JP5867984B2 - 修飾プロテアーゼ - Google Patents
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Description
本発明は修飾プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド及び微生物のプロテアーゼ生産を変更するための方法を提供する。特に本発明は、バチルス属のような微生物のプロテアーゼ発現を変更する方法に関する。本発明は修飾ポリヌクレオチド、ベクター、修飾ポリペプチド、及びプロテアーゼ生産を高めるための方法を開示する。
バチルス属のメンバーであるグラム陰性微生物等の微生物は培地中に発酵生成物を分泌する能力を有することから、発酵工業において大規模に用いられている。分泌されたタンパク質は細胞膜及び細胞壁を通過して、外部の培地に運ばれる。細胞周辺部又は培地へのポリペプチドの分泌は、発酵工業において、注意深く考慮しなければならない各種パラメーターの影響を受ける。
即ち、異種ポリペプチドの分泌は工業的に広く用いられている技術である。通常、所望の異種ポリペプチドをコードしている核酸で、細胞を形質転換して、発現させ、所望のポリペプチドを大量に生産する。この技術は大量のポリペプチドを生産するために用いられている。所望のポリペプチドの発現及び分泌は所望のタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを遺伝子的に操作して制御する。タンパク質生産方法における各種利益があるにも関わらず、細胞外にタンパク質を分泌させるための効果的な方法について、未だ需要が存在する。
本発明は修飾プロテアーゼをコードしている修飾ポリヌクレオチド及び微生物中でプロテアーゼ生産を変更する方法に関する。特に、本発明はバチルス属のような微生物において、プロテアーゼの生産を変更する方法に関する。
本発明は所望のタンパク質を多く生産するように遺伝子的に操作されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び細胞に関する。特に、本発明は外来核酸配列を導入されたグラム陽性微生物及びバチルス属のメンバーのような宿主細胞中で、タンパク質を生産するための方法に関する。より具体的には、本発明は細胞を遺伝子的に操作して、プロテアーゼの生産及び発現されたタンパク質の生産能力が変更されている細胞に関する。特に、本発明は微生物によるプロテアーゼ生産を高める方法を提供する。
幾つかの態様において、本発明は修飾された完全長プロテアーゼをコードする単離され修飾されたポリペプチドを提供する。完全長プレカーサープロテアーゼのプロ領域をコードするポリペプチド配列は、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）５、１３、及び２４４の２８乃至１０８及び１０９の位置のアミノ酸から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換をコードしている変異を含む。幾つかの態様において、修飾された完全長プロテアーゼはセリンプロテアーゼである。この完全長プレカーサープロテアーゼのプロ領域をコードしているポリヌクレオチド配列の部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、及び２４４のアミノ酸位置２８乃至１０８及び１０９に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置の置換をコードしている変異を含む。他の態様において、この完全長プロテアーゼは野生型又は変異プレカーサーアルカリセリンプロテアーゼ由来のアルカリセリンプロテアーゼである。この完全長プレカーサープロテアーゼのプロ領域をコードしているポリヌクレオチド配列の部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、及び２４４のアミノ酸位置２８乃至１０８及び１０９に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置の置換をコードしている変異を含む。更なる他の態様において、この完全長プロテアーゼは野生型又はバチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）又はバチスルレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）アルカリセリンプロテアーゼの野生型又はこれら由来の変異プレカーサーアルカリセリンプロテアーゼである。この完全長プレカーサープロテアーゼのプロ領域をコードするポリヌクレオチド配列の部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、及び２４４の２８乃至１０８及び１０９のアミノ酸位置に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸の置換をコードしている変異を含む。幾つかの態様において、単離された修飾ポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、９、又は２４０で定義されたポリヌクレオチド配列を含む。
幾つかの態様において、本発明は修飾された完全長プロテアーゼをコードしている単離された修飾ポリヌクレオチドを提供する。完全長プレカーサーのプロ領域をコードしているポリヌクレオチド配列の部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、及び２４４の２８乃至１０８及び１０９のアミノ酸位置に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置における置換をコードする変異を含む。この少なくとも１つの置換はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、又は２４４のＥ３３、Ｅ４３、Ａ４４、Ｅ４７、Ｖ４９、Ｅ５７、Ａ５９、Ｅ６３、Ｅ７０、Ｅ７４、Ｅ８４、及びＥ８８から選択される１つのアミノ酸位置である。幾つかの他の態様において、Ｅ３３のアミノ酸置換は、Ｅ３３Ｄ、Ｅ３３Ｉ、Ｅ３３Ｓ、Ｅ３３Ｎ、Ｅ３３Ｋ、Ｅ３３Ｈ、Ｅ３３Ｑ及びＥ３３Ｒから選択される。更なる態様において、Ｅ５７のアミノ酸置換は、Ｅ５７Ｆ、Ｅ５７Ｗ、Ｅ５７Ｋ、Ｅ５７Ｒ、Ｅ５７Ｄ、Ｅ５７Ｍ、Ｅ５７Ｃ、Ｅ５７Ｑ、Ｅ５７Ｓ、Ｅ５７Ｈ、及びＥ５７Ｎから選択される。
幾つかの態様において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、及び２４４の２８乃至１０８及び１０９のアミノ酸位置に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置における置換をコードするために変異されたプレカーサープロ配列を含む単離された修飾ポリヌクレオチドを提供する。幾つかの追加的な態様において、変異領域を含んでいる完全長プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを更に含む。このプロテアーゼの変異領域をコードするポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１６、又は２４７対して少なくとも約７０％同一である。
幾つかの態様において、本発明は修飾された完全長プロテアーゼをコードしている修飾されたポリヌクレオチドを含む、少なくとも１つのベクターを提供する。この完全長プレカーサープロテアーゼのプロ領域をコードしているポリヌクレオチド配列の部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、及び２４４の２８乃至１０８及び１０９のアミノ酸位置に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置での置換をコードしている変異、あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、及び２４４の２８乃至１０８及び１０９のアミノ酸位置に等しい位置における置換をコードするために変異されたプレカーサープロ配列を含む単離された修飾ポリヌクレオチドを含む。
他の態様において、本発明は本発明の修飾されたポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。幾つかの好適な態様において、この形質転換された宿主細胞は微生物である。例えば、幾つかの態様において、本発明は修飾された完全長プロテアーゼをコードしている修飾ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのベクターで形質転換させた宿主細胞を提供する。ここにおいて、この完全長プレカーサープロテアーゼのプロ領域をコードしているポリヌクレオチド配列の部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、及び２４４の２８乃至１０８及び１０９のアミノ酸位置に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置での置換をコードしている変異、又はあるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、及び２４４の２８乃至１０８及び１０９のアミノ酸位置に等しい位置における置換をコードするために変異されたプレカーサープロ配列を含む単離された修飾ポリヌクレオチドを含む。幾つかの態様において、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞は微生物であり、バチスル属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）からなる群より選択される。
幾つかの態様において、本発明は本発明の形質転換された宿主細胞により生産されたプロテアーゼを提供する。
本発明は微生物中で異種プロテアーゼを生産するための方法を提供する。この方法は（ａ）バチルス宿主細胞を、好適な条件下で培養する工程、（ここにおいて、このバチルス宿主細胞は修飾プロテアーゼをコードしている修飾ポリヌクレオチドを含む。）及び（ｂ）この微生物によりプロテアーゼを生産させる工程を含む。幾つかの態様において、このバチルス宿主細胞により生産されたプロテアーゼは回収される。本明細書において提供される修飾されたポリヌクレオチドのいずれかが本発明の方法に用いられる。
幾つかの態様において、本発明は微生物中で異種アルカリセリンプロテアーゼを生産する方法を提供する。この方法は（ａ）バチルス宿主細胞を、好適な条件したで培養する工程、（ここにおいて、このバチルス宿主細胞は修飾プロテアーゼをコードしている修飾ポリヌクレオチドを含む。）及び（ｂ）この微生物によりプロテアーゼを生産させる工程を含む。本発明は微生物中で異種プロテアーゼを生産する方法も提供する。この方法は（ａ）バチルス宿主細胞を、好適な条件下で培養する工程、（ここにおいて、このバチルス宿主細胞はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１６、又は２４７に少なくとも７０％相同な変異領域を含む修飾プロテアーゼをコードしている修飾ポリヌクレオチドを含む。）及び（ｂ）この微生物によりプロテアーゼを生産する工程を含む。幾つかの態様において、このバチルス宿主細胞により生産されたプロテアーゼは回収される。
幾つかの態様において、本発明は微生物中で異種プロテアーゼを生産する方法を提供する。この方法は（ａ）バチルス宿主細胞を、好適な条件下で培養する工程、ここにおいて、このバチルス宿主細胞はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、及び２４４の２８乃至１０８及び１０９のアミノ酸位置に等しい位置から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置での置換をコードしている変異を含むプロ領域を含む修飾プロテアーゼをコードしている修飾ポリヌクレオチドを含む、工程、及び（ｂ）この微生物によりプロテアーゼを生産させる工程を含む。他の態様において、この少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｅ３３Ｄ、Ｅ３３Ｉ、Ｅ３３Ｓ、Ｅ３３Ｎ、Ｅ３３Ｋ、Ｅ３３Ｈ、Ｅ３３Ｑ、Ｅ３３Ｒ、Ｅ５７Ｆ、Ｅ５７Ｗ、Ｅ５７Ｋ、Ｅ５７Ｒ、Ｅ５７Ｄ、Ｅ５７Ｍ、Ｅ５７Ｃ、Ｅ５７Ｑ、Ｅ５７Ｓ、Ｅ５７Ｈ、及びＥ５７Ｎから選択される。
本発明はバチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）プロテアーゼ又はバチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）プロテアーゼである異種プロテアーゼを微生物中で生産する方法も提供する。この方法はバチルスレンタス宿主細胞を好適な条件で培養する工程であって、このバチルス宿主細胞は修飾されたプロテアーゼをコードしている修飾されたポリヌクレオチドを含んでいる、工程、及び（ｂ）この微生物によりプロテアーゼを生産させる工程を含む。
本発明は微生物において異種プロテアーゼを生産する方法も提供する。この方法はバチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスステアロセレモフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスアルカロフィリス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｈｉｌｕｓ）、バチルスハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルスコアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルスサーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスプミラス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルスツリンジェンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群より選択されるバチルス宿主細胞を好適な条件下で培養する工程、ここにおいてこのバチルス宿主細胞は修飾されたプロテアーゼをコードしている修飾されたポリヌクレオチドを含む、工程、及び（ｂ）この微生物によりプロテアーゼを生産させる工程を含む。幾つかの態様において、この宿主細胞はバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞である。
本発明は微生物中で異種プロテアーゼを生成するための方法も提供する。この方法は（ａ）好適な条件下でバチルス宿主細胞を培養する工程であって、バチルス宿主細胞が修飾されたプロテアーゼをコードする修飾ポリヌクレオチドを含む、工程、及びこの微生物によりプロテアーゼを生産させる工程を含む。前記異種プロテアーゼは少なくとも１の生産比を有する。
図１Ａバチルスクラウシ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）からの野生型プロテアーゼの完全長ポリヌクレオチド配列を示す。プロテアーゼのプロ領域をコードする配列の部分は太字で示す。
図１Ｂ、Ｃ、及びＤはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の完全長バチルスクラウシプロテアーゼのシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、プロ領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）及び成熟形態（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）をそれぞれコードしているポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、３、及び４）を示す。
図２Ａはバチルスクラウシ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）からの野生型プロテアーゼの完全長ポリヌクレオチド配列を示す。このプロテアーゼのプロ領域をコードする配列の部分は太字で示す。
図２Ｂ、Ｃ、及びＤはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の完全長バチルスクラウシのシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、プロ領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、及び成熟形態（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）をそれぞれコードしているポリヌクレオチド配列を示す。
図３はバチルスクラウシからの変異プロテアーゼＶ０４９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）の完全長ポリヌクレオチド配列を示す。このプロテアーゼのプロ領域をコードしている配列の部分を太字で示す。
図３Ｂ、Ｃ、及びＤは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のバチルスクラウシプロテアーゼ完全長のシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、プロ領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、及び成熟形態（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）をそれぞれコードしているポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１１、及び１２）を示す。
図４Ａはバチルスクラウシ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）からの変異プロテアーゼＶ０４９の完全長ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）を示す。このプロテアーゼのプロ領域をコードしている配列の部分を太字で示す。
図４Ｂ、Ｃ、及びＤはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の完全長バチルスクラウシプロテアーゼ変異体のシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、プロ領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、及び成熟形態（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）をそれぞれコードしているポリペプチド配列を示す。
図５はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のバチルスクラウシ野生型セリンプロテアーゼのアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のバチルスクラウシセリンプロテアーゼ、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４のバチルスレンタスセリンプロテアーゼのアミノ酸配列のアラインメントを示す。異なるアミノ酸は下線で示す。
図６はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の変異野生型セリンプロテアーゼを含むｐＸＸ−０４９プラスミドのマップを提供する。
図７Ａ乃至Ｄは本発明に用いるｐＸＸ−Ｖ０４９プラスミドベクター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）のポリヌクレオチド配列を示す。
図８Ａはバチルスレンタスからのプロテアーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４０）の完全長ポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４０）を示す。プロテアーゼのプロ領域をコードしている配列の部分を太字で示す。
図８Ｂ、Ｃ、及びＤはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４のバチルスレンタスプレカーサープロテアーゼのシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４５）、プロ領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４６）、及び成熟形態（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７）をそれぞれコードしているポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４１、２４２、２４３）を示す。
図９ＡはバチルスクラウシのＧＧ３６変異プロテアーゼの完全長ポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４）を示す。このプロテアーゼのプロ領域をコードしている配列の部分を太字でしめす。
図９Ｂ、Ｃ、及びＤはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４の完全長バチルスレンタスのシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４５）、プロ領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４６）、及び成熟形態（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７）をそれぞれコードしているポリペプチド配列を示す。
本発明は修飾プロテアーゼをコードしている修飾ポリヌクレオチド及び微生物中のプロテアーゼ生産を修飾する方法に関する。特に本発明はバチルス属のような微生物中でプロテアーゼ生産を修飾する方法に関する。本発明は、修飾されたポリヌクレオチド、ベクター、修飾されたポリペプチド、及びプロテアーゼの生産を高めるための方法を開示する。
本発明は修飾されたポリヌクレオチドによりコードされる修飾されたプロテアーゼのほかに、変異されたプロ領域を有するプロテアーゼをコードしている修飾されたポリヌクレオチド、及びこれらを生産する方法を提供する。この修飾されたプロテアーゼポリヌクレオチドは微生物中での修飾プロテアーゼの発現、及び対応するプレカーサープロテアーゼよりも高いレベルの変異形態を生成するのに好適である。生成されたプロテアーゼは工業的な酵素の生産、洗浄、動物飼料、及びテキスタイル処理工業を含むがこれらに限定されない各種工業で利用される。本発明はこれらの酵素を生産する方法も提供する。幾つかの好適な態様において、本発明のプロテアーゼは精製された又はある程度精製された形態である。
特に定義しない限り、本発明の実施には、分子生物学、微生物学、タンパク質生成、タンパク質工学、タンパク質及びＤＮＡ配列決定、及び修飾ＤＮＡ分野における当業者の知識の範囲内である従来技術が用いられている。そのような技術は当業者によく知られており、多くのテキスト及び学術論文に記載されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第二版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、［１９８９］）；及びＡｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」［１９８７］参照）。本明細書において言及されている前述及び後述の全ての特許、特許出願、文献、及び 刊行物は参照により本明細書に援用される。
特に定義しない限り、本明細書で用いられている技術的及び科学的用語は本発明の属する分野における当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第二版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ, ＮＹ（１９９４）；及びＨａｌｅ ａｎｄ Ｍａｒｋｈａｍ, ＴＨＥ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ, Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ, ＮＹ（１９９１）は本発明に用いる用語の一般的な説明を当業者に提供する。本明細書で開示されているものと同様又は類似したものは本発明の実施に用いることができるけれども、好適な方法及び物質を本明細書に記載する。即ち、以下で定義されている用語は明細書全体を参照することによってより充分に理解される。本明細書において、「１つ」（“ａ”, “ａｎ”）及び「この」（“ｔｈｅ”）は特に定義しない限り、複数も含むものとする。数値範囲はこの範囲を定義している数を含む。特に定義しない限り、核酸は左から右に向かって５’から３’方向に記載する。アミノ酸配列は左から右に向かって、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって記載する。当業者が用いる文脈によりそれらは変更することができるので、本発明を開示されている特定の方法論、手順、及び試薬に限定することは理解されないことは理解されるであろう。
更に、本明細書における表題は本発明の側面又は態様を限定するためのものではなく、それらは明細書全体を参照することにより理解されるだろう。従って、以下で定義されている用語は明細書全体を理解することにより、より完全に理解されるであろう。しかしながら、発明の理解の促進のために、多くの用語を以下で定義する。
定義
定義
「修飾プロテアーゼ」は完全長「プレカーサープロテアーゼ」のアミノ酸配列由来のアミノ酸配列を有する完全長プロテアーゼである。このプレカーサープロテアーゼは「修飾されたプロテアーゼ」と定義される。この修飾されたプロテアーゼはプロ領域においてプレカーサープロテアーゼとは異なる。このプレカーサープロテアーゼは自然発生、即ち、野生型プロテアーゼでもよいし、変異プロテアーゼでもよい。これは野生型又は変異プロテアーゼを生成するために修飾された変異プロテアーゼのプロ領域である。この修飾されたプロテアーゼのアミノ酸配列は、このプレカーサーアミノ酸配列のプロ領域の１つまたはそれ以上のアミノ酸配列の置換、欠失、又は挿入によるプレカーサープロテアーゼアミノ酸配列から「誘導された」ものである。好適な態様において、このプレカーサープロテアーゼのプロ領域の１つまたはそれ以上のアミノ酸を置換して修飾されたプロテアーゼを生成する。そのような修飾はプレカーサー自体を操作するよりも、むしろプレカーサープロテアーゼのアミノ酸配列をコードしている「プレカーサーＤＮＡ配列」を操作する。この修飾されたプロテアーゼはプレカーサープロテアーゼのプロ領域の任意の１つのアミノ酸残基において、１９個の自然発生アミノ酸の任意の置換を包含している。この文脈において、「修飾された」及び「プレカーサー」プロテアーゼの語は、シグナルペプチド、プロ領域、及び成熟領域を含む完全長プロテアーゼである。この修飾された配列をコードしているポリヌクレオチドは「修飾されたポリヌクレオチド」と言われ、このプレカーサープロテアーゼをコードしているポリヌクレオチドは「プレカーサーポリヌクレオチド」である。「プレカーサーポリペプチド」及び「プレカーサーポリヌクレオチド」はそれぞれ「未修飾プレカーサーポリペプチド」又は「未修飾プレカーサーポリヌクレオチド」と互換的に用いられる。
「自然発生」又は「野生型」は、自然界で見られるものと同一な、ポリペプチド又は未修飾アミノ酸配列を有するプロテアーゼをコードしているポリヌクレオチドを意味する。自然発生酵素は天然酵素、自然界で発現されている酵素、又は特に微生物において見られる酵素を意味する。野生型又は自然発生配列は変異体の基礎となる配列を意味する。この野生型配列は相同又は異種タンパク質のいずれかをコードしている。
本明細書において、「変異体」の語は、Ｃ及びＮ末端のいずれか又は両方に１つ以上のアミノ酸を付加すること、アミノ酸配列における異なる部位の１つ又は複数において、１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、タンパク質のいずれか又は両方の末端又はアミノ酸配列の１つ又はそれ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の欠失、及び／又はアミノ酸配列の１つ以上の部位における１つ又はそれ以上のアミノ酸の挿入により対応する野生型タンパク質とは異なるタンパク質プレカーサーを意味する。本発明の文脈における変異体タンパク質の代表例としては、自然発生タンパク質マキサカール（Ｍａｘａｃａｌ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）の変異体であるバチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）プロテアーゼＶ０４６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）がある。この変異体のプレカーサープロテインは野生型又は変異体タンパク質でよい。
本明細書において「〜に等しい」の語は、タンパク質又はペプチドの列挙された位置における残基、又はタンパク質又はペプチドにおける列挙された残渣に異種、相同、又は対応する残基を意味する。
プロテアーゼについて用いる「生産」の語は、１．タンパク質の分泌間に発生すると知られているシングルペプチドの除去、及び２．酵素の活性成熟形態を生じる及び成熟過程の間に生じると知られているタンパク質の除去を含む、完全長タンパク質の２つのプロセス工程を包含する（Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：３１６５−３１７１（１９９８）；Ｐｏｗｅｒら、 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ８３：３０９６-３１００（１９８６））。
成熟プロテアーゼについて用いる「処理された」の語は、完全長タンパク質、例えば、プロテアーゼが活性成熟酵素になるために受ける成熟過程を意味する。
「活性比」及び「生産の比」は、未修飾プロテアーゼから処理された成熟プロテアーゼの酵素活性に対する、修飾されたプロテアーゼから処理された成熟プロテアーゼの酵素活性の比を意味する。
「完全長タンパク質」の語は、遺伝子の一次的遺伝子産物及びシングルペプチド、プロ配列、及び成熟配列を含むものを意味する。
「シグナル配列」又は「シグナルペプチド」の語は、タンパク質の成熟又はプレカーサー形態の分泌に関係している核酸及び／又はアミノ酸の任意の配列を意味する。シグナル配列の定義は、タンパク質の分泌の遂行に参加している、タンパク質遺伝子のＮ末端部分によりコードされている全てのアミノ酸配列を含む、機能的なものを意味する。
「プロ配列」又は「プロ領域」の語は、シグナル配列及びプロテアーゼの分泌／生産について必要な成熟プロテアーゼの間のアミノ酸配列を意味する。プロ配列の切断が成熟活性プロテアーゼとなる。例示のために、本発明のプロテアーゼのプロ領域は少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、又は２４４の２８乃至１１１の残基に等しいアミノ酸配列を含む。
「成熟形態」又は「成熟領域」の語はタンパク質の最終的な機能部分を意味する。例示のために、本発明のプロテアーゼの成熟形態は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、又は２４４の１１２乃至３８０の残基に等しいアミノ酸配列を含む。この文脈において、「成熟形態」は完全長プロテアーゼの「処理された」形態である。この完全長プロテアーゼのプロセシングはシグナルペプチド及びプロ領域の除去を包含する。
本明細書において、「異種タンパク質」の語は、宿主細胞に自然的には発生しないタンパク質又はポリペプチドを意味する。同様に、「異種ポリヌクレオチド」の語は、宿主細胞中に自然発生的には生じないポリヌクレオチドを意味する。
本明細書において、「相同タンパク質」の語は、天然の又は宿主細胞中に自然発生するタンパク質又はポリペプチドを意味する。同様に、「相同ポリヌクレオチド」の語は天然又は細胞中に自然発生するポリヌクレオチドを意味する。
本明細書において、「プロモーター」の語は、下流遺伝子の直接転写に機能する核酸配列を意味する。好適な態様において、このプロモーターは発現される標的遺伝子がある宿主細胞に適している。プロモーターは他の転写及び転写調節核酸配列（制御配列とも言われる）と共に、遺伝子の発現に必要である。通常、転写及び転写調節配列は、プロモーター配列、リボゾーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列、及びエンハンサー又は活性配列を含むがこれらに限定されない。
核酸配列が他の核酸配列に機能的に関係する位置にある場合、この核酸は作動可能に結合していると言われる。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を与えているならば、コード配列に作動可能に結合していると言い、又はリボゾーム結合部位は翻訳を促進するような位置にあるならば、コード配列に作動可能に結合していると言う。通常、「作動可能」の語はリンクされているＤＮＡ配列が隣接していることを意味する。
本明細書において、「プロテアーゼ」及び「タンパク質分解活性」の語は、ペプチド又はペプチド結合を有する基質を加水分解する能力を有するタンパク質又はペプチドを意味する。タンパク質分解活性を測定するための多くの既知の方法が存在する（Ｋａｌｉｓｚ、 「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ」、Ｉｎ：Ｆｉｅｃｈｔｅｒ（ｅｄ．）、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，［１９９８］）。例えば、タンパク質分解活性は市販の基質を加水分解する生成されたプロテアーゼの能力を比較評価することにより評価することができる。プロテアーゼ又はタンパク質分解活性のそのような解析に有用な市販の基質はジメチルカゼイン（シグマＣ−９８０１）、ボバインコラーゲン（シグマＣ−９８７９）、ボバインエラスチン（シグマＥ−１６２５）、及びバイオケミカル９０２１１１）を含むがこれらに限定されない。これらの基質に用いる呈色アッセイは本分野でよく知られている（例えば、ＷＯ ９９／３４０１１及びＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，３７６，４５０参照、これらの文献を参照により本明細書に援用する）。ＡＡＰＦアッセイ（例えば、Ｄｅｌ Ｍａｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９９：３１６−３２０［１９７９］参照）も成熟プロテアーゼの生成を評価するのに用いることができる。このアッセイは、可溶性合成基質である、スクシニル−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド（ｓＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を酵素が加水分解してｐ−ニトロアニリンを放出する速度を測定する。この加水分解からの黄色生成の速度が吸光光度計の４１０ｎｍで測定され、活性酵素濃度に比例している。
本明細書において、「バチルス属」の語は、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスステアロセレモフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアリカロフィリス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスハロヂュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスコアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルスサーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスレンタス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、及びバチルスツリンジェネシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を含むがこれらに限定されない、バチルス属であると当業者に知られている全ての種を含む。バチルス属は分類学上の再編性を受け続けていることは理解されている。従って、この属は、現在は「ゲオバチルスステアロセレモフィリス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」と呼ばれているバチルスステアロセレモフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のような微生物を含むがこれらに限定されない。アリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アンフィバチルス（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィロバチルス（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、グラシリバチルス（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハロバチルス（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サリバチルス（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、セレモバチルス（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ウレイバチルス（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びビリバチルス（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）と呼ばれている属にもあてはまるが、酸素の存在下で、耐性内胞子の生産はバチルス属の特徴であると考えられている。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」の語は本明細書において互換的に使用されており、任意の長さの核酸の重合形態を意味する。これらの語は、一本鎖、二本鎖、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はプリン又はピリミジンベースを含むポリマー、又は他の天然、化学的、生物学的に修飾された、非天然又は誘導化されたヌクレオチドベースを含むがこれらに限定されない。ポリヌクレオチドの非限定的な例は、任意配列の遺伝子、遺伝子断片、ＥＳＴ、エキソンン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボゾーム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、及び単離されたＤＮＡ、任意配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーを含むがこれらに限定されない。
本明細書において、「ＤＮＡ構築体」及び「形質転換ＤＮＡ」の語は互換的に宿主細胞又は微生物へ配列を導入するために用いるＤＮＡを意味する。このＤＮＡはＰＣＲ又は当分野において知られている他の好適な技術によりインビトロで生成される。特に好適な態様において、このＤＮＡ構築体は所望の配列（例えば、修飾された配列）を含む。幾つかの態様において、この技術は制御エレメント（例えば、プロモーター等）のような追加的なエレメントに作動可能に結合している。幾つかの態様において、このＤＮＡ構築体は宿主細胞染色体に相同な配列を含む。他の態様において、このＤＮＡ構築体は非相同配列を含む。一旦このＤＮＡ構築体がインビトロで構築されると、宿主細胞染色体の領域を変異体にさせるために用いる（即ち、異種配列で内性配列を置き換える）。
本明細書において、「ベクター」の語は１つ以上の細胞タイプへ核酸を導入するために設計されたポリヌクレオチド構築体を意味する。ベクターはクローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、及びプラスミドを含む。幾つかの態様において、このポリヌクレオチド構築体は完全長プロテアーゼをコードしているＤＮＡ配列（例えば、修飾されたプロテアーゼ又は未修飾プレカーサープロテアーゼ）を含む。
本明細書において、「プラスミド」の語はクローニングベクターとして用いられる環状二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築体であり、幾つかの真核又は原核生物において染色体外自己複製異伝エレメントを形成するか、又は染色体に取り込まれるものを意味する。
細胞へ核酸配列を導入することに用いる、「導入された」の語は、細胞内へ核酸配列を輸送するための任意の好適な方法を意味する。導入のためのそのような方法はプロトプラスト融合、トランスフェクション、接合、及びトランスダクションを含むがこれらに限定されない（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉら、「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」ｉｎ Ｈａｒｄｗｏｏｄら編、Ｂａｃｉｌｌｕｓ． Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．、５７−７２頁、［１９８９］参照）。
本明細書において、「形質転換された」及び「安定に形質転換された」の語は、ゲノムに挿入された又は少なくとも２世代にわたり維持されているエピソームプラスミドとして非天然（異種の）のポリヌクレオチド配列を有する細胞を意味する。
本発明はアミノ酸配列をコードしている、修飾プロテアーゼをコードしている単離された修飾ポリヌクレオチドを提供する。修飾されたプロテアーゼはプレカーサープロテアーゼのポリヌクレオチドを変異させることにより得られる。具体的には、プレカーサープロテアーゼのプロ領域をコードしているポリヌクレオチドの１つ又はそれ以上を変異させて本発明の修飾されたポリヌクレオチドを提供する。
本発明は修飾されたプロテアーゼをコードしているポリヌクレオチド、及び微生物中でプロテアーゼの生産を変えるための方法に関する。特に、本発明はバチルス属のような、微生物中でプロテアーゼの生産を変える方法に関する。本発明は修飾されたポリヌクレオチド、ベクター、修飾されたポリペプチド、プロテアーゼの生産を高めるための方法に関する。
幾つかの態様において、本発明は、野生型あるいは動物、植物、又は微生物の変異プレカーサープロテアーゼ由来の修飾プロテアーゼをコードしている修飾されたポリヌクレオチドを提供する。微生物由来のプレカーサープロテアーゼをコードしているポリヌクレオチドが好ましく、野生型プレカーサープロテアーゼ及び野生型由来の変異プレカーサープロテアーゼをコードしているポリヌクレオチドを含む。幾つかの態様において、本発明の修飾されたポリヌクレオチドは微生物由来のプレカーサープロテアーゼをコードしているポリペプチド由来である。本発明はプレカーサーをタンパク質工学的にコードしているポリヌクレオチド由来の修飾されたプロテアーゼをコードしているポリヌクレオチドを包含する。セリンプロテアーゼをコードしているポリヌクレオチドが好適なプレカーサープロテアーゼポリヌクレオチドであり、アルカリ微生物プロテアーゼポリヌクレオチドが特に好ましい。セリンプロテアーゼは活性部位におけるセリン残基を必須とする、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素である。セリンプロテアーゼは約２５，０００乃至３０，０００の範囲の分子量を有する（Ｐｒｉｅｓｔ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．，４１：７１１−７５３［１９７７］参照）。幾つかの好適な態様において、スブチリシン及びスブチリシン変異体をコードしているポリヌクレオチドが好適なプレカーサーセリンプロテアーゼポリヌクレオチドである。幾つかの態様において、本発明は、バチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）及びバチルスハロヂュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）等の微生物のポリヌクレオチド由来の修飾されたプロテアーゼをコードしているポリヌクレオチドを包含する。スブチリシンをコードしている各種バチルスポリヌクレオチドが同定され、配列決定されており、例としては、スブチリシン１６８、スブチリシンＢＰＮ’、スブチリシンカールスバッグ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、スブチリシンＤＹ、スブチリシン１４７、及びスブチリシン３０９がある（例えば、ＥＰ４１４２７９Ｂ；ＷＯ８９／０６２７９；及びＳｔａｈｌら、 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５９：８１１−８１８［１９８４］参照；各文献を参照により本明細書に援用する）。本発明の幾つかの態様において、変異（例えば、変異体）プロテアーゼポリヌクレオチドはタンパク質をコードしているプレカーサーポリヌクレオチドとして提供され、本発明の修飾されたプロテアーゼが提供される。変異プロテアーゼの例は多くの文献において見られる（例えば、ＷＯ９９／２０７７０；ＷＯ９９／２０７２６；ＷＯ９９／２０７６９；ＷＯ８９／０６２７９；ＲＥ３４，６０６；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，９１４，０３１；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，９８０，２８８；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，２０８，１５８；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，３１０，６７５；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，３３６，６１１；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，３９９，２８３；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，４４１，８８２；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，４８２，８４９；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，６３１，２１７；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，６６５，５８７； Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，７００，６７６；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，７４１，６９４；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，８５８，７５７；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，８８０，０８０；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，１９７，５６７；及びＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，２１８，１６５；各文献を参照により本明細書に援用する）。他の態様において、本発明に包含されるポリヌクレオチドは市場において入手可能なプロテアーゼをコードしているポリヌクレオチド由来の修飾されたポリヌクレオチドを含む。例えば、市場において入手可能なプロテアーゼはＡＬＣＡＬＡＳＥ（商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）、ＰＲＩＭＡＳＥ（商標）、ＤＵＲＡＬＡＳＥ（商標）、ＥＳＰＥＲＡＳＥ（商標）、及びＫＡＮＮＡＳＥ（商標）、（ノボノルディクスＡＪＳ）、ＭＡＸＡＴＡＳＥ（商標）、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（商標）、及びＰＵＲＡＦＥＣＴ ＯＸＰ（商標）（ジェネンコーインターナショナルインク）を含むがこれらに限定されない。幾つかの態様において、本発明はバチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）からのプレカーサープロテアーゼをコードしているポリヌクレオチド由来である修飾ポリヌクレオチドを含む。他の態様において、本発明はバチルスレンタスからのプレカーサープロテアーゼをコードしているポリヌクレオチド由来である修飾されたポリヌクレオチドを包含する。
幾つかの態様において、本発明の修飾された完全長ポリヌクレオチドは変異されてプレカーサープロテアーゼのプロ領域をコードしている配列を含む。任意の好適なプレカーサープロテアーゼのプロ領域をコードしているポリヌクレオチド配列は本発明の１つ以上の修飾されたポリヌクレオチドの生成に用いることができる。幾つかの好適な態様において、プロ領域をコードしているプレカーサーポリヌクレオチド配列の部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、又は２４４のプロテアーゼの１乃至１０９の位置に等しい位置において１つ以上のアミノ酸置換をコードするように変異させられている。幾つかの態様において、この修飾されたプレカーサーポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、又は２４４のＥ３３、Ｅ４３、Ａ４４、Ｅ４７、Ｖ４９、Ｅ５７、Ａ５９、Ｅ６３、Ｅ７０、Ｅ７４、Ｅ８４、及びＥ８８に等しい位置におけるプロ領域に少なくとも１つのアミノ酸置換をコードしている。幾つかの態様において、Ｅ３３に等しい位置におけるアミノ酸をコードしているポリヌクレオチド配列はＥ３３Ｄ、Ｅ３３Ｉ、Ｅ３３Ｓ、Ｅ３３Ｎ、Ｅ３３Ｋ、Ｅ３３Ｈ、Ｅ３３Ｑ、又はＥ３３Ｒをコードするように変異させられている。他の態様において、Ｅ５７に等しい位置でアミノ酸をコードしているポリヌクレオチド配列はＥ５７Ｆ、Ｅ５７Ｗ、Ｅ５７Ｋ、Ｅ５７Ｒ、Ｅ５７Ｄ、Ｅ５７Ｍ、Ｅ５７Ｃ、Ｅ５７Ｑ、Ｅ５７Ｓ、Ｅ５７Ｈ、及び／又はＥ５７Ｎの１つをコードするように変異されている。
幾つかの態様において、プレカーサーバチルスクラウシ（Ｂ． ｃｌａｕｓｉｉ）プロテアーゼポリヌクレオチド（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）は野生型プロテアーゼ（ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）をコードしている。
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＡＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＧＴＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＴＧＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＧＣＡＣＴＡＣＴＣＡＴＴＴＣＴＧＴＴＧＣＴＴＴＴＡＧＴＴＣＡＴＣＧＡＴＣＧＣＡＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＡＡＴＴＧＧＣＴＴＴＡＡＴＧＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＴＧＴＣＡＧＴＧＡＧＴＴＴＧＴＡＧＡＡＣＡＡＧＴＡＧＡＧＧＣＡＡＡＴＧＡＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＡＴＴＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＧＡＡＡＴＴＧＡＡＴＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＴＧＡＡＡＣＧＡＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＡＴＣＣＧＴＴＧＡＧＴＴＡＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＧＧＡＣＧＣＧＣＴＴＧＡＡＣＴＣＧＡＴＣＣＡＧＣＧＡＴＴＴＣＴＴＡＴＡＴＴＧＡＡＧＡＧＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＴＡＡＣＧＡＣＡＡＴＧＧＣＧＣＡＡＴＣＡＧＴＧＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＴＴＡＧＣＣＧＴＧＴＧＣＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＴＴＧＡＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＴＡＡＡＡＧＴＴＧＣＴＧＴＣＣＴＣＧＡＴＡＣＡＧＧＴＡＴＴＴＣＣＡＣＴＣＡＴＣＣＡＧＡＣＴＴＡＡＡＴＡＴＴＣＧＴＧＧＴＧＧＣＧＣＴＡＧＣＴＴＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＧＡＡＣＣＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＡＴＧＧＧＡＡＴＧＧＧＣＡＴＧＧＣＡＣＧＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＣＧＡＴＴＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＡＣＡＡＴＴＣＧＡＴＴＧＧＣＧＴＴＣＴＴＧＧＣＧＴＡＧＣＡＣＣＧＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＴＡＴＡＣＧＣＴＧＴＴＡＡＡＧＴＡＴＴＡＧＧＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＴＴＣＧＧＴＣＡＧＣＴＣＧＡＴＴＧＣＣＣＡＡＧＧＡＴＴＧＧＡＡＴＧＧＧＣＡＧＧＧＡＡＣＡＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＧＴＴＧＣＴＡＡＴＴＴＧＡＧＴＴＴＡＧＧＡＡＧＣＣＣＴＴＣＧＣＣＡＡＧＴＧＣＣＡＣＡＣＴＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＴＴＡＡＴＡＧＣＧＣＧＡＣＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＧＴＴＣＴＴＧＴＴＧＴＡＧＣＧＧＣＡＴＣＴＧＧＧＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＣＡＡＴＣＡＧＣＴＡＴＣＣＧＧＣＣＣＧＴＴＡＴＧＣＧＡＡＣＧＣＡＡＴＧＧＣＡＧＴＣＧＧＡＧＣＴＡＣＴＧＡＣＣＡＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＣＧＣＧＣＣＡＧＣＴＴＴＴＣＡＣＡＧＴＡＴＧＧＣＧＣＡＧＧＧＣＴＴＧＡＣＡＴＴＧＴＣＧＣＡＣＣＡＧＧＴＧＴＡＡＡＣＧＴＧＣＡＧＡＧＣＡＣＡＴＡＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＧＴＡＴＧＣＣＡＧＣＴＴＡＡＡＣＧＧＴＡＣＡＴＣＧＡＴＧＧＣＴＡＣＴＣＣＴＣＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＴＧＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＡＴＣＴＴＧＧＴＣＣＡＡＴＧＴＡＣＡＡＡＴＣＣＧＣＡＡＴＣＡＴＣＴＡＡＡＧＡＡＴＡＣＧＧＣＡＡＣＧＡＧＣＴＴＡＧＧＡＡＧＣＡＣＧＡＡＣＴＴＧＴＡＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＣＴＴＧＴＣＡＡＴＧＣＡＧＡＡＧＣＧＧＣＡＡＣＡＣＧＣＴＡＡ
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（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
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他の態様において、プレカーサーバチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）プロテアーゼポリヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）は変異プロテアーゼ（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）をコードしている。
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
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他の態様において、プレカーサープロテアーゼポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４のプロテアーゼＧＧ３６をコードしている、バチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）ポリヌクレオチド（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４０）である。
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４０）
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（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４）
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幾つかの態様において、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の完全長プレカーサーポリヌクレオチド由来の修飾された完全長ポリヌクレオチドを提供する。
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のポリヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸１乃至２７に及ぶシグナル配列ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）を発現時にコードしている配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸前記２８乃至１１１に及びプロ領域配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）をコードしているＮ末端プロ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸残基１１２乃至３８０をコードしている成熟セリンプロテアーゼ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）（少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のプロテアーゼのシグナルペプチドの初めの８個のアミノ酸をコードしているポリヌクレオチド配列は、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｐｒＥプロテアーゼの初めの８個のアミノ酸をコードしている配列である。
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
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（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
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（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
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（ＳＥＱ ＩＳ ＮＯ：１１）
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（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
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（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
ＡＱＳＶＰＷＧＩＳＲＶＱＡＰＡＡＨＮＲＧＬＴＧＳＧＶＫＶＡＶＬＤＴＧＩＳＴＨＰＤＬＮＩＲＧＧＡＳＦＶＰＧＥＰＳＴＱＤＧＮＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＡＬＮＮＳＩＧＶＬＧＶＡＰＮＡＥＬＹＡＶＫＶＬＧＡＳＧＳＧＳＶＳＳＩＡＱＧＬＥＷＡＧＮＮＶＭＨＶＡＮＬＳＬＧＬＱＡＰＳＡＴＬＥＱＡＶＮＳＡＴＳＲＧＶＬＷＡＡＳＧＮＳＧＡＧＳＩＳＹＰＡＲＹＡＮＡＭＡＶＧＡＴＤＱＮＮＮＲＡＳＦＳＱＹＧＡＧＬＤＩＶＡＰＧＶＮＶＱＳＴＹＰＧＳＴＹＡＳＬＮＧＴＳＭＡＴＰＨＶＡＧＡＡＡＬＫＱＫＮＰＳＷＳＮＶＱＩＲＮＨＬＫＮＴＡＴＳＬＧＳＴＮＬＹＧＳＧＬＶＮＡＥＡＡＴＲ
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他の態様において、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の野生型完全長ポリヌクレオチド由来の修飾された完全長ポリヌクレオチドを提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のポリヌクレオチドは発現時にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸１乃至２７をコードしているシグナル配列ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）をコードする配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸前記２８乃至１１１をコードしているＮ末端プロ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）（即ち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸残基１１２乃至３８０をコードしている野生型成熟セリンプロテアーゼ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）（即ち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を含む。
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
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（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
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（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
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（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
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（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
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（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
ＲＶＱＡＰＡＡＨＮＲＧＬＴＧＳＧＶＫＶＡＶＬＤＴＧＩＳＴＨＰＤＬＮＩＲＧＧＡＳＦＶＰＧＥＰＳＴＱＤＧＮＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＡＬＮＮＳＩＧＶＬＧＶＡＰＮＡＥＬＹＡＶＫＶＬＧＡＳＧＳＧＳＶＳＳＩＡＱＧＬＥＷＡＧＮＮＧＭＨＶＡＮＬＳＬＧＳＰＳＰＳＡＴＬＥＱＡＶＮＳＡＴＳＲＧＶＬＷＡＡＳＧＮＳＧＡＧＳＩＳＹＰＡＲＹＡＮＡＭＡＶＧＡＴＤＱＮＮＮＲＡＳＦＳＱＹＧＡＧＬＤＩＶＡＰＧＶＮＶＱＳＴＹＰＧＳＴＹＡＳＬＮＧＴＳＭＡＴＰＨＶＡＧＡＡＡＬＶＫＱＫＮＰＳＷＳＮＶＱＩＲＮＨＬＫＮＴＡＴＳＬＧＳＴＮＬＹＧＳＧＬＶＮＡＥＡＡＴＲ
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他の態様において、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４０の変異完全長プレカーサーポリヌクレオチド由来の修飾された完全長ポリヌクレオチドを提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４０のポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４のアミノ酸１乃至２７をコードするシグナル配列ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４５）を発現時にコードすることとなる配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４の２８乃至１１１のアミノ酸残基をコードしているＮ末端プロ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４２）（即ち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４６）、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４のアミノ酸残基１１２乃至３８０をコードしている野生型成熟セリンプロテアーゼ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４３）（即ち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７）を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４のプレカーサープロテアーゼのシグナルペプチドの初めの８個のアミノ酸をコードしているポリヌクレオチド配列はバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｐｒＥプロテアーゼの初めの８個のアミノ酸をコードしている配列である。このプロ部分及びＧＧ３６プレカーサーの成熟部分はＧＧ３６野生型配列によりコードされる。
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４１）
ＧＴＧＡＧＡＡＧＣＡＡＡＡＡＡＴＴＧＴＧＧＡＴＣＧＴＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＧＣＡＣＴＡＣＴＣＡＴＴＴＣＴＧＴＴＧＣＴＴＴＴＡＧＴＴＣＡＴＣＧＡＴＣＧＣＡＴＣＧＧＣＴ
ＧＴＧＡＧＡＡＧＣＡＡＡＡＡＡＴＴＧＴＧＧＡＴＣＧＴＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＧＣＡＣＴＡＣＴＣＡＴＴＴＣＴＧＴＴＧＣＴＴＴＴＡＧＴＴＣＡＴＣＧＡＴＣＧＣＡＴＣＧＧＣＴ
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４５）
ＭＲＳＫＫＬＷＩＶＡＳＴＡＬＬＩＳＶＡＦＳＳＳＩＡＳＡ
ＭＲＳＫＫＬＷＩＶＡＳＴＡＬＬＩＳＶＡＦＳＳＳＩＡＳＡ
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４２）
ＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＡＡＴＴＧＧＣＴＴＴＡＡＴＧＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＴＧＴＣＡＧＴＧＡＧＴＴＴＧＴＡＧＡＡＣＡＡＧＴＡＧＡＧＧＣＡＡＡＴＧＡＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＡＴＴＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＧＡＡＡＴＴＧＡＡＴＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＴＧＡＡＡＣＧＡＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＡＴＣＣＧＴＴＧＡＧＴＴＡＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＧＧＡＣＧＣＧＣＴＴＧＡＡＣＴＣＧＡＴＣＣＡＧＣＧＡＴＴＴＣＴＴＡＴＡＴＴＧＡＡＧＡＧＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＴＡＡＣＧＡＣＡＡＴＧ
ＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＡＡＴＴＧＧＣＴＴＴＡＡＴＧＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＴＧＴＣＡＧＴＧＡＧＴＴＴＧＴＡＧＡＡＣＡＡＧＴＡＧＡＧＧＣＡＡＡＴＧＡＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＡＴＴＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＧＡＡＡＴＴＧＡＡＴＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＴＧＡＡＡＣＧＡＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＡＴＣＣＧＴＴＧＡＧＴＴＡＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＧＧＡＣＧＣＧＣＴＴＧＡＡＣＴＣＧＡＴＣＣＡＧＣＧＡＴＴＴＣＴＴＡＴＡＴＴＧＡＡＧＡＧＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＴＡＡＣＧＡＣＡＡＴＧ
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４６）
ＡＥＥＡＫＥＫＹＬＩＧＦＮＥＱＥＡＶＳＥＦＶＥＱＶＥＡＮＤＥＶＡＩＬＳＥＥＥＥＶＥＩＥＬＬＨＥＦＥＴＩＰＶＬＳＶＥＬＳＰＥＤＶＤＡＬＥＬＤＰＡＩＳＹＩＥＥＤＡＥＶＴＴＭ
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（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４３）
ＧＣＧＣＡＡＴＣＡＧＴＧＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＴＴＡＧＣＣＧＴＧＴＧＣＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＴＴＧＡＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＴＡＡＡＡＧＴＴＧＣＴＧＴＣＣＴＣＧＡＴＡＣＡＧＧＴＡＴＴＴＣＣＡＣＴＣＡＴＣＣＡＧＡＣＴＴＡＡＡＴＡＴＴＣＧＴＧＧＴＧＧＣＧＣＴＡＧＣＴＴＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＧＡＡＣＣＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＡＴＧＧＧＡＡＴＧＧＧＣＡＴＧＧＣＡＣＧＣＡＴＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＧＡＴＴＧＣＴＧＣＴＣＴＡＡＡＣＡＡＴＴＣＧＡＴＴＧＧＣＧＴＴＣＴＴＧＧＣＧＴＡＧＣＧＣＣＧＡＧＣＧＣＧＧＡＡＣＴＡＴＡＣＧＣＴＧＴＴＡＡＡＧＴＡＴＴＡＧＧＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＴＣＧＧＴＣＡＧＣＴＣＧＡＴＴＧＣＣＣＡＡＧＧＡＴＴＧＧＡＡＴＧＧＧＣＡＧＧＧＡＡＣＡＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＧＴＴＧＣＴＡＡＴＴＴＧＡＧＴＴＴＡＧＧＡＡＧＣＣＣＴＴＣＧＣＣＡＡＧＴＧＣＣＡＣＡＣＴＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＴＴＡＡＴＡＧＣＧＣＧＡＣＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＧＴＴＣＴＴＧＴＴＧＴＡＧＣＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＣＡＡＴＣＡＧＣＴＡＴＣＣＧＧＣＣＣＧＴＴＡＴＧＣＧＡＡＣＧＣＡＡＴＧＧＣＡＧＴＣＧＧＡＧＣＴＡＣＴＧＡＣＣＡＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＣＧＣＧＣＣＡＧＣＴＴＴＴＣＡＣＡＧＴＡＴＧＧＣＧＣＡＧＧＧＣＴＴＧＡＣＡＴＴＧＴＣＧＣＡＣＣＡＧＧＴＧＴＡＡＡＣＧＴＧＣＡＧＡＧＣＡＣＡＴＡＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＧＴＡＴＧＣＣＡＧＣＴＴＡＡＡＣＧＧＴＡＣＡＴＣＧＡＴＧＧＣＴＡＣＴＣＣＴＣＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＴＧＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＡＴＣＴＴＧＧＴＣＣＡＡＴＧＴＡＣＡＡＡＴＣＣＧＣＡＡＴＣＡＴＣＴＡＡＡＧＡＡＴＡＣＧＧＣＡＡＣＧＡＧＣＴＴＡＧＧＡＡＧＣＡＣＧＡＡＣＴＴＧＴＡＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＣＴＴＧＴＣＡＡＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＴＴＡ
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（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７）
ＡＱＳＶＰＷＧＩＳＲＶＱＡＰＡＡＨＮＲＧＬＴＧＳＧＶＫＶＡＶＬＤＴＧＩＳＴＨＰＤＬＮＩＲＧＧＡＳＦＶＰＧＥＰＳＴＱＤＧＮＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＡＬＮＮＳＩＧＶＬＧＶＡＰＳＡＥＬＹＡＶＫＶＬＧＡＳＧＳＧＳＶＳＳＩＡＱＧＬＥＷＡＧＮＮＧＭＨＶＡＮＬＳＬＧＳＰＳＰＳＡＴＬＥＱＡＶＮＳＡＴＳＲＧＶＬＷＡＡＳＧＮＳＧＡＧＳＩＳＹＰＡＲＹＡＮＡＭＡＶＧＡＴＤＱＮＮＮＲＡＳＦＳＱＹＧＡＧＬＤＩＶＡＰＧＶＮＶＱＳＴＹＰＧＳＴＹＡＳＬＮＧＴＳＭＡＴＰＨＶＡＧＡＡＡＬＶＫＱＫＮＰＳＷＳＮＶＱＩＲＮＨＬＫＮＴＡＴＳＬＧＳＴＮＬＹＧＳＧＬＶＮＡＥＡＡＴＲ
ＡＱＳＶＰＷＧＩＳＲＶＱＡＰＡＡＨＮＲＧＬＴＧＳＧＶＫＶＡＶＬＤＴＧＩＳＴＨＰＤＬＮＩＲＧＧＡＳＦＶＰＧＥＰＳＴＱＤＧＮＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＡＬＮＮＳＩＧＶＬＧＶＡＰＳＡＥＬＹＡＶＫＶＬＧＡＳＧＳＧＳＶＳＳＩＡＱＧＬＥＷＡＧＮＮＧＭＨＶＡＮＬＳＬＧＳＰＳＰＳＡＴＬＥＱＡＶＮＳＡＴＳＲＧＶＬＷＡＡＳＧＮＳＧＡＧＳＩＳＹＰＡＲＹＡＮＡＭＡＶＧＡＴＤＱＮＮＮＲＡＳＦＳＱＹＧＡＧＬＤＩＶＡＰＧＶＮＶＱＳＴＹＰＧＳＴＹＡＳＬＮＧＴＳＭＡＴＰＨＶＡＧＡＡＡＬＶＫＱＫＮＰＳＷＳＮＶＱＩＲＮＨＬＫＮＴＡＴＳＬＧＳＴＮＬＹＧＳＧＬＶＮＡＥＡＡＴＲ
好適な態様において、本発明の修飾された完全長ポリヌクレオチドは変異されたプレカーサープロテアーゼのプロ領域をコードする配列を含む。任意の好適なプレカーサーのプロ領域をコードしているポリヌクレオチド配列が本発明の１つ以上の修飾されたポリヌクレオチドの生成にもちいられる。幾つかの好適な態様において、プロ領域をコードしているプレカーサーポリヌクレオチド配列の部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のプロテアーゼの１乃至１０９の位置に等しい位置において１以上のアミノ酸置換をコードするために変異させられている。他の態様において、この置換はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のプロテアーゼの１乃至１０９の位置に等しい位置において生じている。更なる態様において、この置換はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４の１乃至１０９の位置に等しい位置においてなされている。幾つかの態様において、この修飾されたプレカーサーポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、２４４のＥ３３、Ｅ４３、Ａ４４、Ｅ４７、Ｖ４９、Ｅ５７、Ａ５９、Ｅ６３、Ｅ７０、Ｅ７４、Ｅ８４、及びＥ８８に等しい位置で少なくとも１つのアミノ酸置換をコードしている。幾つかの態様において、Ｅ３３に等しい位置でのアミノ酸コードしているポリヌクレオチド配列を変異させて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、又は２４４のＥ３３Ｄ、Ｅ３３Ｉ、Ｅ３３Ｓ、Ｅ３３Ｎ、Ｅ３３Ｋ、Ｅ３３Ｈ、Ｅ３３Ｑ、又はＥ３３Ｒの少なくとも１つの置換をコードさせる。幾つかの他の態様において、Ｅ５７に等しい位置におけるアミノ酸をコードしているポリヌクレオチド配列を変異させて、Ｅ５７Ｆ、Ｅ５７Ｗ、Ｅ５７Ｋ、Ｅ５７Ｒ、Ｅ５７Ｄ、Ｅ５７Ｍ、Ｅ５７Ｃ、Ｅ５７Ｑ、Ｅ５７Ｓ、Ｅ５７Ｈ、及び／又はＥ５７Ｎをコードさせる。
前述のように、幾つかの態様において、任意のプレカーサープロテアーゼをコードしているポリヌクレオチドを変異させて変異されてプロ領域を有する少なくとも１つの修飾されたプロテアーゼをコードしている少なくとも１つの修飾されたポリヌクレオチドを生成する。幾つかの特に好適な態様において、セリンプロテアーゼをコードしている完全長ポリヌクレオチドが本発明の修飾されたポリヌクレオチドの生成に用いられる。幾つかの代替的な特に好適な態様において、アルカリセリンプロテアーゼをコードしている完全長ポリヌクレオチドを用いる。前述のように、プレカーサープロテアーゼをコードしているポリヌクレオチドはバチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチスルスブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）及びバチルスハロヂュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）を含むがこれらに限定されない、微生物由来である。
幾つかの態様において、完全長修飾プロテアーゼをコードする本発明の修飾されたポリヌクレオチドはプレカーサープロテアーゼの成熟形態のアミノ酸配列に、少なくとも約６５％のアミノ酸配列の同一性、好ましくは少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは約８５％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも９０％アミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも９２％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、及び最も好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するプロテアーゼの成熟形体をコードしている配列を含み、プレカーサーポリペプチドに匹敵するかそれよりも高い生成活性を有する。幾つかの態様において、完全長修飾プロテアーゼをコードしている本発明の修飾ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７のアミノ酸配列に対して、少なくとも約６５％のアミノ酸配列の同一性、好ましくは少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは約８５％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも９０％アミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも９２％アミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％アミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％アミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性、及び最も好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するプロテアーゼの成熟形体をコードする配列を含む。
幾つかの態様において、修飾されたポリヌクレオチドはプレカーサープロテアーゼのアミノ酸配列に対して、約６５％までのアミノ酸配列の同一性、好ましくは約７０％までのアミノ酸配列同一性、より好ましくは約７５％までのアミノ酸配列同一性、更により好ましくは約８０％までのアミノ酸配列同一性、より好ましくは約８５％までのアミノ酸配列同一性、更により好ましくは９０％までのアミノ酸配列同一性、より好ましくは９２％までのアミノ酸配列同一性、更により好ましくは約９５％までのアミノ酸配列同一性、より好ましくは約９７％までのアミノ酸配列同一性、更により好ましくは約８０％までのアミノ酸配列同一性、及び最も好ましくは約９９％までののアミノ酸配列同一性を有する完全長アミノ酸配列をコードする。
当業者が理解しているように、遺伝子コードの退縮により、各種修飾されたポリヌクレオチドは修飾されたプロテアーゼをコードする。本発明の発明の幾つかの他の態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１２、又は２４３のポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の貼り絵ツ同一性、及び少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。
幾つかの態様において、ポリヌクレオチド配列により占められている配列同一性のパーセンテージは、配列を整列させて、分子間の配列情報を直接比較して、当業者に知られている方法にとり同一性を決定することにより行われる。幾つかの態様において、同一性のパーセンテージ（例えば、アミノ酸配列、核酸配列、及び／又は遺伝子配列）は、配列を整列させて、２つの分子間の配列情報を直接比較し、２つの整列させた配列の間の一致の正確な数をカウントし、より短い配列の長さで割り、得られた結果に１００を掛けて得られる。前述のものを含むこれらの改正に利用可能なコンピュータープロテアーゼを用いることができる。核酸配列同一性を決定するためのプログラムは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムにも依存している、例えば、Ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｌ）における、プログラムとして、ＢＥＳＴＦＩＴＦＡＳＴＡ及びＧＡＰプログラムがある。これらのプログラムは製造元の推奨するデフォルトパラメーターを用いることができ、前述のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅに記載されている。
配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの例としては、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載のＢＬＡＳＴアルゴリズムがある。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは全米バイオテクノロジー情報センター（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により利用可能である。このアルゴリズムは、第一に、データベース配列中の同じ長さのワードで整列させたときに、幾つかのポリティブ値のスレッシュホールドスコアに一致又は満足する、調査配列における長さＷのショートワードを同定することにより、ハイスコアリングシークエンシングペア（ＨＳＰｓ）を同定することを含む。これらの初期の隣接ワードヒットはそれらを含むより長いＨＳＰｓを見つけるためのスタートポイントとして作用する。このワードヒットは累積的なアラインメントスコアが増加される限り、それぞれの比較されている２つの配列の両方向へ広がる、このワードヒットの伸長はこの累積的なアラインメントスコアが最大達成値からＸぶんだけ落ちたとき、累積的スコアが０以下になったとき、又はいずれかの配列の末端に達したときに、停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、及びＸは感受性及び／又はアラインメントのスピードを決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは１１のワードレングス（Ｗ）、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５ （１９８９））、５０のアラインメント（Ｂ）、１０のエクスペクテーション（Ｅ）、Ｍ’５、Ｎ’−４、及び両鎖の比較を用いる。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはその後、２つの配列間の相同性の統計的解析を行う（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７［１９９３］）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによる同一性の測定は、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列がたまたま一致するという可能性があるということを示す、最合計見込み（Ｐ（Ｎ））である。例えば、セリンプロテアーゼ核酸に対する試験核酸の比較において、もし最小合計見込みが約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１未満であれば、本発明の核酸配列に相同であると言える。試験核酸がセリンプロテアーゼポリスプリットペプチドをコードしている場合、もし最小合計見込みが約０．５未満、及びより好ましくは約０．２未満となれば、特定のセリンプロテアーゼ核酸に類似であるといえる。
本発明の幾つかの態様において、配列はＢＬＡＳＴ及びタンパク質翻訳配列決定ツールにより解析される。幾つかの実験において、好適なバージョンはＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ＢＬＳＡＴ ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）である。選択されるプログラムは「ＢｌａｓｔＸ」であり、選択されるデーターベースは「ｎｒ」である。標準的なデフォルトパラメーター値を用いる。
部位変異誘発、スキャニング変異誘発、挿入変異誘発、欠失変異誘発、ランダム変異誘発、部位指定変異誘発、及び指向進化、並びに各種他の組換アプローチを含むがこれらに限定されない、本発明の修飾ポリヌクレオチド配列を生成するための方法は当分野で知られている。
幾つかの態様において、本発明の修飾されたポリヌクレオチド配列は少なくとも１つのコドンにおいて部位指定変異誘発で生成されてプロモーターのプロ領域をコードしている配列の修飾を含む。他の好適な態様において、部位指定変異誘発は２つ以上のコドンで行われる。幾つかの更なる態様において、修飾プロモーターのプロ領域をコードしている修飾ポリヌクレオチド配列は、プレカーサーポリペプチド、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１１、又は２４２のプロ領域をコードしているポリヌクレオチドに対して、約４０％まで、約４５％まで、約５０％まで、約５５％まで、約６０％まで、約６５％まで、約７０％まで、約７５％まで、約８０％まで、約８５％まで、約９０％まで、約９５％まで、約９８％まで、又は約９９％までの相同性を有している。幾つかの代替的な態様において、修飾されたポリヌクレオチドは例えば、照射、ニトロソグアニジン等の任意の既知の変異方法を用いて、インビボで生成される。所望の修飾ポリヌクレオチド配列が単離され、本発明の方法に用いる。
幾つかの好適な態様において、プレカーサープロテアーゼポリヌクレオチドのプロ領域の部位飽和変異誘発が変異プライマーを含む組成物を用いて行われる。変異プライマーはプレカーサーポリヌクレオチドに優先的に適合しない、そして、プライマー中のミスマッチがテンプレートポリヌクレオチドへの所望の変異を導入するために用いられる。プレカーサーポリヌクレオチドに優先的にマッチする非変異プライマーもこのプライマー組成物に含まれる。少なくとも１つの変異プライマーに対応する変異プライマー又は非変異プライマーを添加することにより、各種変異パターンが存在する核酸ライブラリーが生成される。例えば、変異核酸ライブラリーのメンバーの幾つかが、特定の位置においてそれらのプレカーサー配列を有し、他のメンバーはそのような位置において、変異していることが好ましい場合は、非変異プレイマーが所与の残基に対する核酸ライブラリー内の非特異メンバーの特定レベルを得る能力を提供する。本発明の方法は、通常、約１０乃至約５０ベースの長さ、より好ましくは約１５乃至約４５ベースの長さの間の変異及び非変異オリゴヌクレオチドを用いる。対応する変異及び非変異プライマーに関して、同じ長さの対応するオリゴヌクレオチドである必要はなく、変異を付加する領域にオーバーラップしていればよい。
幾つかの態様において、プライマーは予め決められた量で添加される。例えば、同じ又は異なる部位において有意なレベルの特定の変異及び少ない量の異なる変異体を得られるライブラリーが有することが好ましいならば、所定量のプライマーを添加して、所望のライブラリーを生成する。代替的に、少ない又は多い非変異プライマーの量を添加することにより、対応する変異体が核酸ライブラリー中に頻繁に生成されるように調節することができる。部位指定変異誘発のプライマーの組成物を含むキットは市販されており、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位指定変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含む。幾つかの態様において、プレカーサーポリヌクレオチドは更に修飾されたプロ領域中に２つ以上のアミノ酸置換を含む修飾プライマーをコードする。複数部位指定変異誘発を行うためのキットも市販されている（例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）Ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）。
幾つかの態様において、本発明の修飾ポリヌクレオチドは部位飽和方法を用いて生成される。幾つかの他の態様において、修飾されたポリヌクレオチドのそれぞれはプロ領域に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
本発明は本発明の修飾ポリヌクレオチドの任意の１つによりコードされる、修飾完全長プレカーサープロテアーゼを提供する。本発明はプロテアーゼの成熟形態を提供する。このプロテアーゼは修飾されたプレカーサープロテアーゼから処理されたときに、未修飾プレカーサープロテアーゼのプロセシングにより達成されるレベルより大きなレベルで生成される。
本発明は、プレカーサープロテアーゼのプロ領域の少なくとも１つのアミノ酸を変異することにより修飾された完全長プロテアーゼを包含する。幾つかの態様において、このプレカーサープロテアーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の完全長プレカーサープロテアーゼプロ領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）の２８乃至１０９のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の完全長プレカーサープロテアーゼのプロ領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４の完全長プレカーサープロテアーゼのプロ領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４６）に等しい、プロ領域の１つ以上のアミノ酸の位置で変異されている。幾つかの態様において、このアミノ酸置換はバチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）Ｖ０４９プレカーサープロテアーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）の、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ野生型プロテアーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、又は野生型バチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）プロテアーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４）のＥ３３、Ｅ４３、Ａ４４、Ｅ４７、Ｖ４９、Ｅ５７、Ａ５９、Ｅ６３、Ｅ７０、Ｅ７４、Ｅ８４、及び／又はＥ８８に等しい位置で行われている。
幾つかの態様において、Ｅ３３に等しい位置でのアミノ酸の置換は、Ｅ３３Ｄ、Ｅ３３Ｉ、Ｅ３３Ｓ、Ｅ３３Ｎ、Ｅ３３Ｋ、Ｅ３３Ｈ、Ｅ３３Ｑ、又はＥ３３Ｒを含むがこれらに限定されない。他の態様において、Ｅ５７の置換は、Ｅ５７Ｆ、Ｅ５７Ｗ、Ｅ５７Ｋ、Ｅ５７Ｄ、Ｅ５７Ｍ、Ｅ５７Ｃ、Ｅ５７Ｑ、Ｅ５７Ｇ、Ｅ５７Ｓ、Ｅ５７Ｈ、又はＥ５７Ｎを含むがこれらに限定されない。本発明は修飾されたプロテアーゼを包含する。該プロテアーゼにおいて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、又は２４４の２８乃至１０９アミノ酸に等しい位置のアミノ酸それぞれに位置において任意の１つのアミノ酸置換は１９個の自然発生Ｌアミノ酸の任意の１つで置換されて、プレカーサープロテアーゼと比較して修飾されたプロテアーゼの生産／分泌が高められている。（例えば、表２及び／又は実施例４参照）。このアミノ酸は本明細書において、通常用いられ理解されている１つのレターコードで示される（例えば、Ｄａｌｅ，Ｍ．Ｗ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｌｔｄ．参照）。
幾つかの態様において、修飾されたプレカーサープロテアーゼポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１６、又は２４７で示す配列に対して、少なくとも約６５％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性、及び最も好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を占める変異領域を含み、プレカーサーポリペプチドに匹敵するかそれ以上の生成活性を有する。
前述のように、幾つかの態様において、本発明は前述のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。幾つかの好適な態様において、このベクターは本発明のプロテアーゼをコードしているＤＮＡ配列がＤＮＡの転写に必要とされる追加的なセグメントに作動可能に結合している、発現ベクターである。幾つかの好適な態様において、この発現ベクターはプラスミド、又はウイルスＤＮＡ由来であるか、又は代替的な態様において、両方のエレメントを含んでいる。例示的なベクターはｐＸＸ、ｐＣ１９４、ｐＪＨ１０１、ｐＥ１９４、ｐＨＰ１３を含むがこれらに限定されない。（Ｈａｒｗｏｏｄ ａｎｄ Ｃｕｔｔｉｎｇ（ｅｄｓ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，［１９９０］，特にチャプター３； バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に対する好適な複製プラスミドは９２頁に列挙のものを含む；Ｐｅｒｅｇｏ，Ｍ．（１９９３）ｌｎｔｅｇｒａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，ｐｐ６１５-６２４；Ａ．Ｌ． Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ, Ｊ． Ａ． Ｈｏｃｈ， ａｎｄ Ｒ．Ｌｏｓｉｃｋ（ｅｄ．），Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ）。
幾つかの好適な態様において、ベクターｐＸＸは本明細書で説明されているポリヌクレオチドを含むベクターの構築に用いることができる（例えば、ｐＸＸ−０４９、図６参照）。本明細書で説明されているそれぞれのベクターは本発明に用いることができる。幾つかの態様において、この構築体は複製プラスミド上に存在し（他の態様において、ｐＨＰ１３）、他の態様において、１以上のコピー中の染色体へ組み込まれる。統合のための部位の例としては、ａｐｒＥ、ａｍｙＥ、ｖｅｇ、又はｐｐｓ領域を含むがこれらに限定されない。即ち、当業者に知られている他の部位も本発明に用いることができることを意図する。幾つかの態様において、このプロモーターは選択されたプレカーサープロモーターについての野生型プロモーターである。幾つかの他の態様において、このプロモーターはプレカーサープロモーターとは異なるが宿主細胞中で機能することができるものである。特に、バクテリア宿主細胞中に用いるのに好適なプロモーターの例としては、ｐＳＰＡＣ、ｐＡｐｒＥ、ｐＡｍｙＥ、ｐＶｅｇ、ｐＨｐａｌｌプロモーター、バチルスステアロセレモフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニック（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ）アミラーゼ遺伝子、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）（ＢＡＮ）アミラーゼ遺伝子、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリプロテアーゼ遺伝子、バチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）アルカリプロテアーゼ遺伝子、バチルスプミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）キシロシダーゼ遺伝子、バチルスツリンギネシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙｌｌｌＡ、及びバチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファアミラーゼ遺伝子のプロモーターを含むがこれらに限定されない。追加的なプロモーターはＡ４プロモーター、並びに、ファージラムダＰＲ又はＰＬプロモーター、及びＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔｒｐ、又はｔａｃプロモーターを含む。
幾つかの態様において、発現ベクターは核酸操作を容易ならしめるための、ベクターに特異的な少なくとも１つの制限エンドクレアーゼを含むマルチプルクローニング部位カセットを含む。幾つかの更なる好適な態様において、このベクターは１つ以上の選択マーカーも含む（例えば、エリスロマイシン、アクチノミオシン、クロラムフェニコール、及び／又はテトラサイクリン等の構成物質耐性マーカー）。更なる態様において、マルチコピー複製プラスミドは当分野で知られている方法を用いて、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ゲノムＤＮＡへプラスミドを導入することに用いる。
例えば、タンパク質の発現及び生成のために、細胞内において、修飾プロテアーゼをコードしているポリヌクレオチドの少なくとも１つのコピーを含む、好ましくは複数のコピーを含む、所望の少なくとも１つの発現ベクターが、タンパク質発現に好適な条件下で細胞へ形質転換される。幾つかの特に好適な態様において、所望の、例えば、プロテアーゼの、タンパク質（ベクターに含まれた他の配列も）は宿主細胞のゲノムに取り込まれ、他の態様において、自律染色体外エレメントとして細胞内に残る。従って、本発明は染色体外エレメントと宿主細胞ゲノムに組み込まれる外来は配列の両方を提供する。
プレカーサー及び修飾されたプロテアーゼはバクテリア及び糸状菌を含む任意の好適なグラム陽性微生物の宿主細胞中で生産される。例えば、幾つかの態様において、修飾されたプロテアーゼは糸状菌及び／又はバクテリア由来の宿主細胞中で生成される。幾つかの態様において、この宿主細胞はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）又はアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）である。幾つかの他の好適な態様において、修飾されたプロテアーゼはバチルス属の宿主細胞により生産される。バチルス宿主細胞の例としてはバチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスステアロエセレモフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアルカロフィリス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスコアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルスサーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスプミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルスツリンギネシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、及びバチスルメガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、並びにバチルス属の他の微生物を含むがこれらに限定されない。幾つかの好適な態様において、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞が用いられる。Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔｓ ５，２６４，３６６及び４，７６０，０２５（ＲＥ ３４，６０６）は本発明に用いることができる各種バチルス宿主細胞を説明しているが、他の好適な株も本発明に用いることができる。
本発明に用いることができる工業的な株は非組換（即ち、野生型）バチルス株、並びに他の自然発生及び／又は組換株も用いることができる。幾つかの好適な態様において、宿主株は所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが導入されている、組換株である。幾つかの好適な態様において、宿主株はバチルススブチリス宿主株であり、特に組換バチルススブチリス宿主株である。１Ａ６（ＡＴＣＣ ３９０８５）、１６８（１Ａ０１）、ＳＢ１９、Ｗ２３、Ｔｓ８５、Ｂ６３７、ＰＢ１７５３乃至ＰＢ１７５８、ＰＢ３３６０、ＪＨ６４２、１Ａ２４３（ＡＴＣＣ ３９０８７）、ＡＴＣＣ ２１３３２、ＡＴＣＣ ６０５１、ＭＩ１１３、ＤＥ１００（ＡＴＣＣ ３９，０９４）、ＧＸ４９３１、ＰＢＴ １１０, 及びＰＥＰ ２１１株（例えば、Ｈｏｃｈら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７３：２１５‐２２８［１９７３］参照）（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，４５０，２３５； Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，３０２，５４４；及びＥＰ０１３４０４８も参照；これらの文献を参照により本明細書に援用する）を含むがこれらに限定されない、多くのバチルススブチリス株が知られている。バチルススブチリスを発現宿主として使用することは当分野でよく知られている （例えば、Ｐａｌｖａら、Ｇｅｎｅ １９：８１‐８７［１９８２］；Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ及びＦｉｓｃｈｅｒ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １６５：７９６‐８０４［１９８６］；及びＷａｎｇら、Ｇｅｎｅ ６９：３９‐４７［１９８８］参照）。
幾つかの態様において、好適なバチルス宿主はｄｅｇＵ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＲ、及びｄｅｇＱ遺伝子の少なくとも１つにおける変異又は欠失を含むバチルス属である。好ましくは、変異はでｇＵ遺伝子中であり、より好ましくは、変異体にはでｇＵ（Ｈｙ）３２である（例えば、Ｍｓａｄｅｋら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２：８２４‐８３４［１９９０］；及びＯｌｍｏｓら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２５３：５６２−５６７［１９９７］参照）。より好適な宿主株はｄｅｇＵ３２（Ｈｙ）変異を運んでいるバチルススブチリスである。幾つかの更なる態様において、このバチルス宿主はｓｃｏＣ４において変異又は欠失を含んでいる（例えば、Ａｒｉｇｏｎｉら、Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ３１：１４０７‐１４１５［１９９９］）；及び／又はｏｐｐＡ又ｏｐｐオペロンの他の遺伝子（例えば、Ｐｅｒｅｇｏら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５：１７３‐１８５［１９９１］参照）。即ち、ｏｐｐＡ遺伝子における変異と同じ表現型を引き起こすｏｐｐオペロンにおける任意の変異が本発明の変異バチルス株の幾つか態様において用いることができる。幾つかの態様において、これらの変異は、単独で生じ、他の態様では変異の組合せが存在している。幾つかの態様において、本発明の修飾プロテアーゼを生成することに用いることができる変異されたバチルスは前述の変異された遺伝子の１つ以上における変異をすでに含むバチルス宿主株である。（幾つかの態様において、他の遺伝子のおける変異も存在する）。幾つかの代替的な態様において、前述の変異遺伝子の１つ以上の変異を含むように更に遺伝子操作された変異バチルスも用いられる。
宿主細胞は、当分野で既知の好適な方法を用いて、本発明の修飾プロテアーゼをコードする修飾ポリヌクレオチドで形質転換される。修飾されたポリヌクレオチドはベクターに取り込まれるか又はプラスミドＤＮＡの存在なしで用いられ、微生物に、幾つかの態様において、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ細胞又は適合するバチルス細胞に、導入される。プラスミド構築体を含むバチルス細胞へＤＮＡを導入する方法及びＥ．ｃｏｌｉ内へプラスミドを形質転換することは良く知られている。幾つかの態様において、このプラスミドは引き続きＥ．ｃｏｌｉから単離され、バチルスへ形質転換される。しかしながら、Ｅ．ｃｏｌｉのような介在微生物を用いることは必須ではなく、幾つかの態様において、ＤＮＡ構築体又はベクターは直接バチルス宿主細胞に導入される。
バチルス細胞にポリヌクレオチド配列を導入するための好適な方法は当業者が知っている（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉら、「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、Ｈａｒｗｏｏｄら編、Ｂａｃｉｌｌｕｓ, Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．［１９８９］、５７‐７２頁；Ｓａｕｎｄｅｒｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １５７：７１８‐７２６［１９８４］；Ｈｏｃｈら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，９３：１９２５‐１９３７［１９６７］；Ｍａｎｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３：１３１‐１３５［１９８６］；及びＨｏｌｕｂｏｖａ, Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０：９７［１９８５］；Ｃｈａｎｇら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１‐１１５［１９７９］；Ｖｏｒｏｂｊｅｖａら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７：２６１‐２６３［１９８０］；Ｓｍｉｔｈら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１：６３４［１９８６］；Ｆｉｓｈｅｒら、Ａｒｃｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３９：２１３−２１７［１９８１］；及びＭｃＤｏｎａｌｄ， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３０：２０３［１９８４］参照）。即ち、プロトプラスト形質転換及びコングレッション、トランスダクション、及びプロトプラスト融合は知られており、本発明に適している。形質転換方法は、本発明により提供されるＤＮＡ構築体を宿主細胞に導入するための特に好ましい。
通常用いられる方法に加えて、幾つかの態様において、宿主細胞は直接形質転換される（即ち、介在細胞を増幅に用いない又は他の方法、ＤＮＡ構築例えば、幾つかのを宿主細胞に予め導入する）。宿主細胞へのＤＮＡ構築体の導入はプラスミド又はベクターへ挿入しないで、宿主細胞にＤＮＡを導入するための本分野で知られている物理的化学的方法を含む。そのような方法は塩化カルシウム沈殿法、エレクトロポレーション、ネイキッドＤＮＡ法、リポソーム等を含むがこれらに限定されない。追加的な態様において、ＤＮＡ構築例えば、幾つかのはプラスミドで、プラスミドへ挿入されずに、共形質転換される。更なる態様において、選択マーカーが、当分野で既知の方法により、変異されたバチルス株から欠失させられる（Ｓｔａｈｌら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８：４１１−４１８［１９８４］；及びＰａｌｍｅｒｏｓら、Ｇｅｎｅ ２４７：２５５‐２６４［２０００］参照）。
前述のように、本発明の幾つかの態様において、所望の少なくとも１つのポリペプチドをコードしている核酸が、宿主細胞内で複製きる発現ベクターを解して宿主細胞へ導入される。バチルスに好適な複製及び取り込みプラスミドは当分野で知られている（例えば、Ｈａｒｗｏｏｄ及びＣｕｔｔｉｎｇ編, Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ［１９９０］、特にチャプター３参照；バチルススブチリスに対して好適なプラスミドが９２頁に列挙されている）。技術的なハードルが存在するけれども、当業者は、バチルス中のＤＮＡの直接クローニングのための幾つかの手順があることを理解している。
バチルスを形質転換するための当分野で知られている方法は、部分的に相同な耐性プラスミドを運んでいるコンピテントセルによりドナープラスミドの取り込みを含む、プラスミドマーカーレスキュートランスフォーメーションのような方法を含む（Ｃｏｎｔｅｎｔｅら、Ｐｌａｓｍｉｄ ２：５５５−５７１［１９７９］；Ｈａｉｍａら、ＭｏＩ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．，２２３：１８５−１９１［１９９０］；Ｗｅｉｎｒａｕｃｈら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４：１０７７−１０８７［１９８３］；及びＷｅｉｎｒａｕｃｈら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：１２０５−１２１１［１９８７］）。この方法において、導入されるドナープラスミドは染色体形質転換に似たプロセスにおいて、耐性「ヘルパー」プラスミド相同領域を再結合される。
プロトプラスト形質転換により形質転換を含む他の方法も当分野で知られている（例えば、 Ｃｈａｎｇ及びＣｏｈｅｎ, Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１１−１１５［１９７９］；Ｖｏｒｏｂｊｅｖａら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．， ７：２６１−２６３［１９８０］；Ｓｍｉｔｈら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１：６３４［１９８６］；Ｆｉｓｈｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３９：２１３−２１７［１９８１］；ＭｃＤｏｎａｌｄ［１９８４］ Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３０：２０３［１９８４］；及びＢａｋｈｉｅｔら、４９：５７７［１９８５］参照）。更に、Ｍａｎｎら、（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３：１３１−１３５［１９８６］）はバチルスプロトプラストの形質転換を説明し、及びＨｏｌｕｂｏｖａ（Ｈｏｌｕｂｏｖａ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．, ３０：９７［１９８５］）はＤＮＡ含有リポソームを用いて、ＤＮＡをプロトプラストへ導入するための方法を開示している。幾つかの好適な態様において、マーカー遺伝子は所望の遺伝子が宿主細胞中へ存在するかどうかを示すために用いられる。
これら方法に加えて、他の態様において、宿主細胞は直接形質転換される。「直接形質転換」において、中間細胞は増幅又は他の方法に用いられない、修飾されたポリヌクレオチドは宿主細胞（即ち、バチルス）に予め導入されている。修飾されたポリヌクレオチドの宿主細胞への導入はプラスミド又はベクターへ挿入することなしに、宿主細胞へ修飾されたポリヌクレオチドを導入するための当分野で既知の物理的及び化学的方法を含む。そのような方法適合細胞の使用、並びに塩化カルシウム沈殿法、エレクトロポレーション等のＤＮＡを細胞へ導入するための「人工的な手段」を含むがこれらに限定されない。従って、本発明は、ネイキッドＤＮＡ、リポソーム等に用いることができる。更なる態様において、修されたポリヌクレオチドはプラスミドへ挿入することなしに、プラスミドを用いて共形質転換される。
より具体的には、本発明は、構築体、本明細書で説明するポリヌクレオチドを含むベクター、そのようなベクターで形質転換させたベクター、そのような宿主細胞により発現されるプロテアーゼ、微生物（特にバチルス属のメンバー）由来の相同又は異種セリンプロテアーゼ酵素の生産のための発現方法及びシステムを提供する。幾つかの態様において、修飾されたセリンプロテアーゼをエンコードしている修飾ポリヌクレオチドは修飾されてセリンプロテアーゼの発現に適した組換宿主細胞の生成に用いる。幾つかの好適な態様において、この発現宿主は修飾されたプロテアーゼの成熟形態の分泌を高めることができ、従って、プロテアーゼの商業的な生産が高められる。
幾つかの態様において、本発明のこの宿主細胞及び形質転換細胞は従来の栄養培地で培養される。温度、ｐＨ等の好適な特定の培養条件は当業者に知られている。更に、幾つかの好適な培養条件が、Ｈｏｐｗｏｏｄ（２０００）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｖｃｅｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． Ｊｏｈｎ ｌｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， Ｎｏｒｗｉｃｈ ＵＫ；Ｈａｒｄｗｏｏｄら、（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ Ａｎｄ ｆｒｏｍ Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）のような学術文献に記載されている。
幾つかの態様において、修飾プロテアーゼをコードしているポリヌクレオチドで形質転換させられた宿主細胞は発現に好適な条件下で培養され、細胞培地からコードされたタンパク質が回収される。本発明の修飾プロテアーゼを含む組換宿主細胞により生成されたタンパク質は培地へと分泌される。幾つかの態様において、他の組換構築体は可溶性プロテインの生成を促進するプロテアーゼポリペプチドドメインをコードしているヌクレオチド配列に対して異種又は相同なポリヌクレオチド配列を結合する（Ｋｒｏｌｌ ＤＪら、（１９９３） ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２：４４１−５３）。
そのような精製促進ドメインは、固定化された金属上の精製を許容するヒスチジン−トリプトファンモジュール等の金属キレートペプチド（Ｐｏｒａｔｈ Ｊ （１９９２） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ３：２６３−２８１）、固定化されたイムノグロブリン等の精製をするプロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＳエクステンション／親和精製システムに用いるドメイン（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を含むがこれらに限定されない。精製ドメインを異種タンパク質の間のファクターＸＡ又はエンテロキナーゼ等の切断可能なリンカー配列を含めることも精製を促進するために用いられる。
幾つかの好適な態様において、異種又は相同タンパク質は前記態様において、を有する内性物をコードしているポリヌクレオチド配列で、形質転換させた細胞は発現に適した条件下で培養され、コードされた組成物がこの細胞培養培地から回収される。幾つかの態様において、他の組換構築体は、可溶性タンパク質（例えば、各種ソートのタグ）の精製を促進するポリペプチドドメインをコードしているヌクレオチド配列に異種又は相同なポリヌクレオチド配列を含む（Ｋｒｏｌｌら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２：４４１−５３［１９９３］）。
そのような精製促進ドメインは、固定化された金属上の精製を許容するヒスチジン−トリプトファンモジュール等の金属キレートペプチド（Ｐｏｒａｔｈ Ｊ（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ３：２６３−２８１）、固定化されたイムノグロブリン等の精製をするプロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＳエクステンション／親和精製システムに用いるドメイン（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を含むがこれらに限定されない。精製ドメインを異種タンパク質の間のファクターＸＡ又はエンテロキナーゼ等の切断可能なリンカー配列を含めることも精製を促進するために用いられる。
幾つかの好適な態様において、本発明の形質転換された宿主細胞は、本発明のプロテアーゼを発現することができる条件下で好適な栄養培地中で培養され、その後得られたプロターゼが培地から回収される。細胞の培養に用いる培地は、適した栄養素を含んでいる最小又は複合培地等の宿主細胞の育成に適した従来の培地を含む。適した培地は市場で入手可能であり、公知のレシピに基づいて調製することもできる（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション）。幾つかのタンパク質細胞により生産されたプロテアーゼは延伸分離又はろ過、塩（例えば、硫酸アンモニウム）をもちいた上清中のプロテイン様物質の沈殿、ろ過、クロマトグラフ精製（例えば、イオン交換、ゲルろ過、親和等）のよる、培地から宿主細胞を分離するための非限定的な従来技術により培地から回収される。従って、本発明のプロテアーゼを回収するのに適した任意の方法を本発明に用いることができる。即ち、本発明を特定の方法に限定することは意図しない。
本明細書で説明するように、本発明のポリペプチドは対応する未修飾プレカーサーポリペプチドから生産される成熟酵素よりも高いレベルの成熟酵素を生産する。本発明の特徴とするに好適な態様において、プレカーサーポリペプチドのプロ領域内の変異が、同じ条件下で、バチルス株により生成されてときに、プレカーサープロモーターから生産される対応する成熟プロテアーゼと比較して、成熟ポリペプチドの分泌／発現を高める。
高められた分泌／発現の測定は活性比として測定される。これはプレカーサープロテアーゼから生じた成熟形態の酵素活性に対する修飾プロテアーゼから生じた成熟形態の酵素活性の比をして表される。１以上の比は修飾プロテアーゼの成熟形態がプレカーサープロテアーゼの成熟形態に匹敵するか又はそれ以上のレベルで生産されていることを示している。例えば、１．５の活性比はプレカーサープロモーターから生じた変異プロテアーゼのレベルの１．５倍の修飾プロテアーゼから生じた成熟プロテアーゼが生産されていることを示し、即ち、修飾されたプロテアーゼが未修飾プレカーサープロテアーゼよりも５０％より多くのプロテアーゼを生産することを示している。幾つかの態様において、この活性比は少なくとも１、少なくともやく１．０５、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３、少なくとも約１．４、少なくとも約１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、及び少なくとも約２である。他の態様において、この活性比は少なくとも約２．１、少なくとも約２．２、少なくとも約２．３、少なくとも約２．４、少なくとも約２．５、少なくとも約２．６、少なくとも約２．７、少なくとも約２．８、少なくとも約２．９、及び少なくとも約３である。更なる態様において、この活性比は、少なくとも約３．５、少なくとも約４．０、及び少なくとも約５である。従って、幾つかの態様において、修飾されたプロテアーゼからの変異プロテアーゼの生産は、少なくとも約０．５％、約１．０％、約１．５％、約２．０％、約２．５％、約３．０％、約４．０％、約５．０％、約８．０％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％以上、未修飾プレカーサープロモーターから処理された対応する成熟プロテアーゼと比較して高い。他の態様において、修飾されたプロテアーゼから処理されたプロテアーゼの成熟形態の生産は少なくとも約１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、及び少なくとも約２００％、又はこれ以上、未修飾プレカーサープロモーターから処理されてプロテアーゼの成熟形態の生産と比べて高い。幾つかの態様において、修飾されたプロテアーゼの高められた生産は対応する未修飾プレカーサープロテアーゼの成熟形態のタンパク質分解活性に対する修飾プロテアーゼから処理された成熟形態のタンパク質分解活性の比に基づいて決定することができる。
宿主細胞中の異種又は相同タンパク質の分泌レベル及び分泌されたタンパク質の検出のための他の方法はタンパク質に特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いる方法を含むがこれらに限定されない。例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、及び蛍光アッセイか細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を含むがこれらに限定されない。これらの及び他のアッセイは当業者によく知られている（例えば、Ｍａｄｄｏｘら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．，１５８：１２１１［１９８３］参照）。幾つかの好適な態様において、本明細書で提供される方法及び組成物を用いたときの分泌は、ペプチド輸送タンパク質又はペプチド輸送オペロンの生産が導入されていない同じ方法及び組成物を用いたときよりも高い。
本発明のポリペプチドの活性を決定及び測定するための当業者に知られている各種方法が存在する。特にアッセイは、Ｆｏｌｉｎ法を用いて２８０ｎｍ又は呈色吸光度を測定する、カゼイン又はヘモグロビンからの酸可溶ペプチドの放出に基づくプロテアーゼ活性の測定に利用される（例えば、Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ」ｖｏｌ．５， Ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ， Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍ ［１９８４］参照）。幾つかの他のアッセイは、染色体基質の可溶化を含む（例えば、Ｗａｒｄ、「Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ」、ｉｎ Ｆｏｇａｒｔｙ （ｅｄ．）．， Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｏｎｄｏｎ， ［１９８３］， ｐｐ２５１−３１７参照）。他の例示的なアッセイは、スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−パラニトロアニリンアッセイ（ＹＮＢＳアッセイ）を含むがこれらに限定されない。当業者に知られている多くの追加的な文献は公的な方法を提供する（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １１：７９１１−７９２５［１９８３］；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２２３：１１９−１２９［１９９４］；及びＨｓｉａら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４２：２２１−２２７［１９９９］参照）。本願発明を特定の方法に限定することは意図しない。
幾つかの態様において、微生物による修飾されたプロテアーゼの生産は未修飾プレカーサープロテアーゼから処理された成熟プロテアーゼの苛性と修飾プレカーサープロテアーゼから処理された成熟プロモーターの活性の比を用いて決定する。幾つかの特に好適な態様において、１又はそれ以上の比が好ましい。
宿主細胞中で、所望のタンパク質の生産のレベルを決定し、発現されたタンパク質を検出するための他の方法はこのタンパク質に特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いたイムノアッセイの使用を含む。例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、及び蛍光活性化細胞のソーティング（ＦＡＣＳ）を含むがこれらに限定されない。しかしながら、他の方法も当業者に知られており、所望のタンパク質のアッセイに用いられる（例えば、Ｈａｍｐｔｏｎら、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ, Ｓｔ． Ｐａｕｌ, ＭＮ ［１９９０］； 及びＭａｄｄｏｘら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．, １５８：１２１１ ［１９８３］参照）。幾つかの好適な例えば、所望の例えば、の分泌は対応する変異されていない宿主細胞よりも本発明を用いて変異させた株のほうが高い。当業者に知られているように、本発明を用いて生成された修飾されたバチルス細胞は発現の好適な条件下で維持及び育成され、細胞培養から所望のポリペプチドが回収される（例えば、Ｈａｒｄｗｏｏｄ ａｎｄ Ｃｕｔｔｉｎｇ （ｅｄｓ．） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ, Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ［１９９０］参照）。本発明を特定のアッセイ方法に限定することは意図しない。
本明細書で言及する全ての特許出願及び特許は参照により本明細書に援用される。本発明で言及した方法及びシステムの各種変更及びバリエーションは本発明の範囲及び精神を逸脱せずに当業者が理解し得る。本発明を特定の態様に関して説明してきたが、本発明をそのような特定の態様に限定することは意図しない。即ち、当業者に明らかな及び／又は関連分野における当業者に明らかな本発明を実施するための説明の各種変更は本願発明の範囲内である。
以下の実施例は、特定の好適な態様及び本願発明の側面を示し、更に詳述する目的で提供されものであり、本願発明を限定するものではない。
本実施例において、以下の略語を用いる：ｐｐｍ（百万分率）；Ｍ（モル）；ｍＭ（ミリモル）；μＭ（マイクロモル）；ｎＭ（ナノモル）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）； μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇｍ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）； μｇ（マイクログラム）；ｐｇ（ピコグラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ及び ｍＬ（ミリリットル）；μｌ及びμＬ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）； μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；Ｕ（単位）；Ｖ（ボルト）；ＭＷ（分子量）；ｓｅｃ（秒）；ｍｉｓ（分）；ｈ（ｓ）及びｈｒ（ｓ）（時間）；℃（摂氏）；ＱＳ（適量）；ＮＤ（実施していない）；ＮＡ（適応しない）；ｒｐｍ（１分間当たりの回転数）；Ｈ２Ｏ（水）；ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）；ＨＣＩ（塩酸）；ａａ（アミノ酸）；ｂｐ（ベースペア）； ｋｂ（キロベースペア）；ｋＤ（キロダルトン）；ｃＤＮＡ（コピー又は相補的ＤＮＡ）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ｓｓＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡ）；ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）；ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム）；ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）；ｗ／ｖ（重量対容量）；ｖ／ｖ（容量対容量）；ｇ（比重）；ＯＤ（光学密度）；ダルベッコリン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）；ＯＤ２８０（２８０ｎｍにおける光学密度）；ＯＤ６００（６００ｎｍにおける光学密度）；Ａ４０５（４０５ｎｍにおける吸光度）；ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水［１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２］）；ＰＢＳＴ（ＰＢＳ+０．２５％ＴＷＥＥＮ（商標）−２０）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）；ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）；トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタｎｎ）；ＨＥＰＥＳ （Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ−［２−エタンスルホン酸］）；ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）；ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）；ｂＭＥ、ＢＭＥ及びＢＭＥ（ベータメルカプトエタノール又は２−メルカプトエタノール）；Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン−ヒドロクロライド）；Ｔｒｉｃｉｎｅ（Ｎ−［トリス−（ヒドロキシメチル）−メチル］）；ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）；Ｔａｑ（サーマスアクチスＤＮＡポリメラーゼ）；Ｋｌｅｎｏｗ（ＤＮＡポリメラーゼＩラージ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント）；ｒｐｍ（１分間当たりの回転数）；ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（アミノエチルエーテル）Ｎ１、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラ酢酸）；ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）；Ｂｌａ（β−ラクタマーゼ又はアンピシリン耐性遺伝子）；ＤＮＡ２．０（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ, ＣＡ）；オキソイド（ＯＸＯＩＤ）（Ｏｘｏｉｄ, Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ, Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ, ＵＫ）；コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）（コーニングライフサイエンス（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｃｏｍｉｎｇ, ＮＹ）；ＡＴＣＣ （アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ, ＭＤ）；Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ, Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ, ＮＹ）；シグマ（Ｓｉｇｍａ）（シグマケミカルシーオー（Ｓｉｇｍａ ＣＨＥＭＩＣＡＬ Ｃｏ．）Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ, ＭＯ）；ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（ファルマシアバイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｐｉｓａｃａｔａｗａｙ, ＮＪ）；ＮＣＢＩ（全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））；アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ, ＣＡ）；クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（クローンテックラボラトリーズ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ, ＣＡ））；オペロンテクノロジー（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（オペロンテクノロジーインク（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ, Ｉｎｃ．）、Ａｌａｍｅｄａ, ＣＡ）；ベックマン（Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ, Ｉｎｃ．, Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ, ＰＡ）；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｄｅｔｒｏｉｔ, Ｍｌ）；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ又はＧｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ, Ｉｎｃ．, Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ, ＭＤ）；ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ, Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ, ＭＡ）；バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）（ＢＩＯ−Ｒａｄ, Ｈｅｒｃｕｌｅｓ, ＣＡ）；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．, Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ, ＣＡ）；ＮＥＢ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ, Ｂｅｖｅｒｌｙ, ＭＡ）；シグマ（Ｓｉｇｍａ）（Ｓｉｇｍａ ＣＨＥＭＩＣＡＬ Ｃｏ．, Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ, ＭＯ）；ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, Ｒｏｃｋｆｏｒｄ, ＩＬ）；タカラ（Ｔａｋａｒａ）（Ｔａｋａｒａ ＢＩＯ Ｉｎｃ． Ｏｔｓｕ, Ｊａｐａｎ）；ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ, Ｂａｓｅｌ, Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；イーエムサイエンス（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ, Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ, ＮＪ）；キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（Ｑｉａｇｅｎ, Ｉｎｃ．, Ｖａｌｅｎｃｉａ, ＣＡ）；モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ, Ｃｏｒｐ．, Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ, ＣＡ）；アールアンドディーシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ, ＭＮ）；ストラタジェン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ, Ｌａ ＪｏＩＩａ, ＣＡ）；及びマイクロソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ, Ｉｎｃ．, Ｒｅｄｍｏｎｄ, ＷＡ）。
実施例１
バチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）アルカリプロテアーゼＶ０４９のＳｉｇＰ及びＰｒｏ配列の部位スキャニング変異誘発
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位変異誘発キット（ＱＣ；ストラタジェン）を用いて、製造元の説明書に従って、バチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）Ｖ０４９プレカーサープロテアーゼのプロ配列の部位飽和変異誘発を行った。核部位飽和ライブラリーを生成して、その中にバチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）プロテアーゼ変異体Ｖ０４９をコードするプレカーサーカーゼーポリヌクレオチドの修飾されたポリヌクレオチド配列を含めた。ｐＸＸ−Ｖ０４９プラスミドの中に含まれるＶ０４９ポリヌクレオチドのプロ領域をコードしている配列を変異させてプレカーサープロテアーゼのプロ領域の１のコドンの変異をそれぞれ含むポリヌクレオチドのライブラリーを生成した。ＮＮＧ／Ｃにより例示されるＶ０４９のプロ領域の各コドン変異させて、２０個の天然アミノ酸をコードしている３２個の可能性のある核酸３連子で置換した。相補的にオーバーラップしているプライマーをＮＮＳコドンにフランキングしている１８ベースで所望の各コドンについて設計した。このプライマーの配列を表１に示す。
バチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）アルカリプロテアーゼＶ０４９のＳｉｇＰ及びＰｒｏ配列の部位スキャニング変異誘発
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位変異誘発キット（ＱＣ；ストラタジェン）を用いて、製造元の説明書に従って、バチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）Ｖ０４９プレカーサープロテアーゼのプロ配列の部位飽和変異誘発を行った。核部位飽和ライブラリーを生成して、その中にバチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）プロテアーゼ変異体Ｖ０４９をコードするプレカーサーカーゼーポリヌクレオチドの修飾されたポリヌクレオチド配列を含めた。ｐＸＸ−Ｖ０４９プラスミドの中に含まれるＶ０４９ポリヌクレオチドのプロ領域をコードしている配列を変異させてプレカーサープロテアーゼのプロ領域の１のコドンの変異をそれぞれ含むポリヌクレオチドのライブラリーを生成した。ＮＮＧ／Ｃにより例示されるＶ０４９のプロ領域の各コドン変異させて、２０個の天然アミノ酸をコードしている３２個の可能性のある核酸３連子で置換した。相補的にオーバーラップしているプライマーをＮＮＳコドンにフランキングしている１８ベースで所望の各コドンについて設計した。このプライマーの配列を表１に示す。
＊提供されたプライマーネームは置換のアミノ酸位置を反映している。「Ｒ」はプライマーがリバースプライマーであることを示し、「Ｆ」はプライマーがフォワードプライマーであることを示す。例えば、Ｖ０４９−１０８ＦはＶ０４９プレカーサープロテアーゼの１０８の位置のアミノ酸の置換に用いるフォワードプライマーである。
＊＊ベース左及び＊＊＊ベース右はプライマー中に存在している変異コドンの左と右のベースの数を示している。これらのベースはテンプレートプレカーサーポリヌクレオチドベース（即ち、Ｖ０４９）のベースに対して相補的である。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７−ベクターｐＸＸ０４９のポリヌクレオチド配列
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ＱＣ反応物は、４０．２４μＬの滅菌蒸留Ｈ２Ｏ、５μＬのＰｆｕＴｕｒｂｏ１０×緩衝液（キット）、１μＬｄＮＴＰ（キット）、１．２５μＬのフォワードプライマー（１００ｎｇ／μＬ）、１．２５μＬのリバースプライマー（１００ｎｇ／μＬ）、テンプレートとして（〜５０ｎｇ）ｐＭＳＡ−Ｎｃａｌ未修飾プレップＤＮＡを０．２５μＬ、及び／又は１μＬのＰｆｕＴｕｒｂｏ（キット）からなり、合計５０μＬである。サイクル条件は９５℃で１回、次いで、９５℃で１分、５５℃で１分、６８℃で１２分を１９乃至２０サイクル行う。反応の解析のために、５μＬの反応混合物を１．２％Ｅ−ゲル（インビトロジェン）上で、ゲル末端まで泳動した。次に、Ｄｐｎｌ消化を、１μＬと１μＬの酵素で３７℃で２乃至８時間、続けて２回行った。陰性対象を同様の条件下でプライマーなしで行った。その後、１μＬのＤｐｎｌ消化反応生成物をバイオラドエレクトロポレーターを用いて、ワンショット（ｏｎｅｓｈｏｔ）ＴＯＰ１０エレクトロコンピテント細胞（インビトロジェン）の５０μＬへ形質転換させた。その後、ＴＯＰ１０セル（インビトロジェン）と提供されるＳＯＣの１ｍＬをエレクトロコンピテントセルに添加して、５ｐｐｍのクロラムフェニコールを含むＬＡプレート上で平板培養する前、１時間、振とうしながらインキュベーションした。このプレートを３７℃で一晩インキュベーションした。インキュベーションの後、このライブラリーからの９６のコロニーを（即ち、各部位）、９６ウェルマイクロタイタープレートの中にクロラムフェニコール１０乃至５０ｐｐｍを含むＬＢ２００μＬ中でインキュベーションして、３７℃で一晩育成した。次の日にこのプレートにグリセロールを、最終濃度が２０％になるように添加した後、−８０℃で冷凍し、それらをＶ０４９ＳＥＱ−Ｒ２プライマーと共にハイスループットシークエンシングに用いた。同様に、プレカーサープロテアーゼＶ０４９のプロ領域の２つ以上のアミノ酸をコードしているコドンの変異をＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）マルチサイト指定変異誘発（ＱＣＭＳ；ストラタジェン）を用いて行った。このＱＣＭＳ反応は１９．２５μＬの滅菌蒸留Ｈ２Ｏ、２．５μＬｎｏ１０×緩衝液（キット）、１μＬの５’リン酸化フォワードプライマー（１００ｎｇ／μＬ）、０．２５μＬのｐＭＳＡＴ−ＮｃｏｌプライマーＤＮＡ（テンプレートとして（〜５０ｎｇ）、及びキット付属の酵素１μＬからなり、合計２５μＬである。サイクル条件は９５℃で１分を１回、次いで９５℃で１分、５５℃で１分、及び／又は６５℃で１２分を３０サイクル続ける。反応の解析のために、反応物２．５μＬを１．２％Ｅ−ゲル（インビトロジェン）の端まで泳動させた。次に、Ｄｐｍｌを消化を、１μＬと０．５μＬの酵素を用いて、３７℃で、２乃至８時間、２開続けて行う。対照、形質転換、及び配列決定は、前述のＱＣ法に従い、行った。
実施例２
宿主細胞形質転換及び修飾プロテアーゼの発現
所望の修飾されたタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含むｐＸＸ−０４９プラスミドをＤｐｎｌを用いて、３７℃で３乃至５時間、２回消化した。
宿主細胞形質転換及び修飾プロテアーゼの発現
所望の修飾されたタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含むｐＸＸ−０４９プラスミドをＤｐｎｌを用いて、３７℃で３乃至５時間、２回消化した。
Ｅ．ｃｏｌｉにおける形質転換及びスクリーニング
１μＬのＤｐｎｌで消化したプラスミドＤＮＡをエレクトロポレーションでのＥ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０細胞の形質転換に用いた。形質転換された細胞は５ｐｐｍのＣＭＰ（クロラムフェニコール）を含むＬＢアガープレート上で平板培養し、コロニーを一晩育成させた。９６個のそれぞれのコロニーを最初し、ＬＢ＋５ｐｐｍＣＭＰ＋５０ｐｐｍカルベニシリンを含む９６ウェルマイクロタイタープレートの対応するウェルに移した。培養は、振とうしながら、３７℃で一晩行った。グリセロールストックをこの培地に、最終濃度が１０％になるように添加した。プラスミドＤＮＡを９６Ｅ．ｃｏｌｉ培地から調製し、プラスミドＤＮＡ調製物の一部分を配列決定した（Ｃｏｇｅｎｉｃｓ、Ｍｏｒｒｉｓｉｖｌｌｅ、ＮＣ）。自動配列解析をＰｈｒｅｐ、Ｐｈｒａｐ、Ｃｏｎｓｅｄ、Ｃｕｓｔａｌ Ｗ ソフトウェアを用いて行った。
１μＬのＤｐｎｌで消化したプラスミドＤＮＡをエレクトロポレーションでのＥ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０細胞の形質転換に用いた。形質転換された細胞は５ｐｐｍのＣＭＰ（クロラムフェニコール）を含むＬＢアガープレート上で平板培養し、コロニーを一晩育成させた。９６個のそれぞれのコロニーを最初し、ＬＢ＋５ｐｐｍＣＭＰ＋５０ｐｐｍカルベニシリンを含む９６ウェルマイクロタイタープレートの対応するウェルに移した。培養は、振とうしながら、３７℃で一晩行った。グリセロールストックをこの培地に、最終濃度が１０％になるように添加した。プラスミドＤＮＡを９６Ｅ．ｃｏｌｉ培地から調製し、プラスミドＤＮＡ調製物の一部分を配列決定した（Ｃｏｇｅｎｉｃｓ、Ｍｏｒｒｉｓｉｖｌｌｅ、ＮＣ）。自動配列解析をＰｈｒｅｐ、Ｐｈｒａｐ、Ｃｏｎｓｅｄ、Ｃｕｓｔａｌ Ｗ ソフトウェアを用いて行った。
バチルススブチリスの形質転換
プラスミドＤＮＡの第二の部分をバチルススブチリス宿主細胞の形質転換に用いた。適した変異を有する９６個のＥ．ｃｏｌｉ培地のそれぞれからプラスミドＤＮＡを２μＬを用いてバチルススブチリスＣｏｍＫコンピテントセルの１００μＬへ形質転換した。この細胞を２５０ｒｐｍで振とうしながら、３７℃で４５分間インキュベーションした。９６個の形質転換混合物からの細胞を１．６％スキムミルク及び／又は５ｐｐｍのＣＭＰを含むＬＡ上で平板培養し、３７℃のインキュベーターで一晩インキュベーションした。
プラスミドＤＮＡの第二の部分をバチルススブチリス宿主細胞の形質転換に用いた。適した変異を有する９６個のＥ．ｃｏｌｉ培地のそれぞれからプラスミドＤＮＡを２μＬを用いてバチルススブチリスＣｏｍＫコンピテントセルの１００μＬへ形質転換した。この細胞を２５０ｒｐｍで振とうしながら、３７℃で４５分間インキュベーションした。９６個の形質転換混合物からの細胞を１．６％スキムミルク及び／又は５ｐｐｍのＣＭＰを含むＬＡ上で平板培養し、３７℃のインキュベーターで一晩インキュベーションした。
９６個の形質転換体からの４つのコロニーを採取し、１５０μＬのＬ及び／又は５ｐｐｍＣＭＰを含むマイクロタイタープレートへそれぞれ移した。このマイクロタイタープレートを１５０ｒｐｍで撹拌しながら、３７℃で４時間インキュベーションした。各培地の１０μＬを１４０μＬのＧｒａｎｔＩＩ培地＋５ｐｐｍＣＭＰ（ｐＨ７．３）を含む新しいマイクロタイタープレートに移した。ＧｒａｎｔＩＩ培地は以下のように調製した。溶液Ｉ、１０ｇのＳｏｙｔｏｎを５００ｍｌの水に溶解し、２０乃至２５分間オートクレーブ滅菌を行う。溶液ＩＩ３ｍｌの１ＭＫ２ＨＰＯ４、７５ｇグルコース、３．６ｇ尿素、１００ｍｌＧｒａｎｔ１０×ＭＯＰＳを４００ｍｌの水に入れ希釈する。溶液Ｉ及びＩＩを混合し、ＨＣｌ／ＮＡＯＨでｐＨを７．３に調節する。最終容量を１Ｌに調節して、得られた溶液を０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通してろ過滅菌する。
このマイクロタイタープレート培養物を２５０ｒｐｍで振とうしながら、３７℃で培養した。アッセイのために規則的な時間間隔でサンプルを採取した（４０時間まで）。
実施例３
修飾されたプロテアーゼ生成の調節：プロテアーゼ活性のＡＡＰＦアッセイ
実施例２における説明で得られたバチルスブチリスのそれぞれを修飾されたプロテアーゼの生産についてアッセイを行った。この酵素生産は、基質である、スクシニル−Ｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアナライド（ｎｉｔｒｏａｎａｌｉｄｅ）（ＡＡＰＦ）に対する活性を評価する。このアッセイは、修飾されたプロテアーゼの生産を加水分解してｐ−ニトロアラニンを放出することにより生じる、４０５ｎｍにおける吸光度の増加分として、修飾されたプロテアーゼの生産を測定する（Ｅｓｔｅｌｌら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．, ２６０：６５１８−６５２１（１９８５）参照）。この測定はＳｏｆｍａｘＰｒｏソフトウェアを用いて行い、特定の条件は以下のように設定されていた：タイプ：カイネティック（ｋｉｎｅｔｉｃ）；リダクション（Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）：ＶｍａｘＰｏｉｎｔ（リードベスト（Ｒｅａｄ ｂｅｓｔ）１５／２８ポイント）；Ｌｍ１：４０５ｎｍ；時間：５分；及びインターバル：１１秒。バチルススブチリス培地の各１０μＬを、１０ｍＭトリス＋０．００５％ＴＷＥＥＮ（商標）―８０、ｐＨ８．６；及び２５μＬの１００ｎｇ／ｍｌＡＡＰＦを含むトリス緩衝液で希釈した。修飾されたプロテアーゼの相対的活性を計算し、対応する修飾されたプロテアーゼ生産における各アミノ酸置換の影響を、修飾Ｖ０４９プレカーサーカープロテアーゼから処理された成熟プロテアーゼの活性に対する、それぞれの修飾されたプロテアーゼからの成熟プロテアーゼの活性の比として、決定した。結果を表２にまとめた。一旦、ＤＮＡ構築体がコンピテントバチルススブチリス株へ安定に組み込まれると、この修飾されたプロテアーゼの活性は、マイクロタイターアッセイで測定し、対応するプレカーサープロテアーゼの活性と比較する。
修飾されたプロテアーゼ生成の調節：プロテアーゼ活性のＡＡＰＦアッセイ
実施例２における説明で得られたバチルスブチリスのそれぞれを修飾されたプロテアーゼの生産についてアッセイを行った。この酵素生産は、基質である、スクシニル−Ｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアナライド（ｎｉｔｒｏａｎａｌｉｄｅ）（ＡＡＰＦ）に対する活性を評価する。このアッセイは、修飾されたプロテアーゼの生産を加水分解してｐ−ニトロアラニンを放出することにより生じる、４０５ｎｍにおける吸光度の増加分として、修飾されたプロテアーゼの生産を測定する（Ｅｓｔｅｌｌら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．, ２６０：６５１８−６５２１（１９８５）参照）。この測定はＳｏｆｍａｘＰｒｏソフトウェアを用いて行い、特定の条件は以下のように設定されていた：タイプ：カイネティック（ｋｉｎｅｔｉｃ）；リダクション（Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）：ＶｍａｘＰｏｉｎｔ（リードベスト（Ｒｅａｄ ｂｅｓｔ）１５／２８ポイント）；Ｌｍ１：４０５ｎｍ；時間：５分；及びインターバル：１１秒。バチルススブチリス培地の各１０μＬを、１０ｍＭトリス＋０．００５％ＴＷＥＥＮ（商標）―８０、ｐＨ８．６；及び２５μＬの１００ｎｇ／ｍｌＡＡＰＦを含むトリス緩衝液で希釈した。修飾されたプロテアーゼの相対的活性を計算し、対応する修飾されたプロテアーゼ生産における各アミノ酸置換の影響を、修飾Ｖ０４９プレカーサーカープロテアーゼから処理された成熟プロテアーゼの活性に対する、それぞれの修飾されたプロテアーゼからの成熟プロテアーゼの活性の比として、決定した。結果を表２にまとめた。一旦、ＤＮＡ構築体がコンピテントバチルススブチリス株へ安定に組み込まれると、この修飾されたプロテアーゼの活性は、マイクロタイターアッセイで測定し、対応するプレカーサープロテアーゼの活性と比較する。
一晩培養したＧｒａｎｔＩＩ培地細胞培養の１０μＬを１０ｍＭトリス＋０．００５％ＴＷＥＥＮ（商標）−８０、ｐＨ８．６、及び２５μＬの１００ｎｇ／ｍｌのＡＡＰＦ基質を含むトリス緩衝液１００μＬで希釈して、プロテアーゼ活性の評価に用いた。アッセイをマイクロタイタープレートで行い、ＳｏｆｔｍａｘＰｒｏソフトウェアを用いた。
結果はプレカーサーカーＶ０４９プロモーターの大部分のアミノ酸のアミノ酸置換は、プロテアーゼの成熟形態の生産を高める事を示した。更に、置換されたアミノ酸の各部位飽和は、各アミノ酸が同じ位置で２つ以上のアミノ酸で置換することができ、未修飾プロ領域を有するプレカーサープロテアーゼから得られたものに対して、成熟形態の生産が高められていることを示している。
＊「位置」はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の完全長Ｖ０４９プレカーサープロテアーゼにおける番号としてのアミノ酸の一を表している。位置１乃至２７はＶ０４９プレカーサー酵素のプロ領域における位置でのアミノ酸を意味している。
＃活性比は修飾されたプロテアーゼから処理された変異体プロテアーゼの活性を未修飾プレカーサープロテアーゼから処理された成熟プロモーターの活性で割った値である。
実施例４
この実施例において、ＧＧ３６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４）と呼ばれている、バチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）からのシブチリシンのプロ領域を前述の実施例で説明したのと同じ実験プロトコルを用いて、３３ポジションと５９ポジションで変異させた。プレカーサーポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４０）を変異させ、構築体を作り、前述のようにプロモーター発現の増加について試験を行った。
この実施例において、ＧＧ３６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４）と呼ばれている、バチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）からのシブチリシンのプロ領域を前述の実施例で説明したのと同じ実験プロトコルを用いて、３３ポジションと５９ポジションで変異させた。プレカーサーポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４０）を変異させ、構築体を作り、前述のようにプロモーター発現の増加について試験を行った。
結果は、Ｅ３３Ｇ，Ｅ３３Ｑ、及びＥ３３Ｖのアミノ酸置換が、未修飾プレカーサーよりも少なくとも５０％より多く野生型変異ＧＧ３６プロモーターを生産したことを示した。変異体にＨ３２Ｋはやせウ方成熟プロモーターの生産を２０％高めた。
これらの結果は完全長プロテアーゼのプロ領域における変異体には変異体プレカーサータンパク質の発現だけでなく、自然発生酵素の発現も改善することを示している。
Claims (12)
- 修飾された完全長プロテアーゼをコードする単離された修飾ポリヌクレオチドであって、
前記修飾された完全長プロテアーゼのプロ領域をコードしている修飾ポリヌクレオチドが配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）５、１３、又は２４４の２９乃至１０８及び１０９から選択される少なくとも１つのアミノ酸における置換をコードしている変異を含み、
前記変異が、Ｅ３３Ｒ、Ｅ３３Ｑ、およびＥ５７Ｎ、からなる群より選択されることを特徴とする、単離された修飾ポリヌクレオチド。 - 前記修飾された完全長プロテアーゼがセリンプロテアーゼである、請求項１の単離された修飾ポリヌクレオチド。
- 請求項１の修飾されたポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項３のベクターで形質転換された宿主細胞。
- 前記宿主細胞が微生物である、請求項４の宿主細胞。
- 前記宿主細胞がバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）から選択される微生物である、請求項４の宿主細胞。
- 前記宿主細胞がバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞である、請求項１１の宿主細胞。
- 微生物中で異種プロテアーゼを生成する方法であって、
（ａ）好適な条件でＢａｃｉｌｌｕｓ細胞を培養する工程であって、前記バチルス宿主細胞が修飾された完全長プロテアーゼをコードしている修飾ポリヌクレオチドを含み、前記修飾された完全長プロテアーゼをコードする修飾ポリヌクレオチドが配列番号５、１３、又は２４０の２９乃至１０８及び１０９の少なくとも１つのアミノ酸をコードしている変異を含むプロ領域を含み、前記変異が、Ｅ３３Ｒ、Ｅ３３Ｑ、およびＥ５７Ｎ、からなる群より選択されることを特徴とする工程、及び
（ｂ）微生物に前記プロテアーゼの生産をおこなわせる工程、を含む方法。 - 前記バチルス宿主細胞により生成された異種プロテアーゼを回収する、請求項８の方法。
- 前記プロテアーゼがアルカリセリンプロテアーゼである、請求項８の方法。
- 前記宿主細胞が、バチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスステアロセレモフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスアルカロフィリス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｈｉｌｕｓ）、バチルスハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルスコアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルスサーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスプミラス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルスツリンジェンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群より選択される、請求項８の方法。
- 前記宿主細胞がバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞である、請求項８の方法。
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