JP2010528656A - 複数のタンパク質の性質を改良する方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本出願は2007年6月6日に出願された米国仮出願第60/933,307、60/933,331、及び60/933,312について優先権を主張する。これらの全部は参照により本明細書に取り込まれる。
本発明は、産業用、消費者用、又は製薬用利用において一以上の有用な性質を有するタンパク質を得るための効率的な方法を提供する。幾つかの好ましい実施態様においては、本発明は候補となる酵素の簡略セットをスクリーニングすることにより所定の適用に対して優れた酵素を生産するための方法を提供する。
タンパク質の自然環境の外側で機能するタンパク質の性質はしばしば不十分である。例えば、酵素(例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ等)は、しばしば洗濯洗剤において繊維から汚れを洗浄するために用いられ、一般的に活性成分の複合的な組合せを含む。実際、多くの洗浄製品は界面活性剤系、漂白剤、ビルダー、泡抑制剤、泥懸濁剤、泥放出剤、蛍光増白剤、柔軟剤、分散剤、色移り阻害化合物、研削材、抗菌剤、香料、並びに洗浄用の酵素を含む。つまり、今日の洗剤の複合体にかかわらず、不十分な酵素性能のせいで完全に除去しがたい多くの汚れが存在する。酵素開発における多くの研究にかかわらず、特定の使用及び条件に対するタンパク質工学の方法が当分野で必要とされている。実際に、産業用利用における酵素の性能を最適化するために迅速かつ系統的に静電気的性質を調整する方法が当分野に必要とされている。特に、洗浄溶液中の改善される活性、安定性、及び溶解性を有するために産業用に有用な酵素をタンパク質工学で作る方法が当分野に必要であり、かかる酵素は、リパーゼ、アミラーゼ、クチナーゼ、マンナーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、プロテアーゼ、及び他の酵素を含むが、これらに限定されない。さらに、形質転換宿主細胞から高いレベルで発現できる組み換え酵素をタンパク質工学で創る方法が当分野で必要とされている。
本発明は、産業用、消費者用、又は製薬用利用において一以上の有用な性質を有するタンパク質を得るための効率的な方法を提供する。幾つかの好ましい実施態様においては、本発明は候補となる酵素の簡略セットをスクリーニングすることにより所定の適用に対して優れた酵素を生産するための方法を提供する。
所望の試験における所望の性質(例えば、物理的性質)の範囲にわたる複数のタンパク質変異体を試験し、
前記所望の試験における好ましい結果に関係する前記所望の性質の範囲内で最適条件を同定し、
前記所望の性質の範囲の最適条件内で複数のタンパク質変異体を提供し、それにより前記所望の試験における好ましい結果を有するメンバーを多く有するタンパク質変異体のライブラリーを提供する
ことを含む方法を提供する。幾つかの好ましい実施態様においては、好ましい結果が所望の試験において見られる最大値の少なくとも約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、95%より大きい値に相当する。さらなる実施態様においてはさらに所望の試験において、複数のタンパク質変異体及び野生型タンパク質を試験する段階を含む方法を含む。さらなる実施態様において、改善される結果を有するようなタンパク質変異体を同定する段階を含み、野生型タンパク質が所望の試験において1.0値を達成し、改善される結果を有するタンパク質変異体が1.0より大きい値を達成することを特徴とする方法である。幾つかの好ましい実施態様において、性能指標=試験性能/野生型性能である。幾つかの特に好ましい実施態様においては、タンパク質は酵素である。幾つかのさらに好ましい実施態様においては、酵素はプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ポリエステラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ又はオキシダーゼである。幾つかのさらなる実施態様においては、タンパク質が抗体、又はホルモン又はサイトカイン(例えば、成長因子)である。幾つかの好ましい実施態様においては、プロテアーゼが中性メタロプロテアーゼである。幾つかの特に好ましい実施態様においては、親プロテアーゼが中性メタロプロテアーゼの野生型成熟形態である。さらなる好ましい実施態様においては、変異体はバシルス(Bacillaceae)科の中性メタロプロテアーゼ由来である。他の実施態様においては、変異体はバシルス(Bacillus)属の中性メタロプロテアーゼ由来である。幾つかの他の実施態様においては、プロテアーゼはセリンプロテアーゼである。特に好ましい実施態様においては、親プロテアーゼはセリンプロテアーゼの野生型成熟形態である。さらなる好ましい実施態様においては、変異体はミクロコッカス亜目(Suborder Micrococcineae)のセリンプロテアーゼ由来である。さらに実施態様においては、変異体はセルロモナス(Cellulomonas)属のセリンプロテアーゼ由来である。さらなる実施態様においては、所望の性質は野生型酵素に比較した電荷である。幾つかの特に好ましい実施態様においては、所望の性質はゼータ電位である。幾つかの追加的な好ましい実施態様においては、所望の試験は洗浄性能に関するものである。幾つかの特に好ましい実施態様においては、洗浄性能は洗剤における血液、牛乳、インク(BMI)洗浄性能を含む。幾つかの実施態様においては、洗浄性能は5と12の間のpHを有する粉状又は液状洗剤へ構成される洗浄組成物において試験される。さらなる実施態様においては、塩基性pHを有する冷水液体洗剤中で試験される。幾つかの別の実施態様においては、所望の試験は基質結合測定、及び/又は酵素阻害測定、及び/又は発現レベル測定、及び/又は洗剤安定性測定、及び/又は熱安定性測定、及び/又は反応速度測定、及び/又は反応範囲測定、及び/又は熱活性測定を含む。
所望のアッセイにおける所望の性質の範囲にわたるプローブタンパク質折りたたみの複数の変異体をアッセイし、
前記所望のアッセイにおける好ましい結果に関係する前記所望の性質の前記範囲内で最適条件を同定し、
所望のアッセイにおける前記試験タンパク質折りたたみの親タンパク質をアッセイし、
親タンパク質にアミノ酸置換を導入することにより試験タンパク質折りたたみの改良される変異体を生産し、それにより、前記改良される変異体が前記所望の性質の範囲の最適条件内であること
を含む方法である。幾つかの実施態様においては、試験タンパク質折りたたみ及びプローブタンパク質折りたたみは異なる。幾つかのさらなる実施態様においては、試験タンパク質折りたたみは、セリンプロテアーゼ及びプローブタンパク質折りたたみは中性メタロプロテアーゼである。
標準緩衝液における基質汚れのゼータ電位を決定し、
前記標準緩衝液における親酵素のゼータ電位を決定し、及び
前記親酵素にアミノ酸置換を導入することにより基質汚れに特異的な酵素生産し、それにより変異体酵素のゼータ電位が前記親酵素の前記ゼータ電位より前記基質汚れのゼータ電位に近くなることを含む方法である。
標準緩衝液における前記複数の汚れのそれぞれのゼータ電位を決定し、
前記標準緩衝液において前記複数の汚れ一つのゼータ電位と実質的に同等であるゼータ電位を有する洗浄酵素を選択し、その選択が各複数の汚れが少なくとも一つの洗浄酵素と対になるまで続くことを特徴とし、及び
標準緩衝液に等しいpH及び導電率を有する洗剤溶液中b)段階の洗浄酵素の含有により複数の汚れを洗浄するための組成物を調製することを含む方法である。
a)少なくとも一つの所望の試験における少なくとも一つの所望の性質の範囲にわたる複数のタンパク質変異体を試験し、
b)前記少なくとも一つの所望の試験における好ましい結果に関係する前記所望の性質の範囲内で最適条件を同定し、
c)前記所望の性質の範囲の最適条件内で複数のタンパク質変異体を提供し、それにより前記少なくとも一つの所望の試験における好ましい結果を有するメンバーを多く有するタンパク質変異体のライブラリーを提供する
ことを特徴とする方法を提供する。幾つかの実施態様においては、所望の性質が物理的性質である。さらに、幾つかの実施態様においては、好ましい結果が所望の試験に観察される最大値の少なくとも約50%より大きい値に相当する。さらなる実施態様においては、好ましい結果が所望の試験に観察される最大値の少なくとも約60%、約70%、約80%、約90%、95%より大きい値に相当する。幾つかのさらなる実施態様においては、さらに
d)少なくとも一つの所望の試験において、前記複数のタンパク質変異体及び少なくとも一つの野生型タンパク質を試験する段階を含む方法である。幾つかのさらなる実施態様においては、改善される結果を有するような前記タンパク質変異体を同定する段階をさらに含み、野生型タンパク質が少なくとも一つ所望の試験において1.0の性能指標値を有し、前記改善される結果を有するタンパク質変異体が1.0より大きい値であることを特徴とすることを含む方法である。幾つかの実施態様においては、タンパク質が抗体、ホルモン、又はサイトカインである。幾つかの好ましい実施態様においては、タンパク質が酵素である。幾つかの特に好ましい実施態様においては、酵素が、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ポリエステラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、オキシダーゼ、又はトランスフェラーゼである。幾つかのより好ましい実施態様においては、プロテアーゼが中性メタロプロテアーゼ又はセリンプロテアーゼである。幾つかのさらなる好ましい実施態様においては、前記セリンプロテアーゼがスブチリシンである。幾つかの別の好ましい実施態様においては、前記中性メタロプロテアーゼがバシルス(Bacillaceae)科のメンバーから得られる。幾つかのさらなる実施態様においては、セリンプロテアーゼがセルロモナス(Cellulomonas)属のメンバーから得られる。幾つかの追加的な実施態様においては、前記酵素がセルラーゼである一方、他の実施態様においては、前記酵素がアミラーゼである。幾つかのさらなる実施態様においては、所望の性質が電荷である。幾つかの追加的な実施態様においては、タンパク質変異体及び野生型酵素の前記電荷が決定され及び比較される。幾つかのさらなる実施態様においては、前記所望の性質がゼータ電位である。幾つかのまたさらなる実施態様においては、前記タンパク質変異体及び前記野生型酵素の前記ゼータ電位が決定され及び比較される。幾つかの好ましい実施態様においては、前記タンパク質変異体の前記ゼータ電位が約−40mVと約+40mVの間である一方、他の実施態様においては、前記タンパク質変異体の前記ゼータ電位が約−20mVと約+20mVの間であり、またさらなる実施態様においては、前記タンパク質変異体の前記ゼータ電位が約−10mVと約+10mVの間である。幾つかのさらなる実施態様においては、所望の試験が洗浄性能を含む。幾つかの好ましい実施態様においては、前記洗浄性能が血液、牛乳、インク洗浄性能を含む。幾つかのさらなる実施態様においては、前記タンパク質変異体及び野生型タンパク質が洗剤組成物において試験される。幾つかの好ましい実施態様においては、前記洗剤組成物が約5と約12.0の間のpHを有する粉状又は液状洗剤へ構成される。幾つかのさらなる好ましい実施態様においては、前記洗浄性能が塩基性pHを有する冷水液体洗剤中で試験されることを特徴とする。幾つかの別の実施態様においては、前記洗浄性能が温水洗剤中で試験される。幾つかの好ましい実施態様においては、少なくとも一つの所望の試験が基質結合、酵素阻害、発現レベル、洗剤安定性、熱安定性、反応速度、反応範囲、熱活性、デンプン液状化、バイオマス分解、及び/又は糖化を測定することを含む。
a)少なくとも一つの所望のアッセイにおける少なくとも一つの所望の性質の範囲にわたるプローブタンパク質折りたたみの複数の変異体をアッセイし、
b)前記少なくとも一つの所望のアッセイにおける好ましい結果に関係する前記少なくとも一つの所望の性質の前記範囲内で最適条件を同定し、
c)前記少なくとも一つの所望のアッセイにおいて前記試験タンパク質折りたたみの親タンパク質をアッセイし、
d)親タンパク質にアミノ酸修飾を導入することにより前記試験タンパク質折りたたみの少なくとも一つの改良される変異体を生産し、それにより、少なくとも一つの改良される変異体が前記少なくとも一つの所望の性質の前記最適条件範囲内であること
を特徴とする方法である。幾つかのさらなる実施態様においては、前記修飾が少なくとも一つのアミノ酸置換を含む。いくつかの追加的な実施態様においては、前記試験タンパク質折りたたみ及び前記プローブタンパク質折りたたみが異なる。幾つかの実施態様においては、前記所望の性質がゼータ電位である。またさらなるいくつかの実施態様においては、前記試験タンパク質折りたたみが少なくとも一つのセリンプロテアーゼを含み及び前記プローブタンパク質折りたたみが少なくとも一つの中性メタロプロテアーゼを含む。
a)標準緩衝液において基質汚れのゼータ電位を決定し、
b)前記標準緩衝液において親酵素のゼータ電位を決定し、及び
c)前記親酵素に少なくとも一つのアミノ酸修飾を導入することにより基質汚れに特異的な酵素を生産し、それにより、前記基質汚れに特異的な酵素変異体の前記ゼータ電位が前記親酵素の前記ゼータ電位より前記基質汚れのゼータ電位に近いこと
を含む方法を提供する。幾つかの実施態様においては、前記修飾が少なくとも一つのアミノ酸置換、欠損及び/又は挿入を含む。幾つかの別の実施態様においては、前記修飾が前記親酵素の化学的修飾を含む。幾つかのさらなつ実施態様においては、前記基質汚れに特異的な酵素変異体が正に荷電し、吸熱性であり、及び基質汚れが負に荷電する。幾つかの別の実施態様においては、前記基質汚れに特異的な酵素変異体が負に荷電し、発熱性であり、及び基質汚れが負に荷電する。幾つかのさらなる実施態様においては、前記基質汚れに特異的な酵素変異体が正に荷電し、発熱性であり、及び基質汚れが正に荷電する。また追加的実施態様においては、前記基質汚れに特異的な酵素変異体が負に荷電し、吸熱性であり、及び基質汚れが正に荷電する。
a)標準緩衝液において前記複数の汚れのそれぞれのゼータ電位を決定し、
b)前記標準緩衝液において少なくとも一つの前記複数の汚れのゼータ電位に実質的に等しいゼータ電位を有する洗浄酵素を選択し、及び
c)複数の汚れを洗浄するための組成物を生産し、前記組成物がb)段階にて選択される少なくとも一つの洗浄酵素を含むことを特徴とする
ことを含む方法の提供である。幾つかのさらなる実施態様においては、前記組成物が前記標準緩衝液と実質的に等しいpH及び導電率を有する洗剤溶液を含む。幾つかのさらなる実施態様においては、前記選択段階が2以上の洗浄酵素を同定する。また幾つかの追加的な実施態様においては、前記組成物が少なくとも二つの洗浄酵素を含み、前記少なくとも二つの洗浄酵素が少なくとも二つの前記複数の汚れの前記ゼータ電位に相当するゼータ電位を有する。
本発明は、産業用、消費者用、又は製薬用利用において一以上の有用な特性を有するタンパク質を得るための効率的な方法を提供する。幾つかの好ましい実施態様においては、本発明は候補となる酵素の簡略セットをスクリーニングすることにより所定の適用に対して優れた酵素を生産するための方法を提供する。
本明細書において、「プロテアーゼ」及び「タンパク質分解活性」の用語は、ペプチド又はペプチド結合を有する基質を加水分解する能力を有するタンパク質又はペプチドをいう。タンパク質分解活性を測定するための良く知られた方法は数多くある(例えば、Kalisz, "Microbial Proteinases,"In: Fiechter(ed.),Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,[1988]を参照願いたい)。例えば、タンパク質分解活性は市販の基質を加水分解する個々のプロテアーゼの能力を解析して比較することにより、確認される。そのようなプロテアーゼ又はタンパク質分解活性の解析に有用な代表的な基質は、ジメチルカゼイン(シグマ C−9801)、ウシ コラーゲン(シグマ C−9879)、ウシ エラスチン(シグマ E−1625)、及びウシ ケラチン(ICN Biomedical 902111)を含むがこれらに限定されない。これらの基質を用いた非色分析は当業者に良く知られている(例えば、WO 99/34011 及び U.S. Pat. No. 6,376,450,参照のこと。これらの文献を参照により本明細書に援用する。)pNAアッセイ(例えば、Del Mar他、Anal Biochem.,99:316-320 [1979]参照)も勾配溶離をする間に収集されるフラクションの活性酵素濃度を決定するのに有用である。このアッセイは、酵素が可溶性合成基質である、スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−p−ニトロアニリド(sAAPF−pNA)を加水分解したときに放出されるp−ニトロアニリンの割合を測定する。加水分解反応からの黄色の生成速度が410nmの比色計で測定され、活性酵素の濃度が計算される。更に、280nmの吸光度はタンパク質の総濃度を測定するのに用いることができる。活性酵素/総タンパク質の比が酵素の精製度を示す。
1)異種の配列を宿主細胞の所望の標的配列に挿入するため、及び/又は
2)宿主細胞の染色体の領域を変異させるため(即ち、内性の配列を異種の配列で置換)、及び/又は
3)標的遺伝子を欠失させるため、及び/又は
4)宿主細胞に組換えプラスミドを導入するため
に用いられる。
タンパク質をコードする所望の遺伝子をいう。
本発明は、産業用、消費者用、又は製薬用利用において一以上の有用な性質を有するタンパク質を得るための効率的な方法を提供する。ある好ましい実施実施態様においては、本発明は候補となる酵素の簡略セットのスクリーニングを通して所望の適用に対して優れた酵素を生産するための方法を提供する。
(I)物理的性質の範囲にわたるプローブタンパク質をアッセイし、
(II)所定の好ましい結果として物理的性質の最適条件を決定し、及び
(III)物理的性質最適条件を有する変異タンパク質を提供すること
である。
ある実施態様においては、この段階は適切なアッセイにおいて所望の物理的性質(つまり、「所望の性質」)の範囲にわたる複数のプローブタンパク質(つまり、「プローブタンパク質折りたたみ」)の試験を含む。ある実施態様においては、プローブタンパク質はタンパク質及び/又はそれらの変異体の限定セットを含む。一般的な実施態様においては、この段階は一以上の利点を求めて複数のセリンプロテアーゼ及び/又はメタロプロテアーゼ(つまり、二つの異なるタンパク質折りたたみ)を試験することを含む。例えば、ふたつのプロテアーゼの電荷‐ラダー変異体、ASP(セリンプロテアーゼ)及びNprE(中性メタロプロテアーゼ)が提供される。本明細書に記載のASPのプロテアーゼ電荷‐ラダー変異体は、親ASP(例えば、R14I)と比較して−4から+4又は野生型ASPと比較して−5から+3の相対的正味電荷変化範囲に及ぶ。ある実施態様においては、プローブタンパク質セットも商業的に入手なタンパク質を含み、所望の適用(例えば、洗剤製剤に用いるスブチリシン)の基準として役立つ。
好ましい実施態様においては、この段階は物理的性質の最適条件又は好ましい結果に対するその範囲を同定することを含む。一般的な実施態様においては、プロテアーゼ電荷ラダー変異体の洗浄性能を測定した。異なる折りたたみを有するタンパク質で得た利点を比較する場合、共通の物理的性質のスケールを用いる(例えば、ゼータ電位で報告されるタンパク質電荷)。反対に、同じ折りたたみを有するタンパク質で得た利点を比較する場合、相対的スケールを用いる(例えば、野生型又は親タンパク質と比較した正味電荷の差)。特に好ましい実施態様においては、広い物理的性質の範囲にわたるプローブタンパク質を用い、その物理的性質の最適条件を決定する可能性が増加する。一度所望の利点のための最適値又は最適範囲がプローブタンパク質をアッセイすることにより確立されると、劣った性能(例えば、最適範囲外で存在)を優れた性能(例えば最適範囲内)に変換するのに必要な一般的な変化の方向及び強度両方を推測することができる。
疎水性(Rao及びArgos)は膜挿入ヘリックスパラメータを計算(Rao and Argos, Biochim. Biophys. Acta 869:197-214 [1986])、
疎水性(Black及びMould)は生理的L−アルファアミノ酸の疎水性を計算(Black and, Mould, Anal. Biochem., 193:72-82 [1991])、
疎水性(Bull及びBreese)は疎水性(kcal/mole表示で表面へ転移のフリーエネルギー)を計算(Bull and Breese, Arch. Biochem. Biophys. 161 :665-670 [1974])、
疎水性(Chothia)は95%貫通残基の割合を計算(12タンパク質) (Chothia, J. MoI. Biol., 105:1-14 [1976])、
疎水性(Kyte及びDoolittle)はハイドロパシシティー(hydropathicity)を計算(Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol., 157:105-132 [1982])、
疎水性(Eisenberg他)は標準化コンセンサス疎水性スケールを計算 (Eisenberg他、J. MoI. Biol. 179:125-142 [1984])、
疎水性(Fauchere及びPliska)は疎水性スケール(pi‐r)を計算(Fauchere and Pliska, Eur. J. Med. Chem., 18:369-375 [1983])、
疎水性(Guy)は転移のフリーエネルギー(kcal/mole)に基づく疎水性スケールを計算 (Guy, Biophys J., 47:61-70 [1985])、
疎水性(Janin)は球状タンパク質の内側から外側への移転フリーエネルギーを計算 (Janin, Nature 277:491-492 [1979])、
疎水性(Abraham及びLeo)は疎水性(delta G1/2cal)を計算(Abraham and Leo, Proteins: Structure, Function and Genetics 2: 130-152 [1987])、
疎水性(Manavalan他)は平均環境疎水性を計算 (Manavalan他、Nature 275:673-674 [1978])、
疎水性(Miyazawa他)は疎水性スケール(3Dデータ由来の接触エネルギー)を計算 (Miyazawa 他、Macromolecules 18:534-552 [1985])、
疎水性(Aboderin)はクロマトグラフィー紙(RF)上のアミノ酸の動きを計算 (Aboderin, Int. J. Biochem., 2:537-544 [1971])、
HPLCによる疎水性(Parker他)はHPLCペプチド保持時間由来の疎水性スケールを計算 (Parker他、Biochem., 25:5425-5431 [1986]);、
HPLC pH3.4による疎水性はHPLC検出によるpH3.4での疎水性インデックスを計算(Cowan and Whittaker, Peptide Res., 3:75-80 [1990])、
HPLC pH7.5による疎水性はHPLC検出によるpH7.5での疎水性インデックスを計算(Cowan and Whittaker, Peptide Res., 3:75-80 [1990])、
疎水性(Rose他)(AA)は平均分別エリア消失(f)を計算 [平均エリア 貫通/標準状態エリア] (Rose他、Science 229:834-838 [1985])、及び
疎水性(Roseman)は疎水性スケール(pi‐r)を計算(Roseman, J. MoI. Biol., 200:513-522 [1988))
である。
タンパク質融解温度(Tm)は一般的に温度スキャン全域で物理的報告性質のモニタリングによって決定される。適切な方法は示差走査熱量測定、円偏光二色性、動的光散乱、UV−可視分光法を含むが、これらに限定されない。
一度最適値又は範囲が前段階で決定されると、所望の物理的性質に制約される多くの候補タンパク質が提供される。候補タンパク質を提供する適切な方法は組み換え技術による人工的な酵素変異体の生産、並びにクロマトグラフィーによる天然酵素変異体(例えば、相同体)の精製、イン ビトロ(in vitoro)でのグリコシル化又はリン酸化酵素変異体の合成又はビトロでの酵素複合体の生産を含むが、これらに限定されない。グリコシル化を通したタンパク質の疎水性の改変の別の方法は酵素表面上の新しいグリコシル化部位を生成することである。これらの変異体は発現の間インビボ(in vivo)でグリコシル化される。
℃(℃ 摂氏)、rpm (一分当たりの回転数)、H2O (水)、HCl (塩酸); aa及びAA (アミノ酸)、bp (塩対)、kb (キロ塩基対)、kD (キロダルトン)、gm (グラム)、μg及びug (マイクログラム)、mg (ミリグラム)、ng (ナノグラム)、 μl及びul (マイクロリットル)、ml (ミリリットル)、mm (ミリメートル)、nm (ナノメートル)、 μm及びum (マイクロメートル)、 M (モル)、mM (ミリモル)、μM及びuM (マイクロモル)、U (ユニット)、v (ボルト)、MW (分子量)、sec (秒)、 min(s)(分)、hr(s) (時間)、 MgCl2 (塩化マグネシウム)、NaCl (塩化ナトリウム)、OD280 (280nmでの光学密度)、OD405 (405nmでの光学密度); OD600 (600nmでの光学密度); PAGE (ポリアクリルアミドゲル電気泳動)、EtOH (エタノール)、PBS (リン酸緩衝生理食塩水 [150 mM NaCl, 10 mM リン酸ナトリウム緩衝液, pH 7.2]); LAS (ラウリルスルホン酸ナトリウム)、SDS (ドデシル硫酸ナトリウム)、 Tris (トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)、TAED (N,N,N'N'-テトラアセチルエチレンジアミン)、BES (ポリエステルスルホン(polyesstersulfone))、mes (2-モルホリノエタンスルホン酸1水和物(2‐morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate)f.w. 195.24シグマ 番号M‐3671)、CaCl2 (塩化カルシウム無水物、f.w. 110.99、シグマ 番号C‐4901)、DMF (N,N-ジメチルホルムアミド、f.w. 73.09, d = 0.95)、 Abz‐AGLA‐Nba (2-アミノベンゾイル-L-アラニルグリシル-L-ロイシル-L-アラニノ-4-ニトロベンジルアミド(2‐Aminobenzoyl‐L‐alanylglycyl‐L‐leucyl‐L‐alanino‐4‐ nitrobenzylamide)、f.w. 583.65、Bachem 番号H‐6675、VWR カタログ番号100040‐598); SBG1% (「グルコース含有スーパーブロス」、6gソイトン[ディフコ], 3g 酵母抽出物, 6g NaCl, 6g グルコース); pHをNaOH で7.1に調整後周知の方法で滅菌、w/v (重量/体積)、v/v (体積/体積)、Npr及びnpr (中性メタロプロテアーゼ)、SEQUEST(商標)(SEQUESTデータベースサーチプログラム、ワシントン大学)、Npr及びnpr (中性メタロプロテアーゼ遺伝子)、nprE 及びNprE (バシルス アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)中性メタロプロテアーゼ)、PMN (精製MULTIFECT(商標)メタロプロテアーゼ)、MS (マススペクトロスコピー)、SRI (汚れ除去指標(Stain Removal Index))及びBMI (血液 牛乳 インク)
TIGR (ゲノム研究所(Institute for Genomic Research)、ロックビル, MD); AATCC (アメリカン アソシエーション オブ テキスタイル アンド カラリング ケミスト(American Association of Textile and Coloring Chemists))、アマシャム(Amersham) (アマシャム ライフ サイエンス インク(Amersham Life Science, Inc.)アーリントン ハイツ、 IL); こーニング(Corning) (コーニング インターナショナル(Corning International)、コーニング、NY); ICN (アイシーエヌ ファルマシューティカル インク(ICN Pharmaceuticals, Inc.)、コスタ メサ、CA)、ピアス(Pierce) (ピアス バイオテクノロジー(Pierce Biotechnology)、ロックフォールド、IL)、イークエスト(Equest) (イークエスト(Equest)、ウォーリック インターナショナル グループ インク(Warwick International Group, Inc.)、フリントシャー、UK)、 EMPA (Eidgenossische Material Prufungs und Versuch Anstalt, St. Gallen, Switzerland); CFT (センター フォー テスト マテリアル(Center for Test Materials)、フラールディンゲン、オランダ)、アミコン(Amicon) (アミコン インク(Amicon, Inc.)、ベバリー、MA); ATCC(アメリカン タイプ カルチャー コレクション(American Type Culture Collection)、マナサス、VA); ベクトン ディッキンソン(Becton Dickinson) (ベクトン ディッキンソン ラボウェア(Becton Dickinson Labware)、リンカーン パーク、NJ); パーキン‐エルマー(Perkin-Elmer) (パーキン‐エルマー(Perkin-Elmer)、, ウェルズリー、MA)、レイニン(Rainin) (レイニン インストルメント(Rainin Instrument, LLC)、ウォバーン、MA)、エッペンドルフ(Eppendorf) (エッペンドルフ エージー(Eppendorf A)、ハンブルグ、ドイツ)、ウォーターズ(Waters) (ウォーターズ インク(Waters, Inc.)、ミルフォード、MA)、ジーンアート(Geneart) (ジーンアート(Geneart GmbH)、, レーゲンスブルグ、ドイツ)、パースペクティブ バイオシステムズ(Perseptive Biosystems) (パースペクティブ バイオシステムズ(Perseptive Biosystems)、ラムジー、MN)、モレクキュラー プローブス(Molecular Probes) (モレクキュラー プローブス(Molecular Probes)、ユージーン, OR); バイオラッド(BioRad) (バイオラッド(BioRad)、リッチモンド、 CA); クロンテック(Clontech) (クロンテック ラボラトリーズ(CLONTECH Laboratories) パロ アルト、 CA)、 カーギル(Cargill) (カーギル インク(Cargill, Inc.)、ミネアポリス、 MN)、ディフコ(Difco) (ディフコ ラボラトリーズ(Difco Laboratories)、デトロイト、 MI)、ギブコ ビーアールエル(GIBCO BRL)又は ギブコ ビーアールエル (Gibco BRL) (ライフ テクノロジーズ インク、(Life Technologies, Inc.)、ゲイサーズバーグ、 MD)、ニューブランスウィック(New Brunswick) (ニューブランスウィック サイエンティフィック カンパニー インク(New Brunswick Scientific Company, Inc.)、 エジソン、 NJ); サーモエレクトロン(Thermoelectron) (サーモエレクトロン コープ(Thermoelectron Corp.)、 ウォルサム、 MA)、ビーエムジー (BMG) (ビーエムジーラボテック 社(BMG Labtech, GmbH)、 オッフェンブルグ、 ドイツ)、グライナー(Greiner) (グライナー バイオ‐ワン(Greiner Bio-One)、 クレムスミュンスター、オーストリア)、ノバゲン (Novagen) (ノバゲン インク(Novagen, Inc.)、マジソン、 WI)、ノーベックス(Novex)(ノーベックス(Novex)、サンディエゴ、CA)、; フィンザイム(Finnzymes) (フィンザイム(Finnzymes)、 OY、フィンランド)、キアゲン(Qiagen) (キアゲン インク(Qiagen, Inc.)、バレンシア、 CA)、インビトロジェン(Invitrogen) (インビトロジェン コープ(Invitrogen Corp.)、カールズバッド、 CA)、シグマ(Sigma) (シグマ ケミカル 社(Sigma Chemical Co.)、セントルイス、 MO)、デュポン インストルメンツ(DuPont Instruments) (アシュビル、 NY)、グローバル メディカル インストルメンテーション(Global Medical Instrumentation)又は ジーエムアイ(GMI) (グローバル メディカル インストルメンテーション(Global Medical Instrumentation)、ローズマリー、 MN)、エムジェー リサーチ(MJ Research) (エムジェー リサーチ(MJ Research)、 ウォルサム、 MA)、インフォーズ(Infors) (インフォーズ エイジー(Infors AG)、 Bottmingen、スイス)、ストラタジーン(Stratagene) (ストラタジーン クローニング システムズ(Stratagene Cloning Systems)、ラ ホーラ、 CA)、ロシュ(Roche) (ホフマン ラ ロシュ インク(Hoffmann La Roche, Inc.)、 ナットレー、 NJ)、アジレント(Agilent) (アジレント テクノロジーズ(Agilent Technologies)、パロ アルト、 CA)、メルク(Merck) (メルク アンド シーオー(Merck & Co.)、 ローウェー、 NJ)、イオン ビーム アナリシス ラボラトリー(Ion Beam Analysis Laboratory) (イオン ビーム アナリシス ラボラトリー(Ion Bean Analysis Laboratory)、 ユニバーシティー オブ サリー イオン ビーム センター(The University of Surrey Ion Beam Centre) (ギルフォード、 UK)、ティーオーエム(TOM) (Terg-o-Meter)、ビーエムアイ(BMI) (血液、牛乳、インク)、バッケム(BaChem) (バッケム エージー(BaChem AG)、 Bubendorf, スイス)、モレキュラー デバイシズ(Molecular Devices) (モレキュラー デバイシズ インク(Molecular Devices, Inc.)、 サニーベール、 CA)、コーニング(Corning) (コーニング インターナショナル(Corning International)、コーニング、 NY)、マイクロカル(MicroCal) (マイクロカル インク(Microcal, Inc.) ノースハンプトン、 MA)、ケミカル コンピューティング(Chemical Computing) (ケミカル コンピューティング コープ(Chemical Computing Corp.)、モントリール、 Canada)、エヌシービーアイ(NCBI) (ナショナル センター フォー バイオテクノロジー インフォメーション(National Center for Biotechnology Information))、ベックマン(Beckman) (ベックマン‐コールター(Beckman-Coulter)、フラートン、CA)、サイツシェンク(SeitzSchenk) (SeitzSchenk Filtersystems GmbH, バートクトイツナハ, ドイツ); ポール(Pall) (ポール コープ(Pall Corp.)、イーストヒルズ、 NY)、及びマルバーン インストルメンツ(Malvern Instruments) (マルバーン インストルメンツ インク(Malvern Instruments, Inc.)、 ウースターシャー、 UK)
アッセイ
次のアッセイは下記に記載する実施例に用いた。下記に提供する手順からの任意の偏差は実施例に示される。本実施例にて、反応の完了後生成産物の吸光度を測定するために分光光度計を用いた。
BCA(ビシンコニン酸)アッセイ
これらのアッセイにおいて、BCA(ピアス)アッセイをマイクロタイタープレート(MTP)スケールでプロテアーゼサンプルのタンパク質濃度を決定するために用いた。このアッセイ系において、化学及び試薬溶液は、BCAタンパク質アッセイ試薬及びピアス希釈緩衝液(50 mM MES, pH 6.5, 2mM CaCl2, 0.005% TWEEN(商標)-80). 装置をSpectraMAX (340タイプ; Molecular Devices) MTPリーダーを用いた。MTPはコースターから得た(9017タイプ)。
これらのアッセイにおいて、ブラッドフォード染色試薬(クイック スタート)アッセイをMTPスケールでプロテアーゼサンプルのタンパク質濃度を決定するために用いた。このアッセイ系において、化学及び試薬溶液は、クイック スタートブラッドフォード染色試薬(BIO‐RADカタログ番号500‐0205)、希釈緩衝液 (10mM NaCl, 0.1mM CaC12, 0.005%TWEEN(商標)‐80 ). 装置はBiomek FX Robot (Beckman) 及びSpectraMAX (340タイプ) MTPリーダーを用いた。MTPはコースターから得た(9017タイプ)。
このアッセイにて用いる洗剤は酵素本明細書にて記載のように熱不活化を通して分解された酵素又は市販洗剤中に存在する酵素を含まなかった。装置はエッペンドルフ サーモミキサー及びSpectraMAX (340タイプ) MTPリーダーを用いた。MTPsはコースターから得た(9017タイプ)。
ミリキュウ(Milli‐Q)水は6 gpg水硬度(Ca/Mg=3/1)、及び1.5g/lの漂白剤を含まない AATCC 2003標準参照液体洗剤を加えた。洗剤液を少なくとも15分間激しく攪拌した。それらから5 mM HEPES (酸非含有) を加え、pH8.0に調整した。
円の直径0.25インチである血液、牛乳及びインク(BMI)を含む微小布見本をCFT Vlaardingenから入手した。布見本の切断の前に、布地(EMPA 116)を水で洗浄した。表面全体を暴露するためにひとつの微小布見本を96穴マイクロタイタープレートの各ウェルに垂直になるように置いた(つまりウェルの穴の底に平に置いたのではない)。所望の洗剤液を本明細書に記載のように調製した。25℃にサーモミキサーを平衡化後、190μlの洗剤液を微小布見本を含むマイクロタイタープレートの各ウェルへ添加した。この液に10μlの希釈酵素溶液を加え、最終酵素濃度が1μg/ml(BCAアッセイにて検出)となった。マイクロタイタープレートをテープで蓋をし、30分間1400rpmで攪拌しながらインキュベーターに置いた。適切な条件下インキュベーションに続いて、各ウェルから100μlの溶液を新しいMTPへ移した。各ウェルに100μlの溶液を含む新しいMTPをMTPSpectraMaxリーダーを用いて405nmで測定した。ブランクコントロール及び二つの微小布見本及び洗剤含有しかし酵素を含んでいないコントロールも含んだ。
96穴ベイクドエッグヨーク基質プレートをニワトリ卵黄から調製した。ニワトリ卵黄を卵白から分離し、卵黄膜を除き、ミリキュウ水で20%(体積/重量)希釈した。希釈した卵黄をマグネティックスターラーを用いて室温で15分間攪拌した。8チャンネルピペットを用いて、5μlを注意深く96穴V底型プレート(コースター3894番)の各ウェルの中央へ加えた。プレートを90℃にて1時間焼き、室温にて冷却した。ベイクドエッグヨーク基質プレートを室温に保存し、調製の1週間内で使用した。全自動用食器洗剤を本明細書に記載のように調製し、50℃に予熱した。190μlの洗剤液を8チャンネルピペット装置を用いて各ウェルに添加した。10μlの希釈酵素を96チャンネルピペットを用いて96穴プレートの各ウェルに添加した。プレートを注意深く吸着ホイルシールで蓋をし、30分間攪拌しながら50℃でインキュベーションした。120μlの反応混合物を新しい96穴ウェル平底プレートへ移し、吸光度/光散乱を405nmで測定した。405nmでの吸光度/光散乱は卵黄除去に比例する。
全自動用食器洗剤を本明細書に記載のように調製した。用いた装置はNew Brunswick Innova 4230シェーカー/インキュベーター及びSpectraMAX (340タイプ) MTPリーダーである。MTPはコースター社から得た(9017タイプ)。染料含有熟成卵黄見本(CS‐38)をCenter for Test Materials(Vlaardingen, Netherlands)から入手した。 微小布見本を0.25インチの円に切断する前に布地を水で洗浄した。ひとつの微小布見本を96穴マイクロタイタープレートの各ウェルに置いた。試験洗剤を50℃に平衡化した。190μlの洗剤液を微小布見本を含むマイクロタイタープレートの各ウェルへ添加した。この液に10μlの希釈酵素溶液を加えた。マイクロタイタープレートを粘着ホイルで蓋をし、30分間攪拌しながらインキュベーターに置いた。インキュベーションに続いて、各ウェルから100μlの溶液を新しいマイクロタイタープレートへ移した。マイクロタイタープレートをSpectraMaxマイクロタイタープレートリーダーを用いて405nmで測定した。ブランクコントロール及び微小布見本及び洗剤を含有するが酵素を含んでいないコントロールも含んだ。
コメデンプンアッセイはアミラーゼ性能試験である。洗剤を本明細書に記載のように調製した。用いた装置はNew Brunswick Innova 4230シェーカー/インキュベーター及びSpectraMAX (340タイプ) MTPリーダーである。MTPはコースター社から得た(3641タイプ)。オレンジ染料含有熟成卵黄見本(CS‐28)をCenter for Test Materials (Vlaardingen, Netherlands)から入手した。 微小布見本を0.25インチの円に切断する前に布地を水で洗浄した。二つの微小布見本を96穴マイクロタイタープレートの各ウェルに置いた。試験洗剤を20℃(北アメリカ)又は40℃(西ヨーロッパ)に平衡化した。190μlの洗剤液を微小布見本を含むマイクロタイタープレートの各ウェルへ添加した。この液に10μlの希釈酵素溶液を加えた。マイクロタイタープレートを粘着ホイルで蓋をし、一時間750rpmで攪拌しながら所望の試験温度(一般的に20℃又は40℃)でインキュベーターに置いた。インキュベーションに続いて、各ウェルから150μlの溶液を新しいマイクロタイタープレートへ移した。このマイクロタイタープレートをSpectraMaxマイクロタイタープレートリーダーを用いて488nmで測定し、洗浄を定量した。ブランクコントロール及び微小布見本及び洗剤を含有するが酵素を含んでいないコントロールも含んだ。
得られた吸光度の値をブランク値(つまり、酵素非存在下で微小布見本のインキュベーション後得られた値)で修正した。得られた吸光度を加水分解活性として測定した。
このアッセイ系において、用いた試薬溶液は、
100mM Tris/HCl, pH 8.6, 0.005% TWEEN(商標)‐80 (Tris)
100mM Tris/HCl, pH 8.6, 10mM CaCl2及び
0.005% TWEEN(商標)‐ 80 (Tris/Ca)及び
DMSO (suc‐AAPF‐pNA保存溶液) (Sigma: S‐7388)中160mM suc‐AAPF‐pNAであった。
suc‐AAPF‐pNAワーキング溶液の調製するために、1ml AAPFストックを100 ml Tris/Ca緩衝液に加え、少なくとも10秒間良く混合した。 アッセイを10μlの希釈酵素溶液を各ウェルに加えて実施し、続いてすぐに190μlのAAPFワーキング溶液を添加した。溶液を5秒間混合し、25℃でMTPリーダーにて410nmで測定した。
このアッセイ系において、用いた化学及び試薬溶液は、
ジメチルカゼイン (DMC): Sigma C‐9801
TWEEN(商標)‐80:Sigma P‐8074
PIPES緩衝液(酸無添加): Sigma P‐1851であり、
15.1gを960mlの水に溶解し、4N NaOHを用いてpHを7.0に調整し、1mlの5%TWEEN(商標)‐80を加え体積を1000mlとする。PIPES及びTWEEN(商標)‐80の最終濃度はそれぞれ50 mM及び0.005%である。
ピクリルスルホン酸 (TNBS): Sigma P‐2297 (5%水溶液)、
試薬 A: 45.4gの Na2B4O710H2O (Merck 6308)及び15mlの4N NaOHを一緒に溶解し、最終体積を1000ml (必要に応じて温める)、及び
試薬B: 35.2g のNaH2PO41H2O (Merck 6346)及び0.6gのNa2SO3(Merck 6657) を一緒に溶解し最終体積を1000mlとする。
本明細書に記載のように、アルファ‐アミラーゼ濃度及び特異的活性を阻害性ポリクローナル抗体で滴定により決定した。バシルス ステアロテルモフィルス(Bacillusstearothermophilus)アルファ‐アミラーゼ(AmyS)に対するポリクローナル抗体はAmyS及びバシルス種(Bacillus sp.)TS23由来アルファ‐アミラーゼを強く阻害(例えば、結合がとてもきついので活性消失の直線滴定を作成する)することがわかった。従って、この抗体を酵素濃度測定に用いることができ、同様に特異的活性を計算するために用いる。手短に言うと、いくつかの既知濃度の抗体により生じる酵素阻害量を測定する。この情報から完全に阻害するのに必要な抗体の濃度を推定でき、サンプル中の酵素量と等量になる。アルファ‐アミラーゼ活性及び阻害を蛍光性BODIPY‐デンプンアッセイを用いて測定した。緩衝液は0.005% Tween‐80含有50mM MOPS, pH 7.0であった。
本明細書にて記載のように、スブチリシン及びASPプロテアーゼ濃度及び特異的活性はエグリンCを用いて滴定することにより決定した。ヒルのヒルド メディシナリス(Hirudo medicinalis)由来のエグリンCは スブチリシン及びASPプロテアーゼに強く結合するタンパク質阻害剤である。 (Heinz 他、Biochemistry, 31(37): 8755-66 [1992])。従って、エグリンCを酵素濃度測定に用いることができ、同様に、特異的酵素活性を計算することができる。簡潔に言えば、いくつかの既知濃度エグリンCを用いて生産される酵素阻害の量を測定する。この情報から完全な阻害に必要とされるエグリンCの濃度を算出する。これはサンプルにおける酵素濃度と同等である。
変異体タンパク質サンプルの電気泳動の移動を7.5%又は12.5%濃度いずれかで、プレキャストネイティブポリアクリルアミドゲル(pre‐cast native polyacrylamide gels)(PhastGel Homogeneous)にてPhastGelシステム(GE Healthcare)を用いて測定した。ストリップ緩衝液(PhastGel Native)を0.88MのL‐アラニン含有0.25M TrispH8.8からなる緩衝液を用いた。一般的な泳動条件は陽極から陰極の距離が3.7cmで12.75分400Vであった。
市販洗剤製剤の熱不活性化は非酵素的成分の性質を維持しながら行なう任意のタンパク質成分の酵素的活性の分解に役立つ。つまり、この方法は本発明の酵素変異体を試験時に使用する商業的に購入する洗剤の調製に有用であった。北アメリカ(NA)及び西ヨーロッパ(WE)の強力液体洗濯(HDL)洗剤については、重量を量る前、液体洗剤(ガラスボトル中)を95℃2時間水浴に置くことにより熱不活性化を行った。北アメリカ(NA)及び日本(JPN)の強力顆粒洗濯(HDG)洗剤の熱不活性化のインキュベーション時間は8時間及び西ヨーロッパ(WE)のHDG洗剤は5時間であった。NA及びWE自動食器洗浄(ADW)洗剤の熱不活性化のインキュベーション時間は8時間であった。洗剤を地方のスーパーマーケットから購入した。熱未処理及び熱処理洗剤両方は不活性化パーセントを正確に決定するために洗剤を溶かして5分以内にアッセイを実施した。酵素活性はsuc−AAPF−pNAアッセイを用いて試験した。
Bodipy-デンプンアッセイをEnzChek(商標)ウルトラアミラーゼアッセイキット(E33651, Invitrogen)を用いて実施した。1mg/mLのDQデンプン基質の保存溶液を100μLの50mM酢酸ナトリウム pH 4.0緩衝液に凍結乾燥された基質を含むバイアルの内容物を溶解することにより調製した。バイアルを約20秒間ボルテックスで混合し、溶解されるまで室温、暗所、時折混合しながら放置した。900μLのアッセイ緩衝液(2.6mM CaCl2含有50mM酢酸ナトリウムpH5.8) を添加し、バイアルを約20秒間ボルテックスにて混合した。用いるまで基質溶液を室温又は4℃、暗所、で保存した。アッセイのために、100μg/mLのDQ基質のワーキング溶液をアッセイ緩衝液中1mg/mLの基質溶液から調製した。190μLの100μg/mL基質溶液を96穴平底マイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。10μLの酵素サンプルをウェルに添加し、800rpmにてサーモミキサーを用いて30秒間混合した。緩衝液及び基質のみ(酵素含まず)を含むブランクサンプルをアッセイに含んだ。蛍光強度の変化速度を25℃、5分間にて蛍光マイクロタイタープレートリーダーで測定した(励起:485nm、発光:520nm)。
酵素活性のためのトウモロコシ粉基質のデンプン加水分解。有機トウモロコシ粉(Azure Farms、ロット番号 03227)を固体分配装置(V&P Scientific)を用いてグレイナー(Greiner)96ウェルマイクロプレート、ポリプロピレン、黒、平底、チムニーウェル(カタログ番号655209)に均一に広げた。85μLの20mM酢酸ナトリウムpH 5.6を各ウェルに添加し、混合した。ホイルシールをプレートの上に適用し、プレートを20分から30分サーモミキサーを用いて70℃でプレインキュベーションした。酵素サンプルをアジレント(Agilent)ポリプロピレンプレート(5042‐1385)中20mM酢酸ナトリウムで希釈した。11μLの希釈酵素サンプルを基質プレートに添加し、プレートを別のホイルで硬く蓋をした。それからプレートを金属ブロックを伴うLabnet VorTemp 56インキュベーター/シェーカー(カタログ番号S2056A)へ移し、95℃まで予熱し、攪拌速度を500rpmに設定した。インキュベーションを30分続けた。インキュベーション後、プレートをアイスバケットにて迅速に冷却し、デンプン加水分解反応を各ウェルに100μLの0.1N H2SO4を添加することにより停止した。プレートを簡単に混合し、デンプン加水分解反応生産物をPAHBAHアッセイ又はHPLCいずれかで分析した。
このアッセイにおいて、トウモロコシ粉基質溶液の粘度低下を粘度計で測定した。トウモロコシデンプン基質スラリーを蒸留水中30%のトウモロコシ粉乾燥固体を有するバッチモードで新鮮な状態で作成し、硫酸を用いてpH5.8に調整した。各流出において、50グラムのスラリー(15グラム乾燥固体)を秤量し70℃に温まるまで10分間予めインキュベーションした。アミラーゼ添加の時、75rpmの攪拌を伴いながら温度をすぐに70℃から85℃まで急速にあげた。いったんスラリー及びアミラーゼ混合物の温度が85℃に到達すれば、温度を一定に保ち粘度をさらに30分間モニターした。
結合アッセイを酵素の基質結合を決定して行った。それは、
プロテアーゼ(ASP)電荷ラダー変異体(電荷変化=野生型ASPと比較して−5から+3)のリグニン及びセルロースへの結合、及び
アミラーゼ(AmyS)電荷ラダー変異体(電荷変化=野生型AmySと比較して−12から+12)のトウモロコシ茎葉及びバガスへの結合
である。用いた基質は次を含む。すなわち、
リグニン(バガスの完全糖化から回収)、87.5%液体、バガス(ブラジルからサトウキビバガス、希酸、National Renewable Energy Laboratoryにより前処理、洗浄及びpH5で緩衝化)、PASC (リン酸膨張セルロース:純粋、非結晶セルロース、50mM酢酸ナトリウムpH5で希釈)、AFEX(アンモニア繊維膨張トウモロコシ茎葉)及びPCS (希硫酸前処理トウモロコシ茎葉、洗浄及びpH5.0へ調整)である。すべての基質を使用前に所望のパーセントの固体へ調製した。
ASPプロテアーゼ電荷ラダー変異体(電荷変化=野生型ASPと比較して−5から+3)を精製し、0.5mg/mlから1.5mg/mlへ希釈した。約2.4%リグニン、0.5%PASC,及び1%バガス溶液をホウ酸緩衝液(40mM, pH8.5, 0.016% Tween20)中に調製した。各200μlを96穴フィルタープレートをへ加えた。コントロールウェルに緩衝液を入れた。10μlの0.276g/ml Tween‐20を各ウェルへ添加し、Tween‐20の最終濃度が1.38%となった。コントロールウェルへ10μlの水を入れた。リグニン及びバガス結合アッセイのために、ASP電荷ラダー変異体を200ppmへ希釈し10μlの希釈酵素を各ウェルへ添加した。PASC結合アッセイのために、ASP電荷ラダー変異体を40ppmへ希釈し10μlの希釈酵素を各ウェルへ添加した。酵素の添加後、各ウェルをピペットチップを用いて混合した。プレートに蓋をし、室温にて振盪しながらインキュベーションした。インキュベーションの1時間後、ろ過物を96ウェルプレートに集めた。ろ過物を1:20に希釈後、ろ過物中の酵素活性をsuc−AAPF−pNAアッセイを用いて測定した。タンパク質結合のパーセントは基質を伴うインキュベーションサンプルのろ過物対コントロールウェルのろ過物との比として計算した。
アミラーゼ電荷ラダー変異体を精製し、試験用に200ppmに希釈した。1%セルロースバガス溶液をホウ酸緩衝液(40mM,pH8.5,0.016% Tween80)中に調製した。150μlのバガス溶液をマイクロタイターろ過プレートにおける各ウェルへ添加した。150μlのホウ酸緩衝液をコントロールとして用いるように別のウェルのセットへ添加した。10μlのアミラーゼ電荷ラダー変異体をろ過プレートへ添加し、各条件は二度繰り返した。プレートを室温にて2時間インキュベーションした。ろ過物を回収し、上清のアミラーゼ活性をBODIPY‐デンプンアッセイにより測定した。
プロテアーゼ変異体を30分間標準洗浄条件下BMI微小布見本を伴い又は伴わずインキュベーションした。遊離酵素の量をsuc−AAPF−pNAアッセイにより測定した。微小布見本へ結合した酵素フラクションを次のように計算した。それは
結合フラクション=(布見本の非存在下酵素活性−布見本の存在下酵素活性)/(布見本の非存在下酵素活性)
アミラーゼ変異体を30分間標準洗浄条件下CS−28コメデンプン微小布見本伴い又は伴わずインキュベーションした。遊離酵素の量をBODIPY‐デンプンアッセイにより測定した。微小布見本へ結合した酵素フラクションを次のように計算した。
結合フラクション=(布見本の非存在下酵素活性−布見本の存在下酵素活性)/(布見本の非存在下酵素活性)
バシルス スブチリス(B. subtilis)におけるプロテアーゼ生産
この実施例において、バシルス スブチリス(B. subtilis)における多様なプロテアーゼ生産するための実施した実験を記載する。特に、NprE、ASP、GG36、及びFNA用発現ベクターを有するバシルス スブチリス(B. subtilis)の形質転換に用いた方法を提供する。形質転換は周知の方法(WO 02/14490を参照願いたい)で実施した。
バシルス スブチリス(B. subtilis)へのプラスミドpUBnprEの形質転換に用いた方法を提供する。NprE前駆体タンパク質をコードするDNA配列(バシルス アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)由来nprEリーダー、nprE pro及びnprE mature DNA配列)を下記に示す。
オリゴAB1740:CTGCAGGAATTCAGATCTTAACATTTTTCCCCTATCATTTTTCCCG (SEQ ID NO :4)及び、
オリゴAB1741:GGATCCAAGCTTCCCGGGAAAAGACATATATGATCATGGTGAAGCC (SEQ ID NO:5)
を用いてPCRによりバシルス アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)の染色体DNA由来nprEを増幅することにより構築した。
1)30秒98℃、
2)10秒98℃、
3)20秒55℃、
4)1分72℃、
5)2から4の段階を25サイクル、及び
6)5分72℃
である。
バシルス スブチリス(B. subtilis)へのプラスミドpHPLT‐ASP‐C1‐2の形質転換に用いる方法を提供する。バシルス スブチリス(B. subtilis)におけるASP発現を最適化するために合成DNA配列をこれ等の発現実験において利用するDNA2.0により生産した。バシルス種(Bacillus sp.)に適用コドン使用頻度を有し、野生型ASP前駆体タンパク質をコードするDNA配列(合成ASPDNA配列)を下記に示す。
MRSKKRTVTRALAVATAAATLLAGGMAAQA (SEQ ID NO:9)
である。
ATGAGAAGCAAGAAGCGAACTGTCACAAGAGCTCTGGCTGTGGCAACAGCAGCTGCTACACTCTTGGCTGGGGGTATGGCAGCACAAGCT (SEQ ID NO:10)
この実施例において、バシルス スブチリス(B. subtilis)におけるGG36(またバシルス レンタス(B. lentus)スブチリシンとして本明細書にていう)を生産するための導入実験を示す。発現プラスミドpAC‐GG36ciをコンセンサスaprEプロモーター及びBPN'転写ターミネーターの制御下aprEシグナル配列の8番目のコドンに融合したGG36コドン‐改良遺伝子を用いて組み立てた。下記に示す配列において、太字及びイタリックフォントはコンセンサスaprEプロモーターを示し、標準フォントはシグナル配列を示し、下線部フォントはプロ配列を示し、太字フォントはGG36成熟プロテアーゼをコードするDNAを示し、及び下線部イタリックフォントはBPN'ターミネーターを示す。GG36成熟プロテアーゼのコード領域はクローニングの目的のためにKpnI及びXhoI制限部位により隣接される。
pUB110=プラスミドpUB110(McKenzie他、Plasmid 15:93-103 [1986])由来のDNAフラグメント、
pBR322 =プラスミドpBR322 (Bolivar他、Gene 2:95-1 13 [1977])由来のDNAフラグメント、
pC194 =プラスミドpC194 (Horinouchi他、J Bacteriol, 150:815-825 [1982])由来のDNAフラグメント、
である。
プラスミドの特徴は次の通りである。それは、
バシルス スブチリス(B. subtilis)用Ori =pUB110由来複製部位(origin)、
CAT = pC194由来クロラムフェニコール耐性遺伝子、
pMBl部位(origin)= pBR322由来複製部位、
bla = pBR322由来ベータ‐ラクタマーゼ,
Short aprEプロモーター=コンセンサス転写プロモーター、
シグナルペプチド(Signal Peptide)= シグナルペプチド(signal peptide)、
プロペプチド=GG36プロ領域、
GG36ci成熟ペプチド=成熟GG36 (この実験で発現した各変異体のコード領域により置換される)、
BPN' ターミネーター=スブチリシンBPN'由来転写ターミネーター
である。
この実施例において、バシルス スブチリス(B. subtilis)におけるFNA(またバシルス アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)スブチリシンBPN´−Y217Lとして本明細書にていう)を生産するための導入実験を示す。発現プラスミドpAC‐FNAreをコンセンサスaprEプロモーター及びBPN'転写ターミネーターの制御下aprEシグナル配列の8番目のコドンに融合したFNA遺伝子を用いて組み立てた。下記に示す配列において、太字及びイタリックフォントはコンセンサスaprEプロモーターを示し、標準フォントはシグナル配列を示し、下線部フォントはプロ配列を示し、太字フォントはFNA成熟プロテアーゼをコードするDNAを示し、及び下線部イタリックフォントはBPN'ターミネーターを示す。FNA成熟プロテアーゼのコード領域はクローニングの目的のためにKpnI及びXhoI制限部位を含む。
pUB110=プラスミドpUB110 (McKenzie他、Plasmid 15:93-103 [1986])由来のDNAフラグメント、
pBR322 =プラスミドpBR322 (Bolivar他、Gene 2:95-1 13 [1977])由来のDNAフラグメント、
pC194 =プラスミドpC194 (Horinouchi他、J Bacteriol, 150:815-825 [1982])由来のDNAフラグメント、
である。
プラスミドの特徴は次の通りである。それは、
バシルス スブチリス(B. subtilis)用Ori=pUB110由来複製部位(origin)、
CAT=pC194由来クロラムフェニコール耐性遺伝子、
pMBl部位(origin)= pBR322由来複製部位、
bla=pBR322由来ベータ‐ラクタマーゼ,
Short aprEプロモーター=コンセンサス転写プロモーター、
シグナルペプチド(Signal Peptide)=シグナルペプチド(signal peptide)、
プロペプチド=FNAプロ領域、
FNA成熟ペプチド=成熟FNA (この実験で発現した各変異体のコード領域により置換される)、
BPN' ターミネーター=スブチリシンBPN'由来転写ターミネーター
である。
バシルス スブチリス(B. subtilis)におけるアミラーゼ生産
バシルス ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)アルファ‐アミラーゼ(またAmySとして本明細書にていう)、AmySの変異欠損体(29アミノ酸欠損を有するS242Q、またS242Qとして本明細書にていう)、及びバシルス種(Bacillus sp.)TS‐23由来アルファ‐アミラーゼの欠損体(またAmyTS‐23tとして本明細書にていう)及びバシルス スブチリス(B. subtilis)におけるそれらの変異体を生産するために導入する実験を記載する。形質転換を周知の方法(例えば、WO 02/14490を参照願いたい)にて実施した。簡単にいえば、親アミラーゼをコードする遺伝子をLATプロモーター(PLAT)、LATシグナルペプチドをコードする配列(preLAT)、を含み、クローニングのためにPstI及びHpaI制限部位を伴うpHPLT発現ベクターへクローン化した。
MKQQKRLYARLLTLLFALIFLLPHSAASA (SEQ ID NO:22)
Ethyl 4 F:
5'CTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTCAGCAGCCGCACCGTTTAACGGTACCATG 3'(SEQ ID NO:28)、及び
Ethyl 4 R:
5'CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAGGTCGTTTTTCTAGGAAC3' (SEQ ID NO:29)
を用いてプラスミドpICatH‐Ethyl4(ori 1)由来PstI‐HpaIフラグメントとして増幅した。
pUB110=プラスミドpUB110 (McKenzie他、Plasmid 15:93-103 [1986])由来のDNAフラグメント
である。
プラスミドの特徴は次を含む。それは、
ori‐pUB110= pUB110由来複製部位(origin)、
neo=pUB110由来ネオマイシン耐性遺伝子、
Plat=バシルス リチェニフォルミス(B. licheniformis)アミラーゼ由来転写プロモーター
Pre LAT=バシルス リチェニフォルミス(B. licheniformis)アミラーゼ由来シグナルペプチド、
AmyS=欠損AmyS及びアミラーゼ変異体のコード領域、
ターミネーター =バシルス リチェニフォルミス(B. licheniformis)アミラーゼ由来転写ターミネーター
である。
酵素変異体の発現
この実施例は前記実施例の形質転換バシルス スブチリス(Bacillus subtilis)の多様な組み換え酵素を発現するために用いる方法を記載する。
組み換えバシルス スブチリス(Bacillus subtilis)を栄養培地において従来のバッチ発酵により培養した。バシルス アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)中性メタロプロテアーゼ又はその変異体を含むバシルス スブチリス(B. subtilis)培養のひとつのグリセロールバイアルを200mg/Lクロラムフェニコール含有600mlのSBG1%培地に播種した。培養培地を37℃にて36から48時間培養し、その後、培養液体を周知のように12,000rpmで遠心分離機により回収した。この方法を重複して行った。分泌中性メタロプロテアーゼをBES(ポリエーテルスルホン)10kDaカットオフを伴うアミコンフィルターシステム8400を用いて約10倍に濃縮した。
組み換えバシルス スブチリス(Bacillus subtilis)を栄養培地において従来のバッチ発酵により培養した。セルロモナス・ボゴリエンシス(C. bogoriensis)セリンプロテアーゼ又はその変異体を含むバシルス スブチリス(B. subtilis)培養のひとつのグリセロールバイアルを200mg/Lクロラムフェニコール含有600mlのSBG1%培地に播種した。培養培地を37℃にて36から48時間培養し、その後、培養液体を周知のように12,000rpm(SORV ALL(商標)centrifuge model RC5B)で10℃にて遠心分離機により回収した。この方法を重複して行った。得られた上清をSeitz EKS(SeitzSchenk)にて深層ろ過により浄化した。得られた滅菌培養上清をさらに10kDaカットオフ(Pall Omega 10kDa Minisette; Pall)を伴う限外ろ過カセットを用いた限外ろ過により約10倍に濃縮した。得られた濃縮された粗精製セリンプロテアーゼを凍結しさらに使用するまで−20℃に保管した。
ASP発現ベクタータンパク質を含むバシルス スブチリス(B. subtilis)クローンを200μlのTSP培地+20μg/mlネオマシン含有96穴培養プレート(BD,353075)のグリセロールストックからスチール製96穴レプリケーターを用いて複製し、加湿密閉にて220rpm37℃にて終夜培養した。終夜培養培地から15μlをMillipore MultiScreen Filter Platesにおいて185μlの規定の培地+20μg/mlネオマシンへ播種するために用いた。この培養培地は主要な窒素源として尿素を、主な炭素源としてグルコースを伴う、及び好ましい細胞増殖のために1%ソイトンで補強されるMOPS緩衝液に基づく栄養強化半規定培地であった。フィルタープレートを加湿密閉にて220rpm37℃にて60時間培養した。このインキュベーションに続き、培養培地をフィルタープレートを通してろ過し、回収した。さらなる精製又は濃縮を行わなかった。ろ過物のストックを長期間の安定性のために最終濃度40%プロピレングリコールとなるように調整し、96穴クリア非結合ポリスチレンプレート(Corning, CLS3641)にて4℃で保存した。
FNAまたはGG36発現ベクターを含むバシルス スブチリス(B. subtilis)クローンを200μlのLB培地+20μg/mlクロラムフェニコール含有96穴培養プレート(BD,353075)のグリセロールストックからスチール製96穴レプリケーターを用いて複製し、加湿密閉にて220rpm37℃にて終夜培養した。終夜培養培地から200μlを5mL培養管において2000μlの規定の培地+25μg/mlクロラムフェニコールへ播種するために用いた。この培養培地は主要な窒素源として尿素を、主な炭素源としてグルコースを伴う、及び好ましい細胞増殖のために1%ソイトンで補強されるMOPS緩衝液に基づく栄養強化半規定培地であった。培養管を220rpm37℃にて60時間培養した。このインキュベーションに続き、培養培地を8000xRCFより高く遠心分離をした。上澄み溶液を保存のために15mlポリプロピレン円錐管へデカントした。さらなる精製又は濃縮を行わなかった。上清ストックを長期間の安定性のために最終濃度40%プロピレングリコールとなるように調整し、4℃で保存した。
AmyS、S242Q又はAmyTS23t発現ベクターを含むバシルス スブチリス(B. subtilis)クローンを150μlのLB培地+10μg/mlネオマシン含有96穴培養プレート(BD,353075)のグリセロールストックからスチール製96穴レプリケーターを用いて複製し、加湿密閉にて220rpm37℃にて終夜培養した。終夜培養培地から100μlを5mLプラスチック培養管において2000μlの規定の培地+10μg/mlネオマシンへ播種するために用いた。この培養培地は主要な窒素源として尿素を、主な炭素源としてグルコースを伴う、及び好ましい細胞増殖のために1%ソイトン及び5mMカルシウムで補強されるMOPS緩衝液に基づく栄養強化半規定培地であった。培養管を250rpm37℃にて72時間培養した。このインキュベーションに続き、培養培地を3000xgで10分間遠心分離をした。上澄み溶液を15mlポリプロピレン円錐管へデカントし、80μLの各サンプルをタンパク質定量のために96穴プレートへ入れた。
酵素変異体の生産
この実施例は酵素電荷ラダー及び組み合わせ電荷ライブラリーの生産を記載する。
所望の物理的性質の範囲にわたって複数のタンパク質を存在するライブラリー又は周知の部位特異的突然変異の方法(例えば、US Pat. Appln. Ser. Nos., 10/576,331、11/581,102、及び 11/583,334参照願いたい。)により作成したライブラリーから選択する。それからこの特定したプローブタンパク質のセットを所望の試験においてアッセイした。
AmySprimer F 5'- CTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTC-3' (SEQ ID NO:30)、及び
AmySprimer R 5'- TTATCCTTTACCTTGTCTCCAAGC-3' (SEQ ID NO:31)
を用いてプラスミドpGov4からPstI‐HindIIIフラグメントとして増幅した。
バシルス レンタス(B. lentus)スブチリシン(=GG36)組み合わせ電荷ライブラリーの作成
コドン改良GG36遺伝子を含むpAC‐GG36ciプラスミドを組み合わせ電荷ライブラリー(CCL)の作成のためにDNA 2.0 Inc. (Menlo Park, CA)へ送付した。また、それらは形質転換によりバシルス スブチリス(B. subtilis)株(ゲノタイプ:ΔaprE、ΔnprE、ΔspoIIE、amyE::xylRPxylAcomK-phleo)に含まれた。さらに、表5−7に示すようにGG36プロテアーゼにおける4つの各部位でのポジショナルライブラリーの作成をDNA 2.0 Inc.へ依頼した。変異体は96穴プレートにてグリセロールストックとして供給された。
BPN’‐Y217L(=FNA)CCLの作成
FNA遺伝子を含むpAC‐FNAreプラスミドを組み合わせ電荷ライブラリー(CCL)の作成のためにDNA 2.0 Inc. (Menlo Park, CA)へ送付した。また、形質転換のためにバシルス スブチリス(B. subtilis)株(ゲノタイプ:ΔaprE、ΔnprE、ΔspoIIE、amyE::xylRPxylAcomK-phleo)を同社に送った。さらに、表5−8に示すように4つのFNAプロテアーゼの各部位でのポジショナルライブラリーの作成をDNA 2.0 Inc.へ依頼した。変異体は96穴プレートにてグリセロールストックとして供給された。
AmyS−S242QプラスミドDNAを形質転換バシルス スブチリス(B. subtilis)株(ゲノタイプ:ΔaprE、ΔnprE、amyE::xylRPxylAcomK-phleo)から単離し、CCL構築物のテンプレートとしてDNA 2.0 Inc.へ送付した。表5−9に示すようにAmyS−S242Q(S242Q)アミラーゼにおける4つの各部位での位置的ライブラリーの作成をDNA 2.0 Inc.へ依頼した。変異体は96穴プレートにてグリセロールストックとして供給された。
AmyTS23tはバシルス種(Bacillus sp.)TS−23アルファ‐アミラーゼの欠損体である。バシルス スブチリス(B. subtilis)株 (degUHy32、oppA、ΔspoII3501、amyE::xylRPxylAcomK- ermC、ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpr、Δvpr、ΔwprA、Δmpr-ybfJ、ΔnprB) を欠損する複数のプロテアーゼにおけるAmyTS23tの発現は記載されている(例えば、US2005/0202535A1を参照願いたい)。形質転換バシルス スブチリス(B. subtilis)細胞から単離したAmyTS23tプラスミドDNAをCCL構築物のテンプレートとしてDNA 2.0 Inc. (Menlo Park, CA)へ送付した。DNA 2.0 Inc.に次の7つの変異をAmyTS23tへ導入することにより、CCLの親構築物を調製することを依頼した。その変異はAmyTS23t‐7mut(また本明細書にてTS23t’として設計され)とよばれ、Q98R、M201L、S243Q、R309A、 Q320R、Q359E、及びK444Eである。変異体は96穴プレートにてグリセロールストックとして供給された。続いて、表5−10に示すようにAmyTS23t‐7mutアミラーゼにおける4つの各部位でのポジショナルライブラリーの作成をDNA 2.0 Inc.へ依頼した。
酵素性能
この実施例は多様なイオン強度下1.0μg/mlのAATCC HDLまたは5mM HEPES緩衝液にてBMI(血液、牛乳、インク)微小布見本アッセイでのASP変異体の試験を記載する。また、洗濯適用及び自動食器洗浄適用両方の多様なマーケットの地理的要素(例えば、異なるpH、T、及び/又は水硬度)を表す洗剤においてBMI微小布見本及びベイクドエッグアッセイでのFNA及びGG36の試験を記載する。さらに、この実施例は洗濯適用並びにデンプン液化におけるアルファ‐アミラーゼ変異体の試験を記載する。実施例1に記載の方法を用いた(「酵素性能アッセイ」及び「トウモロコシ粉加水分解」を参照願いたい)。
ゼータ電位決定
この実施例は酵素及び基質のゼータ電位の決定について記載する。粒子の表面上の電荷の存在は界面領域周辺におけるイオンの分布に影響する。結果は粒子表面近くの粒子の電荷と反対の電荷の対イオンの増加した濃度である。一つが粒子表面から除去される場合、イオンの不均一な分布が最終的に均一になる。均一分布が得られる距離はデバイ長(Debye length) (1/κ) 又は遮蔽距離(screening distance)といい、下記に説明するようにイオン強度に依存し、ここでε0は自由空間の誘電率(8.854x10−12Fm−1)、εrは液体の誘電率、kはボルツマン定数(1.38x10−23JK−1)、Tはケルビン温度、eは電子電荷(1.6022x10−19C)、Iはモルイオン強度、及びNAはアボガドロ定数(6.022x1023mol−1)である。
基質汚れへの酵素の分配
この実施例は酵素電荷、基質汚れ分配及び洗浄性能の関係を決定することを記載する。図13及び次の表は、多様なイオン強度の下5mM HEPESpH8.0緩衝液におけるASP電荷ラダープローブタンパク質の洗浄性能を示し、減少により測定される基質汚れへの酵素分配に応じたBMI微小布見本活性として測定される。イオン強度を通常の電解質、2.5mM NaCl(白色丸)、16mM NaCl(灰色丸)、及び100mM NaCl(黒色丸)の多様な量の添加により制御した。ASP電荷ラダープローブタンパク質のBMI洗浄性能は低い又は高い酵素と基質の分配両方で落下する。洗浄能力に対する最適分配は結合酵素フラクションの0.1と0.5の間で起こる。酵素と基質分配が低いとき低い性能が予想されるけれども、酵素と基質分配が高いときでの低い性能の観察は直感で理解できない。
タンパク質発現
この実施例はタンパク質電荷とタンパク質発現との関係の決定について記載する。
14Lスケールにおける流加培養のセットをASPプロテアーゼ組み合わせ電荷ライブラリー変異体(R14I-N112E-T116E-R123F-R159F、R14I-N112E-T116E-R123F、R14I-N112E-T116E、R14I-N112E、R14I、R14I-D184T、R14I-D184T-T86K、R14I-T86K-D184T-A64K及びR14I-T86K-D184T-A64K- Q81K)であって、−5から+3の電荷変化を有する変異体の生産レベルと比較して行った。種培養を600mLの培養培地(LBブロス+1%グルコース+20mg/Lネオマイシン)を含む2Lのバッフルの無い振盪フラスコに1mLの各変異体に対応するバシルス スブチリス(Bacillus subtilis)グリセロールストックを播種することにより培養した。培養をOD550が0.8から1.5に到達するまで振盪インキュベーターで175rpmにて攪拌を伴いながら37℃にてインキュベーションした。その時、種培養全部を温度、パーセント溶解酸素(%DO)、pH及び攪拌をモニターする統括制御装置を備える14Lの発酵容器へ無菌的に移した。ガスの排出をインラインマススペクトロメーターによりモニターした。用いた発酵培地(7L)は硫酸塩、微量元素、及び追加の20mg/Lネオマイシンを含むリン酸ベース緩衝液に10%大豆ミールから構成された。初期発酵パラメーターを37℃温度、pH6.8(実施中水酸化アンモニウムで調整した)、750rpm攪拌、40%DO(実施中空気及び攪拌を調整して維持した)、11slpm 空気流量、及び1バール圧力にセットした。抗発泡剤(Mazu DF204)を泡を制御するために必要に応じて加えた。10時間に対して0.5から2.1g/分のグルコースを直線的に供給する流加培養方法をトリガーとしてpH上昇を用いてプログラム(供給用に60%グルコースを用いる)した。4時間ごとに行う培地サンプリングは培地全体の15mLを採取し、次の測定を実施した。それは、分光光度計による細胞密度(550nmの吸光度を測定)、ASP変異体生産、グルコース、窒素、リン酸及び総タンパク質である。総発酵実施時間は40と45時間の間であった。
発酵の間に得たバシルス スブチリス(B. subtilis)培養サンプルを変異体ASPプロテアーゼの生産のためのアッセイをした。酵素生産物を基質N-スクシニル(succinyl)-Ala-Ala-Ala-p-ニトロアニリド(nitroanilide)(AAA-pNA)に対して活性をアッセイした。アッセイは加水分解及びp‐ニトロアニリド(Estell他、J Biol Chem, 260: 6518-6521 [1985])の放出から得られる405nmの吸光度における増加として修飾プロテアーゼの生産物を測定した。発酵装置からのバシルス スブチリス(B. subtilis)浄化上清の一部を緩衝液中でアッセイした。この緩衝液は100mM Tris、0.01mM CaCl2、0.005% TritonX‐100、pH8.6を含んだ。野生型ASP標準物をg/Lの発酵培地におけるタンパク質生産の計算のための検量線を作成するために用いた。
LAS及びキレート安定性
この実施例は陰イオン性界面活性剤及びキレートの一つ又は両方を含む反応媒体におけるタンパク質電荷及び安定性の間の関係を決定することを記載する。ストレスが有る及びストレスが無いサンプルのプロテアーゼ活性の決定のために、suc‐AAPF‐pNAアッセイを用いた。ストレスが有る及びストレスが無いサンプルのアルファ‐アミラーゼ活性の決定のために、BODIPY‐デンプンアッセイを用いた。ストレスのあるプレートからの残渣LAS及びEDTAはsuc‐AAPF‐pNA又はBODIPY‐デンプンアッセイに影響を与えない。
ドデシルベンゼンスルホネート、硫酸ナトリウム(=LAS)、シグマD−2525
TWEEN(商標)−80:シグマP−8074
TRIS緩衝液(酸を含まない)、シグマT−1378、6.35gを960mlの水に溶解し、pHを4N HClで8.2に調整する。TRISの最終濃度は52.5mMである。
LASストック溶液、MQ水中10.5%LAS溶液(=10.5g/100mlMQ)、
TRIS緩衝液、100mM/pH8.6(100mMTris/0.005%Tween80)、及び
TRIS−Ca緩衝液、pH8.6(100mM Tris/10mMCaCl2/0.005%Tween80)。
設備機器は次を含む。
フラットボトムMTP、Costar(#9017)、
バイオメックFX、
ASYSマルチピペッター、
スペクトラマックスMTPリーダー、
iEMSインキュベーター/シェーカー、
イノーバ4330インキュベーター/シェーカー、
バイオヒットマルチチャンネルピペット、及び
BMGサーモスターシェーカー
である。
%残余活性=[t=60の値]*100/[t=10の値]
試薬は次を含む
コントロール緩衝液:50mM HEPES、0.005%Tween−80、pH8.0、及び
ストレス緩衝液:50mM HEPES、0.1%(w/v)LAS(ドデシルベンゼン‐スルホン酸、ナトリウム塩 シグマD−2525、10mM EDTA、pH8.0
酵素変異体(20ppm)をコントロール緩衝液又はストレス緩衝液いずれかを含む96穴非結合平底プレートへ1:20に希釈し、混合した。コントロールプレートを室温にてインキュベーションし、一方ストレスプレートはすぐに37℃にて30から60分間(試験される酵素の安定性次第)放置する。インキュベーション後、酵素活性をプロテアーゼに関してsuc‐AAPF‐pNAアッセイ及びアミラーゼに関してBODIPY‐デンプンアッセイを用いて測定した。活性を維持しているフラクション又は活性残渣を有するフラクションはコントロールサンプルの反応速度で割ったストレスを有するサンプルの反応速度に等しい。親酵素及び変異体はコントロール緩衝液にて60分間安定である。
熱安定性
この実施例はタンパク質電荷及び熱安定性の間の関係を決定することを記載する。プロテアーゼアッセイは、緩衝化された培養上清を加熱する前と加熱した後のジメチルカゼイン(DMC)加水分解に基づいた。アミラーゼアッセイは培養上清を加熱する前と加熱した後のBODIPYデンプン加水分解に基づいた。実施例1で述べられたように同一の化学試薬と試薬溶液がこれらのアッセイに使用された。
ろ過された培養上清をPIPES緩衝液で20ppmに希釈した(培養プレートのコントロールの濃度に基づく)。最初に、10μlの各稀釈酵素サンプルを採り、ジメチルカゼインアッセイで初期活性を決定し、下記のように処理した。次に、50μlの各希釈上清をMTPの空のウェルに加えた。MTPプレートを60℃、400rpmで90分間iEMSインキュベーター/シェーカーHT(Thermo Labsystems)にてインキュベーションした。このプレートを氷で5分間冷却した。次に、インキュベーション後の最終活性を決定するため、10μlのこの溶液を200μlのジメチルカゼイン基質/ウェルを含む新しいMTPへ加えた。このMTPをテープで覆い、数秒振盪し、撹拌せずに2時間37℃でオーブンに置いた。
ろ過された培養上清を2mM CaCl2、002% Tween含有50mM 酢酸ナトリウムpH5.8で滅菌的に希釈した。10μlの各稀釈酵素サンプルをBODIPYデンプンアッセイで初期アミラーゼ活性を決定した。50μlの各希釈上清をVWR低プロファイルPCR96のウェルに置いた。30μLのミネラルオイルをシール剤として各ウェルに加えた。プレートを親酵素の安定性次第で95℃、30又は60分間でBioRad DNA engine Peltier Thermal Cyclerでインキュベーションした。インキュベーション後、このプレートを5分間4℃に冷却し、それから室温に放置した。次に、実施例1に記載のようにBODIPYデンプンアッセイにより最終アミラーゼ活性を決定するため、10μlの各サンプルを新しいプレートへ加えた。
サンプルの残余活性を最終吸光度及び初期吸光度の比率として、両者ともブランクで修正し、表わした。また、これらの観察をアミラーゼ電荷変異体で行った。図23は野生型に比較した電荷変化に応じて第一AmyS電荷ラダーの残余活性を示す。より高い指標がより熱安定性を有する変異体を示す。再度、野生型酵素に比較して極端に負(−12)又は正(+10)の蓄積は熱安定性に有害である。液体洗濯適用における酵素熱安定性を改善するために、これはタンパク質物理的性質、この場合正味電荷、を最適化する実施例である。
熱活性
この実施例にてタンパク質電荷及び温度に依存する反応速度の間の関係を決定することを記載し、ここで熱活性は一つの兆候である。
このアッセイは、緩衝化された培養上清を加熱する前と加熱した後のsuc‐AAPF‐pNA加水分解アッセイに基づく。実施例1におけるsuc‐AAPF‐pNA加水分解アッセイで述べられたように同一の化学試薬と試薬溶液が使用された。
ろ過された培養上清を0.005wt%TWEEN80含有100mM Tris緩衝液pH8.6で400ppmに希釈した(培養プレートのコントロールのタンパク質濃度(BCAによる)に基づく)。最初に、各アッセイ用に20倍希釈を作成する。それから10μLの希釈サンプルを190μLの2.5mM NaCl含有5mM HEPES緩衝液 pH8.0に加えた。各ウェルにおける予想する最終酵素濃度を1ppmのオーダーであった。MTPプレートを30分、30℃又は40℃にて、400rpmでiEMSインキュベーター/シェーカーHT(Thermo Labsystems)にインキュベーションした。次に、suc‐AAPF‐pNAアッセイで初期活性を決定するため、10μlの各希釈酵素サンプルを採取し、7分及び30分両方にて上記記載のように処理した。
サンプルの残余活性を7分でのsuc‐AAPF‐pNA加水分解速度で割った30分でのsuc‐AAPF‐pNA加水分解速度の比率として表わし、両者ともブランクで修正した。
アミノ酸性質の統計的決定
電荷、疎水性、水素結合等のようなアミノ酸の特徴はタンパク質の重要な性質である。例えば、荷電される基質、タンパク質の表面電荷又は全体の電荷は活性に重要なようだけれども、疎水性は溶解性に重要なようだ。タンパク質性能にとって重要であるアミノ酸の性質を同定するために統計的基礎試験を有することは好ましい。そのような試験はアミノ酸の性質及びタンパク質性能の間に相関関係の存在を示すことができる。各アミノ酸の性質にとって、一つのアミノ酸が別のアミノ酸に置換かれる場合性質における変化を非常に反映するスコアがある。アミノ酸置換上性質における変化を予測するためにいくつかのスコアリングマトリックスが存在し又は構築される。この4つの実施例を図に示す。pH8.6でのおおよその電荷変化に対する電荷変化マトリックスを図27に示す。水素結合スコアリングマトリックスを図28に示す。カイト‐ドーリットル ハイドロパシシティー(Kyte−Doolittle hydropathicity)マトリックスを図29に示す(Kyte及びDoolittle、上記参照)。最後に、アイゼンバーグ(Eisenberg)疎水性 マトリックスを図30に示す(Eisenberg他、上記参照)。
多様な電荷を有する基質における反応最適化
周知の方法によりセルロース変換を評価した(例えば、Baker 他、Appl Biochem Biotechnol, 70-72:395-403 [1998]を参照願いたい)。標準的なセルロース転換アッセイを実施例で用いた。このアッセイにおいて、酵素及び基質を容器に加え、室温にて終夜インキュベーションした。反応を100mM グリシンpH11で止め、その結果、反応溶液のpHは少なくともpH10に至る。一度反応が止まると、反応混合物の一部は0.2ミクロン膜を通してろ過をし、固体を除いた。ろ過溶液を上記Baker他に記載の方法に従って、HPLCにより可溶性糖に関してアッセイを実施した。
(Schell他、J Appl Biochem Biotechnol, 105:69 - 86 [2003])記載のようにトウモロコシ茎葉を2%w/wH2SO4で処理し、脱イオン化水で複数回洗浄してpH4.5を得た。酢酸ナトリウムを最終濃度50mMになるように加え、溶液をpH5.0に滴定した。反応混合物におけるセルロース濃度を約7%とした。
この実施例はリジン残基をアセチル化するためのコハク酸無水物を用いて市販トリコデルマ種(Trichoderma sp.)セルラーゼ調製LAMINEX BG酵素複合体(ジェネンコー ディビジョン、ダニスコ ユーエス社(Genencor Division, Danisco US, Inc.))の処理を記載する。LAMINEX BG酵素複合体のリジン残基のアセチル化はタンパク質の正味電荷を改変する(例えば、増加する負の電荷)。他の同様な化学的修飾もリジンの正の電荷を負の電荷基(例えば、アセトキシコハク酸無水物(acetoxysuccinic anhydride)、マレイン酸無水物(maleic anhydride)、酒石酸無水物(tartaric anhydride)、及びフタル酸無水物(phthalic anhydride)処理で)又は二つの負の電荷(例えば、トリメリット酸無水物(trimellitic anhydride)、シス‐アコニット酸無水物(cis−aconitic anhydride)、及び4‐ニトロフタル酸無水物(4−nitrophthalic anhydride)処理で)でさえ変換するために用いてよい。他の化学的修飾は結果として非電荷残基(例えば、無水酢酸(acetic anhydride)、無水酪酸(butyric anhydride)、イソ酪酸無水物(isobutyric anhydride)、ヘキサン酸無水物(hexanoic anhydride)、吉草酸無水物(valeric anhydride)、イソ吉草酸無水物(isovaleric anhydride)、及びピバル酸無水物(pivalic anhydride)処理)を得るリジン残基の正の電荷の除去のために用いてよい。
リグニン、フェノールプロパノイドのバイオポリマー複合体、は堅く及び強い植物の細胞壁であるセルロース繊維に結合する主に木材の非炭水化物成分である。他の細胞壁成分へ交差結合するので、リグニンはセルロース分解酵素へのセルロース及びヘミセルロースのアクセスしやすさを最小にする。つまり、リグニンは一般的にすべての植物バイオマス(Berlin他、Appl Biochem Biotechnol, 121-124: 163-170 [2005])の低下される消化に関与する。実際に、リグニンへのセルロースの結合はセルラーゼによるセルロースの分解を低減する。リグニンは疎水性及び明らかに負に荷電している。かくて、本発明者等はセルラーゼへの負の電荷の追加がリグニンへの結合を低下させると考えた。
バガスはトウモロコシを粉砕し、その絞り汁を抽出した後に残存するバイオマスである。バガス(酸処理、28%固体、57%グリカン)の2%セルロースを含む液を50mM 酢酸ナトリウムpH5にて調製した。トリコデルマ種(Trichoderma sp.)セルラーゼ調製物を同じ酢酸緩衝液にて10倍希釈した。希釈酵素の一部をバガス溶液又は緩衝液単独いずれかと混合し、室温にて1時間インキュベーションした。上清を集め、セルラーゼの成分、つまり、ベータグルコシダーゼの活性をアッセイした。
追加的なリグニンの多様な量を含む酸‐前処理バガス(APB)に存在するセルロースの糖化を化学的修飾及び非修飾トリコデルマ種(Trichoderma sp.)セルラーゼ調製物及びHPLCにより糖の放出、DP1からDP7をモニターするアッセイを用いて評価した。マイクロタイタープレートにおいて、200μLの3.5%APBを50mM 酢酸ナトリウムpH5に調製し、多様な量のリグニンを調整した。20マイクロリットルのセルラーゼ酵素溶液(非修飾又は修飾LAMINEX BG)をウェルに加えた。プレートをアルミニウムプレートのシーラーで蓋をし50℃、24時間又は48時間振盪を伴うインキュベーターに置いた。反応を100μlの100mM グリシンpH10を各ウェルに加えることにより終了した。続いて混合し、マイクロタイタープレートウェルの内容物をミリポア96穴フィルタープレート(0.45μm、PES)通してろ過した。ろ過物を100μlの10mM グリシンpH10を含むプレートへ希釈し、可溶性糖(DP1からDP7)の生成量をHPLCにより測定した。Agilent 1100シリーズHPLCは脱灰/ガードカラム(Bioradカタログ番号125−0118)及びAminex lead based carbohydrateカラム(Aminexカタログ番号HPX−87P)を備えた。移動層は流速0.6ml/分で水であった。シグマから入手した可溶性糖標準物(DP1‐DP7)をすべてミリQ水で100mg/mLに希釈し、個々の糖に関するピーク面積を実際の糖の濃度に変換するために用いた。変換のパーセントをHPLCから測定される糖をセルロースのグルコースへの100%変換で割ることにより算出した。
精製トリコデルマ種(Trichoderma sp.)CBH1、CBH2変異体、EG1、EG2及びベータグルコシダーゼを上記に記載のように化学的に修飾した。この実施例で用いたCBH2変異体はUS Pub. No. 2006/0205042記載のように複数の置換(野生型成熟CBH2セルラーゼに相当する番号でP98L/M134V/T154A/I2112V/S316P/S413Y)を有する。成熟CBH変異体のアミノ酸配列を次に示す。
。移動層は流速0.6ml/分で水であった。シグマから入手した可溶性糖標準物(DP1‐DP7)をすべてミリQ水で100mg/mLに希釈し、個々の糖に関するピーク面積を実際の糖の濃度に変換するために用いた。変換のパーセントをHPLCから測定される糖をセルロースのグルコースへの100%変換で割ることにより算出した。
本発明の開発中に判明したところであるが、CBH2の表面リジン残基のサクシニル化は上記のようにAPB及び前処理トウモロコシ茎葉における性能を改善した。修飾CBH2変異体の電荷は非修飾CBH2変異体に比較して約−17であった。この点を考慮に入れてCBH2電荷ラダーをセルラーゼ性能適用のおける最適表面電荷の決定のために設計した。親野生型トリコデルマ レーシ(T. reesei)cbh2のコード領域を下記に示し、標準文字はシグナル配列のDNAを示し、太字は成熟酵素のDNA配列を示す。
GGHTK22フォワード5'-CACCATGATCGTGGGAATTCTTACTACTC-3' (SEQ ID NO:36)及び、
GGTHK23リバース5'-CTACAAAAACGAAGGGTTCGCATT-3' (SEQ ID NO:37)
を用いてDNA2.0構築物からPCR増幅を行った。
この実施例はトリコデルマ レーシ(T. reesei)におけるCBH2表面電荷変異体(SCV)の発現のために用いる方法を記載する。手短かに言うと、cbh2電荷変異体C3(K129E及びK157E変異)オープンリーディングフレームを含むpTrex3gMを有するトリコデルマ レーシ(T. reesei)のバイオリスティック形質転換を次の手順により実施した。セロビオヒドロラーゼI (CBHI, Cel7a)、セロビオヒドロラーゼII (CBHII, Cel6a)、エンドグルカナーゼI (EGI, Cel7b)、及びエンドグルカナーゼII (EGII, Cel5a)をコードする遺伝子が不活性化されているトリコデルマ レーシ(T. reesei)を用いた。バイオリスティック形質転換方法によるトリコデルマ レーシ(Trichoderma reesei)菌株の形質転換は、製造元の使用説明書(WO 05/001036及びUS 2006/0003408)に従って、Bio−Rad (Hercules, CA)製のバイオリスティック(商標)PDS-1000/he パーティクルデリバリーシステムを用いて完成した。形質転換体を新しいアセトアミド選別プレートへ移した。安定な形質転換体を200μl/ウェルのグリシン最小培地(6.0g/Lグリシン、4.7g/L (NH4)2SO4、5.0g/L KH2PO4、1.0g/L MgSO4・7H2O、33.0g/L PIPPS、pH5.5)を含むフィルターマイクロタイタープレート(ミリポア)へ播種した。その培地は炭素源として~2%グルコース/ソホロース混合物、10ml/Lの100g/LのCaCl2、2.5ml/Lのトリコデルマ レーシ(T. reesei)の微量元素(400X)であって、175g/L無水クエン酸、200g/L FeSO4 7H2O、16g/L ZnSO4 7H2O、3.2g/L CuSO4 5H2O、1.4 g/L MnSO4 H2O、0.8 g/L H3BO3含むものを後で滅菌添加される。形質転換体を28℃のインキュベーターに設置されたO2豊富な区画で5日間液体培地にて培養した。フィルターマイクロタイタープレートから上清サンプルを真空マニホールドを用いて得た。サンプルを製造元の説明書に従って4から12%NuPAGEゲル(Invitrogen)で実施した。ゲルをSimply Blue stain (Invitrogen)で染色した。追加CBH2表面電荷変異体の発現はこの方法を用いて実施してよい。
酵素のpH‐活性プロファイルの調整
この実施例は所定の反応に関する酵素のpH‐活性プロファイルを最適化する表面電荷変異の使用を記載する。
Claims (51)
- タンパク質変異体のライブラリーを提供する方法であって、
a)少なくとも一つの所望の試験における少なくとも一つの所望の性質の範囲にわたる複数のタンパク質変異体を試験し、
b)前記少なくとも一つの所望の試験における好ましい結果に関係する前記所望の性質の範囲内で最適条件を同定し、
c)前記所望の性質の範囲の最適条件内で複数のタンパク質変異体を提供し、それにより、前記少なくとも一つの所望の試験における前記好ましい結果を有するメンバーを多く有するタンパク質変異体のライブラリーを提供すること
を含むことを特徴とする方法。 - 前記所望の性質が物理的性質であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記好ましい結果が前記所望の試験に観察される最大値の少なくとも約50%より大きい値に相当することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記好ましい結果が前記所望の試験に観察される最大値の少なくとも約60%、約70%、約80%、約90%、又は約95%より大きい値に相当することを特徴とする請求項3に記載の方法。
- さらに
d)前記少なくとも一つの所望の試験において、前記複数のタンパク質変異体及び少なくとも一つの野生型タンパク質を試験する
段階を含む請求項1に記載の方法。 - 改善される結果を有するような前記タンパク質変異体を同定する段階をさらに含み、野生型タンパク質が前記少なくとも一つ所望の試験において1.0の性能指標値を達成し、前記改善される結果を有するタンパク質変異体が1.0より大きい値で達成することを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記タンパク質が抗体、ホルモン、又はサイトカインであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質が酵素であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記酵素が、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ポリエステラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、オキシダーゼ、又はトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項8に記載の方法。
- 前記プロテアーゼが中性メタロプロテアーゼ又はセリンプロテアーゼであることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 前記セリンプロテアーゼがスブチリシンであることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記中性メタロプロテアーゼがバシルス(Bacillaceae)科のメンバーから得られることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記セリンプロテアーゼがセルロモナス(Cellulomonas)属のメンバーから得られることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記酵素がセルラーゼであることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 前記酵素がアミラーゼであることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 前記所望の性質が電荷であることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記タンパク質変異体及び前記野生型酵素の前記電荷が決定され及び比較されることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記所望の性質がゼータ電位であることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記タンパク質変異体及び前記野生型酵素の前記ゼータ電位が決定され及び比較されることを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 前記タンパク質変異体の前記ゼータ電位が約−40mVと約+40mVの間であることを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 前記タンパク質変異体の前記ゼータ電位が約−20mVと約+20mVの間であることを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 前記タンパク質変異体の前記ゼータ電位が約−10mVと約+10mVの間であることを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 前記所望の試験が洗浄性能を含むことを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記洗浄性能が血液、牛乳、インク洗浄性能を含むことを特徴とする請求項23に記載の方法。
- 前記タンパク質変異体及び野生型タンパク質が洗剤組成物において試験されることを特徴とする請求項24に記載の方法。
- 前記洗剤組成物が約5と約12の間のpHを有する粉状又は液状洗剤へ構成されることを特徴とする請求項25の方法。
- 前記洗浄性能が塩基性pHを有する冷水液体洗剤中で試験されることを特徴とする請求項25に記載の方法。
- 前記洗浄性能が温水洗剤中で試験されることを特徴とする請求項25に記載の方法。
- 前記少なくとも一つの所望の試験が基質結合、酵素阻害、発現レベル、洗剤安定性、熱安定性、反応速度、反応範囲、熱活性、デンプン液状化、バイオマス分解、及び/又は糖化を測定することを含むことを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 試験タンパク質折りたたみの少なくとも一つの改良される変異体を生産する方法であって、
a)少なくとも一つの所望のアッセイにおける少なくとも一つの所望の性質の範囲にわたるプローブタンパク質折りたたみの複数の変異体をアッセイし、
b)前記少なくとも一つの所望のアッセイにおける好ましい結果に関係する前記少なくとも一つの所望の性質の前記範囲内で最適条件を同定し、
c)前記少なくとも一つの所望のアッセイにおいて試験タンパク質折りたたみの親タンパク質をアッセイし、及び
d)親タンパク質にアミノ酸修飾を導入することにより前記試験タンパク質折りたたみの少なくとも一つの改良される変異体を生産し、それにより、前記少なくとも一つの改良される変異体が前記少なくとも一つの所望の性質の前記最適条件範囲内であることを特徴とすること、
を含む方法。 - 前記修飾が少なくとも一つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項30に記載の方法。
- 前記試験タンパク質折りたたみ及び前記プローブタンパク質折りたたみが異なることを特徴とする請求項30に記載の方法。
- 前記所望の性質がゼータ電位であることを特徴とする請求項30に記載の方法。
- 前記試験タンパク質折りたたみが少なくとも一つのセリンプロテアーゼを含み及び前記プローブタンパク質折りたたみが少なくとも一つの中性メタロプロテアーゼを含むことを特徴とする請求項30に記載の方法。
- 基質汚れに特異的な酵素変異体を生産する方法であって
a)標準緩衝液において基質汚れのゼータ電位を決定し、
b)前記標準緩衝液において親酵素のゼータ電位を決定し、及び
c)前記親酵素に少なくとも一つのアミノ酸修飾を導入することにより基質汚れに特異的な酵素変異体を生産し、それにより前記基質汚れに特異的な酵素変異体の前記ゼータ電位が前記親酵素の前記ゼータ電位より前記基質汚れのゼータ電位に近いことを特徴とする
ことを含む方法。 - 前記修飾が少なくとも一つのアミノ酸置換、欠損及び/又は挿入を含むことを特徴とする請求項35に記載の方法。
- 前記修飾が前記親酵素の化学的修飾を含むことを特徴とする請求項35に記載の方法。
- 前記基質汚れに特異的な酵素変異体が正に荷電し、吸熱性であり、及び前記基質汚れが負に荷電することを特徴とする請求項35に記載の方法。
- 前記基質汚れに特異的な酵素変異体が負に荷電し、発熱性であり、及び前記基質汚れが負に荷電することを特徴とする請求項35に記載の組成物。
- 前記基質汚れに特異的な酵素変異体が正に荷電し、発熱性であり、及び前記基質汚れが正に荷電することを特徴とする請求項35に記載の組成物。
- 前記基質汚れに特異的な酵素変異体が負に荷電し、吸熱性であり、及び前記基質汚れが正に荷電することを特徴とする請求項35に記載の組成物。
- 複数の汚れを洗浄するための組成物を生産する方法であって
a)標準緩衝液において前記複数の汚れのそれぞれのゼータ電位を決定し、
b)前記標準緩衝液において少なくとも一つの前記複数の汚れのゼータ電位と実質的に等しいゼータ電位を有する洗浄酵素を選択し、
c)複数の汚れを洗浄するための組成物を生産し、前記組成物がb)段階にて選択される少なくとも一つの洗浄酵素を含むことを特徴とする
ことを含む方法。 - 前記組成物が前記標準緩衝液と実質的に同じpH及び導電率を有する洗剤溶液を含むことを特徴とする請求項42に記載の方法。
- 前記選択段階が2以上の洗浄酵素を同定することを特徴とする請求項42に記載の方法。
- 前記組成物が少なくとも二つの洗浄酵素を含み、前記少なくとも二つの洗浄酵素が少なくとも二つの前記複数の汚れの前記ゼータ電位に相当するゼータ電位を有することを特徴とする請求項42に記載の方法。
- 請求項42に記載の方法を用いて生産される複数の汚れを洗浄するための組成物。
- 前記組成物が少なくとも一つの洗浄酵素含むことを特徴とする請求項46に記載の組成物
- 前記少なくとも一つ洗浄酵素が変異タンパク質であることを特徴とする請求項47に記載の組成物。
- 前記変異タンパク質が前記変異タンパク質を生産するために用いる野生型前駆体タンパク質より負に荷電することを特徴とする請求項48に記載の組成物。
- 前記変異タンパク質が前記変異タンパク質を生産するために用いる野生型前駆体タンパク質より正に荷電することを特徴とする請求項46に記載の組成物。
- 前記変異タンパク質が陰イオン界面活性剤を含む洗剤における増強される安定性に関して前記変異タンパク質を生産するために用いる野生型前駆体タンパク質より負に荷電することを特徴とする請求項46に記載の組成物。
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