ES2333789T3 - Procedimiento de cribado de mutagenesis de alta productividad. - Google Patents
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Abstract
Variante de cutinasa que comprende una sustitución de uno o más aminoácidos en posiciones de residuo que corresponden a los sitios 34, 73, 75, 77, 78, 79, 80, 99, 164, 191-196, 219, 223 y 225 de cutinasa de Pseudomonas mendocina ID SEC Nº: 2, en la que dicha variante de cutinasa es termoestable y tiene actividad hidrolítica sobre poliéster.
Description
Procedimiento de cribado de mutagénesis de alta
productividad.
La invención proporciona variantes de cutinasa
que proporcionan estabilidad y actividad mejoradas en comparación
con la cutinasa de tipo salvaje.
Se usan varios procedimientos de mutagénesis en
la modificación de proteínas para obtener proteínas con propiedades
y/o capacidades deseadas. En la mayoría de estos procedimientos, se
muta la secuencia de nucleótidos de un gen clonado que codifica una
proteína y se expresa el gen modificado para producir mutantes, que
a continuación se someten normalmente a cribado para actividades de
interés. A continuación, las actividades de las proteínas mutantes
se comparan habitualmente con las de proteínas de tipo salvaje.
En la técnica se conoce una serie de
procedimientos de mutagénesis. Un procedimiento general implica
mutagénesis de saturación de sitios, que produce una población de
genes mutados que consiste en genes por lo demás idénticos, pero
incluye codones introducidos aleatoriamente. El codón introducido
aleatoriamente puede codificar para cualquier aminoácido, y se dice
que la posición está "saturada" (Airaksinen y Hovi, Nucleic
Acids. Res. 26:576-581[1998]). Existen
varios procedimientos diferentes de saturación de sitios conocidos
en la técnica.
Como la mayoría de los procedimientos de
mutagénesis proporcionan un gran número de opciones de mutación de
aminoácidos, generalmente se requiere el cribado de un gran número
de variantes para producir una propiedad de proteína deseada.
Generalmente, el cribado se repite múltiples veces con el fin de
producir una variante beneficiosa de interés. Así, existe una
necesidad continuada en la técnica de procedimientos de mutagénesis
y cribado que proporcionen facilidad de uso relativa así como que
sean eficaces en términos de protocolos y análisis de datos, con el
fin de obtener resultados de ingeniería de proteínas.
El documento EP-0.268.452
describe una cutinasa P. putida ATCC53552, actualmente
clasificada como P. mendocina.
La presente solicitud describe procedimientos de
mutagénesis para ingeniería de proteínas. En particular, la
presente solicitud describe procedimientos de mutagénesis que
incluyen ajuste de realimentación a partir de evaluación
sistemática de los resultados. Más específicamente, la solicitud
describe procedimientos de mutagénesis de saturación de sitios que
criban variantes con una o más propiedades deseables de proteínas y
evalúa los resultados del cribado para proporcionar realimentación
para repetir el cribado y la construcción de nuevas genotecas. La
invención proporciona variantes de cutinasa que proporcionan
estabilidad y actividad mejoradas en comparación con la cutinasa de
tipo salvaje.
Los procedimientos de cribado de mutagénesis de
alta productividad seleccionan sitios para barrido de saturación
que usan consideraciones estructurales de las proteínas. En
realizaciones preferidas, se crean genotecas de saturación de
sitios y se criban usando ensayos seleccionados para identificar
clones que tengan propiedades de proteínas de interés. Los sitios
de mutación se categorizan basándose en sus propiedades de interés,
y se identifican tendencias, si existieran. Se selecciona un
variante o múltiples variantes que tengan al menos una propiedad
deseada para procedimientos de creación de genotecas adicionales.
Estas genotecas adicionales se crean usando realimentación a partir
de las categorías determinadas. Un conjunto de genotecas adicionales
repite la construcción de las genotecas anteriores usando la
realimentación. Un segundo conjunto de genotecas adicionales
representa nuevas genotecas creadas en sitios de los que se espera
que sean beneficiosos basándose en la realimentación. En algunas
realizaciones estas categorías se codifican (es decir, usando color
u otros indicios), para permitir una fácil identificación de
tendencias.
La presente invención proporciona numerosas
variantes de cutinasa. Estas variantes comprenden una sustitución
de uno o más aminoácidos en posiciones de residuo correspondientes a
sitios 34, 73, 75, 77, 78, 79, 80, 99, 164,
191-196, 219, 223 y 225 de cutinasa de
Pseudomonas mendocina ID SEC Nº: 2, en la que dicha variante
de cutinasa es termoestable y tiene actividad hidrolítica sobre
poliéster. En algunas realizaciones preferidas especialmente, las
variantes proporcionan actividad mejorada en diversas condiciones
y/o estabilidad mejorada en comparación con la cutinasa de tipo
salvaje. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona
variantes de cutinasa de cutinasa de Pseudomonas mendocina
ID SEC Nº: 2, en la que las variantes comprenden sustitución de Phe
194 por Pro, sustitución de Ser 219 por Gly, y una o más
sustituciones adicionales en al menos una posición de aminoácido
seleccionada entre las posiciones de aminoácidos 54, 78, 81, 191,
196, 200, 204 y 263.
En algunas realizaciones, las variantes tienen
posición de aminoácido 54 sustituida por Ser, Glu o Thr. En otras
realizaciones, la posición de aminoácido 78 está sustituida por Val.
En realizaciones adicionales, la posición de aminoácido 81 está
sustituida por Ser. En aún más realizaciones adicionales, la
posición de aminoácido 191 está sustituida por Asn o His. En otras
realizaciones, la posición de aminoácido 196 está sustituida por
Leu o Ala. En realizaciones adicionales, la posición de aminoácido
200 está sustituida por Leu. En otras realizaciones adicionales, la
posición de aminoácido 204 está sustituida por Leu. En realizaciones
adicionales, la posición de aminoácido 263 está sustituida por
Pro.
La presente invención proporciona también
variantes de cutinasa que comprenden una sustitución de uno o más
aminoácidos en posiciones de residuo que corresponden a los sitios
34, 73, 75, 77, 78, 79, 80, 99, 164, 191-196, 219,
223 y 225 de cutinasa de Pseudomonas mendocina ID SEC Nº: 2,
en las que las variantes de cutinasa tienen actividad de
poliesterasa. En algunas realizaciones, las variantes de cutinasa
comprenden la sustitución de GLY 73 por un aminoácido seleccionado
entre el grupo que consiste en Phe, Lys, Leu y Val, y en las que la
variante de cutinasa tiene estabilidad incrementada en comparación
con cutinasa de tipo salvaje. En otras realizaciones, la variante
de cutinasa comprende la sustitución de Thr 191 por un aminoácido
seleccionado entre el grupo que consiste en His, Leu y Tyr, y en la
que la variante de cutinasa tiene estabilidad incrementada en
comparación con cutinasa de tipo salvaje. En realizaciones
alternativas, la variante de cutinasa comprende la sustitución de
Thr 78 por un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en
Ala, Leu y Val, y en la que la variante de cutinasa tiene
estabilidad incrementada en comparación con cutinasa de tipo
salvaje. En algunas realizaciones, la variante de cutinasa
comprende la sustitución de Tyr 164 por Phe, y en la que la
variante de cutinasa tiene estabilidad incrementada en comparación
con cutinasa de tipo salvaje. En otras realizaciones más, la
variante de cutinasa comprende la sustitución de Tyr 196 por un
aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Ala, Leu y
Pro, y en la que la variante de cutinasa tiene estabilidad
incrementada en comparación con cutinasa de tipo salvaje. En otras
realizaciones adicionales, la variante de cutinasa comprende la
sustitución de Phe 194 y la sustitución de Ser 219, y en la que la
variante de cutinasa tiene estabilidad incrementada en comparación
con cutinasa de tipo salvaje. En realizaciones adicionales, Phe en
posición 194 se sustituye por un aminoácido seleccionado entre el
grupo que consiste en Ala, His, Lys, Leu, Asn, Pro y Gly, y en que
Ser 219 se sustituye por Gly. En algunas realizaciones preferidas
especialmente, la variante de cutinasa tiene actividad incrementada
de poliesterasa en comparación con cutinasa de tipo salvaje. En
algunas realizaciones, la variante de cutinasa comprende la
sustitución de Ala 80 por Glu, y en la que la variante de cutinasa
tiene estabilidad incrementada en comparación con cutinasa de tipo
salvaje. En realizaciones adicionales preferidas, la variante de
cutinasa comprende la sustitución de Phe 194 por Ile, y la variante
de cutinasa tiene actividad incrementada de poliesterasa en
comparación con cutinasa de tipo salvaje. En otras realizaciones
adicionales, la variante de cutinasa comprende la sustitución de Phe
194 por un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en
Lys y Leu, y la sustitución de Ser 219 por Gly, y la variante de
cutinasa tiene actividad incrementada de poliesterasa en
comparación con cutinasa de tipo salvaje. En otras realizaciones
más, la variante de cutinasa comprende la sustitución de Phe 194
por Asn, y en la que la variante de cutinasa tiene actividad
incrementada de poliesterasa en comparación con cutinasa de tipo
salvaje. En realizaciones adicionales, la variante de cutinasa
comprende la sustitución de Phe 194 por un aminoácido seleccionado
entre el grupo que consiste en Asn, Pro y Ser, y la sustitución de
Ser 205 por Gly, y en la que la variante de cutinasa tiene
actividad incrementada de poliesterasa en comparación con cutinasa
de tipo salvaje. En otras realizaciones adicionales, la variante de
cutinasa comprende la sustitución de Gly 73 por un aminoácido
seleccionado entre el grupo que consiste en Phe y Leu, y en la que
la variante de cutinasa tiene actividad incrementada de poliesterasa
en comparación con cutinasa de tipo salvaje. En realizaciones
adicionales, la variante de cutinasa comprende la sustitución de
Gly 75 por un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en
Asp y Glu, y en la que la variante de cutinasa tiene actividad
incrementada de poliesterasa en comparación con cutinasa de tipo
salvaje. En algunas realizaciones, la variante comprende las
siguientes sustituciones Ile 192 por Met; Phe 194 por Val; y Ser
219 por Gly. En realizaciones preferidas especialmente, estas
variantes de cutinasa tienen actividad incrementada de poliesterasa
en comparación con cutinasa de tipo salvaje.
En una realización adicional más, la variante de
cutinasa comprende la sustitución de Ser 219 por Asn, y la
sustitución de Phe 221 por Leu, y tiene actividad incrementada de
poliesterasa en comparación con cutinasa de tipo salvaje.
En realizaciones adicionales, la variante de
cutinasa comprende la sustitución de Ser 99 por Lys, y tiene
actividad incrementada de poliesterasa en comparación con cutinasa
de tipo salvaje. En realizaciones adicionales, la variante de
cutinasa comprende la sustitución de Thr 191 por un aminoácido
seleccionado entre el grupo que consiste en His, Leu y Tyr, y tiene
actividad incrementada de poliesterasa en comparación con cutinasa
de tipo salvaje. En realizaciones alternativas, la variante de
cutinasa comprende la sustitución de Thr 78 por Leu, y tiene
actividad incrementada de poliesterasa en comparación con cutinasa
de tipo salvaje. En realizaciones adicionales, la variante de
cutinasa comprende la sustitución de Tyr 196 por un aminoácido
seleccionado entre el grupo que consiste en Ala y Pro, y tiene
actividad incrementada de poliesterasa en comparación con cutinasa
de tipo salvaje. En algunas realizaciones, la variante de cutinasa
comprende la sustitución de Phe 1941 por un aminoácido seleccionado
entre el grupo que consiste en Ile, Leu, Asn y Pro, y tiene
estabilidad incrementada en comparación con cutinasa de tipo
salvaje. En otras realizaciones, la variante de cutinasa comprende
la sustitución de Arg 204 por Leu, y tiene estabilidad incrementada
en comparación con cutinasa de tipo salvaje. En realizaciones
adicionales, la variante de cutinasa comprende la sustitución de Arg
204 por Leu, y tiene actividad incrementada de poliesterasa en
comparación con cutinasa de tipo salvaje. En otras realizaciones
adicionales, la variante de cutinasa comprende la sustitución de Leu
263 por Pro, y tiene estabilidad incrementada en comparación con
cutinasa de tipo salvaje. En otras realizaciones, la variante de
cutinasa comprende la sustitución de Leu 263 por Pro, y tiene
actividad incrementada de poliesterasa en comparación con cutinasa
de tipo salvaje. En algunas realizaciones, las mutaciones descritas
anteriormente están presentes en combinación, mientras que en otras
realizaciones, están presentes como mutaciones únicas.
\newpage
La presente invención proporciona además
variantes de cutinasa que comprenden una sustitución de uno o más
aminoácidos en posiciones de residuo correspondientes a sitios 34,
73, 75, 77, 78, 79, 80, 99, 164, 191-196, 219, 223
y 225 de cutinasa de Pseudomonas mendocina ID SEC Nº: 2, en
la que la variante de cutinasa es termoestable y tiene actividad
hidrolítica sobre poliéster.
La presente solicitud describe también
procedimientos para obtener una variante que tenga una o más
propiedades deseadas de proteínas que comprende las etapas de:
selección de sitios de aminoácidos en una proteína para mutación;
realización de mutagénesis en los sitios de mutación seleccionados
para crear una genoteca; cribado de la genoteca para variantes que
tienen una o más propiedades deseadas de proteínas; calificación de
los sitios de mutación de las variantes para la una o más
propiedades deseadas de proteínas; selección de una o más variantes
que tienen una calidad deseable como plantilla para, con
realimentación desde la calificación, creación y cribado de
genotecas adicionales, en la que el procedimiento usa mutaciones
cooperativas para obtener una variante que tenga al menos dos
mutaciones. En algunas realizaciones, la etapa de mutagénesis se
realiza mediante mutagénesis de saturación de sitios y en la que la
selección de sitios de aminoácidos se realiza usando
consideraciones estructurales de proteínas. En realizaciones
adicionales, las etapas de creación y cribado de genotecas
adicionales se realizan repitiendo mutagénesis de saturación de
sitios en sitios de mutación que tienen calidades deseables y
realización de mutagénesis de saturación de sitios en nuevos sitios
en nuevas genotecas. En realizaciones adicionales, la etapa de
realización de saturación de sitios repetidas se realiza
seleccionando sitios situados cerca de sitios de mutación que tengan
calidades deseables. En otras realizaciones adicionales, las
consideraciones estructurales de proteínas comprenden factores como
la posición del sitio de unión, la estructura tridimensional, la
secuencia de aminoácidos, la naturaleza de la reacción química o la
naturaleza de la unión química. En algunas realizaciones preferidas,
la propiedad de proteínas comprende una propiedad de enzimas. En
algunas realizaciones preferidas especialmente, la propiedad de
enzimas comprende al menos una propiedad seleccionada entre el
grupo que consiste en catálisis, unión y estabilidad. En
realizaciones alternativas, la etapa de cribado para una o más
variantes se realiza seleccionando y realizando ensayos para la una
o más propiedades de proteínas de interés. En otras realizaciones
más, la calificación se realiza por identificación de tendencias.
En algunas realizaciones preferidas, la etapa de identificación de
tendencias se realiza representando gráficamente una distribución
espacial de sitios de calidad en una representación tridimensional
de la proteína. En algunas realizaciones adicionales preferidas, la
etapa de identificación de tendencias se realiza representando
gráficamente identidades de mutación de aminoácidos. En otras
realizaciones más, la etapa de identificación de tendencias se
realiza representando gráficamente una distribución de sitios de
mutación de calidad. En realizaciones adicionales, las etapas de
creación y cribado de genotecas adicionales se realizan por cribado
de las genotecas adicionales para las propiedades deseadas de
proteínas y repetición de mutagénesis de saturación de sitios hasta
que se alcance un objetivo de propiedad deseada de proteína.
La presente solicitud describe también
procedimientos u obtención de una variante de enzima que tiene una
o más propiedades deseadas que comprenden: uso de una representación
tridimensional de la enzima para seleccionar sitios de mutación
basándose en los aminoácidos; realización de mutagénesis de
saturación de sitios en los sitios seleccionados de mutación para
crear una genoteca; cribado de la genoteca para variantes que tengan
una o más propiedades deseadas; calificación de los sitios de
mutación de las variantes para una o más propiedades deseadas;
selección de una o más variantes que tengan una calidad deseable
como plantilla; uso de la plantilla y la realimentación para
repetir la mutagénesis de saturación de sitios en sitios de mutación
que tengan calidades deseables y para realizar mutagénesis de
saturación de sitios en nuevas genotecas en nuevos sitios. En otras
realizaciones adicionales, se seleccionan una o más propiedades
deseadas entre el grupo que consiste en actividad de sustrato,
termoestabilidad, estabilidad relativa al entorno de reacción,
intervalo de estabilidad de fuerza iónica, estabilidad de presión e
intervalo de estabilidad de pH. En algunas realizaciones preferidas,
se seleccionan una o más propiedades deseadas entre el grupo que
consiste en actividad de sustrato y termoestabilidad. En algunas
realizaciones preferidas especialmente, la enzima es cutinasa.
La presente solicitud describe también procesos
(es decir, procedimientos) para la producción de una variante de
cutinasa con actividad hidrolítica sobre poliéster, en la que la
cutinasa es una variante de cutinasa de Pseudomonas,
comprendiendo el proceso: uso de un modelo tridimensional para
seleccionar sitios de mutación de aminoácidos con probabilidad de
demostrar actividad hidrolítica; realización de mutagénesis de
saturación de sitios en los sitios de mutación seleccionados de
aminoácidos para crear una genoteca que tenga variantes con sitios
mutados; cribado de la genoteca para variantes que tengan sitios
mutados, usando ensayos para detectar actividad de poliesterasa y
termoestabilidad; calificación los sitios mutados como beneficiosos,
neutros o perjudiciales para actividad de poliesterasa y
termoestabilidad; selección de una variante que tenga al menos una
calidad beneficiosa; creación de genotecas nuevas y de repetición
usando la variante seleccionada y realimentación a partir de la
calificación.
Figura 1. Proporciona una vista esquemática que
ilustra el principio general de la invención.
Figura 2. Proporciona una gráfica que muestra la
relación entre actividad de poliesterasa y concentración de
proteínas, según se determina por ensayo TCA para varios
transformantes diferentes de Bacillus subtilis.
Figura 3. Proporciona una gráfica que muestra la
actividad de poliesterasa de variantes de cutinasa de la
"Genoteca A" en dos genotecas de saturación de sitios relativa
a los resultados del ensayo TCA. Asimismo se muestran controles de
enzimas de tipo salvaje.
Figura 4. Proporciona una gráfica que muestra la
actividad de poliesterasa de variantes de cutinasa de la
"Genoteca B" en dos genotecas de saturación de sitios relativa
a los resultados del ensayo TCA. Asimismo se muestran controles de
enzimas de tipo salvaje.
Figura 5. Proporciona una gráfica que muestra la
estabilidad térmica en detergente de lavado de variantes de
cutinasa de la "Genoteca A" en dos genotecas de saturación de
sitios relativa a los resultados de actividad pNB. Se muestran
también controles de enzimas de tipo salvaje.
Figura 6. Proporciona una gráfica que muestra la
estabilidad térmica en detergente de lavado de variantes de
cutinasa de la "Genoteca B" en dos genotecas de saturación de
sitios relativa a los resultados de actividad pNB. Se muestran
también controles de enzimas de tipo salvaje.
Figura 7. Proporciona un diagrama que muestra la
estructura tridimensional de una proteína que muestra la cara del
sitio activo de la triada catalítica (color oscuro) de cutinasa de
Pseudomonas mendocina.
Figura 8. Proporciona una representación
alternativa representación de la Figura 7. En esta Figura, los
aminoácidos objeto iniciales para el procedimiento de mutagénesis
de saturación de sitios de la presente invención se muestran en un
color más oscuro.
Figura 9. Proporciona una representación
alternativa de la Figura 7. En esta Figura, los sitios que muestran
al menos el 2% de variantes con actividad de enzimas mejorada se
muestran en un color más oscuro.
Figura 10. Proporciona otra representación
alternativa de la Figura 7. En esta Figura, los sitios en que la
mayoría de las mutaciones no tuvieron efecto en la actividad de
enzimas se muestran en color oscuro.
Figura 11. Proporciona otra representación de la
Figura 7. En esta Figura, los sitios en los que la mayoría de las
mutaciones tuvieron un efecto perjudicial en la actividad de enzimas
se muestran en color oscuro.
Figura 12. Proporciona otra representación de la
Figura 7. En esta Figura, los sitios que muestran al menos el 2% de
variantes con estabilidad de proteínas mejorada se muestran en color
oscuro.
Figura 13. Muestra otra representación más de la
Figura 7. En esta Figura, los sitios en los que la mayoría de las
mutaciones no tuvieron efecto en la estabilidad de proteínas se
muestran en color oscuro.
Figura 14. Proporciona otra representación de la
Figura 7. En esta Figura, los sitios en los que la mayoría de
mutaciones tuvieron un efecto perjudicial en la estabilidad de
proteínas se muestran en color oscuro.
Figura 15. Proporciona una gráfica que muestra
la actividad de una segunda variante de generación en comparación
con la enzima de tipo salvaje.
Figura 16. Proporciona una gráfica que muestra
la termoestabilidad incrementada de una segunda variante de
generación frente al tipo salvaje.
Figura 17. Proporciona la secuencia de
nucleótidos (ID SEC Nº: 1) de la cutinasa de P. mendocina
progenitora expresada en Bacillus subtilis #3934.
Figura 18. Proporciona el aminoácido (ID SEC Nº:
2) y la secuencia de ADN (ID SEC Nº: 1) para la cutinasa de P.
mendocina progenitora.
La presente solicitud describe procedimientos de
mutagénesis para ingeniería de proteínas. En particular, la
presente solicitud describe procedimientos de mutagénesis que
incluyen ajuste de realimentación a partir de evaluación
sistemática de los resultados. Más específicamente, la solicitud
describe procedimientos de mutagénesis de saturación de sitios que
criban variantes con una o más propiedades deseables de proteínas y
evalúan los resultados del cribado para proporcionar realimentación
para cribado repetido y construcción de nuevas genotecas. La
invención proporciona variantes de cutinasa que proporcionan
estabilidad y actividad mejoradas en comparación con la cutinasa de
tipo salvaje.
La presente solicitud describe procedimientos de
mutagénesis de barrido y saturación de sitios para producir
variantes mejoradas de proteínas usando tan sólo dos sustituciones
de aminoácidos en secuencia. En realizaciones preferidas, los
procedimientos incluyen ajuste de realimentación a partir de la
evaluación sistemática de resultados de cribado para múltiples
propiedades de proteínas después de sustitución de aminoácidos. El
procedimiento identifica y califica las sustituciones de aminoácido
y los sitios de mutación de las sustituciones basándose en los
resultados de ensayos seleccionados para detectar al menos una
propiedad deseada y mejorada de proteínas. El procedimiento
correlaciona además los sitios de mutación y las mutaciones
específicas con los resultados de los ensayos, facilitando la
identificación de tendencias y permitiendo la construcción de nuevas
genotecas moleculares e identificación calificada de sitios de
mutación para una mayor mejora. El procedimiento implica también
mutagénesis repetida de las genotecas iniciales, produciendo
mutaciones cooperativas que mejoran las propiedades de proteínas
con tan sólo dos mutaciones. También se crean nuevas genotecas en
nuevos sitios seleccionados con realimentación de calificación.
Los procedimientos generales se exponen de forma
general en la Figura 1. En realizaciones preferidas, los sitios se
seleccionan para saturación basándose en información estructural de
proteínas y/o cualquier hipótesis relacionada con relaciones
estructurales-funcionales en la etapa 2 (véase
Figura 1), y las genotecas de saturación de sitios se crean en la
etapa 4 (véase Figura 1). Las genotecas creadas se someten a
continuación a cribado en la etapa 6 (véase Figura 1) en cuanto a
su(s) propiedad(es) de interés, y se usan los
resultados del cribado para categorizar los sitios en la etapa 8
(véase Figura 1). Por ejemplo, en algunas realizaciones preferidas,
los sitios se ordenan como "beneficiosos", "neutros" o
"perjudiciales", mientras que en otras realizaciones, se
designan otras categorías según se desee. En la etapa 10 (véase
Figura 1), se selecciona una variante mejorada basándose en los
resultados obtenidos en la etapa 8 (véase Figura 1), y la variante
se usa como una plantilla para construcción de genotecas
adicionales. La construcción de genotecas en la etapa 12 (véase
Figura 1) usa la variante de plantilla de la etapa 10 (véase Figura
1) y crea nuevos sitios que se espera que sean beneficiosos
basándose en la realimentación a partir de los resultados
categorizados en la etapa 8 (véase Figura 1). Además de nuevas
genotecas, la variante mejorada de la etapa 10 (véase Figura 1) se
usa para repetir las genotecas anteriores en sitios beneficiosos en
la etapa 14 usando realimentación a partir de los resultados
categorizados de la etapa 8 (véase Figura 1).
Los procedimientos de mutagénesis de barrido de
saturación de sitios se realizan de una forma iterativa, con ajuste
de realimentación, y en algunas realizaciones, se descomponen en las
cuatro secciones siguientes: mutagénesis de saturación de sitios;
cribado de actividad; evaluación sistemática de resultados;
construcción de nuevas genotecas/mutagénesis repetida de saturación
de sitios de genotecas anteriores.
A no ser que se defina lo contrario en la
presente memoria descriptiva, todos los términos técnicos y
científicos usados en la presente memoria descriptiva tienen el
mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la
materia a los que se dirige esta invención. Por ejemplo, Singleton y
Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2ª
ed., John Wiley and Sons, NY (1994); y Hale y Marham, The Harper
Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)
proporcionan a los expertos en la materia unos diccionarios
generales de muchos de los términos usados en la invención. Aunque
cualesquiera procedimientos y materiales similares o equivalentes a
los descritos en la presente memoria descriptiva encuentran uso en
la práctica de la presente invención, los procedimientos y
materiales preferidos se describen en la presente memoria
descriptiva. En consecuencia, los términos definidos inmediatamente
a continuación se describen más completamente como referencia a la
memoria descriptiva en su conjunto. Además, según se usa en la
presente memoria descriptiva, el singular "un", "una" y
"el/la" incluye la referencia en plural a no ser que el
contexto indique claramente lo contrario.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"Pseudomonas" se refiere a todos los miembros del género
bacteriano Pseudomonas, lo que incluye pero no se limita a
P. fluorescens, P. synxantha, P. mendocina,
P. aeruginosa, P. aureofaciens, y cualquier otra
especie dentro del género Pseudomonas. Se pretende que el
término comprenda cepas de tipo salvaje, así como cepas mutantes y
recombinantes. Se pretende también que el género incluya especies
que hayan sido reclasificadas en otro género.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"el género Bacillus" incluye todos los miembros
conocidos para los expertos en la materia, lo que incluye pero no
se limita a B. subtilis, B. licheniformis, B.
lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B.
alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii,
B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans,
B. circulans, B. lautus y B. thuringiensis. Se
reconoce que el género Bacillus continúa sometido a
reorganización taxonómica. Así, se pretende que el género incluya
especies que han sido reclasificadas, lo que incluye pero no se
limita a organismos como B. stearothermophilus, que ahora se
denomina "Geobacillus stearothermophilus". La
producción de endosporas resistentes en presencia de oxígeno se
considera el rasgo que define al género Bacillus, aunque
esta característica también se aplica a los recientemente
denominados Alicyclobacillus, Amphibacillus,
Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus,
Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus,
Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus,
Ureibacillus y Virgibacillus. Se pretende que el
término comprenda cepas de tipo salvaje, así como cepas mutantes y
recombinantes.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
las proteínas "de tipo salvaje" y "nativas" son aquellas
encontradas en la naturaleza. Los términos "secuencia de tipo
salvaje", y "gen de tipo salvaje" se usan indistintamente
en la presente memoria descriptiva, para referirse a una secuencia
que es nativa o que aparece naturalmente en una célula hospedadora.
En algunas realizaciones, la secuencia de tipo salvaje se refiere a
una secuencia de interés que es el punto de partida de un proyecto
de ingeniería de proteínas. Los genes que codifican la proteína de
ocurrencia natural (es decir, precursora) pueden obtenerse de
acuerdo con los procedimientos generales conocidos por los expertos
en la materia. Los procedimientos comprenden generalmente síntesis
de sondas marcadas que tienen posibles secuencias que codifican
regiones de la proteína de interés, preparando genotecas genómicas
a partir de organismos que expresan la proteína, y cribado de las
genotecas para el gen de interés por hibridación de las sondas. A
continuación se cartografían y secuencian los clones de hibridación
positivamente.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"proteína recombinante", se refiere a una proteína en la que
la secuencia de ADN que codifica la proteína se ha modificado para
producir una secuencia de ADN variante (o mutante) que codifica la
sustitución, deleción o inserción de uno o más aminoácidos en la
secuencia de aminoácidos de ocurrencia natural. Los procedimientos
adecuados para producir dicha modificación, y que pueden combinarse
con los desvelados en la presente memoria descriptiva, incluyen,
pero no se limitan a los desvelados en la patente de EE.UU.
4.760.025 (US-RE-34.606), la patente
de EE.UU. 5.204.015 y la patente de EE.UU. 5.185.258.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"proteína" se refiere a cualquier composición formada por
aminoácidos y reconocida como una proteína por los expertos en la
materia. Los términos "proteína", "péptido" y polipéptido
se usan indistintamente en la presente memoria descriptiva. Los
aminoácidos pueden referirse por sus nombres completos (por
ejemplo, alanina) o por abreviaturas aceptadas de una letra (por
ejemplo, A) o tres letras (por ejemplo, ala). Cuando un péptido es
una parte de una proteína, los expertos en la materia comprenden el
uso del término en su contexto. El término "proteína" comprende
formas maduras de proteínas, así como las formas pro y prepro de
proteínas relacionadas. las formas prepro de proteínas comprenden la
forma madura de la proteína que tiene una prosecuencia ligada
operativamente al término amino de la proteína, y una secuencia
"pre-" o de "señal" ligada operativamente al término amino
de la prosecuencia.
En algunas realizaciones preferidas, el término
proteína se refiere a enzimas naturales, sintéticas y de ingeniería
como oxidorreductasas, transferasas, isomerasas, ligasas,
hidrolasas; anticuerpos; polipéptidos; péptidos; hormonas;
citocinas; factores de crecimiento; otros moduladores biológicos;
reactivos de diagnóstico basados en proteínas; y biosensores. Los
ejemplos de enzimas que pueden potenciarse mediante el procedimiento
de la invención incluyen, pero no se limitan a, proteasas,
carbohidrasas, lipasas, peroxidasas, celulasas y dioxigenasas.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "derivado" se refiere a una proteína (por ejemplo,
una cutinasa) que se obtiene de una proteína precursora (por
ejemplo, la cutinasa nativa) por adición de uno o más aminoácidos a
uno o ambos de los extremos terminales C y N, sustitución de uno o
más aminoácidos en uno o varios de diferentes sitios en la
secuencia de aminoácidos, y/o deleción de uno o más aminoácidos en
uno o ambos extremos de la proteína o en uno o más sitios en la
secuencia de aminoácidos, y/o inserción de uno o más aminoácidos en
uno o más sitios en la secuencia de aminoácidos. La preparación de
un derivado de cutinasa se consigue preferentemente por
modificación de una secuencia de ADN que codifica para la proteína
nativa, transformación de esa secuencia de ADN en un hospedador
adecuado y expresión de la secuencia de ADN modificada para formar
la cutinasa derivada.
Las proteínas relacionadas (y derivadas)
incluyen "variantes de proteínas". En realizaciones preferidas,
las variantes de proteínas difieren de una proteína progenitora y
entre sí por un pequeño número de residuos de aminoácidos. El
número de residuos de aminoácidos diferentes puede ser uno o más,
preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más
residuos de aminoácidos. En una realización preferida, el número de
diferentes aminoácidos entre variantes está entre 1 y 10. En
realizaciones preferidas especialmente, las proteínas relacionadas
y especialmente las variantes de proteínas comprenden al menos el
50%, 60%, 65%. 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de
identidad de secuencias de aminoácidos.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"propiedades de proteínas" se refiere a integridad estructural
y/o función de proteínas, incluyendo unión y/o catálisis relativas a
una o más condiciones o sustratos, con la actividad de proteínas
que incluye pero no se limita a unión y catálisis; estabilidad de
proteínas relativa a exposición a condiciones seleccionadas,
estabilidad de proteínas que incluye pero no se limita a estabilidad
térmica, estabilidad del intervalo de pH, estabilidad del intervalo
de fuerza iónica, estabilidad de presión; y/o estabilidad del
entorno de sustancias de reacción, como estabilidad en disolventes
orgánicos.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"consideraciones estructurales de proteínas" se refiere a
información disponible sobre la estructura física de la proteína de
interés, lo que incluye pero no se limita a posición de sitios de
unión a sustratos, estructura tridimensional, secuencias de
aminoácidos; y, la naturaleza química del evento de reacción o
unión al que se dirigirá la mutagénesis de la proteína.
El uso de consideraciones estructurales de
proteínas se ilustra mediante los siguientes dos ejemplos que no
pretenden ser limitativos. Cuando se conocen tanto el sitio de unión
al sustrato como la estructura tridimensional, la mutagénesis de
saturación de sitios puede limitarse a un sitio de unión a sustrato
si la propiedad objeto es actividad catalítica. Cuando sólo se
conoce la secuencia de aminoácidos de la proteína objeto, los sitios
de mutagénesis pueden seleccionarse por comparación de la secuencia
conocida con secuencias homólogas para permitir la selección de
sitios sospechosos funcionalmente importantes para mutagénesis.
Ambos ejemplos incluyen además la consideración de la naturaleza
del problema que se debe resolver (es decir, alteración de actividad
catalítica, unión, estabilidad, etc.).
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"mutagénesis de saturación de sitios" se refiere a un
procedimiento de mutagénesis en la que se aleatorizan cebadores de
oligonucleótidos en el sitio de interés usando la secuencia de
triplete NNG/C, en la que N es una mezcla de las 4 bases. Para cada
sitio seleccionado, el aminoácido se sustituye aleatoriamente por
las 19 posibles alternativas. La mutagénesis de saturación de sitios
no se limita a mutaciones producidas por una única sustitución de
codones. En algunas realizaciones preferidas, se generan secuencias
de ADN mutantes con mutagénesis de saturación de sitios en al menos
un codón. En otras realizaciones preferidas, la mutagénesis de
saturación de sitios se realiza para dos o más codones. En una
realización adicional, las secuencias de ADN mutantes tienen más
del 40%, más del 45%, más del 50%, más del 55%, más del 60%, más
del 65%, más del 70%, más del 75%, más del 80%, más del 85%, más del
90%, más del 95% o más del 98% de homología con la secuencia de
tipo salvaje. Alternativamente, el ADN mutante puede generarse in
vivo usando cualquier procedimiento mutagénico conocido (por
ejemplo, radiación, nitrosoguanidina, etc.). Las secuencias de
constructos de ADN pueden ser de tipo salvaje, mutante o
modificado. Además, las secuencias pueden ser homólogas o
heterólogas.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "aleatorización dirigida" se refiere a un
procedimiento que produce una pluralidad de secuencias en el que se
han aleatorizado una o varias posiciones. En algunas realizaciones,
la aleatorización es completa (es decir, los cuatro nucleótidos, A,
T, G, y C, pueden darse en una posición aleatorizada). En
realizaciones alternativas, la aleatorización de un nucleótido se
limita a un subconjunto de los cuatro nucleótidos. La
aleatorización dirigida puede aplicarse a uno o varios codones de
una secuencia, codificando para una o varias proteínas de interés.
Cuando se expresan, las genotecas resultantes producen poblaciones
de proteínas en las que una o más posiciones de aminoácidos pueden
contener una mezcla de los 20 aminoácidos o un subconjunto de
aminoácidos, según se determina por el esquema de aleatorización
del codón aleatorizado. En algunas realizaciones, los miembros
individuales de una población resultantes de aleatorización
dirigida difieren en el número de aminoácidos, debido a la inserción
o deleción dirigida o aleatoria de codones. En realizaciones
adicionales, se incluyen aminoácidos sintéticos en las poblaciones
de proteínas producidas.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"correspondiente a", se refiere a un residuo en la posición
enumerada en una proteína o péptido, o un residuo que es análogo,
homólogo o equivalente a un residuo enumerado en otra proteína o
péptido.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"región correspondiente" se refiere generalmente a una posición
análoga dentro de proteínas relacionadas o una proteína
progenitora.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "secuencia análoga" se refiere a una secuencia
dentro de una proteína que proporciona función, estructura terciaria
y/o residuos conservados similares a la proteína de interés. En
realizaciones preferidas especialmente, la secuencia análoga implica
secuencia(s) en o cerca de un epítopo. Por ejemplo, en
regiones de epítopos que contienen una hélice alfa o una estructura
de lámina beta, los aminoácidos de sustitución en la secuencia
análoga mantienen preferentemente la misma estructura específica.
El término también se refiere a secuencias de nucleótidos, así como
secuencias de aminoácidos.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"proteína homóloga" se refiere a una proteína (por ejemplo,
cutinasa) que tiene acción catalítica, estructura, respuesta
antigénica y/o inmunogénica similares a la proteína (es decir,
cutinasa) de interés. No se pretende que un homólogo y una proteína
(por ejemplo, cutinasa) de interés estén relacionados
necesariamente de forma evolutiva. Así, se pretende que el término
comprenda la misma proteína funcional obtenida de diferentes
especies. En algunas realizaciones preferidas, es deseable
identificar un homólogo que tenga una estructura terciaria y/o
primaria similar a la proteína de interés, ya que la sustitución
para el epítopo en la proteína de interés por un segmento análogo a
partir del homólogo reducirá la desorganización del cambio. Así, en
la mayoría de los casos, las proteínas estrechamente homólogas
proporcionan las fuentes más deseables de sustituciones de epítopos.
Alternativamente, es ventajoso buscar análogos humanos para una
proteína dada.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"genes homólogos" se refiere a al menos un par de genes de
especies diferentes, pero habitualmente especies relacionadas, que
se corresponden entre sí y que son idénticas o muy similares entre
sí. El término comprende genes que se separan por especiación (es
decir, el desarrollo de nuevas especies) (por ejemplo, genes
ortólogos), así como genes que se han separado por duplicación
genética (por ejemplo, genes parálogos).
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"ortólogo" y "genes ortólogos" se refiere a genes en
diferentes especies que han evolucionado a partir de un gen
ancestro común (es decir, un gen homólogo) por especiación.
Normalmente, los ortólogos conservan la misma función durante el
curso de evolución. La identificación de ortólogos encuentra uso en
la predicción fiable de función génica en genomas de nueva
secuenciación.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"parálogo" y "genes parálogos" se refiere a genes que
están relacionados por duplicación dentro de un genoma. Mientras
los ortólogos conservan la misma función a través del curso de la
evolución, los parálogos evolucionan en nuevas funciones, aun cuando
algunas funciones estén relacionadas a menudo con la original. Los
ejemplos de genes parálogos incluyen, pero no se limitan a genes
que codifican tripsina, quimotripsina, elastasa y trombina, que son
todas serinproteinasas y que aparecen juntas dentro de la misma
especie.
El grado de homología entre secuencias puede
determinarse usando cualquier procedimiento adecuado conocido en la
técnica (véase por ejemplo, Smith y Aguaman, Adv. Appl. Math., 2:482
1981]; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 1970]; Pearson y
Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 1988]; programas como
GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software
Package (Genetics Computer Group, Madison, WI); y Devereux y col.,
Nucl. Acid Res., 12:387-395 1984]). Por ejemplo,
PILEUP es un programa útil para determinar los niveles de homología
de secuencias. PILEUP crea una alineación de secuencias múltiples a
partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones
progresivas por pares. También puede representar un árbol que
muestra las relaciones de agrupación usadas para crear la
alineación. PILEUP usa una simplificación del procedimiento de
alineación progresiva de Feng y Doolittle, (Feng y Doolittle, J.
Mol. Evol., 35:351-360 1987]). El procedimiento es
similar al descrito por Higgins y Sharp (Higgins y Sharp, CABIOS
5:151-153 1989]). Los parámetros de PILEUP útiles
que incluyen un peso de espacio vacío por omisión de 3,00, un peso
de longitud de espacio vacío por omisión de 0,10, y espacios vacíos
de extremo ponderados. Otro ejemplo de un algoritmo útil es el
algoritmo BLAST, descrito por Altschul y col., (Altschul y col., J.
Mol. Biol., 215:403-410, 1990]; y Karlin y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 1993]). Un
programa BLAST especialmente útil es el programa
WU-BLAST-2 (véase Altschul y col.,
Meth. Enzymol., 266:460-480 1996]). Los parámetros
"W", "T" y "X" determinan la sensibilidad y la
velocidad de la alineación. El programa BLAST usa como valores por
omisión una longitud de palabra (W) de 11, alineaciones (B) de
matriz de valoración BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 1989]) de 50, expectativa (E) de 10,
M'5, N'-4, y una comparación de las dos cadenas.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"identidad de secuencias de ácidos nucleicos porcentual (%)"
se define como el porcentaje de residuos de nucleótidos en una
secuencia candidata que son idénticos a los residuos de nucleótidos
de la secuencia.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "hibridación" se refiere al procedimiento por el
que una cadena de ácido nucleico se une con una cadena
complementaria a través de apareamiento de bases, según se conoce
en la técnica.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"restricción máxima" se refiere al nivel de hibridación que
tiene lugar normalmente a aproximadamente Tm - 5ºC (5ºC por debajo
de la Tm de la sonda); "restricción alta" a aproximadamente de
5ºC a 10ºC por debajo de Tm; "restricción intermedia" a
aproximadamente de 10ºC a 20ºC por debajo de Tm; y "restricción
baja" a aproximadamente de 20ºC a 25ºC por debajo de Tm. Como
comprenderán los expertos en la materia, puede usarse una
hibridación de restricción máxima para identificar o detectar
secuencias de polinucleótidos idénticas mientras que puede usarse
una hibridación de restricción intermedia o baja para identificar o
detectar homólogos de secuencias de polinucleótidos.
Las frases "sustancialmente similar" y
"sustancialmente idéntico" en el contexto de dos ácidos
nucleicos o polipéptidos significa normalmente que un
polinucleótido o polipéptido comprende una secuencia que tiene al
menos una identidad de secuencias del 75%, preferentemente al menos
el 80%, más preferentemente al menos el 90%, más preferentemente
todavía el 95%, con la máxima preferencia el 97%, a veces hasta el
98% y el 99% de identidad de secuencias, en comparación con la
secuencia de referencia (es decir, tipo salvaje). La identidad de
secuencias puede determinarse usando programas conocidos como BLAST,
ALIGN y CLUSTAL usando parámetros estándar. (Véase por ejemplo,
Altschul, y col., J. Mol. Biol. 215:403-410 1990];
Henikoff y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:10915 1989]; Karin y
col., Proc. Natl Acad. Sci USA 90:5873 1993]; y Higgins y col., Gene
73:237-244 1988]). El software para realizar
análisis BLAST está disponible públicamente a través del National
Center for Biotechnology Information. Además, pueden realizarse
búsquedas en bases de datos usando FASTA (Pearson y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448 1988]).
En algunas realizaciones, los "residuos
equivalentes" se definen determinando la homología en el nivel de
estructura terciaria para una proteína precursora (es decir,
proteína de interés) cuya estructura terciaria se ha determinado
mediante cristalografía de rayos X. Los residuos equivalentes se
definen como aquellos para los cuales las coordenadas atómicas de
dos o más de los átomos de cadenas principales de un residuo de
aminoácido en particular de la proteína precursora y otra proteína
están dentro de 0,13 nm y preferentemente 0,1 nm después de
alineación. La alineación se consigue después de que se ha orientado
y colocado el mejor modelo para dar la máxima superposición de
coordenadas atómicas de átomos de proteínas no de hidrógeno de la
proteína. En la mayoría de las realizaciones, el mejor modelo es el
modelo cristalográfico que da el menor factor R para datos de
difracción experimental en la máxima resolución disponible.
En algunas realizaciones, la modificación se
realiza preferentemente en la "secuencia de ADN precursora" que
codifica la secuencia de aminoácidos de la enzima precursora, pero
puede ser por la manipulación de la proteína precursora. En el caso
de residuos que no se conservan, la sustitución de uno o más
aminoácidos se limita a sustituciones que producen una variante que
tiene una secuencia de aminoácidos que no se corresponde con la
encontrada en la naturaleza. En el caso de residuos conservados,
dichas sustituciones no deben producir una secuencia de ocurrencia
natural. Los derivados proporcionados por la presente invención
incluyen además modificación(es) química(s) que
cambian las características de la cutinasa.
En algunas realizaciones preferidas, el gen de
proteína está ligado en un plásmido de expresión apropiada. A
continuación se usa el gen de proteína clonado para transformar o
transfectar una célula hospedadora con el fin de expresar el gen de
proteína. Este plásmido puede replicarse en hospedadores en el
sentido de que contiene los elementos bien conocidos necesarios
para replicación de plásmidos o el plásmido puede diseñarse para
integrarse en el cromosoma hospedador. Se proporcionan los elementos
necesarios para expresión génica eficaz (por ejemplo, un promotor
ligado operativamente al gen de interés). En algunas realizaciones,
estos elementos necesarios se suministran como el propio promotor
homólogo del gen si es reconocido (es decir, transcrito, por el
hospedador), un terminador de transcripción (una región de
poliadenilación para células hospedadoras eucariotas) que es
exógeno o es suministrado por la región de terminador endógeno del
gen de proteína. En algunas realizaciones, se incluye también un
gen de selección como un gen de resistencia a antibióticos que
permite el mantenimiento continuo en cultivo de células hospedadoras
infectadas por plásmidos mediante crecimiento en medios de
contenido antimicrobiano.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"célula hospedadora" se refiere a una célula que tiene la
capacidad de actuar como un vehículo hospedador o de expresión para
una secuencia de entrada. En una realización, la célula hospedadora
es un microorganismo.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
los términos "constructo de ADN " y "ADN transformante" se
usan indistintamente para referirse a ADN usado para introducir
secuencias en una célula hospedadora u organismo. El ADN puede
generarse in vitro por PCR o cualquier otra(s)
técnica(s) adecuada(s) conocida(s) para los
expertos en la materia. En realizaciones preferidas especialmente,
el constructo de ADN comprende una secuencia de interés (por
ejemplo, como una secuencia de entrada). En algunas realizaciones,
la secuencia se vincula operativamente a elementos adicionales como
elementos de control (por ejemplo, promotores, etc.). El constructo
de ADN puede comprender además un marcador seleccionable. Puede
comprender además una secuencia de entrada flanqueada por cajas de
homología. En una realización adicional, el ADN transformante
comprende otras secuencias no homólogas, añadidas a los extremos
(por ejemplo, secuencias de relleno o flancos). En algunas
realizaciones, los extremos de la secuencia de entrada están
cerrados de manera que el ADN transformante forma un círculo
cerrado. Las secuencias transformantes pueden ser de tipo salvaje,
mutantes o modificadas. En algunas realizaciones, el constructo de
ADN comprende secuencias homólogas al cromosoma de la célula
hospedadora. En otras realizaciones, el constructo de ADN comprende
secuencias no homólogas. Una vez que el constructo de ADN se
ensambla in vitro puede usarse para: 1) insertar secuencias
heterólogas en una secuencia objeto de una célula hospedadora, y/o
2) mutagenizar una región del cromosoma de la célula hospedadora (es
decir, sustituir una secuencia endógena por una secuencia
heteróloga), 3) borrar genes objeto; y/o introducir un plásmido
replicante en el hospedador.
En una realización, la presente invención
implica ensamblaje de un constructo de ADN in vitro, seguido
por clonación de dicho constructo en una célula hospedadora. Por
ejemplo, puede emplearse fusión y/o ligación de PCR para ensamblar
un constructo de ADN in vitro. En algunas realizaciones, el
constructo de ADN comprende un ADN en el que se ha introducido una
mutación.
Una "secuencia de entrada" según se usa en
la presente memoria descriptiva significa una secuencia de ADN que
se acaba de introducir en la célula hospedadora. En algunas
realizaciones, la secuencia de entrada se integra en el cromosoma o
el genoma del hospedador. La secuencia puede codificar una o más
proteínas de interés. Así, según se usa en la presente memoria
descriptiva, el término "secuencia de interés" se refiere a una
secuencia de entrada o una secuencia que será generada por la
célula hospedadora. Los términos "gen de interés" y
"secuencia de interés" se usan indistintamente en la presente
memoria descriptiva. La secuencia de entrada puede comprender un
promotor ligado operativamente a una secuencia de interés. Una
secuencia de entrada comprende una secuencia que puede o no estar
ya presente en el genoma de la célula que se transformará (es decir,
las secuencias homólogas y heterólogas encuentran uso con la
presente invención).
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
los términos "cutinasas híbridas" y "cutinasas de fusión"
se refieren a proteínas que se diseñan por ingeniería a partir de al
menos dos proteínas diferentes o "progenitoras". En
realizaciones preferidas, estas proteínas progenitoras son homólogas
entre sí. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una proteína
preferida de cutinasas híbridas o cutinasas de fusión contiene el
término N de una proteína y el término C de un homólogo de la
proteína. En alguna realización preferida, los dos extremos
terminales se combinan para corresponderse con la proteína activa de
longitud completa.
El término "muestra" según se usa en la
presente memoria descriptiva se usa en su sentido más amplio. Sin
embargo, en realizaciones preferidas, el término se usa en
referencia a una muestra (por ejemplo, una parte alícuota) que
comprende una variante (por ejemplo, una variante de una proteína de
interés) que está siendo analizada, identificada, modificada y/o en
comparación con otras variantes y/o la proteína de tipo salvaje.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"mutaciones" se refiere a inserciones, deleciones,
duplicaciones o alteraciones a secuencias de péptidos o secuencias
de ácidos nucleicos (por ejemplo, secuencias de tipo salvaje), que
incluyen, pero no se limitan a, mutaciones puntuales.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"mutaciones cooperativas" se refiere a dos o más mutaciones de
aminoácidos. En algunas realizaciones preferidas, estas mutaciones
funcionan conjuntamente en un medio complementario.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"cutinasa" se refiere a una enzima lipolítica capaz de
hidrolizar sustancias de cutina. Se pretende que dentro de esta
definición se comprendan cutinasas de cualquier fuente. Por
ejemplo, se sabe que las cutinasas son producidas por diversos
hongos y especies bacterianas. Se han descrito muchas cutinasas
(véase, por ejemplo, Kolattukudy, en Borgstrom y Brockman (ed.),
Lipases, Elsevier, en páginas 471-504 1984]; Longhi
y col., J. Mol. Biol., 268:779-799 1997]; patente de
EE.UU. nº 5.827.719; documentos WO-94/14.963;
WO-94/14.964; WO-00/05.389; Appl.
Environ. Microbiol. 64:2794-2799 1998]; Proteins:
Structure, Function and Genetics 26:442-458 1996];
J. Comput. Chem., 17:1783-1803 1996]; Protein
Engineer., 6:157-165 1993]). En algunas
realizaciones, la cutinasa "progenitora" (es decir, las
cutinasas a partir de las cuales se diseñan y proporcionan
variantes de cutinasas) tiene una secuencia de nucleótidos y/o
aminoácidos que es al menos homóloga al 50% a secuencias de ácidos
nucleicos y/o aminoácidos de las cutinasas de cutinasa de
Pseudomonas mendocina ID SEC Nº: 1 e ID SEC Nº: 2. En algunas
realizaciones, las cutinasas progenitoras son el 60%, 70%, 80%, 90%
o más del 90% homólogas con las secuencias de nucleótidos y/o
aminoácidos de cutinasa de Pseudomonas mendocina expuestas
en ID SEC Nº: 1 e ID SEC Nº: 2). En algunas realizaciones, la
cutinasa es de ocurrencia natural, mientras que en otras
realizaciones, son cutinasas modificadas genéticamente. En algunas
realizaciones, las cutinasas modificadas genéticamente se obtienen
por irradiación UV, tratamiento con
N-metil-N'-nitrosoguanidina
(NTG), tratamiento con metanosulfonato de etilo (EMS), tratamiento
con ácido nitroso, tratamiento con acridina o similar. En
realizaciones adicionales, la cutinasa modificada es una cutinasa
recombinante producida por procedimientos de ingeniería genética
como fusión celular, recombinación génica y/u otros procedimientos
conocidos en la técnica.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"calificación" se refiere al ordenamiento, valoración y
categorización de propiedades de proteínas, lo que incluye pero no
se limita a identificación de las propiedades como beneficiosas,
neutras y perjudiciales, e incluyendo agrupación de dichas
propiedades ordenadas y marcado de los grupos por codificación por
colores de los datos y representaciones tridimensionales, e
incluyendo identificación de análisis de tendencias
estructurales-funcionales.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"genoteca molecular" se refiere a un ensamblaje basado en
vectores de al menos una molécula de ácido nucleico que está basada
en vectores, no basada en vectores, o basada y no basada en
vectores en combinación.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"poliéster" se refiere moléculas poliméricas lineales
alifílicas y aromáticas que contienen grupos de ésteres en cadena y
que se derivan de la condensación de un diácido con un diol o a
partir de la polimerización de ácidos hidroxílicos. Los poliésteres
principales en uso industrial incluyen tereftalato de polietileno
(PET), tereftalato de tetrametileno (PTMT), tereftalato de
polibutileno (PBT), tereftalato de politrimetileno (PTT), ácido
poliláctico (PLA) y naftalato de polietileno (PEN), tereftalato de
policiclohexanodimetileno (CHDMT),
poli(etilen-4-oxibenzoato)A-Tell,
poliglicólido, PHBA y 2GN.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"poliesterasa" se refiere a una enzima que tiene una capacidad
importante para catalizar la hidrólisis y/o la modificación
superficial de poliéster. Las poliesterasas adecuadas se aíslan de
fuentes animales, vegetales, fúngicas y bacterianas. En algunas
realizaciones, la enzima se obtiene a partir de cualquier cepa
mutante (por ejemplo, obtenida por irradiación UV, tratamiento de
N-metil-N'-nitrosoguanidina
(NTG), tratamiento de metanosulfonato de etilo (EMS), tratamiento
de ácido nitroso, tratamiento de acridina o similar), así como
cepas recombinantes inducidas por procedimientos de ingeniería
genética como fusión celular y recombinación génica, etc.
La presente solicitud describe procedimientos de
mutagénesis para ingeniería de proteínas. En particular, la
presente solicitud describe procedimientos de mutagénesis que
incluyen ajuste de realimentación a partir de la evaluación
sistemática de resultados. Más específicamente, la solicitud
describe procedimientos de mutagénesis de saturación de sitios que
criban variantes con una o más propiedades de proteínas deseables y
evalúa los resultados del cribado para proporcionar realimentación
para cribado repetido y construcción de nuevas genotecas. La
invención proporciona varian-
tes de cutinasa que proporcionan estabilidad y actividad mejoradas en comparación con la cutinasa de tipo salvaje.
tes de cutinasa que proporcionan estabilidad y actividad mejoradas en comparación con la cutinasa de tipo salvaje.
La solicitud describe procedimientos de cribado
de mutagénesis de alta productividad para seleccionar sitios para
barrido de saturación usando consideraciones estructurales de
proteínas. Las genotecas de saturación de sitios se crean y se
criban usando ensayos para sitios que tienen propiedades de
proteínas de interés. Los sitios se categorizan para las
propiedades de interés y se identifican tendencias, si existen. A
continuación, se selecciona al menos una variante que tiene una
propiedad deseada para procedimientos adicionales de creación de
genotecas. Las genotecas adicionales se crean usando realimentación
a partir de las categorías determinadas. Un conjunto de genotecas
adicionales repite la construcción de las genotecas anteriores
usando la realimentación. Un segundo conjunto de genotecas
adicionales son nuevas genotecas creadas en sitios que según se
espera serán beneficiosos basándose en la realimentación. En
algunas realizaciones, las categorías se codifican, usando color u
otros indicios, para permitir la fácil identificación de
tendencias.
A continuación se describen los procedimientos
usados en la presente solicitud. Esta descripción se divide en
cuatro secciones para mayor claridad de presentación y que no se
deben entender como limitativas.
Según se ilustra en la Figura 1, en algunas
realizaciones preferidas, el procedimiento de mutagénesis de
saturación de sitios se limita a un subconjunto seleccionado de
posiciones de aminoácidos en la proteína definido después de un
minucioso análisis de la estructura y función de la proteína.
Después de la selección del subconjunto de
posiciones de aminoácidos en la proteína para mutagénesis (es decir,
etapa 2 en la Figura 1), las genotecas de saturación de sitios se
hacen en los sitios seleccionados por sustituciones aleatorias de
los 19 aminoácidos usando mutagénesis convencional dirigida a
oligonucleótidos (es decir, etapa 4 en la Figura 1). Durante el
desarrollo de la presente invención, se usó el kit Stratagene
Quik-Change^{TM}. Sin embargo, no se pretende que
el procedimiento se limite a ningún procedimiento en particular ya
que la producción convencional de genotecas es bien conocida para
los expertos en la materia (por ejemplo, véase también, Airaksinen
y Hovi, Nucl. Acids Res., 26:576-581 1998]; y
Sculptor Mutagenesis Kit (Amersham, RU)).
El oligonucleótido mutagénico empleado es
complementario a las áreas contiguas a los sitios seleccionados. El
codón para los sitios seleccionados se sustituye por la secuencia
N,N, (mezcla G/C). Como el procedimiento de mutagénesis no se
limita a mutaciones producidas por sustitución de un solo codón, el
procedimiento determina la importancia del sitio con respecto a las
propiedades deseadas de proteínas, e identifica las sustituciones
de aminoácidos que producen los resultados más eficaces. El
procedimiento es aplicable a una variedad de procedimientos de
mutagénesis.
Después de la mutagénesis de saturación de
sitios, los miembros de la genoteca experimentan un cribado para
las propiedades de proteínas de interés usando ensayos apropiados
para la proteína de interés (es decir, etapa 6 en la Figura 1). El
cribado se realiza preferentemente para más de una propiedad para
proporcionar información adicional relativa a la calidad y los
efectos mutacionales de los datos de cribado. La probabilidad,
"P", de que una colección de varian-
tes contenga al menos un clon con un aminoácido dado se determina a partir de la fórmula de distribución binomial.
tes contenga al menos un clon con un aminoácido dado se determina a partir de la fórmula de distribución binomial.
P = 1 - (1 -
p)^{n}
p = probabilidad de encontrar el
aminoácido en particular en la mezcla de
clones
n = número de clones cribados.
Por ejemplo, si se criban 90 clones, existe una
probabilidad del 94% de identificar un aminoácido codificado por
uno de los 32 codones posibles.
A continuación, se evalúan los resultados de
cribado de actividad para cada variante y se categorizan con
respecto a la posición de la mutación en la proteína para
identificar cualquier tendencia basada en la estructura (es decir,
etapa 8 en la Figura 1). Las evaluaciones de tendencias incluyen,
pero no se limitan a, uno o más de los siguientes ejemplos usando
los resultados del ensayo: (1) representación gráfica de la
distribución espacial de sitios de variantes dentro de una
representación tridimensional de la estructura de la proteína; (2)
representación gráfica de la identidad de la mutación de
aminoácidos; (3) representación gráfica de la distribución de
sitios de mutación beneficiosos comparados con secuencias de
aminoácidos de proteínas similares; y/o (4) calificación y
categorización de resultados, por ejemplo, como beneficiosos,
perjudiciales y neutros. Los resultados evaluados, especialmente
categorías, pueden codificarse según colores. La codificación por
colores puede añadirse a los datos representados y superponerse en
representaciones estructurales tridimensionales conocidas de la
proteína. Dicho análisis produce datos que revelan claramente
distribución de sitios no uniforme para las diversas categorías, y
señala rápidamente a tendencias para sustituciones de aminoácidos
beneficiosas, perjudiciales y neutras. El análisis y la
realimentación de la evaluación de resultados permite la selección
informada de más sitios de mutagénesis y construcción de nuevas
genotecas.
Los datos de la evaluación sistemática de los
resultados se usan como realimentación para construir nuevas
genotecas y para seleccionar sitios de mutación prometedores para
las genotecas probadas anteriormente (es decir, etapas 12, 14 en la
Figura 1). Estas nuevas genotecas se construyen usando las variantes
óptimas identificadas como poseedoras de mutaciones beneficiosas
después de mutagénesis primaria. Las variantes óptimas se usan como
plantillas para un procedimiento adicional de mutagénesis (es decir,
etapa 10 en la Figura 1). En este procedimiento de construcción,
las genotecas se preparan en cada uno de los sitios que produjeron
variantes mejoradas o beneficiosas en las etapas anteriores de
mutagénesis y cribado. Después de un segundo procedimiento de
mutagénesis de saturación de sitios que usa como ADN progenitor un
clon con una mutación de aminoácidos identificada como beneficiosa,
las variantes óptimas tienen cada una dos mutaciones beneficiosas.
El procedimiento se repite hasta que se alcanza algún objetivo de
mejora de las proteínas, o hasta que el número de sitios
beneficiosos se agota. Esta construcción de nuevas genotecas repite
esencialmente genotecas anteriores usando una proteína de inicio
mejorada elegida entre una de las genotecas anteriores y usando
mutaciones beneficiosas identificadas.
Un segundo procedimiento de construcción de una
nueva genoteca usa el análisis de tendencias descrito anteriormente
para mutar sitios adicionales situados cerca de cualquier sitio de
mutación beneficioso observado y categorizado (es decir, etapa 12
en la Figura 1). Esta etapa se extiende también para producir
mutaciones basándose en tendencias distintas de la proximidad
espacial observada en sitios beneficiosos. Esta construcción de
genotecas se extiende a sitios de aminoácidos potencialmente
beneficiosos, y permite la exclusión de sitios perjudiciales
categorizados. En realizaciones preferidas, esta construcción
conduce también a mejoras adicionales.
Con el fin de ilustrar la utilidad de la
presente invención, se produjeron numerosas variantes de cutinasas
usando los procedimientos descritos en la presente memoria
descriptiva.
La presente invención, proporciona variantes de
cutinasa con actividad y/o estabilidad mejoradas en comparación con
las cutinasas de tipo salvaje. En algunas realizaciones, la variante
de cutinasa comprende una o más sustituciones de aminoácidos en
posiciones de residuo correspondientes a sitios 34, 73, 75, 77, 78,
79, 80, 99, 164, 191-196, 219, 223 y 225 de
cutinasa de Pseudomonas mendocina ID SEC Nº: 2.
Una variante preferida de cutinasa es una
variante de cutinasa de Pseudomonas mendocina ID SEC Nº: 2,
en la que la variante comprende las sustituciones de Phe 194 por
Pro, Ser 219 por Gly y una o más sustituciones adicionales en
posiciones de aminoácidos, lo que incluye pero no se limita a 54,
78, 81, 191, 196, 200, 204, 263. Por ejemplo, en algunas
realizaciones preferidas, la posición de aminoácido 54 está
sustituida por Ser, Glu o Thr; la posición de aminoácido 78 está
sustituida por Val; la posición de aminoácido 81 está sustituida
por Ser; la posición de aminoácido 191 está sustituida por Asn o
His; la posición de aminoácido 196 está sustituida por Leu o Ala;
la posición de aminoácido 200 está sustituida por Leu; la posición
de aminoácido 204 está sustituida por Leu; la posición de
aminoácido 263 está sustituida por Pro. Así, en algunas
realizaciones, está sustituido más de un aminoácido en las
variantes de cutinasa en comparación con la cutinasa de tipo
salvaje. Por ejemplo, en algunas realizaciones preferidas, existen
mutaciones en dos, tres, cuatro, cinco, seis o más residuos de
aminoácidos. En algunas realizaciones, las variantes se obtuvieron
de una variante progenitora (por ejemplo,
F180P-S205G, referida en las tablas más adelante).
Así, en algunas realizaciones, se sustituyen múltiples aminoácidos
de manera que proporcionan beneficios adicionales a las variantes de
cutinasas.
Los siguientes ejemplos se proporcionan con el
fin de demostrar e ilustrar adicionalmente ciertas realizaciones y
aspectos preferidos de la presente invención y no deben entenderse
como limitativos del ámbito de la misma. Estos Ejemplos describen
la aplicación de los procedimientos para producir una enzima que
tiene estabilidad incrementada y actividad hidrolítica
incrementada. Sin embargo, no debe entenderse que la presente
invención se limita a estas enzimas específicas.
En la descripción experimental que sigue, se
aplican las siguientes abreviaturas: ºC (grados centígrados); rpm
(revoluciones por minuto); H_{2}O (agua); dH_{2}O (agua
desionizada); (HCl (ácido clorhídrico); aa (aminoácido); bp (par de
bases); kb (par de kilobases); kD (kilodaltons); gm (gramos); \mug
(microgramos); mg (miligramos); ng (nanogramos); \mul
(microlitros); ml (mililitros); mm (milímetros); nm (nanómetros);
\mum (micrómetro); M (molar); mM (milimolar); \muM (micromolar);
U (unidades); V (voltios); PM (peso molecular); seg (segundos);
min(s) (minuto/minutos); hr(s) (hora/horas):
MgCl_{2} (cloruro de magnesio); NaCl (cloruro de socio);
DO_{280} (densidad óptica a 280 nm); DO_{600} (densidad óptica a
600 nm); PAGE (electroforesis de gel de poliacrilamida); PBS (suero
salino con tampón de fosfato 150 mM NaCl, 10 mM tampón de fosfato de
sodio, pH 7,2]); MOPS (ácido
3-(N-morfolino)propanosulfónico); TCA (ácido
tricloroacético); PEG (polietilenglicol); PCR (reacción de cadena
de la polimerasa); RT-PCR (PCR de transcripción
inversa); SDS (dodecilsulfato de sodio); Tris
(tris(hidroximetil)aminometano); p/v (peso por
volumen); v/v (volumen por volumen); medio LA (por litro: Triptona
Peptona Difco 20 g, Extracto de Levadura Difco 10 g, NaCl de EM
Science NaCl 1 g, Agar de EM Science 17,5 g, dH_{2}0 a 1 L): ATCC
(American Type Culture Collection, Rockville, MD); Clontech
(CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA); Difco (Difco Laboratories,
Detroit, MI); GIBCO BRL o Gibco BRL (Life Technologies, Inc.,
Gaithersburg, MD); Invitrogen (Invitrogen Corp:, San Diego, CA);
NEB (New England Biolabs, Beverly, MA); Sigma (Sigma Chemical Co.,
St. Louis, MO); Takara (Takara Bio Inc. Otsu, Japón); Roche
(Hoffmann-La Roche, Basilea, Suiza); Testfabrics
(Testfabrics, Inc., West Pittston, PA); Scientific Polymer
(Scientific Polymer Products, Ontario, NY); V&P Scientific
(V&P Scientific, San Diego, CA); Marsh (Marsh BioProducts,
Rochester, NY); EM Science (EM Science, Gibbstown, NJ); Qiagen
(Qiagen; Inc., Valencia, CA); y Stratagene (Stratagene Cloning
Systems, La Jolla, CA).
\vskip1.000000\baselineskip
La cutinasa de P. mendocina (véanse
Figuras 17 y 18, ID SEC Nº: 1 y ID SEC Nº: 2) se sometió a
procedimientos para identificar mutantes que mejoran la actividad
hidrolítica sobre poliéster en fibras de poli(tereftalato de
etileno) y resina y/o la estabilidad de las enzimas.
En los medios de cultivo usados se usó MOPS como
tampón y también contenían 5 \mug/mL de cloranfenicol, para
seleccionar transformantes que alojaban el gen de cutinasa. Todos
los productos químicos usados en estos Ejemplos se obtuvieron a
partir de vendedores comerciales. El medio de cultivo se preparó del
modo siguiente:
- 100 mL
- 10x MOPS (véase más adelante)
- 12,6 g
- Glucosa
- 0,23 g
- K_{2}HPO_{4}
- 0,53 g
- NH_{4}Cl
Ajustar pH a 7,3 con KOH
- 100 mL
- 10x MOPS (véase más adelante)
- 0,52 g
- K_{2}HPO_{4}
- 3,6 g
- Urea
- 21 g
- Glucosa
- 35 g
- Maltrin-150
Ajustar pH a 7,4 con KOH
\vskip1.000000\baselineskip
- 83,7 g
- MOPS
- 7,2 g
- Tricina
- 12,0 g
- KOH
- 0,48 g
- K_{2}SO_{4}
- 1,07 g
- MgCl_{2},6H_{2}O
- 29,2 g
- NaCl
- 100 mL
- 100x Micronutrientes (véase más adelante)
\vskip1.000000\baselineskip
- 400 mg
- FeSO_{4},7H_{2}O
- 100 mg
- MnSO_{4}.H_{2}O
- 100 mg
- ZnSO_{4},7H_{2}O
- 50 mg
- CuCl_{2},2H_{2}O
- 100 mg
- CoCl_{2},6H_{2}O
- 100 mg
- NaMoO_{4},2H_{2}O
- 100 mg
- Na_{2}B_{4}O_{7},10H_{2}O
- 1,1 g
- CaCl_{2} (o 10 mL de reserva 1,0 M)
- 1,47 g
- Citrato de sodio
\vskip1.000000\baselineskip
Las variantes de genotecas de saturación de
sitios se crearon en posiciones de aminoácidos correspondientes a
posiciones de residuo 71-80, 82, 99, 100, 102, 139,
141, 144, 162-166, 168, 169, 190-197
y 218-225 de ID SEC Nº: 2 en cutinasa de P.
mendocina, expresadas en cepa de Bacillus subtilis 3934.
La secuencia de ácidos nucleicos de la cutinasa progenitora se une
a las mismas como en la Figura 17 (ID SEC Nº: 1). Las genotecas se
crearon usando el kit Stratagene Quik-Change^{TM}
usando cebadores de oligonucleótidos aleatorizados con
NN(G/C) en la posición objeto. Cada aminoácido seleccionado
se sustituyó aleatoriamente por todas las 19 alternativas posibles.
Las colonias obtenidas de las variantes de genotecas se
seleccionaron y se colocaron en placas de crecimiento de 96
pocillos que contenían 100 \muL/pocillo de medio de inicio MOPS
1A. Las placas se incubaron a 37ºC durante toda la noche con
agitación humidificada continua a 260 rpm. Se replicó una muestra
de cada pocillo en una placa de filtro de 96 pocillos Millipore que
contenía 200 \muL/pocillo de medio de Urea-MOPS.
A continuación, se añadieron 50 \muL de glicerol al 45% a cada
pocillo de las placas de crecimiento iniciales, que a continuación
se almacenaron a -70ºC.
\newpage
Las placas de filtro se incubaron durante 4 días
a 37ºC con agitación humidificada continua a 260 rpm, para permitir
el crecimiento y la producción de enzimas. A continuación, se
filtraron las placas y se sometieron a ensayo de actividad de
hidrólisis usando un ensayo de hidrólisis de poliéster. Además, se
determinó la concentración extracelular de cutinasa usando un
ensayo de turbidez TCA, y se evaluó también la estabilidad térmica
en detergente de lavado.
Los ensayos usados para caracterizar las
variantes enzimáticas incluyeron los siguientes sistemas de
ensayo.
Este ensayo de hidrólisis de poliéster vigila la
liberación de fragmentos que contienen tereftalato procedentes de
la hidrólisis enzimática de poliéster insoluble (tereftalato de
polietileno o PET). Los fragmentos tienen una absorbancia
significativa a aproximadamente 240-250 nm.
Se usaron sustratos de poliéster PET insoluble
en forma de muestras de tejido (Dacron 54 de Testfabrics) o polvo
de resina PET (catálogo # 138 de Scientific Polymer Products,
pulverizado criogénicamente a un tamaño de partícula < 400
\mum). Las muestras de PET en polvo se colocaron en un dispositivo
dispensador (V&P Scientific), para distribuir aproximadamente
18 mg de muestras uniformes en los pocillos de placas convencionales
de ensayo de 96 pocillos. Cuando se usaron muestras de tela PET, se
cortaron piezas circulares de 15,9 mm de la tela y se colocaron en
las placas de ensayo de 12 pocillos.
Para el ensayo de hidrólisis de polvo de PET, se
prepararon dos placas, una que contenía polvo de PET y una sin
sustrato. Cada uno de los 96 pocillos de las dos placas de ensayo
recibió 200 \muL de un tampón de reacción que contenía Tris 50 mM
de pH 8,6 y Brij-35 al 0,01% (Sigma
#430AG-6). La placa sin sustrato de PET se usó como
un blanco de ensayo.
Se añadieron 20 \mul de cada muestra de
variante enzimática a pocillos apropiados en cada una de las dos
placas de ensayo. Ambas placas de ensayo se sellaron con selladores
de placa (Marsh). La placa de ensayo que contenía la muestra de PET
se colocó en una incubadora cubierta a 40ºC, y se incubó la placa
durante 18 horas con agitación a 250 rpm. La placa de ensayo
cubierta en blanco se mantuvo a temperatura ambiente.
Después de incubación, se transfirieron muestras
de 180 \muL de cada pocillo de la placa del sustrato de PET a una
placa de filtro con un dispositivo pipeteador de 12 canales. Los
extremos de las pipetas se retiraron cortando para evitar la
obstrucción con polvo de PET. Cada muestra de la placa de filtro de
PET se filtró en un pocillo de una nueva placa de ensayo de 96
pocillos.
A continuación se transfirieron 100 \mul de
cada pocillo de la placa de sustrato y la placa en blanco a una
placa transparente a UV, y se determinó la absorbancia de cada
muestra en un lector de placas a 250 nm. La absorbancia de los
pocillos de la placa en blanco sin sustrato se restó de los pocillos
correspondientes en la placa de ensayo con sustrato de PET.
Se añadieron 20 \muL del sobrenadante de
cultivo filtrado a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de base
plana que contenía 100 \muL/pocillo de agua purificada. Se
determinó la dispersión de la luz/absorbancia a 410 nm usando modo
de mezclado de 5 segundos en un lector de placas para determinar los
valores de blanco de línea de base. A continuación, se añadieron
100 \muL de TCA al 15% p/v a cada pocillo antes de incubar la
placa durante entre 5 y 30 minutos a temperatura ambiente. Se
determinó la dispersión de la luz/absorbancia causada por
precipitación de proteínas a 410 nm usando un lector de placas
ajustado para modo de mezclado de 5 segundos.
Los resultados se calcularon restando la lectura
en blanco, que no contenía TCA, de las lecturas de muestras con
TCA. Se determinó que los resultados de la dispersión de la
luz/absorbancia eran lineales con respecto a las concentraciones de
enzimas presentes en las muestras, permitiendo así la representación
directa de la concentración frente al rendimiento enzimático según
se muestra en la Figura 2. La Figura 2 muestra los resultados
obtenidos a partir de cepa de hospedador no transformada
(PE-1), tres transformantes de cutinasa de tipo
salvaje (PE-2 a PE-4) y un control
negativo, transformado con un gen de celulasa (BCE). Se observa una
buena correlación entre actividad de hidrólisis de poliéster y la
señal de TCA. Estas gráficas ayudan a facilitar la identificación y
selección de variantes con actividad hidrolítica elevada.
Las Figuras 3 y 4 proporcionan datos de dos
genotecas de saturación de sitios que implican posiciones de
aminoácidos Leu 168 (Genoteca A) y Phe 194 (Genoteca B). Según se
indica, los controles de tipo salvaje caen a lo largo de la misma
línea de actividad-concentración; la línea mostrada
corresponde al mejor ajuste de estos puntos de datos calculados
usando regresión lineal. Las gráficas muestran también que las
variantes se sitúan por encima, por debajo y a lo largo de esta
línea, lo que significa mejor, peor o similar actividad específica
con respecto a los controles de tipo salvaje. Además, según se
indica en las gráficas, la genoteca de la posición 194 exhibe más
diversidad y más variantes mejoradas que la genoteca de la posición
168.
Se realizaron ensayos de estabilidad para
determinar la termoestabilidad de las variantes en un medio
detergente. La estabilidad de las variantes obtenidas del
procedimiento de mutagénesis de saturación de sitios se determinó
añadiendo 10 \muL de muestras de la placa de filtro en cada
pocillo de dos placas de 96 pocillos que contenían 200
\muL/pocillo de detergente líquido (1,6 g/L, dureza 6,3 gpg). Las
2 placas se mezclaron, y una placa se mantuvo en hielo o en un baño
de agua y hielo (placa sin tensión) mientras que la segunda placa se
incubó en un baño de agua a 40ºC durante 10 minutos (placa con
tensión térmica). La placa con tensión se transfirió a un baño de
agua y hielo, y se realizaron ensayos de actividad de esterasa en
las dos placas según se describe más adelante. Las muestras de
cutinasa de tipo salvaje también se trataron como anteriormente para
comparación con las variantes.
El ensayo de actividad de enzimas usado en estos
experimentos se basa en la escisión de butirato de
p-nitrofenilo (pNB) incoloro con esterasa en
presencia de agua para producir butirato y
p-nitrofenolato de color amarillo. El ensayo se
realizó usando un tampón de ensayo que contenía Tris 100 mM de pH
8,0 y Triton X-100 al 0,1% (v/v). La reserva de
sustrato fue butirato de p-nitrofenilo 100 mM en
DMSO, preparada añadiendo 174,3 \muL de pNB a 10 mL de DMSO. La
reserva de sustrato se dividió en partes alícuotas de 1 mL y se
almacenó a -20ºC hasta su uso.
El procedimiento de ensayo de pNB fue el
siguiente: se diluyó reserva de sustrato (400 \muL) en 40 mL de
tampón de ensayo para cada par de placas de ensayo. A continuación,
se añadieron 200 \muL de esta solución de sustrato diluida a cada
pocillo de placas convencionales de 96 pocillos. Las placas se
equilibraron a 25ºC, y se inició la reacción añadiendo 10 \muL de
la solución de enzimas/detergente a partir de una placa con tensión
o sin tensión. Se mezcló la placa y se introdujo en el lector de
placas y se inició la adquisición de datos. Se determinó la
velocidad de la actividad (\DeltamAU_{410}/minuto). La velocidad
de reacción de pNB es proporcional a la concentración de la enzima
activa. Para cada pocillo, se calculó la fracción de enzima activa
después de tensión usando la fórmula siguiente:
Fracción activa
= (actividad pNB con tensión-blanco)/(actividad de
pNB sin
tensión-blanco)
Se representó gráficamente la fracción de enzima
activa después de tensión frente a la actividad de pNB de la enzima
sin tensión para cada variante, según se muestra en las Figuras 5 y
6, que ilustran los resultados para genotecas de saturación de
sitios en posiciones de aminoácidos Leu 168 (Genoteca A) y Phe 194
Genoteca B). Los resultados mostrados en las Figuras 5 y 6 muestran
variantes termoestables que tienen actividad de pNB sin tensión, y
también identifican algunas variantes que tienen termoestabilidad
aparentemente elevada sólo porque la actividad de pNB es demasiado
baja para producir una proporción precisa. Las Figuras 5 y 6
demuestran adicionalmente que mutaciones en sitios diferentes
producen diferentes propiedades enzimáticas. Por ejemplo, la
genoteca mostrada en la Figura 5 produjo sólo algunas variantes
prometedoras con actividad mayor que el tipo salvaje, mientras que
la genoteca mostrada en la Figura 6 produjo un número de variantes
con actividad considerablemente mayor que la enzima de tipo
salvaje.
Los resultados del ensayo de TCA, el ensayo de
hidrólisis de PET y el ensayo de estabilidad se analizaron usando
fórmulas convencionales conocidas según se exponen anteriormente,
usando software Excel^{TM}. Las variantes se calificaron y
ordenaron según la estabilidad y la actividad de hidrólisis. La
Tabla 1 muestra los resultados obtenidos del procedimiento de
mutagénesis de saturación de sitios descrito en este Ejemplo. Los
resultados se calificaron y codificaron por colores del modo
siguiente: verde = más del 2% de las variantes en los sitios
enumerados tenían una actividad significativamente mayor que el
control (mutación beneficiosa); azul = la mayoría de las variantes
tenían actividad sin cambios (mutación neutra); rojo = la mayoría de
las variantes tenían actividad significativamente reducida con
respecto al control (mutación perjudicial); y marrón =
aproximadamente la mitad de las variantes tenían actividad sin
cambios y la mitad tenían una actividad reducida (mutación neutra).
Se repitió la codificación por colores usando los mismos colores y
los mismos criterios porcentuales para resultados de estabilidad.
Según se indica en la Tabla 1, la codificación por colores
identifica fácilmente aquellas variantes que tienen las dos
propiedades enzimáticas deseadas.
Verde 2 = más del 2% de los
clones tenían una actividad significativamente mayor que el
control). Azul 3 = la mayoría no tuvieron cambios.
Rojo 4 = la mayoría tenían actividad
significativamente reducida con respecto al control. Marrón
5 = aproximadamente la mitad no tenían cambios y en
la mitad estaba reducida.
El cribado secundario para repetir las genotecas
anteriores y crear genotecas nuevas se realizó usando las variantes
que tenían propiedades beneficiosas, según se muestra en la Tabla 1.
Se estriaron las muestras de reserva de glicerol congeladas para
cada variante mejorada en medios apropiados y se incubó para obtener
colonias únicas. Las colonias de cada variante se inocularon en
tubos que contenían 3 mL de medio LB y se agitó a 37ºC durante 6 a
18 horas.
A continuación, se combinaron 800 \muL de
caldo de cada tubo incubado con 400 \muL de glicerol al 45% y se
almacenó a -70ºC. Se centrifugó 1 mL de caldo, se eliminó el
sobrenadante, y se almacenó el sedimento a -20ºC para secuenciación
de ADN.
A continuación, se pipetearon 100 \muL de cada
caldo en múltiples replicados en una placa de 96 pocillos. Se
replicó una muestra de cada pocillo en una placa de filtro que
contenía 200 \muL/pocillo de medio de MOPS-Urea.
Se dejó que las muestras presentes en las placas de filtro crecieran
durante 4 días a 37ºC con agitación humidificada a 260 rpm. Se
filtraron las placas y se realizaron los ensayos de TCA, hidrólisis
de PET y estabilidad descritos anteriormente. Los resultados se
calcularon según se describe anteriormente, y se agruparon las
muestras de las variantes de más alto rendimiento. La concentración
de enzimas en la muestra agrupada se determinó por
SDS-PAGE usando densitometría o LC/MS usando una
cutinasa marcada en 15N de tipo salvaje estándar. Las variantes se
sometieron a ensayo de actividad sobre tela de poliéster en tampón y
en detergente. Los resultados se muestran en la Tabla 2, que
enumera el sitio y la sustitución realizados para variantes con
estabilidad elevada. La Tabla 3 indica las variantes con hidrólisis
de poliéster (PET) mejorada. Las últimas siete variantes
F180-S205 mostradas en la Tabla 2 representan una
segunda genoteca según se creó en la etapa 14 de la Figura 1
(usando la variante S205G como plantilla), que muestra dos
mutaciones beneficiosas que mejoran enormemente la estabilidad
relativa de estas siete variantes. En la Tabla 3 se indica también
una serie de variantes con dos mutaciones.
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\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los datos de la Tabla 3 se obtuvieron comparando
muestras de las variantes que tenían las mutaciones indicadas con
cutinasa de tipo salvaje. Estas comparaciones se realizaron usando
concentraciones de enzimas iguales en el "cribado terciario"
(es decir, hidrólisis durante toda la noche de pedazos de tela de
poliéster Dacron 54 de 15,9 mm en placas de 12 pocillos mantenidas
a 40ºC). En estos experimentos se usó detergente líquido de lavado
a una concentración estándar en la industria.
En las Figuras 15 y 16 se muestran gráficamente
las mejoras en las propiedades de las variantes de segunda
generación cuando se someten a ensayo en un entorno de detergente.
La Figura 15 indica que la variante de segunda generación tiene un
aumento de tres veces en la actividad en comparación con el tipo
salvaje cuando se representa frente a la concentración de enzimas.
La Figura 16 muestra que la termoestabilidad de la variante de
segunda generación está aumentada enormemente en comparación con el
tipo salvaje.
Un resumen de los resultados del procedimiento
de la presente invención incluye los resultados del procedimiento
de cribado inicial mostrados en la Tabla 1. La Tabla 1 proporciona
una lista de sitios en los que las mutaciones produjeron variantes
que tenían al menos alguna actividad de poliesterasa y alguna
estabilidad: Adicionalmente, la Tabla 1 muestra que las mutaciones
en los siguientes sitios produjeron variantes que tenían más del 2%
de los clones con mayor actividad que los controles: sitios
77-79, 192-196, 219, 223 y 225. Las
mutaciones en los siguientes sitios que dieron como resultado
variantes que tenían más del 2% de los clones con estabilidad mayor
que los controles incluyen sitios 73, 78, 164, 191, 194 y 196. Los
siguientes sitios que representan variantes con actividad y
estabilidad mejoradas incluyen sitios 78, 194, 196 y 225. Los clones
se seleccionaron basándose en los sitios prometedores mostrados en
la Tabla 1, y el cribado secundario se realizó repitiendo las
genotecas anteriores y creando genotecas nuevas en sitios nuevos que
se esperaba que fueran beneficiosos.
Las Tablas 2 y 3 representan, respectivamente,
etapas de cribado de estabilidad secundario y etapas de cribado de
actividad terciario que usaban los clones seleccionados
identificados durante el cribado primario como plantillas. Las
Tablas 2 y 3 identifican las mutaciones realizadas en los sitios
seleccionados e incluyen combinaciones de mutaciones. Las
sustituciones de serina en las posiciones 34 y 99 representan la
creación de nuevas genotecas en nuevos sitios de los que se espera
que sean beneficiosos.
La Tabla 2 muestra que la sustitución de
fenilalanina en el sitio 194 por isoleucina, leucina, asparaginas o
prolina produjo variantes que tenían estabilidad mejorada en
comparación con el tipo salvaje; la sustitución de glicina en el
sitio 73 por fenilalanina, lisina, leucina o valina produjo
variantes con estabilidad mejorada en comparación con el tipo
salvaje. Las sustituciones de fenilalanina en el sitio 194 en
combinación con sustituciones de serina en el sitio 219 produjeron
variantes con estabilidad relativa significativamente mejorada.
Según se indica en la Tabla 3, las sustituciones
específicas en de uno a tres sitios produjeron variantes con
actividad mejorada de poliesterasa.
Se examinaron los resultados de cribado
calificados (cambios de aminoácidos que produjeron mejora, perjuicio
o resultado neutro) en el contexto de la posición dentro de la
proteína para elucidar cualquier tendencia de base estructuralmente
subyacente. Los resultados se muestran en negrita superpuestos en
los mapas de la estructura de la proteína, según se muestra en las
Figuras 7 a 14. Los resultados también se codificaron por colores
(no mostrado) usando los mismos colores usados en la Tabla 1. La
Figura 7 muestra la cara del sito activo de triada catalítica (en
negrita) de la cutinasa de Pseudomonas mendocina (Ser 140,
Asp 190, His 220). La Figura 8 muestra la adición de los
aminoácidos objetivos iniciales (en negrita) que se usaron para el
procedimiento de mutagénesis de barrido de saturación de sitios. La
Figura 9 muestra los sitios (en negrita) que dieron lugar a al
menos el 2% de las variantes que tenían actividad de hidrólisis de
poliéster significativamente mejorada. La Figura 10 muestra los
sitios de variantes (en negrita) en que la mayoría de mutaciones no
tuvieron efecto sobre la actividad. La Figura 11 muestra los sitios
de variantes (en negrita) en que la mayoría de las mutaciones
tuvieron generalmente un efecto perjudicial en la actividad. La
Figura 12 muestra los sitios de variantes (en negrita) que dieron
lugar a al menos el 2% de las variantes que tenían estabilidad
significativamente mejorada. La Figura 13 muestra los sitios de
variantes (en negrita) en que la mayoría de las mutaciones
generalmente no tuvieron efecto en la estabilidad. La Figura 14
muestra los sitios de variantes (en negrita) en que la mayoría de
las mutaciones generalmente no tuvieron efectos perjudiciales en la
estabilidad.
Las Figuras 7 a 14 relacionan las variantes con
la estructura, sugiriendo con ello sitios de modificación
adicionales. Por ejemplo, en los ejemplos mostrados, los sitios
perjudiciales suelen estar ocultos en los mapas de actividad y
estabilidad y confinados generalmente a los mismos lugares. Los
sitios de mejora para actividad y estabilidad suelen ocupar lugares
similares dentro de la estructura de la proteína. Los sitios sin
efecto también ocupan posiciones similares dentro de la estructura
de proteína para resultados de actividad y estabilidad.
\vskip1.000000\baselineskip
El número de clon
PE051-2-A2, que tiene mutaciones
F194P-S219G, se sometió a mutagénesis adicional de
saturación de sitios para crear mutaciones adicionales según se
describe en el Ejemplo 1. La Tabla 4 enumera el sitio y la
sustitución realizada para variantes con estabilidad elevada en
comparación con la variante progenitora. La Tabla 5 enumera el
sitio y la sustitución realizada para variantes con actividad
elevada en comparación con la variante progenitora.
Los procedimientos descritos en la presente
memoria descriptiva encuentran uso en la ingeniería de proteínas
con propiedades potenciadas para su uso en campos distintos de las
modificaciones textiles según se describe anteriormente. Dichos
campos incluyen, pero no se limitan a, atención sanitaria, alimentos
y alimentación, fabricación de cerveza, cosmética, agricultura,
textiles, detergentes, conversión de residuos ambientales,
procesamiento de biopulpa, conversión de biomasa a combustible y
otros procedimientos químicos. De hecho, los procedimientos
encuentran uso en la mejora de proteínas para cualquier
aplicación.
No se pretende que los ejemplos anteriores sean
limitativos, y se pretende que el procedimiento se aplique a la
mutagénesis de cualquier proteína. Para aquellas proteínas en las
que no existen mapas tridimensionales disponibles y sólo se conoce
la secuencia de aminoácidos, el procedimiento puede efectuarse
comparando la secuencia conocida con otras secuencias que son
homólogas. Usando este procedimiento, los sitios disímiles o sitios
con importancia funcional sospechada se mutan porque los sitios no
conservados generalmente están disponibles más fácilmente para
alojar sustituciones de aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
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mutagénesis de alta productividad
\vskip0.400000\baselineskip
<130> SJK/FP6240899
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 03744218.3
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-03-05
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US03/06908
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-03-05
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 10/091.912
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-03-05
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 10/092.227
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-03-05
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/362.372
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-03-05
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/403.921
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-08-15
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4,0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 818
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas mendocina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 273
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas mendocina
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (9)
1. Variante de cutinasa que comprende una
sustitución de uno o más aminoácidos en posiciones de residuo que
corresponden a los sitios 34, 73, 75, 77, 78, 79, 80, 99, 164,
191-196, 219, 223 y 225 de cutinasa de
Pseudomonas mendocina ID SEC Nº: 2, en la que dicha variante
de cutinasa es termoestable y tiene actividad hidrolítica sobre
poliéster.
2. Variante de cutinasa según la reivindicación
1, en la que dicha variante comprende las sustituciones de Phe 194
por Pro, Ser 219 por Gly y una o más sustituciones adicionales
seleccionadas entre las posiciones de aminoácidos 54, 78, 81, 191,
196, 200, 204, y 263.
3. Variante de cutinasa según la reivindicación
2 en la que:
- a)
- la posición de aminoácido 54 está sustituida por Ser, Glu o Thr; o
- b)
- la posición de aminoácido 78 está sustituida por Val; o
- c)
- la posición de aminoácido 81 está sustituida por Ser; o
- d)
- la posición de aminoácido 191 está sustituida por Asn o His; o
- e)
- la posición de aminoácido 196 está sustituida por Leu o Ala; o
- f)
- la posición de aminoácido 200 está sustituida por Leu; o
- g)
- la posición de aminoácido 204 está sustituida por Leu; o
- h)
- la posición de aminoácido 263 está sustituida por Pro.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Variante de cutinasa según la reivindicación
1, en la que dicha variante de cutinasa tiene actividad de
poliesterasa.
5. Variante de cutinasa según la reivindicación
4, en la que dicha variante de cutinasa tiene estabilidad
incrementada en comparación con cutinasa de tipo salvaje y
comprende
- a)
- la sustitución de Gly 73 por un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Phe, Lys, Leu y Val; o
- b)
- la sustitución de Thr 191 por un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en His, Leu y Tyr; o
- c)
- la sustitución de Thr 78 por un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Ala, Leu y Val; o
- d)
- la sustitución de Tyr 164 por Phe; o
- e)
- la sustitución de Tyr 196 por un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Ala, Leu y Pro; o
- f)
- la sustitución de Phe 194 y la sustitución de Ser 219; o
- g)
- la sustitución de Ala 80 por Glu.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Variante de cutinasa según la reivindicación
5(f), en la que dicho Phe 194 está sustituido por un
aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Ala, His,
Lys, Leu, Asn, Pro y Gly; y en la que dicho Ser 219 está sustituido
por Gly.
7. Variante de cutinasa según la reivindicación
6, en la que dicha variante de cutinasa tiene actividad incrementada
de poliesterasa en comparación con cutinasa de tipo salvaje.
8. Variante de cutinasa según la reivindicación
4, en la que dicha variante de cutinasa tiene actividad incrementada
de poliesterasa en comparación con cutinasa de tipo salvaje y
comprende
- a)
- la sustitución de Phe 194 por Ile; o
- b)
- la sustitución de Phe 194 por un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Lys y Leu, y la sustitución de Ser 219 por Gly; o
- c)
- la sustitución de Phe 194 por Asn; o
- d)
- la sustitución de Phe 194 por un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Asn, Pro y Ser, y la sustitución de Ser 219 por Gly; o
- e)
- la sustitución de Gly 73 por un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Phe y Leu; o
- f)
- la sustitución de Gly 75 por un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Asp y Glu; o
- g)
- las siguientes sustituciones Ile 192 por Met; Phe 194 por Val; y Ser 219 por Gly; o
- h)
- la sustitución de Ser 219 por Asn, y sustitución de Phe 221 por Leu; o
- i)
- la sustitución de Ser 99 por Lys; o
- j)
- la sustitución de Thr 191 por un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en His, Leu y Tyr; o
- k)
- la sustitución de Thr 78 por Leu; o
- l)
- la sustitución de Tyr 196 por un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Ala y Pro; o
- m)
- la sustitución de Arg 204 por Leu; o
- n)
- la sustitución de Leu 263 por Pro.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Variante de cutinasa según la reivindicación
4, en la que dicha variante de cutinasa tiene estabilidad
incrementada en comparación con cutinasa de tipo salvaje y
comprende
- a)
- la sustitución de Phe 194 por un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Ile, Leu, Asn y Pro; o
- b)
- la sustitución de Arg 204 por Leu; o
- c)
- la sustitución de Leu 263 por Pro.
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