MXPA00003807A - Variantes de proteasa multiplemente substituidas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a novedosas variantes de proteasa derivadas de las secuencias de DNA de proteasas no humanas recombinantes o de proteasas que se presentan naturalmente. Las variantes de proteasas, en general, se obtienen mediante la modificación in vitro de una secuencia de DNA precursor, que codifica la proteasa recombinante o que se presenta naturalmente, para generar la substitución de una pluralidad de residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de una proteasa precursora. Esas variantes de proteasa tienen propiedades que son diferentes a las de la proteasa precursora, tales como características de lavado alteradas. El residuo de aminoácido substituido corresponde a la posición 103 en combinación con una o más de las siguientes substituciones en las posiciones de residuos que corresponden a las posiciones, 1, 3, 4, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 27, 33, 37, 38, 42, 43, 48, 55, 57, 58, 61, 62, 68, 72, 75, 76, 77, 78, 79, 86, 87, 89, 97, 98, 99, 101, 102, 104, 106, 107, 109, 111, 114, 116, 117, 119, 121, 123, 126, 128, 130, 131, 133, 134, 137, 140, 141, 142, 146, 147, 158, 159, 160, 166, 167, 170, 173, 174, 177, 181, 182, 183, 184, 185, 188, 192, 194, 198, 203, 204, 5 205, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 222, 224, 227, 228, 230, 232, 236, 237, 238, 240, 2421 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 265, 268, 10 269, 270, 271, 272, 274 y 275 de la subtilisina del Bacíllus amyloliquefacíens, en donde, cuando una substitución en una posición que corresponde a la posición de residuo 103, se combina con una substitución en una posición que corresponde a la posición de residuo 76,. existe también una substitución en una o más posiciones de residuos diferentes de las posiciones de residuos que corresponden a las posiciones 27, 99, 101, 104, 107, 109, 123, 128, 166, 204, 206, 210, 216, 217, 218, 222, 260, 265, o 274 de la subtilisina del Bacíllus amyloliquefacíens.

Description

VARIANTES DE PROTEASA MÚLTIPLEMENTE SUBSTITUIDAS CAMPO Y ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las proteasas de serina son un subgrupo de c-arboni lhidrolasas . Comprenden una clase diversa de enzimas que tienen un alto rango de especificidades y funciones biológicas. Stroud, R. Sci . Amer . , 131:74-88. A pesar de su diversidad funcional, la maquinaria catalítica de las proteasas de serina ha sido abordada por al menos dos familias de enzimas genéticamente distintas: 1) las subtilisinas y 2) las proteasas de serina bacterianas homologas y relacionadas con la quiítio t rips ina , de mamíferos (por ejemplo, la tripsina y la tripsina del S . gre s i u s ) . Estas dos familias de proteasas de serina muestran mecanismos de catálisis notablemente similares. Kraut. J. (1977) . Annu . Rev . Biochem . , 46:331-358. Además, aunque la estructura primaria no está relacionada, la estructura terciaria de estas dos familias de enzimas reúne una tríada catalítica, conservada, de aminoácidos que consisten de serina, histidina y aspartato.

REF, 119512 Las subtilisinas son proteasas de serina (con un peso molecular de aproximadamente 27,500) que son secretadas en grandes cantidades de una amplía variedad de especies de Bacillus y otros microorganismos. La secuencia proteínica de la subtilisina ha sido determinada a partir de al menos nueve especies diferentes de Bacillus. Markland, F.S., et al (1983), Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 364:1537-^1540. La estructura cristalográfica tridimensional de la subtilisina del Bacillus a yloliquefaciens, Bacillus 1 i cheni orimi s y varias variantes naturales del B. lentus han sido reportadas. Estos estudios indican que aunque la subtilisina no está relacionada genéticamente con las proteasas de serina de mamíferos, tiene una estructura de sitios activos similar. Las estructuras cristalinas de rayos X, de la subtilisina, contienen inhibidores peptídicos enlazados covalentemente (Robertus, J.D., et al. (1972), Biochemistry, 11:2439-2449) o productos complejos (Robertus, J.D., et al. (1976), J .

Biol . Chem . , 251:1097-1103) han proporcionado también información concerniente al sitio activo y al substrato putativo que enlaza la hendidura de la subtilisina. Además, un gran número de estudios de modificación cinética y química han sido reportados para la subtilisina; Svendsen. B. (1976), Carisberg Res. Commun., 41:237-291; Markland, F.S. I_d. ) así como al menos un reporte en donde la cadena lateral de metionina en el residuo 222 de la subtilisina fue convertida por peróxido de hidrógeno en sulfóxido de metionina (Stauffer. D.C., et al. (1965) , J . Biol . Chem. , 244:5333-5338) y se ha llevado a cabo la mutagénesis extensiva específica al sitio (Wells y Estell (1988) (TIBS 13:291-297) .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un objetivo de la presente es proporcionar variantes de proteasa que contienen una substitución de un aminoácido en una posición de residuo que corresponde a la posición 103 de la subtilisina del Ba ci l l u s amyl ol i qu efa ci en s y sustituir uno o más aminoácidos en las posiciones de residuos seleccionadas del grupo que consiste de posiciones de residuos que corresponden a las posiciones 1, 3, 4, 8, 10, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 27, 33, 37, 38, 42, 43, 48, 55, 57, 58, 61, 62, 68, 72, 75, 76, 77, 78, 79, 86, 87, 89, 97, 98, 99, 101, 102, 104, 106, 107, 109, 111, 114, 116, 117, 119, 121, 123, 126, 128, 130, 131, 133, 134, 137, 140, 141, 142, 146, 147, 158, 159, 160, 166, 167, 170, 173, 174, 177, 181, 182, 183, 184, 185, 188, 192, 194, 198, 203, 204, 205, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 222, 224, 227, 228, 230, 232, 236, 237, 238, 240, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 265, 268, 269, 270, 271, 272, 274 y 275 de la subtilisina del Ba ci l l u s amyl ol i qu efa ci en s ; en donde, cuando una substitución en una posición que corresponde a la posición de residuo 103 se combina con una substitución en una posición que corresponde a la posición de residuo 76, existe también una substitución en una o más posiciones de residuos diferentes que las posiciones de residuos que corresponden a las posiciones 27, 99, 101, 104, 107, 109, 123, 128, 166, 204, 206, 210, 216, 217, 218, 222, 260, 265, o 274 de la subtilisina del Ba ci l l us amyl ol i qu efa ci ens .

Aunque se puede emplear cualquier combinación de las substituciones de aminoácidos dadas anteriormente, las enzimas de variantes de proteasa preferidas, útiles para la presente invención, comprenden la substitución de los residuos de aminoácidos en las siguientes combinaciones de posiciones. Todas las posiciones de residuos corresponden a las posiciones de la subtilisina del Ba ci l l u s amyl ol i qu e fa cí ens : (1) una variante de proteasa que incluya substituciones de residuos de aminoácidos en la posición 103 y en una o más de las siguientes posiciones 236 y 245; (2) una variante- de proteasa que incluya substituciones de residuos de aminoácidos en las posiciones 103 y 236 y en una o más de las siguientes posiciones 1, 9, 12, 61, 62, 68, 76, 97, 98, 101, 102, 104, 109, 130, 131, 159, 183, 185, 205, 209, 210, 211, 212, 213, 215, 217, 230, 232, 248, 252, 257, 260, 270 y 275; (3) una variante de proteasa que incluya substituciones de residuos de aminoácidos en las posiciones 103 y 245 y en una o más de las siguientes posiciones 1, 9, 12, 61, 62, 68, 76, 97, 98, 101, 102, 104, 109, 130, 131, 159, 170, 183, 185, 205, 209, 210, 211, 212, 213, 215, 217, 222, 230, 232, 248, 252, 257, 260, 261, 270 y 275; o (4) una variante de proteasa que incluya substituciones de residuos de aminoácidos en las posiciones 103, 236 y 245 y en una o más de las siguientes posiciones 1, 9, 12, 61, 62, 68, 76, 97, 98, 101, 102, 104, 109, 130, 131, 159, 183, 185, 205, 209, 210, 211, 212, 213, 215, 217, 230, 232, 243, 248, 252, 257, 260, 270 y 275. Variantes de proteasa más preferidas son los conjuntos de substitución seleccionados del grupo que consiste de las posiciones de residuos que corresponden a las posiciones que se encuentran en la Tabla 1 de la subtilisina del Ba ci l l us amyl o l i qu efa ci ens : Las variantes de proteasa más preferidas son las que se presentan en la Tabla 3. Un objetivo adicional es proporcionar secuencias de DNA que codifiquen esas variantes de proteína, así como vectores de expresión que contengan esas secuencias de DNA de las variantes . Todavía aún, otro objetivo de la invención es proporcionar células huésped transformadas con esos vectores, así como células huésped que sean capaces de expresar ese DNA para producir variantes de proteasa ya sea intracelul ármente o e tracelul ármente . Además se proporciona una composición de limpieza que comprende una variante de proteasa de la presente invención. Adicionalmente se proporciona un alimento para animales que comprende una variante de proteasa de la presente invención. También se proporciona una composición para el tratamiento de un producto textil, que comprende una variante de proteasa de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1 A-C representan la secuencia de aminoácidos y de DNA para la subtilisina del Bacillus amyloliquefaciens y un mapa de restricción parcial de este gen. La Figura 2 representa los residuos de aminoácidos conservados, entre subtilisina del Bacillus amyloliquefaciens (BPN)' y del Bacillus lentus (tipo salvaje) . Las Figuras 3A y 3B representan la secuencia de aminoácidos de cuatro subtilisinas. La línea de arriba representa la secuencia de aminoácidos de subtilisina de la subtilisina del Bacillus amyl oliquefaciens -(a la que algunas veces se hace referencia como subtilisina BPN' ) . Lá segunda línea representa la secuencia de aminoácidos de la subtilisina del Bacillus subtilis . La tercera línea representa la secuencia de aminoácidos de la subtilisina del B. licheniformis. La cuarta línea representa la secuencia de aminoácidos de la subtilisina del Bacillus lentus (a la que también _se hace referencia como subtilisina 309 en la PCT WO89/06276) . El símbolo * denota la ausencia de residuos de aminoácidos específicos comparados con la subtilisina BPN' .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las proteasas son carbonilhidrolas as que actúan generalmente para romper los enlaces proteínicos de proteínas o péptidos. Como se usa en la presente, "proteasa" significa una proteasa que se presenta naturalmente o una proteasa recombinante. Las proteasas que se presentan naturalmente incluyen la hidrolasa de a-amino aci lpépt ido , la hidrolasa de pept idi laminoácido , la hidrolasa de acilamino, la carboxipep t idas a de serina, la me t alocarboxipept i das a , la t io lpro teínas a , la carboxi lpro teinasa y la metaloproteinasa. También se encuentran incluidas las proteasas de serina, las me talopro t eas as , las t iolpro teas as y las proteasas acidas, así como las endopro t eas as y las exoproteasas . La presente invención incluye enzimas de proteasa que no son variantes de carbonilhidrolasa que se presentan naturalmente (variantes de proteasa) que tienen una actividad proteolítica, estabilidad, especificidad por el substrato, perfil de pH y/o características de funcionamiento, diferentes, al compararse con la carbonilhidrolasa precursora de la cual se deriva la secuencia de aminoácidos de la variante. Específicamente esas variantes de proteasa tienen una secuencia de aminoácidos no encontrada en la naturaleza, la cual se deriva por la substitución de una pluralidad de residuos de aminoácidos de una proteasa precursora con diferentes aminoácidos. La proteasa precursora puede ser una proteasa que se presente naturalmente o una proteasa recomb inant e . Las variantes de proteasa útiles en la presente abarcan la substitución de cualesquiera de las diecinueve aminoácidos L que se presentan naturalmente en las posiciones de los residuos de aminoácidos designadas. Esas substituciones pueden estar hechas en cualquier subtilisina precursora (procarióticas, eucarióticas, de mamífero, etc.) . En toda esta solicitud se hace referencia a varios aminoácidos a través de códigos comunes de una y tres letras. Esos códigos se identifican en Dale, M.W. (1989), Molecular Genetics of Bacteria, John Wiley & Sons. Ltd.; Ap éndi ce B . Las variantes de proteasa útiles en la presente se derivan preferentemente de una subtilisina de Ba ci l l u s . Más preferentemente, las variantes de proteasa se derivan de la subtilisina del Ba ci l l u s l en t u s y/o de la subtilisina 309. Las subtilisinas son proteasas bacterianas o fúngicas, que generalmente actúan para romper los enlaces peptídicos de proteínas o péptidos. Como se usa en la presente, "subtilisina" significa una subtilisina que se presenta naturalmente o una subtilisina recombinante. Se sabe que una serie de subtilisinas que se presentan naturalmente son producidas y a menudo secretadas por varias especies microbianas. Las secuencias de aminoácidos de los miembros de esta serie no son totalmente homologas. Sin embargo, las subtilisinas en esta serie exhiben el mismo tipo o un tipo similar de actividad proteolítica. Esta clase de proteasas de serina comparte una secuencia de aminoácidos común, que define una tríada catalítica que las distingue de la clase de proteasas de serina relacionadas con la quimotripsina . Las proteasas de serina relacionadas con las subtilisinas y la quimotripsina, tienen ambas una tríada catalítica que comprende aspartato, histidina y serina. Sin embargo, en las proteasas relacionadas con la quimotripsina, el orden relativo es hi s t idina-aspartato-serina . De esta manera, subtilisina se refiere en la presente a una proteasa de serina que tiene la tríada catalítica de las proteasas relacionadas con la subtilisina. Los ejemplos incluyen, aunque no_ están limitados a, las subtilisinas identificadas en la Figura 3 de la presente. De manera general, y para propó-sitos de la presente invención, la numeración de los aminoácidos en las proteasas corresponde a los números asignados a la secuencia de subtilisina del Ba ci l l u s amyl ol i qu efa ci ens madura, presentada en la Figura 1. "Subtilisina recombinante" o "proteasa recombinante" se refiere a una subtilisina o pxoteasa en la que la secuencia de DNA que codifica la subtilisina o la proteasa está modificada para producir una secuencia de DNA variante (o mutante) que codifica la substitución, deleción o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos que se presentan naturalmente. Los métodos adecuados para producir esa modificación, y que se pueden combinar con los que se describen en la presente, incluyen los descritos en la Patente Norteamericana RE 34,606, Patente Norteamericana No. 5,204,015 y Patente Norteamericana No. 5,185,258, Patente Norteamericana No. 5,700,676, Patente Norteamericana No. 5,801,038, y Patente Norteamericana No. 5,763,257. "las subtilisinas no humanas" y el DNA que las codifica-, se pueden obtener a partir de cualesquiera organismos • procariót i eos y eucarióticos. Los ejemplos adecuados de organismos procar i ó ti eos incluyen los organismos gram negativos tales como la E . Coli o Pseudomona s y bacterias gram positivas tales como Micrococcus o Bacillus . Ejemplos de organismos eucarióticos de los cuales se puede obtener la subtilisina y sus genes, incluyen la levadura tales como la Saccharomyces cerevi siae , hongos tales como el Aspergillus sp . - Una "variante de proteasa" tiene una secuencia de aminoácidos que se deriva de la secuencia de aminoácidos de una "proteasa precursora". Las proteasas precursoras incluyen las proteasas que se presentan naturalmente y las proteasas recombinantes. La secuencia de aminoácidos de la variante de proteasa se "deriva" de la secuencia de aminoácidos de la proteasa precursora, por la substitución, deleción o inserción de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos precursora. Esa modificación es de la "secuencia de DNA precursora" que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteasa precursora en vez que la manipulación de la enzima de la proteasa precursora, per s e . Métodos- adecuados para esa manipulación de la secuencia de DNA precursora, incluyen los métodos descritos en la presente, así como los métodos conocidos por los experimentados en la técnica (ver, por ejemplo, la EP 0 328299, la WO 89/06279 y las Patentes y Solicitudes Norteamericanas a las cuales ya se ha hecho referencia en la presente) . Las substituciones específicas que corresponden a la posición 103 en combinación con una o más de las substituciones siguientes y que corresponden a las posiciones 1, 3, 4, 8, , 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 27, 33, 37, 38, 42, 43, 48, 55, 57, 58, 61, 62, 68, 72, 75, 76, 77, 78, 79, 86, 87, 89, 97, 98, 99, 101, 102, 104, 106, 107, 109, 111, 114, 116, 117, 119, 121, 123, 126, 128, 130, 131 , 133, 134, 137, 140, 141, 142, 146, 147, 158, 159, 160, 166, 167, 170, 173, 174, 177, 181 , 182, 183, 184, 185, 188 , 192, 194, 198, 203, 204, 205, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 222, 224, 227, 228, 230, 232, 236, 237, 238, 240, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 265, 268, 269, 270, 271, 272, 274 y 275 de la subtilisina del Bacillus amyloliquefaciens, se identifican en la presente. Variantes preferidas son aquellas que tienen combinaciones de substituciones en posiciones de residuos que corresponden a las posiciones de la subtilisina del Bacillus amyloliquefaciens de la Tabla 1. Las variantes más preferidas son aquellas que tienen combinaciones de substituciones en las posiciones de residuos que corresponden a las posiciones de la subtilisina del Bacillus amyloliquefaciens de la Tabla 3. Variantes adicionalmente preferidas son aquellas que tienen combinaciones de substituciones en las posiciones de residuos que corresponden a las posiciones de la subtilisina del Bacillus amyl oliquefaci ens de la Tabla 2.

Estos números de posición de los aminoácidos se refieren a aquellos asignados a la secuencia de la subtilisina del Bacillus amyloliquefaciens madura, presentada en la Figura 1. Sin embargo, la invención no está limitada a la mutación de esta subtilisina particular sino que se extiende a las proteasas precursoras que contienen residuos de aminoácidos en las posiciones que son-"equivalentes" a los residuos particulares identificados en la subtilisina del Bacillus amyl oliquefaci ens . En una modalidad preferida de la presente invención, la proteasa precursora es la subtilisina del Bacillus lentus y las substituciones están hechas- en las posiciones equivalentes de residuos de aminoácidos, en el B. lentus, que corresponden a las listadas anteriormente . Una posición de residuo (de aminoácido) de una proteasa precursora es equivalente a un residuo de la subtilisina del Bacillus amyloliquefaci ens ya sea homologa (es decir que corresponda a la posición en cada estructura primaria o terciaria) o análoga a un residuo específico o porción de ese residuo en la subtilisina del Bacillus amyl olique aciens (es decir, que tenga una capacidad funcional igual o similar para combinar, reaccionar, o interactuar químicamente) . Para establecer homología con la estructura primaria, la secuencia de aminoácidos de una proteasa precursora se compara directamente con la secuencia primaria de la subtilisina del Bacillus amyloliquefaciens y particularmente con un conjunto de residuos conocidos por ser invariantes en las subtilisina para las cuales la secuencia es conocida. Por ejemplo, la Figura 2 de la presente muestra los residuos conservados como entre la subtilisina del B. amyl ol iquef aciens y la subtilisina del B. lentus. Después de alinear los residuos conservados, permitiendo las inserciones y deleciones necesarias para mantener la alineación (es decir, evitando la eliminación de los residuos conservados a través de la deleción e inserción arbitraria) , se definen los residuos equivalentes para aminoácidos particulares en la secuencia primaria de la subtilisina del Bacillus amyloliquef aciens . La alineación de los residuos conservados deberá conservar preferentemente el 100 % de esos residuos. Sin embargo, la alineación mayor que 75 % o tan pequeña como 50 % de los residuos conservados, es también adecuada para definir residuos equi alentes. Deberá mantenerse la conservación de la tríada catalítica Asp32 /Hi s 64 / S er221. Siezen et al. (1991) Protein Eng. , 4(7) :719-737 muestra la alineación de un gran número de proteasas de serina. Siezen et al se refiere al agrupamiento como subtilasas o proteasas de serina similares a la subtilisina. Por ejemplo, en la Figura 3, la secuencia de aminoácidos de la subtilisina del Bacillus amyloliquef aciens , Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis { carlsbergensi s ) y Bacilu s lentus , están alineadas para proporcionar la máxima cantidad de homología" entre las secuencias de aminoácidos. Una comparación de estas secuencias muestra que existe cierto número de residuos conservados y contenidos en cada secuencia. Estos residuos conservados (tal como entre BPN' y B. lent s) se identifican en la Figura 2. Estos residuos conservados pueden, por lo tanto, ser usados para definir los residuos de aminoácidos equivalentes, correspondientes, de la subtilisina del Bacillus amyfol iquefaci ens, en otras subtilisinas tales coma la subtilisina del Bacillus lentus (Publicación PCT No. WO89/06276 publicada el 13 de Julio de 1989) , la enzima precursora de proteasa preferida, de la presente, o la subtilisina a la que se hace referencia como PB92 (EP 0 328 299), que es grandemente homologa a la subtilisina del Bacillus lentus preferida. Las secuencias de aminoácidos de ciertas de estas subtilisinas están alineadas en las Figuras 3A y 3B con la secuencia de la subtilisina del Bacillus amyl oliquef aciens , para producir la máxima homo-logia de residuos conservados. Como puede observarse, existe cierto número de deleciones en la secuencia del Bacillus lentus, al compararse con la subtilisina del Bacillus amyloliquef aciens . De esta manera, por ejemplo, el aminoácido equivalente para la Vall65 en la subtilisina del Bacillus amyloliquefaci ens , en las otras subt:-lisinas , es la isoleucina para el B. lentus y B. licheniformis. , Los "residuos equi alentes" pueden ser definidos también determinando la homología en el nivel de la estructura terciaria para una proteasa precursora cuya estructura terciaria haya sido determinada por cristalografía de rayos X. Los residuos equivalentes se definen como aquellos para los cuales las coordenadas atómicas de dos o más de los átomos de la cadena principal, de un residuo de aminoácido particular, de la proteasa precursora y de la subtilisina del Bacillus amyloliquef aciens (N sobre N, CA sobre Ca, C sobre C y O sobre O) se encuentren dentro de 0.13 nm y preferentemente 0.1 nm después de la alineación. La alineación se consigue después de que el mejor modelo se ha orientado y ubicado para dar el máximo traslape de las coordenadas atómicas de los átomos de la proteína, que no sean hidrógeno, de la proteasa en cuestión para la subtilisina del Bacillus amyloliquef aciens . El mejor modelo es el modelo cristalográfico que proporciona el menor factor R para los datos de difracción experimentales, a la mayor resolución disponible.

Factor R = Sh\Fo(h)\-\Fc(h)\ t.\Fo(h)\ Los residuos equivalentes que son funcionalmente análogos a un residuo específico de la subtilisina del Bacillus amylol iquef aciens , están definidos como aquellos aminoácidos de la proteasa precursora que pueden adoptar una conformación tal que, o alteren, o modifiquen o contribuyan a, la estructura de la proteína, al enlazamiento al substrato o a la catálisis, en una manera definida y atribuida a un residuo específico de la subtilisina del Bacillus amyl oliquef aci ens . Además, son esos residuos de la proteasa precursora (para la que una estructura terciaria ha sido obtenida por cristalografía de rayos X) que ocupan una posición análoga al grado que, aunque los átomos de la cadena principal del residuo dado pueden no satisfacer los criterios de equivalencia en base a la ocupación de una posición homologa, las coordenadas atómicas de al menos dos de los átomos de la cadena lateral, del residuo, coinciden con 0.13 nm de los átomos de la cadena lateral, correspondientes, de la subtilisina del Bacillus amyloliquef aciens . Las coordenadas de la estructura tridimensional de la subtilisina del Bacillus amyloliquef aciens se presentan en la publicación EPO No. 0 251 446 (equivalente a la Patente No teamericana No. 5,182,204, la descripción de la cual se incorpora en la presente como referencia) y pueden usarse como se bosquejó anteriormente, para determinar los residuos equivalentes en el nivel de la estructura terciaria. Algunos de los residuos identificados para substitución son residuos conservados, mientras que otros no lo son. En el caso de residuos que no estén conservados, la substitución de uno o más aminoácidos está limitada a substituciones que producen una variante que tiene una secuencia de aminoácidos que no corresponde con una encontrada en la naturaleza. En el caso de residuos conservados, esas substituciones no darán por resultado una secuencia que se presente naturalmente. Las variantes de proteasa de la presente invención incluyen las formas maduras de las variantes de proteasa, así como las proformas y preproformas de esas variantes de proteasa. Las preproformas son la construcción preferida dado que esta facilita la expresión, secreción y maduración de las variantes de proteasa.

Prosecuencia' se ref i ere una secuencia de aminoácidos enlazados a la porción terminal N de la forma madura de una proteasa, que cuando se elimina, da por resultado la aparición de la forma "madura" de la proteasa. Muchas enzimas proteolíticas se encuentran en la naturaleza como productos proenzimát icos de traducción y, en la ausencia de un proceso posterior a la traducción, se expresan en esta manera. Una prosecuencia preferida para producir variantes de proteasa es la prosecuencia putativa de la subtilisina del Ba ci l l u s amyl ol i qu ef a ci ens , aunque se pueden usar otras prosecuencias de proteasa. Una "secuencia señal" o "presecuencia" se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos enlazada a la porción terminal N de una proteasa o de la porción terminal N de una proproteasa que pueda participar en la secreción de las formas maduras o proformas de la proteasa. Esta definición de secuencia señal es una definición funcional que pretende incluir todas aquellas secuencias de aminoácidos codificadas por la porción terminal N del gen de proteasa que participa para efectuar la secreción de la proteasa bajo condiciones nativas u originales. La presente invención utiliza esas secuencias para efectuar la secreción de las variantes de proteasa, tal como se definió en la presente. Una posible secuencia señal comprende los primeros siete residuos de aminoácidos de la secuencia señal de la subtilisina del Ba ci l l us s ub t i l i s r fusionada al resto de la secuencia señal de la subtilisina del Ba ci l l u s l en t u s (ATCC 21536) . Una "prepro" forma, de una variante de proteasa, consiste de la forma madura de la proteasa, que tiene una prosecuencia funcionalmente enlazada al término amino de la proteasa y una "pre" secuencia o secuencia "señal" enlazada funcionalmente al término amino de la prosecuencia. "Vector de expresión" se refiere a un constructo de DNA que contiene una secuencia de DNA que está enlazada funcionalmente a una secuencia control adecuada, capaz de efectuar la expresión de ese DNA en un huésped adecuado. Esas secuencias control incluyen un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar esa transcripción, una secuencia que codifica los sitios de enlazamiento y secuencias, del ribosoma de mRNA, adecuados, que controlan la terminación de la transcripción y traducción. El vector puede ser un plásmido, una partícula fago, o simplemente un inserto genómico potencial. Una vez transformado en un huésped adecuado, el vector se puede replicar y funcionar en forma independiente del genoma huésped, o puede, en algunos casos, integrarse dentro del genoma mismo. En la presente especificación "plásmido" y "vector" se usan a veces de manera intercambiable ya que el plásmido es la forma comúnmente más usada del vector, actualmente. Sin embargo, la invención pretende incluir esas formas de vectores de expresión que sirvan para funciones equivalentes y que sean, o lleguen a ser, conocidas en la técnica . Las "células huésped" usadas en la presente invención son generalmente huéspedes procar ió ti eos o eucar t ió t i eos que han sido preferentemente manipulados a través de métodos descritos en la Patente Norteamericana RE 34,606 para volverlos incapaces de secretar endoproteasa enzimáticamente activa. Una célula huésped preferida para expresar la proteasa es la cepa BG2036 de Bacillus que tenga deficiencia en proteasa neutra enzimáticamente activa y en proteína alcalina (subtilisina) . La construcción de la cepa BG2036 se describe con detalle en la Patente Norteame icana No. 5,264,366. Otras células huésped para expresar la proteasa incluyen el Bacillus subtilis 1168 (también descrito en la Patente Norteamericana RE 34,606 y en la Patente Norteamericana No. 5,264,366, la descripción de las cuales se incorpora en la presente como referencia), así como cualquier cepa de Bacillus adecuada tal como el B. licheniformis, B. lentus , etc. Las células huésped se transforman o transfectan con vectores construidos, usando técnicas de DNA recombinante. Esas células huésped transformadas son capaces, ya sea de replicar vectores que codifican las variantes de proteasa, o de expresar la variante de proteasa deseada. En el caso de vectores que codifiquen la preforma o preproforma de la variante de proteasa, esas variantes, cuando se expresan, se secretan típicamente de la célula huésped hacia el medio de la célula huésped. "Funcionalmente enlazadas", cuando se describe la relación entre dos regiones de DNA, simplemente significa que están relacionadas funcionalmente una con la otra. Por ejemplo, una presecuencia está enlazada funcionalmente a un péptido si funciona como una secuencia señal, participando en la secreción de la forma madura de la proteína involucrando más probablemente la ruptura de la secuencia señal. Un promotor está enlazado funcionalmente a una secuencia codificadora si controla la transcripción de la secuencia; un sitio de enlazamiento al ribosoma está enlazado funcionalmente a una secuencia codificadora si está ubicado de manera tal que permita la traducción. Los genes que codifican la proteasa precursora que se presenta naturalmente, se pueden obtener de acuerdo con métodos conocidos por los experimentados en la técnica. Los métodos generalmente comprenden sintetizar sondas marcadas que tengan secuencias putativas que codifiquen regiones de la proteasa de interés, preparar bibliotecas genómicas de organismos que expresen la proteasa, y clasificar selectivamente las bibliotecas para el gen de interés mediante la hibridación de las sondas. Los clones hibridados se mapean y secuencian posteriormente. La proteasa clonada se usa luego para transformar una célula huésped a fin de expresar la proteasa. El gen de proteasa se liga luego en un plásmido de alto número de copias. Esta plásmido se replica en huéspedes, en el sentido de que contiene los. elementos bien conocidos, necesarios para la replicación del plásmido: un promotor enlazado funcionalmente al gen en cuestión (que puede ser suministrado como el propio promotor homólogo del gen si es reconocido, es decir, transcrito, por el huésped), una terminación de la transcripción y una región de poliadenilación (necesaria para la estabilidad del mRNA transcrito por el huésped, del gen de proteasa, en ciertas células huésped eucarióticas que es exógena o es suministrada por la región terminadora endógena del gen de proteasa y, deseablemente, un gen de selección tal como un gen con resistencia a antibióticos, que permita la manutención continua del cultivo de las células huésped infectadas por el plásmido, mediante el crecimiento en medios que contengan ant iobió tico s . Los plásmidos con alto número de copias también contienen un origen de replicación para el huésped, permitiendo con ello que un gran número de plásmidos sea generado en el citoplasma sin limitaciones cromos ómi cas . Sin embargo, dentro del alcance de la presente invención se encuentra integrar múltiples copias del gen de proteasa en el genoma del huésped. Esto es facilitado por los organismos pro cari ó ticos y eucarióticos que son particularmente susceptibles a la recombinación homo loga. Los genes pueden ser un gen de B . l en t u s natural. Alternativamente, se puede producir un gen sintético que codifique una proteasa precursora mutante o que se presente naturalmente. En ese enfoque se determina la secuencia de DNA y/o aminoácidos, de la proteasa precursora. Posteriormente se sintetizan múltiples fragmentos de DNA, de una sola hebra, sintéticos, traslapantes, que con la hibridación y ligación producen un DNA sintético que codifica la proteasa precursora. Un ejemplo de construcción sintética de genes se presenta en el Ejemplo 3 de la Patente Norteamericana No. 5,204,015, la descripción de la cual se incorpora en la presente como referencia. Una vez que se ha clonado el gen de proteasa precursora, sintética, o que se presenta naturalmente, se lleva a cabo cierto número de modificaciones para mejorar el uso del gen más allá de la síntesis de la proteasa precursora que se presenta naturalmente. Esa modificaciones incluyen la producción de proteasas recombinantes tal como se describe en la Patente Norteamericana No. RE 34,606 y la Publicación EPO No. 0 251 446 y la producción de variantes de proteasa descritas en la presente. El siguiente ejemplo de mutagénesis de cassette, se puede usar para facilitar la construcción de las variantes de proteasa de la presente invención, aunque se pueden usar otros métodos. Primero se obtiene el gen que se presenta naturalmente y que codifica la proteasa, y se somete a secuenciación totalmente o en parte. Luego la secuencia se explora para un punto en el cual se desee realizar una mutación (deleción, inserción o substitución) de uno o más aminoácidos en la enzima codificada.

Las secuencias que flanqueen este punto se evalúan respecto a la presencia de los sitios de restricción para volver a colocar un corto segmento del gen con un estancamiento de oligonucleótidos que cuando se expresen codificarán varios mutantes. Esos sitios de restricción son preferentemente sitios únicos dentro del gen de proteasa, a fin de facilitar el reemplazo del segmento del gen. Sin embargo, se puede usar cualquier sitio de restricción que no sea demasiado redundante en el gen de proteasa, con la condición de que los fragmentos del gen, generados por la digestión de la restricción, puedan volverse a ensamblar en la secuencia apropiada. Si • los sitios de restricción no están presentes en sitios dentro de una distancia conveniente desde el punto seleccionado (de 10 a 15 nucleótidos), esos sitios se generan substituyendo nucleótidos en el gen, en una manera tal que ni el marco de lectura ni los aminoácidos codificados, sean cambiados en la construcción final. La mutación del gen, para cambiar su secuencia y adaptarse a la secuencia deseada, se logra por la extensión del cebador M13, de conformidad con métodos, en general conocidos. La tarea de localizar regiones de flanco adecuadas y de evaluar los cambios necesarios para llegar a dos secuencias de sitios de restricción convenientes, se hace rutina por la redundancia del código genético, un mapa de enzimas de restricción, del gen, y el gran número de diferentes enzimas de restricción. Obsérvese que si se encuentra disponible un sitio de restricción de flanco, conveniente, el método anterior necesita usarse únicamente con xelación a la región de flanco que no contenga un sitio. Una vez que se clona el DNA sintético o el DNA que se presenta naturalmente, los sitios de restricción que flanquean las posiciones que se van a mutar, son digeridos con las enzimas de restricción innatas, y una pluralidad de cassettes de oligonucleótidos complementarios, de los términos extremos, se ligan en el gen. La mutagénesis se simplifica por este método, debido a que todos los oligonucleótidos se pueden sintetizar de manera que tengan los mismos sitios de restricción, y no son necesarios enlazantes sintéticos, para crear los sitios de restricción.

Como se usa en la presente, se define actividad proteolítica como la velocidad de hidrólisis de los enlaces peptídicos por miligramo de enzima activa. Existen muchos procedimientos bien conocidos para medir la actividad proteolítica (K. M. Kalisz. "Microbial Proteinases . " Advances in Biochemi cal Engineering/Biotechnology , A. Fiechter ed., 1988) .Además de, o como una alternativa a, la actividad proteolítica modificada, las enzimas variantes de la presente invención pueden tener otras propiedades modificadas tales como Km, Kc t, relación Kcat/Km y/o la especificidad por el substrato modificada y/o el perfil de actividad en el pH, modificado. Estas enzimas se pueden producir para el substrato particular que se anticipe que estará presente, por ejemplo, en la preparación de péptidos o para procesos hidrolíticos tales como usos en lavandería. En un aspecto de la invención, el objetivo es asegurar una variante de proteasa que tenga un rendimiento de lavado alterado, preferentemente mejorado, comparada con una proteasa precursora, al menos en una formulación de detergente y bajo al menos un conjunto de condiciones de lavado. Existe una variedad de condiciones de lavado, que incluyen formulaciones de detergentes variables, el volumen del agua de lavado, la temperatura del agua de lavado y el tiempo de lavado, a las cuales puede estar expuesta una variante de proteasa. Por ejemplo, las formulaciones de detergentes usadas en diferentes áreas, tienen diferentes concentraciones de sus componentes relevantes que se encuentran presentes en el agua de lavado. Por ejemplo, un detergente Europeo tiene típicamente de aproximadamente 4,500 a 5,000 ppm de componentes detergentes, en el agua de lavado, mientras que un • detergente Japonés típicamente tiene aproximadamente 667 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. En Norteamérica, particularmente en los Estados Unidos, un detergente tiene típicamente aproximadamente 975 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado. Un sistema de baja concentración incluye detergentes en donde menos de aproximadamente 800 ppm de los componentes detergentes estén presentes en el agua de lavado. Los detergentes Japoneses se consideran típicamente como un sistema de baja concentración de detergente ya que tienen aproximadamente 667 ppiti de componentes detergentes presentes en el agua de lavado. Un sistema de concentración media de detergente incluye detergentes en donde entre aproximadamente 800 ppm y 2,000 pppi de componentes detergentes se encuentran presentes en el agua de lavado. Los detergentes Norteamericanos se consideran generalmente sistemas de detergentes de concentración media ya que tienen aproximadamente 975 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado. Los sistemas en Brasil tienen típicamente aproximadamente 1,500 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado . Un sistema de alta concentración de detergente incluye los detergentes en donde más de aproximadamente 2,000 ppm de los componentes detergentes se encuentran presentes en el agua de lavado. Los detergentes Europeos se consideran generalmente como sistemas de alta concentración de detergentes ya que tienen aproximadamente de 4,500 a 5,000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. Los detergentes de Latinoamérica son generalmente detergentes con aditivos de fosfatos, que producen mucha espuma, y el intervalo de detergentes usados en Latinoamérica puede caer en las concentraciones de detergentes tanto media como alta, ya que varían desde 1,500 hasta 6,000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. Como se mencionó anteriormente, Brasil tiene típicamente aproximadamente 1,500 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado. Sin embargo, otras geografías con detergentes que tienen aditivos de fosfato, de mucha espuma, no limitadas a otros países de Latinoamérica, pueden tener sistemas de alta concentración de detergentes de hasta aproximadamente 6,000 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado. En vista a lo precedente, es evidente que las concentraciones de las composiciones detergentes en las soluciones de lavado típicas, a través del mundo, varían desde menos de aproximadamente 800 ppm de composición detergente ("geografías con baja concentración de detergente"), por ejemplo de aproximadamente 667 ppm en Japón, hasta aproximadamente entre 800 ppm y aproximadamente 2,000 ppm ("geografías con concentraciones medias de detergentes") , por ejemplo de aproximadamente 975 ppm en los Estados Unidos y aproximadamente 1,500 ppm en Brasil, hasta más de aproximadamente 2,000 ppm ("geografías con alta concentración de detergentes"), por ejemplo de aproximadamente 4,500 ppm hasta aproximadamente 5,000 ppm en Europa y aproximadamente 6,000 ppm en geografías con aditivos de fosfato con mucha espuma. Las concentraciones de las soluciones de lavado típicas se determinan empíricamente. Por ejemplo, en los Estados- Unidos, una máquina lavadora típica contiene un volumen de aproximadamente 64.4 litros de solución de lavado. Por consiguiente, para obtener una concentración de aproximadamente 975 ppm de detergente, dentro de la solución de lavado, deben adicionarse aproximadamente 62.79 g de composición detergente a los 64.4 litros de solución de lavado. Esta cantidad es la cantidad típica medida en el agua de lavado por el consumidor que usa la copa medidora proporcionada con el detergente. Como un ejemplo adicional, diferentes geografías usan diferentes temperaturas de lavado. La temperatura del agua de lavado en Japón es típicamente menor que la que se usa en Europa . Por consiguiente, un aspecto de la presente invención incluye una variante de proteasa que muestre características de lavado mejoradas en al menos un conjunto de condiciones de lavado . En otro aspecto de la invención, se ha determinado que las substituciones en una posición que corresponda a 103 en combinación con una o más substituciones seleccionadas del grupo que consiste de las posiciones que corresponden a 1, 3, 4, 8, 10, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 27, 33, 37, 38, 42, 43, 48, 55, 57, 58, 61, 62, 68, 72, 75, 76, 77, 78, 79, 86, 87, 89, 97, 98, 99 , 101, 102, 104, 106, 107, 109, 111, 114, 116, 117, 119, 121, 123, 126, 128, 130, 131, 133, 134, 137, 140, 141, 142, 146, 147, 158, 159, 160, 166, 167, 170, 173, 174, 177, 181, 182, 183, 184, 185, 188, 1 19922,, 119944,, 119988,, 203, 204, 205, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 222, 224, 227, 228, 230, 232, 236, 237, 238, 240, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, -261, 262, 263, 265, 268, 269, 270, 271, 272, 274 y 275 de la subtilisina del Bacillus amyloliquef aciens , son importantes en mejorar las características de lavado, de la enzima. Estas substituciones se realizan preferentemente en la subtilisina del Bacillus lentus (recombinante o del tipo nativo), aunque las substituciones se pueden realizar en cualquier proteasa de Bacillus. En base a los resultados de clasificación selectiva obtenidos con las proteasas variantes, las mutaciones observadas en la subtilisina de Bacillus amyl oliquef aciens , son importantes para la actividad proteolítica, para las características y/o estabilidad de esas enzimas y las características de limpieza o de lavado, de esas variantes de enzimas. Muchas de estas variantes de proteasa de la invención son útiles en la formulación de varias composiciones detergentes o de formulaciones para el cuidado personal, tales como champús o lociones. Cierto número de compuestos conocidos son agentes tensioacti os útiles y adecuados en composiciones que comprenden los mutantes de proteasa de la invención. Estos incluyen los detergentes no iónicos, aniónicos, catiónicos o de iones anfotéricos como se describe en la Patente Norteamericana No. 4,404,128 expedida a Barry J. Anderson y la Patente Norteamericana No. 4,261,868 expedida a Jiri Flora, et al. Una formulación detergente adecuada es la que se describe en el Ejemplo 7 de la Patente Norteamericana No. 5,204,015 (previamente incorporada como referencia) . La técnica es familiar a las diferentes formulaciones que se puedan usar como composiciones de limpieza. Además de las composiciones de limpieza típicas se comprende fácilmente que las variantes de proteasa de la presente invención pueden ser usadas para cualquier propósito para el que se usan las proteasas nativas o de tipo salvaje. De esta manera, estas variantes se pueden usar, por ejemplo, en aplicaciones de jabón en barra o líquido, formulaciones para la limpieza de platos, soluciones o productos de limpieza de lentes de contacto, hidrólisis de péptidos, tratamiento de deshechos, aplicaciones e productos textiles, como enzimas de ruptura po fusión en la producción de proteínas, etc. La variantes de la presente invención puede comprender características mejoradas, en algun composición detergente (si se compara con la precursoras) . Como se usa en la presente, rendimiento mejorado en un detergente se defin como el incremento en la limpieza, de cierta tintas sensibles a enzimas tales como pasto sangre, tal como se determina por la evaluació usual después del ciclo de lavado estándar. Las proteasas de la invención se puede formular en detergentes líquidos y en polv conocidos, que tengan un pH entre 6.5 y 12.0 niveles de aproximadame te 0.01 hast aproximadamente 5 % (preferentemente de 0.1 % 0.5 % ) en peso. Estas composiciones de detergentes de limpieza pueden incluir tambié otras enzimas tales como las proteasas, amilasas, celulosas, lipasas o endoglicosidasas , conocidas, así como aditivos y estabilizantes. La adición de proteasas de la invención, a las composiciones de limpieza convencionales, no crea ninguna limitación especial en el uso. En otras palabras, cualquier temperatura y pH adecuados para el detergente son también adecuados para las composiciones de la presente, siempre y cuando el pH se mantenga dentro del intervalo anterior, y siempre y cuando la temperatura esté por debajo de la temperatura de desnaturalización de las proteasas, descritas. Además, las proteasas de la invención se pueden usar en una composición de limpieza sin detergentes, nuevamente, ya sea solas o en combinación con aditivos y estabilizantes . La presente invención se refiere también a composiciones de limpieza que contienen las variantes de proteasa de la invención. Las composiciones de limpieza pueden contener además aditivos que se usen comúnmente en composiciones de limpieza. Estos pueden seleccionarse de, aunque no limitarse a, blanqueadores, agentes tensioactivos, aditivos, enzimas y catalizadores de blanqueado. A una persona de experiencia ordinaria en la técnica se pondrá de manifiesto qué aditivos serán adecuados para incluirlos en las composiciones.

La lista proporcionada en la presente no pretende ser exhaustiva y deberá considerarse como ejemplos de aditivos adecuados. También se pondrá de manifiesto para una persona de experiencia ordinaria en la técnica, usar únicamente aquellos aditivos que sean compatibles con las enzimas y otros componentes que se encuentren en la composición, por ejemplo, el agente tensioactivo. Cuando se encuentre presente, la cantidad de aditivo presente en las composiciones de limpieza es desde aproximadamente 0.01 % hasta aproximadamente 99.9 %, preferentemente desde aproximadamente 1 % hasta aproximadamente -95 % , en forma más preferente desde aproximadamente 1 % hasta aproximadamente 80 %. Las proteasas variantes de la presente invención se pueden incluir en alimentos para animales, como parte de los aditivos del alimento para animales, como se describe por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 5,612,055; Patente Norteamericana No. 5,314,692; y Patente Norteamericana No. 5,147,642. Un aspecto de la invención es una composición para el tratamiento de un producto textil, que incluye las variantes de la presente invención. La composición se puede usar para tratar, por ejemplo, seda o lana, tal como se describe en publicaciones tales como la RD 216,034; EP 134,267, US 4,533,359; y EP 344,259. Lo siguiente se presenta a manera de ejemplo y no se pretende que limite el alcance de las reivindicaciones. Todas las publicaciones y patentes a las que se ha hecho referencia, se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

Ej e pl o 1 Se produjo un gran número de variantes de proteasa y se purificaron usando métodos bien conocidos en la técnica. Todas las mutaciones fueron hechas en la subtilisina del B a ci l l u s l en t u s GG36. Las variantes se presentan en la Tabla 3.

Ej empl o 2 Se analizó un gran número de variantes de proteasa, producidas en el Ejemplo 1, respecto a sus características de funcionamiento en dos tipos de detergentes y condiciones de lavado, usando un ensayo de mi cromues t ras de telas, descrito en "un método mejorado para ensayar una enzima preferida y/o una composición detergente preferida", Patente Norteamericana con No. de Serie 60/068,796. La Tabla 4 lista las variantes de proteasas sometidas a ensayo y los resultados del análisis en dos detergentes diferentes. Para la columna A, el detergente fue Ariel Ultra, filtrado, de 0.67 g/1 (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, Estados Unidos de América), y una solución que contenía 3 granos 3.785 litros (un galón) de dureza de Ca2+/Mg2+ mezclados, y se usaron 0.3 ppm de enzimas en cada pozo, a 20 °C. Para la columna B, el detergente fue Ariel Futur, filtrado, de 3.38 g/1 (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, Estados Unidos de América), en una solución que contenía 15 granos por 3.785 litros (un galón) de dureza de Ca+/Mg2+ mezclados, y se usaron 0.3 ppm de enzimas en cada pozo a 40 °C.

Ejemplo 3 La Tabla 5 lista las variantes de proteasas ensayadas, del Ejemplo 1, y los resultados del análisis en cuatro detergentes diferentes. Los mismos análisis de características de funcionamiento, que para el Ejemplo 2, fueron realizados en las variantes de proteasas mencionadas, con los siguientes detergentes. Para la columna A, el detergente fue Ariel Ultra (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, Estados Unidos de América) filtrado, a 0.67 g/1, en una solución que contenía una dureza de 3 granos 3.785 litros (un galón) de Ca2+/Mg2+ mezclados, y se usaron 0.3 ppm de enzimas en cada pozo, a 20 °C. Para la columna B, el detergente fue Ariel Futur (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, Estados Unidos de América) filtrado, a 3.38 g/1, en una solución que contenía 15 granos 3.785 litros (un galón) de Ca2+/Mg2+ mezclados, y se usaron 0.3 ppm de enzimas en cada pozo, a 40 °C. Para la columna C, el detergente fue el HSP1 (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, Estados Unidos de América) a 3.5 g/1, en una solución que contenía una dureza de 8 granos 3.785 litros (un galón) de Ca2+/Mg2+ mezclados, y se usaron 0.3 ppm de enzimas en cada pozo a 20 °C. Para la columna D, el detergente fue el Tide KT (Procter & Gamble, Cíncinnati, OH, Estados Unidos de América) a 1.5 g/1, en una solución que contenía una dureza de 3 granos 3.785 litros (un galón) de Ca2+/Mg2+ mezclados, y se usaron 0.3 ppm de enzimas en cada pozo, a 20 °C.

H O ro Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se re fier e . Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Una variante de proteasa caracterizada porque comprende substituir un aminoácido en una posición de residuo que corresponda a la posición 103 y en una o más de las posiciones 236 y 245 de la subtilisina del Ba ci l l us amyl ol i qu ef a ci ens y substituir uno o más aminoácidos en posiciones de residuos seleccionadas del grupo que consiste de las posiciones de residuos que corresponden a las posiciones 1, 3, 4, 8, 10, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 27, 33, 37, 38, 42, 43, 48, 55, 57, 58, 61, 62, 68, 72, 75, 76, 77, 78, 79, 86, 87, 89, 97, 98, 99, 101,- 102, 104, 106, 107, 109, 111, 114, 116, 117, 119, 121, 123, 126, 128, 130, 131, 133, 134, 137, 140, 141, 142, 146, 147, 158, 159, 160, 166, 167, 170, 173, 174, 177, 181, 182, 183, 184, 185, 188, 192, 194, 198, 203, 204, 205, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 222, 224, 227, 228, 230, 232, 237, 238, 240, 242, 243, 244, 246, 247, 248, 249, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 265, 268, 269, 270, 271, 272, 274 y 275 de la subtilisina del Bacillus amyloliquef aciens ; en donde cuando una substitución en una posición que corresponde a la posición de residuo 103 se combina con una substitución en una posición que corresponde a la posición de residuo 76, existe también una substitución en una o más posiciones de residuos diferentes de las posiciones de residuos que corresponden a las posiciones 27, 99, 101, 104, 107, 109, 123, 128, 166, 204, 206, 210, 216, 217, 218, 222, 260, 265, o 274 de la subtilisina del Bacillus amyl oliquef aci ens .

2. La variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque incluye las substituciones de los residuos de aminoácidos en las posiciones 103 y 236 y en una o más de las posiciones 1, 9, 12, 61, 62, 68, 76, 97, 98, 101, 102, 104, 109, 130, 131, 159, 183, 185, 205, 209, 210, 211, 212, 213, 215, 217, 230, 232, 248, 252, 257, 260, 270 y 275.

3. La variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque incluye las substituciones de los residuos de aminoácidos en las posiciones 103 y 245 y en una o más de las posiciones 1, 9, 12, 61, 62, 68, 76, 97, 98, 101, 102, 104, 109, 130, 131, 159, 170, 183, 185, 205, 209, 210, 211, 212, 213, 215, 217, 222, 230, 232, 248, 252, 257, 260, 261, 270 y 275.

4. La variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque incluye las substituciones de los residuos de aminoácidos en las posiciones 103, 236 y 245 y en una o más de las posiciones 1, 9, 12, 61, 62, 68, 76, 97, 98, 101, 102, 104, 109, 130, 131, 159, 183, 185, 205, 209, 210, 211, 212, 213, 215, 217, 230, 232, 243, 248, 252, 257, 260, 270 y 275.

5. La variante de proteasa de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, caracterizada porque incluye una substitución de residuo de aminoácido en la posición 159.

6. La variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se deriva de la subtilisina de un Bacillus.

1. La variante de proteasa de conformidad con la rei indicación 6, caracterizada porque se deriva de la subtilisina del Bacillus lentus.

8. Un DNA, caracterizado porque codifica una variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 1.

9. Un vector de expresión, caracterizado porque codifica el DNA de conformidad con la reivindicación 8.

10. Una célula huésped, caracterizada porque es transformada con el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 9.

11. Una composición de limpieza, caracterizada porque comprende la variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 1.

12. Un alimento para animales, caracterizado porque comprende la proteasa de conformidad con la reivindicación 1.

13. Una composición para tratar un producto textil, caracterizada porque comprende la variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 1.

14. La variante de proteasa, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende un conjunto de substituciones seleccionado del grupo que consiste de posiciones de residuos que corresponden a las posiciones de la Tabla 1 de la subtilisina del Bacill us amyl ol i quef a ci ens .

15. La variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque comprende un conjunto de substituciones seleccionado del grupo que consiste de las posiciones de residuos que corresponden a las posiciones de la Tabla 3 de la subtilisina del Ba cill u s amyl ol i quefa ci ens .

16. La variante de proteasa de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque comprende un conjunto de substituciones seleccionado del grupo que consiste de las posiciones de residuos que corresponden a las posiciones de la Tabla 2 de la subtilisina del Bacillus amyloliquef aciens .