una proteína tiene una carga positiva neta o negativa neta a un pH dado. El pH al cual las cargas positiva y negativa son igualmente efectivas y transportan un estado electrostáticamente neutral a una proteína es llamado el punto isoeléctrico (pl) . Una proteína perderá o ganará carga cuando el pH es desplazado o cuando un aminoácido con un residuo de la cadena lateral ionizable es agregado o removido. Un incremento en la carga positiva neta puede ser logrado ya sea reemplazando un residuo que a un pH dado está cargado negativamente con un residuo no cargado o cargado positivamente, conduciendo a un cambio de la carga formal de +1 y +2, respectivamente. Reemplazando un residuo de la cadena lateral no cargada con una que es protonada al pH dado, el cambio de la carga formal podría ser de +1. Similarmente, la carga negativa neta puede ser incrementada reemplazando las cadenas laterales no cargadas y cargadas positivamente con cadenas laterales cargadas negativamente al pH de observación y ganar un incremento formal de la carga negativa en -1 y -2, respectivamente . Un sistema de concentración baja de detergente incluye los detergentes en donde menos de aproximadamente 800 ppm de los componentes detergentes están presentes en el agua de lavado. Los detergentes japoneses son considerados típicamente como un sistema de concentración baja del detergente porque los mismos tienen aproximadamente 667 ppm de los componentes detergente presentes en el agua de lavado. Una concentración intermedia del detergente incluye los detergentes en donde entre aproximadamente 800 ppm y aproximadamente 2000 ppm de los componentes detergentes están presentes en el agua de lavado. Los detergentes de América del Norte se considera generalmente que van a ser sistemas de concentración intermedia de detergentes porque los mismos tienen aproximadamente 975 ppm de los componentes detergentes presentes en el agua de lavado. Brasil tiene típicamente de manera aproximada 1500 ppm de los componentes detergentes presentes en el agua de lavado. Un sistema de concentración elevada del detergente incluye los detergentes en donde una cantidad mayor que aproximadamente 2000' ppm de los componentes detergentes están presentes en el agua de lavado. Los detergentes europeos se considera generalmente que van a ser sistemas de concentración elevada de detergente porque los mismos tienen aproximadamente 4500-5000 ppm de los componentes detergentes en el agua de lavado. Los detergentes latinoamericanos son generalmente detergentes acumuladores de fosfato de alta espuma y el intervalo de detergentes utilizados en América Latina cae en las concentraciones tanto elevada como intermedia del detergente porque las mismas varían desde 1500 ppm hasta 6000 ppm de los componentes detergentes en el agua de lavado. Como se mencionó anteriormente, Brasil típicamente tiene de manera aproximada 1500 ppm de los componentes detergentes presentes en el agua de lavado. Sin embargo, otras geografías de detergentes acumuladores de fosfatos de alta espuma, no limitadas a otros países de América Latina, pueden tener sistemas de concentración elevada del detergente hasta aproximadamente 6000 ppm de los componentes detergentes presentes en el agua de lavado. En vista de lo anterior, es evidente que las concentraciones de las composiciones detergentes en las soluciones de lavado típicas en todo el mundo varía desde menos de aproximadamente 800 ppm de la composición detergente ("geografías de concentración baja del detergente") , por ejemplo de aproximadamente 667 ppm en Japón, a entre aproximadamente 800 ppm hasta aproximadamente 2000 ppm ("geografías de concentración intermedia del detergente"), por ejemplo aproximadamente 975 ppm en los Estados Unidos de América y aproximadamente 1500 ppm en Brasil, hasta mayores que aproximadamente 2000 ppm ("geografías de concentración elevada del detergente") , por ejemplo aproximadamente 4500 ppm hasta aproximadamente 5000 ppm en Europa y aproximadamente 6000 ppm en las geografías de acumulación de fosfato de espuma elevada. Las concentraciones de las soluciones de lavado típicas son determinadas empíricamente. Por ejemplo, en los Estados Unidos, una máquina lavadora típica retiene un volumen de aproximadamente 64.4 1 de la solución de lavado. En consecuencia, para obtener una concentración de aproximadamente 975 ppm del detergente dentro de la solución de lavado, aproximadamente 62.79 g de la composición detergente deben ser agregadas a los 64.4 1 de la solución de lavado. Esta cantidad es la cantidad típica medida en el agua de lavado por el consumidor que utiliza la taza medidora provista por el detergente. Las proteasas son las carbonil hidrolasas las cuales generalmente actúan para segmentar los enlaces de péptido de las proteínas o pép'tidos. Cuando se utilice aquí, "proteasa" significa una proteasa que está presente en forma natural o una proteasa recombinante. Las proteasas que están presentes en forma natural incluyen la a-aminoacilpéptido hidrolasa, la peptidilamino ácido hidrolasa, acilamino hidrolasa, serina carboxipeptidasa, metalocarboxipeptidasa, tiol proteinasa, carboxilproteinasa y metaloproteinasa. Las serina, metalo, tiol proteasas y las proteasas acidas están incluidas, así como las endo y exo-proteasas.

La presente invención incluye las enzimas de proteasa las cuales no son variantes de carbonil hidrolasa que no están presentes de manera natural (variantes de proteasa) que tienen una actividad proteolítica, estabilidad, especificidad del substrato, perfil de pH y/o características de funcionamiento diferentes cuando se compara con la carbonil hidrolasa precursora a partir de la cual la secuencia de aminoácidos de la variante es derivada. Específicamente, tales variantes de proteasa tienen una secuencia de aminoácidos no encontrada en la naturaleza, la cual es derivada por la substitución de una pluralidad de residuos de aminoácidos de una proteasa precursora con diferentes aminoácidos. La proteasa precursora puede ser una proteasa que está presente de manera natural o una proteasa recombinante. Las variantes de proteasa útiles aquí abarcan la substitución de cualquiera de los diecinueve L-aminoácidos que están presentes de manera natural en las posiciones de los residuos de aminoácidos designadas. Tales substituciones se pueden hacer en cualquier, subtilisina precursora (procariótica, eucariótica, de mamífero, etc.). En toda esta solicitud se hace referencia a varios aminoácidos por la vía de los códigos de una y tres letras comunes. Tales códigos son identificados en Dale, M. W. (1989) , Molecular Genetics of Bacteria, John Wiley & Sons, Ltd., Apéndice B. Las variantes de proteasa útiles aquí sin derivadas preferentemente de una subtilisina de Bacillus. Más preferentemente, las variantes de proteasa son derivadas de subtilisina de Bacillus lentus y/o la subtilisina 309. Las subtilisinas son proteasas fungosas o bacterianas las cuales actúan generalmente para segmentar los enlaces de péptido de las proteínas o péptidos. Cuando se utilice aquí, "subtilisina" significa una subtilisina que está presente de manera natural o una subtilisina recombinante. Una serie de subtilisinas que están presentes de manera natural se sabe que van a ser producidas y secretadas frecuentemente por varias especies microbianas. Las secuencias de aminoácidos de los elementos de esta serie no son totalmente homologas. Sin embargo, las subtilisinas en esta serie exhiben el mismo o un tipo similar de actividad proteolítica. Esta clase de serina proteasas comparte una secuencia de aminoácidos común que define una triada catalítica la cual las distingue de la clase relacionada con la quimiotripsina de las serina proteasas. Las subtilisinas y las serina proteasas relacionadas con la quimiotripsina, ambas tienen una triada catalítica que comprende aspartato, histidina y serina. En las proteasas relacionadas con la subtilisina el orden relativo de estos aminoácidos, que se leen desde las terminales o extremos amino a carboxi, es aspartato-histidina-serina. En las proteasas relacionadas con la quimiotripsina, el orden relativo, sin embargo, es histidina-aspartato-serina. Por consiguiente, la subtilisina de aquí se refiere a una serina proteasa que tiene la triada catalítica de las proteasas relacionadas con la subtilisina. Los ejemplos incluyen pero no están limitados a las subtilisinas identificadas en la Figura 3 de aquí. En general y para los propósitos de la presente invención, la numeración de los aminoácidos en las proteasas corresponde a los números asignados a la secuencia de subtilisina del Bacillus amyloliquefaciens maduro presentada en la Figura i. "Subtilisina recombinante" o "proteasa recombinante" se refiere a una subtilisina o proteasa en la cual la secuencia de ADN que codifica la subtilisina o la proteasa es modificada para producir una secuencia de ADN variante (o mutante) la cual codifica la substitución, deleción o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos que está presente de manera natural. Los métodos adecuados para producir tal modificación, y los cuales pueden ser combinados con aquellos descritos aquí, incluyen aquellos descritos en la Patente US RE 34,606, la Patente U.S. No. 5,204,015 y la Patente US No. 5,185,258, la Patente U.S. No. 5,700,676, la Patente U.S. No. 5,801,038, y la Patente U.S. No. 5,763,257. "Subtilisinas no humanas" y el ADN que las codifica pueden ser obtenidos de muchos organismos procarióticos y eucarióticos. Los ejemplos adecuados de los organismos procarióticos incluyen organismos gram negativos tales como el E. coli o Pseudomonas y bacterias gram positivas tales como Micrococcus o Bacillus. Los Ejemplos de organismos eucarióticos a partir de los cuales la subtilisina y sus genes pueden ser obtenidos incluyen levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae, hongos tales como Aspergillus sp. Una "variante de protéasa" tiene una secuencia de aminoácidos la cual es derivada de la secuencia de aminoácidos de un "precursor de proteasa". Las proteasas precursoras incluyen proteasas que están presentes en forma natural y proteasas recombinantes. La secuencia de aminoácidos de la variante de proteasa es "derivada" de la secuencia de aminoácidos de la proteasa precursora por la substitución, deleción o inserción de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos precursora. Tal modificación es de la "secuencia de ADN precursora" la cual codifica la secuencia de aminoácidos de la proteasa precursora en lugar de la manipulación de la enzima de proteasa precursora per se. Los métodos adecuados para tal manipulación de la secuencia de ADN precursora incluyen los métodos descritos aquí, así como los métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica (véase, por ejemplo, EP 328299, WO89/06279 y las Patentes US y solicitudes ya referidas aquí) . Estos números de la posición de los aminoácidos se refieren a aquellos asignados a la secuencia de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens madura presentada en la Figura 1. La invención, sin embargo, no está limitada a la mutación de este subtilisina particular sino que se extiende a las proteasas precursoras que contienen los residuos de aminoácidos en las posiciones las cuales son "equivalentes" a los residuos identificados particulares en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens . En una modalidad preferida de la presente invención, la proteasa precursora es la subtilisina de Bacillus lentus y las substituciones se hacen en las posiciones de los residuos de aminoácidos equivalentes en B. lentus que corresponden a aquellas listadas anteriormente. Una posición del residuo (aminoácido) de una proteasa precursora es equivalente a un residuo de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens si es ya sea homologa (es decir que corresponde en la posición en la estructura ya sea primaria o terciaria) o análoga a un residuo o porción específica de este residuo en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (es decir, que tiene la misma capacidad funcional o una similar para combinarse, reaccionar, o interactuar químicamente) . Para establecer una homología con respecto a la estructura primaria, la secuencia de aminoácidos de una proteasa precursora es comparada directamente con la secuencia primaria de la subtilisina de Bacillus amylolíquefaciens y particularmente con un conjunto de residuos que se sabe que van a ser no variables en las subtilisinas para las cuales la secuencia es conocida. Por ejemplo, la Figura 2 muestra aquí los residuos conservados como entre la subtilisina de B. amyloliquefaciens y la subtilisina de B. lentus. Después de alinear los residuos conservados, permitiendo las inserciones y deleciones necesarias para mantener el alineamiento (es decir, evitar la eliminación de los residuos conservados a través de la deleción e inserción arbitrarias) , los residuos equivalentes a los aminoácidos particulares en la secuencia primaria de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens son definidas. El alineamiento de los residuos conservados preferentemente debe conservar el 100% de tales residuos. Sin embargo, el alineamiento en más de 75% o en menos del 50% de los residuos conservados también es adecuado para definir residuos equivalentes. La conservación de la triada catalítica, Asp32/His64/Ser221 debe ser mantenida. Siezen et al. (1991) Protein Eng.4 (7 ): 719-737 muestra el alineamiento de un gran número de serina proteasas. Siezen et al., se refieren a la agrupación como subtilasas o serina proteasas semejantes a la subtilisina. Por ejemplo, en la Figura 3, la secuencia de aminoácidos de la subtilisina a partir de Bacillus a yloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis (carlsbergensis) y Bacillus lentus están alineadas para proporcionar la cantidad máxima de homología entre las secuencias de aminoácidos. Una comparación de estas secuencias muestra que existe un número de residuos conservados contenidos en cada secuencia. Estos residuos conservados (como entre BPN' y B. lentus) son identificados en la Figura 2. Estos residuos conservados, por consiguiente, pueden ser utilizados para definir los residuos de aminoácidos equivalentes correspondientes de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens en otras subtilisinas tales como la subtilisina de Bacillus lentus (Publicación PCT No. WO89/06279 publicada el 13 de julio de 1989), la enzima precursora de proteasa preferida de aquí, o la subtilisina referida como PB92 (EP 0 328 299), la cual es altamente homologa con respecto a la subtilisina de Bacillus lentus preferida. Las secuencias de aminoácidos de ciertas de estas subtilisinas están alineadas en las Figuras 3A y 3B con la secuencia de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens para producir la homología máxima de los residuos conservados. Como se puede observar, existe un número de deleciones en la secuencia de Bacillus lentus cuando se compara con la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens . Por consiguiente, por ejemplo, el aminoácido equivalente para Val 165 en la subtilisina de Bacillus amyloliquefacien en las otras subtilisinas es la isoleucina para el B. lentus y B. licheniformis . "Residuos equivalentes" también pueden ser definidos determinando la homología al nivel de la estructura terciaria para una proteasa precursora cuya estructura terciaria ha sido determinada por cristalografía de rayos x. Los residuos equivalentes son definidos como aquellos para los cuales las coordenadas atómicas de dos o más de los átomos de la cadena principales de un residuo de aminoácidos particular de la proteasa precursora y la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (N sobre N, CA sobre CA, C sobre C y O sobre 0) están dentro de 0.13 nm y preferentemente 0.1 nm después del alineamiento. El alineamiento es logrado después que el mejor modelo ha sido orientado y colocado para dar la superposición máxima de las coordenadas atómicas de los átomos de proteína sin hidrógeno de la proteasa en cuestión con respecto a la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens . El mejor modelo es el modelo cristalográfico que da el factor R más bajo para los datos de difracción experimental a la resolución más elevada disponible.

Factor R = ?hlFo(h) |-|Fc(h) | ShlFo(h) | Los residuos equivalentes los cuales son funcionalmente análogos a un residuo específico de la subtilisina de Bacillus amylolíquefaciens son definidos como aquellos aminoácidos de la proteasa precursora que pueden adoptar una conformación de tal modo que las mismas ya sea alteren, modifiquen o contribuyan a la estructura de la proteína, la unión del substrato o la catálisis de una manera definida y atribuida a un residuo específico de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens . Además, ellos son aquellos residuos de la proteasa precursora (para los cuales una estructura terciaria ha sido obtenida por cristalografía de rayos x) los cuales ocupan una posición análoga hasta el grado que, aunque los átomos de la cadena principal del residuo dado no puedan satisfacer los criterios de equivalencia sobre la base de ocupar una posición homologa, las coordenadas atómicas de al menos dos de los átomos de la cadena lateral del residuo descansan con 0.13 nm de los átomos de la cadena lateral correspondiente de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens . Las coordenadas de la estructura tridimensional de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens se describen en la Publicación EPO No. 0 251 446 (equivalente a la Patente US No. 5,182,204, la descripción de la cual es incorporada aquí para referencia) y puede ser utilizada como se describió anteriormente para determinar los residuos equivalentes al nivel de la estructura terciaria. Algunos de los residuos identificados para la substitución son los residuos conservados mientras que los otros no lo son. En el caso de los residuos los cuales no son conservados, la substitución de uno o más aminoácidos está limitada a las substituciones las cuales producen una variante la cual tiene una secuencia de aminoácidos que no corresponde a una encontrada en la naturaleza. En el caso de los residuos conservados, tales substituciones no deben conducir a una secuencia que está presente de manera natural. Las variantes de proteasa de la presente invención incluyen las formas maduras de las variantes de proteasa, así como las formas pro- y prepro-de tales variantes de proteasa. Las formas prepro son la construcción preferida puesto que esto facilita la expresión, secreción y maduración de las variantes de proteasa. La "Prosecuencia" se refiere a una secuencia de aminoácidos unida a la porción N-terminal de la forma madura de una proteasa la cual cuando se remueve conduce a la aparición de la forma "madura" de la proteasa. Muchas enzimas proteolíticas son encontradas en la naturaleza como productos de proenzima translacional y, en la ausencia de procesamiento pos-translacional, son expresados de esta manera. Una prosecuencia preferida para producir variantes de proteasa es la prosecuencia supuesta o putativa de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, aunque otras prosecuencias de proteasa pueden ser utilizadas. Una "señal de la secuencia" o "prosecuencia" se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos unida a la porción N-terminal de una proteasa o a la porción N-terminal de una proproteasa la cual puede participar en la secreción de las proformas o las formas maduras de la proteasa. Esta definición de la secuencia de la señal es una función, significando que incluye la totalidad de las secuencias de aminoácidos codificadas por la porción N-terminal del gen de proteasa el cual participa en llevar a cabo la secreción de la proteasa bajo las condiciones naturales. La presente invención utiliza tales secuencias para efectuar la secreción de las variantes de proceso como se definió aquí. Una secuencia posible de la señal comprende los primeros siete residuos de aminoácidos de la secuencia de la señal de la subtilisina de Bacillus subtilis fusionada al resto de la secuencia de la señal de la subtilisina de Bacillus lentus (ATCC 21536) . Una forma "prepro" de una variante de proteasa consiste de la forma madura de la proteasa que tiene una prosecuencia enlazada operativamente a los extremos de amino de la proteasa y a una secuencia de "pre" o de la "señal" enlazado operativamente al extremo amino de la prosecuencia. "Vector de expresión" se refiere a una construcción de ADN que contiene una secuencia de ADN la cual está enlazada operativamente a una secuencia de control capaz de efectuar la expresión del ADN en un huésped adecuado. Tales secuencias de control incluyen un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia de operador opcional para controlar tal transcripción, una secuencia que codifica los sitios de unión de los ribosomas de ARNm adecuados y secuencias las cuales controlan la terminación de la transcripción y la translación. El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago, o simplemente un inserto genómico potencial. Una vez transformado en un huésped adecuado, el vector puede replicarse y funcionar independientemente del genoma huésped, o puede, en algunos casos, integrarse en el propio genoma. En la presente especificación, el "plásmido " y el "vector" son utilizados algunas veces intercambiablemente cuando el plásmido es la forma utilizada más comúnmente del vector en el presente. Sin embargo, la invención está propuesta para que incluya algunas otras formas de vectores de expresión los cuales sirven para funciones equivalentes y los cuales son, o llegan a ser, conocidos en la técnica. Las "células huésped" utilizadas en la presente invención son huéspedes procarióticos o eucarióticos los cuales preferentemente han sido manipulados por los métodos descritos en la Patente US RE 34,606 para hacerlos incapaces de secretar la endoproteasa activa enzimática ente. Una células huésped preferida para expresar la proteasa en la cepa BG2036 de Bacillus la cual es deficiente en la proteasa neutral activa enzimáticamente y la proteasa alcalina (subtilisina) . La construcción de la cepa BG2036 se describe con detalle en la Patente US 5,264,366. Otras células huésped para expresar la proteasa incluyen Bacillus subtilis 1168 (también descrita en la Patente US RE 34,606 y la Patente US 5,264,366, la descripción de las cuales es incorporada aquí para referencia) , así como cualquiera otra cepa de Bacillus adecuada tal como de B. licheniformis, B. lentus, etc. Las células huésped son transformadas o transfectadas con vectores construidos utilizando las técnicas de ADN recombinantes. Tales células huésped transformadas son capaces ya sea de replicar los vectores que codifican las variantes de proteasa o de expresar la variante de proteasa deseada. En el caso de los vectores los cuales codifican la pre- o prepro-forma de la variante de proteasa, tales variantes, cuando son expresadas, son secretadas típicamente de la célula huésped en el medio de la célula huésped. "Enlazado operativamente", cuando se describe la relación entre dos regiones de ADN, simplemente significa que las mismas están relacionadas funcionalmente entre sí. Por ejemplo, una presecuencia está enlazada operativamente con un péptido si el mismo funciona como una secuencia de la señal, que participa en la secreción de la forma madura de la proteína que involucra más probablemente la segmentación de la secuencia de la señal. Un promotor está enlazado operativamente a una secuencia de codificación si la misma controla la transcripción de la secuencia; un sitio de unión del ribosoma está enlazado operativamente a una secuencia de codificación si la misma está colocada para permitir la translación. Los genes que codifican la proteasa precursora que está presente de manera natural pueden ser obtenidos de acuerdo con los métodos generales conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los métodos comprenden en general la sintetización de las sondas etiquetadas que tienen secuencias putativas o supuestas que codifican las regiones de la proteasa de interés, preparar las bibliotecas genómicas de los organismos que expresan la proteasa, y seleccionar las bibliotecas para el gen de interés por la hibridación de las sondas. Los clones de hibridación positiva son asignados entonces con coordenadas y secuenciados . La proteasa clonada es utilizada entonces para transformar una célula huésped para expresar la proteasa. El gen de la proteasa es ligado entonces en un plásmido de número de copias elevado.

Este plásmido se replica en huéspedes en el sentido de que el mismo contiene los elementos bien conocidos necesarios para la replicación del plásmido: un promotor enlazado operativamente al gen en cuestión (el cual puede ser provisto como el promotor homólogo poseído por el gen si el mismo es reconocido, es decir, transcrito, por el huésped) , una región de terminación y de poliadenilación de la transcripción (necesaria para la estabilidad del ARNm transcrito por el huésped del gen de la proteasa en ciertas células huésped eucarióticas) la cual es exógena o es suministrada por la región terminadora endógena del gen de la proteasa y, deseablemente, un gel de selección tal como un gen de resistencia a los antibióticos que hace posible el mantenimiento del cultivo continuo de las células huésped infectadas con el plásmido en él medio que contiene los antibióticos. Los plásmidos con un número elevado de copias también contienen un origen de replicación para el huésped, por lo cual hacen posible que grandes números de plásmidos sean generados en el citoplasma sin limitaciones cro osómicas. Sin embargo, está dentro del alcance de aquí integrar copias múltiples del gen de proteasa en el genoma del huésped. Esto es facilitado por los organismos procarióticos y eucarióticos los cuales son susceptibles particularmente a la recombinación homologa. El gen puede ser un gen de B. lentus natural. Alternativamente, un gen sintético que codifica una proteasa precursora mutante o que está presente de manera natural, puede ser producida. En tal enfoque, el ADN y/o la secuencia de aminoácidos de la proteasa precursora es determinada. Los fragmentos de ADN de una sola hebra, sintéticos, de superposición, múltiples, son sintetizados después de esto, lo cual durante la hibridación y la unión produce un ADN sintético que codifica la proteasa precursora. Un ejemplo de la construcción de un gen sintético se describe en el Ejemplo 3 de la Patente US No. 5,204,015, la descripción de la cual es incorporada aquí para referencia. Una vez que el gen dé proteasa del precursor sintético o que está presente de manera natural ha sido clonado, un número de modificaciones son emprendidas para mejorar el uso del gen más allá de la síntesis de la proteasa precursora que está presente de manera natural. Tales modificaciones incluyen la producción de las proteasas recombinantes como se describió en la Patente US RE 34,606 y la Publicación EPO No. 0 251 446 y la producción de las variantes de proteasa descritas aquí.

El siguiente método de mutagénesis de cásete puede ser utilizado para facilitar la construcción de las variantes de proteasa de la presente invención, aunque se pueden utilizar otros métodos. En primer lugar, el gen que está presente de manera natural que codifica la proteasa es obtenido y secuenciado total o parcialmente. Luego la secuencia es explorada para encontrar un punto en el cual sea deseable hacer una mutación (deleción, inserción o substitución) de uno o más aminoácidos en la enzima codificada. Las secuencias que flanquean este punto son evaluadas para verificar la presencia de los sitios de restricción para reemplazar un segmento corto del gen con un grupo de oligonucleótidos el cual cuando se exprese codificará varias mutantes. Tales sitios de restricción son preferentemente sitios únicos dentro del gen de proteasa para facilitar él reemplazo del segmento del gen. Sin embargo, cualquier sitio de restricción conveniente el cual no es ampliamente redundante en el gen de la proteasa puede ser utilizado, siempre que los fragmentos del gen generados por la digestión de la restricción puedan ser reensamblados en la secuencia apropiada. Si los sitios de la restricción no están presentes en los lugares dentro de una distancia conveniente desde el punto seleccionado (desde 10 hasta 15 nucleótidos), tales sitios son generados substituyendo los nucleótidos en el gen de tal modo que ningún marco de lectura ni los aminoácidos codificados sean cambiados en la construcción final. La mutación del gen para cambiar su secuencia para que se conforme a la secuencia deseada es efectuada por la extensión del cebador M13 de acuerdo con los métodos conocidos generalmente. La tarea de localizar regiones de flanqueo adecuadas y evaluar los cambios necesarios para arribar a dos secuencias del sitio de restricción convenientes se hace rutinariamente por la redundancia del código genético, un mapa de la enzima de restricción y el número grande de las diferentes enzimas de restricción. Nótese que si un sitio de restricción de flanqueo conveniente está disponible, el método anterior necesita ser utilizado solamente con relación a la región de flanqueo la cual no contiene un sitio. Una vez que el ADN que está presente de manera natural o el ADN sintético es clonado, los sitios de restricción que flanquean las posiciones que van a ser mutadas son digeridos con las enzimas de restricción análogas o semejantes y una pluralidad de los casetes de oligonucleótidos de terminales complementarias extremas son unidos o ligados en el gen. La mutagénesis es simplificada por este método a causa de que la totalidad de los oligonucleótidos pueden ser sintetizados para que tengan los mismos sitios de restricción, y no sean necesarios enlazadores sintéticos para crear los sitios de restricción. Cuando se utilice aquí, la actividad proteolítica es definida como la velocidad de la hidrólisis de las uniones de péptidos por miligramo de la enzima activa. Existen muchos procedimientos bien conocidos para medir la actividad proteolítica (K. M. Kalisz, "Microbial Proteinases", Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, A Fiechter ed., 1988). Además de o como una alternativa a la actividad proteolítica, las enzimas variantes de la presente invención pueden tener otras propiedades modificadas tales como la Km, kcat, la relación kcat/Km y/o la especificidad del substrato modificado y/o el perfil de actividad de pH modificado. Estas enzimas pueden ser adaptadas para el substrato particular el cual se anticipa que va a estar presente, por ejemplo, en la preparación de péptidos o para los procesos hidrolíticos tales como usos en lavandería. En un aspecto de la invención, el objetivo es asegurar una proteasa variante o variable que tiene una actividad proteolítica alterada cuando se compara con la proteasa precursora, puesto que el incremento de tal actividad (numéricamente más grande) hace posible el uso de la enzima para que actúe más eficientemente sobre un substrato de blanco u objetivo. También son de interés las enzimas variantes o variables que tienen una estabilidad térmica alterada y/o una especificidad del substrato alterada cuando se compara con el precursor. En algunos casos, la actividad proteolítica inferior puede ser deseable, por ejemplo una reducción en la actividad proteolítica podría ser útil en donde la actividad sintética de las proteasas es deseable (como para sintetizar péptidos) . Se puede desear reducir esta actividad proteolítica, la cual es capaz de destruir el producto de tal síntesis. Por el contrario, en algunos casos puede ser deseable incrementar la actividad proteolítica de la enzima variante o variable contra su precursor. Adicionalmente, se incrementa o reduce (altera) la estabilidad de ' la variante, si una estabilidad alcalina o térmica, puede ser deseable. Los incrementos o reducciones en kcat, Km o kcat/Km son específicos para el substrato utilizado para determinar estos parámetros cinéticos. En otro aspecto de la invención, se ha encontrado que las variantes de proteasa que contienen substituciones de los aminoácidos en una o más posiciones de los residuos de modo que la substitución altere la carga en esta posición para hacer a la carga más negativa o menos positiva, comparado con una proteasa precursora, son más efectivas a una concentración baja del detergente que una proteasa precursora. En un aspecto adicional de la invención, se ha encontrado que las variantes de proteasa que contienen las substituciones de los aminoácidos en una o más posiciones de los residuos, de modo que la substitución altere la carga en esta posición para hacer a la carga más positiva o menos negativa comparado con una proteasa precursora, son más efectivas a una concentración elevada de detergente que una proteasa precursora. Además, se ha encontrado que muchas de las variantes de proteasa útiles en el sistema de concentración baja del detergente y/o el sistema de concentración elevada del detergente también son efectivas en un sistema de concentración intermedia del detergente. Estas substituciones se hacen preferentemente en la subtilisina de Bacillus lentus (del tipo natural o recombinante) , aunque se pueden hacer las substituciones en cualquier proteasa de Bacillus, preferentemente las subtilisinas de Bacillus . Con base en los resultados de la selección obtenidos con las proteasas variantes o variables, las mutaciones señaladas en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens son importantes para la actividad proteolítica, el funcionamiento y/o la estabilidad de estas enzimas y el funcionamiento de limpieza o lavado de tales enzimas variables o variantes. Muchas de las variantes de proteasa de la invención son útiles en la formulación de varias composiciones detergentes o formulaciones para el cuidado personal tales como champús o lociones . Un número de compuestos conocidos son agentes tensioactivos adecuados útiles en las composiciones que comprenden los mutantes de proteasa de la invención. Estos incluyen los detergentes no iónicos, aniónicos, catiónicos o zwitteriónicos, como se describieron en la Patente US 4,404,128 de Barry J. Anderson y la patente US No. 4,261,868 de Jiri Flora, et al. Una formulación detergente adecuada es aquella descrita en el Ejemplo 7 de la Patente US 5,204,015 (incorporada previamente para referencia) . La técnica es familiar con las diferentes formulaciones las cuales pueden ser utilizadas como composiciones limpiadoras. Además de las composiciones de limpieza típicas, se sobreentiende fácilmente que las variantes de proteasa de la presente invención pueden ser utilizadas para cualquier propósito que se utilicen las proteasas naturales o del tipo silvestre. Por consiguiente, estas variantes se pueden utilizar, por ejemplo, en aplicaciones de jabón en barra o líquido, formulaciones para el cuidado de los platos, soluciones o productos para la limpieza de los lentes de contacto, hidrólisis de péptidos, tratamiento de desechos, aplicaciones textiles, como enzimas de segmentación por fusión en la producción de proteínas, etc. Las variantes de la presente invención pueden comprender un funcionamiento mejorado en una composición detergente (cuando se compara con el precursor) . Cuando se utilice aquí, un funcionamiento mejorado en un detergente está definido como una limpieza creciente de ciertas manchas sensibles a las enzimas tales como la hierba o la sangre, como se determinó por la evaluación usual después de un ciclo de lavado estándar. Las proteasas de la invención pueden ser formuladas en detergentes líquidos y pulverizados conocidos que tienen un pH entre 6.5 y 12.0 a niveles de aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 5% (preferentemente 1% a 5%) en peso. Estas composiciones de limpieza detergentes también pueden incluir otras enzimas tales como las proteasas, amilasas, celulasas, lipasas o endoglicosidasas conocidas, así como agentes de construcción y estabilizadores. La adición de proteasas de la invención a las composiciones de limpieza convencionales no crean ninguna limitación de uso especial. En otras palabras, cualquier temperatura y pH adecuados para el detergente también son adecuados para las presentes composiciones siempre que el pH esté dentro del intervalo anterior, y la temperatura está abajo de la temperatura de desnaturalización de la proteasa descrita. Además, las proteasas de la invención pueden ser utilizadas en una composición de limpieza sin detergentes, nuevamente ya sea solos o en combinación con agentes de construcción y estabilizadores. La presente invención también se refiere a composiciones de limpieza que contienen las variantes de proteasa de la invención. Las composiciones de limpieza pueden contener adicionalmente aditivos los cuales son utilizados comúnmente en las composiciones de limpieza. Estas pueden ser seleccionadas de, pero no limitadas a, agentes blanqueadores, agentes tensioactivos, agentes de construcción, enzimas y catalizadores de blanqueo. Podría ser fácilmente evidente para una persona con experiencia ordinaria en la técnica que los aditivos son adecuados para la inclusión en las composiciones. Esta lista provista aquí no significa que sea exhaustiva y debe ser tomada solamente como los ejemplos de los aditivos adecuados. También será fácilmente evidente para una persona con experiencia ordinaria en la técnica solamente utilizar aquellos aditivos los cuales sean compatibles con las enzimas y otros componentes en la composición, por ejemplo, el agente tensioactivo. Cuando está presente, la cantidad del aditivo presente en la composición de limpieza es desde aproximadamente 0.01 % hasta aproximadamente 99.9 %, preferentemente de manera aproximada 1% hasta aproximadamente 95 %, más preferentemente de manera aproximada 1% hasta aproximadamente 80%. Las proteasas variantes o variables de la presente invención pueden ser incluidas en la alimentación animal tal como parte de los aditivos de la alimentación de los animales como se describió en, por ejemplo, las Patentes US Nos. 5,612,055; 5,314,692 y ,147,642. Un aspecto de la invención es una composición para el tratamiento de un material textil que incluye las proteasas variantes o variables de la presente invención.

La composición puede ser utilizada para tratar por ejemplo la seda o la lana como se describió en las publicaciones tales como RD 216,034; EP 134,267; US 4,533,359; y EP 344,259. Lo siguiente es presentado a manera de ejemplo y no va a ser construido como una limitación del alcance de las reivindicaciones.

Todas las publicaciones y patentes referidas aquí son incorporadas por el presente para referencia en su totalidad.

Ejemplo 1 Un gran número de variantes de proteasa fueron producidas y purificadas utilizando los métodos bien conocidos en la técnica. Todas las mutaciones se hicieron en subtilisina de Bacillus lentus GG36. Las variantes de proteasa producidas fueron probadas para verificar el funcionamiento en los dos tipos de condiciones de lavado y detergentes utilizadas en un ensayo de micromuestras de tela descrito en "An improved method of assaying for a preferred enzyme and/or preferred detergent compositio'n", U.S. No. de Serie 60/068,796. Las Tablas 1-13 listan las proteasas variables o variantes ensayadas y los resultados de prueba en dos diferentes detergentes. Todos los valores son dados como comparación con la primera proteasa mostrada en la tabla (es decir, un valor de 1.32 indica una capacidad para liberar 132% de la mancha como lo opuesto al 100% de a primera variante en la tabla) .

La columna A muestra la diferencia de la carga de una variante. Para la columna B, el detergente fue de 0.67 g/1 de Ariel Ultra filtrado (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, EUA), en una solución que contiene 3 granos por galón de dureza de Ca2+/Mg2+ mezclados, y 0.3 ppm de enzima se utilizó en cada cavidad a 25 °C (sistema detergente de concentración baja) . Para la columna C, el detergente fue 3.38 g/1 de Ariel Futur filtrado (Procter & Gamble, Cincinnati, OH; EUA), en una solución que contiene 15 granos por galón de dureza de Ca2+/Mg2+ mezclado, y 0.3 ppm de enzima se utilizó en cada cavidad a 40 °C (sistema detergente de concentración elevada) .

Tabla 1 Ta?La 2 Tabla 3 t 8 Ejemplo 2 Las siguientes variantes de proteasa se hicieron y se probaron como se señaló en el Ejemplo 1. Las variantes en la Tabla 14 son variantes de proteasa las cuales tienen ambos tipos de substituciones: aquellas las cuales alteran la carga en una posición para hacer a la carga más negativa o menos positiva y aquellas las cuales alteran la carga en una posición para hacer a la carga más positiva o menos negativa comparado con B. Lentus GG36 así como las substituciones neutrales que no afectan la carga en una posición del residuo dada. Esto produce variantes de proteasa que funcionan mejor que un estándar tanto en sistemas de concentración baja de detergente (columna A; 0.67 g/1 de Ariel Ultra filtrado (Procter & Gamble, Cincinnati, ÓH, USA) , en una solución que contiene 3 granos por galón de dureza de Ca2+/Mg2+ mezclado, y 0.3 ppm de enzima fue utilizada en cada cavidad a 25 °C) como en sistemas de concentración elevada del detergente (columna B; 3.38 g/1 de Ariel Futur filtrado (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, EUA), en una solución que contiene 15 granos por galón de dureza de Ca2+/Mg2+ mezclado, y 0.3 ppm de enzima se utilizó en cada cavidad a 40 °C) .

Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims (24)

REIVINDICACIONES

1. Una variante de proteasa que comprende una substitución de un aminoácido en una o más posiciones del residuo, caracterizado porque la substitución altera la carga en esta posición para hacer a la carga más negativa o menos positiva comparado con una proteasa precursora y en donde la variante de proteasa es más efectiva en un sistema de concentración baja del detergente que una proteasa precursora.

2. La variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteasa es una subtilisina.

3. La variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se deriva de una subtilisina de Bacillus .

4. La variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque se deriva de la subtilisina de Bacillus lentus.

5. Un ADN que codifica una variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 1.

6. Un vector de expresión que codifica el ADN de conformidad con la reivindicación 5.

7. Una célula huésped, caracterizada porque está transformada con el vector de expresión de la reivindicación 6.

8. Una composición de limpieza, caracterizada porque comprende la variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 1.

9. Una alimentación animal, caracterizada porque comprende la variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 1.

10. Una composición 'para tratar un material textil, caracterizado porque comprende la variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 1.

11. Una variante de proteasa que comprende una substitución de un aminoácido en una o más posiciones del residuo, caracterizada porque la substitución altera la carga en esta posición para hacer a la carga más positiva o menos negativa comparado con una proteasa precursora y en donde la variante de proteasa es más efectiva en un sistema de concentración elevada del detergente que una proteasa precursora.

12. La variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la proteasa es una subtilisina.

13. La variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque se deriva de una subtilisina de Bacillus .

14. La variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque se deriva de la subtilisina de Bacillus lentus .

15. Un ADN, caracterizado porque codifica una variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 11.

16. Un vector de expresión, caracterizado porque codifica el ADN de la reivindicación 15.

17. Una célula huésped, caracterizada porque está transformada con el vector de expresión de la reivindicación 16.

18. Una composición de limpieza, caracterizada porque comprende la variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 11.

19. Una alimentación de animal, caracterizada porque comprende la variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 11.

20. Una composición para tratar un material textil, caracterizado porque comprende la variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 11.

21. La variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la concentración elevada del detergente es mayor que 2000 ppm en el agua de lavado.

22. Un método de producción de una variante de proteasa que es más efectiva en un sistema de concentración media y elevada de detergente que una proteasa precursora, caracterizado porque comprende: a) substituir un aminoácido en una o más posiciones del residuo, en donde la substitución altera la carga en esta posición para hacer a la carga más positiva o menos negativa comparado con la proteasa precursora; b) substituir un aminoácido en una o más posiciones del residuo en donde la substitución altera la carga en esta posición para hacer a la carga más negativa o menos positiva comparado con la proteasa precursora; c) probar la variante para determinar su efectividad en un sistema de concentración elevada, intermedia y baja del detergente comparado con la proteasa precursora; y d) repetir los pasos a) - c) cuando sea necesario para producir una variante de proteasa que es más efectiva en un sistema de concentración baja, intermedia y elevada del detergente que una proteasa precursora.

23. Una variante de proteasa que comprende la substitución de un aminoácido en una o más posiciones del residuo, caracterizada porque la substitución altera la carga en esta posición para hacer a la carga más positiva o menos negativa comparado con una proteasa precursora y en donde la variante de proteasa es más efectiva en un sistema de concentración intermedia del detergente que una proteasa precursora.

24. Una variante de proteasa que comprende la substitución de un aminoácido en una o más posiciones del residuo, caracterizada, porque la substitución altera la carga en esta posición para hacer a la carga más negativa o menos positiva comparado con una proteasa precursora y en donde la variante de proteasa es más efectiva en un sistema de concentración intermedia del detergente que una proteasa precursora. •r ?, VARIANTES DB PROTEASA SUBSTITUIDAS CON PLIEGUES MÚLTIPLES, CON ONA CARGA DE LA RED ALTERADA PARA SU US RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a nue variantes de proteasa derivadas de las secuencias de 5 de las proteasas no humanas recombinantes o que est presentes de manera natural. Las variantes de protea son obtenidas por modificación (in vitro) de u secuencia de ADN precursora que codifica la protea recombinante o que está presente de manera natural pa 10 generar la substitución de una pluralidad de residuos aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de u proteasa precursora. Se proporcionan variantes proteasa que contienen substituciones de los aminoácid en una o más posiciones de los residuos de modo que 15 substitución altere la carga en esta posición para hac a la carga más negativa o menos positiva comparado c una proteasa precursora y por consiguiente la variante proteasa es más efectiva en un sistema de concentraci baja del detergente que una proteasa precursora. Tambi 20 se proporcionan variantes de proteasa que contien substituciones de los aminoácidos en una o más posicion del residuo de modo que la substitución altere la car en esta posición para hacer a la carga más positiva menos negativa comparado con una proteasa precursora ÍS por consiguiente la variante de proteasa es más efecti en un sistema de concentración elevada del detergente qu una proteasa precursora.