TWI571472B - 具耐熱性之果膠裂解酶 - Google Patents

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吳姿慧
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Description

具耐熱性之果膠裂解酶
本案係關於一種果膠酶，尤指一種具耐熱性之果膠酶。
果膠(Pectin)是植物細胞壁中主要的組成之一，絕大部分存在於初生細胞壁(primary cell wall)以及中膠層(middle lamella)。果膠物質是種複雜的異質多醣，主要是以D-半乳糖醛酸(D-galacturonic acid)，經由α-1,4-糖苷鍵結組成其骨幹。而此骨幹可被進一步地修飾，像是甲基酯化(methyl-esterification)或取代成乙醯基(acetyl groups)。果膠大致上可被分成三大類：同質半乳醛酸聚醣(homogalacturonan)、木糖半乳醛酸聚醣(xylogalacturonan)以及鼠李半乳醛酸聚醣(rhamnogalacturonan)。第三種果膠的結構最為複雜，其由重複的鼠李糖-半乳糖醛酸組成其主鏈，且有不同種的糖，像是半乳糖、木糖以及阿拉伯糖(arabinose)形成其支鏈。
由於這樣複雜構成的果膠，其完整的分解需要依靠好幾種不同的果膠酶(pectinases)來共同作用。果膠酶在自然界中廣泛地存在於許多不同的細菌、酵母、真菌以及植物中，大致上可分為三大種：果膠水解酶(hydrolases)、果膠裂解酶(lyases)以及果膠酯酶(esterases)。在這些果膠酶中，果膠裂解酶(pectate lyase；endopolygalacturonate lyase；EC 4.2.2.2)是分解果膠過程中的關鍵酶種之一。它可以透過反式消除機制(transelimination mechanism)任意地催化半乳醛酸聚糖中的α-1,4-糖苷鍵結，進而生成不飽和半乳醛酸寡糖的產物。
長久以來，果膠酶已經被廣泛應用在食品以及製酒工業上。近年來，更延伸應用在許多不同的工業上，像是造紙、紡織以及飼料中。因為果膠酶在工業上具有極高的經濟應用價值，許多研究不論是從大自然中篩選新基因或是改造現有的蛋白，都企圖想要找到更適合於工業應用的果膠酶。在許多提升工業酶的策略中，根據蛋白結構分析，進而邏輯性地設計突變點是改造蛋白的主要方法之一。而一個好的工業酶所要具備的理想條件之一就是高耐熱性，因為高耐熱性的酶通常具有較高的蛋白穩定性以及較佳性能的酶作用力，故也較有利於工業應用。
因此，本案藉由邏輯性的突變設計去增加果膠裂解酶的耐熱性，進而提升它在工業上的應用價值。
本案之目的在於改造現有果膠裂解酶，利用結構分析及點突變技術，有效提升果膠裂解酶之耐熱性，藉以增加果膠裂解酶之工業應用價值。
為達上述目的，本案之一較廣義實施態樣為提供一種果膠酶，其胺基酸序列係為將序列編號2第181位置之絲胺酸(serine)以一胺基酸取代修飾之序列，其中用於取代之該胺基酸係選自苯丙胺酸(phenylalanine)、甲硫胺酸(methionine)以及白胺酸(leucine)。編碼該序列編號2之基因係從坎皮納斯類芽孢桿菌(Paenibacillus campinasensis BL-11)所分離出來的PcPEL基因。該果膠酶係為果膠裂解酶。
在一實施例中，該果膠酶之胺基酸序列係為序列編號4之胺基酸序列。
在一實施例中，該果膠酶之胺基酸序列係為序列編號6之胺基酸序列。
在一實施例中，該果膠酶之胺基酸序列係為序列編號8之胺基酸序列。
又，該果膠酶的用途係用於製造食品、製酒、造紙、紡織或製造飼料。
第1圖顯示PcPEL的核苷酸序列以及胺基酸序列。
第2圖顯示PcPEL的蛋白結構。
第3圖顯示突變引子序列。
第4圖顯示S181F的核苷酸序列以及胺基酸序列。
第5圖顯示S181M的核苷酸序列以及胺基酸序列。
第6圖顯示S181L的核苷酸序列以及胺基酸序列。
第7圖顯示PcPEL原始蛋白及S181F、S181M、S181L三種突變蛋白的耐熱性分析。
體現本案特徵與優點的一些典型實施例將在後段的說明中詳細敘述。應理解的是本案能夠在不同的態樣上具有各種的變化，其皆不脫離本案的範圍，且其中的說明及圖式在本質上係當作說明之用，而非用以限制本案。
本案之果膠裂解酶(PcPEL)是從嗜鹼性細菌坎皮納斯類芽孢桿菌(Paenibacillus campinasensis BL-11)菌株中所分離出來的基因。根據先前文獻中指出，該果膠裂解酶的最適活性是在50℃以及pH 10的條件之下。為了提升此果膠裂解酶的耐熱性，本案欲透過結構分析以及點突變技術(site-directed mutagenesis)對其進行改造。因此，本案利用X-ray結晶學技術去解開PcPEL的蛋白三級結構，進而闡明其詳細的結構資訊。為了提升PcPEL的耐熱性，本案根據其結構分析挑選位在活性區附近的第181個胺基酸的絲胺酸(serine)，利用點突變技術，分別單一突變成苯丙胺酸(phenylalanine)、甲硫胺酸(methionine)以及白胺酸(leucine)，因而成功地提高其耐熱性，也進一步地增加此果膠裂解酶的工業應用價值。以下將詳述本案改造果膠裂解酶之方法及其所得到之改良果膠裂解酶蛋白。
首先，PcPEL基因被構築在pPICZα A的載體上，其中如第1圖所示，PcPEL基因包含858個鹼基(不含終止密碼子，核苷酸序列以序列編號1標示)以及286個胺基酸(胺基酸序列以序列編號2標示)。線性化之後的質體DNA接著被轉殖到畢赤酵母(Pichia pastoris)中，再利用含有0.1mg/ml zeocin抗生素的YPD盤，在30℃中培養2天，篩選出成功轉化細胞。接著挑選菌落，分別接種到YPD培養基中增生，再進一步地將菌分離出來，轉移到含有0.5%甲醇的BMMY培養基內，進而誘導其目標蛋白的表現。經由離心步驟，收集含有表現出的目標蛋白之上清液。為了接續的蛋白純化步驟，本案利用含有25mM Tris；pH 7.5的緩衝液進行兩次透析。再利用FPLC系統以及DEAE純化管柱，純化出PcPEL蛋白。最後，為了接續的養晶實驗，純化的蛋白再濃縮至10mg/ml的濃度。
為了利用X-ray結晶學技術解析蛋白結構，必須先得到蛋白晶體。本案利用座滴式蒸氣擴散法以及養晶套組篩選出成功養晶的條件，再進行調整之後，得到適當的養晶條件是在0.1M Bis-Tris；pH 6.5、0.2M Lithium sulfate以及25% PEG3350的環境中，在室溫下培養2天。而相位角問題則是透過分子置換法(molecular replacement)解開，經由電腦運算之後，得到PcPEL的蛋白結構。
如第2圖所示，PcPEL的蛋白結構屬於典型PL10家族的(α/α)3 barrel蛋白摺疊。本案欲藉由增加PcPEL蛋白的疏水性作用力(hydrophobic interaction)，來進一步提升其耐熱性。透過結構分析，本案挑選位於活性區附近第181位置的絲胺酸(serine)分別突變成苯丙胺酸(phenylalanine)、甲硫胺酸(methionine)以及白胺酸(leucine)，亦即，本案利用點突變技術獲得PcPEL的三種突變基因，分別是S181F、S181M以及S181L。
突變方式係利用PCR分別取得三種突變基因，而當中所用到的突變引子列在第3圖。原始的模板DNA則利用限制酶DpnI移除掉。突變基因個別送入大腸桿菌內複製放大，再藉由DNA定序，確認突變的成功與否。最後，突變基因分別送入畢赤酵母中表達出突變蛋白，如同前述之蛋白表達步驟。
三種突變基因的核苷酸序列以及胺基酸序列分別如第4圖、第5圖及第6圖所示。第4圖顯示S181F之突變序列，其核苷酸序列以序列編號3標示，胺基酸序列則以序列編號4標示。第5圖顯示S181M之突變序列，其核苷酸序列以序列編號5標示，胺基酸序列則以序列編號6標示。第6圖顯示S181L之突變序列，其核苷酸序列以序列編號7標示，胺基酸序列則以序列編號8標示。
果膠裂解酶的活性測定是利用偵測聚半乳糖醛酸(polygalacturonic acid)受質在C4與C5之間的分解，進而產生的不飽和鍵結，被波長235nm所吸收。大致而言，反應混合物包含了0.5ml適當稀釋的蛋白樣本以及0.2%聚半乳糖醛酸作為受質，在含有0.6mM氯化鈣的pH 9.4 glycine-NaOH緩衝液環境中於45℃下作用10分鐘。接著，加入3ml 30mM的磷酸以停止反應。最後，偵測在OD235nm波長的吸收值，進而求出果膠裂解酶的活性。
至於耐熱性分析方面，突變蛋白以及原始蛋白分別在65℃、68℃、70℃以及75℃下作用2分鐘。接著放在冰上5分鐘降溫，再置於室溫下5分鐘回復。最後，再偵測高溫處理過的樣本所剩餘的酶活性。
第7圖顯示PcPEL原始蛋白及S181F、S181M、S181L三種突變蛋白的耐熱性分析，其中未熱處理的樣本之果膠裂解酶活性設定為100%。由第7圖可知，S181F、S181M及S181L三種突變蛋白的耐熱性皆高於原始蛋白(wild type)。相較於未熱處理的蛋白，原始蛋白在68℃高溫處理之下所剩餘的活性還有約50%，而三種突變蛋白在相同68℃高溫處理之下則保留了80%的活性。此外，在70℃高溫處理之下，原始蛋白幾乎失去全部的活性，然而三種突變蛋白還保留了約40%的活性。以上結果顯示出，這三種突變蛋白S181F、S181M及S181L相較於原始蛋白，具有較高的耐熱性，也表示具有較大潛力的工業應用價值。
綜上所述，為了增加果膠裂解酶的工業應用價值，本案藉由邏輯性的突變設計去增加果膠裂解酶的耐熱性，根據PcPEL之結構分析並利用點突變技術，將位在活性區附近的第181個位置的絲胺酸(serine)分別單一突變成苯丙胺酸(phenylalanine)、甲硫胺酸(methionine)以及白胺酸(leucine)，而得到S181F、S181M及S181L三種突變蛋白。由耐熱性分析結果可知，S181F、S181M及S181L三種突變蛋白的耐熱性皆高於原始蛋白，故本案成功地設計出較具耐熱性的PcPEL突變蛋白，不但提高果膠裂解酶之耐熱性，也進一步地增加此果膠裂解酶的工業應用價值。
縱使本發明已由上述實施例詳細敘述而可由熟悉本技藝人士任施匠思而為諸般修飾，然皆不脫如附申請專利範圍所欲保護者。
<110> 基酵生物科技股份有限公司
<120> 具耐熱性之果膠裂解酶
<160> 8
<210> 1
<211> 858
<212> DNA
<213> 坎皮納斯類芽孢桿菌(Paenibacillus campinasensis BL-11)
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<212> PRT
<213> 坎皮納斯類芽孢桿菌(Paenibacillus campinasensis BL-11)
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<213> 人工序列
<400> 8

Claims (8)

  1. 一種果膠裂解酶，其胺基酸序列係為將序列編號2第181位置之絲胺酸(serine)以一胺基酸取代修飾之序列，其中用於取代之該胺基酸係選自苯丙胺酸(phenylalanine)、甲硫胺酸(methionine)以及白胺酸(leucine)。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之果膠裂解酶，其中編碼該序列編號2之基因係從坎皮納斯類芽孢桿菌(Paenibacillus campinasensis BL-11)所分離出來的PcPEL基因。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之果膠裂解酶，其中該果膠裂解酶之胺基酸序列係為序列編號4之胺基酸序列。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之果膠裂解酶，其中該果膠裂解酶之胺基酸序列係為序列編號6之胺基酸序列。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之果膠裂解酶，其中該果膠裂解酶之胺基酸序列係為序列編號8之胺基酸序列。
  6. 一種編碼如申請專利範圍第1項所述之果膠裂解酶之核酸分子。
  7. 一種重組質體，其係包含如申請專利範圍第6項所述之核酸分子。
  8. 一種如申請專利範圍第1-5項中任意一項所述之果膠裂解酶的用途，其係用於製造食品、製酒、造紙、紡織或製造飼料。
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