RU2009137600A - Модифицированные протеазы - Google Patents

Abstract

1. Выделенный модифицированный полинуклеотид, кодирующий модифицированную полноразмерную протеазу, где часть указанного модифицированного полинуклеотида, которая кодирует про-участок указанной полноразмерной протеазы, содержит мутацию, кодирующую замену, по меньшей мере, в одном аминокислотном положении, выбранном из положений, эквивалентных аминокислотным положениям 28-108 и 109 SEQ ID NO:5, 13 или 244. ! 2. Выделенный модифицированный полинуклеотид по п.1, где указанная модифицированная полноразмерная протеаза представляет собой сериновую протеазу. ! 3. Выделенный модифицированный полинуклеотид по п.1, где указанная модифицированная полноразмерная протеаза представляет собой щелочную сериновую протеазу, полученную из предшественника щелочной сериновой протеазы дикого типа или его варианта. ! 4. Выделенный модифицированный полинуклеотид по п.3, где указанный предшественник щелочной сериновой протеазы представляет собой щелочную протеазу B. clausii или B. Lentus. ! 5. Выделенный модифицированный полинуклеотид по п.1, где указанный выделенный модифицированный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, указанную в SEQ ID NO:1, 9 или 240. ! 6. Выделенный модифицированный полинуклеотид по п.1, где указанная часть указанного модифицированного полинуклеотида, которая кодирует про-участок, содержит мутацию, кодирующую замену, по меньшей мере, в одном аминокислотном положении, выбранном из E33, E43, A44, E47, V49, E57, A59, E63, E70, E74, E84 и E88 SEQ ID NO:5, 13 или 244. ! 7. Выделенный полинуклеотид по п.6, где указанная замена E33 выбрана из E33D, E33I, E33S, E33N, E33K, E33H, E33Q и E33R. ! 8. Выделенный полинуклеотид по п.6, где указанная замена E57 выбрана из E57F, E57W, E57K, E57R, E57D,

Claims (26)

1. Выделенный модифицированный полинуклеотид, кодирующий модифицированную полноразмерную протеазу, где часть указанного модифицированного полинуклеотида, которая кодирует про-участок указанной полноразмерной протеазы, содержит мутацию, кодирующую замену, по меньшей мере, в одном аминокислотном положении, выбранном из положений, эквивалентных аминокислотным положениям 28-108 и 109 SEQ ID NO:5, 13 или 244.

2. Выделенный модифицированный полинуклеотид по п.1, где указанная модифицированная полноразмерная протеаза представляет собой сериновую протеазу.

3. Выделенный модифицированный полинуклеотид по п.1, где указанная модифицированная полноразмерная протеаза представляет собой щелочную сериновую протеазу, полученную из предшественника щелочной сериновой протеазы дикого типа или его варианта.

4. Выделенный модифицированный полинуклеотид по п.3, где указанный предшественник щелочной сериновой протеазы представляет собой щелочную протеазу B. clausii или B. Lentus.

5. Выделенный модифицированный полинуклеотид по п.1, где указанный выделенный модифицированный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, указанную в SEQ ID NO:1, 9 или 240.

6. Выделенный модифицированный полинуклеотид по п.1, где указанная часть указанного модифицированного полинуклеотида, которая кодирует про-участок, содержит мутацию, кодирующую замену, по меньшей мере, в одном аминокислотном положении, выбранном из E33, E43, A44, E47, V49, E57, A59, E63, E70, E74, E84 и E88 SEQ ID NO:5, 13 или 244.

7. Выделенный полинуклеотид по п.6, где указанная замена E33 выбрана из E33D, E33I, E33S, E33N, E33K, E33H, E33Q и E33R.

8. Выделенный полинуклеотид по п.6, где указанная замена E57 выбрана из E57F, E57W, E57K, E57R, E57D, E57M, E57C, E57Q, E57S, E57H и E57N.

9. Выделенный модифицированный полинуклеотид, содержащий про-последовательность предшественника, которая подвергнута мутации, чтобы она кодировала замену, по меньшей мере, в одном аминокислотном положении, выбранном из положений, эквивалентных аминокислотным положениям 28-108 и 109 SEQ ID NO:5, 13 или 244.

10. Выделенный модифицированный полинуклеотид по п.9, дополнительно содержащий полинуклеотид, кодирующий полноразмерную протеазу, содержащую зрелую область, где указанная полинуклеотидная последовательность, кодирующая зрелую область, по меньшей мере, приблизительно на 70% идентична SEQ ID NO:8, 16 или 247.

11. Вектор, содержащий модифицированные полинуклеотиды по п.1 или 9.

12. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п.11.

13. Клетка-хозяин по п.12, где указанная клетка-хозяин представляет собой микроорганизм.

14. Клетка-хозяин по п.12, где указанная клетка-хозяин представляет собой микроорганизм, выбранный из группы, состоящей из Bacillus sp., Streptomyces sp., Escherichia sp. и Aspergillus sp.

15. Клетка-хозяин по п.12, где указанная клетка-хозяин представляет собой клетку B. subtilis.

16. Протеаза, продуцируемая клеткой-хозяином по п.12.

17. Способ пролучения гетерологичной протеазы в микроорганизме, включающий стадии: (a) культивирования клетки-хозяина Bacillus в пригодных условиях, где клетка-хозяин Bacillus содержит модифицированный полинуклеотид, кодирующий модифицированную протеазу; и (b) позволения микроорганизму продуцировать указанную протеазу.

18. Способ по п.17, где указанную гетерологичную протеазу, продуцируемую указанным хозяином Bacillus, выделяют.

19. Способ по п.17, где указанная протеаза представляет собой щелочную сериновую протеазу.

20. Способ по п.17, где указанный модифицированный полинуклеотид кодирует протеазу, содержащую зрелую область, которая, по меньшей мере, приблизительно на 70% идентична SEQ ID NO:8,16 или 247.

21. Способ по п.17, где указанный полинуклеотид, кодирующий модифицирующую протеазу, содержит про-участок, содержащий мутацию, кодирующую замену, по меньшей мере, в одном аминокислотном положении, выбранном из группы, состоящей из положений, эквивалентных аминокислотным положениям 28-108 и 109 SEQ ID NO:5, 13 или 240.

22. Способ по п.21, где указанная, по меньшей мере, одна аминокислотная замена выбрана из E33D, E33I, E33S, E33N, E33K, E33H, E33Q, E33R, E57F, E57W, E57K, E57R, E57D, E57M, E57C, E57Q, E57S, E57H и E57N.

23. Способ по п.17, где указанная клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из B. licheniformis, B. lentus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. brevis, B. stearothermophilus, B. clausii, B. alkalophilus, B. halodurans, B. coagulans, B. circulans, B. pumilus и B. thuringiensis.

24. Способ по п.17, где указанная гетерологичная протеаза представляет собой протеазу B. clausii или B. lentus.

25. Способ по п.17, где указанная клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина B. subtilis.

26. Способ по п.17, где указанная гетерологичная протеаза обладает отношением продукции, равным, по меньшей мере, 1.