JP2010528656A - 複数のタンパク質の性質を改良する方法 - Google Patents

複数のタンパク質の性質を改良する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、産業用、消費者用、又は製薬用利用において一以上の有用な性質を有するタンパク質を得るための効率的な方法を提供する。幾つかの好ましい実施態様においては、本発明は候補となる酵素の簡略セットをスクリーニングすることにより所定の適用に対して優れた酵素を生産するための方法を提供する。
【選択図】図１

Description

関連出願
本出願は２００７年６月６日に出願された米国仮出願第60/933,307、60/933,331、及び60/933,312について優先権を主張する。これらの全部は参照により本明細書に取り込まれる。
発明分野
本発明は、産業用、消費者用、又は製薬用利用において一以上の有用な性質を有するタンパク質を得るための効率的な方法を提供する。幾つかの好ましい実施態様においては、本発明は候補となる酵素の簡略セットをスクリーニングすることにより所定の適用に対して優れた酵素を生産するための方法を提供する。
発明の背景
タンパク質の自然環境の外側で機能するタンパク質の性質はしばしば不十分である。例えば、酵素（例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ等）は、しばしば洗濯洗剤において繊維から汚れを洗浄するために用いられ、一般的に活性成分の複合的な組合せを含む。実際、多くの洗浄製品は界面活性剤系、漂白剤、ビルダー、泡抑制剤、泥懸濁剤、泥放出剤、蛍光増白剤、柔軟剤、分散剤、色移り阻害化合物、研削材、抗菌剤、香料、並びに洗浄用の酵素を含む。つまり、今日の洗剤の複合体にかかわらず、不十分な酵素性能のせいで完全に除去しがたい多くの汚れが存在する。酵素開発における多くの研究にかかわらず、特定の使用及び条件に対するタンパク質工学の方法が当分野で必要とされている。実際に、産業用利用における酵素の性能を最適化するために迅速かつ系統的に静電気的性質を調整する方法が当分野に必要とされている。特に、洗浄溶液中の改善される活性、安定性、及び溶解性を有するために産業用に有用な酵素をタンパク質工学で作る方法が当分野に必要であり、かかる酵素は、リパーゼ、アミラーゼ、クチナーゼ、マンナーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、プロテアーゼ、及び他の酵素を含むが、これらに限定されない。さらに、形質転換宿主細胞から高いレベルで発現できる組み換え酵素をタンパク質工学で創る方法が当分野で必要とされている。
発明の趣旨
本発明は、産業用、消費者用、又は製薬用利用において一以上の有用な性質を有するタンパク質を得るための効率的な方法を提供する。幾つかの好ましい実施態様においては、本発明は候補となる酵素の簡略セットをスクリーニングすることにより所定の適用に対して優れた酵素を生産するための方法を提供する。
本発明はタンパク質変異体のライブラリーを提供する方法であって、
所望の試験における所望の性質（例えば、物理的性質）の範囲にわたる複数のタンパク質変異体を試験し、
前記所望の試験における好ましい結果に関係する前記所望の性質の範囲内で最適条件を同定し、
前記所望の性質の範囲の最適条件内で複数のタンパク質変異体を提供し、それにより前記所望の試験における好ましい結果を有するメンバーを多く有するタンパク質変異体のライブラリーを提供する
ことを含む方法を提供する。幾つかの好ましい実施態様においては、好ましい結果が所望の試験において見られる最大値の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、９５％より大きい値に相当する。さらなる実施態様においてはさらに所望の試験において、複数のタンパク質変異体及び野生型タンパク質を試験する段階を含む方法を含む。さらなる実施態様において、改善される結果を有するようなタンパク質変異体を同定する段階を含み、野生型タンパク質が所望の試験において１．０値を達成し、改善される結果を有するタンパク質変異体が１．０より大きい値を達成することを特徴とする方法である。幾つかの好ましい実施態様において、性能指標＝試験性能／野生型性能である。幾つかの特に好ましい実施態様においては、タンパク質は酵素である。幾つかのさらに好ましい実施態様においては、酵素はプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ポリエステラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ又はオキシダーゼである。幾つかのさらなる実施態様においては、タンパク質が抗体、又はホルモン又はサイトカイン（例えば、成長因子）である。幾つかの好ましい実施態様においては、プロテアーゼが中性メタロプロテアーゼである。幾つかの特に好ましい実施態様においては、親プロテアーゼが中性メタロプロテアーゼの野生型成熟形態である。さらなる好ましい実施態様においては、変異体はバシルス（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科の中性メタロプロテアーゼ由来である。他の実施態様においては、変異体はバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の中性メタロプロテアーゼ由来である。幾つかの他の実施態様においては、プロテアーゼはセリンプロテアーゼである。特に好ましい実施態様においては、親プロテアーゼはセリンプロテアーゼの野生型成熟形態である。さらなる好ましい実施態様においては、変異体はミクロコッカス亜目（Ｓｕｂｏｒｄｅｒ Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｉｎｅａｅ）のセリンプロテアーゼ由来である。さらに実施態様においては、変異体はセルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属のセリンプロテアーゼ由来である。さらなる実施態様においては、所望の性質は野生型酵素に比較した電荷である。幾つかの特に好ましい実施態様においては、所望の性質はゼータ電位である。幾つかの追加的な好ましい実施態様においては、所望の試験は洗浄性能に関するものである。幾つかの特に好ましい実施態様においては、洗浄性能は洗剤における血液、牛乳、インク（ＢＭＩ）洗浄性能を含む。幾つかの実施態様においては、洗浄性能は５と１２の間のｐＨを有する粉状又は液状洗剤へ構成される洗浄組成物において試験される。さらなる実施態様においては、塩基性ｐＨを有する冷水液体洗剤中で試験される。幾つかの別の実施態様においては、所望の試験は基質結合測定、及び／又は酵素阻害測定、及び／又は発現レベル測定、及び／又は洗剤安定性測定、及び／又は熱安定性測定、及び／又は反応速度測定、及び／又は反応範囲測定、及び／又は熱活性測定を含む。
また、本発明は試験タンパク質折りたたみの改良される変異体を生産する方法であって、
所望のアッセイにおける所望の性質の範囲にわたるプローブタンパク質折りたたみの複数の変異体をアッセイし、
前記所望のアッセイにおける好ましい結果に関係する前記所望の性質の前記範囲内で最適条件を同定し、
所望のアッセイにおける前記試験タンパク質折りたたみの親タンパク質をアッセイし、
親タンパク質にアミノ酸置換を導入することにより試験タンパク質折りたたみの改良される変異体を生産し、それにより、前記改良される変異体が前記所望の性質の範囲の最適条件内であること
を含む方法である。幾つかの実施態様においては、試験タンパク質折りたたみ及びプローブタンパク質折りたたみは異なる。幾つかのさらなる実施態様においては、試験タンパク質折りたたみは、セリンプロテアーゼ及びプローブタンパク質折りたたみは中性メタロプロテアーゼである。
また、本発明は基質汚れに特異的な酵素変異体を生産する方法であって、
標準緩衝液における基質汚れのゼータ電位を決定し、
前記標準緩衝液における親酵素のゼータ電位を決定し、及び
前記親酵素にアミノ酸置換を導入することにより基質汚れに特異的な酵素生産し、それにより変異体酵素のゼータ電位が前記親酵素の前記ゼータ電位より前記基質汚れのゼータ電位に近くなることを含む方法である。
さらに、本発明は複数の汚れを洗浄するための組成物を生産する方法であって、
標準緩衝液における前記複数の汚れのそれぞれのゼータ電位を決定し、
前記標準緩衝液において前記複数の汚れ一つのゼータ電位と実質的に同等であるゼータ電位を有する洗浄酵素を選択し、その選択が各複数の汚れが少なくとも一つの洗浄酵素と対になるまで続くことを特徴とし、及び
標準緩衝液に等しいｐＨ及び導電率を有する洗剤溶液中ｂ）段階の洗浄酵素の含有により複数の汚れを洗浄するための組成物を調製することを含む方法である。
本発明はタンパク質変異体のライブラリーを提供する方法であって、
ａ）少なくとも一つの所望の試験における少なくとも一つの所望の性質の範囲にわたる複数のタンパク質変異体を試験し、
ｂ）前記少なくとも一つの所望の試験における好ましい結果に関係する前記所望の性質の範囲内で最適条件を同定し、
ｃ）前記所望の性質の範囲の最適条件内で複数のタンパク質変異体を提供し、それにより前記少なくとも一つの所望の試験における好ましい結果を有するメンバーを多く有するタンパク質変異体のライブラリーを提供する
ことを特徴とする方法を提供する。幾つかの実施態様においては、所望の性質が物理的性質である。さらに、幾つかの実施態様においては、好ましい結果が所望の試験に観察される最大値の少なくとも約５０％より大きい値に相当する。さらなる実施態様においては、好ましい結果が所望の試験に観察される最大値の少なくとも約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、９５％より大きい値に相当する。幾つかのさらなる実施態様においては、さらに
ｄ）少なくとも一つの所望の試験において、前記複数のタンパク質変異体及び少なくとも一つの野生型タンパク質を試験する段階を含む方法である。幾つかのさらなる実施態様においては、改善される結果を有するような前記タンパク質変異体を同定する段階をさらに含み、野生型タンパク質が少なくとも一つ所望の試験において１．０の性能指標値を有し、前記改善される結果を有するタンパク質変異体が１．０より大きい値であることを特徴とすることを含む方法である。幾つかの実施態様においては、タンパク質が抗体、ホルモン、又はサイトカインである。幾つかの好ましい実施態様においては、タンパク質が酵素である。幾つかの特に好ましい実施態様においては、酵素が、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ポリエステラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、オキシダーゼ、又はトランスフェラーゼである。幾つかのより好ましい実施態様においては、プロテアーゼが中性メタロプロテアーゼ又はセリンプロテアーゼである。幾つかのさらなる好ましい実施態様においては、前記セリンプロテアーゼがスブチリシンである。幾つかの別の好ましい実施態様においては、前記中性メタロプロテアーゼがバシルス（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科のメンバーから得られる。幾つかのさらなる実施態様においては、セリンプロテアーゼがセルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属のメンバーから得られる。幾つかの追加的な実施態様においては、前記酵素がセルラーゼである一方、他の実施態様においては、前記酵素がアミラーゼである。幾つかのさらなる実施態様においては、所望の性質が電荷である。幾つかの追加的な実施態様においては、タンパク質変異体及び野生型酵素の前記電荷が決定され及び比較される。幾つかのさらなる実施態様においては、前記所望の性質がゼータ電位である。幾つかのまたさらなる実施態様においては、前記タンパク質変異体及び前記野生型酵素の前記ゼータ電位が決定され及び比較される。幾つかの好ましい実施態様においては、前記タンパク質変異体の前記ゼータ電位が約−４０ｍＶと約＋４０ｍＶの間である一方、他の実施態様においては、前記タンパク質変異体の前記ゼータ電位が約−２０ｍＶと約＋２０ｍＶの間であり、またさらなる実施態様においては、前記タンパク質変異体の前記ゼータ電位が約−１０ｍＶと約＋１０ｍＶの間である。幾つかのさらなる実施態様においては、所望の試験が洗浄性能を含む。幾つかの好ましい実施態様においては、前記洗浄性能が血液、牛乳、インク洗浄性能を含む。幾つかのさらなる実施態様においては、前記タンパク質変異体及び野生型タンパク質が洗剤組成物において試験される。幾つかの好ましい実施態様においては、前記洗剤組成物が約５と約１２．０の間のｐＨを有する粉状又は液状洗剤へ構成される。幾つかのさらなる好ましい実施態様においては、前記洗浄性能が塩基性ｐＨを有する冷水液体洗剤中で試験されることを特徴とする。幾つかの別の実施態様においては、前記洗浄性能が温水洗剤中で試験される。幾つかの好ましい実施態様においては、少なくとも一つの所望の試験が基質結合、酵素阻害、発現レベル、洗剤安定性、熱安定性、反応速度、反応範囲、熱活性、デンプン液状化、バイオマス分解、及び／又は糖化を測定することを含む。
また、本発明は試験タンパク質折りたたみの少なくとも一つの改良される変異体を生産する方法であって、
ａ）少なくとも一つの所望のアッセイにおける少なくとも一つの所望の性質の範囲にわたるプローブタンパク質折りたたみの複数の変異体をアッセイし、
ｂ）前記少なくとも一つの所望のアッセイにおける好ましい結果に関係する前記少なくとも一つの所望の性質の前記範囲内で最適条件を同定し、
ｃ）前記少なくとも一つの所望のアッセイにおいて前記試験タンパク質折りたたみの親タンパク質をアッセイし、
ｄ）親タンパク質にアミノ酸修飾を導入することにより前記試験タンパク質折りたたみの少なくとも一つの改良される変異体を生産し、それにより、少なくとも一つの改良される変異体が前記少なくとも一つの所望の性質の前記最適条件範囲内であること
を特徴とする方法である。幾つかのさらなる実施態様においては、前記修飾が少なくとも一つのアミノ酸置換を含む。いくつかの追加的な実施態様においては、前記試験タンパク質折りたたみ及び前記プローブタンパク質折りたたみが異なる。幾つかの実施態様においては、前記所望の性質がゼータ電位である。またさらなるいくつかの実施態様においては、前記試験タンパク質折りたたみが少なくとも一つのセリンプロテアーゼを含み及び前記プローブタンパク質折りたたみが少なくとも一つの中性メタロプロテアーゼを含む。
また、本発明は基質汚れに特異的な酵素変異体を生産する方法であって、
ａ）標準緩衝液において基質汚れのゼータ電位を決定し、
ｂ）前記標準緩衝液において親酵素のゼータ電位を決定し、及び
ｃ）前記親酵素に少なくとも一つのアミノ酸修飾を導入することにより基質汚れに特異的な酵素を生産し、それにより、前記基質汚れに特異的な酵素変異体の前記ゼータ電位が前記親酵素の前記ゼータ電位より前記基質汚れのゼータ電位に近いこと
を含む方法を提供する。幾つかの実施態様においては、前記修飾が少なくとも一つのアミノ酸置換、欠損及び／又は挿入を含む。幾つかの別の実施態様においては、前記修飾が前記親酵素の化学的修飾を含む。幾つかのさらなつ実施態様においては、前記基質汚れに特異的な酵素変異体が正に荷電し、吸熱性であり、及び基質汚れが負に荷電する。幾つかの別の実施態様においては、前記基質汚れに特異的な酵素変異体が負に荷電し、発熱性であり、及び基質汚れが負に荷電する。幾つかのさらなる実施態様においては、前記基質汚れに特異的な酵素変異体が正に荷電し、発熱性であり、及び基質汚れが正に荷電する。また追加的実施態様においては、前記基質汚れに特異的な酵素変異体が負に荷電し、吸熱性であり、及び基質汚れが正に荷電する。
また、本発明は複数の汚れを洗浄するための組成物を生産する方法であって
ａ）標準緩衝液において前記複数の汚れのそれぞれのゼータ電位を決定し、
ｂ）前記標準緩衝液において少なくとも一つの前記複数の汚れのゼータ電位に実質的に等しいゼータ電位を有する洗浄酵素を選択し、及び
ｃ）複数の汚れを洗浄するための組成物を生産し、前記組成物がｂ）段階にて選択される少なくとも一つの洗浄酵素を含むことを特徴とする
ことを含む方法の提供である。幾つかのさらなる実施態様においては、前記組成物が前記標準緩衝液と実質的に等しいｐＨ及び導電率を有する洗剤溶液を含む。幾つかのさらなる実施態様においては、前記選択段階が２以上の洗浄酵素を同定する。また幾つかの追加的な実施態様においては、前記組成物が少なくとも二つの洗浄酵素を含み、前記少なくとも二つの洗浄酵素が少なくとも二つの前記複数の汚れの前記ゼータ電位に相当するゼータ電位を有する。
また、本発明は本明細書にて上述する方法を用いて生産される複数の汚れを洗浄するための組成物を提供する。幾つかの好ましい実施態様においては、前記組成物が少なくとも一つの洗浄酵素を含む。幾つかの別の実施態様においては、前記少なくとも一つ洗浄酵素が変異タンパク質である。幾つかのさらなる実施態様においては、前記変異タンパク質が前記変異タンパク質を生産するために用いる野生型前駆体タンパク質より負に荷電する一方、幾つかの別の実施態様においては、前記変異タンパク質が前記変異タンパク質を生産するために用いる野生型前駆体タンパク質より正に荷電する。幾つかの追加的な実施態様においては、前記変異タンパク質は前記変異タンパク質を生産するために用いる野生型前駆体タンパク質より負に荷電し、陰イオン界面活性剤を含む洗剤における増強される安定性を与える。
図１はＡＡＴＣＣ液体洗剤（黒三角）及びｐＨと導電率（５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、２．５ｍＭ ＮａＣｌ）に適合する緩衝液（白丸）において測定するときの野生型ＡＳＰに比較して正味電荷変化に応じたＡＳＰ変異体の相対的な血液、牛乳、インク（ＢＭＩ）微小布見本活性（最良性能に対して標準化）を示す。 図２はＡＡＴＣＣ液体洗剤（黒丸）において測定するときの野生型ＡＳＰに比較して正味電荷変化に応じたＡＳＰ電荷組み合わせライブラリーの相対的な血液、牛乳、インク（ＢＭＩ）微小布見本活性（最良性能に対して標準化）を示す。 図３は多様なＮａＣｌ濃度、２．５ｍＭ（白丸）、１６ｍＭ（灰色丸）及び１００ｍＭ（黒丸）を含有する５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、２．５ｍＭ ＮａＣｌ）に適合する緩衝液（白丸）において測定するときの野生型ＡＳＰに比較して正味電荷変化に応じたＡＳＰ変異体の相対的な血液、牛乳、インク（ＢＭＩ）微小布見本活性（最良性能に対して標準化）を示す。 図４は北アメリカ液体洗濯条件にて測定するときの親ＦＮＡ又は野生型ＧＧ３６（白記号）に比較して正味電荷変化に応じたＦＮＡ（４Ａ）及びＧＧ３６（４Ｂ）電荷組み合わせライブラリー変異体（黒記号）の相対的な血液、牛乳、インク（ＢＭＩ）微小布見本活性（親分子に対して標準化）を示す。 図５は西ヨーロッパ液体洗濯条件にて測定するときの親ＦＮＡ又は野生型ＧＧ３６（白記号）に比較して正味電荷変化に応じたＦＮＡ（５Ａ）及びＧＧ３６（５Ｂ）電荷組み合わせライブラリー変異体（黒記号）の相対的な血液、牛乳、インク（ＢＭＩ）微小布見本活性（親分子に対して標準化）を示す。 図６は日本洗濯用粉体条件にて測定するときの親ＦＮＡ又は野生型ＧＧ３６（白記号）に比較して正味電荷変化に応じたＦＮＡ（６Ａ）及びＧＧ３６（６Ｂ）電荷組み合わせライブラリー変異体（黒記号）の相対的な血液、牛乳、インク（ＢＭＩ）微小布見本活性（親分子に対して標準化）を示す。 図７は西ヨーロッパ自動食器洗浄条件にて測定するときの親ＦＮＡ又は野生型ＧＧ３６（白記号）に比較して正味電荷変化に応じたＦＮＡ（７Ａ）及びＧＧ３６（７Ｂ）電荷組み合わせライブラリー変異体（黒記号）の相対的なベイクドエッグ微小布見本活性（親分子に対して標準化）を示す。 図８は北アメリカ洗濯条件にて測定するときの親（黒記号）に比較して正味電荷変化に応じたＳ２４２Ｑ電荷組み合わせライブラリー変異体（白記号）のコメデンプン微小布見本活性（親に対して標準化）を示す。 図９は西ヨーロッパ洗濯条件にて測定するときの親（黒記号）に比較して正味電荷変化に応じたＴＳ２３ｔ電荷組み合わせライブラリー変異体（白記号）のコメデンプン微小布見本活性（親に対して標準化）を示す。 図１０は親（黒記号）に比較して正味電荷変化に応じたＳ２４２Ｑ電荷組み合わせライブラリー変異体（白記号）の相対的ＢＯＤＩＰＹデンプン加水分解活性（親に対して標準化）を示す。 図１１は野生型ＡｍｙＳに比較して正味電荷変化に応じた第一ＡｍｙＳ電荷ラダーの最終粘度を示す。 図１２は緩衝液（５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、２．５ｍＭ ＮａＣｌ）において測定するときのゼータ電位に対するＡＳＰ変異体のＢＭＩ微小布見本活性を主軸に示す。副軸はｚスコアに対するＡＳＰ変異体のＢＭＩ微小布見本活性（正規分布に適合するピーク値により標準化、実線）を示す。基質汚れのゼータ電位は−８．９７ｍＶに等しい。 図１３は多様なＮａＣｌ濃度、２．５ｍＭ（白）、１６ｍＭ（灰色）及び１００ｍＭ（黒）を伴う５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０において測定するときの結合ＡＳＰフラクションに対するＡＳＰ変異体のＢＭＩ微小布見本活性を示す。 図１４はＡＡＴＣＣ ＨＤＬ洗剤（三角）又は多様なＮａＣｌ濃度、２．５ｍＭ（白丸）、１６ｍＭ（灰色丸）及び１００ｍＭ（黒丸）を伴う５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０において測定するときの野生型ＡＳＰに比較して正味電荷変化に応じて結合ＡＳＰフラクションを示す。 図１５は５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、２．５ｍＭ ＮａＣｌにおいて測定するときの親ＡＳＰ‐Ｒ１４Ｉ（黒記号）に比較して正味電荷変化に応じてＡＳＰ電荷組み合わせ変異体（白記号）の結合フラクションを示す。 図１６は５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、２．５ｍＭ ＮａＣｌにおいて測定するときのゼータ電位に応じて結合ＡＳＰフラクションを示す。 図１７は野生型ＡＳＰ比較して正味電荷変化に応じてバシルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるＡＳＰ変異体の発現レベルを示す。 図１８は標準緩衝液５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、２．５ｍＭ ＮａＣｌにて測定されるゼータ電位に応じてバシルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるＡＳＰ（黒丸）及びＮｐｒＥ（白丸）変異体の発現レベルを主軸に示す。副軸はｚ‐スコアに対するＡＳＰ変異体の発現レベル（正規分布に適合するピーク値より標準化、実線）を示す。 図１９は野生型ＡＳＰに比較しての正味電荷変化に応じたＡＳＰ変異体のＬＡＳ安定性を示す。 図２０は親ＦＮＡに比較しての正味電荷変化に応じたＦＮＡ変異体のＬＡＳ／ＥＤＴＡ安定性を示す。 図２１は親ＴＳ２３ｔ‐７ｍｕｔに比較しての正味電荷変化に応じたＴＳ２３ｔ変異体のＬＡＳ／ＥＤＴＡ安定性を示す。 図２２は野生型ＡＳＰに比較しての正味電荷変化に応じたＡＳＰ変異体の熱安定性を示す。 図２３は野生型ＡｍｙＳに比較しての正味電荷変化に応じた第一ＡｍｙＳ電荷ラダーの熱安定性を示す。 図２４は異なる温度、４０℃、５０℃及び６０℃に関してそれぞれ野生型ＡＳＰ及びＮｐｒＥに比較しての正味電荷変化に応じたＡＳＰ（２４Ａ）及びＮｐｒＥ（２４Ｂ）の熱活性を示す。熱活性は３０℃活性（上昇温度の活性を３０℃での活性で割る）のフラクションとして示す。 図２５は異なる温度、４０℃、５０℃及び６０℃でのゼータ電位に応じたＡＳＰ（２５Ａ）及びＮｐｒＥ（２５Ｂ）の熱活性を示す。熱活性は３０℃活性（上昇温度の活性を３０℃での活性で割る）のフラクションとして示す。 図２６は５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、２．５ｍＭ ＮａＣｌにおける３０℃（白丸）及び４０℃（黒丸）でのＡＳＰ電荷ラダーへの熱安定性を示す。 図２７はｐＨ８．６でのアミノ酸残基置換に関して電荷変化を示す電荷変化マトリックスを提供する。このマトリックスから親酵素と比較するとき変異体酵素の正味電荷変化を容易に決定できる。 図２８はアミノ酸残基置換に関しての水素‐結合能力変化を示す水素‐結合能力変化マトリックスを提供する。このマトリックスから親酵素と比較するとき変異体酵素の正味水素‐結合能力変化を容易に決定できる。 図２９はアミノ酸残基置換に関するハイドロパシシティー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）変化を示すカイト‐ドーリットル ハイドロパシシティー（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）変化マトリックスを提供する。このマトリックスから親酵素と比較するときの変異体酵素の正味ハイドロパシシティー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）変化を容易に決定できる。 図３０はアミノ酸残基置換に関する疎水性変化を示すアイゼンバーグ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）疎水性変化マトリックスを提供する。このマトリックスから親酵素と比較するときの変異体酵素の正味疎水性変化を容易に決定できる。 図３１はｐＨに応じた第一ＡｍｙＳ電荷ラダーのコメデンプン洗浄活性を示す。ｐＨ３．０から４．２５は２００ｍＭ 蟻酸ナトリウム＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０である。ｐＨ４．２５から５．５は２００ｍＭ 酢酸ナトリウム＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０である。データは滴定曲線に適合し、単一ｐＫａ値をそれぞれ伴う。 図３２は図３１にて決定したｐＫａ値で野生型ＡｍｙＳと比較した電荷変化に対してプロットしたものを示す。
発明の一般的な説明
本発明は、産業用、消費者用、又は製薬用利用において一以上の有用な特性を有するタンパク質を得るための効率的な方法を提供する。幾つかの好ましい実施態様においては、本発明は候補となる酵素の簡略セットをスクリーニングすることにより所定の適用に対して優れた酵素を生産するための方法を提供する。
プロテアーゼスブチリシンは洗濯洗剤において用いる主要な酵素であり、おそらく世界で最も広く使用される酵素である。およそ２０年前、表面静電効果はスブチリシンの触媒活性を調節できることが明らかとなった（例えば、Russell and Fersht, Nature 328:496-500 [1987]を参照願いたい）。最近、スブチリシンの正味電荷の変化に関係する変異が洗剤における洗浄性能に対して顕著な効果を有することが観察された（例えば、参照により本明細書に取り込まれるEP Patent No. 0 479 870 B1を参照願いたい）。この有用な効果は洗浄液体のｐＨに接近するようにスブチリシンのｐＩ（等電点）がシフトした結果と考えられた。しかしながら、後の研究によって、この結論は必ずしも適切ではないと実証された（例えば、参照により本明細書に取り込まれるUS Patent No. 6,673,590 B1を参照願いたい）。この特許で示すように、スブチリシンにおける電荷変異の効果は洗剤濃度にかなり依存し、低い洗剤濃度にてより効果的な酵素を有する場合親スブチリシンのｐＩを低くする変異を伴い、高い洗剤濃度にてより効果的な酵素を有する場合ｐＩを高くする変異を伴う。洗浄液体における洗剤濃度は世界中で非常に多様なのでこれはとても有用である。つまり、スブチリシンの洗浄性能に関して最適ｐＩがあり、洗浄液のｐＨ及び洗剤濃度に依存することは当業者に明らかとった。さらに、洗濯洗剤におけるスブチリシンの活性を改善する努力が記載された（例えば、参照により本明細書に取り込まれるUS Pat. Publication No. 2005/0221461を参照願いたい）。驚くことに、親スブチリシンと同じ正味静電電荷を有するスブチリシンは高い及び低い両方の洗剤濃度条件下洗浄性能を増加したことがわかった。つまり、タンパク質（例えば、酵素）の静電気の性質はタンパク質の機能に大きな効果を有する。
従来、優れた酵素を開発する試みは表面に対する酵素の結合を最小化することに絞られていた。例えば、幾つかの方法は不溶性基質への吸着を低減する変異体酵素を得るためにスブチリシン配列を改変することに関係した（例えば、WO 95/07991を参照願いたい）。別のアプローチについては、所定のｐＨにて零の正味電荷を有する変異体酵素を得るためにスブチリシンのｐＩを改変した（例えば、WO 91/00345を参照願いたい）。しかしながら、本発明の開発中に判明したように、これらのアプローチは必ずしも成功しない。本明細書に記載のように、酵素の表面特性は、結合特性を含み、表面電荷又は疎水性の変化の関数として、絶えず変化するものではなく、一般的に最適条件を有する。通常かなり活性的な酵素でさえ表面特性は他の条件下及び／又は他の基質を伴う場合よりある条件下及びある基質を伴う反応全体をずっと遅くさせる。本発明の幾つかの実施態様においては、酵素の表面特性は酵素表面上の一以上のアミノ酸の性質を変えることにより変化した。これらの変化が任意の他のアミノ酸と相互作用せず、酵素機能に必要の無い表面上の部位でなされる場合、それらの部位で置換されたアミノ酸の性質に基づいて、タンパク質の性質を本発明の方法を用いて予想できる。幾つかの実施態様においては、これらの部位は構造データから容易に同定される一方、他の実施態様においては、相同体配列アライメント、部位評価ライブラリーデータ及び／又は任意のそれらの組み合わせが使用できる。さらなる実施態様においては、アミノ酸スコアリングマトリックスがアミノ酸置換を導くのに役立ち、置換アミノ酸の性質に相関するタンパク質のそれらの物理的性質を同定するために用いることができる。
本発明は、産業用、消費者用、又は製薬用利用において一以上の有用な性質を有するタンパク質を得るための効率的な方法を提供する。特に、本発明は候補となる酵素の簡略セットをスクリーニングすることにより所定の適用に対して優れた酵素を生産するための方法を提供する。一般的なセリンプロテアーゼ（例、ＡＳＰ）及び一般的なメタロプロテアーゼ（例、ＮｐｒＥ）に関して本明細書に記載するけれども、本発明の組成物及び方法はプロテアーゼに限定されない。実際、本発明は酵素の多様な分類（ｃｌａｓｓ）並びにプロテアーゼ（例えば、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、オキシドリダクターゼ、クチナーゼ、マンナーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ等）の性能を改良することに用いる。実際、本発明は任意の特定の酵素又は酵素分類に限定されることを意図しない。さらに、本発明は非酵素タンパク質の性質の最適化及び所望の優れたタンパク質の生産に用いる。
本発明の実施には、特に定義しない限り、当業者の知識の範囲内である、タンパク質精製、分子生物学、微生物学、及び組み換えＤＮＡ技術が用いられる。そのような技術は当業者に知られ、当業者に良く知られている多くのテキストや参考文献に記載されている。本明細書に記載した全ての特許、特許出願、論文及び出版物は、既述の又はこれ以降に記載するもの両者ともに、引用により本明細書に明確に組み入れられる。
本明細書で、特に定義しない限り、、本明細書で用いる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の分野の当業者により一般的に理解されているのと同一の意味をもつ。本明細書に記載されたものに類似するまたは同等の方法や材料は本発明の実施に用いることができるけれども、若干の好ましい方法と材料は本明細書に記載されている。従って、直ぐ後に定義される用語は、全体として本明細書を参照することにより、より十分に明らかにされる。
また、本明細書にて用いる単数「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は内容がはっきりと他を示さない限り、複数の意味を含む。数値の範囲はその範囲を定義する数字を含む。特に他に示さない限り、核酸は、左から右へ、５’から３’の方向へ、アミノ酸配列は左から右へ、アミノ基からカルボキシ基の方向へそれぞれ記載されている。本発明は、記載されている特定の方法論、実験手順及び試薬に限定されず、これらのものが当業者により、使用される状況により変わり得ることを理解すべきである。
本明細書を通して与えられる各最大限定数値は、本明細書中にそのような低い数値限定が具体的に明記されたと同様に、それぞれ最大限定数値よりも低い数値とすることを含む。本明細書を通して与えられる各最小限定数値は、本明細書にそのような高い数値限定が具体的に明記されたと同様に、それぞれ最小限定数値よりも高い数値とすることを含む。本明細書を通して与えられる各数値範囲は、本明細書にそのような狭い数値範囲が具体的に明記されたと同様に、そのような広い数値範囲内の狭い数値範囲とすることを含む。
さらに、本明細書に記載された見出しは、全体として本明細書を参照することにより得られる発明の種々の側面又は実施態様を限定するものではない。従って、直ぐ後に定義される用語は全体として明細書を参照することにより十分に定義される。それにもかかわらず、本発明の理解を促進するために、多くの用語が下記に定義される。
定義
本明細書において、「プロテアーゼ」及び「タンパク質分解活性」の用語は、ペプチド又はペプチド結合を有する基質を加水分解する能力を有するタンパク質又はペプチドをいう。タンパク質分解活性を測定するための良く知られた方法は数多くある（例えば、Kalisz， "Microbial Proteinases，"In: Fiechter（ed.），Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，[1988]を参照願いたい）。例えば、タンパク質分解活性は市販の基質を加水分解する個々のプロテアーゼの能力を解析して比較することにより、確認される。そのようなプロテアーゼ又はタンパク質分解活性の解析に有用な代表的な基質は、ジメチルカゼイン（シグマ Ｃ−９８０１）、ウシ コラーゲン（シグマ Ｃ−９８７９）、ウシ エラスチン（シグマ Ｅ−１６２５）、及びウシ ケラチン（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ９０２１１１）を含むがこれらに限定されない。これらの基質を用いた非色分析は当業者に良く知られている（例えば、WO 99/34011 及び U.S. Pat. No. 6，376，450，参照のこと。これらの文献を参照により本明細書に援用する。）ｐＮＡアッセイ（例えば、Del Mar他、Anal Biochem.，99:316-320 [1979]参照）も勾配溶離をする間に収集されるフラクションの活性酵素濃度を決定するのに有用である。このアッセイは、酵素が可溶性合成基質である、スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド（ｓＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を加水分解したときに放出されるｐ−ニトロアニリンの割合を測定する。加水分解反応からの黄色の生成速度が４１０ｎｍの比色計で測定され、活性酵素の濃度が計算される。更に、２８０ｎｍの吸光度はタンパク質の総濃度を測定するのに用いることができる。活性酵素／総タンパク質の比が酵素の精製度を示す。
本明細書において、用語「ＡＳＰプロテアーゼ」、「Ａｓｐプロテアーゼ」、及び「Ａｓｐ」は本明細書に記載及びU.S. Pat. Appln. Ser. No. 10/576,331（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のセリンプロテアーゼをいう。幾つかの好ましい実施態様においては、Ａｓｐプロテアーゼはセルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）株６９Ｂ４から得られた６９Ｂ４プロテアーゼとして本明細書にて設計されたプロテアーゼである。従って、好ましい実施態様において、「６９Ｂ４プロテアーゼ」の用語は配列番号８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）で提供されるアミノ酸配列と実質的に同一な配列を有するセルロモナス（Ｃｅｌｌｕｒｏｍｏｎａｓ）株６９Ｂ４（ＤＳＭ １６０３５）由来の自然発生成熟プロテアーゼをいう。代替的な実施態様において、本発明はＡＳＰプロテアーゼの一部分を提供する。
「セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）プロテアーゼ相同体」の用語は、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）株６９Ｂ４由来の成熟タンパク質に対するアミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸配列を有する自然発生プロテアーゼ、又はそのような自然発生プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド配列、及びそのような核酸によりコードされるセリンプロテアーゼの機能性質を保持するプロテアーゼをいう。ある実施態様においては、これらのプロテアーゼ相同体は「セルロモナジン（ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｄｉｎ）」という。
本明細書にて、「ＡＳＰ変異体」、「ＡＳＰプロテアーゼ変異体」、及び「６９Ｂプロテアーゼ変異体」の用語は、野生型ＡＳＰと、特にその機能において同様であるが、野生型プロテアーゼの配列とは異なる配列となるようにそれらのアミノ酸おいて変異を有するプロテアーゼを表す言葉として用いる。
本明細書にて用いる、「セルロモナス種(Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｓｐ)」は、放線細菌綱(Ｃｌａｓｓ Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ)、放線菌目(Ｏｒｄｅｒ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ)、ミクロコッカス亜目(Ｓｕｂｏｒｄｅｒ Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｉｎｅａｅ)、セルロモナス科(Ｆａｍｉｌｙ Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ)として分類されるグラム陽性菌である、セルロモナス(Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ)属に属する種の全てをいう。セルロモナス属は分類学の再編成を継続して受けていることが知られている。よって、この属は、再編成された種を含むことが予定されている。
本明細書では「ストレプトミセス種(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｓｐ)」は、放線細菌綱(Ｃｌａｓｓ Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ)、放線菌目(Ｏｒｄｅｒ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ)、ストレプトミセス亜目(Ｓｕｂｏｒｄｅｒ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅａｅ)、ストレプトミセス科(Ｆａｍｉｌｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ)として分類されるグラム陽性菌である、「ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）」属に属する種の全てをいう。ストレプトミセス属は分類学の再編成を継続して受けていることが知られている。よって、この属は、再編成された種を含むことが予定されている。
本明細書において、「バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属」は「バシルス」属に属すると当業者により認識されている全ての種を含む。この例としては、バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルスリケニホルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス レンタス（Ｂ． ｌｅｎｔｕｓ）、バシルス ブレビス（Ｂ． ｂｒｅｖｉｓ）、バシルス ステアロセレモフィリス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス アルカノフィリス（Ｂ． ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス アミロロケファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシル スクラウシ（Ｂ． ｃｌａｕｓｉｉ）、バシルス ハロデュランス（Ｂ． ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バシルス メガテリウム（Ｂ． ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシルス コアギュランス（Ｂ． ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシルス サーキュランス（Ｂ． ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチル レンタス（Ｂ， ｌａｕｔｕｓ）及びバシルス スリンギエンシス（B. ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を含むがこれらに限定されない。バシルス属は分類上再編成され続けている。従って、バシルス ステアロセレモフィリス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のように、現在はゲオバシルス ステアロセレモフィリス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）と呼ばれているものも含むがこれらに限定されない。酸素の存在下で耐性のある内性胞子を生成することはバシルス属の特徴であると定義されている。しかしながらこの特徴は、近年分類されたアリシクロバシルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｔｌｕｓ）、アンピバチリルス（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アネウニバチスル（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アノキシバチスル（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバシルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィロバシルス（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、グラシリバシルル（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハロバシルス（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パエニバシルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サリバシルス（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、セルモバシルス（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｉｔｓ）、ウレイバシルス（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びバージバシルス（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）についても当てはまる。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」の用語は、本明細書において、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、互換的に用いられる。この用語は、一重鎖、二重鎖、又は三重鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、又はプリン又はピリジン塩基を含むポリマー、又は他の天然の、化学的に、生物学的に修飾された、非天然の又は誘導されたヌクレオチド塩基を含むがこれらに限定されない。以下にポリヌクレオチドの非限定的な例を示す。それは、遺伝子、遺伝子フラグメント、染色体フラグメント、ＥＳＴ、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボゾーム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列より単離されたＤＮＡ、任意の配列より単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーである。ある実施態様においては、ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド、及びヌクレオチドアナログ、ウラシル、他の糖、及びフルオロリボゾーム及びチオールのような結合基、及びヌクレオチド分岐等の修飾されたヌクレオチドを含む。代替的な実施態様において、ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により阻害されたヌクレオチド配列を含む。
本明細書において、「ＤＮＡ構築物」及び「形質転換ＤＮＡ」の用語は宿主細胞又は有機体に配列を導入するために用いるＤＮＡを意味するために互換的に使用される。このＤＮＡはＰＣＲによりインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で生成されるか又は当業者に知られている他の好適な方法で生成される。特に好ましい実施態様において、ＤＮＡ構築物は所望の配列を含む（例えば、挿入配列として）。幾つかの実施態様において、この配列は制御エレメント等（例えば、プロモーター等）の付加的なエレメントに作動可能に結合している。さらに、ＤＮＡ構築物は選択マーカーを含んでよい。それはさらにホモロジーボックスの傍にある挿入配列を含んでよい。更なる実施態様において、形質転換ＤＮＡは末端に付加している非相同配列を含む（例えば、スタッファー配列又はフランク）。幾つかの実施態様において、挿入配列の末端を閉じて、形質転換ＤＮＡが閉鎖環を形成する。形質転換は野生型、変異体又は修飾されていてもよい。幾つかの実施態様においてＤＮＡ構築物は宿主細胞染色体に相同な配列を含み。他の実施態様において、ＤＮＡ構築物は非相同配列を含む。一旦ＤＮＡ構築物がインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で構築されると、それは、
１）異種の配列を宿主細胞の所望の標的配列に挿入するため、及び／又は
２）宿主細胞の染色体の領域を変異させるため（即ち、内性の配列を異種の配列で置換）、及び／又は
３）標的遺伝子を欠失させるため、及び／又は
４）宿主細胞に組換えプラスミドを導入するため
に用いられる。
本明細書において、「発現カセット」及び「発現ベクター」の用語は、標的細胞内で特定の核酸の転写をさせることができる一連の特定の核酸エレメントで、組み換え的又は合成的に生成された核酸構築物をいう。組み換え発現カセットはプラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸フラグメントに取り込まれる。通常、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、他の配列の中で、転写される核酸配列及びプロモーターを含む。好ましい実施態様において、発現ベクターは宿主細胞内でヘテロＤＮＡフラグメントを取り込み発現する能力を有している。多くの真核及び原核発現ベクターが市販されている。好適な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。「発現カセット」の用語は、「ＤＮＡ構築物」と互換的に用いられ、これらの語は同義である。適切な発現ベクターの選択は当業者の知識の範囲内である。
本明細書において、「ベクター」の用語は核酸を１つ以上のタイプの細胞に導入するために設計されたポリヌクレオチド構築物をいう。ベクターはクローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、及びカセット等を含む。幾つかの実施態様において、ポリヌクレオチド構築物は、適した宿主の中でＤＮＡの発現に影響を与えることができる好適なプロ配列（例えば、分泌等）に作動可能に結合しているプロテアーゼ（例えば、前駆体及び成熟プロテアーゼ）をコードするＤＮＡ配列を含む。
本明細書において、「プラスミド」の用語は、クローニングベクターとして用いる環状二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築体であり、種々の原核及び真核生物内で染色体外自己複製遺伝子要素を形成し、又は他の宿主細胞に組み込むことができるものをいう。
核酸配列を細胞に導入する文脈で本明細書にて用いられる、「導入する」の用語は細胞に核酸配列を輸送するのに適した任意の方法をいう。そのような導入するための方法は、プロトプラスト融合、トランスフェクション、形質転換、結合、及び形質導入を含むがこれらに限定されない（例えば、Ferrari他、"Genetics，" in Hardwood他、（eds.）， Bacillus， Plenum Publishing Corp.， pages 57-72， [1989]を参照願いたい）。
本明細書にて用いる「形質転換された」、「安定に形質転換された」の用語は、そのゲノム内に、又は少なくとも二世代にわたり維持されているエピソームプラスミドとして、組み込まれている非自然的（異種の）ポリヌクレオチド配列有する細胞をいう。
本明細書にて用いる「選択マーカーをコードするヌクレオチド配列」の用語は、宿主細胞中に発現でき、選択マーカーの発現が相当する選択剤存在下又は必須栄養素が欠損下増殖できる発現遺伝子を含む細胞を与えることのできるヌクレオチド配列をいう。
本明細書にて用いる「選択可能マーカー」及び「選択マーカー」はベクターを含む宿主細胞の選択を容易にさせる宿主細胞中に発現可能な核酸（例、遺伝子）をいう。そのような選択マーカーの例は抗生物質を含むが、これに限定されない。つまり、「選択マーカー」の用語は宿主細胞が所望の挿入ＤＮＡを取り入れたこと又は他の反応が生じたことの指標を与える遺伝子である。一般的に、選択マーカーは宿主細胞に抗生物質耐性又は代謝効果を与える遺伝子であり、外来ＤＮＡを含む細胞を形質転換の間に任意の外来遺伝子を受けることができなかった細胞と区別できるようにさせる。「存在選択マーカー」は形質転換すべき微生物の染色体上に位置するものである。存在選択マーカーは形質転換ＤＮＡ構築物上に選択マーカーと異なる遺伝子をコードする。選択マーカーは当業者に周知である。上記に示すように、好ましい選択マーカーは抗生物質耐性マーカー（例えば、ampR、phleoR、specR、 kanR、eryR、tetR、cmpR、及びneoR (例えば Guerot-Fleury, Gene, 167:335- 337 [1995」、Palmeros 他, Gene 247:255-264 [2000]及びTrieu-Cuot他 Gene, 23:331-341, [1983]を参照願いたい）である。本発明に関して有用な他のマーカーはトリプトファンのような栄養要求性のマーカー、及びベータガラクトシダーゼのような検出マーカーを含むがこれらに限定されない。
本明細書にて用いる、「プロモーター」の用語は下流遺伝子の直接転写に作用する核酸配列をいう。好ましい実施態様において、プロモーターは標的遺伝子が発現される宿主細胞に適している。プロモーターは他の転写及び翻訳制御核酸配列（また「制御配列」と呼ばれる）と共に、所定の遺伝子を発現に必要である。一般的に、転写及び翻訳制御核酸配列はプロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始と停止配列、翻訳開始と停止配列、及び増幅又は活性化配列を含むがこれらに限定されない。
核酸は、他の核酸配列と機能的関係に位置する場合に「作動可能に結合する」という。例えば、分泌リーダー（つまり、シグナルペプチド）をコードするＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合に、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に結合し、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合に、コード配列に作動可能に結合し、又は翻訳に作用するように位置する場合、リボソーム結合部位はコード配列に作動可能に結合するという。一般に、「作動可能に結合する」とは、結合するＤＮＡ配列が隣接することを意味し、分泌リーダーの場合には、隣接し、且つリーディングフェーズ（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）中にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは必ずしも隣接しない。結合は都合のよい制限部位で結合されることにより行われる。そのような部位がない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが従来の方法により用いられる。
本明細書において、「遺伝子」の語は、ポリペプチドをコードし、個々のコードセグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン）だけでなく、コード領域の前及び後ろに続く領域を含むポリヌクレオチド（例えばＤＮＡセグメント）をいう。
本明細書において、「相同遺伝子」の用語は異なるが通常関連性を有している一組の遺伝子を意味する。これらはお互いに対応し、お互いに同一であるか非常に似ている。この用語は遺伝子複製により分離された遺伝子（パラロガス）の他に、スペーシエーションにより分離された遺伝子（即ち、新たな種の発達）（例えば、オーソログ遺伝子）種により分離された遺伝子も含む。
本明細書において「オーソログ」及び「オーソロガス遺伝子」の用語はスピーシエーション（種形成）により共通の遺伝子の祖先から進化した遺伝子を意味する（即ち、相同遺伝子）。通常、オーソログは進化の過程において同じ機能を保持している。オーソログの同定は新たに配列決定されたゲノムにおいて遺伝子の機能を予測するのに有用である。
本明細書において、「パラログ」及び「パラロガス遺伝子」の用語はゲノム内の複製に関係している遺伝子を意味する。オーソログは進化の過程で同じ機能を保持しているのに対し、パラログは、幾つかの機能はオリジナルのものに関連しているが、更に新たな機能を獲得している。パラロガス遺伝子の例としては、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、及びトロンビンをコードしている遺伝子を含むがこれらに限定されない。これらは全て、セリンプロテアーゼであり同じ種を起源とする。
本明細書において、「相同性」の用語は類似又は同一な配列を意味し、同一であることが好ましい。この相同性は当業者において標準的な方法で測定することができる（例えば、Smith and Waterman，Adv. Appl. Math.，2:482 [1981]； Needleman and Wunsch， J. MoI. Biol.， 48:443 [1970]； Pearson and Lipman，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]； Wisconsin Geneticsソフトウェアパッケージである（Genetics Computer Group， Madison， WI） GAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTAのようなプログラム；及びDevereux他、Nucl. Acid Res.，12:387-395 [1984]参照のこと）。
本明細書において、「アナロガス配列」の用語は遺伝子の機能が親遺伝子（例えば、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）株６９Ｂ４プロテアーゼ）に基づく遺伝子と本質的に同じであることをいう。追加的に、アナロガス遺伝子は、親遺伝子配列に対して、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同等性を有している。あるいは、アナロガス配列は親遺伝子（例えば、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）株６９Ｂ４プロテアーゼ）に見られる遺伝子の７０から１００％の間のアラインメントを有し、及び／又は親遺伝子（例、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）株６９Ｂ４染色体）を含む染色体における遺伝子に配列される領域においてみられる少なくとも５から１０の間の遺伝子を有している。追加的な実施態様において、２つ以上の前述の特性がこの配列に適用される。アナロガス配列は配列アラインメントの既知の方法により決定される。通常行われているアラインメントはＢＬＡＳＴである。上と下に示したように、配列をアラインするのに他の方法も用いられる。
有用なアルゴリズムの１例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰはプログレッシブ、ペアワイズアラインメントを用いて関係する配列のグループから複数の配列アラインメントを作り出す。このアラインメントを作り出すためにクラスタリング関係を示す系統樹もプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰはＦｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅのプログレッシブアラインメント方法の簡略化したものを用いる（Feng and Doolittle，J. MoI. Evol.，35:351-360 [1987]）。この方法はＨｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐにより説明されるものと類似している（Higgins and Sharp，CABIOS 5:151-153 [1989]）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは３．００のデフォルトギャップ、０．１０のデフォルトギャップレングスウエイト、及び重量測定されたエンドギャップを用いる。
他の有用なアルゴリズムはＢＬＡＳＴアルゴリズムであるが、Ａｌｔｓｔｃｈｕｌ等により説明されている（Altschul他、J. MoI. Biol.，215:403-410， [1990]； and Karlin 他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993]）。特に有用なＢＡＬＳＴプログラムはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（Altschul他、Meth. Enzymol.， 266:460-480 [1996]を参照）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は大部分がデフォルトの値である幾つかのサーチパラメーターを用いる。調節可能なパラメーターは以下の値に設定されている：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワードスレッシュホールド（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２パラメーターは動的値であり、特定の配列のコンポジシヨン及び所望の配列をサーチされる所望の配列に対する特定のデータベースのコンポジションに依存してプログラム自身により確立される。しかしながら、この値は感受性を高めるために調節することができる。Ａ％アミノ酸配列同定値は同定残基適合数を配列された領域における「より長い」配列の残基の総数で割る。「より長い」配列は配列された領域において最も実際的な残基を有するものである（アラインメントスコアを最大化するためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２により導入されたギャップは無視される）。
従って、「核酸配列の相同性のパーセンテージ（％）」は初期の配列（即ち、所望の配列）の核酸残基に同一である候補配列中の核酸残基のパーセンテージであると定義される。好ましい方法はデフォルトパラメータが設定され、オーバーラップスパン、及びオーバーラップフラクションがそれぞれ１及び０．１２５に設定されているＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＩＮモジュールを用いる。
本明細書にて用いる「ハイブリダイゼーション」は、周知技術のように、核酸の一本鎖が塩基対を通して相補鎖に結合する方法をいう。
核酸配列は中位から高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション及び洗浄条件下二つの配列が特異的にお互いにハイブリダイズする場合基準核酸配列に「選択的にハイブリダイズできる」と考えられる。ハイブリダイゼーション条件は核酸結合複合体又はプローブの融点（Ｔｍ）に基づく。例えば、「最大ストリンジェンシー」は一般的に約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍの５℃以下）で起こり、「高いストリンジェンシー」はＴｍの約５から１０℃以下、「中間ストリンジェンシー」はプローブのＴｍの約１０から２０℃以下、及び「低ストリンジェンシー」はＴｍの約２０から２５℃以下で起こる。機能的に、最大ストリンジェンシー条件をハイブリダイゼーションプローブと厳密な同定又は厳密に近い同定を有する配列の同定に用いてよく、一方中間ストリンジェンシー又は低いストリンジェンシーハイブリダイゼーションはポリヌクレオチド配列相同体を同定又は検出するために用いることができる。
緩やかな及び高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は周知である。高いストリンジェンシー条件の例は５０％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ、５Ｘデンハート液、０．５％ＳＤＳ及び１００μｇ/ｍｌ変性キャリアＤＮＡ中４２℃でハイブリダイゼーションし、続いて室温にて２Ｘ ＳＳＣ及び０．５％ ＳＤＳで二回洗浄し、４２℃にて１Ｘ ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳでさらに二回洗浄することを含む。緩やかなストリンジェンシー条件の例は２０％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ（１５ＯｍＭ ＮａＣｌ，１５ｍＭ クエン酸３ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム (pH 7.6)、５Ｘデンハート液、１０％硫酸デキストラン及び２０ｍｇ/ｍｌ変性せん断サケ精子ＤＮＡ中３７℃で終夜インキュベーションし、続いて３７℃から５０℃にて１Ｘ ＳＳＣ中フィルターを洗浄することを含む。当業者はプローブの長さ等のような因子を適応する必要がある時、温度、イオン強度等どのように調整するかを知っている。
本明細書において、「組み換え」の用語は、異種核酸配列の導入により修飾されている細胞又はベクター、又はそのように修飾された細胞由来の、細胞又はベクターをいう。したがって、例えば、組み換え細胞は、細胞の自然（非組み換え）形態の中に同一形態として見られない遺伝子を発現し、又は計画された人為的介入の結果、過剰に発現した、不十分に発現した、又はまったく発現しない天然遺伝子を発現する。「組み換え」、「組み換える」及び「組み換え」核酸配列を生成することは、通常２つ以上の核酸フラグメントをキメラ遺伝子が生じるように組み立てることを意味する。
好ましい実施態様において、変異体ＤＮＡ配列は少なくとも１つのコドンにおいて飽和突然変異誘発を用いて生成される。他の好ましい実施態様において、飽和突然変異は２以上のコドンにおいて実施される。さらなる実施態様において、変異体ＤＮＡ配列は野生型配列に対して、５０％より多い、５５％より多い、６０％より多い、６５％より多い、７０％より多い、７５％より多い、８０％より多い、８５％より多い、９０％より多い、９５％より多い、又は９８％より多い配列相同性を有する。別の実施態様において、変異体ＤＮＡは、例えば、放射線、ニトロソグアニジン（ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）等の既知の変異法を用いてインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で生成される。所望のＤＮＡ配列がその後単離され、本明細書に定義される方法に用いられる。
本明細書にて用いる、「標的配列」の用語は配列をコードする宿主細胞中のＤＮＡ配列をいい、宿主細胞遺伝子に挿入されるべき組み込まれる配列が望ましい。ある実施態様においては、標的配列は機能的野生型遺伝子又はオペロン又は非機能的遺伝子又はオペロンをコードする、一方他の実施態様においては、機能的変異体遺伝子又はオペロン又は非機能的遺伝子又はオペロンをコードする。
本明細書にて用いる、「フランキング配列」の用語は検討される配列の上流又は下流どちらかにある任意の配列（例えば、Ａ‐Ｂ‐Ｃ遺伝子にとって、遺伝子ＢはＡ及びＣ配列により隣接される）をいう。好ましい実施態様においては、挿入配列はそれぞれの側にホモロジーボックスにより隣接される。別の実施態様においては、挿入配列及びホモロジーボックスはそれぞれの側にスタファー配列により隣接される単位を含む。ある実施態様においては、フランキング配列は一つの側（３’又は５’いずれか）のみに存在するが、好ましい実施態様においては、それは隣接される配列のそれぞれの側にある。ある実施態様においては、フランキング配列は一つの側（３’又は５’いずれか）のみに存在するが、好ましい実施態様においては、隣接される配列のそれぞれの側に存在する。
本明細書にて用いる、「スタファー配列」の用語はホモロジーボックス（一般的にベクター配列）に隣接する任意の余剰ＤＮＡをいう。しかしながら、その用語は任意の非相同性ＤＮＡ配列を含む。任意の理論に限定されないが、スタファー配列はＤＮＡ取り込みを開始する細胞に対する非臨界標的を提供する。
本明細書において、「増幅」及び「遺伝子増幅」の用語は特定のＤＮＡ配列が増幅された遺伝子がゲノム中の初期に存在する遺伝子のコピー数よりも多くなるように、不均衡に複製されるプロセスを意味する。幾つかの実施態様において、薬物（例えば、阻害可能な酵素の阻害剤）の存在下の増殖による細胞の選択がその薬物存在下の増殖のために必要な遺伝子生成物をコードする内因性の遺伝子の増幅により又はこの遺伝子産物をコードする外因性（即ち、挿入）配列の増幅により、又は両者により、行われる。
「増幅」はテンプレート特異性を含む核酸複製の特別なケースである。非特異的テンプレート複製で構築される（即ち、テンプレート依存性ではあるが特定のテンプレートには依存していない）。テンプレート特異性は、本明細書において、複製の忠実性（即ち、正確なポリヌクレオチド配列の合成）及び（リボ又はデオキシ）ヌクレオチド特異性とは区別して用いられる。テンプレート特異性はしばしば、「標的」特異性の観点で記載する。標的配列が他の核酸から選び出されるように求められるものである意味において「標的」である。増幅技術は主にこの選び出しのために設計されている。
本明細書にて用いる、「共増幅」の用語は他の遺伝子配列（つまり、発現ベクター内に有するもののような一以上の非選択的遺伝子を含む）に隣接する増幅可能マーカーの単一細胞への導入及び適切な選択圧の適用をいい、その結果細胞が増幅可能マーカー及び他の非選択遺伝子配列両方を増幅することをいう。増幅可能マーカーは他の遺伝子配列又はあるいは二つの離れたＤＮＡ断片に物理的に結合してよい。このＤＮＡの断片はひとつは増幅可能マーカーを含み及び他は非選択マーカーを含み同じ細胞に導入されている。
本明細書にて用いる、「増幅可能マーカー」、「増幅可能遺伝子」、及び「増幅可能ベクター」の用語は遺伝子をコードする遺伝子又はベクターをいい、適切な増殖条件下その遺伝子の増幅を許容する。
「テンプレート特異性」は酵素の選択によりたいていの増幅技術にて実施される。増幅酵素は酵素を使用する条件下、核酸の異種混合物中核酸の特異的配列のみを処理する酵素である。例えば、Ｑβレプレカーゼの場合、ＭＤＶ‐１ ＲＮＡはそのレプリカーゼ（例えば、Kacian他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:3038 [1972] を参照願いたい）の特異的テンプレートであり、他の核酸はこの増幅酵素によって複製されない。同様に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの場合、この増幅酵素はそれ自身のプロモーターに厳密に特異性を有する（Chamberlin他、Nature 228:227 [197O]を参照願いたい）。Ｔ４ＤＮＡリガーゼの場合、酵素は二つのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをライゲートせず、ライゲーション接合部位でオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド基質とテンプレートの間でミスマッチがある（Wu and Wallace, Genomics 4:560 [1989]を参照願いたい）。最後にＴａｑ及びＰｆｕポリメラーゼの場合、高い温度で機能する能力により、高い配列結合特異性を示し、つまり、プライマーにより決定される。高温は標的配列とプライマーハイブリダイゼーションを促進し、非標的配列とハイブリダイゼズしない熱力学的条件を有する。
本明細書にて用いる、「増幅核酸」の用語は任意の増幅方法により増幅される核酸をいう。「増幅核酸」は通常「サンプルテンプレート」を含むと考えられる。
本明細書にて用いる、「サンプルテンプレート」の用語は「標的」（下記に定義する）の存在を知るために分析するサンプルに由来する核酸をいう。反対に、「バックグラウンドテンプレート」はサンプルテンプレート以外の核酸に関して用い、サンプル中に存在してよく又は存在しなくてよい。バックグラウンドテンプレートはしばしば不注意によるものである。それはキャリーオーバーの結果として、又はサンプルから精製除去されるべき核酸混入の存在によるものでよい。例えば、検出される核酸以外の有機体由来の核酸は試験サンプル中バックグラウンドとして存在してよい。
本明細書において、「プライマー」の用語は、核酸ストランドに相補的であるプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下（即ち、ヌクレオチドの存在、及びＤＮＡポリメラーゼのような誘導剤の存在下、好適な温度とｐＨ）におかれた場合に、合成の開始点として作用することができる、制限消化精製により自然発生する、又は合成的に生成されたオリゴヌクレオチドを意味する。好ましくは、プライマーは増幅の最大効率のためには１本鎖ＤＮＡポリメラーゼであるが、代替的には２本鎖ＤＮＡでもよい。もし、２本鎖ＤＮＡを用いる場合には、このプライマーを初めに各鎖を分離する処理を行い、その後伸長生成物に用いる。好ましくは、このプライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。このプライマーは誘導剤の存在下で伸長生成物の合成を準備するために十分な長さである必要がある。プライマーの正確な長さは温度、プライマーの源、及び用いる方法に依存する。
本明細書において、「プローブ」の用語は、他の所望のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、精製制限消化のように自然発生的に、合成的に、組み換え的に、又はＰＣＲ増幅により得られたオリゴヌクレオチド（つまり、ヌクレオチド配列）をいう。プローブは１本鎖又は２本鎖でもよい。プローブは特定の遺伝子配列の検出、同定、オリグヌクレオチド単離に有用である。本発明に用いる任意のプローブは、酵素（例えば、酵素ベースの組織学的アッセイの他、ＥＬＩＺＡ）、蛍光法、放射線法、及び発光法を含むがこれらに限定されない任意の検出システムにおいて、検出すことができるように、「レポーター分子」で標識される。本発明を特定の検出法又は標識に限定することは意図しない。
本明細書において「標的」の語は、ポリメラーゼ連鎖反応に用いられる場合、ポリメラーゼ連鎖反応に用いるためのプライマーにより結合される核酸領域をいう。従って、「標的」は他の核酸配列から区別される。「セグメント」は標的配列の中の核酸の領域であると定義される。
本明細書において、「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」の語は、当業者に周知のようにクローニング又は精製をせずに、ゲノムＤＮＡの混合物中で、標的配列のセグメントの濃度を高めるための方法を含み、参照により本明細書に援用される米国特許Ｎｏｓ．４，６８３，１９５、４，６８３，２０２、及び４、９６５，１８８の方法を意味する。標的配列の所望の増幅セグメントが混合物中では（濃度について言うと）主な配列となることから、これらのことをＰＣＲ増幅物と言う。
本明細書おいて、「増幅試薬」の用語は、プライマー、核酸テンプレート、及び増幅用酵素以外に必要な増幅のための試薬をいう。通常、増幅試薬の他の成分と一緒に反応管（試験管、マイクロウェル等）内に置かれ及び含まれている。
ＰＣＲを用いて、ゲノムＤＮＡにおける特異的標的配列の１本鎖コピーをいくつかの異なる方法（例えば、ラベル化プローブによるハイブリダイゼーション、アビジン−酵素結合検出を伴うビオチニル化プライマーの取り込み、ｄＣＴＰ又はｄＡＴＰのような３２Ｐラベル化デオキシヌクレオチド３リン酸の増幅セグメントへの取り込み）によって検出できるレベルまで増幅することができる。ゲノムＤＮＡに加え、任意のオリゴヌクレオチド又はポヌクレオチド配列はプライマー分子の適切なセットで増幅出来る。ＰＣＲ方法により創製される増幅セグメントはそれ自身が後に続くＰＣＲ増幅の効率のよいテンプレートである。
本明細書にて用いる、「ＰＣＲ生成物」、「ＰＣＲフラグメント」及び「増幅生産物」は変性、アニーリング及びエクステンションのＰＣＲ段階の二以上のサイクルが完了後、得られる化合物の混合液をいう。これらの用語は一以上の標的配列の一以上のセグメントの増幅の場合も含む。
本明細書において、「ＲＴ−ＰＣＲ」の用語はＲＮＡ配列の複製及び増幅することをいう。この方において、逆方向転写をＰＣＲに組合せ、熱安定性ポリメラーゼを用いる１つの酵素的な方法を用いる。この方法は米国特許Ｎｏ．５、３２２、７７０に記載されており、該特許を参照により本明細書に援用する。ＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＲＮＡテンプレートはポリメラーゼの逆転写活性によりｃＤＮＡに転換され、その後、ポリメラーゼの重合活性によりそれらを増幅する（つまり、ＰＣＲ方法に見られるように）。
本明細書において、「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」の用語は特定のヌクレオチド配列で、またはその付近でそれぞれの２本鎖ＤＮＡを切断するバクテリア酵素をいう。
「制限部位」とは、所定のエンドヌクレアーゼにより認識され切断される核酸配列をいい、しばしば、この部位はＤＮＡフラグメントに挿入される部位でもある。本発明の特定の実施態様において、制限部位は選択マーカーにエンジニアされ、ＤＮＡ構築物の５’末端及び３’末端に導入される。
本明細書で用いる、「染色体組み込み」は挿入配列が宿主細胞の染色体に導入される方法いう。形質転換ＤＮＡの相同性領域は染色体の相同領域と整列される。続いて、ホモロジーボックスの間の配列がダブルクロスオーバー（つまり、相同組み換え）で挿入配列により置換される。本発明のある実施態様において、ＤＮＡ構築物の不活性染色体セグメントの相同部位はバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体の固有の染色体領域のフランキング相同領域と整列化される。続いて、固有の染色体の領域はダブルクロスオーバー（つまり、相同組み換え）におけるＤＮＡ構築物により検出される。
「相同組み換え」の語は２つのＤＮＡ分子又は一対の染色体の間のＤＮＡフラグメントを同一の部位又は近くの部位の核酸配列を交換することを意味する。特定の実施態様において、染色体取込は相同組み換えである。本明細書にて用いる「相同配列」は、比較のための最適整列化した時別の核酸又はポリペプチド配列に対して１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８８％、 ８５％、８０％、７５％、又は７０％の配列相同性を有する核酸又はポリペプチド配列をいう。ある実施態様においては、相同配列は８５％と１００％の間の配列相同性を有する一方、他の実施態様においては、９０％と１００％の間の相同性を有し、より好ましい実施態様においては、９５％と１００％の間の配列相同性である。
本明細書において、「アミノ酸」は、ペプチド又はタンパク質配列、あるいはそれらの一部分をいう。「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」の語は互換的に使用される。
本明細書において、「所望のタンパク質」及び「所望のポリペプチド」の用語は所望の及び／又は評価されるタンパク質又はポリペプチドをいう。いくつかの実施態様においては、「所望のタンパク質」は「親タンパク質」（つまり、開始タンパク質）である。幾つかの実施態様においては、親タンパク質はタンパク質工学／設計に関して開始点として用いる野生型酵素である。幾つかの実施態様において、所望のタンパク質は細胞内で発現され、他の実施態様において、それは分泌タンパク質である。特に好適な実施態様において、これらの酵素は本明細書記載のセリンプロテアーゼ及びメタロプロテアーゼを含む。幾つかの実施態様において、所望のタンパク質はシグナルペプチドに融合する分泌されたポリペプチドである（即ち、分泌されるタンパク質上のアミノ末端伸長）。ほとんど全ての分泌されたタンパク質は、膜を横断するタンパク質前駆体を標的とする、又はこの輸送に重要な役割をしているアミノ末端タンパク質伸長を用いる。この伸長は膜輸送の間又は膜輸送に引き続き、シグナルペプチダーゼにより、タンパク質を分解するように除去される。
本明細書で用いる、「異種タンパク質」の用語は、宿主細胞で天然に存在しないタンパク質またはポリペプチドをいう。異種タンパク質の例は、プロテアーゼ等を含む加水分解酵素のような酵素を含む。いくつかの実施態様では、このタンパク質をコードしている遺伝子は、自然に発生する遺伝子であるが、他方、他の実施実施態様では、突然変異を受けた及び/または合成遺伝子が使用される。
本明細書にて用いる、「相同タンパク質」は、細胞内に本来存在する、または天然に生じるタンパク質又はポリペプチドをいう。好ましい実施態様では、この細胞はグラム陽性細胞であり、特に好ましい実施態様では、この細胞はバシルス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ)宿主細胞である。別の実施態様では、相同タンパク質は、大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)、トリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)及びアスペルギルス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)を含む、しかしこれらに限定されない他の生物により産生される固有のタンパク質である。本発明は組換えＤＮＡ技術を用いて相同タンパク質を産生する宿主細胞を含む。
本明細書において、タンパク質は同じ配列において、同じトポロジー結合を有する同じ主要２次構造を有しているならば、共通の「折りたたみ」を有する。同じ折りたたみを有する異なるタンパク質は２次構造の末端エレメント及びサイズ及び立体構造において異なるターン領域を有する。幾つかのケースにおいて、これらの異なる末端領域は構造の半分を占めるであろう。同じ折りたたみカテゴリに置かれたタンパク質は共通の進化の祖先を有しているわけではない（例えば、特定のパックは位置及びチェーントポロジーを好む例えば、の物理的及び化学的由来の構造的類似性）。
本明細書にて用いる、「試験タンパク質折りたたみ」は所望のアッセイにおいて性能指標が改善されるタンパク質をいう。
本明細書にて用いる、「結合」及び「分配」の用語は熱力学意味での平衡に到達、又は速度論的に可逆的又は不可逆的に吸着するとにかかわらず、基質に結合する酵素又は表面に吸着するタンパク質の量をいう。
本明細書にて用いる、「オペロン領域」は共通プロモーターからひとつの転写単位として転写される連続遺伝子のグループをいい、それにより同時制御される。ある実施態様においては、オペロンは調節遺伝子を含む。好ましい実施態様においては、ＲＮＡレベルにより測定される場合に高く発現するが、未知又は不要な機能を持つオペロンを用いる。
本明細書にて用いる、「抗生物質領域」は抗生物質タンパク質をコードする少なくとも一つの遺伝子を含む領域である。
ポリヌクレオチドは、天然の状態において又は当業者により既知の方法で操作される場合、それが転写及び／又は翻訳されてＲＮＡ、ポリペプチド、又はそれらのフラグメントを生成する場合、ＲＮＡ又はポリペプチドを「コードする」と言う。そのような核酸のアンチセンスストランドもこの配列をコードする。
当業者に知られているように、ＤＮＡはＲＮＡポリメラーゼにより転写され、ＲＮＡを生成する。しかし、ＲＮＡは逆転写酵素により逆転写されて、ＤＮＡを生成することもできる。従って、ＤＮＡはＲＮＡをコードし、その逆も成立する。
「調節セグメント」、又は「調節配列」又は「発現調節配列」はコードアミノ酸配列の発現に効果を与えるポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードするＤＮＡのポリヌクレオチド配列と操作可能に結合するＤＮＡのポリヌクレオチド配列をいう。調節配列はアミノ酸をコードする操作可能に結合するポリヌクレオチド配列の発現を阻害し、抑制し又は促進出来る。
「宿主株」又は「宿主細胞」の語は本発明においては、ＤＮＡを含む発現ベクターに好適な宿主をいう。
酵素は、野生型細胞において発現されるレベルよりも高いレベルで細胞内で発現された場合、酵素は「過剰発現」しているという。
「タンパク質」及び「ポリペプチド」の用語は本明細書において互換的に使用される。本明細書において、アミノ酸を示す３つのコードはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＪｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｒｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）により規定された３文字コードを使用する。遺伝子コードの退縮により、１つのポリペプチドが１つ以上の核酸配列によりコードされることは理解されている。
「プロシークエンス」はプロテアーゼの分泌に必要な、シグナル配列と成熟プロテアーゼの間のアミノ酸配列である。プロ配列の切断が成熟活性プロテアーゼとなる。
「シグナル配列」又は「シグナルペプチド」の用語はタンパク質の成熟又は前駆型の分泌において、参加する核酸配列及び／又はアミノ酸配列の任意の配列をいう。シグナル配列の定義は、機能的なものであり、タンパク質の分泌に影響を与えるタンパク質遺伝子のＮ末端部分によりコードされるアミノ酸配列の全てを含むことを意味する。これらは、しばしば、しかし一般的ではないが、タンパク質のＮ末タンパク質又は前駆体タンパク質のＮ末部分に結合する。シグナル配列は内因性でも、外因性のものでもよい。このシグナル配列は通常タンパク質（例えば、プロテアーゼ）に関係するものでもよいし、又の別の分泌タンパク質をコードしている遺伝子由来のものでもよい。例示的なシグナル配列の例としては、バシルス レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）（ＡＴＣＣ２１５３６）由来スブチリシンのシグナル配列の残りに融合するバシルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）スブチリシン由来のシグナル配列の最初の７つのアミノ酸残基を含む。
「ハイブリッドシグナル配列」の用語は、発現される遺伝子のシグナル配列に融合する発現宿主から得られる配列の一部分であるシグナル配列をいう。幾つかの実施態様において、合成配列が用いられる。
「実質的に同一のシグナル活性」の用語は培養培地へプロテアーゼの実質的に同じ分泌により示されるシグナル活性をいう。例えば、培養培地プロテアーゼレベルが配列番号９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の培養培地における分泌プロテアーゼレベルである。
「成熟」の用語は、タンパク質又はペプチドの最終的な機能形態をいう。例えば、少なくとも本発明のＡＳＰプロテアーゼの成熟形態は配列番号（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：８）のアミノ酸配列を少なくとも含み、少なくとも本発明のＮｐｒＥプロテアーゼの成熟形態は配列番号（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：３）のアミノ酸配列を少なくとも含む。
タンパク質又はペプチドの形態「前駆体」の用語はタンパク質のアミノ又はカルボニル末端に作動可能に結合しているプロ配列を有するタンパク質の成熟形態をいう。前駆体は、プロ配列のアミノ末端に作動可能に結合している「シグナル」配列も有する。前駆体は翻訳活性において含まれる付加的なポリヌクレオチド（例えば、タンパク質又はポリペプチドの成熟形態から切り離されたポリペプチド）も有してよい。
「自然発生酵素」及び「自然発生タンパク質」は自然に見られるのと同一な修飾されていないアミノ酸配列を有する酵素をいう。自然発生酵素は天然酵素、特定の微生物中で自然発生的に発現される又は見られる酵素を含む。
「〜由来の」又は「〜より得られた」の用語は、問題の有機体の株より生成された又は生成可能な酵素（例えば、プロテアーゼ）だけでなく、そのような株から単離されたＤＮＡ配列コードされる酵素、及びそのようなＤＮＡ配列を含む宿主有機体により生成された酵素も含む。更に、この用語は合成ＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡのよりコードされる酵素を含み、この酵素は問題の酵素の同定された性質を有する。
この定義の範囲内において、「誘導体」の用語は、誘導体が野生型、天然、又親同様の目的のために有用な誘導体であるという意味において、野生型、天然、又は親において見られるタンパク質分解活性の性質を有している。酵素の機能的な誘導体は自然発生、合成、又は組み換え的に生成されたポリペプチド、又はペプチドフラグメントを含み、それらは、親酵素の一般的な性質を有する。
「機能的な誘導体」の用語は酵素をコードする核酸の機能的な性質を有する核酸の誘導体を意味する。本明細書にて提供する酵素をコードする核酸配列の機能的な誘導体は天然発生、合成、又は組み換え的に生成された核酸又はフラグメントを含む。本発明の酵素をコードする野生型核酸は自然発生対立遺伝子及び当分野で知られている遺伝子コードの退縮に基づく相同体を含む。
２つの核酸配列又はポリペプチド配列の文脈中「同一」の用語は、以下一つの配列比較又は配列解析アルゴリズムを用いて測定する際、最大対応配列したときに２つの配列における残基が同じであることをいう。
「最適アラインメント」の語は、最も高い同一性のパーセンテージスコアを有するアラインメントを意味する。
２つのアミノ酸、ポリヌクレオチド、及び／又は遺伝子配列（必要に応じて）に対して用いる「配列相同性パーセント」、「アミノ酸配列相同性パーセント」、「遺伝子配列相同性のパーセント」及び／又は「核酸／ポリヌクレオチド配列の相同性のパーセント」の用語は配列を最適にアラインメントしたときに２つの配列において同一な残基のパーセンテージをいう。従って、８０％のアミノ酸配列相同性は最適にアラインメントされたポリヌクレオチド配列において８０％のアミノ酸が同一であることをいう。
２つの核酸又はポリペプチドの文脈中「実質的に同一」の用語は、標準的なパラメーターを用いてプログラム又はアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）を用いた対象の配列と比較したときに、少なくとも７０％の配列相同性、好ましくは少なくとも７５％の配列相同性、好ましくは少なくとも８０％の配列相同性、好ましくは少なくとも８５％の配列相同性、好ましくは少なくとも９０％の配列相同性、好ましくは少なくとも９５％の配列相同性、好ましくは少なくとも９７％の配列相同性、好ましくは少なくとも９８％の配列相同性、及び好ましくは少なくとも９９％の配列相同性を有するポリヌクレオチド又はポリペプチドをいう。２つのポリヌクレオチドが実質的に同一であるという同定は第一ポリペプチドが免疫学的に第二ポリペプチドに交差反応性があることでわかる。通常、保存的なアミノ酸置換により異なるポリペプチドが免疫学的に交差反応性がある。従って、２つのポリペプチドが保存置換によってのみ違う場合は、交差反応性がある。つまり、例えば、二つのペプチドが保存的置換にのみ異なる場合、ポリペプチドは第二ポリペプチドに対して実質的に同一であると言う。２つの核酸配列が実質的に同一である他の同定は、２つの分子がストリンジェントな条件において互いにハイブリダイズすることで同定できる（例えば、中程度から高度にストリンジェント条件）。
「単離された」又は「精製された」の用語は本来の環境（例えば、それが自然派生的なものであるならば自然環境）から切り離されている物質をいう。例えば、この物質は、自然発生又は野生型有機体と比較したときに低い又は高い濃度で存在するか、又は自然発生又は野生型有機体から発現する上では通常存在しない成分と組み合わされ存在する場合、「精製された」と言う。例えば、生きている動物中にある自然派生ポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていない。しかし自然システムにおいて共存している物質の幾つか又は全てを分離した、同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていると言う。幾つかの実施態様において、そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり、及び／又はそのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは組成物一部であり、更にそのようなベクター又は組成物において、単離されたものは自然環境の一部ではない。好ましい実施態様において、核酸又はタンパク質は、電気泳動又はブロットにおいて１つのバンドか検出された場合には、精製されていると言う。
「単離された」の用語は、ＤＮＡ配列に対して用いる場合、本来の遺伝的環境から単離されているＤＮＡ配列をいい、従って、これは他の外来又は不要なコード配列を有しておらず、遺伝的なエンジニアリングによるタンパク質生成システムに用いるのに有用である。そのような単離された分子はそれらの本来の環境から分離されており、ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを含む。本発明の単離されたＤＮＡ分子は通常結合している他の遺伝子を含まないが、プロモーター及びターミネーターとしての自然発生５’及び３’非翻訳領域を含む。結合領域の同定は、当業者に良く知られており（例えば、Dynan and Tijan， Nature 316:774-78 [1985]）参照のこと）。「単離されたＤＮＡ配列」の用語は、代替的に「クローン化されたＤＮＡ配列」と言うこともある。
「単離された」の用語は、タンパク質について用いる場合、その本来の環境以外の環境で見られるタンパク質を意味する。好ましい状態において、単離されたタンパク質は実質的に他のタンパク質、特に他の相同タンパク質を含まない。単離されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出される場合、１０％より、好ましくは２０％より、更に好ましくは３０％より高く精製されている。本発明の更なる実施態様は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出される場合、より高度に（即ち、４０％より高く、６０％より高く、８０％より高く、９０％より高く、９５％より高く、９７％より高く、及び９９％より高く）精製されたタンパク質を含む。
本明細書において用いる、「組合せ変異誘発」の用語は初期配列の変異体のライブラリーを生成する方法をいう。これらのライブラリーにおいて、変異体は変異のあらかじめ決められたセットから選択される１つ又は幾つかの変異を含む。更に、この方法は変異のあらかじめ決められたメンバーではないランダム変異を導入する手段を提供する。幾つかの実施態様において、この方法は２０００年１０月２６日にファイルされた米国特許出願番号０９／６９９．２５０に記載の方法を含む。この文献を参照により本明細書に援用する。代替的な実施態様において、組合せ変異誘発法は市販のキットを含む（例えば、QuikChange（商標）Multisite，Stratagene，San Diego，CA）。
本明細書にて用いる、「変異体のライブラリー」の用語は、それらのゲノムの大部分が同一であるが、１つ以上の遺伝子の別の相同体を含む細胞の集団をいう。そのようなライブラリーは、例えば、改善された性質を有する遺伝子又はオペロンを同定するのに用いることができる。
本明細書にて用いる、「開始遺伝子」の用語は本発明に用いる改善された又は変更された所望の
タンパク質をコードする所望の遺伝子をいう。
本明細書にて用いる、「変異体」の用語は一以上のアミノ酸の挿入、置換、又は欠損前駆体タンパク質（例えば、「親」タンパク質）由来のタンパク質をいう。ある実施態様においては、変異体は前駆体タンパク質と比較して電荷において変化を含む少なくとも一つ修飾を含む。ある好ましい実施態様においては、前駆タンパク質は野生型タンパク質である親タンパク質である。
本明細書にて用いる、「複数配列アラインメント」及び「ＭＳＡ」の用語はアルゴリズム（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ）を用いて配列させる開始遺伝子の複数の相同体の配列をいう。
本明細書にて用いる、「コンセンサス配列」及び「カノニカル配列」の用語は比較される特定のタンパク質又は所望の配列の全ての変異体に対しての原型であるアミノ酸配列をいう。この用語は所望のＤＮＡ配列中に最も多く存在するヌクレオチドを形成する配列をいう。遺伝子の各位置に対して、コンセンサス配列はＭＳＡにおける位置において最も豊富なアミノ酸を与える。
本明細書にて用いる、「コンセンサス変異」の用語は開始遺伝子の配列とコンセンサス配列における違いをいう。コンセンサス変異は開始遺伝子の配列とＭＳＡにより得られたコンセンサス配列を比較することにより同定される。幾つかの実施態様において、コンセンサス変異はコンセンサス配列に一層類似するように開始遺伝子に導入される。コンセンサス変異は、開始遺伝子におけるアミノ酸を、開始遺伝子におけるアミノ酸の頻度に関係する位置において、ＭＳＡに見られるよりもより高い頻度であるアミノ酸に変更するアミノ酸変異を含む。従って、コンセンサス変異は、ＭＳＡにおいけるアミノ酸よりも豊富に存在するアミノ酸で開始遺伝子のアミノ酸を置き換える、すべての単一のアミノ酸変異を含む。
本明細書にて用いる、「イニシャルヒット（ｉｎｉｔｉａｌ ｈｉｔ）の用語は組合せコンセンサス変異誘発ライブラリーをスクリーニングすることにより同定された変異体をいう。好ましい実施態様において、イニシャルヒットは開始遺伝子と比較して、改善された性能を有する。
本明細書にて用いる、「改善されたヒット（ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｈｉｔ）」の用語は、高められた組合せコンセンサス変異体ライブラリーをスクリーニングすることで同定された変異体を意味する。
本明細書にて用いる、「改善された変異」及び「性能が高められた変異」の用語は開始遺伝子に導入したときに、改善された性能を示す変異をいう。幾つかの好ましい実施態様において、これらの変異は本発明のスクリーニング工程の間に同定されたシークエンシングヒット（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｈｉｔ）により同定される。大部分の実施態様において、ヒット中により頻繁に見られる変異はスクリーニングされていない組合せコンセンサス変異誘発ライブラリーと比較したときに、改善された変異体である。
本明細書にて用いる、「高められた組合せコンセンサス変異誘発ライブラリー」の用語は、ＣＣＭ変異誘発及びスクリーニングの初期のラウンドから得られたスクリーニング及び／又は配列決定に基づいて設計され、構築されたＣＣＭライブラリーをいう。幾つかの実施態様において、高められたＣＣＭライブラリーはＣＣＭの初期のラウンドから得られたイニシャルヒットの配列に基づいている。更なる実施態様において、高められたＣＣＭは変異誘発及びスクリーニングの初期ラウンドから得られたイニシャルヒットにおいて頻繁に見られる変異を好ましくするように設計される。いくつかの好ましい実施態様において、初期のＣＣＭライブラリーにおいて用いた他のプライマーに対して性能が劣る変異をコードするプライマーを省略する又は性能が高い変異をコードするプライマーの濃度を高めることにより、達成することができる。
本明細書にて用いる、「性能が劣る変異」の用語は、スクリーンされていない組合せコンセンサス変異誘発ライブラリーと比較してスクリーニングから得られたヒットにおいてより頻繁に見られない組み換えコンセンサス変異誘発ライブラリーにおける変異をいう。好ましい実施態様において、スクリーニングプロセスは「性能が劣る変異」を含む変異体の多くを除去及び／又は減らす。
本明細書にて用いる、「機能アッセイ」の用語は、タンパク質活性の同定を提供するアッセイをいう。特定の好ましい実施態様において、この用語は、タンパク質が、通常の範囲において機能する能力について解析するためのアッセイシステムをいう。例えば、酵素の場合、機能アッセイは反応を触媒する酵素の有効性を決定することを含む。
本明細書にて用いる、「標的性質」の用語は、変更予定の開始遺伝子の性質をいう。本発明を特定の標的性質に限定することは意図しない。しかしながら、幾つかの好ましい実施態様において、この標的性質は遺伝子生成物の安定性である（例えば、変性、タンパク質分解性、又の分解因子に対する安定性）一方、他の実施態様において、生産宿主における生産レベルが変更される。実際、開始遺伝子の任意の性質を本発明に用いることができる。
核酸の内容において、用語「性質」又はそれと文法的に等しい用語は、本明細書では、選択又は検出を受け得る核酸のいずれかの特徴又は属性をいう。これらの性質は、ポリペプチドへの結合に影響する性質、特定の核酸を含む細胞に与えられた性質、遺伝子転写に影響する性質（例えば、プロモーター強度、プロモーター認識、プロモーター調節、エンハンサー機能）、ＲＮＡプロセシングに影響する性質（例えば、ＲＮＡスプライシング、ＲＮＡ安定性、ＲＮＡコンフォメーション、及び／又は転写後調節）、翻訳に影響する性質（例えば、レベル、調節、ｍＲＮＡのリボゾームタンパク質への結合、翻訳後調節）を含むがこれらに限定されない。例えば、核酸の転写因子についての結合部位、ポリメラーゼ、調節因子等は所望の性質を生成するために又は好ましくない性質を同定するために、変更される。
ポリペプチドの内容において、用語「性質」又はそれと文法的に等しい用語は、本明細書では、選択又は検出を受け得るポリペプチドのいずれかの特徴又は属性をいう。これらの性質等は、酸化安定性、基質特異性、触媒活性、熱的安定性、アルカリ安定性、pH活性プロファイル、タンパク質分解に対する耐性、KM，kcat，kcat / ＫM 比、タンパク質の折りたたみ、免疫反応の誘導、配位子への結合性、受容体への結合性、分泌される能力、細胞表面上に呈示される能力、オリゴマー化する能力、シグナルを出す能力、細胞増殖を刺激する能力、細胞増殖を抑制する能力、アポトーシスを誘起する能力、リン酸化またはグリコシレーションにより修飾される能力、疾病を治療する能力を含むがこれらに限定されない。
本明細書にて用いる、「スクリーニング」の用語は、通常用いられる意味において、複数の工程プロセスを意味する。第一の工程において、変異体核酸又は変異体ポリペプチドが提供される。第二の工程において、変異体核酸又は変異体ポリペプチドの性質が決定される。第三の工程において、決定された性質が対応する親核酸の性質、対応する自然発生ポリペプチドの性質、又は変異体核酸の生成のための開始物質（例えば、開始配列）の性質と比較される。
変えられた性質をもつ核酸又はタンパク質を得るスクリーニング方法は、開始物質の性質により変わることは当業者には明らかであろう。従って、当業者は本発明がスクリーンされる特定の性質に限定することは意図されず、以下の例は例示のみであることを理解するだろう。任意の特定の性質のためのスクリーニングの方法は当分野で知られている。例えば、結合、ｐＨ、特異性等を変異の前と後で測定することができる。これらの変化が変異を示している。好ましくは、スクリーニングは、チップ、ファージディスプレイ、及び複数基質及び／又はインジケーターを含むがこれらに限定されない、複数のサンプルを同時にスクリーニングすることを含む、高い処理能力の方法で行われる。
本明細書にて用いるように、幾つかの実施態様において、スクリーニングは変異体の集団から所望の変異体を豊富に含むようにするための選択工程を含む。これらの実施態様の例は、宿主微生物の生育に有利な変異体の選択の他、ファージディスプレイ、又は変異体をそれらの結合能又は触媒性質に基づき変異体の集団から捕捉することができる他のディスプレイ法を含む。好ましい実施態様において、変異体のライブラリーはストレスに曝され（熱、プロテアーゼ、変性）引き続き、まだインタクトである変異体をスクリーニングにおいて同定し、又は選択により高濃度化する。この用語は選択のための任意の適切な手段を含むことを意図する。実際に、本発明を特定のスクリーニング方法に限定することは意図しない。
本明細書にて用いる、「標的ランダム化」の用語は１つ又は幾つかの位置がランダム化されている複数の配列を生成する工程をいう。幾つかの実施態様において、ランダム化は完全に位置をランダム化する（即ち、すべての４つのヌクレオチドのＡ、Ｔ、Ｇ、及びＣがランダムな位置にある）。別の実施態様において、ヌクレオチドのランダム化は４つのヌクレオチドのサブセットに限定される。標的ランダム化は所望の１つ又は幾つかの位置をコードする１つ又は幾つかの配列のコドンに適用することができる。発現したときに、得られたライブラリーが１つ以上のアミノ酸の位置が、ランダム化コドンのランダム化スキームにより決定されるように、２０全てのアミノ酸又はアミノ酸のサブセットの混合物を含むことができるように、タンパク質集団を生成する。幾つかの実施態様において、標的ランダム化から得られた集団の個々のメンバーは、標的にされた又はランダム化挿入又は欠損されたコドンによりアミノ酸の数が異なる。更なる実施態様において、合成アミノ酸は生成されたタンパク質の集団の中に含まれる。幾つかの好ましい実施態様において、標的ランダム化の結果得られた集団の主なメンバーは初期の遺伝子よりもコンセンサス配列に対して配列相同性が高い。幾つかの実施態様において、この配列は１つ以上の所望のタンパク質をコードする。別の実施態様において、タンパク質は異なる生物学的機能を有する。さらに好ましい実施態様において、挿入配列は少なくとも１つの選択可能なマーカーを含む。
「修飾配列」及び「修飾遺伝子」の用語は本明細書において互換的に使用され、欠損、挿入、又は自然発生核酸配列の阻害を含む配列をいう。幾つかの好ましい実施態様において、修飾配列の発現生成物は切断されたタンパク質である（例えば、修飾が配列の欠損又は阻害である場合）。幾つかの特に好ましい実施態様において、切断されたタンパク質は生物活性を有する。別の実施態様において、修飾配列の発現生成物は伸長されたタンパク質である（例えば、修飾が核酸配列内へ挿入を含む場合）。幾つかの実施態様において、挿入は切断タンパク質を生成する（例えば、挿入が停止コドンの構成となる場合）。従って、挿入は発現生成物としては、切断タンパク質又は伸長タンパク質のいずれかになる。
本明細書にて用いる、「変異体配列」及び「変異体遺伝子」の用語は互換的に使用され、宿主細胞の野生型配列において生じる少なくとも１つのコドンの変更を有する配列をいう。変異配列の発現生成物は野生型に対して変更されたアミノ酸配列を有するタンパク質である。発現生成物は変更された機能的な能力を有する（例えば、高められた酵素活性）。
「変異プライマー」又は「変異オリゴヌクレオチド」の用語は（本明細書において互換的に使用され）、テンプレート配列の一部分に対応し、それらにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド組成物をいう。変異体プライマーに関して、このプライマーは正確にテンプレート核酸に一致せず、プライマー中に１つ以上のミスマッチを核酸ライブラリーに所望の変異を導入するために用いる。本明細書にて用いる、「非変異プライマー」又は「非変異オリゴヌクレオチド」の用語は、核酸テンプレートに正確に一致するオリゴヌクレオチド組成物を意味する。本発明の幾つかの実施態様において、変異プライマーのみを用いる。本発明の他の好ましい実施態様において、プライマーは変異プライマーにおける少なくとも１つの領域について、オリグヌクレオチド混合物中に非変異プライマーが含まれるように設計される。少なくとも１つの変異プライマーに対応する変異プライマー及び非変異プライマーの混合物を添加することにより、多様な組合せ変異パターンが存在する核酸ライブラリーを生成することができる。例えば、変異体核酸ライブラリーのいくつかのメンバーが特定の部位においてそれらの親配列を有し、他のメンバーがそのような部位で変異していることが望まれる場合、非変異プライマーは所定の残基に対しての核酸ライブラリー内の非変異メンバーの特定のレベルを得ることができる能力を提供する。本発明の方法は、通常１０から５０ベースの間の長さ、好ましくは約１５から４５ベースの間の長さの変異体及び非変異オリゴヌクレオチドを用いる。しかしながら、所望の変異誘発を行うためには１０ベースより短い又は５０ベースより長いプライマーを用いることが必要である。変異及び非変異プライマーに関して、対応するオリゴヌクレオチドの長さに同一である必要はないが、加えられる変異に対応する領域において、重複のみが見られる。
ある実施態様において、プライマーは予め決められた比で添加される。例えば、得られたライブラリーが有意なレベルの特定の変異を有し、同じ又は別の部位において、より少ない量の別の変異を有することが望ましい場合、添加するプライマーの量を調節することで、所望の偏ったライブラリーを生成することができる。あるいは、より少ない又はより多い量の非変異プライマーの添加により。対応する変異が変異核酸ライブラリーにおいて生成される頻度を調節することができる。
本明細書にて用いる、「隣接している変異」の用語は、同じオリゴヌクレオチドプライマー内に存在する変異をいう。例えば、隣接している変異は隣にあるか又はお互いに近い場所にある。しかしながら、これらは同じプライマーにより得られた変異体テンプレート核酸に導入される。
本明細書にて用いる、「隣接していない変異」の用語は別のオリゴヌクレオチドプライマーに存在する変異をいう。例えば、隣接してない変異は別々に調製されたオリゴヌクレオチドプライマーにより得られた変異テンプレート核酸に導入される。
本明細書にて用いる、「野生型配列」、「野生型核酸配列」又は「野生型遺伝子」の用語は、互換的に用いられ、宿主細胞内に自然発生的に本来存在する配列をいう。幾つかの実施態様において、この野生型配列はタンパク質エンジニアリングプロジェクトの開始点である所望の配列をいう。この野生型配列は相同の又は異種のタンパク質のいずれかをコードする。相同タンパク質は本発明を用いずに宿主細胞が生成するものである。異種タンパク質は本発明によらなければ宿主細胞が生成することができないものである。
「酸化安定性」の用語は、例えば、漂白剤又は酸化剤に曝され又は接触させる間のような、タンパク質分解、加水分解、洗浄又は本発明の他の工程の一般的条件下、所定の時間、特定の酵素活性の量を維持する本発明のプロテアーゼをいう。幾つかの実施態様において、このプロテアーゼは少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％のタンパク質活性分解活性を、例えば、少なくとも１分、３分、５分、８分、１２分、１６分、２０分等の特定の間漂白剤又は酸化剤に接触させた後に有している。
「キレート安定性」の用語は例えば、キレート剤に曝され又は接触させる間のような、タンパク質分解、加水分解、洗浄又は本発明の他の工程の間の一般的な条件下、所定の時間、特定の酵素活性の量を維持する本発明のプロテアーゼをいう。幾つかの実施態様において、このプロテアーゼは少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％のタンパク質活性分解活性を、例えば、少なくとも１０分、２０分、４０分、６０分、１００分等の特定のキレート剤に接触させた後に有している。
「熱的に安定性」及び「熱安定性」の用語は、例えば、温度を変更させた場合に、タンパク質分解、加水分解、洗浄又は本発明の他の工程の間一般的条件下に、所定の時間、特定の酵素活性の量を維持する本発明のプロテアーゼをいう。変更させた温度は温度の上昇及び下降を含む。いくつかの実施態様において、このプロテアーゼは、変更させた温度に特定の時間、例えば、少なくとも６０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分等暴露された後に、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％のタンパク質活性分解活性を有している。
「熱的に活性」及び「熱活性」の用語は例えば、温度を変更させた場合に、タンパク質分解、加水分解、洗浄又は本発明の他の工程の間一般的条件下に、所定の時間、同定した温度にて特定の酵素活性の量を獲得する本発明のプロテアーゼをいう。変更させた温度は温度の上昇及び下降を含む。いくつかの実施態様において、このプロテアーゼは、所定の時間、例えば、少なくとも１０分、２０分、３０分、６０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分に対して、同定された温度で少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％またはそれ以上の酵素活性を有している。
本明細書にて用いる、「化学的安定性」の用語は活性に悪影響を与える化学物質に対するタンパク質（例えば、酵素）の安定性をいう。幾つかの実施態様においては、そのような化学物質は過酸化水素、過酸、陽イオン性洗剤、陰イオン性洗剤、非イオン性洗剤、キレート剤等を含むが、これらに限定されない。しかしながら、本発明は特定の化学安定性レベル又は化学的安定性範囲いずれかに限定することを意図しない。実際に、「洗剤安定性」及び「ＬＡＳ安定性」はタンパク質分解、加水分解、洗浄又は本発明の他の工程の間一般的条件下に、所定の時間、洗剤組成物に暴露後に、特定の酵素活性の量を維持する本発明のプロテアーゼをいう。いくつかの実施態様において、このプロテアーゼは、例えば、少なくとも６０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分等の特定の時間、洗剤に暴露後に、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％のタンパク質活性分解活性を有している。
本明細書にて用いる「洗浄安定性」の用語は、タンパク質分解、加水分解、洗浄又は本発明の他の工程の間一般的条件下に、タンパク質（例えば、酵素）の安定性をいう。しかしながら、「洗浄安定的」及び「洗浄条件安定性」はタンパク質分解、加水分解、洗浄又は本発明の他の工程の間一般的条件下に、所定の時間、特定の酵素活性の量を維持している本発明のプロテアーゼをいう。幾つかの実施態様において、このプロテアーゼは、例えば、少なくとも５分、１０分、３０分、６０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分等の所定の時間、洗剤に暴露後に、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％のタンパク質活性分解活性を維持している。
酸化、キレート剤、熱的に、及び/又はpHに安定な酵素の内容において、「高められた安定性」又は「低下した安定性」の用語は野生型酵素と比較して経時的にそれぞれ高く又は低く保持されたタンパク質分解活性をいう。
酸化、キレート剤、熱的に、及び/又はpHに安定な酵素の内容において、「高められた安定性」又は「低下した安定性」の用語は野生型酵素と比較して経時的にそれぞれ高く又は低く保持されたタンパク質分解活性をいう。
酸化、キレート剤、熱的に及び/又はpHに安定なプロテアーゼの内容において、「高められた安定性」の用語とは他のセリンプロテアーゼ（例．スブチリシンプロテアーゼ）及び/または野生型の酵素と比較して経時的に高く保持されたタンパク質分解活性をいう。
酸化、キレート剤、熱的に及び/又はpHに安定なプロテアーゼの内容において、「低下した安定性」の用語とは他のセリンプロテアーゼ（例．スブチリシンプロテアーゼ）及び/または野生型の酵素と比較して経時的に低く保持されたタンパク質分解活性をいう。
本明細書にて用いる、「利点」及び「好ましい結果」の用語は動物、ヒト、及び産業用適用により有用にするためにタンパク質を改善する結果をいう。幾つかの実施態様において、好ましい結果は洗剤プロテアーゼの洗浄性能のような最終的に対象とする商品に用いるタンパク質に直接的に関与し、一方他の実施態様においては、その製品に関与する利点を与える。好ましい結果の例は、基質結合、酵素阻害、反応速度、洗剤安定性、熱安定性、熱的活性、立体配座の安定性、タンパク質分解及び／又は自己分解に対する安定性、発現レベル、溶解度、復元可能性、ｐＨ活性プロファイル、乳化性、発泡性、及び湿潤性を含むがこれらに限定されない。
本明細書にて用いる、「発熱の」及び「吸熱の」の用語は当分野のおける習慣の意味として用いる。本明細書に記載の幾つかのアッセイ系は１より低い残存活性分画は変異体が高い温度（発熱の）で活性が低いことを示し、つまり低い温度でより有用な性能である。反対に、１より高い残存活性分画は変異体は高い温度（吸熱の）でより活性を有することを示し、つまり、高い温度でより有用な性能である。
本明細書にて用いる、「物理的性質」はタンパク質の物理化学の特徴を示す任意の有用なパラメーターをいう。本明細書にて用いる、「所望の物理的性質」及び「所望の性質」は互換的に用い、調べられ及び／又は修飾されたタンパク質の物理的性質をいう。一般的な意味で「タンパク質」の用語は酵素、ポリペプチド、及び高分子電解質を含む。物理的性質の例は、正味の表面電荷とタンパク質表面上の電荷分布、正味の疎水性とタンパク質表面上の疎水性残基分布、表面電荷密度、表面疎水性密度、表面イオン化基の総数、表面張力、タンパク質サイズとその溶液中の分布、融点、熱容量、及び第二ビリアル係数を含むがこれらに限定されない。
本明細書にて用いる、「洗浄組成物」の用語は、他に示さない限り、粒状又は粉状の形態、多目的又は「頑固汚れ用」洗浄剤であって特に洗浄洗剤、液体、ゲル又はペースト形態 多目的洗浄剤であって特にいわゆる頑固汚れ用液体タイプ、液体きめの細かい布地用洗剤、手洗浄剤又は簡単な汚れ用の食器洗浄剤であって特に高い発泡性タイプのもの、食器洗浄機用の洗剤であって、家庭用及び営業用の種々の錠剤、粒状、液状及び泡切れの良いタイプを含む洗剤、液体洗浄及び殺菌剤であって、抗菌手洗浄タイプ、洗浄スティック、口腔洗浄、歯科用クリーナー、車又はカーペットシャンプー、浴槽クリーナー、毛髪用シャンプーと毛髪用リンス、シャワーゲル、及び入浴剤及び金属用クリーナー、並びに漂白添加剤のような洗浄補助剤及び「汚れ用スティック」又は前処理タイプを含む。
本明細書にて用いる、「洗剤組成物」及び「洗剤製剤」の用語は汚れた物の洗浄用洗浄媒体において使用を意図する混合物に関して用いる。幾つかの好ましい実施態様において、この用語は洗濯布地及び／又は衣類に関して用いる（例えば、「洗濯洗剤」）。別の実施態様においては、この用語は食器、刃物など洗浄に用いるもののような他の洗剤（例えば、「食器洗浄洗剤」）をいう。本発明は任意の特定の洗剤製剤又は組成物に限定することを意図しない。実際、この用語は界面活性剤、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、オキシドレダクターゼ、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、青味剤、蛍光染料、凝固阻害剤、マスキング剤、酵素活性剤、抗酸化剤、及び安定化剤を含むことが考えられる。
本明細書にて用いる、「標準緩衝液」は所望の性質の測定（例えば、ゼータ電位）に用いるｐＨ及びイオン強度が知られている緩衝液をいう。
本明細書にて用いる、「改良された変異体」は文中に示すように野生型又は他の親タンパク質と比較して、１．０より大きい性能指標を有する酵素変異体をいう。
本明細書にて用いる、「基質汚れに特異的な酵素変異体」は他の汚れ存在下特定の汚れを選択的に加水分解する酵素をいう。
本明細書にて用いる、「所望のアッセイ」は酵素に対して特定の所望の性質を決定するために用いる任意の試験方法をいう。幾つかの実施態様においては、所望の複数のアッセイを用いる。
本明細書にて用いる、洗剤で使用する「向上した性能」は標準洗浄サイクル後通常の評価により決定されるとき、汚れ（例えば、草、紅茶、ワイン、血液、黒ずみ、食品等）の洗浄が増加として定義される。ある実施態様においては、本発明の酵素変異体は着色汚れ及び泥の除去について向上した性能を有する。さらなる実施態様において、本発明の酵素は染みの除去及び／又は脱色について向上した性能を有する。
本明細書にて用いる、「硬い表面洗浄組成物」の用語は床、壁、タイル、浴槽、及び台所付属品等のような固い表面の洗浄用洗剤組成物をいう。そのような組成物は固体、液体、乳液等を含む任意の形態を有するが、これらに限定されない。
本明細書にて用いる、「食器洗浄組成物」は粒状及び液体の形態を含むがこれらに限定されない食器洗浄用の組成物のためのすべての形態をいう。
本明細書にて用いる、「布地洗浄組成物」は粒状、液体、及び棒状を含むがこれらに限定されない布地を洗浄するための洗剤組成物のすべての形態をいう。
本明細書にて用いる、「繊維」は毛糸、織物、ニット、及び非織物として転換又は使用に適切な織物、並びに人造繊維、及びフィラメントをいう。この用語は天然並びに合成（例えば、製造）糸から作られる糸を含む。
本明細書にて用いる、「繊維物質」は糸、糸中間体、糸生地、及び布地（例えば、衣類及び他の商品）からつくられる。
本明細書にて用いる、「布地」は任意の繊維物質を含む。つまり、この用語は衣類並びに布地、毛糸、繊維、非織物物質、天然物質、合成物質、及び任意の他の繊維物質を含むことを意図する。
本明細書にて用いる、「適合性」の用語は洗浄組成物物質が通常の使用状態の間酵素が必要とする効果がない範囲まで本発明の酵素の酵素活性を低下しないことを意味する。具体的洗浄組成物は本明細書にて詳しく説明する。
本明細書にて用いる、「酵素の有効量」は特定の利用（例えば、個人的ケア商品、洗浄組成物等）に必要となる酵素活性を達成するのに必要な酵素の量をいう。そのような有効量は当業者により容易に確認でき、特定の酵素変異体の使用、洗浄適用、洗浄組成物の特定の組成物、及び液体又は乾燥（例えば、顆粒、棒状物）組成物が必要とされるかなど、多くの因子に基づく。
本明細書にて用いる、「非布地洗浄組成物」は、硬い表面洗浄組成物、食器洗浄組成物、個人的ケア洗浄組成物（例えば、口内洗浄組成物、義歯洗浄組成物、人の体を洗う組成物等）及びパルプ及び製紙産業の使用に適する組成物を含む。
他に示さない限り、すべての成分又は組成物レベルはその成分又は組成物の活性レベルに関し、例えば商業的に入手できる供給源に存在する残留溶剤又は副産物のような不純物を除去している。
酵素成分量は総活性タンパク質に基づく。特に他に示さない限り、すべてのパーセント及び割合は重量％で計算される。特に他に示さない限り、すべてのパーセント及び割合は総組成物に基づいて計算される。
本明細書を通して与えられる各最大限定数値は、本明細書中にそのような低い数値限定が具体的に明記されたと同様に、それぞれ最大限定数値よりも低い数値とすることを含む。本明細書を通して与えられる各最小限定数値は、本明細書にそのような高い数値限定が具体的に明記されたと同様に、それぞれ最小限定数値よりも高い数値とすることを含む。本明細書を通して与えられる各数値範囲は、本明細書にそのような狭い数値範囲が具体的に明記されたと同様に、そのような広い数値範囲内の狭い数値範囲とすることを含む。
「洗浄活性」の用語は、酵素的、加水分解、洗浄又は本発明の他の処理において一般的な条件で、酵素により達成される洗浄性能をいう。いくつかの実施態様では、洗浄性能は、標準洗浄条件に汚れを適用した後、種々のクロマトグラフ、分光学的又は他の定量的方法により決定されるように、酵素に感受性のある汚れ、例えば、草、血液、ミルク、又は卵のタンパク質に関し、多様な洗浄アッセイの適用により決定される。分析法の例には、実施例に含まれる方法のほか、WO99/34011と米国特許第6,605,458号（両者ともに引用により本明細書に組み込む）で記載された分析法を含むがこれらに限定はされない。
酵素の「洗浄有効量」の用語は、特定の洗浄組成物において酵素活性の所望のレベルを達成する、すでに明細書で述べたプロテアーゼの量をいう。このような有効量は本願技術分野において通常の技術をもつ者により容易に確認され、使用する特定のプロテアーゼ、洗浄態様と、洗浄組成物の特定の組成及び液状又は乾燥（例．粒状、棒状）組成物が必要とされるかなど、多くの因子に基づく。
本明細書にて用いる、「洗浄添加物質」の用語は、所望の特定の洗浄剤組成と製品形態（例えば、液体、顆粒、粉末、棒状物、ペースト、スプレー、錠剤、ゲル又は泡の組成物）について選択された液体、固体又は気体の物質であり、好ましくはその組成物で使用されるプロテアーゼ酵素に適合するものである。いくつかの実施態様では、顆粒組成物は「コンパクト」な形態にされ、他方、他の実施態様では、液体組成物は「濃縮」された形態である。
洗浄活性の内容において、「向上した性能」及び「好ましい性質」の用語は、親酵素と比較して、標準洗浄サイクル及び／又は複数洗浄サイクル後の通常評価により決定するように、血液、牛乳、インク、卵、草、紅茶、ワインなどのような特定酵素に感受性のある汚れの増加した又は大きくなった洗浄活性をいう。ある実施態様においては、本発明のプロテアーゼ変異体は着色汚れの除去に向上した性能を有する。
洗浄活性の内容において、「低下した性能」及び「好ましくない性質」の用語は、親酵素と比較して、標準洗浄サイクルの通常評価により決定するように、血液、牛乳、インク、卵、草、紅茶、ワインなどのような特定酵素に感受性のある汚れの減少した又は小さくなった洗浄活性をいう。
洗浄活性の内容において、「比較性能」及び「満足な性質」の用語は比較酵素（例えば、商業的に入手可能なプロテアーゼ）少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の洗浄活性をいう。洗浄性能は本発明のプロテアーゼと他のプロテアーゼを標準洗浄サイクル条件後通常の分光光度又は分析の方法で決定する血液、牛乳、及び／又はインク（ＢＭＩ）のような酵素に感受性のある汚れに関する多様な洗浄アッセイにて比較することにより決定できる。
本明細書にて用いる、「低洗剤濃度」系は約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分が洗浄に用いる水に含まれる洗剤を含む。日本の洗剤は、洗浄に用いる水に普通約６６７ｐｐｍの洗剤成分を含むので、通常は、低洗剤濃度系であると考えられている。
本明細書にて用いる、「中程度の洗剤濃度」系は、約８００ｐｐｍと約２０００ｐｐｍの間の洗剤成物が洗浄用の水に含まれる洗剤を含む。北アメリカの洗剤は、普通約９７５ｐｐｍの洗剤成物が洗浄用の水に含まれるので、一般的に中程度の洗剤濃度系であると考えられている。一般的に、ブラジルの洗剤は、洗浄用の水に約１５００ｐｐｍの洗剤組成物を含む。
本明細書にて用いる、「高洗剤濃度」系は約２０００ｐｐｍより高濃度の洗剤成物が洗浄用の水に含まれる洗剤を含む。ヨーロッパの洗剤は一般的に、約３０００−８０００ｐｐｍの洗剤成物を洗浄用の水に含むので一般的に高洗剤濃度系であると考えられている。
本明細書にて用いる、「布製品洗浄用組成物」の用語は、洗濯用添加剤組成物及び汚れた布製品（例えば、衣類、繊維、及び他の布製品）を浸す及び／又は前処理に用いるのに好ましい組成物を含む、手洗い又は機械洗いのための洗濯用組成物をいう。
本明細書にて用いる、「非布製品洗浄用組成物」の用語は、非繊維（つまり、布製品以外）の表面を洗浄する組成物を含み、食器洗浄用組成物、口腔洗浄用組成物、歯磨き用組成物、及び個人用洗浄ケア組成物を含むがこれらに限定されない。
本明細書における洗浄組成物の「コンパクト」形態は、密度により反映され、組成物の観点からは、無機充填塩の量に反映されている。無機充填塩は粉末形態の洗浄用組成物の従来の成分である。従来の洗浄組成物において、充填塩は組成物全体に対して、通常１７から３５重量％で存在する。対照的に、コンパクト組成物において、充填塩は１５％を超えない量で存在する。幾つかの実施態様において、この充填塩は１０％を超えない量で存在し、又はより好ましくは組成物の重量により５％である。幾つかの実施態様において、無機充填塩は硫酸又は塩素のアルカリ及びアルカリ土類金属塩である。好適な充填剤点在は硫酸ナトリウムである。
発明の詳細な説明
本発明は、産業用、消費者用、又は製薬用利用において一以上の有用な性質を有するタンパク質を得るための効率的な方法を提供する。ある好ましい実施実施態様においては、本発明は候補となる酵素の簡略セットのスクリーニングを通して所望の適用に対して優れた酵素を生産するための方法を提供する。
最近、産業用、消費者用、又は製薬用利用においてタンパク質の性能を改良のために役立つ多くの戦略は、酵素活性部位又はその近くでのアミノ酸置換に焦点をあわせ、その結果触媒効率が増強された。しかしながら、本発明の研究中、酵素表面の他の箇所の変異が触媒効率性の改善を通して出来る程度を超えて酵素性能を劇的に増強することが明らかとなった。基本的に、酵素により仲介される基質の生産物への変換を支配する反応速度は化学的触媒変換段階単独の速度によっては単に部分的に制御される。酵素‐基質であるＥＳ複合体として結合する前並びに化学変換後形成される酵素‐生産物であるＥＰ複合体から分離する間、酵素及び基質はコロイドとして相互作用する。速い速度で反応段階が進む場合でさえ、静電反発力を有する同符号のコロイドの場合のように、基質への酵素の接近は非常に遅い（例えば、拡散律速）。同様に、短い距離の疎水性力及び拡散力にひきつけられるコロイドの場合のように、酵素‐生成物であるＥＰ複合体から酵素の放出は非常に遅い（例えば、拡散律速）。両者の条件は基質から生成物への酵素の経過時間を増加し、化学変換に比較して速度段階が限定される。逆帯電したコロイドは実際ＥＳ複合体（例えば、上記拡散律速）の形成が加速されることが予測可能であるけれども、次のＥＰ複合体の解離は大変遅く（荷電されない又は電荷消失と考えられる）全体の反応速度は遅くなる。従って、ＥＳ及びＥＰ複合体両者の最小の律速時間を得るためにペア‐ワイズ相互作用電位の非対称を利用する。しばしば酵素が律速される条件下最も短い可能な時間ですべての基質を生産物へ変換することが望まれているので、これは産業用バイオテクノロジーの分野でとても重要である。歴史的に、タンパク質工学は化学変換段階の特異的酵素‐基質相互作用に焦点をあて、短い及び長い範囲の非特異的相互作用であって、分子間コロイド力及び表面力から生じ、結合及び解離段階を支配することを特徴とする相互作用の寄与を認識していなかった。本発明の目的は化学変換段階が律速になる時点に分子間力を最適化することである。一度化学変換段階が律速になると、酵素活性部位の変化を通して改善できる。本目的は基質が溶液中の小さなペプチド又は不溶性巨視的な基質であろうと適用できる。にもかかわらず、本発明を作製し及び使用するために関連する作用機序の情報は必要とならない。また、本発明は任意の特定の作用機序に限定することを意図しない。
例えば、液体洗濯剤において、酵素及び帯電した基質間で性能に対して電荷最適条件を観察する。理論に束縛されずに、酵素及び基質汚れが強い反対符号の電荷を有する場合、強い非生産的な結合が原因により、少しだけ性能を検出する。反対に、それらの電荷が強い同符号の電荷を有する場合、反発力が原因により、少しだけ性能を検出する。任意の酵素折りたたみに関してこの性能に対するこの電荷最適条件は親酵素に比較して正味の電荷という用語で的確に記載する。異なる酵素折りたたみに渡って性能を比較する場合、しかしながら、共通のスケールを用いてよい。一般的に共通のスケールはゼータ電位、電気泳動、水素イオン滴定測定により実験的に決定される酵素電荷又はパブリックソフトウェア（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）又は商業的ソフトウェア（例えば、ＤｅｌＰｈｉ、ＭＯＥ）を用いての計算さえ含むがこれらに限定されない。本明細書にて記載のように、所定の基質汚れ及び洗剤製剤に対して、異なる折りたたみ由来の最適酵素は同程度の正味電荷を有する。この発見は任意の反応媒体中所定の適用に対してすぐれた性能を発揮する酵素を迅速に決定する方法に基礎となる。
性能最適化の場所は利用する媒体（例えば、洗剤製剤、ｐＨ、イオン強度等）並びに正味電荷及び所望の酵素のアミノ酸残基の電荷分布によって大きく影響する。つまり、最適酵素は多様なｐＨ、イオン強度、界面活性剤のタイプと割合、ビルダー、及びキレーターであって、すべて静電気現象に影響する異なる要素が存在することを意図する。ブレンドの各種類が異なる電荷最適化を有する酵素ブレンドの使用は広い範囲の条件（例えば、異なる地理又は場所で販売される洗剤製剤中のプロテアーゼはことなる水硬度を有する）に有用な製剤の生産を含む。また、酵素ブレンドの使用は広範囲の汚れの洗浄に有用な製剤の生産も含み、ブレンドの各種類が異なる汚れの洗浄に優れる。さらに、酵素ブレンドの使用は酵素基質それ自身帯電している場合に酵素反応の間変化することを含み、ブレンドの各種が異なる電荷最適化を有する。
プロテアーゼ及び血液、牛乳やインク汚れの関係について本明細書にて記載するけれども、本発明の方法は任意の反応媒体における任意の酵素‐基質を最適化することに有用である。特に、本発明の方法は他のプロテアーゼ及び酵素分類（例えば、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、マンナーゼ、等）の性質を改良することに用いることを含む。さらに、本発明の方法は他の製剤（例、緩衝液）における酵素及び他のタンパク質の性質を改良することに用いるのに有用であることを意図する。
ある実施態様においては、本発明の方法はセルラーゼを改良するのに用いることができる。セルラーゼはセルロース基質と反応し、多くの産業利用に多様な利益をもたらす。これらは繊維製品に対するストーンウォッシュ効果、洗濯における衣類からの汚れ洗浄、綿及び綿／合成繊維ブレンドの毛玉除去及毛玉防止、及び発酵性糖に対するバイオマスの分解を含むがこれらに限定されない。すべてこれらの適用におけるセルラーゼの性能をプロテアーゼとして本明細書に記載のようにセルラーゼの表面電荷及び／又は疎水性を最適化することにより改善でき、所定の適用条件下最適性能を獲得できる。特に、繊維製品におけるセルラーゼの使用及び衣類の手入れの利用に関連する主要な課題の一つはセルラーゼの処理が衣類を傷めることである。繊維は帯電する表面であるので、酵素表面の電荷を最適化する本発明の方法を用いることは繊維へのセルラーゼの侵入を防止に有用である。繊維表面を反応することによって最適電荷を有する酵素変異体はなお表面を磨くことができるが、表面の侵入を防ぐことができない。つまり、本発明は繊維強度の少しの消失で好ましい衣類の手入れ性能を有するセルラーゼを得る方法を提供する。更なる実施態様においては、本発明により提供される改良セルラーゼはバイオマス及び他の適用において用いることができる。
さらに、本発明の方法は多様な商業的及び工業的適用に有用であるデンプン加水分解において使用するアミラーゼを改良することに用いることができる。
ポリエステラーゼ及びクチナーゼはポリエステルの表面を修飾するのに用いる。この反応はポリエステル及びポリエステル／綿ブレンドに衣類手入れの良い効果を与えるために用いることができる。周知の酵素の主な欠点のひとつはそれらが繊維にとても強く結合することである。これは多様な衣類手入れの適用において酵素性能の低下をもたらす。本発明はポリエステルとクチナーゼ酵素の表面電荷及び／又は疎水性を修飾することによりこれらの酵素の性能を改善する手段を提供する。
リパーゼは油分の汚れを洗浄する洗濯適用において用いられる。一般的に、これらの汚れはとても疎水性である。本発明はリパーゼの酵素の表面電荷及び／又は疎水性を最適化することによりこれらの酵素の性能を改善する手段を提供する。別のリパーゼ性能の欠点は衣類及び又は汚れに結合するリパーゼが原因で悪臭が発生することである。同様に、本発明はリパーゼの表面電荷及び／又は疎水性を最適化し、衣類への酵素結合を低減させることにより悪臭発生を最小にするために用いることができる。
通常、洗浄組成物は非プロテアーゼ酵素を伴うプロテアーゼを含む製剤を必要とする。しばしば、プロテアーゼは他の酵素並びにそれら自身（つまり、自己消化を通して）を分解する。現在、これはプロテアーゼを阻害する化合物の添加により解決される。本発明はプロテアーゼ耐性を有する所定の酵素の物理的性質最適化を決定することによりタンパク質分解への酵素耐性を増強するために用いることができる。
簡単に言うと、本発明の方法は下記に詳しく述べる一以上の段階を含む。それは
（Ｉ）物理的性質の範囲にわたるプローブタンパク質をアッセイし、
（ＩＩ）所定の好ましい結果として物理的性質の最適条件を決定し、及び
（ＩＩＩ）物理的性質最適条件を有する変異タンパク質を提供すること
である。
Ｉ．プローブタンパク質アッセイ
ある実施態様においては、この段階は適切なアッセイにおいて所望の物理的性質（つまり、「所望の性質」）の範囲にわたる複数のプローブタンパク質（つまり、「プローブタンパク質折りたたみ」）の試験を含む。ある実施態様においては、プローブタンパク質はタンパク質及び／又はそれらの変異体の限定セットを含む。一般的な実施態様においては、この段階は一以上の利点を求めて複数のセリンプロテアーゼ及び／又はメタロプロテアーゼ（つまり、二つの異なるタンパク質折りたたみ）を試験することを含む。例えば、ふたつのプロテアーゼの電荷‐ラダー変異体、ＡＳＰ（セリンプロテアーゼ）及びＮｐｒＥ（中性メタロプロテアーゼ）が提供される。本明細書に記載のＡＳＰのプロテアーゼ電荷‐ラダー変異体は、親ＡＳＰ（例えば、Ｒ１４Ｉ）と比較して−４から＋４又は野生型ＡＳＰと比較して−５から＋３の相対的正味電荷変化範囲に及ぶ。ある実施態様においては、プローブタンパク質セットも商業的に入手なタンパク質を含み、所望の適用（例えば、洗剤製剤に用いるスブチリシン）の基準として役立つ。
ＩＩ．物理的性質最適条件の決定
好ましい実施態様においては、この段階は物理的性質の最適条件又は好ましい結果に対するその範囲を同定することを含む。一般的な実施態様においては、プロテアーゼ電荷ラダー変異体の洗浄性能を測定した。異なる折りたたみを有するタンパク質で得た利点を比較する場合、共通の物理的性質のスケールを用いる（例えば、ゼータ電位で報告されるタンパク質電荷）。反対に、同じ折りたたみを有するタンパク質で得た利点を比較する場合、相対的スケールを用いる（例えば、野生型又は親タンパク質と比較した正味電荷の差）。特に好ましい実施態様においては、広い物理的性質の範囲にわたるプローブタンパク質を用い、その物理的性質の最適条件を決定する可能性が増加する。一度所望の利点のための最適値又は最適範囲がプローブタンパク質をアッセイすることにより確立されると、劣った性能（例えば、最適範囲外で存在）を優れた性能（例えば最適範囲内）に変換するのに必要な一般的な変化の方向及び強度両方を推測することができる。
二以上のプローブタンパク質シリーズの使用は、所望の利点対する異なる物理的性質の最適条件の同定を許容することを含む。例えば、ある実施態様においては、洗剤プロテアーゼに関して電荷‐ラダー及び疎水性‐ラダーの両者を血液、牛乳、インクのアッセイにおける洗浄性能に関して試験を行う。反対に同じ物理的性質は異なる利点に対する異なる最適条件が存在することを含む。例えば、ＮｐｒＥに関して洗浄性能に対する最適プロテアーゼ電荷が存在し、これは洗剤安定性に対する最適プロテアーゼ電荷と異なる。
ある実施態様においては、電荷関連物理的性質は測定されるゼータ電位、正味電荷、電荷密度、及び／又はイオン性基の表面の数の観点から異なるタンパク質折りたたみにわたって比較される。一般的に、滴定又は電気泳動測定からタンパク質電荷を決定する任意の方法は異なるタンパク質折りたたみを比較するのに有用である。別の実施態様においては、異なるタンパク質折りたたみの比較が、入手できるタンパク質の一次、二次、及び／又は三次配列情報に基づいて、一以上の上記定量の計算により行われる。そのような目的のために用いる典型的なバイオインフォマティック手段はヘンダーソン‐ヘッセルバッハの方程式（例えば、European Molecular Biology Laboratory）又はポアソン‐ボルツマンの正電気的ソルバー（例えば、ＤｅｌＰｈｉ、ＭＯＥ）を用いる等電点計算器を含む
ある実施態様においては、疎水性関連物理的性質はその天然水溶性環境と疎水性相の間で測定されるタンパク質分配の観点から異なるタンパク質折りたたみにわたって比較される。実施例は空気‐水又はヘプタン‐水の境界面で表面張力、並びに接触角度、及び水溶液と相を含む固体基質間でぬれ測定を含むがこれらに限定されない。一般的に、二相の間でタンパク質の分配を特徴づけるのに有用な任意の方法は、本発明おける使用に適しており、光学の（例えば、偏光解析法、表面プラズモン共鳴、干渉分光法、及び／又は反射率）、音響の（例えば、クウォーツ‐クリスタルマイクロバランス）、蛍光の、分光の（例えば、減衰全反射赤外分光法）又は濃度（例えば酵素活性）検出を含む。ある実施態様においては、総合的な疎水性の寄与は入手可能な文献及び当業者に周知のタンパク質一次、二次、及び／又は三次構造情報を考慮する一以上の多くのアミノ酸疎水性スケールを用いて計算される。
荷電する残基が疎水性の特徴を与えるので、電荷及び疎水性スケールはお互いに無関係ではない。つまり、別のスケールに対して一つのスケールを単に選択することよりむしろ、本発明のある実施態様は物理的性質を同定するための複数の異なるスケール（例えば、理論的又は実験的検出）を用いる。最も一般的に用いる疎水性スケールの２３の文献は次を含む。それは、
疎水性(Rao及びArgos)は膜挿入ヘリックスパラメータを計算(Rao and Argos, Biochim. Biophys. Acta 869:197-214 [1986])、
疎水性(Black及びMould)は生理的Ｌ−アルファアミノ酸の疎水性を計算(Black and, Mould, Anal. Biochem., 193:72-82 [1991])、
疎水性(Bull及びBreese)は疎水性（ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ表示で表面へ転移のフリーエネルギー）を計算(Bull and Breese, Arch. Biochem. Biophys. 161 :665-670 [1974])、
疎水性(Chothia)は９５％貫通残基の割合を計算（１２タンパク質） (Chothia, J. MoI. Biol., 105:1-14 [1976])、
疎水性(Kyte及びDoolittle)はハイドロパシシティー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）を計算(Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol., 157:105-132 [1982])、
疎水性(Eisenberg他)は標準化コンセンサス疎水性スケールを計算 (Eisenberg他、J. MoI. Biol. 179:125-142 [1984])、
疎水性(Fauchere及びPliska)は疎水性スケール(ｐｉ‐ｒ)を計算(Fauchere and Pliska, Eur. J. Med. Chem., 18:369-375 [1983])、
疎水性(Guy)は転移のフリーエネルギー(ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ)に基づく疎水性スケールを計算 (Guy, Biophys J., 47:61-70 [1985])、
疎水性(Janin)は球状タンパク質の内側から外側への移転フリーエネルギーを計算 (Janin, Nature 277:491-492 [1979])、
疎水性(Abraham及びLeo)は疎水性(ｄｅｌｔａ Ｇ１／２ｃａｌ)を計算(Abraham and Leo, Proteins: Structure, Function and Genetics 2: 130-152 [1987])、
疎水性(Manavalan他)は平均環境疎水性を計算 (Manavalan他、Nature 275:673-674 [1978])、
疎水性(Miyazawa他)は疎水性スケール（３Ｄデータ由来の接触エネルギー）を計算 (Miyazawa 他、Macromolecules 18:534-552 [1985])、
疎水性(Aboderin)はクロマトグラフィー紙(RF)上のアミノ酸の動きを計算 (Aboderin, Int. J. Biochem., 2:537-544 [1971])、
HPLCによる疎水性(Parker他)はＨＰＬＣペプチド保持時間由来の疎水性スケールを計算 (Parker他、Biochem., 25:5425-5431 [1986]);、
HPLC pH3.4による疎水性はＨＰＬＣ検出によるｐＨ３．４での疎水性インデックスを計算(Cowan and Whittaker, Peptide Res., 3:75-80 [1990])、
HPLC pH7.5による疎水性はＨＰＬＣ検出によるｐＨ７．５での疎水性インデックスを計算(Cowan and Whittaker, Peptide Res., 3:75-80 [1990])、
疎水性(Rose他)(AA)は平均分別エリア消失（ｆ）を計算 [平均エリア 貫通／標準状態エリア] (Rose他、Science 229:834-838 [1985])、及び
疎水性(Roseman)は疎水性スケール(ｐｉ‐ｒ)を計算(Roseman, J. MoI. Biol., 200:513-522 [1988))
である。
ある実施態様においては、溶解度関連物理的性質はすでに記載の電荷及び疎水性スケール両者の観点から異なるタンパク質折りたたみにわたって比較される。一般的に、タンパク質‐タンパク質対タンパク質‐溶媒相互作用を特徴づける任意の熱力学的又は速度論的量は本発明の方法を使用するのに適している。第二ビリアル係数（Wilson, Acta Crystallographica, D50:361-365 [1994]を参照願いたい）、カイパラメーター、浸透圧、及び活性又は理想の混合作用由来の偏差値を反映するフガシティー係数が用いられる（例えばReid 他"The Properties of Gases and Liquids", 4th Ed. McGraw-Hill, [1987]を参照願いたい）。
ある実施態様においては、サイズ関連物理的性質はタンパク質又はポリマーの大きさを決定するのに有用な任意の実験手段を用いて異なるタンパク質折りたたみにわたって比較される。さらなる実施態様においては、サイズはタンパク質又はポリマー配座（コイル、球状、分岐）、それらの分子量及び流体力学半径又は回転半径間で通常入手できる相関を用いて分子量から推測される。サイズ又は分子量決定のために有用な技術は静的光散乱及び動的光散乱、ゲル電気泳動、マススペクトログラフィー及びクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない。さらなる実施態様においては、サイズは実験的に決定されるタンパク質結晶構造又は構造相同性モデルの知識から容易に算定される。
タンパク質融解温度（Ｔｍ）は一般的に温度スキャン全域で物理的報告性質のモニタリングによって決定される。適切な方法は示差走査熱量測定、円偏光二色性、動的光散乱、ＵＶ−可視分光法を含むが、これらに限定されない。
III．物理的特徴最適条件を有する変異タンパク質の提供
一度最適値又は範囲が前段階で決定されると、所望の物理的性質に制約される多くの候補タンパク質が提供される。候補タンパク質を提供する適切な方法は組み換え技術による人工的な酵素変異体の生産、並びにクロマトグラフィーによる天然酵素変異体（例えば、相同体）の精製、イン ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｏｒｏ）でのグリコシル化又はリン酸化酵素変異体の合成又はビトロでの酵素複合体の生産を含むが、これらに限定されない。グリコシル化を通したタンパク質の疎水性の改変の別の方法は酵素表面上の新しいグリコシル化部位を生成することである。これらの変異体は発現の間インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でグリコシル化される。
ＡＳＰ及びＮｐｒＥ電荷ラダープローブタンパク質の使用により、物理的性質の多様化から生じる利点又は好ましい結果が同じ標準正規分布により十分に説明されることが明らかとなった。ある実施態様においては、プローブタンパク質のセットを所定の適用に関してこの分布の平均及び幅を決定するために用いる。次に、この分布は、同じ条件下試験する場合、所望の利点を有する同じ又は異なる折りたたみ由来のさらなる酵素変異体を得るために必要となる改良の方向及び強度を決定するための基準として用いる。
例えば、同じ増殖条件下バシルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるＡＳＰ及びＮｐｒＥ電荷ラダー変異体両方の最適化発現レベルは同じ標準分布を伴い、各酵素が−８．８４ｍＶのゼータ電位を生じる。例えば、北アメリカ洗剤ｐＨ及び導電率に適合する緩衝液中血液、牛乳、インク汚れのＡＳＰ電荷ラダー変異体の最適洗浄性能は−９．６８ｍＶのゼータ電位であって実質的に基質汚れの−８．９７ｍＶのゼータ電位と等しいゼータ電位で最適洗浄を有する標準正規分布を伴う。さらに、この電荷要求性に合致するＡＳＰ及びＮｐｒＥプロテアーゼはタンパク質工学、共有結合又は非共有結合を通しての化学修飾、自然単離選別及び翻訳後の修飾（例えば、グリコシル化）を用いて提供される。
以下実施例は特定の好ましい本発明の実施態様及び態様を実証及び説明するために提供され、それらの特許請求の範囲を限定するものとして解釈される。
実施例は次に開示され、次の略語が適用される。
℃(℃ 摂氏)、ｒｐｍ (一分当たりの回転数)、H2O (水)、ＨＣｌ (塩酸); ａａ及びＡＡ (アミノ酸)、ｂｐ (塩対)、ｋｂ (キロ塩基対)、ｋＤ (キロダルトン)、ｇｍ (グラム)、μｇ及びｕｇ (マイクログラム)、ｍｇ (ミリグラム)、ｎｇ (ナノグラム)、 μｌ及びｕｌ (マイクロリットル)、ｍｌ (ミリリットル)、ｍｍ (ミリメートル)、ｎｍ (ナノメートル)、 μｍ及びｕｍ (マイクロメートル)、 Ｍ (モル)、ｍＭ (ミリモル)、μＭ及びｕＭ (マイクロモル)、Ｕ (ユニット)、ｖ (ボルト)、ＭＷ (分子量)、ｓｅｃ (秒)、 ｍｉｎ（ｓ）(分)、ｈｒ（ｓ） (時間)、 ＭｇＣｌ2 (塩化マグネシウム)、ＮａＣｌ (塩化ナトリウム)、ＯＤ280 (２８０ｎｍでの光学密度)、ＯＤ４０５ (４０５ｎｍでの光学密度); ＯＤ600 (６００ｎｍでの光学密度); ＰＡＧＥ (ポリアクリルアミドゲル電気泳動)、ＥｔＯＨ (エタノール)、ＰＢＳ (リン酸緩衝生理食塩水 [１５０ mM ＮａＣｌ, １０ ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液, ｐＨ ７．２]); ＬＡＳ (ラウリルスルホン酸ナトリウム)、ＳＤＳ (ドデシル硫酸ナトリウム)、 Ｔｒｉｓ (トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン)、ＴＡＥＤ (N,N,N'N'-テトラアセチルエチレンジアミン)、ＢＥＳ （ポリエステルスルホン（ｐｏｌｙｅｓｓｔｅｒｓｕｌｆｏｎｅ）)、ｍｅｓ (2-モルホリノエタンスルホン酸１水和物（２‐ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ, ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）f.w. 195.24シグマ 番号Ｍ‐３６７１)、ＣａＣｌ2 (塩化カルシウム無水物、f.w. 110.99、シグマ 番号Ｃ‐４９０１)、ＤＭＦ (N,N-ジメチルホルムアミド、f.w. 73.09, d = 0.95)、 Ａｂｚ‐ＡＧＬＡ‐Ｎｂａ (2-アミノベンゾイル-L-アラニルグリシル-L-ロイシル-L-アラニノ-4-ニトロベンジルアミド（２‐Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｙｌ‐Ｌ‐ａｌａｎｙｌｇｌｙｃｙｌ‐Ｌ‐ｌｅｕｃｙｌ‐Ｌ‐ａｌａｎｉｎｏ‐４‐ ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌａｍｉｄｅ）、f.w. 583.65、Ｂａｃｈｅｍ 番号Ｈ‐６６７５、ＶＷＲ カタログ番号１０００４０‐５９８); ＳＢＧ１％ (「グルコース含有スーパーブロス」、６gソイトン[ディフコ], ３ｇ 酵母抽出物, ６ｇ ＮａＣｌ, ６g グルコース); ｐＨをＮａＯＨ で７．１に調整後周知の方法で滅菌、ｗ／ｖ (重量／体積)、ｖ／ｖ (体積／体積)、Ｎｐｒ及びｎｐｒ (中性メタロプロテアーゼ)、ＳＥＱＵＥＳＴ（商標）(ＳＥＱＵＥＳＴデータベースサーチプログラム、ワシントン大学)、Ｎｐｒ及びｎｐｒ (中性メタロプロテアーゼ遺伝子)、ｎｐｒＥ 及びＮｐｒＥ (バシルス アミロリケファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）中性メタロプロテアーゼ)、ＰＭＮ (精製ＭＵＬＴＩＦＥＣＴ（商標）メタロプロテアーゼ)、ＭＳ (マススペクトロスコピー)、ＳＲＩ (汚れ除去指標（Ｓｔａｉｎ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｉｎｄｅｘ）)及びＢＭＩ (血液 牛乳 インク)
さらに、材料は次の機関から得た。
TIGR (ゲノム研究所（Institute for Genomic Research）、ロックビル, MD); AATCC (アメリカン アソシエーション オブ テキスタイル アンド カラリング ケミスト（American Association of Textile and Coloring Chemists）)、アマシャム（Amersham） (アマシャム ライフ サイエンス インク（Amersham Life Science, Inc.）アーリントン ハイツ、 IL); こーニング（Corning） (コーニング インターナショナル（Corning International）、コーニング、NY); ICN (アイシーエヌ ファルマシューティカル インク（ICN Pharmaceuticals, Inc.）、コスタ メサ、CA)、ピアス（Pierce） (ピアス バイオテクノロジー（Pierce Biotechnology）、ロックフォールド、IL)、イークエスト（Equest） (イークエスト（Equest）、ウォーリック インターナショナル グループ インク（Warwick International Group, Inc.）、フリントシャー、UK)、 EMPA (Eidgenossische Material Prufungs und Versuch Anstalt, St. Gallen, Switzerland); CFT (センター フォー テスト マテリアル（Center for Test Materials）、フラールディンゲン、オランダ)、アミコン（Amicon） (アミコン インク（Amicon, Inc.）、ベバリー、MA); ATCC(アメリカン タイプ カルチャー コレクション（American Type Culture Collection）、マナサス、VA); ベクトン ディッキンソン（Becton Dickinson） (ベクトン ディッキンソン ラボウェア（Becton Dickinson Labware）、リンカーン パーク、NJ); パーキン‐エルマー（Perkin-Elmer） (パーキン‐エルマー（Perkin-Elmer）、, ウェルズリー、MA)、レイニン（Rainin） (レイニン インストルメント（Rainin Instrument, LLC）、ウォバーン、MA)、エッペンドルフ（Eppendorf） (エッペンドルフ エージー（Eppendorf A）、ハンブルグ、ドイツ)、ウォーターズ（Waters） (ウォーターズ インク（Waters, Inc.）、ミルフォード、MA)、ジーンアート（Geneart） (ジーンアート（Geneart GmbH）、, レーゲンスブルグ、ドイツ)、パースペクティブ バイオシステムズ（Perseptive Biosystems） (パースペクティブ バイオシステムズ（Perseptive Biosystems）、ラムジー、MN)、モレクキュラー プローブス（Molecular Probes） (モレクキュラー プローブス（Molecular Probes）、ユージーン, OR); バイオラッド（BioRad） (バイオラッド（BioRad）、リッチモンド、 CA); クロンテック（Clontech） (クロンテック ラボラトリーズ（CLONTECH Laboratories） パロ アルト、 CA)、 カーギル（Cargill） (カーギル インク（Cargill, Inc.）、ミネアポリス、 MN)、ディフコ（Difco） (ディフコ ラボラトリーズ（Difco Laboratories）、デトロイト、 MI)、ギブコ ビーアールエル（GIBCO BRL）又は ギブコ ビーアールエル （Gibco BRL） (ライフ テクノロジーズ インク、（Life Technologies, Inc.）、ゲイサーズバーグ、 MD)、ニューブランスウィック（New Brunswick） (ニューブランスウィック サイエンティフィック カンパニー インク（New Brunswick Scientific Company, Inc.）、 エジソン、 NJ); サーモエレクトロン（Thermoelectron） (サーモエレクトロン コープ（Thermoelectron Corp.）、 ウォルサム、 MA)、ビーエムジー （BMG） (ビーエムジーラボテック 社（BMG Labtech, GmbH）、 オッフェンブルグ、 ドイツ)、グライナー（Greiner） (グライナー バイオ‐ワン（Greiner Bio-One）、 クレムスミュンスター、オーストリア)、ノバゲン （Novagen） (ノバゲン インク（Novagen, Inc.）、マジソン、 WI)、ノーベックス（Novex）(ノーベックス（Novex）、サンディエゴ、CA)、; フィンザイム（Finnzymes） (フィンザイム（Finnzymes）、 OY、フィンランド)、キアゲン（Qiagen） (キアゲン インク（Qiagen, Inc.）、バレンシア、 CA)、インビトロジェン（Invitrogen） (インビトロジェン コープ（Invitrogen Corp.）、カールズバッド、 CA)、シグマ（Sigma） (シグマ ケミカル 社（Sigma Chemical Co.）、セントルイス、 MO)、デュポン インストルメンツ（DuPont Instruments） (アシュビル、 NY)、グローバル メディカル インストルメンテーション（Global Medical Instrumentation）又は ジーエムアイ（GMI） (グローバル メディカル インストルメンテーション（Global Medical Instrumentation）、ローズマリー、 MN)、エムジェー リサーチ（MJ Research） (エムジェー リサーチ（MJ Research）、 ウォルサム、 MA)、インフォーズ（Infors） (インフォーズ エイジー（Infors AＧ）、 Bottmingen、スイス)、ストラタジーン（Stratagene） (ストラタジーン クローニング システムズ（Stratagene Cloning Systems）、ラ ホーラ、 CA)、ロシュ（Roche） (ホフマン ラ ロシュ インク（Hoffmann La Roche, Inc.）、 ナットレー、 NJ)、アジレント（Agilent） (アジレント テクノロジーズ（Agilent Technologies）、パロ アルト、 CA)、メルク（Merck） (メルク アンド シーオー（Merck & Co.）、 ローウェー、 NJ)、イオン ビーム アナリシス ラボラトリー（Ion Beam Analysis Laboratory） (イオン ビーム アナリシス ラボラトリー（Ion Bean Analysis Laboratory）、 ユニバーシティー オブ サリー イオン ビーム センター（The University of Surrey Ion Beam Centre） (ギルフォード、 UK)、ティーオーエム（TOM） (Terg-o-Meter)、ビーエムアイ（BMI） (血液、牛乳、インク)、バッケム（BaChem） (バッケム エージー（BaChem AG）、 Bubendorf, スイス)、モレキュラー デバイシズ（Molecular Devices） (モレキュラー デバイシズ インク（Molecular Devices, Inc.）、 サニーベール、 CA)、コーニング（Corning） (コーニング インターナショナル（Corning International）、コーニング、 NY)、マイクロカル（MicroCal） (マイクロカル インク（Microcal, Inc.） ノースハンプトン、 MA)、ケミカル コンピューティング（Chemical Computing） (ケミカル コンピューティング コープ（Chemical Computing Corp.）、モントリール、 Canada)、エヌシービーアイ（NCBI） (ナショナル センター フォー バイオテクノロジー インフォメーション（National Center for Biotechnology Information）)、ベックマン（Beckman） (ベックマン‐コールター（Beckman-Coulter）、フラートン、CA)、サイツシェンク（SeitzSchenk） (SeitzSchenk Filtersystems GmbH, バートクトイツナハ, ドイツ); ポール（Pall） (ポール コープ（Pall Corp.）、イーストヒルズ、 NY)、及びマルバーン インストルメンツ（Malvern Instruments） (マルバーン インストルメンツ インク（Malvern Instruments, Inc.）、 ウースターシャー、 UK)
実施例１
アッセイ
次のアッセイは下記に記載する実施例に用いた。下記に提供する手順からの任意の偏差は実施例に示される。本実施例にて、反応の完了後生成産物の吸光度を測定するために分光光度計を用いた。
Ａ．タンパク質含有量決定
ＢＣＡ（ビシンコニン酸）アッセイ
これらのアッセイにおいて、ＢＣＡ（ピアス）アッセイをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）スケールでプロテアーゼサンプルのタンパク質濃度を決定するために用いた。このアッセイ系において、化学及び試薬溶液は、ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬及びピアス希釈緩衝液(５０ ｍＭ ＭＥＳ, ｐＨ ６．５， ２ｍＭ ＣａＣｌ２, ０．００５％ ＴＷＥＥＮ（商標）-80). 装置をＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ (３４０タイプ; Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ) ＭＴＰリーダーを用いた。ＭＴＰはコースターから得た(９０１７タイプ)。
試験おいて、２００μｌＢＣＡ試薬を各ウェルへピペットにて入れ、続いて２０μｌ希釈タンパク質を入れた。混合後、ＭＴＰを３７℃にて３０分間インキュベーションした。気泡を除き、ウェル内の溶液の吸光度（ＯＤ）を５６２ｎｍで測定した。タンパク質濃度を決定するために、バックグラウンド値をサンプル値から差し引いた。標準曲線を作成するためにＯＤ５６２測定値をタンパク質標準（精製プロテアーゼ）に対してプロットした。サンプルのタンパク質濃度を標準曲線から内挿した。
ブラッドフォードアッセイ
これらのアッセイにおいて、ブラッドフォード染色試薬（クイック スタート）アッセイをＭＴＰスケールでプロテアーゼサンプルのタンパク質濃度を決定するために用いた。このアッセイ系において、化学及び試薬溶液は、クイック スタートブラッドフォード染色試薬(ＢＩＯ‐ＲＡＤカタログ番号５００‐０２０５)、希釈緩衝液 (１０ｍＭ ＮａＣｌ， ０.１ｍＭ ＣａＣ１2, ０．００５％ＴＷＥＥＮ（商標）‐８０ ). 装置はＢｉｏｍｅｋ ＦＸ Ｒｏｂｏｔ (Ｂｅｃｋｍａｎ) 及びＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ (３４０タイプ) ＭＴＰリーダーを用いた。ＭＴＰはコースターから得た(９０１７タイプ)。
試験おいて、２００μｌブラッドフォード染色試薬を各ウェルへピペットにて入れ、続いて１５μｌ希釈緩衝液を入れた。最終的に１０μｌのフィルターろ過培養培地をウェルに添加した。混合後、ＭＴＰｓを室温にて１０分間インキュベーションした。気泡を除き、ウェル内の溶液の吸光度（ＯＤ）を５９５ｎｍで測定した。タンパク質濃度を決定するために、バックグラウンド値（つまり、インキュベーションしていないウェルから）をサンプル値から差し引いた。得られたＯＤ５９５測定値はサンプルのタンパク質含有量の相対的測定値を有する。
B．酵素性能アッセイ
このアッセイにて用いる洗剤は酵素本明細書にて記載のように熱不活化を通して分解された酵素又は市販洗剤中に存在する酵素を含まなかった。装置はエッペンドルフ サーモミキサー及びＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ (３４０タイプ) ＭＴＰリーダーを用いた。ＭＴＰsはコースターから得た(９０１７タイプ)。
洗剤調製（ＡＡＴＣＣ ＨＤＬ; ＵＳ条件）
ミリキュウ（Ｍｉｌｌｉ‐Ｑ）水は６ ｇｐｇ水硬度(Ｃａ／Ｍｇ＝３／１)、及び１．５ｇ／ｌの漂白剤を含まない ＡＡＴＣＣ ２００３標準参照液体洗剤を加えた。洗剤液を少なくとも１５分間激しく攪拌した。それらから５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ (酸非含有) を加え、ｐＨ８．０に調整した。
ＢＭＩ微小布見本（Ｍｉｃｒｏｓｗａｔｃｈ）アッセイ
円の直径０．２５インチである血液、牛乳及びインク（ＢＭＩ）を含む微小布見本をＣＦＴ Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎから入手した。布見本の切断の前に、布地(ＥＭＰＡ １１６)を水で洗浄した。表面全体を暴露するためにひとつの微小布見本を９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに垂直になるように置いた（つまりウェルの穴の底に平に置いたのではない）。所望の洗剤液を本明細書に記載のように調製した。２５℃にサーモミキサーを平衡化後、１９０μｌの洗剤液を微小布見本を含むマイクロタイタープレートの各ウェルへ添加した。この液に１０μｌの希釈酵素溶液を加え、最終酵素濃度が１μｇ／ｍｌ（ＢＣＡアッセイにて検出）となった。マイクロタイタープレートをテープで蓋をし、３０分間１４００ｒｐｍで攪拌しながらインキュベーターに置いた。適切な条件下インキュベーションに続いて、各ウェルから１００μｌの溶液を新しいＭＴＰへ移した。各ウェルに１００μｌの溶液を含む新しいＭＴＰをＭＴＰＳｐｅｃｔｒａＭａｘリーダーを用いて４０５ｎｍで測定した。ブランクコントロール及び二つの微小布見本及び洗剤含有しかし酵素を含んでいないコントロールも含んだ。
ベイクドエッグ微小布見本アッセイ
９６穴ベイクドエッグヨーク基質プレートをニワトリ卵黄から調製した。ニワトリ卵黄を卵白から分離し、卵黄膜を除き、ミリキュウ水で２０％（体積／重量）希釈した。希釈した卵黄をマグネティックスターラーを用いて室温で１５分間攪拌した。８チャンネルピペットを用いて、５μｌを注意深く９６穴V底型プレート（コースター３８９４番）の各ウェルの中央へ加えた。プレートを９０℃にて１時間焼き、室温にて冷却した。ベイクドエッグヨーク基質プレートを室温に保存し、調製の１週間内で使用した。全自動用食器洗剤を本明細書に記載のように調製し、５０℃に予熱した。１９０μｌの洗剤液を８チャンネルピペット装置を用いて各ウェルに添加した。１０μｌの希釈酵素を９６チャンネルピペットを用いて９６穴プレートの各ウェルに添加した。プレートを注意深く吸着ホイルシールで蓋をし、３０分間攪拌しながら５０℃でインキュベーションした。１２０μｌの反応混合物を新しい９６穴ウェル平底プレートへ移し、吸光度／光散乱を４０５ｎｍで測定した。４０５ｎｍでの吸光度／光散乱は卵黄除去に比例する。
卵黄微小布見本アッセイ
全自動用食器洗剤を本明細書に記載のように調製した。用いた装置はＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｉｎｎｏｖａ ４２３０シェーカー／インキュベーター及びＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ (３４０タイプ) ＭＴＰリーダーである。ＭＴＰはコースター社から得た(９０１７タイプ)。染料含有熟成卵黄見本(ＣＳ‐３８)をＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ(Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ)から入手した。 微小布見本を０．２５インチの円に切断する前に布地を水で洗浄した。ひとつの微小布見本を９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに置いた。試験洗剤を５０℃に平衡化した。１９０μｌの洗剤液を微小布見本を含むマイクロタイタープレートの各ウェルへ添加した。この液に１０μｌの希釈酵素溶液を加えた。マイクロタイタープレートを粘着ホイルで蓋をし、３０分間攪拌しながらインキュベーターに置いた。インキュベーションに続いて、各ウェルから１００μｌの溶液を新しいマイクロタイタープレートへ移した。マイクロタイタープレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロタイタープレートリーダーを用いて４０５ｎｍで測定した。ブランクコントロール及び微小布見本及び洗剤を含有するが酵素を含んでいないコントロールも含んだ。
コメデンプン微小布見本アッセイ
コメデンプンアッセイはアミラーゼ性能試験である。洗剤を本明細書に記載のように調製した。用いた装置はＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｉｎｎｏｖａ ４２３０シェーカー／インキュベーター及びＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ (３４０タイプ) ＭＴＰリーダーである。ＭＴＰはコースター社から得た(３６４１タイプ)。オレンジ染料含有熟成卵黄見本(ＣＳ‐２８)をＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ (Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ)から入手した。 微小布見本を０．２５インチの円に切断する前に布地を水で洗浄した。二つの微小布見本を９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに置いた。試験洗剤を２０℃（北アメリカ）又は４０℃（西ヨーロッパ）に平衡化した。１９０μｌの洗剤液を微小布見本を含むマイクロタイタープレートの各ウェルへ添加した。この液に１０μｌの希釈酵素溶液を加えた。マイクロタイタープレートを粘着ホイルで蓋をし、一時間７５０ｒｐｍで攪拌しながら所望の試験温度（一般的に２０℃又は４０℃）でインキュベーターに置いた。インキュベーションに続いて、各ウェルから１５０μｌの溶液を新しいマイクロタイタープレートへ移した。このマイクロタイタープレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロタイタープレートリーダーを用いて４８８ｎｍで測定し、洗浄を定量した。ブランクコントロール及び微小布見本及び洗剤を含有するが酵素を含んでいないコントロールも含んだ。
酵素性能の計算
得られた吸光度の値をブランク値（つまり、酵素非存在下で微小布見本のインキュベーション後得られた値）で修正した。得られた吸光度を加水分解活性として測定した。
C．プロテアーゼ活性試験用ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ加水分解アッセイ
このアッセイ系において、用いた試薬溶液は、
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ, ｐＨ ８．６， ０．００５％ ＴＷＥＥＮ（商標）‐８０ (Ｔｒｉｓ)
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ, ｐＨ ８．６， １０ｍＭ ＣａＣｌ2及び
０．００５％ ＴＷＥＥＮ（商標）‐ ８０ (Ｔｒｉｓ／Ｃａ)及び
ＤＭＳＯ (ｓｕｃ‐ＡＡＰＦ‐ｐＮＡ保存溶液) (Ｓｉｇｍａ： Ｓ‐７３８８)中１６０ｍＭ ｓｕｃ‐ＡＡＰＦ‐ｐＮＡであった。
ｓｕｃ‐ＡＡＰＦ‐ｐＮＡワーキング溶液の調製するために、１ｍｌ ＡＡＰＦストックを１００ ｍｌ Ｔｒｉｓ／Ｃａ緩衝液に加え、少なくとも１０秒間良く混合した。 アッセイを１０μｌの希釈酵素溶液を各ウェルに加えて実施し、続いてすぐに１９０μｌのＡＡＰＦワーキング溶液を添加した。溶液を５秒間混合し、２５℃でＭＴＰリーダーにて４１０ｎｍで測定した。
D.プロテアーゼ活性試験用ジメチルカゼイン加水分解アッセイ
このアッセイ系において、用いた化学及び試薬溶液は、
ジメチルカゼイン (ＤＭＣ): Ｓｉｇｍａ Ｃ‐９８０１
ＴＷＥＥＮ（商標）‐８０：Ｓｉｇｍａ Ｐ‐８０７４
ＰＩＰＥＳ緩衝液(酸無添加): Ｓｉｇｍａ Ｐ‐１８５１であり、
１５．１ｇを９６０ｍｌの水に溶解し、４Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨを７．０に調整し、１ｍｌの５％ＴＷＥＥＮ（商標）‐８０を加え体積を１０００ｍｌとする。ＰＩＰＥＳ及びＴＷＥＥＮ（商標）‐８０の最終濃度はそれぞれ５０ ｍＭ及び０．００５％である。
ピクリルスルホン酸 (ＴＮＢＳ)： Ｓｉｇｍａ Ｐ‐２２９７ (５％水溶液)、
試薬 Ａ： ４５．４ｇの Ｎａ2Ｂ4Ｏ7１０Ｈ2Ｏ (Ｍｅｒｃｋ ６３０８)及び１５ｍｌの４Ｎ ＮａＯＨを一緒に溶解し、最終体積を１０００ｍｌ (必要に応じて温める)、及び
試薬Ｂ: ３５．２ｇ のＮａＨ2ＰＯ4１Ｈ2Ｏ (Ｍｅｒｃｋ ６３４６)及び０．６ｇのNa2SO3(Ｍｅｒｃｋ ６６５７) を一緒に溶解し最終体積を１０００ｍｌとする。
基質の調製のために、４ｇ ＤＭＣを４００ｍｌ ＰＩＰＥＳ緩衝液に溶解した。ろ過済み培養上清をＰＩＰＥＳ緩衝液で希釈した。培養プレート中コントロールの最終濃度は２０ｐｐｍであった。それから、１０μｌの各希釈上清をＭＴＰのウェル中の２００μｌの基質に加えた。ＭＴＰプレートをテープで蓋をし、数秒振盪し、攪拌せずに２時間３７℃でオーブンの中に置いた。約１５分後ＴＮＢＳ試薬を５０ｍｌの試薬Ａ当たり１ｍｌ ＴＮＢＳ溶液を混合することにより調製し、その後オーブンから第一プレートを取り出す。ＭＴＰをウェルごとに６０μｌのＴＮＢＳ試薬Ａで満たした。インキュベーションしたプレートを数秒振盪し、その後、その１０μｌをＴＮＢＳ試薬Ａで満たしたＭＴＰへ移した。プレートをテープで蓋をして２０分間ベンチシェーカー(ＢＭＧ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｒ)で室温及び５００ｒｐｍにて振盪した。最終的に、２００μｌ試薬Ｂをウェルに加え、シェーカーで１分間混合し、４０５ｎｍの吸光度をＭＴＰリーダーを用いて測定した。
得られた吸光度の値をブランク値（酵素の無い基質）で修正した。得られた吸光度を加水分解活性として測定した。サンプルの（任意）特異的活性を吸光度及び決定したタンパク質濃度を割ることで計算した。
Ｅ．抗体滴定によるアミラーゼ濃度決定
本明細書に記載のように、アルファ‐アミラーゼ濃度及び特異的活性を阻害性ポリクローナル抗体で滴定により決定した。バシルス ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ（ＡｍｙＳ）に対するポリクローナル抗体はＡｍｙＳ及びバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＴＳ２３由来アルファ‐アミラーゼを強く阻害（例えば、結合がとてもきついので活性消失の直線滴定を作成する）することがわかった。従って、この抗体を酵素濃度測定に用いることができ、同様に特異的活性を計算するために用いる。手短に言うと、いくつかの既知濃度の抗体により生じる酵素阻害量を測定する。この情報から完全に阻害するのに必要な抗体の濃度を推定でき、サンプル中の酵素量と等量になる。アルファ‐アミラーゼ活性及び阻害を蛍光性ＢＯＤＩＰＹ‐デンプンアッセイを用いて測定した。緩衝液は０．００５％ Ｔｗｅｅｎ‐８０含有５０ｍＭ ＭＯＰＳ, ｐＨ ７．０であった。
精製ＡｍｙＳに対するポリクローナル抗体をウサギで上昇させ標準法により精製した。抗体保存液の実験による「あきらかな濃度」値を既知の特異的活性のＡｍｙＳサンプルの阻害を測定することにより決定した。それから、抗体サンプルをＡｍｙＳ及びＴＳ２３ｔ変異体の濃度及び特異的活性を決定するために用いた。これらの値を通常９６穴酵素保存プレートを創製するために用い、すべての変異体を共通濃度に希釈した。
Ｆ．エグリンＣ（Ｅｇｌｉｎ Ｃ）阻害によるプロテアーゼ濃度決定
本明細書にて記載のように、スブチリシン及びＡＳＰプロテアーゼ濃度及び特異的活性はエグリンＣを用いて滴定することにより決定した。ヒルのヒルド メディシナリス（Ｈｉｒｕｄｏ ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）由来のエグリンＣは スブチリシン及びＡＳＰプロテアーゼに強く結合するタンパク質阻害剤である。 (Heinz 他、Biochemistry, 31(37): 8755-66 [1992])。従って、エグリンＣを酵素濃度測定に用いることができ、同様に、特異的酵素活性を計算することができる。簡潔に言えば、いくつかの既知濃度エグリンＣを用いて生産される酵素阻害の量を測定する。この情報から完全な阻害に必要とされるエグリンＣの濃度を算出する。これはサンプルにおける酵素濃度と同等である。
プロテアーゼ活性を上記に記載の発色するｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイを用いて測定した。エグリンＣの遺伝子を合成し、標準的な方法で大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）より発現した。その性質及び阻害能力はシグマ（Ｓｉｇｍａ）社から購入のエグリンＣと同様であった。エグリンＣ保存溶液の濃度を既知の特異的活性を有するバシルス レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）スブチリシンのサンプルの阻害を測定することにより決定した。それからエグリンＣのサンプル検量線をスブチリシン及びＡＳＰ変異体の濃度及び特異的活性を決定するために用いた。これらの値を規格化９６穴酵素保存プレートを創製するために用い、すべての変異体を共通の濃度に希釈した。
Ｇ．ネイティブプロテインゲル電気泳動
変異体タンパク質サンプルの電気泳動の移動を７．５％又は１２．５％濃度いずれかで、プレキャストネイティブポリアクリルアミドゲル（ｐｒｅ‐ｃａｓｔ ｎａｔｉｖｅ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ）(ＰｈａｓｔＧｅｌ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ)にてＰｈａｓｔＧｅｌシステム(ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)を用いて測定した。ストリップ緩衝液(ＰｈａｓｔＧｅｌ Ｎａｔｉｖｅ)を０．８８ＭのＬ‐アラニン含有０．２５Ｍ ＴｒｉｓｐＨ８．８からなる緩衝液を用いた。一般的な泳動条件は陽極から陰極の距離が３．７ｃｍで１２．７５分４００Ｖであった。
あるいは、変異体タンパク質サンプルの電気泳動の移動を適切な緩衝系の選択を通して多様なｐＨ値（つまり、５．８、８．０及び１０．０）にて１ｍｍの薄い０．５から１．５％のアガロースゲル上で測定した。電気泳動を非変性条件下実施した。陽極から陰極の長さは１３．９ｃｍであった。１から２μｇのタンパク質サンプルを５％グリセロール＋０．０５％ブロモフェノールブルーに混合し、各レーンに注入した。電気泳動を一般的に１時間１００Ｖで行った。
いずれの場合でも、ゲルを１０％酢酸に溶解したＬｏｕｉｓｅｖｉｌｌｅブルー染料で染色し、１０％メタノール及び１０％酢酸を含む水で脱色した。用いるネイティブゲルシステム次第で同時に１２から２０のタンパク質変異体を注入することができる。結果として、タンパク質変異体の電気泳動による移動は同じゲル上に荷電ラダー標準サンプルと比較してすぐに評価できる。
Ｈ．洗剤熱不活性化
市販洗剤製剤の熱不活性化は非酵素的成分の性質を維持しながら行なう任意のタンパク質成分の酵素的活性の分解に役立つ。つまり、この方法は本発明の酵素変異体を試験時に使用する商業的に購入する洗剤の調製に有用であった。北アメリカ（ＮＡ）及び西ヨーロッパ（ＷＥ）の強力液体洗濯（ＨＤＬ）洗剤については、重量を量る前、液体洗剤（ガラスボトル中）を９５℃２時間水浴に置くことにより熱不活性化を行った。北アメリカ（ＮＡ）及び日本（ＪＰＮ）の強力顆粒洗濯（ＨＤＧ）洗剤の熱不活性化のインキュベーション時間は８時間及び西ヨーロッパ（ＷＥ）のＨＤＧ洗剤は５時間であった。ＮＡ及びＷＥ自動食器洗浄（ＡＤＷ）洗剤の熱不活性化のインキュベーション時間は８時間であった。洗剤を地方のスーパーマーケットから購入した。熱未処理及び熱処理洗剤両方は不活性化パーセントを正確に決定するために洗剤を溶かして５分以内にアッセイを実施した。酵素活性はｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイを用いて試験した。
熱不活性化洗剤における酵素活性の試験のために、洗剤のワーキング溶液を熱不活性化ストックから作製した。適切な水硬度（６ｇｐｇ又は１２ｇｐｇ）の量及び緩衝液を所望の条件（表１−１）に適合するように洗剤溶液に添加した。溶液をボルテックス又はボトルを逆さにして混合した。
Figure 2010528656
Ｉ．アミラーゼ活性の決定のためのＢｏｄｉｐｙ‐デンプンアッセイ
Ｂｏｄｉｐｙ-デンプンアッセイをＥｎｚＣｈｅｋ（商標）ウルトラアミラーゼアッセイキット(Ｅ３３６５１， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を用いて実施した。１ｍｇ／ｍＬのＤＱデンプン基質の保存溶液を１００μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ ４．０緩衝液に凍結乾燥された基質を含むバイアルの内容物を溶解することにより調製した。バイアルを約２０秒間ボルテックスで混合し、溶解されるまで室温、暗所、時折混合しながら放置した。９００μＬのアッセイ緩衝液(２．６ｍＭ ＣａＣｌ2含有５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．８) を添加し、バイアルを約２０秒間ボルテックスにて混合した。用いるまで基質溶液を室温又は４℃、暗所、で保存した。アッセイのために、１００μｇ／ｍＬのＤＱ基質のワーキング溶液をアッセイ緩衝液中１ｍｇ／ｍＬの基質溶液から調製した。１９０μＬの１００μｇ／ｍＬ基質溶液を９６穴平底マイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。１０μＬの酵素サンプルをウェルに添加し、８００ｒｐｍにてサーモミキサーを用いて３０秒間混合した。緩衝液及び基質のみ（酵素含まず）を含むブランクサンプルをアッセイに含んだ。蛍光強度の変化速度を２５℃、５分間にて蛍光マイクロタイタープレートリーダーで測定した（励起：４８５ｎｍ、発光：５２０ｎｍ）。
Ｊ．アミラーゼ活性の決定のためのトウモロコシ粉加水分解
酵素活性のためのトウモロコシ粉基質のデンプン加水分解。有機トウモロコシ粉(Ａｚｕｒｅ Ｆａｒｍｓ、ロット番号 ０３２２７)を固体分配装置(Ｖ＆Ｐ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)を用いてグレイナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）９６ウェルマイクロプレート、ポリプロピレン、黒、平底、チムニーウェル(カタログ番号６５５２０９)に均一に広げた。８５μＬの２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ ５．６を各ウェルに添加し、混合した。ホイルシールをプレートの上に適用し、プレートを２０分から３０分サーモミキサーを用いて７０℃でプレインキュベーションした。酵素サンプルをアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）ポリプロピレンプレート(５０４２‐１３８５)中２０ｍＭ酢酸ナトリウムで希釈した。１１μＬの希釈酵素サンプルを基質プレートに添加し、プレートを別のホイルで硬く蓋をした。それからプレートを金属ブロックを伴うＬａｂｎｅｔ ＶｏｒＴｅｍｐ ５６インキュベーター／シェーカー(カタログ番号Ｓ２０５６Ａ)へ移し、９５℃まで予熱し、攪拌速度を５００ｒｐｍに設定した。インキュベーションを３０分続けた。インキュベーション後、プレートをアイスバケットにて迅速に冷却し、デンプン加水分解反応を各ウェルに１００μＬの０．１Ｎ H2SO4を添加することにより停止した。プレートを簡単に混合し、デンプン加水分解反応生産物をＰＡＨＢＡＨアッセイ又はＨＰＬＣいずれかで分析した。
トウモロコシ粉基質の酵素加水分解由来可溶性糖濃度の着色検出。８０μＬの０．５Ｎ ＮａＯＨを空のＰＣＲプレートのすべてのウェルに添加し、続いて２０μＬのＰＡＨＢＡＨ試薬(５％ ｗｔ％／ｖ ｐ‐ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（ＰＡＨＢＡＨ， Ｓｉｇｍａ番号Ｈ９８８２， ０．５Ｎ ＨＣｌに溶解)を添加し、混合した(ＰＡＨＢＡＨ反応プレート)。１０μＬのデンプン加水分解反応上清をＰＡＨＢＡＨ反応プレートに添加した。すべてのプレートに蓋をして、２分間９５℃及びそれから２０℃に冷却というプログラムをしたサーモサイクラー(ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｔｒａｄ)に置いた。サンプルの８０μＬの処理済みＰＡＨＢＡＨ反応混合物を読み取り用プレートへ移し分光光度計で４０５ｎｍにて吸光度を測定した。
トウモロコシ粉基質の酵素加水分解由来可溶性糖濃度のＨＰＬＣ検出。Ｓｉｇｍａ(Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ)から入手した可溶性糖標準物(ＤＰ１‐ＤＰ７)をミリＱ水で１００ ｍｇ／ｍＬにすべて希釈し、ピーク面積を実際の糖濃度へ変換するために用いた。デンプン加水分解アッセイから急冷プレートを２５℃、３０００ｒｐｍ、５分間Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ ６Ｒ遠心機で回転した。回転処理プレートから上清をピペットで採取し、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ‐ＨＶフィルタープレート(カタログ番号ＭＡＨＶＮ４５５０)へ移した。フィルタープレートをＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣプレートを通して２５℃、６０００ｒｐｍ、１０分間Ｈｅｔｔｉｃｈ Ｒｏｔａｎｔａ遠心機で回転した。５０μＬの０．０１Ｎ硫酸移動層(０．１Ｎ硫酸をミリＱ水で１０倍希釈) を別のきれいなＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣプレートの各ウェルに移した。フィルタープレートを少し混合し、５０μＬのろ過物を移動層がウェルあたり５０μＬ有するプレートにおける対応するウェルへ移した。希釈糖標準物をプレートの空のウェルへ添加し、検量線を含んだ。内容物をプラットフォームシェーカー上軽く混合し、プレートをＮａｌｇｅｎｅ Ｐｒｅ‐ｓｌｉｔウェルキャップで蓋をした。ＨＰＬＣカラム(Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ‐８７Ｈカラム カタログ番号１２５−０１４０) を前もって０．６ｍＬ／分の一定流速にて２Ｌの移動層を用いて調製した。プレート中のすべてのサンプルを２０μＬの注入量で流出し、検出器としてＡＭＩＮＥＸＨ．Ｍ及びＲＩＤ(屈折率)を用いて分析した。 流出が完了後ＨＰＬＣの流速を０．０５ｍＬ/分に下げた。
Ｋ．アミラーゼによるデンプン粘度低下の決定
このアッセイにおいて、トウモロコシ粉基質溶液の粘度低下を粘度計で測定した。トウモロコシデンプン基質スラリーを蒸留水中３０％のトウモロコシ粉乾燥固体を有するバッチモードで新鮮な状態で作成し、硫酸を用いてｐＨ５．８に調整した。各流出において、５０グラムのスラリー（１５グラム乾燥固体）を秤量し７０℃に温まるまで１０分間予めインキュベーションした。アミラーゼ添加の時、７５ｒｐｍの攪拌を伴いながら温度をすぐに７０℃から８５℃まで急速にあげた。いったんスラリー及びアミラーゼ混合物の温度が８５℃に到達すれば、温度を一定に保ち粘度をさらに３０分間モニターした。
Ｌ．高分子基質へ酵素結合の測定
結合アッセイを酵素の基質結合を決定して行った。それは、
プロテアーゼ（ＡＳＰ）電荷ラダー変異体（電荷変化＝野生型ＡＳＰと比較して−５から＋３）のリグニン及びセルロースへの結合、及び
アミラーゼ（ＡｍｙＳ）電荷ラダー変異体（電荷変化＝野生型ＡｍｙＳと比較して−１２から＋１２）のトウモロコシ茎葉及びバガスへの結合
である。用いた基質は次を含む。すなわち、
リグニン（バガスの完全糖化から回収）、８７．５％液体、バガス（ブラジルからサトウキビバガス、希酸、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより前処理、洗浄及びｐＨ５で緩衝化）、ＰＡＳＣ (リン酸膨張セルロース：純粋、非結晶セルロース、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５で希釈)、ＡＦＥＸ(アンモニア繊維膨張トウモロコシ茎葉)及びＰＣＳ (希硫酸前処理トウモロコシ茎葉、洗浄及びｐＨ５．０へ調整)である。すべての基質を使用前に所望のパーセントの固体へ調製した。
プロテアーゼ結合
ＡＳＰプロテアーゼ電荷ラダー変異体（電荷変化＝野生型ＡＳＰと比較して−５から＋３）を精製し、０．５ｍｇ／ｍｌから１．５ｍｇ／ｍｌへ希釈した。約２．４％リグニン、０．５％ＰＡＳＣ，及び１％バガス溶液をホウ酸緩衝液(４０ｍＭ， ｐＨ８．５， ０．０１６％ Ｔｗｅｅｎ２０)中に調製した。各２００μｌを９６穴フィルタープレートをへ加えた。コントロールウェルに緩衝液を入れた。１０μｌの０．２７６ｇ／ｍｌ Ｔｗｅｅｎ‐２０を各ウェルへ添加し、Ｔｗｅｅｎ‐２０の最終濃度が１．３８％となった。コントロールウェルへ１０μｌの水を入れた。リグニン及びバガス結合アッセイのために、ＡＳＰ電荷ラダー変異体を２００ｐｐｍへ希釈し１０μｌの希釈酵素を各ウェルへ添加した。ＰＡＳＣ結合アッセイのために、ＡＳＰ電荷ラダー変異体を４０ｐｐｍへ希釈し１０μｌの希釈酵素を各ウェルへ添加した。酵素の添加後、各ウェルをピペットチップを用いて混合した。プレートに蓋をし、室温にて振盪しながらインキュベーションした。インキュベーションの１時間後、ろ過物を９６ウェルプレートに集めた。ろ過物を１：２０に希釈後、ろ過物中の酵素活性をｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイを用いて測定した。タンパク質結合のパーセントは基質を伴うインキュベーションサンプルのろ過物対コントロールウェルのろ過物との比として計算した。
アミラーゼ結合
アミラーゼ電荷ラダー変異体を精製し、試験用に２００ｐｐｍに希釈した。１％セルロースバガス溶液をホウ酸緩衝液(４０ｍＭ，ｐＨ８．５，０．０１６％ Ｔｗｅｅｎ８０)中に調製した。１５０μｌのバガス溶液をマイクロタイターろ過プレートにおける各ウェルへ添加した。１５０μｌのホウ酸緩衝液をコントロールとして用いるように別のウェルのセットへ添加した。１０μｌのアミラーゼ電荷ラダー変異体をろ過プレートへ添加し、各条件は二度繰り返した。プレートを室温にて２時間インキュベーションした。ろ過物を回収し、上清のアミラーゼ活性をＢＯＤＩＰＹ‐デンプンアッセイにより測定した。
微小布見本へのプロテアーゼ結合
プロテアーゼ変異体を３０分間標準洗浄条件下ＢＭＩ微小布見本を伴い又は伴わずインキュベーションした。遊離酵素の量をｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイにより測定した。微小布見本へ結合した酵素フラクションを次のように計算した。それは
結合フラクション＝（布見本の非存在下酵素活性−布見本の存在下酵素活性）／（布見本の非存在下酵素活性）
微小布見本へのアルファ‐アミラーゼ結合
アミラーゼ変異体を３０分間標準洗浄条件下ＣＳ−２８コメデンプン微小布見本伴い又は伴わずインキュベーションした。遊離酵素の量をＢＯＤＩＰＹ‐デンプンアッセイにより測定した。微小布見本へ結合した酵素フラクションを次のように計算した。
結合フラクション＝（布見本の非存在下酵素活性−布見本の存在下酵素活性）／（布見本の非存在下酵素活性）
実施例２
バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるプロテアーゼ生産
この実施例において、バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における多様なプロテアーゼ生産するための実施した実験を記載する。特に、ＮｐｒＥ、ＡＳＰ、ＧＧ３６、及びＦＮＡ用発現ベクターを有するバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の形質転換に用いた方法を提供する。形質転換は周知の方法（WO 02/14490を参照願いたい）で実施した。
NprEプロテアーゼ生産
バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）へのプラスミドｐＵＢｎｐｒＥの形質転換に用いた方法を提供する。ＮｐｒＥ前駆体タンパク質をコードするＤＮＡ配列(バシルス アミロリケファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来ｎｐｒＥリーダー、ｎｐｒＥ ｐｒｏ及びｎｐｒＥ ｍａｔｕｒｅ ＤＮＡ配列)を下記に示す。
Figure 2010528656
Figure 2010528656
上記の配列において、太字は成熟ＮｐｒＥプロテアーゼをコードするＤＮＡを示し、標準フォントはリーダー配列（ｎｐｒＥリーダー）を示し、及び下線部はプロ配列（ｎｐｒＥ ｐｒｏ）を示す。下記に示すアミノ酸配列（ＮｐｒＥリーダー、ＮｐｒＥ ｐｒｏ及びＮｐｒＥ ｍａｔｕｒｅ ＤＮＡ配列）は完全長ＮｐｒＥ前駆体タンパク質に相当する。このＮｐｒＥ配列において、下線部はプロ配列を示し太字は成熟ＮｐｒＥプロテアーゼを示す。
Figure 2010528656
成熟ＮｐｒＥ配列を変異ライブラリーを作成するための基礎として用いた。
Figure 2010528656
Figure 2010528656
ｐＵＢｎｐｒＥ発現ベクターを二つのプライマ−
オリゴＡＢ１７４０：CTGCAGGAATTCAGATCTTAACATTTTTCCCCTATCATTTTTCCCG (SEQ ID NO :4)及び、
オリゴＡＢ１７４１：GGATCCAAGCTTCCCGGGAAAAGACATATATGATCATGGTGAAGCC (SEQ ID NO:5)
を用いてＰＣＲによりバシルス アミロリケファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）の染色体ＤＮＡ由来ｎｐｒＥを増幅することにより構築した。
ＰＣＲをＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメラーゼ(Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ)を用いてサーモサイクラー上で実施した。ＰＣＲ混合物は１０μｌの５ｘ緩衝液(Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｐｈｕｓｉｏｎ)、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ'ｓ、１．５μｌのＤＭＳＯ、１μｌ の各プライマー、１μｌのＦｉｎｎｚｙｍｅｓ ＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼ、１μｌの染色体ＤＮＡ溶液５０ｎｇ／μｌ、３４．５μｌのミリＱ水を含んだ。次のＰＣＲ手順を用いた。それは、
１）３０秒９８℃、
２）１０秒９８℃、
３）２０秒５５℃、
４）１分７２℃、
５）２から４の段階を２５サイクル、及び
６）５分７２℃
である。
これにより１．９ｋｂＤＮＡフラグメントを得て、それはＢｇｌＩＩ及びＢｃｌＩＤＮＡ制限酵素を用いて消化した。マルチコピーバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベクターｐＵＢ１１０(例えば、Gryczan, J Bacteriol, 134:318-329 [1978]を参照願いたい)をＢａｍＨＩで消化した。ｐＵＢｎｐｒＥ発現ベクターを形成するためにＰＣＲフラグメントx ＢｇｌＩＩx ＢｃｌＩをｐＵＢ１１０ｘＢａｍＨＩベクターにてライゲーションした。
ｐＵＢｎｐｒＥをバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）(ΔaprE,、ΔnprE、 oppA、 ΔspoIIE、 degUHy32、 ΔamyE: : (xylR、pxylA-comK)株へ形質転換した。バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）への形質転換を参照により本明細書に組み込まれるWO 02/14490記載のように行った。ｐＵＢｎｐｒＥベクターを含むバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）形質転換体の選択的増殖を２５ｍｌの２０ｍｇ／Ｌネオマイシン含有ＭＢＤ培地(ＭＯＰＳ基礎とした規定培地)を含む振盪フラスコで実施した。ＭＢＤ培地をＮＨ4Ｃｌ2、ＦｅＳＯ4、及びＣａＣｌ2を基本培地から除き、３ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4を用い、及び基礎培地に６０ｍＭ 尿素、７５ ｇ／Ｌグルコース、及び１％ソイトンを補完することを除いて周知（Neidhardt 他、J Bacteriol, 1 19: 736-747 [1974]を参照願いたい）のように実質的に作成した。また、微量栄養素を１リットルに次のものを含む１００倍ストックとして作成した。それは、４００ｍｇ ＦｅＳＯ4７Ｈ2Ｏ、１００ｍｇ ＭｎＳＯ4 Ｈ2Ｏ、１００ｍｇ ＺｎＳＯ4７Ｈ2Ｏ、５０ｍｇ ＣｕＣｌ2２Ｈ2Ｏ、１００ｍｇ ＣｏＣｌ2６Ｈ2Ｏ、１００ｍｇ ＮａＭｏＯ4２Ｈ2O、１００ｍｇ Ｎａ2Ｂ4Ｏ7１０Ｈ2Ｏ、１０ｍｌの１Ｍ ＣａＣｌ2及び１０ｍｌの０．５Ｍ クエン酸ナトリウムを培養培地をインキュベーター／シェーカーで３７℃にて３日間インキュベーションした(Ｉｎｆｏｒｓ)。この培地はプロテアーゼ活性による測定のようにタンパク質加水分解活性を伴う分泌されるＮｐｒＥプロテアーゼの生産を有する。ＮｕＰａｇｅ Ｎｏｖｅｘ １０％‐Ｂｉｓ‐Ｔｒｉｓゲル(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０３０１ＢＯＸ)を用いてゲル分析を行った。分析用サンプルを調製するために２体積の上清を１ＭＨＣｌ、１体積４ｘＬＤＳサンプル緩衝液(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０００７)、及び１％ ＰＭＳＦ (２０ｍｇ／ｍｌ) と混合し、続けて７０℃にて１０分間温めた。それから１０μＬのＳｅｅＢｌｕｅ ｐｌｕｓ ２あらかじめ染色されたタンパク質標準物(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＬＣ５９２５)と共に２５μＬの各サンプルをゲルへ注入した。結果はこの実施例に記載のｎｐｒＥクローニング戦略がバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における活性ＮｐｒＥの生産に有用であると明らかに実証した。
ＡＳＰプロテアーゼ生産
バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）へのプラスミドｐＨＰＬＴ‐ＡＳＰ‐Ｃ１‐２の形質転換に用いる方法を提供する。バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるＡＳＰ発現を最適化するために合成ＤＮＡ配列をこれ等の発現実験において利用するＤＮＡ２．０により生産した。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）に適用コドン使用頻度を有し、野生型ＡＳＰ前駆体タンパク質をコードするＤＮＡ配列（合成ＡＳＰＤＮＡ配列）を下記に示す。
Figure 2010528656
Figure 2010528656
上記配列において、太字は成熟ＡＳＰプロテアーゼをコードするＤＮＡを示し、標準フォントはリーダー配列（ＡＳＰリーダー）を示し、下線部はＮ末端及びＣ末端プロ配列を示す。下記に示すアミノ酸配列は完全長ＡＳＰ前駆体タンパク質に相当し、下線部はプロ配列及び太字は成熟ＡＳＰプロテアーゼを示す。
Figure 2010528656
成熟ＡＳＰ配列は本明細書に記載の変異体ライブラリーを作成するために基礎として用いる。
Figure 2010528656
Ａｓｐ発現カセットをｐＸＸ‐ＫｐｎＩベクターで構築し続けてバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）においてＡＳＰの発現のためにｐＨＰＬＴへクローン化した。ｐＸＸ‐ＫｐｎＩはｃａｔ遺伝子の発現を誘導するａｐｒＥプロモーター（バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、及びバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）コピー数の増幅用の重複ａｐｒＥプロモーターを有するｐＵＣをベースとしたベクターである。ｂｌａ遺伝子は大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)にて選択的増殖をさせる。ＫｐｎＩはリボソーム結合部位であって、ａｐｒＥプロモーター領域下流にて、ＨｉｎｄＩＩＩと共に導入され、ｐＸＸ‐ＫｐｎＩにおけるＡｓｐ発現カセットのクローニングを可能とする。ｐＨＰＬＴ‐ＥＢＳ２ｃ２、ｐＨＰＬＴの誘導体(Solingen他、Extremophiles 5:333-341 [2001])であり、バシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）熱安定性アミラーゼＬＡＴプロモーター（ＰＬＡＴ）含み、ＡＳＰ発現構築物をクローニングするＸｂａＩ及びＨｐａＩ制限部位を伴う。Ａｓｐ発現カセットは、２５個のＡｓｐＣ末端シグナルペプチドアミノ酸に融合した５個のスブチリシンＡｐｒＥのＮ末端シグナルペプチドアミノ酸が構築されるハイブリッドシグナルペプチド配列番号９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）をコードするＤＮＡを含むｐＸＸ‐ＫｐｎＩベクターにクローン化した。配列番号９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）は
MRSKKRTVTRALAVATAAATLLAGGMAAQA (SEQ ID NO:9)
である。
ハイブリッドＡＳＰシグナルペプチドは次のＤＮＡ配列によりコードされる。
ATGAGAAGCAAGAAGCGAACTGTCACAAGAGCTCTGGCTGTGGCAACAGCAGCTGCTACACTCTTGGCTGGGGGTATGGCAGCACAAGCT (SEQ ID NO:10)
ｐＸＸ‐ＫｐｎＩベクターにクローン化したＡｓｐ発現カセットを大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ) (Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｘ ＤＨｌＯＢ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２０３３‐０１５)へ形質転換した。用いたプライマー及びクローニング方法を下記に記載する。続いて、発現カセットをこれ等のベクターからクローン化し、バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ΔaprE、ΔnprE、 oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::（xylR、pxylA-comK)株へ形質転換するためのｐＨＰＬＴ発現ベクターへ導入した。プライマー及びｐＨＰＬＴにおけるＡＳＰ発現カセットクローニングのためのクローニング方法も以下に記載する。
プライマーをＭＷＧ及びインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ (カタログ番号１１３０４‐０２９)をインビトロジェンの説明書に従ってＰＣＲ増幅(０．２μＭプライマー、２５から３０サイクル)のために用いた。ＡＳＰ発現カセット及び宿主ベクターのリガーゼ反応を末端を糊付けする一般的なクローニングにて推奨する手順を用いてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(カタログ番号１５２２４‐０２５)を用いて完成した。
ａｓｐ遺伝子の発現をバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ΔaprE、ΔnprE、 oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::（xylR、pxylA-comK)株において研究した。プラスミドｐＨＰＬＴ‐ＡＳＰ‐Ｃ１‐２をバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ΔaprE、ΔnprE、 oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::（xylR、pxylA-comK)へ形質転換した。形質転換を周知の方法（例えば、WO 02/14490を参照願いたい。参照により本明細書組み込まれる。）にて実施した。
ｐＨＰＬＴ‐ＡＳＰ‐Ｃ１‐２ベクターを含むバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ΔaprE、ΔnprE、 oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::（xylR、pxylA-comK)形質転換体の選択的培養を０．５ｇ／ｌ ＣａＣｌ2のかわりに０．９７ ｇ/ｌＣａＣｌ２.６Ｈ2Ｏ を含み（参照により本明細書に取り込まれる、米国特許第5,324,653を参照願いたい）、２０ｍｇ／Ｌネオマイシン含有２５ｍｌの合成マキシターゼ培地（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍａｘａｔａｓｅ Ｍｅｄｉｕｍ (ＳＭＭ)）を含む振盪フラスコで実施した。この増殖はタンパク質分解活性を有する分泌ＡＳＰの生産をもたらした。ゲル分析をＮｕＰａｇｅ Ｎｏｖｅｘ １０％ Ｂｉｓ‐Ｔｒｉｓゲル(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＮＰ０３０１ＢＯＸ)を用いて実施した。分析用サンプルを調製するために、２体積の上清を１体積の１Ｍ ＨＣｌ、１体積の４ｘＬＤＳサンプル緩衝液(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０００７)、及び１％ ＰＭＳＦ (２０ ｍｇ／ｍｌ)に混合し、その後、７０℃にて１０分で温めた。それから、２５μＬの各サンプルをゲルに注入し、一緒に１０μｌのＳｅｅＢｌｕｅ ｐｌｕｓ ２着色済みタンパク質スタンダード(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＬＣ５９２５)を注入した。結果は、この実施例において記載のａｓｐクローニング方法がバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において活性ＡＳＰの生産に有用であると明らかに示した。
Figure 2010528656
Figure 2010528656
ＧＧ３６プロテアーゼ生産
この実施例において、バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるＧＧ３６（またバシルス レンタス（Ｂ. ｌｅｎｔｕｓ）スブチリシンとして本明細書にていう）を生産するための導入実験を示す。発現プラスミドｐＡＣ‐ＧＧ３６ｃｉをコンセンサスａｐｒＥプロモーター及びＢＰＮ'転写ターミネーターの制御下ａｐｒＥシグナル配列の８番目のコドンに融合したＧＧ３６コドン‐改良遺伝子を用いて組み立てた。下記に示す配列において、太字及びイタリックフォントはコンセンサスａｐｒＥプロモーターを示し、標準フォントはシグナル配列を示し、下線部フォントはプロ配列を示し、太字フォントはＧＧ３６成熟プロテアーゼをコードするＤＮＡを示し、及び下線部イタリックフォントはＢＰＮ'ターミネーターを示す。ＧＧ３６成熟プロテアーゼのコード領域はクローニングの目的のためにＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ制限部位により隣接される。
Figure 2010528656
ＧＧ３６前駆体タンパク質のアミノ酸配列を下記に示す。この配列において、太字は成熟ＧＧ３６プロテアーゼを示す。
Figure 2010528656
Figure 2010528656
成熟ＧＧ３６プロテアーゼのアミノ酸配列は本明細書に記載の変異体ライブラリーを作成するために基礎として用いる。
Figure 2010528656
プラスミドｐＡＣ‐ＧＧ３６ｃｉの要素は次を含む。それは
ｐＵＢ１１０=プラスミドｐＵＢ１１０(McKenzie他、Plasmid 15:93-103 [1986])由来のＤＮＡフラグメント、
ｐＢＲ３２２ ＝プラスミドｐＢＲ３２２ (Bolivar他、Gene 2:95-1 13 [1977])由来のＤＮＡフラグメント、
ｐＣ１９４ =プラスミドｐＣ１９４ (Horinouchi他、J Bacteriol, 150:815-825 [1982])由来のＤＮＡフラグメント、
である。
プラスミドの特徴は次の通りである。それは、
バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）用Ori =ｐＵＢ１１０由来複製部位（ｏｒｉｇｉｎ）、
ＣＡＴ = ｐＣ１９４由来クロラムフェニコール耐性遺伝子、
ｐＭＢｌ部位（ｏｒｉｇｉｎ）= ｐＢＲ３２２由来複製部位、
ｂｌａ = ｐＢＲ３２２由来ベータ‐ラクタマーゼ,
Ｓｈｏｒｔ ａｐｒＥプロモーター=コンセンサス転写プロモーター、
シグナルペプチド（Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ）= シグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）、
プロペプチド=ＧＧ３６プロ領域、
ＧＧ３６ｃｉ成熟ペプチド=成熟ＧＧ３６ (この実験で発現した各変異体のコード領域により置換される)、
ＢＰＮ' ターミネーター=スブチリシンＢＰＮ'由来転写ターミネーター
である。
ＦＮＡプロテアーゼ生産
この実施例において、バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるＦＮＡ（またバシルス アミロリケファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）スブチリシンＢＰＮ´−Ｙ２１７Ｌとして本明細書にていう）を生産するための導入実験を示す。発現プラスミドｐＡＣ‐ＦＮＡｒｅをコンセンサスａｐｒＥプロモーター及びＢＰＮ'転写ターミネーターの制御下aprEシグナル配列の８番目のコドンに融合したＦＮＡ遺伝子を用いて組み立てた。下記に示す配列において、太字及びイタリックフォントはコンセンサスａｐｒＥプロモーターを示し、標準フォントはシグナル配列を示し、下線部フォントはプロ配列を示し、太字フォントはＦＮＡ成熟プロテアーゼをコードするＤＮＡを示し、及び下線部イタリックフォントはＢＰＮ'ターミネーターを示す。ＦＮＡ成熟プロテアーゼのコード領域はクローニングの目的のためにＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ制限部位を含む。
Figure 2010528656
ＦＮＡ前駆体タンパク質のアミノ酸配列を下記に示す。この配列において、太字は成熟ＦＮＡプロテアーゼを示す。
Figure 2010528656
成熟ＦＮＡプロテアーゼのアミノ酸配列は本明細書に記載の変異体ライブラリーを作成するために基礎として用いる。
Figure 2010528656
プラスミドｐＡＣ‐ＦＮＡｒｅの要素は次を含む。それは
ｐＵＢ１１０=プラスミドｐＵＢ１１０ (McKenzie他、Plasmid 15:93-103 [1986])由来のＤＮＡフラグメント、
ｐＢＲ３２２ ＝プラスミドｐＢＲ３２２ (Bolivar他、Gene 2:95-1 13 [1977])由来のＤＮＡフラグメント、
ｐＣ１９４ =プラスミドｐＣ１９４ (Horinouchi他、J Bacteriol, 150:815-825 [1982])由来のＤＮＡフラグメント、
である。
プラスミドの特徴は次の通りである。それは、
バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）用Ｏｒｉ=ｐＵＢ１１０由来複製部位（ｏｒｉｇｉｎ）、
ＣＡＴ=ｐＣ１９４由来クロラムフェニコール耐性遺伝子、
ｐＭＢｌ部位（ｏｒｉｇｉｎ）= ｐＢＲ３２２由来複製部位、
ｂｌａ＝ｐＢＲ３２２由来ベータ‐ラクタマーゼ,
Ｓｈｏｒｔ ａｐｒＥプロモーター=コンセンサス転写プロモーター、
シグナルペプチド（Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ）=シグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）、
プロペプチド=ＦＮＡプロ領域、
ＦＮＡ成熟ペプチド=成熟ＦＮＡ (この実験で発現した各変異体のコード領域により置換される)、
ＢＰＮ' ターミネーター=スブチリシンＢＰＮ'由来転写ターミネーター
である。
実施例３
バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるアミラーゼ生産
バシルス ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ（またＡｍｙＳとして本明細書にていう）、ＡｍｙＳの変異欠損体（２９アミノ酸欠損を有するＳ２４２Ｑ、またＳ２４２Ｑとして本明細書にていう）、及びバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＴＳ‐２３由来アルファ‐アミラーゼの欠損体（またＡｍｙＴＳ‐２３ｔとして本明細書にていう）及びバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるそれらの変異体を生産するために導入する実験を記載する。形質転換を周知の方法（例えば、WO 02/14490を参照願いたい）にて実施した。簡単にいえば、親アミラーゼをコードする遺伝子をＬＡＴプロモーター(ＰＬＡＴ)、ＬＡＴシグナルペプチドをコードする配列(ｐｒｅＬＡＴ)、を含み、クローニングのためにＰｓｔＩ及びＨｐａＩ制限部位を伴うｐＨＰＬＴ発現ベクターへクローン化した。
ＬＡＴシグナルペプチドのためのコード領域を以下に示す。
Figure 2010528656
ＬＡＴシグナルペプチドのアミノ酸配列を下記に示す。
MKQQKRLYARLLTLLFALIFLLPHSAASA (SEQ ID NO:22)
成熟ＡｍｙＳアミラーゼのコード領域を下記に示す。
Figure 2010528656
成熟ＡｍｙＳアミラーゼのアミノ酸配列を本明細書に記載の変異体ライブラリーを作成するために基礎として用いる。
Figure 2010528656
Figure 2010528656
イタリック体で示す置換アミノ酸を有する成熟欠損Ｓ２４２Ｑアミラーゼのアミノ酸配列を本明細書に記載の変異体ライブラリーを作成するために基礎として用いる。
Figure 2010528656
成熟ＡｍｙＴＳ‐２３ｔアミラーゼのためのコード領域を以下に示す。
Figure 2010528656
Figure 2010528656
成熟ＡｍｙＴＳ‐２３ｔアミラーゼのアミノ酸配列を本明細書に記載の変異体ライブラリーを作成するために基礎として用いる。
Figure 2010528656
ＡｍｙＳ遺伝子をプライマー
Ethyl 4 F:
5'CTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTCAGCAGCCGCACCGTTTAACGGTACCATG 3'(SEQ ID NO:28)、及び
Ethyl 4 R:
5'CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAGGTCGTTTTTCTAGGAAC3' (SEQ ID NO:29)
を用いてプラスミドｐＩＣａｔＨ‐Ｅｔｈｙｌ４(ｏｒｉ １)由来ＰｓｔＩ‐ＨｐａＩフラグメントとして増幅した。
ＰＣＲ生産物をＱｉａｇｅｎからＱｉａｑｕｉｋカラムを用いて精製し、５０μＬの脱イオン水に再懸濁した。５０μＬの精製ＤＮＡをＨｐａＩ（Ｒｏｃｈｅ）及びＰｓｔＩ （Ｒｏｃｈｅ）で消化し、得られたＤＮＡを３０μＬの脱イオン水に再懸濁した。１０から２０ｎｇ／μＬのＤＮＡをＰｓｔＩ及びＨｐａＩクローニング部位を用いてプラスミドｐＨＰＬＴへクローン化した。ライゲーション混合物をコンピテントバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞(ゲノタイプ: Δvpr、 ΔwprA、 Δmpr-ybfJ、 ΔnprB)へ直接形質転換した。バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞はキシロース誘導プロモーター下に位置するコンピテンシー遺伝子(comK)を有しており、キシロースはＤＮＡ結合及び取り込みのためのコンピテンシーを誘導するために用いる。
プラスミドｐＨＰＬＴ‐ＡｍｙＳの要素は次を含む。それは
ｐＵＢ１１０=プラスミドｐＵＢ１１０ (McKenzie他、Plasmid 15:93-103 [1986])由来のＤＮＡフラグメント
である。
プラスミドの特徴は次を含む。それは、
ｏｒｉ‐ｐＵＢ１１０= ｐＵＢ１１０由来複製部位（ｏｒｉｇｉｎ）、
ｎｅｏ＝ｐＵＢ１１０由来ネオマイシン耐性遺伝子、
Ｐｌａｔ=バシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼ由来転写プロモーター
Ｐｒｅ ＬＡＴ=バシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼ由来シグナルペプチド、
ＡｍｙＳ=欠損ＡｍｙＳ及びアミラーゼ変異体のコード領域、
ターミネーター =バシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼ由来転写ターミネーター
である。
実施例４
酵素変異体の発現
この実施例は前記実施例の形質転換バシルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の多様な組み換え酵素を発現するために用いる方法を記載する。
中性メタロプロテアーゼ−６００ｍｌ スケール
組み換えバシルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を栄養培地において従来のバッチ発酵により培養した。バシルス アミロリケファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）中性メタロプロテアーゼ又はその変異体を含むバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）培養のひとつのグリセロールバイアルを２００ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール含有６００ｍｌのＳＢＧ１％培地に播種した。培養培地を３７℃にて３６から４８時間培養し、その後、培養液体を周知のように１２，０００ｒｐｍで遠心分離機により回収した。この方法を重複して行った。分泌中性メタロプロテアーゼをＢＥＳ（ポリエーテルスルホン）１０ｋＤａカットオフを伴うアミコンフィルターシステム８４００を用いて約１０倍に濃縮した。
濃縮上清を１０ｍＭ ＮａＣｌ含有２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ５．４対して４℃にて終夜透析をした。それから透析物を下記に記載するように陽イオン交換カラムＰｏｒｏｓ ＨＳ２０ (総体積~８３ｍＬ、結合能~ ４．５ ｇタンパク質/ｍＬカラム、ウォーターズ)に注入した。カラムを１０ｍＭ ＮａＣｌ含有２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ５．４にて前もって平衡化した。それから、約２００から３００ｍＬのサンプルをカラムに注入した。結合タンパク質を１０カラム体積のＭＥＳ緩衝液に対してｐＨ５．４から６．２のｐＨ勾配を用いて溶出した。タンパク質の溶出物はｐＨ５．８と６．０の間であり、本明細書に記載のタンパク質分解活性及び１０％ (ｗｔ％／ｖ) ＮＵＰＡＧＥ（商標）ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ (Ｎｏｖｅｘ)を用いて評価した。中性メタロプロテアーゼ含有フラクションを集めた。塩化カルシウム塩及び塩化亜鉛塩を３：１の比率で添加し、その後、ｐＨ５．８へ調整した。Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＢＩＯＣＡＤ（商標）Ｖｉｓｉｏｎ(ＧＭＩ)を用いてタンパク質精製を行った。精製タンパク質を１０％ (ｗｔ％／ｖ) ＮＵＰＡＧＥ（商標）ＳＤＳ‐ＰＡＧＥを用いて評価し、９５％より高い純度で均一性であった。
セリンプロテアーゼ‐６００ｍｌスケール
組み換えバシルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を栄養培地において従来のバッチ発酵により培養した。セルロモナス・ボゴリエンシス（Ｃ． ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）セリンプロテアーゼ又はその変異体を含むバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）培養のひとつのグリセロールバイアルを２００ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール含有６００ｍｌのＳＢＧ１％培地に播種した。培養培地を３７℃にて３６から４８時間培養し、その後、培養液体を周知のように１２，０００ｒｐｍ(ＳＯＲＶ ＡＬＬ（商標）ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｍｏｄｅｌ ＲＣ５Ｂ)で１０℃にて遠心分離機により回収した。この方法を重複して行った。得られた上清をＳｅｉｔｚ ＥＫＳ(ＳｅｉｔｚＳｃｈｅｎｋ)にて深層ろ過により浄化した。得られた滅菌培養上清をさらに１０ｋＤａカットオフ(Ｐａｌｌ Ｏｍｅｇａ １０ｋＤａ Ｍｉｎｉｓｅｔｔｅ； Ｐａｌｌ)を伴う限外ろ過カセットを用いた限外ろ過により約１０倍に濃縮した。得られた濃縮された粗精製セリンプロテアーゼを凍結しさらに使用するまで−２０℃に保管した。
細胞分離培養培地を８Ｋ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｃｕｔ Ｏｆｆ (ＭＷＣＯ) Ｓｐｅｃｔｒａ‐Ｐｏｒ７ (Ｓｐｅｃｔｒｕｍ)透析チューブを用いて１ｍＭＣａＣｌ２含有２０ｍＭ(２-(４-モルホリノ)-エタンスルホン酸 (ＭＥＳ)ｐＨ５．４に対して透析した。透析を終夜又はサンプルの導電率がＭＥＳ緩衝液の導電率未満又は同等になるまでに透析した。透析酵素サンプルを１０x１００ｍｍ (７．８４５ｍＬ) ＰＯＲＯＳ Ｈｉｇｈ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｓｕｌｆｏ‐ｐｒｏｐｙｌ(ＨＳ) ２０ (２０ミクロン) 陽イオン交換カラム (ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)を有するＢｉｏＣａｄ ＶＩＳＩＯＮ (Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)を用いて精製した。前もって５ｍｌ／分で平衡化したカラムに酵素を注入後、カラムを２５カラム体積で２５ｍＭＭＥＳｐＨ６．２、１ｍＭＣａＣｌ２から２５ｍＭ (Ｎ-[２-ヒドロキシエチル] ピペラジン-Ｎ'-[２-エタン] スルホン酸 [Ｃ8Ｈ１８Ｎ2Ｏ4Ｓ、カタログ番号７３６５‐４５‐９]) (ＨＥＰＥＳ) ｐＨ ８．０、１ｍＭ ＣａＣｌ２までのｐＨ勾配を用いて４０ｍＬ／分で洗浄した。フラクション（８ｍＬ）を溶出の間に渡って集めた。ｐＨ８．０の洗浄段階を５体積分保持し、それから酵素を勾配（０から１００ｍＭＮａＣｌ、同じ緩衝液、３５カラム体積にて）を用いて溶出した。フラクションのプロテアーゼ活性をｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイを用いてモニターした。４０ｍＭＮａＣｌで溶出されたプロテアーゼ活性を濃縮し、１ｍＭＣａＣｌ２含有２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．８へ緩衝液を交換(５Ｋ ＭＷＣＯ ＶＩＶＡ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０ｍＬ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒを用いて)した。この物質を更なる酵素特徴付けに用いた。
セリンプロテアーゼ − ２００μｌスケール
ＡＳＰ発現ベクタータンパク質を含むバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）クローンを２００μｌのＴＳＰ培地＋２０μｇ／ｍｌネオマシン含有９６穴培養プレート(ＢＤ，３５３０７５)のグリセロールストックからスチール製９６穴レプリケーターを用いて複製し、加湿密閉にて２２０ｒｐｍ３７℃にて終夜培養した。終夜培養培地から１５μｌをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅｓにおいて１８５μｌの規定の培地＋２０μｇ／ｍｌネオマシンへ播種するために用いた。この培養培地は主要な窒素源として尿素を、主な炭素源としてグルコースを伴う、及び好ましい細胞増殖のために１％ソイトンで補強されるＭＯＰＳ緩衝液に基づく栄養強化半規定培地であった。フィルタープレートを加湿密閉にて２２０ｒｐｍ３７℃にて６０時間培養した。このインキュベーションに続き、培養培地をフィルタープレートを通してろ過し、回収した。さらなる精製又は濃縮を行わなかった。ろ過物のストックを長期間の安定性のために最終濃度４０％プロピレングリコールとなるように調整し、９６穴クリア非結合ポリスチレンプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＣＬＳ３６４１)にて４℃で保存した。
スブチリシン−２ｍｌスケール
ＦＮＡまたはＧＧ３６発現ベクターを含むバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）クローンを２００μｌのＬＢ培地＋２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール含有９６穴培養プレート(ＢＤ，３５３０７５)のグリセロールストックからスチール製９６穴レプリケーターを用いて複製し、加湿密閉にて２２０ｒｐｍ３７℃にて終夜培養した。終夜培養培地から２００μｌを５ｍＬ培養管において２０００μｌの規定の培地＋２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールへ播種するために用いた。この培養培地は主要な窒素源として尿素を、主な炭素源としてグルコースを伴う、及び好ましい細胞増殖のために１％ソイトンで補強されるＭＯＰＳ緩衝液に基づく栄養強化半規定培地であった。培養管を２２０ｒｐｍ３７℃にて６０時間培養した。このインキュベーションに続き、培養培地を８０００ｘＲＣＦより高く遠心分離をした。上澄み溶液を保存のために１５ｍｌポリプロピレン円錐管へデカントした。さらなる精製又は濃縮を行わなかった。上清ストックを長期間の安定性のために最終濃度４０％プロピレングリコールとなるように調整し、４℃で保存した。
アミラーゼ発現−２ｍｌスケール
ＡｍｙＳ、Ｓ２４２Ｑ又はＡｍｙＴＳ２３ｔ発現ベクターを含むバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）クローンを１５０μｌのＬＢ培地＋１０μｇ／ｍｌネオマシン含有９６穴培養プレート(ＢＤ，３５３０７５)のグリセロールストックからスチール製９６穴レプリケーターを用いて複製し、加湿密閉にて２２０ｒｐｍ３７℃にて終夜培養した。終夜培養培地から１００μｌを５ｍＬプラスチック培養管において２０００μｌの規定の培地＋１０μｇ／ｍｌネオマシンへ播種するために用いた。この培養培地は主要な窒素源として尿素を、主な炭素源としてグルコースを伴う、及び好ましい細胞増殖のために１％ソイトン及び５ｍＭカルシウムで補強されるＭＯＰＳ緩衝液に基づく栄養強化半規定培地であった。培養管を２５０ｒｐｍ３７℃にて７２時間培養した。このインキュベーションに続き、培養培地を３０００ｘｇで１０分間遠心分離をした。上澄み溶液を１５ｍｌポリプロピレン円錐管へデカントし、８０μＬの各サンプルをタンパク質定量のために９６穴プレートへ入れた。
実施例５
酵素変異体の生産
この実施例は酵素電荷ラダー及び組み合わせ電荷ライブラリーの生産を記載する。
酵素電荷ラダー
所望の物理的性質の範囲にわたって複数のタンパク質を存在するライブラリー又は周知の部位特異的突然変異の方法（例えば、US Pat. Appln. Ser. Nos., 10/576,331、11/581,102、及び 11/583,334参照願いたい。）により作成したライブラリーから選択する。それからこの特定したプローブタンパク質のセットを所望の試験においてアッセイした。
一般的なプロテアーゼ電荷ラダー変異体を次の表に示し、本明細書記載のようにアッセイする。これらの表において、電荷変化は野生型酵素と比較する。
Figure 2010528656
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一般的にアミラーゼ電荷ラダー変異体を次の表に示し及び本明細書記載のようにアッセイする。これらの表において、電荷変化は野生型酵素と比較する。
ＡｍｙＳの遺伝子配列はＧｅｎｅ Ｏｒａｃｌｅ (Mountain View, CA)に表５−５に示す２８電荷ラダー変異体の合成物を提供した。Ｇｅｎｅ Ｏｒａｃｌｅにより合成されＡｍｙＳ変異体をベクターｐＧｏｖ４へクローン化し、それらを大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）へ形質転換した。ミニプレップから単離されるＤＮＡ並びに穿刺寒天が変異体ごとに供給された。
変異体をＰＣＲにて増幅し、ｐＨＰＬＴバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）発現ベクターへクローン化した。変異体を
AmySprimer F 5'- CTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTC-3' (SEQ ID NO:30)、及び
AmySprimer R 5'- TTATCCTTTACCTTGTCTCCAAGC-3' (SEQ ID NO:31)
を用いてプラスミドｐＧｏｖ４からＰｓｔＩ‐ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして増幅した。
ＰＣＲ生産物をＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｋカラムを用いて精製し、５０μＬのミリＱ水に再懸濁した。５０μＬの精製ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ（Ｒｏｃｈｅ） 及びＰｓｔＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化し、得られたＤＮＡを３０μＬの脱イオン水に再懸濁した。１０から２０ｎｇ／μＬのＤＮＡをＰｓｔＩ及びＨｐａＩクローニング部位を用いてプラスミドｐＨＰＬＴへクローン化した。ライゲーション混合物をコンピテントバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞(ゲノタイプ: amyE::xylRPxylAcomK-phleo)へ直接形質転換した。これらのバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞はキシロース誘導プロモーター下に位置するコンピテンシー遺伝子(ｃｏｍＫ)を有しており、キシロースはＤＮＡ結合及び取り込みのためのコンピテンシーを誘導するために用いられる。
Figure 2010528656
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酵素組み合わせ電荷ライブラリー
バシルス レンタス（Ｂ. ｌｅｎｔｕｓ）スブチリシン（＝ＧＧ３６）組み合わせ電荷ライブラリーの作成
コドン改良ＧＧ３６遺伝子を含むｐＡＣ‐ＧＧ３６ｃｉプラスミドを組み合わせ電荷ライブラリー（ＣＣＬ）の作成のためにＤＮＡ ２．０ Ｉｎｃ． (Menlo Park, CA)へ送付した。また、それらは形質転換によりバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株（ゲノタイプ：ΔaprE、ΔnprE、ΔspoIIE、amyE::xylRPxylAcomK-phleo）に含まれた。さらに、表５−７に示すようにＧＧ３６プロテアーゼにおける４つの各部位でのポジショナルライブラリーの作成をＤＮＡ ２．０ Ｉｎｃ．へ依頼した。変異体は９６穴プレートにてグリセロールストックとして供給された。
ＧＧ３６ＣＣＬを活性部位の外側で４つのよく分布している、表面に露出している、非電荷極性アミノ酸残基を同定することにより設計した。これらの残基はＳｅｒ‐８５、Ｇｌｎ‐１０７、Ｓｅｒ‐１８２、及びＡｓｎ‐２４２(ＢＰＮ' ナンバリングにおいては８７、１０９、１８８、及び２４８残基)である。野生型、アルギニン又はアスパラギン酸の３つの可能性のある各部位のすべての組み合わせを作ることにより、８１つのメンバー組み合わせライブラリー（Ｇ−１からＧ−８１）を創製した。
Figure 2010528656
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バシルス アミロリケファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）スブチリシン
ＢＰＮ’‐Ｙ２１７Ｌ(＝ＦＮＡ)ＣＣＬの作成
ＦＮＡ遺伝子を含むｐＡＣ‐ＦＮＡｒｅプラスミドを組み合わせ電荷ライブラリー（ＣＣＬ）の作成のためにＤＮＡ ２．０ Ｉｎｃ． (Menlo Park, CA)へ送付した。また、形質転換のためにバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株（ゲノタイプ：ΔaprE、ΔnprE、ΔspoIIE、amyE::xylRPxylAcomK-phleo）を同社に送った。さらに、表５−８に示すように４つのＦＮＡプロテアーゼの各部位でのポジショナルライブラリーの作成をＤＮＡ ２．０ Ｉｎｃ．へ依頼した。変異体は９６穴プレートにてグリセロールストックとして供給された。
スブチリシンＢＰＮ’‐Ｙ２１７Ｌ組み合わせ電荷ライブラリーを活性部位の外側で４つのよく分布している、表面に露出している、非電荷極性アミノ酸残基を同定することにより設計した。これらの残基はＳｅｒ‐８７、Ａｓｎ‐１０９、Ｓｅｒ‐１８８、及びＳｅｒ‐２４８である。野生型、アルギニン又はアスパラギン酸の３つの可能性のある各部位のすべての組み合わせを作ることにより、８１つのメンバー組み合わせライブラリー（Ｆ−１からＦ−８１）を創製した。
Figure 2010528656
Figure 2010528656
バシルス ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＡｍｙＳ−Ｓ２４２Ｑ ＣＣＬの作成
ＡｍｙＳ−Ｓ２４２ＱプラスミドＤＮＡを形質転換バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株（ゲノタイプ：ΔaprE、ΔnprE、amyE::xylRPxylAcomK-phleo）から単離し、ＣＣＬ構築物のテンプレートとしてＤＮＡ ２．０ Ｉｎｃ．へ送付した。表５−９に示すようにＡｍｙＳ−Ｓ２４２Ｑ（Ｓ２４２Ｑ）アミラーゼにおける４つの各部位での位置的ライブラリーの作成をＤＮＡ ２．０ Ｉｎｃ．へ依頼した。変異体は９６穴プレートにてグリセロールストックとして供給された。
次の４つの残基であるＧｌｎ‐９７、Ｇｌｎ ３１９、Ｇｌｎ ３５８、及びＧｌｎ ４４３を同定することによりＡｍｙＳ Ｓ２４２Ｑ組み合わせ電荷ライブラリーを設計した。野生型、アルギニン又はアスパラギン酸の３つの可能性のある各部位のすべての組み合わせを作ることにより、４つの部位、８１個のメンバー組み合わせライブラリーを創製した。
Figure 2010528656
Figure 2010528656
Figure 2010528656
バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＡｍｙＴＳ２３ｔＣＣＬの作成
ＡｍｙＴＳ２３ｔはバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼの欠損体である。バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株 (degUHy32、oppA、ΔspoII3501、amyE::xylRPxylAcomK- ermC、ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpr、Δvpr、ΔwprA、Δmpr-ybfJ、ΔnprB) を欠損する複数のプロテアーゼにおけるＡｍｙＴＳ２３ｔの発現は記載されている(例えば、US2005/0202535A1を参照願いたい)。形質転換バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞から単離したＡｍｙＴＳ２３ｔプラスミドＤＮＡをＣＣＬ構築物のテンプレートとしてＤＮＡ ２．０ Ｉｎｃ． (Menlo Park, CA)へ送付した。ＤＮＡ ２．０ Ｉｎｃ．に次の７つの変異をＡｍｙＴＳ２３ｔへ導入することにより、ＣＣＬの親構築物を調製することを依頼した。その変異はＡｍｙＴＳ２３ｔ‐７ｍｕｔ（また本明細書にてＴＳ２３ｔ’として設計され）とよばれ、Ｑ９８Ｒ、Ｍ２０１Ｌ、Ｓ２４３Ｑ、Ｒ３０９Ａ、 Ｑ３２０Ｒ、Ｑ３５９Ｅ、及びＫ４４４Ｅである。変異体は９６穴プレートにてグリセロールストックとして供給された。続いて、表５−１０に示すようにＡｍｙＴＳ２３ｔ‐７ｍｕｔアミラーゼにおける４つの各部位でのポジショナルライブラリーの作成をＤＮＡ ２．０ Ｉｎｃ．へ依頼した。
ＡｍｙＴＳ２３ｔ‐７ｍｕｔにおける次の４つの残基であるＧｌｎ ８７、Ａｓｎ ２２５、Ａｓｎ ２７２、及びＡｓｎ ２８２を同定することによりＡｍｙＴＳ２３ｔ組み合わせ電荷ライブラリーを設計した。野生型、アルギニン又はアスパラギン酸の３つの可能性のある各部位のすべての組み合わせを作ることにより、４つの部位、８１個のメンバー組み合わせライブラリー（ＣＣＬ）を創製した。
Figure 2010528656
Figure 2010528656
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実施例６
酵素性能
この実施例は多様なイオン強度下１．０μｇ／ｍｌのＡＡＴＣＣ ＨＤＬまたは５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液にてＢＭＩ（血液、牛乳、インク）微小布見本アッセイでのＡＳＰ変異体の試験を記載する。また、洗濯適用及び自動食器洗浄適用両方の多様なマーケットの地理的要素（例えば、異なるｐＨ、Ｔ、及び／又は水硬度）を表す洗剤においてＢＭＩ微小布見本及びベイクドエッグアッセイでのＦＮＡ及びＧＧ３６の試験を記載する。さらに、この実施例は洗濯適用並びにデンプン液化におけるアルファ‐アミラーゼ変異体の試験を記載する。実施例１に記載の方法を用いた（「酵素性能アッセイ」及び「トウモロコシ粉加水分解」を参照願いたい）。
図１に示すのは、ＡＡＴＣＣ ＨＤＬ洗剤におけるＡＳＰの洗濯性能に対する最適正味電荷変化である。性能をＢＭＩ微小布見本活性アッセイにて観察される相対的洗浄性能の観点から測定した。このアッセイで約１．０の値が一番よい洗濯性能を示す。図の傾向から、野生型と比較して極端な負（−５）又は正（＋３）の電荷の蓄積は乏しい洗濯性能を示す。野生型ＡＳＰと比較して−２に中心がある顕著な電荷最適洗濯性能を示す。これは所定の結果または利点（例えば、液体洗濯用洗剤における洗浄性能）を改善するためにタンパク質物理的性質（例えば、正味電荷）を最適化する例である。電荷最適条件は、この限られたセットのプローブタンパク質で観察される最適電荷は図２で示すＡＳＰ電荷組合せライブラリー全体を測定する場合に観察される最適電荷と合致する。従って、プローブタンパク質の使用はライブラリー全体の性質を予測する。
デバイ−ヒュッケル（Ｄｅｂｙｅ−Ｈｕｅｃｋｅｌ）理論(Israelachivili, Intermolecular and SurfaceForces, Second Edition: With Applications to Colloidal and Biological Systems, Academic Press 2nd Ed. [1992])によれば、静電気的相互作用は定電位又は一定電荷（酵素、基質、生地、及び洗剤）での相互作用因子、それらのサイズ、及び環境媒体の誘電率の間で二重層の力の強度によって主に制御される。洗剤製剤のような複合体媒体における粒子の静電的性質を特徴づけるためには、低減した環境にて同じデバイスクリーニング長を有するそれらの相互作用で十分である。これは洗浄条件下ｐＨ及び導電率を洗剤のものと適合する緩衝液を選択することで達成できた。図１に示すようにこの緩衝液におけるＡＳＰ電荷ラダーのスクリーニングはＡＡＴＣＣ洗剤（黒三角）を用いて観察される−２で電荷最適条件を正確に予想できた。図３は、この場合ＮａＣｌであるが、多様な量の通常の電解質含有５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ８．０における野生型ＡＳＰと比較した電荷変化に応じた相対的ＢＭＩ汚れ除去を示す。緩衝液への２．５ｍＭ ＮａＣｌの添加は一般的な北アメリカ洗浄条件のｐＨ及び導電率と適合する。より高い濃度のＮａＣｌの添加は日本又はヨーロッパ洗浄条件の典型であり、水硬度及び洗剤濃度両方の増加によりイオン強度が一般的に高い。つまり、ＡＳＰ電荷最適条件は溶液環境（例えば、洗剤製剤）に応じる。
すぐ明らかとなる二つの特徴がある。第一は、適合するｐＨ及び導電率を有する簡略した緩衝液環境において所定の物理的性質（例えば、電荷ラダーＡＳＰ変異体）に関して限定した数のプローブタンパク質からなるモデルシステムの使用により、洗剤条件下スクリーニングされる大きなＡＳＰライブラリーの性質を予測する。実際、２．５ｍＭ ＮａＣｌ含有緩衝液（白丸）における測定した図１に示す電荷最適条件は、北アメリカ洗浄条件下ＡＡＴＣＣ洗剤にてスクリーニングしたこのＡＳＰ電荷ラダーに観察された最適条件と同一であった。第二に、電荷最適条件の位置はイオン強度の強い作用を受ける。さらにＮａＣｌの追加により、野生型ＡＳＰに比較して正電荷を有する変異体へ電荷最適条件をシフトする。簡単に言うと、電荷ラダータンパク質プローブの使用は広い地理的市場を反映する製剤にわたって異なる酵素変異体の性能を迅速に予測できる。
上記考察はスブチリシンＦＮＡ及びＧＧ３６のような他のセリンプロテアーゼに役立つ。例えば、図４Ａ及び４ＢはＴＩＤＥ２Ｘを用いる北アメリカ洗濯条件下洗浄性能におけるそれぞれＦＮＡ及びＧＧ３６の最適電荷を示す。左Ｙ軸は微小布見本洗浄性能を示し、高い数は優れたＢＭＩ汚れ除去を示す。右Ｙ軸は親分子（白シンボル）に比較した変異体（黒シンボル）の洗浄性能を示す。横線はアッセイのノイズを超えた２又は３のいずれかの標準偏差での性能指標を示す。ＦＮＡ電荷組み合わせライブラリー（ＣＣＬ）は親ＦＮＡに関して０電荷変化で電荷最適条件を有し、一方ＧＧ３６ＣＣＬは親ＧＧ３６に比較してマイナス２の電荷で電荷最適条件を有する。
図５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂ、７Ａ、及び７Ｂは、電荷最適条件の位置が水硬度及び洗剤濃度が原因で洗剤製剤、ｐＨ、温度及びイオン強度により決定される溶液環境の作用であることを示す。例えば、ＦＮＡ ＣＣＬの電荷最適条件は北アメリカ洗濯条件下の０から西ヨーロッパ及び日本条件下のより正の電荷へ劇的にシフトする。さらに、電荷最適条件は液体及び顆粒（粉）洗濯洗剤製剤両方に観察される。同様に、電荷最適条件が酵素基質としてのベイクドエッグに対する自動食器洗浄（ＡＤＷ）洗剤（例えば、Reckitt Benckiser Calgonit４０℃, １２ｇｐｇ， ｐＨ１０）においてＦＮＡ及びＧＧ３６ＣＣＬ両方に観察された。
本発明の開発中実験として、異なる洗剤におけるプロテアーゼ電荷変異体（例えば、ＡＤＰ，ＧＧ３６、ＦＮＡ等）の洗浄性能はワーキング溶液のｐＨ及び導電率によって大きく支配される。最終導電率はイオン強度の測定及び水硬度、洗剤濃度及び組成に起因する。例えば、ｐＨ１０．６及び導電率３．０ｍＳ／ｃｍにて実施する場合、ヨーロッパ及び北アメリカＡＤＷ洗剤下ベイクドエッグ汚れに対してＧＧ３６及びＦＮＡ変異体の洗浄性能の間で相関関係がある。特に、ｐＨ及び導電率が同じ場合、電荷変異体の洗浄性能はかなり相関関係がある。この発見により、適合するｐＨ及び導電率の別の洗剤にそれらの結果を推測適用するために、所定の洗剤を用いて酵素性能をスクリーニングすることを可能とする。同様に、同様のワーキングｐＨ及び導電率を有する洗剤へそれらの結果を推測適用するために、適合ｐＨ及び導電率の緩衝液における酵素性能をスクリーニングすることを可能とする。
同様に、洗浄適用におけるアミラーゼ電荷変異体（例えば、ＡｍｙＳ‐Ｓ２４２Ｑ、及びＡｍｙＴＳ２３ｔ等）の洗浄性能に対する電荷最適条件があり、ワーキング溶液ｐＨ及び導電率の強い作用を有する。具体的に、本発明の開発中に決定したように、正の電荷変化変異体Ｓ２４２Ｑは図８に示すように北アメリカ洗濯条件（例えば、ＴＩＤＥ ２Ｘ）コメデンプン微小布見本の洗浄に優れ、一方図９に示すように、負の電荷変化変異体ＡｍｙＴＳ２３ｔは西ヨーロッパ洗濯条件下コメデンプン微小布見本の洗浄に優れている。さらに、これらの観察結果をデンプン加水分解反応において用いるアミラーゼに実際に適用できる。図１０に示すように、正のＳ２４２Ｑ変異体はＢＯＤＩＰＹデンプン基質の加水分解に対して高い特異的活性を示す。
ＡｍｙＳ電荷ラダー変異体によるデンプン液化をトウモロコシデンプンの液化を伴う最終粘度をモニタリングすることにより決定した。低い粘度の値はデンプンポリサッカライドの分解を示す。図１１に示すように、電荷最適条件（例えば、−４から−２）が液状化に見られた。かなり負である（例えば−１２から−１０）ＡｍｙＳ変異体は非常に高い最終粘度を示し、かなり正である（例えば＋６又はより大きい）その変異体でさえ高い最終粘度（例えば、トルクオーバーロードにより実験装置の限度を超える）を示した。
実施例７
ゼータ電位決定
この実施例は酵素及び基質のゼータ電位の決定について記載する。粒子の表面上の電荷の存在は界面領域周辺におけるイオンの分布に影響する。結果は粒子表面近くの粒子の電荷と反対の電荷の対イオンの増加した濃度である。一つが粒子表面から除去される場合、イオンの不均一な分布が最終的に均一になる。均一分布が得られる距離はデバイ長（Ｄｅｂｙｅ ｌｅｎｇｔｈ） (１／κ) 又は遮蔽距離（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｃｅ）といい、下記に説明するようにイオン強度に依存し、ここでε０は自由空間の誘電率（８．８５４ｘ１０−１２Ｆｍ−１）、εｒは液体の誘電率、ｋはボルツマン定数（１．３８ｘ１０−２３ＪＫ−１）、Ｔはケルビン温度、ｅは電子電荷（１．６０２２ｘ１０−１９Ｃ）、Ｉはモルイオン強度、及びＮＡはアボガドロ定数（６．０２２ｘ１０２３ｍｏｌ−１）である。
Figure 2010528656
 モルイオン強度を次の公式から計算する。ここでＣｉはイオン種の濃度及びＺｉは価数である。
Figure 2010528656
 ２９８Ｋでの水にとって、デバイ長表示は次の形に簡略できる。
Figure 2010528656
 粒子の周りの液体層は二つの部分として存在する。それはイオンが強く結合する内部領域（スターン層）及びそれほど強くない結合である外部（拡散）領域である。拡散層内でイオンと粒子が安定なエンティティを形成する内側部分とその外側部分の間に境界がある。粒子が移動する場合、この境界内のイオンは粒子とともに移動する。境界を越えたそれらのイオンは粒子とともに移動しない。この境界の電位、またいわゆる流体力学的せん断の表面は、ゼータ電位として定義される。
電気泳動光散乱において、下記に示すヘンリーの公式を用いて、ゼータ電位ｚは測定される電気泳動の移動ｕから計算できる。ここでεは誘電率、ｈは溶液粘度、ｋはデバイ長の逆数、ａは粒子半径、及びｆ（ｋａ）はヘンリー関数である。
Figure 2010528656
ｋの単位は長さの逆数であり、電気的二重層（デバイ長）の「厚み」である１／ｋを有する。パラメーターａは粒子の半径をいい、従って、ｋａは電気的二重層の厚さに対する粒子半径の比率である。ヘンリー関数ｆ（ｋａ）は粒子の形に依存し、球形として知られる。上記式において、それはｆ（０）＝１（ヒュッケル限界）からｆ（￥）＝１．５（スモルコウスキー限界）の範囲である。低い誘電率（又は低いイオン強度）媒体におけるタンパク質のような小粒子にとって、ｆ（ｋａ）＝１のヒュッケル限界がより適切なモデルである。
タンパク質のゼータ電位を上記説明の原則に従ってＺｅｔａｓｉｚｅｒ ＮＳ (Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， ＵＫ)を用いて測定した。ＢＭＩ‐汚れ布地のゼータ電位を上記原則の流動電位を用いてＳｕｒＰａｓｓ(Ａｎｔｏｎ‐Ｐａａｒ， Ａｕｓｔｒｉａ)にて測定した。表面電荷の定義から、通常クーロンの法則で表現する。
Figure 2010528656
 また、これは電気素量ｅ１．６＊１０−１９Ｃを乗じることにより正味電荷ｚとして表現される。
Figure 2010528656
 従って、正味電荷増量によるゼータ電位における予想する変化は次の式により与えられる。
Figure 2010528656
また、実施例１に記載のようにネイティブゲル方法(Sparks他、Journal of Lipid Research, 33: 123-130 [1992])を用いてゼータ電位を測定することができる。ネイティブゲルで測定する電気泳動の移動は通常ゲルマトリックにより生じる遅延に起因して溶液中より遅い。この方法で計算されるゼータ電位は溶液を基礎とした方法と比較して通常低い。従って、ネイティブゲル方法を通して得た場合それらを見掛けのゼータ電位という。
所定の製剤における効果的な電荷はそのゼータ電位として一覧表にする。共通の電荷スケールとしてゼータ電位の使用により異なる折りたたみ（例えば、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ等）並びに所望の条件（例えば、ＡＡＴＣＣ ＨＤＬ洗剤）下異なる基質（例えば、ＢＭＩ微小布見本）との相互作用を有する酵素変異体の比較ができる。ゼータ電位は異なるタンパク質折りたたみを比較するのに好ましいけれども、電気泳動の移動又は測定される電荷も絶対スケールを有し、比較するのに十分である。図１２はセリンプロテアーゼＡＳＰ（黒丸）に対するゼータ電位（下方、Ｘ軸）に応じたＢＭＩ性能（左Ｙ軸）を示す。ＡＳＰ電荷ラダー変異体は野生型ＡＳＰと比較して８電荷の範囲に及ぶ。実施例５に記載のように洗浄性能に関して正味電荷最適条件がある。図１２には酵素ゼータ電位に応じたＢＭＩ性能が標準正規分布により十分記載され、これは実線にて示され、平均μは−９．６８ｍＶに等しく、標準偏差σは１１．３９ｍＶ及びピーク値は０．４０５６（Ａ６００からバックグラウンドを除く）を有する。この分布は上のＸ軸上のＺスコアに応じて右Ｙ軸上で表示するピーク値によりＢＭＩ活性を割ることにより標準簡略座標として示される。Ｚスコアは（Ｘ−μ）／σとして通常定義される。ここで、この場合のＸはゼータ電位である。
Figure 2010528656
正規分布は所定の反応条件（ｐＨ、導電率、塩のタイプ、洗剤キレーター等）下、各基質汚れ対して特徴的である。種々の利点又は好ましい結果は多様な折りたたみ由来の酵素にわたって維持される物理的性質を有する正規分布に従う。たとえるなら、ＡＳＰ及びＮｐｒＥ電荷ラダーに関する発現レベルとゼータ電位の場合である。正規分布において、ピーク値は平均値に位置する。共通のゼータ電位スケールでの酵素及び基質電荷の比較により、最適ＢＭＩ性能が、この場合−９．６８ｍＶである平均酵素ゼータ電位の時に生じ、同じ条件下の測定される基質汚れゼータ電位、この場合−８．９７ｍＶ、と実質的に適合することが明らかとなる。
標準正規分布の性能レベルを表７−１に示すようにｚスコアの観点から便宜的に記載する（Abramowitz and Stegun, Handbook of Mathematical Functions with Formulas, Graphs, and Mathematical Tables, Dover, New York, 9th Ed. [1964]を参照願いたい）。ゼータ電位への変換は、所定の適用に関する分布を規定する平均及び標準偏差の知識があれば極めて簡単に理解できる。この実施例において、タンパク質折りたたみに対する測定される洗剤性能はー４０ｍＶと＋２０ｍＶの間のゼータ電位値の範囲である。８０％の変異体折りたたみ最適条件（つまり、ｚ＝±０．６５）以上の洗剤性能を有する変異体は−１７．０８ｍＶと−２．２８ｍＶの間のゼータ電位値の範囲である。９０％の変異体折りたたみ最適条件（つまり、ｚ＝±０．４６）以上の洗剤性能を有する変異体は−１４．９２ｍＶと−４．４４ｍＶの間のゼータ電位値の範囲である。
異なる基質汚れ（例えば草、体の汚れ、トマト）は同じ製剤下異なるゼータ電位を有し、同じ基質汚れは異なる製剤（例えば、北アメリカＨＤＬ、ヨーロッパ粉状食器洗浄洗剤）下異なるゼータ電位を有する。にもかかわらず、基質汚れ電荷は多様であるが、正規分布の標準偏差は一定を維持すると期待される。所定の洗剤製剤における酵素及び基質ゼータ電位の情報は、最適性能レベルを達成するために、その変異体に対する予想する性能レベル並びに必要とされる電荷変化の方向及び強度の迅速な同定を可能とする。所望の反応媒体における基質ゼータ電位の測定はその媒体における粒子状基質の酵素反応の最適化を可能とする。任意の媒体における任意の酵素反応は同様の方法を用いて最適化できる。
幾つかの実施態様において、汚れに特異的な酵素は所定の条件下特異的な汚れへの酵素性能を最適化することにより得られる。これは、汚れ除去条件下汚れのゼータ電位を測定し、それから同じ条件下（例えば、最適性能の少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、又は約９９％に相当するゼータ電位）実質的に同等であるゼータ電位を有する変異体を生産するために改変することにより達成される。幾つかの実施態様においては、遺伝子的又は化学的修飾により酵素の表面上に一以上のアミノ酸を修飾することにより達成される。他の実施態様においては、汚れ‐特異的酵素は標的範囲内のゼータ電位を有する酵素を同定するためにプローブ酵素の天然からの単離物又は相同体をスクリーニングすることにより得られる。この実施例はＢＭＩ汚れを洗浄すること示すけれども、本発明の方法も草、ワイン、又は尿であってこれらに限定されない他の汚れの洗浄を最適化するときに用いるのに有用である。同様に、この実施例はセリンプロテアーゼ活性を示すけれども、本発明の方法もプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ポリエステラーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、マンナーゼ、及びオキシドレダクターゼであってこれらに限定されない他の酵素の活性を最適化するときに用いるのに有用である。
実施例８
基質汚れへの酵素の分配
この実施例は酵素電荷、基質汚れ分配及び洗浄性能の関係を決定することを記載する。図１３及び次の表は、多様なイオン強度の下５ｍＭ ＨＥＰＥＳｐＨ８．０緩衝液におけるＡＳＰ電荷ラダープローブタンパク質の洗浄性能を示し、減少により測定される基質汚れへの酵素分配に応じたＢＭＩ微小布見本活性として測定される。イオン強度を通常の電解質、２．５ｍＭ ＮａＣｌ（白色丸）、１６ｍＭ ＮａＣｌ（灰色丸）、及び１００ｍＭ ＮａＣｌ（黒色丸）の多様な量の添加により制御した。ＡＳＰ電荷ラダープローブタンパク質のＢＭＩ洗浄性能は低い又は高い酵素と基質の分配両方で落下する。洗浄能力に対する最適分配は結合酵素フラクションの０．１と０．５の間で起こる。酵素と基質分配が低いとき低い性能が予想されるけれども、酵素と基質分配が高いときでの低い性能の観察は直感で理解できない。
Figure 2010528656
Figure 2010528656
Figure 2010528656
図１４は、多様なイオン強度（丸）下及びＡＡＴＣＣ ＨＤＬ洗剤（三角）下、５ｍＭ ＨＥＰＥＳｐＨ８．０緩衝液での野生型ＡＳＰに比較した電荷に応じて結合酵素フラクションを示す。この図の結果から、野生型ＡＳＰと比較して極端な負（−５）電荷は基質汚れに対する極めて低い酵素分配をもたらし、従って、低塩条件における洗浄性能が低い。同様に、この図の結果から、野生型ＡＳＰと比較して極端な正（＋３）電荷は基質汚れに対する過剰な酵素分配をもたらし、従って低塩条件における洗浄性能が低い。
同様に、図１５に示すように、２．５ｍＭ ＮａＣｌ含有５ｍＭ ＨＥＰＥＳｐＨ８．０緩衝液におけるＡＳＰ電荷組合せライブラリーの全部に関する正味電荷変化に対する酵素結合フラクションのプロットはＡＳＰ電荷ラダー変異体で得られたプロットと似ていた。再度プローブタンパク質（例えば、電荷ラダー）の使用はライブラリー全体の性質を反映した。つまり、ＡＳＰ電荷ラダープローブタンパク質の使用は基質汚れへの酵素の分配のための最適化電荷の迅速な同定を可能とする。この場合、野生型ＡＳＰと比較して−２と＋２の間の正味電荷範囲は０．１と０．５内の結合フラクションに相当し、低塩条件における洗浄性能に最適である。これは、酵素基質結合を調節するためのタンパク質物理的性質（この場合正味電荷／疎水性であるが）の最適化の例である。
図１６は２．５ｍＭ ＮａＣｌ含有５ｍＭ ＨＥＰＥＳｐＨ８．０緩衝液における酵素ゼータ電位に応じて基質汚れに結合する酵素フラクションを示す。予想したように、すべてのプロファイルは、添加した通常の電解質の同じ量で図１４において記載したのと同様であった。基質汚れゼータ電位は−８．９７ｍＶに等しい。
理論により束縛されずに、黒丸（例えば−１５ｍＶよりもっと負）として示す負に荷電する酵素変異体は負に荷電する基質汚れに接近すると跳ね返され、結果低い分配となる。反対に白丸（例えば、零に荷電する位置より上）として示す正に荷電する変異体は負に荷電する基質汚れに引きつけられ、結果高い分配となる。つまり、洗浄性能への最適分配である。
一般的に酵素、基質及び溶液条件の任意の組み合わせのために、基質汚れへの分配は同じ条件下測定される基質汚れゼータ電位値で中央に位置するゼータ電位ウィンドウへ限定され、この場合、−８．９７ｍＶである。ゼータ電位ウィンドウの幅は期待する結合フラクションを決定する。例えば、−８．９７ｍＶ±１５ｍＶにより与えられるゼータ電位ウィンドウ３０‐ｍＶ幅は０．１未満（低い結合）及び０．５より大きい（高い結合）の間の基質分配を含む。−８．９７ｍＶ±１０ｍＶにより与えられるゼータ電位ウィンドウ２０‐ｍＶ幅は０．１より大きい及び０．５未満の間の基質分配を含む。−８．９７ｍＶ±５ｍＶにより与えられるゼータ電位ウィンドウ１０‐ｍＶ幅は０．１５と０．４の間がこれらの条件下この基質汚れへの洗浄性能の最適条件と考えられる。
異なる基質汚れ（例えば草、体の汚れ、トマト）は同じ製剤下異なるゼータ電位を有し、同じ基質汚れは異なる製剤（例えば、北アメリカＨＤＬ、ヨーロッパ粉状食器洗浄洗剤）下異なるゼータ電位を有する。にもかかわらず、基質汚れ電荷が多様であるが、正規分布の標準偏差は一定を維持すると期待される。所定の洗剤製剤における酵素及び基質ゼータ電位の情報は、最適性能レベルを達成するために、その変異体に対する期待する性能レベル並びに必要とされる電荷変化の方向及び強度の迅速な同定を可能とする。つまり、所望の反応媒体における基質ゼータ電位の測定はその媒体における粒子状基質の酵素反応の最適化を可能とする。任意の媒体における任意の酵素反応は同様の方法を用いて最適化できる。反対に、裏地マトリックス（つまり、バラスト）のゼータ電位の情報は結合の阻害に用いられる。ＢＭＩ汚れは−８．９７ｍＶのゼータ電位を有するが、汚れのない基本となる綿布地は−１４．４３ｍＶのゼータ電位を有する。
この実施例はＢＭＩ基質汚れのセリンプロテアーゼ分配を示すけれども、本発明の方法はまた他の酵素及び基質の分配を最適化するときの使用に有用である。例えば、本発明の方法は実施例１４に記載のように布地又はバイオマスへのセルラーゼ変異体の分配を最適化するときの使用に有用である。幾つかの実施態様においては、適用条件下処理すべき布地のゼータ電位を測定し、布地のゼータ電位と＋／−３０ｍＶまで差があるセルラーゼ変異体が得られる。これらの変異体は遺伝子工学又は化学修飾により得られた。それから、変異体を繊維適用のための緩衝液又は洗浄適用のための洗剤における適用条件下、表面磨き性能及び引張強度の消失としてスクリーニングする。つまり、最適な表面磨き性能及び最小の引張強度消失を有するセルラーゼ変異体をこの方法を用いて効率的に同定できる。さらに、燃料エタノールの生産への増加される糖化のための植物バイオポリマー基質への最適な結合を有するセルラーゼ変異体をこの方法を用いて容易に同定できる。
実施例９
タンパク質発現
この実施例はタンパク質電荷とタンパク質発現との関係の決定について記載する。
１４Ｌ発酵スケールでのＡＳＰ変異体の生産
１４Ｌスケールにおける流加培養のセットをＡＳＰプロテアーゼ組み合わせ電荷ライブラリー変異体（R14I-N112E-T116E-R123F-R159F、R14I-N112E-T116E-R123F、R14I-N112E-T116E、R14I-N112E、R14I、R14I-D184T、R14I-D184T-T86K、R14I-T86K-D184T-A64K及びR14I-T86K-D184T-A64K- Q81K）であって、−５から＋３の電荷変化を有する変異体の生産レベルと比較して行った。種培養を６００ｍＬの培養培地（ＬＢブロス＋１％グルコース＋２０ｍｇ／Ｌネオマイシン）を含む２Ｌのバッフルの無い振盪フラスコに１ｍＬの各変異体に対応するバシルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）グリセロールストックを播種することにより培養した。培養をＯＤ５５０が０．８から１．５に到達するまで振盪インキュベーターで１７５ｒｐｍにて攪拌を伴いながら３７℃にてインキュベーションした。その時、種培養全部を温度、パーセント溶解酸素（％ＤＯ）、ｐＨ及び攪拌をモニターする統括制御装置を備える１４Ｌの発酵容器へ無菌的に移した。ガスの排出をインラインマススペクトロメーターによりモニターした。用いた発酵培地（７Ｌ）は硫酸塩、微量元素、及び追加の２０ｍｇ／Ｌネオマイシンを含むリン酸ベース緩衝液に１０％大豆ミールから構成された。初期発酵パラメーターを３７℃温度、ｐＨ６．８（実施中水酸化アンモニウムで調整した）、７５０ｒｐｍ攪拌、４０％ＤＯ（実施中空気及び攪拌を調整して維持した）、１１ｓｌｐｍ 空気流量、及び１バール圧力にセットした。抗発泡剤（Mazu DF204）を泡を制御するために必要に応じて加えた。１０時間に対して０．５から２．１ｇ／分のグルコースを直線的に供給する流加培養方法をトリガーとしてｐＨ上昇を用いてプログラム（供給用に６０％グルコースを用いる）した。４時間ごとに行う培地サンプリングは培地全体の１５ｍＬを採取し、次の測定を実施した。それは、分光光度計による細胞密度（５５０ｎｍの吸光度を測定）、ＡＳＰ変異体生産、グルコース、窒素、リン酸及び総タンパク質である。総発酵実施時間は４０と４５時間の間であった。
Ａａａ‐Ｐｎａアッセイを用いたＡＳＰ変異体力価測定
発酵の間に得たバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）培養サンプルを変異体ＡＳＰプロテアーゼの生産のためのアッセイをした。酵素生産物を基質N-スクシニル（ｓｕｃｃｉｎｙｌ）-Ala-Ala-Ala-p-ニトロアニリド（ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）(AAA-pNA)に対して活性をアッセイした。アッセイは加水分解及びｐ‐ニトロアニリド(Estell他、J Biol Chem, 260: 6518-6521 [1985])の放出から得られる４０５ｎｍの吸光度における増加として修飾プロテアーゼの生産物を測定した。発酵装置からのバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）浄化上清の一部を緩衝液中でアッセイした。この緩衝液は１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．０１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．００５％ ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００、ｐＨ８．６を含んだ。野生型ＡＳＰ標準物をｇ／Ｌの発酵培地におけるタンパク質生産の計算のための検量線を作成するために用いた。
図１７は野生型ＡＳＰに比較した正味電荷に応じてバシルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるＡＳＰ電荷ラダープローブタンパク質の発現レベルを示す。この図からわかるように、野生型ＡＳＰに比較して極端に負の（−５）又は正の（＋３）の電荷の蓄積により低い発現をもたらす。ＡＳＰ電荷ラダープローブタンパク質の使用は所定の宿主有機体における発現を改善する最適正味電荷の迅速な同定を可能とする。この場合、野生型ＡＳＰに比較して−２と＋１の間の正味電荷範囲が最適発現レベルに相当する。電荷最適条件それ自身、ＡＳＰ（−２）を見ると、極端に電荷変化を有する変異体と比較してほぼ４倍の改善が観察された。振盪フラスコレベルでのこれらの観察を１４Ｌ発酵装置スケールで確認した。表９−１は１４Ｌ発酵装置における発現の二つの測定である、４０時間でのＡＳＰおおよその力価並びに発現曲線の直線部分から算出されるＡＳＰ生産を示す。振盪フラスコ力価を参照として最終カラムに表示する。すべての力価はＡＳＰ‐Ｒ１４Ｉレベルに標準化した。野生型ＡＳＰに比較して−２と＋１の間の正味電荷範囲が発酵装置スケールでの最適発現レベルに相当する。これは、全く異なる利点、この場合組み換えタンパク質発現、を調節するためにタンパク質の物理的性質、この場合正味電荷、を最適化する別の実施例である。
Figure 2010528656
宿主細胞におけるタンパク質の発現及び分泌は多くの宿主のタンパク質と発現タンパク質の相互作用に関係する。宿主細胞タンパク質、特に律速相互作用と発現タンパク質の最適な相互作用はタンパク質生産に重要である。この相互作用は発現タンパク質（又は宿主細胞タンパク質）の表面電荷／疎水性の修飾により最適化できる。にもかかわらす、関与する作用機構の情報は本発明を作成し使用するために必要でない。
図１８はゼータ電位に応じてバシルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における二つの異なる発現レベルを示す。セリンプロテアーゼＡＳＰの発現を黒丸で示し、一方メタロプロテアーゼＮｐｒＥを白丸で示す。これらのプロテアーゼを野生型酵素に比較して少なくとも８電荷の範囲を測定する。すでに説明したように、発現に関して正味電荷最適条件がある。２．５ｍM ＮａＣｌ含有５ｍＭ ＨＥＰＥＳｐＨ８．０のような標準溶液におけるゼータ電位のような共通の電荷スケールはふたつの非常に異なるタンパク質折りたたみを有する発現レベルの比較を可能とする。タンパク質発現はゼータ電位ウィンドウ ４０‐ｍＶの幅、この場合−４０ｍＶと＋２０ｍＶの間に限定される。ちょうどＢＭＩ性能のように、酵素ゼータ電位を関数としてバシルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるＡＳＰ及びＮｐｒＥの発現レベルは標準正規分布により十分記載され、これは実線にて示され、平均μは−８．９２ｍＶに等しく、標準偏差σは８．９５ｍＶ及びピーク値は１８１（培養１リットル当たりのｍｇタンパク質）を有する。この分布は上のＸ軸に表示のＺスコアに応じて右Ｙ軸表示のピーク値により発現レベルを割ることにより標準簡略座標として示される。Ｚスコアは（Ｘ−μ）／σとして通常定義される。ここで、この場合のＸはゼータ電位である。正規分布は所定の培養条件（例えば、ｐＨ、導電率、塩のタイプ、鉱物等）下、各宿主有機体に対して特徴的である。タンパク質折りたたみにわたって最適発現レベルは−８．９２ｍＶに等しい分布平均で生じる。
標準正規分布の性能レベルは表９−２に示すようにｚスコアの観点から便宜的に記載される。ゼータ電位の転換は、所定の適用のための分布を特徴付ける平均及び標準偏差の直接的与えられる情報である。この実施例において、すべて測定される発現レベルは−４０ｍＶと＋２０ｍＶの間のゼータ電位値に限られる。８０％のタンパク質折りたたみ最適条件（つまり、ｚ＝±０．６５）以上の発現レベルを有する変異体は−１４．７３ｍＶと−３．１１ｍＶの間のゼータ電位値に限られる。９０％の変異体折りたたみ最適条件（つまり、ｚ＝±０．４６）以上の発現レベルを有する変異体は−１３．０３ｍＶと−４．８０ｍＶの間のゼータ電位値に限られる。他の性能レベル、ｚスコア及びゼータ電位範囲の変換を示す。
Figure 2010528656
所定の生産宿主において発現する既存タンパク質のゼータ電位の情報は異なるタンパク質折りたたみを有し、しかし同じ条件下測定する場合比較できるゼータ電位を有するタンパク質の期待する発現レベルの迅速な同定を可能とする。さらに、ゼータ電位の情報は最適な発現レベルを達成するために必要とする電荷変化の方向及び強度の決定を可能とする。同じ培養条件下異なる折りたたみを有するタンパク質の発現レベルが、同じ有機体内で比較できる場合（又は相当な系統発生的相同体を有する有機体内）、この方法の適用はバシルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を越えて適用できる。
実例として、バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における増加されるタンパク質発現のためのＮｐｒＥの電荷最適化を記載する。
段階１は少なくとも一つのＮｐｒＥ変異体の発現レベル並びに同じ条件下同じ宿主及び培養においてクローン化されるＡＳＰ電荷ラダープローブの発現を測定することに関係する。例えば、野生型ＮｐｒＥと比較して４つの正に電荷する変異体を有するＮｐｒＥ変異体をバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）にて発現する。ＡＳＰプローブタンパク質の系列は発現の電荷最適条件存在を示す（図１７）。この最適条件は野生型ＡＳＰと比較してマイナス２の電荷を有するＡＳＰ変異体に存在する。ＮｐｒＥへの電荷変化の方向及び強度を決定するために、ＡＳＰプローブタンパク質及び親ＮｐｒＥを共通の電荷スケールにて比較しなければならない。
段階２は同じ溶液条件下ＡＳＰ電荷ラダープローブタンパク質及びＮｐｒＥ変異体のゼータ電位を測定する（又は計算する）ことに関係する。この場合、低イオン性標準緩衝液を電荷効果の遮蔽を最小にするために用いる。適切な標準溶液は２．５ｍM ＮａＣｌ含有５ｍＭ ＨＥＰＥＳｐＨ８．０である。
すでに述べたように、図１８は標準溶液において測定するゼータ電位に応じてＡＳＰプローブタンパク質の発現レベルを示す。この図に示すＮｐｒＥ（＋４）変異体はゼータ電位値１３．２４ｍＶを有し、タンパク質発現の低いレベルに相当する（例えば、１リットル培地の当たり３３．７ｍｇタンパク質）。バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において高いレベルので発現できるＮｐｒＥ変異体を得るために、このＮｐｒＥ変異体は−８．９２ｍＶに等しい正規分布平均ゼータ電位μにより規定されるピーク値で又はその付近でエンジニアリングされる。これはこの宿主において１リットル培地当たり約１８１ｍｇに等しい最適発現レベルに相当する。ゴールに到達するために、より負のＮｐｒＥ変異体を得る（これは必要とする電荷変化の方向性である）。必要とする電荷変化の強度は−８．９２ｍＶ−（１３．２８ｍＶ）＝−２２．２ｍＶにより与えられる。これは電荷コンストレイント（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）である。
段階３はこの実施例におけるタンパク質工学を通して所望のＮｐｒＥ変異体を得ることに関係する。所望のＮｐｒＥ変異体を得るための他の可能性は天然単離、グリコシレーション、又は所望のゼータ電位に適合する化学的修飾から選択を含む。式（０．７）はタンパク質工学の取り組みを導くために用いる。ＮｐｒＥは２．６５４ｎｍに等しい流体力学半径を有し、例えば、高いイオン強度光散乱により測定され、流体力学半径への二重層力の寄与を除く。式（０．３）に従って、デバイ長ｋ−１はゼータ電位測定のウェル規定標準溶液条件下２．０８７ｎｍに等しい。すでに特定した物理的定数と共に、式（０．７）にこれらの値を導入後、正味電荷変化ごとに３．０４ｍＶの予想されるゼータ電位変化を算出する。従って、＋４ＮｐｒＥ変異体のゼータ電位ギャップをうめるために−２２．２／３．０４＝−７．３又は７マイナスの電荷を有するＮｐｒＥ変異体をエンジニアリングする。電気泳動の移動における滑り面の位置のような不確定要素のために、通常この計算は必要とする電荷数を過剰に示す（Hunter in "Zeta Potential in Colloid Science", Academic Press, [1981]を参照願いたい）。親ＮｐｒＥに比較して総合的に負電荷を有するＮｐｒＥ変異体を設計する。親ＮｐｒＥの正電荷を低減するアミノ酸置換のタイプを迅速に同定するために、電荷マトリックスを提供する。
図１８に示すように、親ＮｐｒＥ（Ｔ１４Ｒ‐Ｓ２３Ｒ‐Ｎ４６Ｋ‐Ｔ５４Ｒ）と比較して５マイナスである電荷を有するＮｐｒＥ変異体Ｔ６０Ｄは試験されたＮｐｒＥ変異体の発現最適条件に接近する。ＮｐｒＥ変異体Ｔ６０Ｄは−１０．７２ｍＶのゼータ電位及び１リットル培地当たり１７１．９ｍｇに等しい発現レベルを有する。これは親ＮｐｒＥ変異体Ｔ１４Ｒ‐Ｓ２３Ｒ‐Ｎ４６Ｋ‐Ｔ５４Ｒにて得られる値に比較して５倍改善する。
実施例１０
ＬＡＳ及びキレート安定性
この実施例は陰イオン性界面活性剤及びキレートの一つ又は両方を含む反応媒体におけるタンパク質電荷及び安定性の間の関係を決定することを記載する。ストレスが有る及びストレスが無いサンプルのプロテアーゼ活性の決定のために、ｓｕｃ‐ＡＡＰＦ‐ｐＮＡアッセイを用いた。ストレスが有る及びストレスが無いサンプルのアルファ‐アミラーゼ活性の決定のために、ＢＯＤＩＰＹ‐デンプンアッセイを用いた。ストレスのあるプレートからの残渣ＬＡＳ及びＥＤＴＡはｓｕｃ‐ＡＡＰＦ‐ｐＮＡ又はＢＯＤＩＰＹ‐デンプンアッセイに影響を与えない。
試薬は次を含む。
ドデシルベンゼンスルホネート、硫酸ナトリウム（＝ＬＡＳ）、シグマＤ−２５２５
ＴＷＥＥＮ（商標）−８０：シグマＰ−８０７４
ＴＲＩＳ緩衝液（酸を含まない）、シグマＴ−１３７８、６．３５ｇを９６０ｍｌの水に溶解し、ｐＨを４Ｎ ＨＣｌで８．２に調整する。ＴＲＩＳの最終濃度は５２．５ｍＭである。
ＬＡＳストック溶液、ＭＱ水中１０．５％ＬＡＳ溶液（＝１０．５ｇ／１００ｍｌＭＱ）、
ＴＲＩＳ緩衝液、１００ｍＭ／ｐＨ８．６（１００ｍＭＴｒｉｓ／０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０）、及び
ＴＲＩＳ−Ｃａ緩衝液、ｐＨ８．６（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／１０ｍＭＣａＣｌ２／０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０）。
設備機器は次を含む。
フラットボトムＭＴＰ、Ｃｏｓｔａｒ（＃９０１７）、
バイオメックＦＸ、
ＡＳＹＳマルチピペッター、
スペクトラマックスＭＴＰリーダー、
ｉＥＭＳインキュベーター／シェーカー、
イノーバ４３３０インキュベーター／シェーカー、
バイオヒットマルチチャンネルピペット、及び
ＢＭＧサーモスターシェーカー
である。
ＬＡＳ安定性は、０．０６％ＬＡＳ（ドデシルベンゼンスルホン酸 ナトリウム）の存在下で試験プロテアーゼをインキュベーションした後に測定し、残余活性をＡＡＰＦ‐ｐＮＡッセイに用いて決定した。０．０６３％ＬＡＳ溶液を５２．５ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．２中で調製した。このＡＡＰＦワーキング溶液は、１ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌ ＡＡＰＦストック溶液（ＤＭＳＯ中）を１００ｍｌ（１００ｍＭ）ＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ８．６に添加して調製した。上清を希釈するために、平底プレートを希釈緩衝液で満たし、上清の一部分を添加して、よく混合した。希釈の比は培養プレート中のＡＳＰコントロールの濃度に依存する（ｓｕｃ‐ＡＡＰＦ‐ｐＮＡ活性）。所望のタンパク質濃度は８０ｐｐｍであった。
１０μｌの希釈した上清をウェルごとに１９０μｌの０．０６３％ＬＡＳに添加した。このＭＴＰをテープで覆い、数秒振盪し、２５℃又は３５℃の温度で、２００ｒｐｍの攪拌速度のインキュベーター（イノーバ４２３０）に６０分置いた。初期活性（ｔ＝１０分）を、インキュベーションの１０分後に各ウェルの１０μｌの混合物を１９０μｌのｓｕｃ‐ＡＡＰＦ‐ｐＮＡワーキング溶液を含む新しいＭＴＰに移すことにより決定した。これらの溶液を十分混合してｓｕｃ‐ＡＡＰＦ‐ｐＮＡ活性をＭＴＰリーダー（２５℃において５分間で２５回測定する）を用い測定した。
最終活性（ｔ＝６０分）をインキュベーションの６０分後にインキュベーションプレートから別の１０μｌの溶液を採取して決定した。このｓｕｃ‐ＡＡＰＦ‐ｐＮＡ活性を上で述べたのと同様の方法で決定した。計算は以下のように行った。
％残余活性＝［ｔ＝６０の値］＊１００／［ｔ＝１０の値］
図１９は２２９変異体を含むライブラリーに関し野生型ＡＳＰに比較して正味電荷変化に応じてＬＡＳ安定性を示す。このライブラリーは変異Ｒ１４Ｉを有する親ＡＳＰ分子に比較していくつかの正味電荷にわたって設計及び構築（例えば、US Pat. Appln. Ser. Nos. 10/576,331 and 11/583,334を参照願いたい）された。洗剤安定性を１０分のみのインキュベーションに対して６０分間ＬＡＳ中にインキュベーション後の残余活性の比率の観点から測定した。図からわかるように、野生型ＡＳＰに比較して負の電荷（−５まで）の蓄積がＬＡＳ安定性に対して良い効果がある。複合液体洗濯環境におけるタンパク質安定性を改善するために、これはタンパク質物理的性質、この場合正味電荷を最適化する実施例である。
ＬＡＳ／ＥＤＴＡ安定性
試薬は次を含む
コントロール緩衝液：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−８０、ｐＨ８．０、及び
ストレス緩衝液：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％（ｗ／ｖ）ＬＡＳ（ドデシルベンゼン‐スルホン酸、ナトリウム塩 シグマＤ−２５２５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
酵素変異体（２０ｐｐｍ）をコントロール緩衝液又はストレス緩衝液いずれかを含む９６穴非結合平底プレートへ１：２０に希釈し、混合した。コントロールプレートを室温にてインキュベーションし、一方ストレスプレートはすぐに３７℃にて３０から６０分間（試験される酵素の安定性次第）放置する。インキュベーション後、酵素活性をプロテアーゼに関してｓｕｃ‐ＡＡＰＦ‐ｐＮＡアッセイ及びアミラーゼに関してＢＯＤＩＰＹ‐デンプンアッセイを用いて測定した。活性を維持しているフラクション又は活性残渣を有するフラクションはコントロールサンプルの反応速度で割ったストレスを有するサンプルの反応速度に等しい。親酵素及び変異体はコントロール緩衝液にて６０分間安定である。
図２０は８０変異体を含むライブラリー関して親ＦＮＡに比較した正味電荷変化に応じてＬＡＳ／ＥＤＴＡ安定性を示す。このライブラリーを実施例２に記載の方法に従って親ＦＮＡ分子に比較していくつかの正味電荷にわたって設計及び構築した。図からわかるように、親ＦＮＡに比較して負の電荷（−４まで）の蓄積が結合ＬＡＳ／キレート安定性に対して良い効果がある。複合液体洗濯環境におけるタンパク質安定性を改善するために、これはタンパク質物理的性質、この場合正味電荷、を最適化する実施例である。
ＡＳＰ及びＦＮＡにはＬＡＳ／ＥＤＴＡ安定性に関して電荷依存性が有る。負電荷を追加すると安定性が増加する。しかし、親より一以上の電荷がより正へ移行する場合、本方法により、親と等しいまたは親より大きい安定性を獲得する電荷変異の調整を見つけることができる。また、このアプローチは図２１に示すＴＳ２３ｔ’のような大きな酵素に効果的であり、ここで安定性における追加する正電荷の有害な効果は安定性が増加するように最適電荷調整によりバランスをとることができる。
実施例１１
熱安定性
この実施例はタンパク質電荷及び熱安定性の間の関係を決定することを記載する。プロテアーゼアッセイは、緩衝化された培養上清を加熱する前と加熱した後のジメチルカゼイン（ＤＭＣ）加水分解に基づいた。アミラーゼアッセイは培養上清を加熱する前と加熱した後のＢＯＤＩＰＹデンプン加水分解に基づいた。実施例１で述べられたように同一の化学試薬と試薬溶液がこれらのアッセイに使用された。
プロテアーゼに対する熱安定性アッセイ
ろ過された培養上清をＰＩＰＥＳ緩衝液で２０ｐｐｍに希釈した（培養プレートのコントロールの濃度に基づく）。最初に、１０μｌの各稀釈酵素サンプルを採り、ジメチルカゼインアッセイで初期活性を決定し、下記のように処理した。次に、５０μｌの各希釈上清をＭＴＰの空のウェルに加えた。ＭＴＰプレートを６０℃、４００ｒｐｍで９０分間ｉＥＭＳインキュベーター／シェーカーＨＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）にてインキュベーションした。このプレートを氷で５分間冷却した。次に、インキュベーション後の最終活性を決定するため、１０μｌのこの溶液を２００μｌのジメチルカゼイン基質／ウェルを含む新しいＭＴＰへ加えた。このＭＴＰをテープで覆い、数秒振盪し、撹拌せずに２時間３７℃でオーブンに置いた。
サンプルの残余活性を最終吸光度及び初期吸光度の比率として、両者ともブランクで修正し、表わした。図２２はＳＥＬライブラリーに関して野生型ＡＳＰに比較した正味電荷変化に応じて熱安定性の指標を示す。より高い指標がより熱安定性を有する変異体を示す。図からわかるように、野生型酵素に比較して極端に負（−２）又は正（＋２）の蓄積は熱安定性に有害である。野生型ＡＳＰに比較した正味電荷変化の０点にて中心とする熱安定性の顕著な電荷最適条件がある。液体洗濯適用における酵素熱安定性を改善するために、これはタンパク質物理的性質、この場合正味電荷、を最適化する実施例である。
アルファ‐アミラーゼに対する熱安定性アッセイ
ろ過された培養上清を２ｍＭ ＣａＣｌ２、００２％ Ｔｗｅｅｎ含有５０ｍＭ 酢酸ナトリウムｐＨ５．８で滅菌的に希釈した。１０μｌの各稀釈酵素サンプルをＢＯＤＩＰＹデンプンアッセイで初期アミラーゼ活性を決定した。５０μｌの各希釈上清をＶＷＲ低プロファイルＰＣＲ９６のウェルに置いた。３０μＬのミネラルオイルをシール剤として各ウェルに加えた。プレートを親酵素の安定性次第で９５℃、３０又は６０分間でBioRad DNA engine Peltier Thermal Cyclerでインキュベーションした。インキュベーション後、このプレートを５分間４℃に冷却し、それから室温に放置した。次に、実施例１に記載のようにＢＯＤＩＰＹデンプンアッセイにより最終アミラーゼ活性を決定するため、１０μｌの各サンプルを新しいプレートへ加えた。
熱安定性の計算
サンプルの残余活性を最終吸光度及び初期吸光度の比率として、両者ともブランクで修正し、表わした。また、これらの観察をアミラーゼ電荷変異体で行った。図２３は野生型に比較した電荷変化に応じて第一ＡｍｙＳ電荷ラダーの残余活性を示す。より高い指標がより熱安定性を有する変異体を示す。再度、野生型酵素に比較して極端に負（−１２）又は正（＋１０）の蓄積は熱安定性に有害である。液体洗濯適用における酵素熱安定性を改善するために、これはタンパク質物理的性質、この場合正味電荷、を最適化する実施例である。
実施例１２
熱活性
この実施例にてタンパク質電荷及び温度に依存する反応速度の間の関係を決定することを記載し、ここで熱活性は一つの兆候である。
洗浄条件中の安定性アッセイ
このアッセイは、緩衝化された培養上清を加熱する前と加熱した後のｓｕｃ‐ＡＡＰＦ‐ｐＮＡ加水分解アッセイに基づく。実施例１におけるｓｕｃ‐ＡＡＰＦ‐ｐＮＡ加水分解アッセイで述べられたように同一の化学試薬と試薬溶液が使用された。
方法
ろ過された培養上清を０．００５ｗｔ％ＴＷＥＥＮ８０含有１００ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．６で４００ｐｐｍに希釈した（培養プレートのコントロールのタンパク質濃度（ＢＣＡによる）に基づく）。最初に、各アッセイ用に２０倍希釈を作成する。それから１０μＬの希釈サンプルを１９０μＬの２．５ｍＭ ＮａＣｌ含有５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ８．０に加えた。各ウェルにおける予想する最終酵素濃度を１ｐｐｍのオーダーであった。ＭＴＰプレートを３０分、３０℃又は４０℃にて、４００ｒｐｍでｉＥＭＳインキュベーター／シェーカーＨＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）にインキュベーションした。次に、ｓｕｃ‐ＡＡＰＦ‐ｐＮＡアッセイで初期活性を決定するため、１０μｌの各希釈酵素サンプルを採取し、７分及び３０分両方にて上記記載のように処理した。
洗浄条件中の安定性の計算
サンプルの残余活性を７分でのｓｕｃ‐ＡＡＰＦ‐ｐＮＡ加水分解速度で割った３０分でのｓｕｃ‐ＡＡＰＦ‐ｐＮＡ加水分解速度の比率として表わし、両者ともブランクで修正した。
幾つかの実施態様においては、異なる反応温度での改善される性能のために酵素をエンジニアリングすることは好ましい。例えば、世界的エネルギー節約の流れの一部として、冷水洗浄の場合のように低下する温度で操作可能な洗剤プロテアーゼを開発する必要性がある。所定の酵素‐基質反応にとって、総合的な反応活性障壁は触媒作用（化学変換の活性エネルギーの障壁）及び物理的（基質及び／又は生産物への結合のエンタルピー）時期の合計である。発熱反応は低い温度で速い速度で促進することは良く知られ、一方、吸熱反応はより高い温度で速い速度で促進する。この現象は化学熱力学におけるファントホッフ方程式によりよく記載され、温度における変化をエンタルピー変化を与える平衡定数における変化に関連付ける（Laidler, "Chemical Kinetics", Harper Collins 3rd Ed. [1987]を参照願いたい）。また、部分的モル熱容量又は活性エネルギー障壁について記載する。活性部位から離れたアミノ酸置換は化学触媒に対する活性障壁に影響しないけれども、それらは基質及び／又は生成物に結合エンタルピーに影響する。従って、低温で反応速度を増加するために、結合している期間の酵素エンタルピーをエンジニアリングし、触媒段階のみに関与する反応のエンタルピーにかかわらず、反応の全体的な発熱エンタルピーを促進する。反対に、高温で反応速度を増加するために、結合している期間の酵素エンタルピーをエンジニアリングし、触媒段階のみに関与する反応のエンタルピーにかかわらず、反応の全体的な吸熱エンタルピーを促進する。これを達成するためのひとつの戦略は、酵素の電荷の変化又は疎水性を通してできる。
図２４は野生型プロテアーゼに比較したＡＳＰ及びＮｐｒＥ電荷ラダータンパク質プローブの正味電荷変化に応じて、３０℃での初期洗浄活性と比較して増加温度にて維持するＢＭＩ微小布見本活性を示す。１未満の維持する活性分画は高温にて活性がより低い酵素（例えば、発熱的）変異体を示し、つまり、低温での性能に有用である。反対に、１より高い維持する活性分画は高温にて活性がより高い酵素（例えば、吸熱的）変異体を示し、つまり、より高温での性能に有用である。この図にて示すように、野生型プロテアーゼよりもっと負の電荷を有する変異体は発熱的である一方、より正の電荷を有する変異体は吸熱的である。変異体の安定性が劇的に影響しない場合にこの情報を変化した温度での優れた性能を有する酵素を効率的に得るために適用できる。実際に、図２６はＡＳＰ変異体の安定性が３０℃及び４０℃両方に維持されることを示す。
反応の総エンタルピーに対する結合のエンタルピーの寄与はしばしばなおざりにされ、反応速度について改善は触媒段階に起因すると単に仮定される。実際に、酵素が熱安定である場合、アレニウスの法則（前述のLaidlerを参照）の或る変化によれば、反応速度は温度と共に増加することだけ予想できる。本明細書に示すように、発熱性ＡＳＰ及びＮｒｐＥ変異体（それらの野生型プロテアーゼに関して陰性）は、高い温度で活性が低く、明らかにこの仮定に矛盾する。液体洗濯適用における規定温度にて酵素反応速度を改善するために、これはタンパク質物理的性質、この場合正味電荷、を最適化する実施例である。つまり、ＡＳＰ又はＮｐｒＥ電荷ラダープローブタンパク質の限定セットの使用はこれらのタンパク質折りたたみ内の吸熱性及び発熱性変異体の迅速な同定を可能とする。特に、ゴールが改善される冷水洗浄性能のための酵素を同定することである場合、本発明は研究を発熱性変異体に限定することを教示する。
他のタンパク質折りたたみにわたってこれらの発見を適用のための基準セットを工夫するために共通のスケールにおける電荷効果を記載することが必要である。図２５は、同じ条件（反応緩衝液は２．５ｍＭ ＮａＣｌ含有５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０）下測定されるＡＳＰ及びＮｐｒＥ電荷ラダータンパク質プローブのゼータ電位に応じて３０℃にて初期活性と比較して増加温度にて維持するＢＭＩ微小布見本活性を示す。同じ条件下測定する場合、ゼータ電位基質汚れの値、非固定ＢＭＩ、は−８．９７ｍＶに等しい。予想通りに各曲線の全体のプロファイルは野生型プロテアーゼに比較した正味電荷として表示する電荷を有する図２４と同様である。さらに、ゼータ電位の情報はこれらの条件下、実際に陽性の変異体（零電荷の点以上、例えば、０ｍＶ）が吸熱性であることを示し、一方陰性の変異体は発熱性であることを示す。自然からの単離、化学的修飾、及びタンパク質エンジニアリングを通して低温洗浄適用に有用な酵素を探す時、本発明は、これらの条件下、負にゼータ電位に制約する任意のタンパク質折りたたみからタンパク質を同定する指針を提供する。手短に言えば、所望の物理的性質（例えば、ＡＳＰ電荷ラダー）を測定するプローブタンパク質の使用は、所望のもの（例えば、所望の試験における好ましい結果を有するタンパク質変異体）の迅速な同定のための基準を提供する。
本発明の方法を任意の酵素、基質及び反応媒体の組み合わせに当てはめてよい。特に、発熱性又は吸熱性の作用を示すゼータ電位値は所定の製剤環境における酵素及び基質電荷の作用である。この場合、基質に比較して反対の表示の酵素変異体は吸熱性である。これは０mＶで又は付近で傾きの変化により顕著に表示され、零電荷の位置でタンパク質がすぐに表示を変える。理論に束縛されずに、反対に荷電する酵素及び基質（又は反応生成物）は強固に結合し及び化学的触媒変換段階（例えば拡散‐律速）より長く接触を維持する。これは次の反応を行うことのできる酵素の濃度を限定する。従って、熱エネルギーの追加は酵素性能を改善する。なぜなら、基質（又は生成物）複合体から酵素の分離を助け、つまり非生産的結合量を低減するからである。酵素、基質及び製剤環境の任意の所定の組み合わせに関して、発熱性及び吸熱性変異体の範囲は零電荷の位置及び基質電荷に作用する。もし基質が負に荷電されるという適用条件下、吸熱性変異体は正のゼータ電位値に制限され又は零電荷の位置の右側に制限される。反対に基質が正に荷電される場合、吸熱性変異体は負のゼータ電位値に制限され、又は零電荷の位置の左側に制限される。一般的に酵素及び基質のゼータ電位の生成物は吸熱性変異体に対して陰性であり、発熱変異体に対して陽性である。
つまり、ＡＳＰ又はＮｐｒＥ電荷ラダープローブタンパク質の限定セットはこれらのタンパク質折りたたみ内で吸熱性及び発熱性変異体の迅速な同定を可能とする。特に、ゴールが改善される低温洗浄性能に対する酵素の同定である場合、本発明は研究を発熱性変異体に限定する。
この方法は多様な温度、デンプン液化におけるアミラーゼ、バイオマス分解におけるセルラーゼ及び低温及び高温いずれかにて熱活性を必要とする任意の酵素の洗浄酵素に対するプロテアーゼの改良に適用できる。電荷の蓄積が有害である環境下、例えば熱安定性又は触媒段階の効率性に対して、対立する性質のバランスをとるためのＵＳ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ６０／９３３，３３１に記載する方法の使用はこのアプローチを用いる熱活性を達成するために有用である。
実施例１３
アミノ酸性質の統計的決定
電荷、疎水性、水素結合等のようなアミノ酸の特徴はタンパク質の重要な性質である。例えば、荷電される基質、タンパク質の表面電荷又は全体の電荷は活性に重要なようだけれども、疎水性は溶解性に重要なようだ。タンパク質性能にとって重要であるアミノ酸の性質を同定するために統計的基礎試験を有することは好ましい。そのような試験はアミノ酸の性質及びタンパク質性能の間に相関関係の存在を示すことができる。各アミノ酸の性質にとって、一つのアミノ酸が別のアミノ酸に置換かれる場合性質における変化を非常に反映するスコアがある。アミノ酸置換上性質における変化を予測するためにいくつかのスコアリングマトリックスが存在し又は構築される。この４つの実施例を図に示す。ｐＨ８．６でのおおよその電荷変化に対する電荷変化マトリックスを図２７に示す。水素結合スコアリングマトリックスを図２８に示す。カイト‐ドーリットル ハイドロパシシティー（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）マトリックスを図２９に示す（Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、上記参照）。最後に、アイゼンバーグ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）疎水性 マトリックスを図３０に示す(Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ他、上記参照)。
ＡＳＰプロテアーゼ（WO 2005/052146）対する部位評価ライブラリーデータのような変異体データの任意のセットに対して、データを任意の切捨て値（＞１００％ｗｔ活性、＞５０％ｗｔ活性又は＞５％ｗｔ活性のような）より良い、及び悪いそれらの変異体へ挿入することができる。アミノ酸スコアリングマトリックスを各アミノ酸置換にスコア値を与えるために用いてよい。便宜上、スコアを（電荷スコア）として又はクインタイル（Ｑｕｉｎｔｉｌｅ）（ハイドロパシシティー、疎水性、水素結合）に解析して用いてよい。例えば、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシシティーにおいて、スコアを−２クインタイル（スコア＜−４）、−１クインタイル（スコア−４と−１の間）、０クインタイル（スコア−１と＋１の間）、＋１クインタイル（スコア１と４の間）及び＋２クインタイル（スコア４より大きい）に分割する。簡単なカウントは切り捨て値を超える多くの変異体からなり及びアミノ酸の性質に関して特定のスコア又はスコア範囲を有する多くの変異体からなる。切捨て値以上及び以下である変異のパーセント及び所定のスコア又はスコア範囲を有するアミノ酸変化のパーセントから、各クラスの予想される数はアミノ酸の性質及び性能の間の非相関関係に基づいて計算されてよい。これは、実測される数と比較でき、予想される実測の比率を計算できる。１より非常に大きい比率は性能と性質の正の相関関係の指標であり、１より小さい比率は性能と性質の負の相関関係の指標である。アミノ酸スコアの１０のランダムシャッフルのセットを作成し、１０の実測／予測（ｏ／ｅ）比率をランダムデータセットとして計算できる。それから、結果を平均し、ランダムデータの標準偏差を決定する。実際のｏ／ｅ比率をランダム化平均と比較でき、ランダム化標準偏差に基づいて１，２、又は３のシグマレベルにて有意として決定できる。ＡＳＰ、アシルトランスフェラーゼ（ＡＣＴ）、及びＡｍｙＳの結果を表１３−１、１３−２及び１３−３にそれぞれ示す。１シグマレベルで有意である実測／予測比率は太字で示す。
Figure 2010528656
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表１３−１は、図２７（ΔＣＨＲＧ）におけるマトリックスに基づいて電荷変化スコアに比較して野生型（ΔΔＧ＜０）より有意なＡＳＰ変異体の計算を示す。ケラチン（ＫＥＲ）及びＡＡＰＦ活性並びにＢＭＩ活性、ＬＡＳ、熱（ＴＨＥＲ）安定性に対して３シグマレベルにて有意である電荷変化の強い効果がある一方、カゼイン（ＣＡＳ）活性及びバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるタンパク質発現（タンパク質）は効果が明白ではない。また、表１３−１は水素結合（ΔＨＢ）の値を示し、水素結合能力の消失を意味する−２のスコアを有する。この酵素及びこれらの性質に関して、低減する水素結合は一般的に優れている。さらに、表１３−１はカイト‐ドーリットル ハイドロパシシティー（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）（ΔＫ−Ｄ）及びアイゼンバーグ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）疎水性（ΔＥ）の結果を示す。より明白な効果を示すＥｉｓｅｎｂｅｒｇスケールを用いてすべての性質の有意な疎水性効果がある。
表１３−２は、過酸形成（ＰＡＦ）、過酸分解（ＰＡＤ）及び大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)中のタンパク質発現におけるＡＣＴ（US Pat. Appln. Ser. No. 10/581,014を参照願いたい）に関する電荷変化（ΔＣＨＲＧ）及びカイト‐ドーリットル ハイドロパシシティー（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）（ΔＫ−Ｄ）の効果を示す。明らかに、電荷及び疎水性のようなアミノ酸置換の特性がバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)の発現レベル並びにタンパク質の基礎活性及び安定性に影響を与える。
表１３−３は、５，１０、及び６０分（ＣＦ５、ＣＦ１０、ＣＦ６０）でのトウモロコシ粉加水分解、ｐＨ４．０及び５．８（ｐＨ４．０、ｐＨ５．８）でのＤＰ７基質活性、ｐＨ８．６及び１０でのコメデンプン洗浄（Ｃｌｅａｎ８及びＣｌｅａｎ１０）、及びバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるタンパク質発現）（ＥＸＰ）に対する野生型より優れたＡｍｙＳ変異体の計算を示す。活性における電荷の効果は発現における電荷の効果に対して反対の方向を有する。また、水素結合及び疎水性これらの性質に関連性がある効果を統計的に示す。明らかに、電荷及び疎水性のようなアミノ酸置換の特性がバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)の発現レベル並びにタンパク質の基礎活性及び安定性に影響を与える。
Figure 2010528656
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表１３−４は、トウモロコシ粉加水分解（ＣＦ），ＤＰ３及びＤＰ７オリゴサッカロイド基質（ＤＰ３及びＤＰ７）における活性、熱安定性（ＤＰ３ＨＳ）、ｐＨ８．６及び１０でのコメデンプン微小布見本洗浄（Ｃｌｅａｎ８及びＣｌｅａｎ１０）及びバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるタンパク質発現（ＥＸＰ）に関して野生型より優れるＡｍｙＳ変異体に関する計算を示す。洗浄活性は最も強く電荷効果を有する。
実施例１４
多様な電荷を有する基質における反応最適化
周知の方法によりセルロース変換を評価した（例えば、Baker 他、Appl Biochem Biotechnol, 70-72:395-403 [1998]を参照願いたい）。標準的なセルロース転換アッセイを実施例で用いた。このアッセイにおいて、酵素及び基質を容器に加え、室温にて終夜インキュベーションした。反応を１００ｍＭ グリシンｐＨ１１で止め、その結果、反応溶液のｐＨは少なくともｐＨ１０に至る。一度反応が止まると、反応混合物の一部は０．２ミクロン膜を通してろ過をし、固体を除いた。ろ過溶液を上記Baker他に記載の方法に従って、ＨＰＬＣにより可溶性糖に関してアッセイを実施した。
処理済みトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）
（Schell他、J Appl Biochem Biotechnol, 105:69 - 86 [2003]）記載のようにトウモロコシ茎葉を２％ｗ／ｗＨ２ＳＯ４で処理し、脱イオン化水で複数回洗浄してｐＨ４．５を得た。酢酸ナトリウムを最終濃度５０ｍＭになるように加え、溶液をｐＨ５．０に滴定した。反応混合物におけるセルロース濃度を約７％とした。
市販セルラーゼ混合物、Ｓｐｅｚｙｍｅ ＣＰ及びＩｎｄｉａｇｅ ４４Ｌによる糖化の前及び後のＰＣＳの一部を１．５ｍＬエッペンドルフ遠心チューブに入れ、体積の１／３を占めた。サンプルを５分間６，０００ｒｐｍで遠心し、上清をミリＱ（商標）水に交換し、この処理を５回繰り返した。ミリＱ（商標）水中１００ｍｇ／ｍＬストック液を浸漬トウモロコシ茎葉から調製した。ゼータ電位を測定するために、このストック溶液を１ｍｇ／ｍＬになるよう５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０で希釈した。各基質サンプルの１ｍＬを清潔なＭａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ (UK)ディスポーザブルＺｅｔａｓｉｚｅｒ ＮＳ（商標）キュベットへ移した。
表１４−１は糖化反応の過程を通してＰＣＳ基質電荷をゼータ電位として表示し、負として２倍近くになった。理論に束縛されず、正味電荷増加に関して多くの説明があり、リグニン濃縮、この基質の非反応部分、並びに非生産的結合又はセルラーゼ及び他のタンパク質全体のファウリングを含むが、これらに限定されない。実施例８（酵素と基質分配）におけるＢＭＩ微小布見本活性からわかるように、性能（例えば、反応範囲及び反応速度）に関する最適酵素ゼータ電位あり、それは反応媒体条件下基質ゼータ電位と適合する。異なるバイオマス前処理が初期基質電荷に非常に影響してよい。反応過程を通して酵素又は基質が不適合なゼータ電位ならば、酵素‐基質相互作用はもはや最適でないであろう。この効果は１０ｍＶ付近の電荷について飛躍的であり、それはバイオマス変換に関する例である。
この状態を改善する戦略は、多様な電荷に渡る酵素ブレンドを提供すること、新しい最適条件で異なる電荷を有する酵素を異なる反応時間及び／又は変換範囲にて供給される流加培養方法を提供すること、製剤補助剤、特に界面活性剤（イオン性及び非イオン性）又は他のタンパク質の添加を通して基質表面電荷の制御を提供すること、ｐＨ調整を通して基質表面電荷の制御を提供すること、酵素電荷最適条件をシフトするために反応を通してイオン強度の調整を提供すること、膜ろ過、特に反応を通してイオン強度を制御するために逆浸透及びナノろ過を提供すること、塩の放出を通してイオン強度を制御するキレート剤の添加を提供すること、及び前処理工程を通してバイオマス基質電荷の制御を提供することを含むが、これらに限定されない。
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トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ.）セルラーゼ調製の化学的修飾
この実施例はリジン残基をアセチル化するためのコハク酸無水物を用いて市販トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ.）セルラーゼ調製ＬＡＭＩＮＥＸ ＢＧ酵素複合体(ジェネンコー ディビジョン、ダニスコ ユーエス社（Genencor Division, Danisco US, Inc.）)の処理を記載する。ＬＡＭＩＮＥＸ ＢＧ酵素複合体のリジン残基のアセチル化はタンパク質の正味電荷を改変する（例えば、増加する負の電荷）。他の同様な化学的修飾もリジンの正の電荷を負の電荷基（例えば、アセトキシコハク酸無水物（ａｃｅｔｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、マレイン酸無水物（ｍａｌｅｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、酒石酸無水物（ｔａｒｔａｒｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、及びフタル酸無水物（ｐｈｔｈａｌｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）処理で）又は二つの負の電荷（例えば、トリメリット酸無水物（ｔｒｉｍｅｌｌｉｔｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、シス‐アコニット酸無水物（ｃｉｓ−ａｃｏｎｉｔｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、及び４‐ニトロフタル酸無水物（４−ｎｉｔｒｏｐｈｔｈａｌｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）処理で）でさえ変換するために用いてよい。他の化学的修飾は結果として非電荷残基（例えば、無水酢酸（ａｃｅｔｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、無水酪酸（ｂｕｔｙｒｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、イソ酪酸無水物（ｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、ヘキサン酸無水物（ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、吉草酸無水物（ｖａｌｅｒｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、イソ吉草酸無水物（ｉｓｏｖａｌｅｒｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、及びピバル酸無水物（ｐｉｖａｌｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）処理）を得るリジン残基の正の電荷の除去のために用いてよい。
セルラーゼ調製上リジン残基を無水コハク酸を用いて、多様な既知の方法（Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, Editor: R. Lundblad, 3rd Edition CRC press, 1984）を用いて修飾した。この反応に関して、２３６ｍｇのＬＡＭＩＮＥＸ ＢＧ酵素複合体を１ｍＬの５００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ８に調製した。無水コハク酸（アルドリッチ）溶液を最終濃度５００ｍｇ／ｍＬになるように粉をＤＭＳＯに溶解し、酵素複合体に添加した。無水コハク酸の一部の溶液を反応試験管中にてリジン対コハク酸の比が＞１：１００になるように添加した。別の反応試験管はＤＭＳＯ及び酵素のみ、同様の体積で用意され、非修飾タンパク質コントロールとして使用した。これらの試験管をボルテックスにて攪拌し、終夜室温に放置した。次の日１：１０の比の体積で１ＭグリシンｐＨ３を各試験管に加え、無水コハク酸反応を止めた。
化学修飾をネイティブゲル上修飾又は非修飾タンパク質を比較することにより確認した。各反応溶液（化学的に修飾及び非修飾）の一部を１００ボルト、ｐＨ８．８にて実施する８から２５％の勾配を有するネイティブゲル（Ｐｈａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ ｇｅｌｓ, ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にて分析した。ゲルのクーマジーブルー染色後タンパク質を観察し、修飾が成功していることを確認した。染色によりタンパク質のバンドの移動においてシフトしていること明らかとなり、セルラーゼ調製物の多様なタンパク質成分の電荷における変化を確認できる。トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）セルラーゼ調製物の修飾サンプルは非修飾サンプルより負へ荷電していた。
修飾及び非修飾（コントロール）タンパク質を単離するために、８０μｌの各サンプルをスピン脱塩カラム（ピアス）を用いて脱塩した。サンプルの総タンパク質濃度を決定するために１：１０にサンプルを希釈し、複数点で、脱塩サンプル（修飾していないコントールを含む）の２８０ｎｍでの吸光度をＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）分光光度計(テルモ)を用いて測定した。
リグニン結合評価
リグニン、フェノールプロパノイドのバイオポリマー複合体、は堅く及び強い植物の細胞壁であるセルロース繊維に結合する主に木材の非炭水化物成分である。他の細胞壁成分へ交差結合するので、リグニンはセルロース分解酵素へのセルロース及びヘミセルロースのアクセスしやすさを最小にする。つまり、リグニンは一般的にすべての植物バイオマス（Berlin他、Appl Biochem Biotechnol, 121-124: 163-170 [2005]）の低下される消化に関与する。実際に、リグニンへのセルロースの結合はセルラーゼによるセルロースの分解を低減する。リグニンは疎水性及び明らかに負に荷電している。かくて、本発明者等はセルラーゼへの負の電荷の追加がリグニンへの結合を低下させると考えた。
本明細書にて記載のように、植物性ポリマー成分、つまり、リグニンへ結合するトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）セルラーゼ調製物の能力における化学修飾の効果を測定するために反応を実施する。手短かに言うと、５０ｍＭ 酢酸ナトリウムｐＨ５にて調製した５０μＬの１．１６％リグニン（バガスの完全糖化から回収）を４μｌの脱塩修飾又は非修飾トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）セルラーゼ調製物と混合した。反応混合物を含む微小遠心管を室温にて一時間インキュベーションし、それから高速で遠心分離をし、不溶性物質から可溶性物質を分離した。各チューブの１０μｌの上清を集めた。反応チューブを再度混合し、さらに２時間インキュベーションし、インキュベーション後、各チューブから第二の１０μｌの上清を集めた。上清サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。修飾トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）セルラーゼ調製物におけるバンド強度の低下はリグニン結合における低下を示した。
バガス結合評価
バガスはトウモロコシを粉砕し、その絞り汁を抽出した後に残存するバイオマスである。バガス（酸処理、２８％固体、５７％グリカン）の２％セルロースを含む液を５０ｍＭ 酢酸ナトリウムｐＨ５にて調製した。トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）セルラーゼ調製物を同じ酢酸緩衝液にて１０倍希釈した。希釈酵素の一部をバガス溶液又は緩衝液単独いずれかと混合し、室温にて１時間インキュベーションした。上清を集め、セルラーゼの成分、つまり、ベータグルコシダーゼの活性をアッセイした。
ベータ‐グルコシダーゼ活性をクロロ‐ニトロ‐フェニル‐ベータ‐Ｄ‐グルコシド（ＣＮＰＧ）アッセイを用いて測定した。ＣＮＧＰアッセイはベータ‐グルコシダーゼがＣＮＰＧを発色性生成物２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル（ＣＮＰ）へ変換する速度論的アッセイである。３７℃にて１０分間に対して４０５ｎｍで測定する。速度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘソフトウェアを用いてＶｍａｘとして得て、それから特異的活性へ変換する（μＭ ＣＮＰ／秒／ｍｇ タンパク質）。手短かに言うと、２００μｌの５０ｍＭ 酢酸ナトリウムｐＨ５．０を９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルへ添加した。プレートに蓋をし、３７℃にて１５分間エッペンドルフ サーモミキサーに置き温度と平衡化するようにした。平衡化後５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０で滅菌的に希釈した５μｌの酵素サンプルを各ウェルへ加えた。１０ｍＭ ＣＮＧＰストック溶液を５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０を用いて１：５に希釈し、それから２０μｌの希釈ＣＮＧＰ溶液（２ｍＭ）を酵素サンプルを含む各ウェルへ添加した。マイクロタイタープレート（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ, ｔｙｐｅ ３４０： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を３７℃に設定した分光光度計へ移し、ＯＤを０から１５分間、≦９秒の間隔にて４０５ｎｍで読んだ。
バガス基質に結合せずに残存するセルラーゼ酵素サンプルのベータグルコシダーゼ活性の量は化学的修飾トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ.）セルラーゼ調製物の場合かなり大きい。実際、ＣＮＰＧアッセイにより決定する場合、非修飾ベータグルコシダーゼの５０％未満がバガス基質に非結合（例えば、５０％結合）で残存した一方、修飾ｂｇｌｕのほぼ８０％がバガス基質に非結合（例えば、２０％結合）で残存した。総合すれば、修飾セルラーゼ結合データはセルラーゼにおける正の電荷を低減することにより負に荷電している植物ポリマー基質への結合を低減することを示す。この場合、植物ポリマー基質は酸処理バイオマスに残っているリグニンであった。ゼータ電位（表１４−１を参照願いたい）の測定により決定するように、トウモロコシ茎葉由来酸処理バイオマス、同様な化学組成の植物バイオポリマーは、糖化の課程の間ますます負の電荷を採用することを示した。
酸‐前処理バガスの糖化
追加的なリグニンの多様な量を含む酸‐前処理バガス（ＡＰＢ）に存在するセルロースの糖化を化学的修飾及び非修飾トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ.）セルラーゼ調製物及びＨＰＬＣにより糖の放出、ＤＰ１からＤＰ７をモニターするアッセイを用いて評価した。マイクロタイタープレートにおいて、２００μＬの３．５％ＡＰＢを５０ｍＭ 酢酸ナトリウムｐＨ５に調製し、多様な量のリグニンを調整した。２０マイクロリットルのセルラーゼ酵素溶液（非修飾又は修飾LAMINEX BG）をウェルに加えた。プレートをアルミニウムプレートのシーラーで蓋をし５０℃、２４時間又は４８時間振盪を伴うインキュベーターに置いた。反応を１００μｌの１００ｍＭ グリシンｐＨ１０を各ウェルに加えることにより終了した。続いて混合し、マイクロタイタープレートウェルの内容物をミリポア９６穴フィルタープレート（０．４５μｍ、ＰＥＳ）通してろ過した。ろ過物を１００μｌの１０ｍＭ グリシンｐＨ１０を含むプレートへ希釈し、可溶性糖（ＤＰ１からＤＰ７）の生成量をＨＰＬＣにより測定した。Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣは脱灰／ガードカラム（Ｂｉｏｒａｄカタログ番号１２５−０１１８）及びＡｍｉｎｅｘ ｌｅａｄ ｂａｓｅｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅカラム（Ａｍｉｎｅｘカタログ番号ＨＰＸ−８７Ｐ）を備えた。移動層は流速０．６ｍｌ／分で水であった。シグマから入手した可溶性糖標準物（ＤＰ１‐ＤＰ７）をすべてミリＱ水で１００ｍｇ／ｍＬに希釈し、個々の糖に関するピーク面積を実際の糖の濃度に変換するために用いた。変換のパーセントをＨＰＬＣから測定される糖をセルロースのグルコースへの１００％変換で割ることにより算出した。
リグニン結合セルラーゼはセルロース分解に関してその効率を低減させる。これは糖化反応に存在するリグニンの増加量に伴うセルロースの変換の低減として示す。この傾向は修飾セルラーゼ調製物おいてみられる。しかしながら、上記反応条件下非修飾セルラーゼサンプルに比較して修飾セルラーゼサンプルにおいて１０％増加のセルロースの変換を有する。この結果はセルラーゼの負電荷の増加によりセルラーゼのリグニンへの非生産的結合が低減することを示す。さらに、この実施例は化学的修飾が酵素電荷の制御に関して突然変異生成に代替するものであることを示す。
化学的修飾ＣＢＨ２はＡＰＢの糖化を増加する
精製トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ.）ＣＢＨ１、ＣＢＨ２変異体、ＥＧ１、ＥＧ２及びベータグルコシダーゼを上記に記載のように化学的に修飾した。この実施例で用いたＣＢＨ２変異体はUS Pub. No. 2006/0205042記載のように複数の置換（野生型成熟ＣＢＨ２セルラーゼに相当する番号でＰ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｖ／Ｔ１５４Ａ／Ｉ２１１２Ｖ／Ｓ３１６Ｐ／Ｓ４１３Ｙ）を有する。成熟ＣＢＨ変異体のアミノ酸配列を次に示す。
Figure 2010528656
ＣＢＨ１、ＣＢＨ２変異体、ＥＧ１、ＥＧ２及びベータグルコシダーゼの化学的修飾を非修飾タンパク質と比較してネイティブゲル上のそれらのシフトした移動により確認した。修飾ＣＢＨ１、ＣＢＨ２変異体、ＥＧ１、ＥＧ２及びベータグルコシダーゼはより負の電荷を有する。すべてのタンパク質濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）分光光度計(テルモ)を用いて測定した。糖化反応をマイクロタイタープレートにて行い、マイクロタイタープレート各ウェル中、５０ｍＭ 酢酸ナトリウムｐＨ５．０に調製された１５０μＬの７％ＡＰＢ、２０μｌの２１μｇ総タンパク質の酵素混合物を添加し、各ウェルにおけるセルロース対する最終タンパク質が２０ｍｇ／ｇであった。６つの酵素混合物を精製修飾又は非修飾Ｂｇｌｕ、ＣＢＨ２変異体、ＥＧ１又はＥＧ２をセロビオヒドロラーゼ I (ＣＢＨＩ, Ｃｅｌ７ａ)、セロビオヒドロラーゼＩＩ(ＣＢＨＩＩ, Ｃｅｌ６ａ)、エンドグルカナーゼI (ＥＧＩ, Ｃｅｌ７ｂ)、及びエンドグルカナーゼII (ＥＧＩＩ, Ｃｅｌ５ａ)をコードする遺伝子が不活化されている (US 2007/0128690参照願いたい)トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）バックグラウンドに添加することにより作成した。各混合物において、７２．５％トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）バックグラウンド、２．５％Ｂｇｌｕ，１５％ＣＢＨ２変異体、５％ＥＧ１、５％ＥＧ２を加え、最初の４つの混合は修飾されていないひとつのタンパク質、５番目の混合は修飾されていないすべてのタンパク質、６番目の混合はすべての修飾タンパク質を有する。プレートは５０℃にて７２時間でインキュベーションした。反応を１００μｌの１００ｍＭ グリシンｐＨ１０を各ウェルに加えることにより終了した。続いて混合し、マイクロタイタープレートウェルの内容物をミリポア９６穴フィルタープレート（０．４５μｍ、ＰＥＳ）通してろ過した。ろ過物を１００μｌの１０ｍＭ グリシンｐＨ１０を含むプレートへ希釈し、可溶性糖（ＤＰ１からＤＰ７）の生成量をＨＰＬＣにより測定した。Agilent １１００シリーズＨＰＬＣは脱灰／ガードカラム（Ｂｉｏｒａｄカタログ番号１２５−０１１８）及びＡｍｉｎｅｘ ｌｅａｄ ｂａｓｅｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅカラム（Ａｍｉｎｅｘカタログ番号ＨＰＸ−８７Ｐ）を備えた
。移動層は流速０．６ｍｌ／分で水であった。シグマから入手した可溶性糖標準物（ＤＰ１‐ＤＰ７）をすべてミリＱ水で１００ｍｇ／ｍＬに希釈し、個々の糖に関するピーク面積を実際の糖の濃度に変換するために用いた。変換のパーセントをＨＰＬＣから測定される糖をセルロースのグルコースへの１００％変換で割ることにより算出した。
本発明の開発中に決定するように、すべて修飾タンパク質を伴う第６番目の酵素混合（修飾ＥＧ２、ＥＧ１、ＣＢＨ２変異体及びベータグルコシダーゼ）は最も高いセルロース変換を示す一方、すべての非修飾タンパク質を伴う第５番目の酵素混合は最も低いセルロース変換を示す。第１番目の４つの酵素混合と比較して、非修飾ＣＢＨ２を伴う第２番目の酵素混合は次に低い正味セルロース変換を示した。つまり、修飾タンパク質は非修飾タンパク質に対してセルロース変換において非常に有効である。
トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ２表面電荷変異体の調整
本発明の開発中に判明したところであるが、ＣＢＨ２の表面リジン残基のサクシニル化は上記のようにＡＰＢ及び前処理トウモロコシ茎葉における性能を改善した。修飾ＣＢＨ２変異体の電荷は非修飾ＣＢＨ２変異体に比較して約−１７であった。この点を考慮に入れてＣＢＨ２電荷ラダーをセルラーゼ性能適用のおける最適表面電荷の決定のために設計した。親野生型トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ２のコード領域を下記に示し、標準文字はシグナル配列のＤＮＡを示し、太字は成熟酵素のＤＮＡ配列を示す。
Figure 2010528656
親野生型トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ２前駆体タンパク質のアミノ酸配列を下記に示す。
Figure 2010528656
親野生型トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ２成熟タンパク質のアミノ酸配列を下記に示す。
Figure 2010528656
突然変異のために選択される残基は非保存、露出リジン、アルギニン、アスバラギン、及びグルタミン残基を含み、負の電荷を導入するために置換を選択した。修飾ＣＢＨ２スクシニル化リジンをマススペクトロメトリーにより同定し、グルタミン酸への変異を選択し、置換当たり、−２電荷異なる結果となった。他の残基を相同体ＣＢＨ２配列（例えば、参照により本明細書に取り込まれるUS Pub. No. US 2006/0205042の図３を参照願いたい。）のアミノ酸アライメント結合するＣＢＨ２の３次元構造の分析により置換を選択した。ＣＢＨ２のアミノ酸配列アライメントにおいて非常に変化する表面残基が変異の候補であった。しかしながら、かなり接近する置換の蓄積を避けた。アルギニンをグルタミン（電荷−１）で置換、及びグルタミン及びアスパラギンを各カルボキシル変異体（電荷−１）で置換した。さらに、アスパラギン酸及びグルタミン酸残基は電荷ラダー（電荷＋１）を完成するために各アミン残基への置換を選択した。特異的ＣＢＨ２置換を表５−１に示す。Ｒ６３及びＲ７７以外に示すすべての位置はＣＢＨ２触媒領域に位置した。正味の正電荷を負に荷電する残基の除去あるいは正に荷電する残基の挿入により創製する。同様に正味の負電荷を正に荷電する残基の除去あるいは負に荷電する残基の挿入により創製する。
Figure 2010528656
ＣＢＨ２電荷ラダーの調製に関して、１０のＣＢＨ２電荷変異体（Ｃ１からＣ１０）を野生型ＣＢＨ２に比較して＋８から−３２の電荷範囲にわたって設計し、表１４−３に示す。
Figure 2010528656
変異体のアミノ酸配列をＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎｅｒソフトウェア(ＤＮＡ２．０)を用いてＤＮＡ及びトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）において発現のための最適化コドンへバックトランスレーションをした。コドン最適化ｃｂｈ２変異体遺伝子を合成し、ＣＢＨ２表面電荷変異体（ＳＣＶｓ）のＤＮＡを次のプライマー、
GGHTK22フォワード5'-CACCATGATCGTGGGAATTCTTACTACTC-３' (SEQ ID NO:36)及び、
GGTHK23リバース5'-CTACAAAAACGAAGGGTTCGCATT-３' (SEQ ID NO:37)
を用いてＤＮＡ２．０構築物からＰＣＲ増幅を行った。
しかしながら、ある実験において、部位特異的突然変異誘発法をＫ１２９Ｅ及びＫ１５７Ｅ変異（ｃｂｈ２電荷変異体Ｃ３）を野生型ＣＢＨ２のゲノムＤＮＡへ挿入するために用いた。ＣＢＨ２ｃｂｈ２電荷変異体Ｃ３をｐＴｒｅｘ３ＧＭへクローン化し、本明細書に記載のように発現した。ＰＣＲ生産物を精製し、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞の形質転換のためにｐＥＮＴＲ／ＴＯＰＯへクローン化した。プラスミドＤＮＡを単一クローンから単離し、修正配列を確認した。ＣＢＨ２ＳＣＶｓを表１４−４に示すようにｐＴｒｅｘ３ＧＭ、ｐＴＴＴｐｙｒ（ｐｃｂｈ１）、及びｐＴＴＴｐｙｒ（ｐｓｔｐ１）へクローン化した。
Figure 2010528656
トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）におけるＣＢＨ２変異体の発現
この実施例はトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）におけるＣＢＨ２表面電荷変異体（ＳＣＶ）の発現のために用いる方法を記載する。手短かに言うと、ｃｂｈ２電荷変異体Ｃ３（Ｋ１２９Ｅ及びＫ１５７Ｅ変異）オープンリーディングフレームを含むｐＴｒｅｘ３ｇＭを有するトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）のバイオリスティック形質転換を次の手順により実施した。セロビオヒドロラーゼＩ (ＣＢＨＩ, Ｃｅｌ７ａ)、セロビオヒドロラーゼＩＩ (ＣＢＨＩＩ， Ｃｅｌ６ａ)、エンドグルカナーゼI (ＥＧＩ, Ｃｅｌ７ｂ)、及びエンドグルカナーゼＩＩ (ＥＧＩＩ, Ｃｅｌ５ａ)をコードする遺伝子が不活性化されているトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）を用いた。バイオリスティック形質転換方法によるトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）菌株の形質転換は、製造元の使用説明書（WO 05/001036及びUS 2006/0003408）に従って、Ｂｉｏ−Ｒａｄ (Ｈｅｒｃｕｌｅｓ, CA)製のバイオリスティック（商標）ＰＤＳ-１０００／ｈｅ パーティクルデリバリーシステムを用いて完成した。形質転換体を新しいアセトアミド選別プレートへ移した。安定な形質転換体を２００μｌ／ウェルのグリシン最小培地（６．０ｇ／Ｌグリシン、４．７ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４、５．０ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３３．０ｇ／Ｌ ＰＩＰＰＳ、ｐＨ５．５）を含むフィルターマイクロタイタープレート（ミリポア）へ播種した。その培地は炭素源として~２％グルコース／ソホロース混合物、１０ｍｌ／Ｌの１００ｇ／ＬのＣａＣｌ２、２．５ｍｌ／Ｌのトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）の微量元素（４００Ｘ）であって、１７５ｇ／Ｌ無水クエン酸、２００ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ、１６ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ、３．２ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４ ５Ｈ２Ｏ、１．４ ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４ Ｈ２Ｏ、０．８ ｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３含むものを後で滅菌添加される。形質転換体を２８℃のインキュベーターに設置されたＯ２豊富な区画で５日間液体培地にて培養した。フィルターマイクロタイタープレートから上清サンプルを真空マニホールドを用いて得た。サンプルを製造元の説明書に従って４から１２％ＮｕＰＡＧＥゲル(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)で実施した。ゲルをＳｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。追加ＣＢＨ２表面電荷変異体の発現はこの方法を用いて実施してよい。
実施例１５
酵素のｐＨ‐活性プロファイルの調整
この実施例は所定の反応に関する酵素のｐＨ‐活性プロファイルを最適化する表面電荷変異の使用を記載する。
図３１は、実施例５の第一ＡｍｙＳ電荷ラダーに関するｐＨに応じてコメデンプン微小布見本洗浄活性を示す。３．０から４．２５のｐＨ範囲は０．０１％Ｔｗｅｅｎ‐８０を含む２００ｍＭ 蟻酸塩ナトリウムである一方、４．２５から５．５までのｐＨ範囲は０．０１％Ｔｗｅｅｎ‐８０を含む２００ｍＭ 酢酸ナトリウムであった。データは滴定曲線に一致し、各単一ｐＫａ値を有する。
図３２は実施例５の第一ＡｍｙＳ電荷ラダーに関するｐＨに応じてＡｍｙＳ触媒作用に関する見かけのｐＫａを示す。これらのデータはアルファ‐アミラーゼに関するｐＨ‐活性プロファイルが２００ｍＭ緩衝液でさえ、表面電荷変異により顕著にシフトすることを示す。これはスブチリシン（Russell他、J Mol Biol, 193: 803-13 [1987])及びＤ‐キシロースイソメラーゼ(Cha他、Mol Cell, 8: 374-82 [1998])に関して非常に低いイオン強度で報告されているけれども、アルファ‐アミラーゼを用いて、しかも驚くほどに高いイオン強度で達成されたことは本発明が最初である。
明細書に記載された全ての特許と刊行物は、発明の属する技術分野の技術者の水準を示す。当業者は、本発明が対象物を扱い、対象物が固有に備えているもののほか、記述された目的と利点を得るに十分に適していることが分かるであろう。本明細書に記載された組成物と方法は好ましい実施実施態様の代表、典型であり、本発明の特許請求の範囲に関し限定することは意図していない。本発明の特許請求の範囲と本質から逸脱せず本明細書に開示されている発明に種々の置換と変更が行われ得ることは、本願発明の技術分野の技術者には容易に明らかである。
本明細書に説明のため述べられた発明は、本明細書に特定して開示されていないいずれの発明特定事項、限定もない条件で実施できる。使用された用語及び表現は記述のための用語として使用されており、限定のためではなく、かつそのような用語と表現の使用は、明らかにされかつ述べられた特徴と等価なものまたはその一部と等価なものを排除する意図はなく、むしろ、特許を請求する発明の範囲内で種々の変更が可能であることが認識される。従って、本発明は好ましい実施態様と任意の特徴により具体的に開示されているが、本明細書に開示された概念の修飾、変更は本発明の技術分野の技術者に委ねられ、且つそのような修飾と変更が、添付の特許請求により定義されている発明の範囲内にあることが理解されるべきである。
本発明は本明細書に広く、属に関して述べられてきた。属の開示の範囲内にあるより狭い範囲の種及び属より下位の分類のそれぞれもまた本発明の一部を形成する。これには、除外されるものが本明細書で特定して記載されていたか否かに拘らず、当該属からいずれかのものを除外する条件または否定的限定(Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ)を付した発明についての属に関する記述が含まれる。

Claims (51)

  1. タンパク質変異体のライブラリーを提供する方法であって、
    ａ）少なくとも一つの所望の試験における少なくとも一つの所望の性質の範囲にわたる複数のタンパク質変異体を試験し、
    ｂ）前記少なくとも一つの所望の試験における好ましい結果に関係する前記所望の性質の範囲内で最適条件を同定し、
    ｃ）前記所望の性質の範囲の最適条件内で複数のタンパク質変異体を提供し、それにより、前記少なくとも一つの所望の試験における前記好ましい結果を有するメンバーを多く有するタンパク質変異体のライブラリーを提供すること
    を含むことを特徴とする方法。
  2. 前記所望の性質が物理的性質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 前記好ましい結果が前記所望の試験に観察される最大値の少なくとも約５０％より大きい値に相当することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  4. 前記好ましい結果が前記所望の試験に観察される最大値の少なくとも約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約９５％より大きい値に相当することを特徴とする請求項３に記載の方法。
  5. さらに
    ｄ）前記少なくとも一つの所望の試験において、前記複数のタンパク質変異体及び少なくとも一つの野生型タンパク質を試験する
    段階を含む請求項１に記載の方法。
  6. 改善される結果を有するような前記タンパク質変異体を同定する段階をさらに含み、野生型タンパク質が前記少なくとも一つ所望の試験において１．０の性能指標値を達成し、前記改善される結果を有するタンパク質変異体が１．０より大きい値で達成することを特徴とする請求項５に記載の方法。
  7. 前記タンパク質が抗体、ホルモン、又はサイトカインであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  8. 前記タンパク質が酵素であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  9. 前記酵素が、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ポリエステラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、オキシダーゼ、又はトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
  10. 前記プロテアーゼが中性メタロプロテアーゼ又はセリンプロテアーゼであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
  11. 前記セリンプロテアーゼがスブチリシンであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
  12. 前記中性メタロプロテアーゼがバシルス（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科のメンバーから得られることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
  13. 前記セリンプロテアーゼがセルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属のメンバーから得られることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
  14. 前記酵素がセルラーゼであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
  15. 前記酵素がアミラーゼであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
  16. 前記所望の性質が電荷であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
  17. 前記タンパク質変異体及び前記野生型酵素の前記電荷が決定され及び比較されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
  18. 前記所望の性質がゼータ電位であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
  19. 前記タンパク質変異体及び前記野生型酵素の前記ゼータ電位が決定され及び比較されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
  20. 前記タンパク質変異体の前記ゼータ電位が約−４０ｍＶと約＋４０ｍＶの間であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
  21. 前記タンパク質変異体の前記ゼータ電位が約−２０ｍＶと約＋２０ｍＶの間であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
  22. 前記タンパク質変異体の前記ゼータ電位が約−１０ｍＶと約＋１０ｍＶの間であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
  23. 前記所望の試験が洗浄性能を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
  24. 前記洗浄性能が血液、牛乳、インク洗浄性能を含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
  25. 前記タンパク質変異体及び野生型タンパク質が洗剤組成物において試験されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
  26. 前記洗剤組成物が約５と約１２の間のｐＨを有する粉状又は液状洗剤へ構成されることを特徴とする請求項２５の方法。
  27. 前記洗浄性能が塩基性ｐＨを有する冷水液体洗剤中で試験されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
  28. 前記洗浄性能が温水洗剤中で試験されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
  29. 前記少なくとも一つの所望の試験が基質結合、酵素阻害、発現レベル、洗剤安定性、熱安定性、反応速度、反応範囲、熱活性、デンプン液状化、バイオマス分解、及び／又は糖化を測定することを含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
  30. 試験タンパク質折りたたみの少なくとも一つの改良される変異体を生産する方法であって、
    ａ）少なくとも一つの所望のアッセイにおける少なくとも一つの所望の性質の範囲にわたるプローブタンパク質折りたたみの複数の変異体をアッセイし、
    ｂ）前記少なくとも一つの所望のアッセイにおける好ましい結果に関係する前記少なくとも一つの所望の性質の前記範囲内で最適条件を同定し、
    ｃ）前記少なくとも一つの所望のアッセイにおいて試験タンパク質折りたたみの親タンパク質をアッセイし、及び
    ｄ）親タンパク質にアミノ酸修飾を導入することにより前記試験タンパク質折りたたみの少なくとも一つの改良される変異体を生産し、それにより、前記少なくとも一つの改良される変異体が前記少なくとも一つの所望の性質の前記最適条件範囲内であることを特徴とすること、
    を含む方法。
  31. 前記修飾が少なくとも一つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
  32. 前記試験タンパク質折りたたみ及び前記プローブタンパク質折りたたみが異なることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
  33. 前記所望の性質がゼータ電位であることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
  34. 前記試験タンパク質折りたたみが少なくとも一つのセリンプロテアーゼを含み及び前記プローブタンパク質折りたたみが少なくとも一つの中性メタロプロテアーゼを含むことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
  35. 基質汚れに特異的な酵素変異体を生産する方法であって
    ａ）標準緩衝液において基質汚れのゼータ電位を決定し、
    ｂ）前記標準緩衝液において親酵素のゼータ電位を決定し、及び
    ｃ）前記親酵素に少なくとも一つのアミノ酸修飾を導入することにより基質汚れに特異的な酵素変異体を生産し、それにより前記基質汚れに特異的な酵素変異体の前記ゼータ電位が前記親酵素の前記ゼータ電位より前記基質汚れのゼータ電位に近いことを特徴とする
    ことを含む方法。
  36. 前記修飾が少なくとも一つのアミノ酸置換、欠損及び／又は挿入を含むことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
  37. 前記修飾が前記親酵素の化学的修飾を含むことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
  38. 前記基質汚れに特異的な酵素変異体が正に荷電し、吸熱性であり、及び前記基質汚れが負に荷電することを特徴とする請求項３５に記載の方法。
  39. 前記基質汚れに特異的な酵素変異体が負に荷電し、発熱性であり、及び前記基質汚れが負に荷電することを特徴とする請求項３５に記載の組成物。
  40. 前記基質汚れに特異的な酵素変異体が正に荷電し、発熱性であり、及び前記基質汚れが正に荷電することを特徴とする請求項３５に記載の組成物。
  41. 前記基質汚れに特異的な酵素変異体が負に荷電し、吸熱性であり、及び前記基質汚れが正に荷電することを特徴とする請求項３５に記載の組成物。
  42. 複数の汚れを洗浄するための組成物を生産する方法であって
    ａ）標準緩衝液において前記複数の汚れのそれぞれのゼータ電位を決定し、
    ｂ）前記標準緩衝液において少なくとも一つの前記複数の汚れのゼータ電位と実質的に等しいゼータ電位を有する洗浄酵素を選択し、
    ｃ）複数の汚れを洗浄するための組成物を生産し、前記組成物がｂ）段階にて選択される少なくとも一つの洗浄酵素を含むことを特徴とする
    ことを含む方法。
  43. 前記組成物が前記標準緩衝液と実質的に同じｐＨ及び導電率を有する洗剤溶液を含むことを特徴とする請求項４２に記載の方法。
  44. 前記選択段階が２以上の洗浄酵素を同定することを特徴とする請求項４２に記載の方法。
  45. 前記組成物が少なくとも二つの洗浄酵素を含み、前記少なくとも二つの洗浄酵素が少なくとも二つの前記複数の汚れの前記ゼータ電位に相当するゼータ電位を有することを特徴とする請求項４２に記載の方法。
  46. 請求項４２に記載の方法を用いて生産される複数の汚れを洗浄するための組成物。
  47. 前記組成物が少なくとも一つの洗浄酵素含むことを特徴とする請求項４６に記載の組成物
  48. 前記少なくとも一つ洗浄酵素が変異タンパク質であることを特徴とする請求項４７に記載の組成物。
  49. 前記変異タンパク質が前記変異タンパク質を生産するために用いる野生型前駆体タンパク質より負に荷電することを特徴とする請求項４８に記載の組成物。
  50. 前記変異タンパク質が前記変異タンパク質を生産するために用いる野生型前駆体タンパク質より正に荷電することを特徴とする請求項４６に記載の組成物。
  51. 前記変異タンパク質が陰イオン界面活性剤を含む洗剤における増強される安定性に関して前記変異タンパク質を生産するために用いる野生型前駆体タンパク質より負に荷電することを特徴とする請求項４６に記載の組成物。
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