KR20100075986A - 시트레이트-안정성 중성 메탈로프로테아제의 제조 및 용도 - Google Patents
시트레이트-안정성 중성 메탈로프로테아제의 제조 및 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 금속 킬레이터의 존재 하에 향상된 안정성을 갖는 하나 이상의 중성 메탈로프로테아제 효소를 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 중성 메탈로프로테아제는 시트레이트를 포함하는 세정 및 기타 적용에서 사용될 수 있다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 시트레이트-유도 자가분해를 견디도록 조작된 변이체 중성 메탈로프로테아제(들) 를 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다.
Description
관련 출원
본 출원은 2007 년 10 월 31 일에 출원된 "시트레이트-안정성 중성 메탈로프로테아제의 용도 및 제조," 명칭의 미국 가출원 일련 번호 제 60/984,046 호를 우선권으로 청구한다.
기술분야
본 발명은 금속 킬레이터의 존재 하에 향상된 안정성을 갖는 하나 이상의 중성 메탈로프로테아제 효소를 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 중성 메탈로프로테아제는 시트레이트를 포함하는 세정 및 기타 적용에서 사용될 수 있다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 시트레이트-유도 자가분해를 견디도록 조작된 변이체 중성 메탈로프로테아제(들) 를 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다.
바실러스 (Bacillus) 속 (genus) 의 일원 (member) 은 많은 산업적으로 유용한 효소를 분비하는 그람-양성 박테리아로서, 발효에 의해 고 부피로 값싸게 제조될 수 있다. 분비되는 바실러스 효소의 예는 서브틸리신 세린 프로테아제, 아연 함유 중성 프로테아제, 알파-아밀라아제, 및 셀룰라아제이다. 바실러스 프로테아제는 섬유, 세탁 및 가정용 산업에서 광범위하게 사용된다 (Galante, Current Organic Chemistry, 7:1399-1422, 2003; 및 Showell, Handbook of Detergents, Part D: Formulation, Hubbard (ed.), NY: Taylor and Francis Group, 2006). 세탁물에서 색상 및 오염을 고도로 효율적으로 제거하는 일은 프로테아제를 필요로 한다. 그러나, 세정 및 세척 시약의 액체 제제는 전형적으로 세척 강화제, 계면활성제, 및 금속 킬레이터를 함유하고, 이는 대부분의 프로테아제에 대해 불안정화 효과를 갖는다.
일반적으로, 변성제는 자가분해에 의한 빠른 프로테아제 분해를 유도한다. 따라서, 프로테아제 자가분해의 분자적 기작을 이해하는 것은 안정한 프로테아제를 생성하는 수단으로서 탐구되었다 (Eijsink 등, J Biotechnol, 113: 105-120, 2004). 자가분해 경로의 설명은 (i) 고 효능으로 인해 프로테아제는 국소적으로 변성된 단백질 상태를 분해하고, (ii) 왜냐하면, 복수의 접히지 않은 상태는 단백질 분자 전체에 걸쳐 존재하고 분포되는 가능성이 커서, 복수의 및 아주 유사한 자가분해 경로를 초래한다는 것에 의해 복잡해진다. 서모리신-형 메탈로프로테아제의 자가분해의 분자적 기작은 보고되어 있다 (Eijsink 등, Nat Struct Biol, 2:374-379, 1995; van den Burg 등, Biotechnol Appl Bioeng, 30:35-40, 1999; 및 Vriend, J Comput Aided MoI Des, 7:367-396, 1993).
그러나, 추가의 산업적으로 관련된 메탈로프로테아제의 자가분해 기작에 대한 설명을 할 필요가 당업계에 여전히 존재한다. 특히, 칼슘 킬레이터의 존재 하에 향상된 안정성을 갖는 NprE 변이체를 디자인하기 위해 사용될 수 있는, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens) 중성 프로테아제 (NprE) 의 시트레이트-유도 자가분해에 대해 이해할 필요가 있다. 이는 B. 아밀로리퀘파시엔스 NprE 의 경우 특히 중요한데, 그 이유는 상기 효소가 구조 및 기능을 위해서 칼슘에 의존하여 시트레이트와 같은 칼슘-고갈 제제에 더욱 더 민감해지게 하기 때문이다.
발명의 개요
본 발명은 금속 킬레이터의 존재 하에 향상된 안정성을 갖는 하나 이상의 중성 메탈로프로테아제 효소를 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 중성 메탈로프로테아제는 시트레이트를 포함하는 세정 및 기타 적용에서 사용될 수 있다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 시트레이트-유도 자가분해를 견디도록 조작된 변이체 중성 메탈로프로테아제(들) 를 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명은 시트레이트-유도 자가분해에 대한 향상된 내성을 갖는 단리된 중성 메탈로프로테아제 변이체를 제공한다. 일부 바람직한 구현예에서, 중성 메탈로프로테아제 변이체는 SEQ ID NO:3 에 나타낸 아미노산 서열의 위치 129, 130, 138, 190, 및 220 에 상응하는 군으로부터 선택되는 3, 4, 또는 5 개의 위치에서의 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 바실러스 중성 메탈로프로테아제 변이체이다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 치환은 S129I/F130L/D220P, M138L/V190I/D220P, 및 S129I/F130L/M138L/V190I/D220P 로부터 선택되는 복수의 돌연변이를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 바실러스는 B, 아밀로리퀘파시엔스이다. 일부 구현예에서, 중성 메탈로프로테아제는 SEQ ID NO: 3 으로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중성 메탈로프로테아제와 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 53% 이상, 약 55% 이상, 약 57% 이상, 약 60% 이상, 약 63% 이상, 약 65% 이상, 약 67% 이상, 약 70% 이상, 약 73% 이상, 약 75% 이상, 약 77% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 아미노산 동일성을 갖는다. 본 발명은 또한, 본원에 기술된 중성 메탈로프로테아제 변이체를 암호화하는 단리된 핵산, 뿐만 아니라 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 더욱이, 본 발명은 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 더욱 추가의 구현예에서, 본 발명은 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포로부터 수득되는 중성 메탈로프로테아제 변이체를 제공한다.
또한, 본 발명은 시트레이트-유도 자가분해에 대한 향상된 내성을 갖는 단리된 B. 아밀로리퀘파시엔스 중성 메탈로프로테아제 변이체를 제공한다. 일부 바람직한 구현예에서, 중성 메탈로프로테아제 변이체는 SEQ ID NO:3 으로 나타낸 아미노산 서열의 위치 129, 130, 138, 190, 및 220 에 상응하는 군으로부터 선택되는 3, 4, 또는 5 개의 위치에서의 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 또한, SEQ ID NO:3 으로 나타낸 아미노산 서열의 복수의 돌연변이를 포함하는 단리된 B. 아밀로리퀘파시엔스 중성 메탈로프로테아제 변이체가 제공되며, 여기서, 복수의 돌연변이는 S129I/F130L/D220P, M138L/V190I/D220P, 및 S129I/F130L/M138L/V190I/D220P 로부터 선택된다. 일부 바람직한 구현예에서, 단리된 B. 아밀로리퀘파시엔스 중성 메탈로프로테아제 변이체는 SEQ ID NO:18 (S129I/F130L/D220P), SEQ ID NO:19 (M138L/V190I/D220P), 또는 SEQ ID NO:20 (S129I/F130L/M138L/V190I/D220P) 로 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명은 또한, 본원에 기술된 중성 메탈로프로테아제 변이체를 암호화하는 단리된 핵산, 뿐만 아니라 중성 메탈로프로테아제 변이체를 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 더욱이, 본 발명은 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 더욱 추가의 구현예에서, 본 발명은 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포로부터 수득되는 중성 메탈로프로테아제 변이체를 제공한다.
더욱이, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 중성 메탈로프로테아제 활성을 갖는 효소의 제조 방법을 제공한다 : 중성 메탈로프로테아제 변이체를 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계 ; 및 중성 메탈로프로테아제의 제조에 적합한 조건 하에 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계. 본 발명의 일부 구현예는 제조된 중성 메탈로프로테아제를 수합하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 바실러스 종이고, 한편 특히 바람직한 구현예에서, 바실러스 종은 B. 서브틸리스 (B. subtilis) 이다.
본 발명은 또한, 시트레이트-유도 자가분해에 대해 향상된 내성을 갖는 단리된 중성 메탈로프로테아제 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 칼슘 이온 및/또는 하나 이상의 아연 이온을 추가로 포함한다. 추가의 구현예에서, 조성물은 시트레이트를 추가로 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 조성물은 세정 조성물 (예를 들어, 세제) 이다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 조성물은 프로테아제, 아밀라아제, 리파아제, 만나나제 (mannanase), 펙티나아제, 큐티나아제, 산화환원효소, 헤미셀룰라아제, 및 셀룰라아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 효소 또는 효소 유도체를 추가로 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 조성물은 하기를 포함한다 : 약 0.0001 중량% 이상의 중성 메탈로프로테아제 변이체 ; 또는 약 0.001 내지 약 0.5 중량% 의 중성 메탈로프로테아제 변이체. 본 발명의 일부 조성물은 하나 이상의 보조 성분을 추가로 포함한다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 조성물은 약 3 내지 약 5 의 순 pH 를 갖는 조성물을 제공하기에 충분한 양의 pH 개질제를 추가로 포함하고, 상기 조성물에는 약 pH 3 내지 약 pH 5 의 pH 에서 가수분해되는 물질이 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 약 pH 3 내지 약 pH 5 의 pH 에서 가수분해되는 물질은 하나 이상의 계면활성제를 추가로 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 계면활성제는 에틸렌 옥시드 부분을 포함하는 나트륨 알킬 술페이트 계면활성제이다. 일부 구현예에서, 조성물은 액체이다.
또한, 본 발명은 시트레이트-유도 자가분해에 대해 향상된 내성을 갖는 단리된 중성 메탈로프로테아제 변이체를 포함하는 동물 사료 조성물을 제공한다. 추가의 구현예에서, 시트레이트-유도 자가분해에 대해 향상된 내성을 갖는 단리된 중성 메탈로프로테아제 변이체를 포함하는 섬유 가공 조성물이 제공된다. 더욱 추가의 구현예에서, 시트레이트-유도 자가분해에 대해 향상된 내성을 갖는 단리된 중성 메탈로프로테아제 변이체를 포함하는 가죽 가공 조성물이 제공된다.
더욱이, 본 발명은 직물 (예를 들어, 물질) 을 포함하는 물품 및/또는 표면을, 시트레이트-유도 자가분해에 대해 향상된 내성을 갖는 단리된 중성 메탈로프로테아제 변이체를 포함하는 세정 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세정 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 표면 또는 물질을 세정 조성물과 접촉시킨 후, 상기 물품 및/또는 표면을 헹구는 단계를 추가로 포함한다.
도 1 은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 중성 프로테아제 (NprE) 의 시트레이트-유도 자가분해를 예시한다. 패널 A 는 0.1 M Tris-HCl, pH 8.4 중 시트레이트 농도 (0 ~ 250 mM), 및 칼슘 농도 (0 ~ 10 mM) 의 함수로서 0.4 mg/ml 프로테아제의 불활성화를 보여주는 그래프를 제공한다. 잔여 활성은 숙시닐화된-카제인/TNBSA 를 사용하여 측정되었고, 10 mM 염화칼슘의 존재 하에 측정된 활성에 비례한다. 패널 B 는 시트레이트에 의해 유도되는 프로테아제의 자가분해 패턴을 예시하는 10% SDS-PAGE 분석을 도시한다. 대략 0.4 mg/ml 단백질을 0 ~ 100 mM 시트레이트가 든, 5 mM HEPES, pH 8.0 내에서 100 분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 젤 로딩하기 전에 자가분해를 중지시키기 위해, 프로테아제를 0.1 N HCl 을 사용해 불활성화시켰다. 레인 1 은 시트레이트의 부재 하에 인큐베이션된 대조군 단백질을 나타내고, 레인 2 ~ 7 은 증가하는 시트레이트의 존재 하에 단백질을 함유하고, 레인 8 은 분자량 마커를 함유한다.
도 2 는 B. 아밀로리퀘파시엔스 중성 프로테아제 (NprE) 의 자가분해 절편에 대한 아미노산 서열을 제공한다 : 절편 1 (SEQ ID NO:13); 절편 2 (SEQ ID NO: 14); 절편 3 (SEQ ID NO: 15); 절편 4 (SEQ ID NO: 16); 및 절편 5 (SEQ ID NO: 17). 자가분해 절편의 N-말단을 굵은 글씨로 두드러지게 한다. 넘버링은 성숙한 형태의 NprE 의 위치에 상응한다.
도 3 은 시트레이트 민감성에 대해 NprE 내 3 개의 위치에서의 모든 가능한 아미노산 대체를 스크리닝함으로써 수득되는 활성 데이타를 예시하는 대표도를 제공한다. 패널 A 는 위치 M138 의 활성 스크린의 데이타를 제공한다. 패널 B 는 위치 D220 의 활성 스크린의 데이타를 제공한다. 패널 C 는 위치 V190 의 활성 스크린의 데이타를 제공한다. 스크리닝은 25 mM HEPES, pH 8.0 내에서 50 mM 시트레이트의 부재 및 존재 하에 25℃ 에서 60 분 동안 수행되었다. y-눈금은 임의적이고, 야생형 단백질에 대한 증가를 나타낸다.
도 4 는 시트레이트 농도 및 인큐베이션 시간의 함수로서의 중성 프로테아제 변이체의 활성을 보여주는 그래프를 제공한다. 패널 A 는 야생형 프로테아제 (●), V190I (○), M138L (▼), D220P (Δ), M138L-D220P (■) 및 S129I-F130L-M138L-V190I-D220P (◆) 에 대해, 실온에서 60 분 후에 측정된 활성의 시트레이트 농도 의존성을 도시한다. 패널 B 는 야생형 NprE 및 변이체 S129I-F130L-M138L-V190I-D220P 에 대한 시트레이트의 효과를 보여주는 10% SDS-PAGE 분석을 도시한다. 대략 0.4 mg/ml 의 단백질을 4℃ 에서 100 분 동안 시트레이트 농도를 증가시키면서 인큐베이션하였다. 레인 1 ~ 4 는 시트레이트 (0 ~ 75 mM) 의 함수로서 야생형에 대한 자가분해 패턴을 도시하고, 레인 6 ~ 10 은 본래의 (비-자가분해된) S129I-F130L-M138L-V190I-D220P 를 보여준다. 레인 5 는 표준 분자량 마커를 나타낸다.
도 5 는 야생형 및 변이체 프로테아제의 열안정성을 보여주는 그래프를 제공한다. 패널 A 는 130 mM 시트레이트의 존재 하에 0.4 mg/ml 의 프로테아제 변이체 S1291, D220E, V190I-D220P, S129I-F130L-D220P, 및 S129I-F130L-M138L-V190I-D220P 에 대한 대표적인 열량 프로파일을 제공한다. Auto-Cap VP-DSC (MicroCal, Northampton, MA, USA) 를 사용하여 200℃/시간의 스캔 속도에서 20 ~ 90℃ 에서 데이타를 수합하였다. 나타낸 모든 데이타를 완충제 기준선에 대해 보정하였다. 완충제는 5 mM HEPES, pH 8.0 이었다. 패널 B 는 130 mM 시트레이트, pH 8.0 의 존재 하에 열적 용융점 (Tm's) 에서의 증분 증가 (incremental increase) 를 보여주는 많은 단일, 이중 및 삼중 프로테아제 변이체에 대한 막대 그래프를 제공한다.
도 6 은 야생형 NprE 및 그의 변이체의 활성 및 열안정성을 나열한 표를 제공한다.
도 7 은 본 발명의 실례의 시트레이트-안정성 NprE 변이체의 아미노산 서열을 제공한다. 패널 A 는 S129I-F130L-D220P NprE 변이체의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 18) 을 제공한다. 패널 B 는 M138L-V190I-D220P NprE 변이체의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 19) 을 제공한다. 패널 C 는 S129I-F130L-M138L-V190I-D220P NprE 변이체의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:20) 을 제공한다.
도 8 은 야생형 NprE 및 5중 NprE 변이체 (S129I-F130L-M138L-V190I-D220P) 둘 다 pH 6.5 에서 AGLA 기질에 대한 최적의 활성을 가짐을 예시하는, Kcat/Km 대 (vs) pH 의 그래프를 제공한다.
도 9 는 칼슘의 첨가가 낮고 높은 pH 둘 다에서 야생형 NprE 및 5중 NprE 변이체 (S1291-F130L-M138L-V190I-D220P) 둘 다를 안정화시킴을 예시하는, 잔여 NprE 활성 대 (vs) pH 의 그래프를 제공한다.
발명의 일반적인 설명
본 발명은 금속 킬레이터의 존재 하에 향상된 안정성을 갖는 하나 이상의 중성 메탈로프로테아제 효소를 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 중성 메탈로프로테아제는 시트레이트를 포함하는 세정 및 기타 적용에서 사용될 수 있다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 시트레이트-유도 자가분해를 견디도록 조작된 변이체 중성 메탈로프로테아제(들) 를 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다.
본원에서 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 실행은 분자 생물학, 미생물학, 및 재조합 DNA 에서 흔히 사용되는 통상의 기술을 포함하며, 이들 기술은 당업계 내에 존재한다. 상기 기술은 당업자에게 알려져 있고, 많은 교재 및 참조 문서에 기술되어 있다 (예를 들어, [Sambrook 등, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor, 1989; 및 Ausubel 등, "Current Protocols in Molecular Biology," 1987] 참조). 상기 및 하기 둘 다에서 언급되는 모든 특허, 특허 출원, 기사 및 공개물은 그 전체가 참조로서 본원에 삽입된다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당업자가 흔히 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, [Singleton and Sainsbury, Dictionoary of Microbiology and Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley and Sons, NY (1994) ; 및 Hale and Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)] 은 본 발명에서 사용되는 일반적인 사전의 많은 용어를 당업자에게 제공한다. 본원에서 기술된 것과 유사 또는 동일한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실행에서 사용되더라도, 바람직한 방법 및 물질이 본원에 기술된다. 따라서, 하기 바로 정의되는 용어는 전체로서 명세서에서 참조에 의해 더욱 완전히 기술된다.
또한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 단수 표현은 문맥에서 달리 분명하게 지시하지 않는 한, 복수를 포함한다. 수 범위는 범위를 한정하는 숫자를 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 핵산은 5' 에서 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 쓰여지고 ; 아미노산 서열은 각각 아미노에서 카르복실 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 쓰여진다. 본 발명은 기술되는 특별한 방법, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않고, 당업자에 의해 사용되는 문맥에 따라 다양할 수 있음을 이해한다.
더욱이, 본원에 제공되는 제목은 본 발명의 다양한 측면 또는 구현예를 제한하는 것이 아니고, 전체로서 명세서에서 일컬어질 수 있다. 따라서, 바로 하기에서 정의되는 용어는 전체로서 명세서에서 참조에 의해 더욱 완전히 정의된다. 그렇더라도, 본 발명의 이해를 돕고자, 많은 용어가 하기에 정의된다.
정의
본원에 다르게 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자에게 통상 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 본원에 기재된다. 따라서, 바로 하기에서 정의되는 용어는 전체로서 명세서를 참조로 더욱 상세히 기재된다. 또한, 본원에 사용되는 바와 같이, 단수형에는 문맥이 명확하게 다르게 지시하지 않는 한 복수형 참조가 포함된다. 다르게 지시되지 않는다면, 핵산은 5' 에서 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 표기하며; 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 각각 표기한다. 본 발명은 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약이 당업자에 의해 사용되는 문맥에 따라 다양할 수 있기 때문에 이에 제한되지 않는 것으로 이해된다.
본 명세서를 통틀어서 주어지는 모든 최대 수치 한계는 모든 더 낮은 수치 한계를 포함하고, 상기 더 낮은 수치 한계는 본원에서 표현되어 쓰여진 것으로 생각된다. 본 명세서를 통틀어서 주어지는 모든 최소 수치 한계는 모든 더 높은 수치 한계를 포함할 것이고, 상기 더 높은 수치 한계는 본원에서 표현되어 쓰여진 것으로 생각된다. 본 명세서를 통틀어서 주어지는 모든 수치 범위는 그러한 더 광범위한 수치 범위 내에 속하는 모든 더 좁은 수치 범위를 포함할 것이고, 상기 더 좁은 수치 범위는 모두 본원에서 표현되어 쓰여진 것으로 생각된다.
언급된 모든 문서는 상대적으로, 참조로서 본원에 삽입되어 있으며 ; 임의의 문서의 언급은 본 발명에 대해 선행 기술임을 허락받은 것으로서 해석되는 것은 아니다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "프로테아제," 및 "단백분해 활성" 은 펩타이드, 또는 펩타이드 연결을 갖는 기질을 가수분해하는 능력을 나타내는 단백질 또는 펩타이드를 말한다. 많은 잘 공지된 절차가 단백분해 활성의 측정을 위해 존재한다 (Kalisz, "Microbial Proteinase," In: Fiechter (ed.), Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, [1988] 참조). 예를 들어, 단백분해 활성은 통상의 기질을 가수분해하는 각각의 프로테아제의 능력을 분석하는 비교 어세이에 의해 확인될 수 있다. 프로테아제 또는 단백분해 활성의 분석에 유용한 실례의 기질에는, 디-메틸 카제인 (Sigma C-9801), 소 콜라겐 (Sigma C-9879), 소 엘라스틴 (Sigma E-1625), 및 소 케라틴 (ICN Biomedical 902111) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 기질을 사용하는 비색 어세이는 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, WO 99/34011 호; 및 미국 특허 번호 제 6,376,450 호 참조, 둘 다 본원에 참조로서 인용됨). pNA 어세이 (예를 들어, Del Mar 등, Anal. Biochem., 99:316-320 [1979] 참조) 가 또한 구배 용출 동안 수합된 분획에 대한 활성 효소 농도를 측정하는데 사용될 수 있다. 상기 어세이는 효소가 용해성 합성 기질인 숙시닐-알라닌-알라닌-프롤린-페닐알라닌-p-니트로아닐리드 (sAAPF-pNA) 를 가수분해함에 따라 p-니트로아닐린이 방출되는 속도를 측정한다. 가수분해 반응으로 인한 황색조의 생성 속도는 분광광도계 상에서 410 nm 에서 측정되고, 활성 효소 농도에 비례한다. 또한, 280 nm 에서의 흡광도 측정을 사용하여, 총 단백질 농도를 측정할 수 있다. 활성 효소/총-단백질 비율은 효소 순도를 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "NprE 프로테아제," 및 "NprE" 는 본원에 기술된 중성 메탈로프로테아제를 말한다. 일부 바람직한 구현예에서, NprE 프로테아제는 예를 들어, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스로부터 수득되는 정제된 MULTIFECT® Neutral 또는 PMN 으로서 지정되는 프로테아제이다. 따라서, 일부 구현예에서, 용어 "PMN 프로테아제" 는 SEQ ID NO:3 에서 제공되는 바와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스로부터 유도되는 자연 발생 성숙 프로테아제를 말한다. 대안의 구현예에서, 본 발명은 NprE 프로테아제의 일부를 제공한다.
용어 "바실러스 프로테아제 호모로그 (homologue)" 는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 유래의 성숙 프로테아제와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 자연 발생 프로테아제, 또는 상기 자연 발생 프로테아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 말하고, 상기 프로테아제는 이러한 핵산에 의해 암호화되는 중성 메탈로프로테아의 기능적인 특징을 보유한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "NprE 변이체," 및 "NprE 프로테아제 변이체" 는 야생형 NprE 와 특히 그의 기능 면에서는 유사하나, 그의 아미노산 서열에 돌연변이가 있어서 야생형 프로테아제와 서열 면에서 상이하게 되는 프로테아제를 말할 때 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "바실러스 종 (Bacillus ssp.)" 은 "바실러스" 속 내의 모든 종을 말하며, 이는 바실래아세애 과 (Family Bacillaceae), 바실래알레스 목 (Order Bacillales), 바실리 강 (Class Bacilli) 의 일원으로서 부류되는 그람-양성 박테리아이다. "바실러스 (Bacillus)" 속에는 B. 서브틸리스 (B. subtilis), B. 리체니포르미스 (B. licheniformis), B. 렌투스 (B. lentus), B. 브레비스 (B. brevis), B. 스테아로테르모필루스 (B. stearothermophilus), B. 알칼로필루스 (B. alkalophilus), B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens), B. 클라우시 (B. clausii), B. 할로두란스 (B. halodurans), B. 메가테리움 (B. megaterium), B. 코아굴란스 (B. coagulans), B. 서큘란스 (B. circulans), B. 라우투스 (B. lautus), 및 B. 투린지엔시스 (B. thuringiensis) 가 포함되나 이에 제한되지 않는, 당업자에게 공지된 바와 같은 "바실러스 (Bacillus)" 속 내의 모든 종이 포함된다. 바실러스 (Bacillus) 속에 대한 지속적인 분류학적 개편이 있다는 것으로 인지된다. 따라서, 상기 속에는 현재 "제오바실러스 스테아로테르모필루스 (Geobacillus stearothermophilus)" 라고 불리는 B. 스테아로테르모필루스 (B. stearothermophilus) 와 같은 개체를 포함하나 이에 제한되지 않는, 재분류된 종이 포함되는 것으로 인지된다. 산소의 존재 하에서의 내성 내생포자의 생성은, 상기 특징이 또한 최근에 명명된 알리시클로바실러스 (Alicyclobacillus), 암피바실러스 (Amphibacillus), 아네우리니바실러스 (Aneurinibacillus), 아녹시바실러스 (Anoxybacillus), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 필로바실러스 (Filobacillus), 그라실리바실러스 (Gracilibacillus), 할로바실러스 (Halobacillus), 파에니바실러스 (Paenibacillus), 살리바실러스 (Salibacillus), 테르모바실러스 (Thermobacillus), 우레이바실러스 (Ureibacillus), 및 비르지바실러스 (Virgibacillus) 에 적용됨에도 불구하고, 바실러스 (Bacillus) 속의 한정적인 특징인 것으로 간주된다.
관련 (및 유도체) 단백질은 "변이체 단백질" 을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 변이체 단백질은 소수의 아미노산 잔기에 의해 부모 (parent) 단백질과 그리고 서로 상이하다. 차이가 나는 아미노산 잔기의 수는 하나 이상, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 개 이상의 아미노산 잔기일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 변이체 간의 상이한 아미노산의 수는 1 내지 10 이다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 관련 단백질 및 특히 변이체 단백질은 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%. 95%, 97%, 98%, 또는 99% 의 아미노산 서열 동일성을 포함한다. 추가로, 본원에 사용된 바와 같이 관련 단백질 또는 변이체 단백질은 중요한 영역의 수 내의 부모 단백질 또는 또다른 관련 단백질과 상이한 단백질을 말한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 변이체 단백질은 부모 단백질과 상이한 상응하는 중요 영역을 1, 2, 3, 4, 5, 또는 10 개 갖는다.
본 발명의 효소의 변이체를 생성하는데 적합한 다수의 방법이 당업계에 알려져 있으며, 이에는 부위-포화 돌연변이, 스캐닝 돌연변이, 삽입 돌연변이, 랜덤 돌연변이, 부위-특이적 돌연변이, 및 특이적-진화, 뿐만 아니라 다양한 기타 재조합 접근법이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
야생형 및 돌연변이 단백질의 특징화는 임의의 수단 또는 적합한 "테스트" 를 통해 수행되고, 바람직하게는 흥미있는 특성의 평가를 바탕으로 한다. 예를 들어, pH 및/또는 온도, 뿐만 아니라 세제 및/또는 산화 안정성은 본 발명의 일부 구현예에서 측정된다. 실제로, 이들 특징 중 하나 이상에서 다양한 정도의 안정성 (pH, 온도, 단백분해 안정성, 세제 안정성, 및/또는 산화 안정성) 을 갖는 메탈로프로테아제 효소가 사용될 것으로 고려된다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산" 은 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태 (리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드) 를 말한다. 상기 용어에는 단일-, 이중- 또는 삼중-가닥 DNA, 게놈 DNA, cDNA, RNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기, 또는 기타 자연, 화학적으로, 생화학적으로 개질된 비-자연 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 하기는 폴리뉴클레오타이드의 비-제한적인 예이다 : 유전자, 유전자 절편, 염색체 절편, EST, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 개질된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체, 우라실, 다른 당 및 연결기, 예컨대 플루오로리보오스 및 티오에이트, 및 뉴클레오타이드 분지를 포함한다. 대안적인 구현예에서, 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 방해된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "DNA 구축물" 및 "형질전환 DNA" 는 숙주 세포 또는 개체에 서열을 도입하는데 사용되는 DNA 를 말하는 것으로서, 상호교환적으로 사용된다. DNA 는 시험관 내에서 PCT, 또는 당업자에게 공지된 다른 적합한 기술(들) 에 의해 생성될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, DNA 구축물은 관심있는 서열 (예를 들어, 유입 (incoming) 서열) 을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열은 조절 구성원 (예를 들어, 프로모터 등) 과 같은 추가의 구성원에 조작적으로 연결된다. DNA 구축물은 선별 마커를 추가로 포함할 수 있다. 이는 상동성 박스 옆에 유입 서열을 추가로 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 형질전환 DNA 는 말단에 첨가되는 다른 비상동성 서열을 포함한다 (예를 들어, 스터퍼 (stuffer) 서열 또는 측면 (flank)). 일부 구현예에서, 유입 서열의 말단은 형질전환 DNA 가 닫힌 고리를 형성하도록 밀접해 있다. 형질전환 서열은 야생형, 돌연변이 또는 개질될 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 구축물은 숙주 세포 염색체에 상동인 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, DNA 구축물은 비-상동성 서열을 포함한다. 일단 DNA 구축물이 시험관 내에서 조립되면, 이는 하기를 위해 사용될 수 있다 : 1) 숙주 세포의 목적하는 표적 서열에 이종성 서열을 삽입함 ; 및/또는 2) 숙주 세포 염색체의 영역을 돌연변이시킴 (즉, 내인성 서열을 이종성 서열로 대체함), 및/또는 3) 표적 유전자를 결실시킴 ; 및/또는 숙주에 복제 플라스미드를 도입함.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "발현 카세트" 및 "발현 벡터" 는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특정 핵산 구성원이 있는 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 핵산 구축물을 말한다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스, 또는 핵산 절편에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부위는 다른 서열 중에서도, 전사될 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 발현 벡터는 숙주 세포에서 이종성 DNA 절편을 혼입 및 발현하는 능력을 갖는다. 많은 원핵 및 진핵 발현 벡터가 시판된다. 적절한 발현 벡터의 선택은 당업자의 지식으로 가능하다. 용어 "발현 카세트" 는 본원에서 "DNA 구축물" 및 그의 문법적인 상응물과 상호교환적으로 사용된다. 적절한 발현 벡터의 선택은 당업자의 지식으로 가능하다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터" 는 하나 이상의 세포 유형에 핵산을 도입하도록 디자인된 폴리뉴클레오타이드 구축물을 말한다. 벡터에는 클로닝 벡터, 발현 벡터, 셔틀 벡터, 플라스미드, 카세트 등이 포함된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 구축물은 프로테아제 (예를 들어, 전구체 또는 성숙 프로테아제) 를 암호화하는 DNA 서열을 포함하며, 이 서열은 적합한 숙주에서 DNA 의 발현에 영향을 줄 수 있는 적합한 전구서열 (예를 들어, 분비 서열 등) 에 조작적으로 연결되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "플라스미드" 는 클로닝 벡터로서 사용되는 환형의 이중-가닥 (ds) DNA 구축물을 말하며, 이는 일부 진핵세포 또는 원핵세포에서 염색체외 자가복제성 유전적 구성원을 형성하거나, 또는 숙주 염색체에 함입된다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산 서열을 세포에 도입하는 맥락에서, 용어 "도입된" 은 핵선 서열을 세포에 이동시키기에 적합한 방법을 말한다. 상기 도입 방법에는 원형질 융합, 형질감염, 형질전환, 접합, 및 유전자도입이 포함되나 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, Ferrari 등, "Genetics, " in Hardwood 등, (eds.), Bacillus, Plenum Publishing Corp., pages 57-72 [1989] 참조).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "형질전환된" 및 "안정하게 형질전환된" 은 본래의 것이 아닌 (이종성) 폴리뉴클레오타이드 서열이 세포의 게놈에 함입되거나, 또는 2 개 이상의 세대 동안 유지되는 에피좀 플라스미드로서의 세포를 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "선별 마커-암호화 뉴클레오타이드 서열" 은 숙주 세포에서 발현할 수 있는 뉴클레오타이드 서열로서, 여기서, 선별 마커의 발현은 상응하는 선별제의 존재 시 또는 필수 영양소의 결여 시에 성장하는 능력을, 발현된 유전자를 함유하는 세포에 부여한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "선별 마커" 및 "선별성 마커" 는 벡터를 함유하는 숙주를 쉽게 선별할 수 있게 하는, 숙주 세포에서 발현할 수 있는 핵산 (예를 들어, 유전자) 을 말한다. 상기 선별 마커의 예에는 항생제가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 용어 "선별 마커" 는 숙주 세포가 관심있는 유입 DNA 를 취하였거나 또는 일부 다른 반응이 발생하였다는 지시를 제공하는 유전자를 말한다. 전형적으로, 선별 마커는 외인성 DNA 를 함유하는 세포를 형질전환 동안에 임의의 외인성 서열을 받지 못한 세포와 구별할 수 있도록, 숙주 세포에 대사성 이점 또는 항생제 내성을 부여하는 유전자이다. "상주 (residing) 선별 마커" 는 형질전환되는 미생물의 염색체 상에 위치하는 마커이다. 상주 선별 마커는 형질전환 DNA 구축물 상의 선별 마커와 상이한 유전자를 암호화한다. 선별성 마커는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 상기 지시한 바와 같이, 바람직하게는 마커는 항생제 내성 마커이다 (예를 들어, ampR; phleoR; specR; kanR; eryR; tetR; cmpR; 및 neoR (예를 들어, Guerot-Fleury, Gene, 167:335-337 [1995); Palmeros 등, Gene 247:255-264 [2000]; 및 Trieu-Cuot 등, Gene, 23:331-341, [1983] 참조). 본 발명에 따라 유용한 다른 마커에는 트립토판과 같은 영양요구성 마커 ; 및 β-갈락토시다아제와 같은 검출 마커가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터" 는 하류 유전자의 전사를 지도하는 기능을 하는 핵산 서열을 말한다. 바람직한 구현예에서, 프로모터는 표적 유전자가 발현되는 숙주 세포에 적절하다. 다른 전사 및 번역 조절 핵산 서열 ("조절 서열" 이라고도 함) 과 함께 프로모터는 해당 유전자의 발현에 필요하다. 일반적으로, 전사 및 번역 조절 서열에는 프로모터 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 개시 및 정지 서열, 번역 개시 및 정지 서열, 및 인핸서 또는 활성화 서열이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적 관계를 맺도록 위치되는 경우 "조작적으로 연결된다". 예를 들어, 분비 리더 (즉, 신호 펩타이드) 를 암호화하는 DNA 는 그것이 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 프리단백질 (preprotein) 로서 발현된다면 폴리펩타이드에 대한 DNA 에 조작적으로 연결되며 ; 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 미친다면 암호화 서열에 조작적으로 연결되거나 ; 또는 리보좀 결합 부위는 그것이 번역을 용이하게 하도록 위치된다면 암호화 서열에 조작적으로 연결된다. 일반적으로, "조작적으로 연결된" 은 연결되는 DNA 서열이 인접해 있고, 분비 리더의 경우, 인접해 있고 해독 기 (reading phase) 에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접해 있을 필요가 없다. 연결은 통상의 제한효소 부위에서의 결합에 의해 이루어진다. 상기 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커가 통상의 실행에 따라 사용된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자" 는 폴리펩타이드를 암호화하고, 암호화 영역 전 후 영역뿐만 아니라, 개별 암호화 분절 (엑손) 사이의 개입 서열 (인트론) 영역을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, DNA 분절) 를 말한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "상동 유전자" 는 상이하지만 일반적으로는 연관된 종으로부터 비롯된 유전자 쌍을 말하며, 상기 상동 유전자는 서로에게 상응하며 서로 동일하거나 또는 매우 유사하다. 상기 용어는 종분화 (즉, 신규 종의 개발) 에 의해 분리된 유전자 (예를 들어, 오르토로그 (orthologous) 유전자), 뿐만 아니라 유전적 복제에 의해 분리된 유전자 (예를 들어, 파라로그 (paralogous) 유전자) 를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "오르토로그" 및 "오르토로그 유전자" 는 종분화에 의해 공통의 조상 유전자 (즉, 상동 유전자) 로부터 진화한 상이한 종의 유전자를 말한다. 전형적으로, 오르토로그는 진화 과정 동안에 동일한 기능을 유지한다. 오르토로그의 규명은 새로 서열화된 게놈에서 유전자 기능을 신뢰할만하게 예측하는데 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "파라로그" 및 "파라로그 유전자" 는 게놈 내에서의 복제 (duplication) 에 의해 관계되는 유전자를 말한다. 오르토로그는 진화 과정 동안에 동일한 기능을 유지하는 한편, 파라로그는 일부 기능이 본래의 것과 종종 관련있더라도 새로운 기능을 진화시킨다. 파라로그 유전자의 예에는, 모두 세린 단백분해효소이고 동일 종에서 함께 발생하는 트립신, 키모트립신, 엘라스타제, 및 트롬빈을 암호화하는 유전자가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이, "상동성" 은 서열 유사성 또는 동일성을 말하며, 동일성이 바람직하다. 상기 상동성은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 측정된다 (예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; 프로그램, 예컨대 GAP, BESTFlT, FASTA, 및 TFASTA {Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, WI)}; 및 Devereux 등, Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984] 참조).
본원에 사용되는 바와 같이, "유사 서열" 은 유전자의 기능이 B. 아밀로리퀘파시엔스 NprE 프로테아제를 바탕으로 한 유전자와 본질적으로 동일한 서열이다. 추가로, 유사 유전자는 B. 아밀로리퀘파시엔스 NprE 프로테아제의 서열과 적어도 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 의 서열 동일성을 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 특성 중 하나 초과가 서열에 적용된다. 유사 서열은 공지된 서열 정렬 방법에 의해 측정된다. 통상 사용되는 정렬 방법은 BLAST 이나, 상기 및 하기에 나타나 있듯이, 서열 정렬에 사용될 수 있는 다른 방법도 있다.
유용한 알고리즘의 한 예는 PILEUP 이다. PILEUP 는 점진, 2쌍 정렬을 사용하는 관련 서열의 군으로부터의 다중 서열 정렬을 만든다. 이는 정렬을 만드는데 사용되는 클러스터링 관계 (clustering relationship) 를 보여주는 나무 (tree) 를 그릴 수 있다. PILEUP 는 Feng 및 Doolittle 의 점진 정렬 방법의 단일화 (simplification) 를 사용한다 (Feng and Doolittle, J. Mol. Evol., 35:351-360 [1987]). 상기 방법은 Higgins 및 Sharp 에 의해 기술된 방법과 유사하다 (Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153 [1989]). 유용한 PILEUP 파라미터는 3.00 의 디폴트 갭 가중치 (weight), 0.10 의 디폴트 갭 길이 가중치, 및 가중치 엔드 갭을 포함한다.
유용한 알고리즘의 또다른 예는 Altschul 등에 의해 기술된 BLAST 알고리즘이다 (Altschul 등, J. Mol. Biol., 215:403-410 [1990]; 및 Karlin 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:5873-5787 [1993)). 특히 유용한 BLAST 프로그램은 WU-BLAST-2 프로그램이다 (Altschul 등, Meth. Enzymol., 266:460-480 [1996] 참조). WU-BLAST-2 는 다수의 검색 파라미터를 사용하는데, 이의 대부분은 디폴트 값에 맞춰진다. 조정가능한 파라미터는 하기 값을 사용해 맞춰진다 : 오버랩 스팬 (overlap span) = 1, 오버랩 프랙션 (overlap fraction) = 0.125, 워드 역치 (word threshold) (T) = 11. HSP S 및 HSP S2 파라미터는 동적 값 (dynamic 값) 이고, 관심있는 서열이 검색되는 특정 데이타베이스의 조성 및 특정 서열의 조성에 의존하여 프로그램 자체에 의해 구축된다. 그러나, 상기 값은 민감도를 증가시키도록 조정될 수 있다. 아미노산 서열 동일성 값 % 는 매칭하는 동일한 잔기의 수를 정렬된 영역 내 "더 긴" 서열의 잔기의 총 수로 나누어서 측정된다. "더 긴" 서열은 정렬된 영역에서 가장 실제적인 잔기를 갖는 서열이다 (정렬 스코어를 최대화하기 위해 WU-Blast-2 에 의해 도입된 갭은 무시함).
따라서, "핵산 서열 동일성 %" 는 출발 서열 (즉, 관심있는 서열) 의 뉴클레오타이드 잔기와 동일한 후보 서열 내 뉴클레오타이드 잔기의 % 로서 정의된다. 바람직한 방법은 WU-BLAST-2 의 BLASTN 모듈을 디폴트 파라미터에 맞추는데 사용되고, 오버랩 스팬 및 오버랩 프랙션은 각각 1 및 0.125 로 맞추어진다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "혼성화" 는 당업계에 공지된 바와 같이, 핵산 중 한 가닥이 염기쌍을 통해 상보성 가닥과 결합하는 방법을 말한다.
핵산 서열과 대조군 핵산 서열이 중간 내지 높은 엄격한 혼성화 및 세정 조건 하에 서로 특이적으로 혼성된다면, 핵산 서열은 대조군 핵산 서열에 "선택적으로 혼성화가능한" 것으로 간주된다. 혼성화 조건은 핵산 결합 복합체 또는 프로브의 용융 온도 (Tm) 를 바탕으로 한다. 예를 들어, "최대의 엄격성" 은 전형적으로 약 Tm - 5℃ (프로브의 Tm 보다 5℃ 낮음) 에서 발생하고 ; "높은 엄격성" 은 Tm 보다 약 5 ~ 10℃ 낮은 온도에서 발생하고 ; "중간 정도의 엄격성" 은 프로브의 Tm 보다 약 10 ~ 20℃ 낮은 온도에서 발생하고 ; "낮은 엄격성" 은 Tm 보다 약 20 ~ 25℃ 낮은 온도에서 발생한다. 기능적으로, 혼성화 프로브를 사용해 엄격한 동일성 또는 거의 엄격한 동일성을 갖는 서열을 규명하기 위해서는 최대의 엄격한 조건이 사용될 수 있으며 ; 한편, 중간 또는 낮은 엄격한 혼성화는 폴리뉴클레오타이드 서열 호모로그 (homolog) 를 규명 또는 검출하는데 사용될 수 있다.
중간 및 높은 엄격한 혼성화 조건은 당업계에 잘 공지되어 있다. 높은 엄격한 조건의 예는 50% 포름아마이드, 5X SSC, 5X Denhardt 용액, 0.5% SDS 및 100 μg/ml 변성된 운반체 DNA 내, 약 42℃ 에서 혼성화하고, 이어서 2X SSC 및 0.5% SDS 내, 실온에서 2 회 세정하고, 0.1X SSC 및 0.5% SDS 내, 42℃ 에서 추가로 2 회 세정하는 것을 포함한다. 중간 정도의 엄격한 조건의 예는 20% 포름아마이드, 5X SSC (15O mM NaCl, 15 mM 트리나트륨 시트레이트), 50 mM 나트륨 포스페이트 (pH 7.6), 5X Denhardt 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml 변성된 쉐어드 연어 정자 DNA (denatured sheared salmon sperm DNA) 를 포함하는 용액 내, 37℃ 에서 밤새 인큐베이션하고, 이어서 약 37 ~ 50℃, 1X SSC 에서 필터를 세정하는 것을 포함한다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 요소를 조절하는데 필요한 온도, 이온 세기 등을 조정하는 방법을 알고 있다.
본원에 사용되는 바와 같은, "재조합" 은 이종 핵산 서열의 도입에 의해 개질된 세포 또는 벡터, 또는 그렇게 해서 개질된 세포로부터 유래된 세포를 말하는 것을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 본래의 (비-재조합) 형태 내에서 동일한 형태로 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 또는 고의적인 인간 개입의 결과로서 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는, 즉, 다르게 비정상적으로 발현되는 본래의 유전자를 발현한다. "재조합," "재조합화," 및 "재조합된" 핵산의 발생은 일반적으로 2 개 이상의 핵산 절편의 어셈블리로서, 이러한 어셈블리는 키메라 유전자를 산출한다.
바람직한 구현예에서, 돌연변이체 DNA 서열은 하나 이상의 코돈에서의 부위 포화 돌연변이화로 발생된다. 또다른 바람직한 구현예에서, 부위 포화 돌연변이화는 2 개 이상의 코돈에 대해 수행된다. 추가의 구현예에서, 돌연변이체 DNA 서열은 야생형 서열과 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과, 또는 약 98% 초과의 상동성을 갖는다. 대안적인 구현예에서, 돌연변이체 DNA 는 임의의 공지된 돌연변이화 과정 예컨대, 방사선조사, 니트로소구아니딘 등을 사용하여 생체 내에서 발생된다. 다음, 목적하는 DNA 서열을 단리하고 본원에 제공된 방법에 사용한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표적 서열" 은 유입 서열을 숙주 세포 게놈에 삽입하는 것이 바람직한 경우, 서열을 암호화하는 숙주 세포 내 DNA 서열을 말한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 기능성 야생형 유전자 또는 오페론을 암호화하는 한편, 다른 구현예에서, 표적 서열은 기능성 돌연변이 유전자 또는 오페론, 또는 비-기능성 유전자 또는 오페론을 암호화한다.
본원에 사용된 바와 같이, "측면 서열 (flanking sequence)" 은 논의되는 서열의 상류 또는 하류에 있는 임의의 서열을 말한다 (예를 들어, 유전자 A-B-C 에 대해서, 유전자 B 는 A 및 C 유전자 서열의 측면에 있음). 바람직한 구현예에서, 유입 서열은 각 면 상에 있는 상동성 박스의 측면에 있다. 또다른 구현예에서, 유입 서열 및 상동성 박스는 각 면 상의 스터퍼 서열의 측면에 있는 단위 (unit) 를 포함한다. 일부 구현예에서, 측면 서열은 단지 단일 면 (3' 또는 5') 상에만 존재하나, 바람직한 구현예에서, 상기 서열은 측면에 있는 서열의 각 면 상에 존재한다. 일부 구현예에서, 측면 서열은 단지 단일 면 (3' 또는 5') 상에만 존재하나, 한편, 바람직한 구현예에서, 상기 서열은 측면에 있는 서열의 각 면 상에 존재한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "스터퍼 서열" 은 상동성 박스의 측면에 있는 임의의 외부 DNA (전형적으로 벡터 서열) 를 말한다. 그러나, 상기 용어는 임의의 비상동성 DNA 서열을 포함한다. 이론에 제한되지 않으면서, 스터퍼 서열은 세포가 DNA 취득을 개시하도록, 중요하지 않은 표적을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증폭" 및 "유전자 증폭" 은, 증폭된 유전자가 게놈에 처음에 존재하던 것보다 더 높은 복사수로 존재하게 되는 식으로 특정 DNA 서열이 과잉 복제되는 방법을 말한다. 일부 구현예에서, 약물 (예를 들어, 억제가능 효소의 억제자) 의 존재 하에서의 성장에 의한 세포의 선별은, 상기 약물의 존재 하의 성장에 필요한 유전자 생성물을 암호화하는 내인성 유전자의 증폭, 또는 상기 유전자 생성물을 암호화하는 외인성 (즉, 투입됨) 서열의 증폭, 또는 둘 다를 초래한다.
"증폭" 은 주형 특이성과 관련된 핵산 복제의 특별한 경우이다. 이것은 비-특이적 주형 복제 (즉, 주형-의존적이나 특이적 주형에는 의존하지 않는 복제) 와는 대조적인 것이다. 여기서 주형 특이성은 복제 충성도 (즉, 적합한 폴리뉴클레오타이드 서열의 합성) 및 뉴클레오타이드 (리보- 또는 데옥시리보-) 특이성과는 구별된다. 주형 특이성은 종종 "표적" 특이성과 관련되어 기술된다. 표적 서열은 다른 핵산으로부터 색출된다는 점에서 "표적" 이다. 증폭 기술은 이러한 색출을 위해 일차적으로 고안되었다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "공동-증폭" 은 다른 유전자 서열과 함께 증폭가능 마커를 단일 세포 내로 도입하는 것 (즉, 발현 벡터 내에 함유된 유전자들과 같은 하나 이상의 비-선별적 유전자를 포함함), 및 적절한 선택적 압력을 적용하는 것을 말하며, 세포는 증폭가능 마커 및 기타, 비-선별적 유전자 서열 모두를 증폭시킨다. 증폭가능 마커는 다른 유전자 서열에 물리적으로 연결될 수 있거나 대안적으로는 하나는 증폭가능 마커를 함유하고 다른 하나는 비-선별적 마커를 함유하는 2 개의 분리된 DNA 조각이 동일 세포 내에 도입될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증폭가능 마커," "증폭가능 유전자" 및 "증폭 벡터" 는 적합한 성장 조건 하에서 유전자의 증폭을 가능하게 하는 유전자를 암호화하는 유전자 또는 벡터를 말한다.
"주형 특이성" 은 대부분 효소 선택에 의한 증폭 기술로 달성된다. 증폭 효소는 사용되는 조건 하에서 핵산의 불균질 혼합물 중 오직 특정 핵산 서열만을 처리할 효소이다. 예를 들어, Qβ 복제효소의 경우, MDV-1 RNA 가 복제효소에 대한 특이적 주형이고 (예를 들어, Kacian 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:3038 [1972] 참조), 다른 핵산은 상기 증폭 효소에 의해 복제되지 않는다. 유사하게, T7 RNA 중합효소의 경우, 상기 증폭 효소는 그 자신의 프로모터에 대해 엄격한 특이성을 갖는다 (Chamberlin 등, Nature 228:227 [1970] 참조). T4 DNA 리가아제의 경우, 상기 효소는 연결 접합점에서 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 기질과 주형 사이에 미스매치가 있는 경우, 2 개의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 연결하지 않을 것이다 (Wu and Wallace, Genomics 4:560 [1989] 참조). 마지막으로, Taq 및 Pfu 중합효소는 고온에서 작용하는 그들의 능력에 비추어, 결합된 서열에 대해 높은 특이성을 나타내는 것으로 발견되므로, 프라이머에 의해 정의되며; 고온은 표적 서열과의 프라이머 혼성화를 선호하고 비-표적 서열과의 혼성화를 선호하지 않는 열역학적 상태를 초래한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증폭가능 핵산" 은 임의의 증폭 방법에 의해 증폭될 수 있는 핵산을 말한다. "증폭가능 핵산" 은 통상 "샘플 주형" 을 포함할 것으로 생각된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "샘플 주형" 은 "표적" (하기 정의됨) 의 존재를 분석하는 샘플로부터 기원하는 핵산을 말한다. 대조적으로, "배경 주형" 은 샘플에 존재할 수 있거나 존재할 수 없는, 샘플 주형 이외의 핵산을 말할 때 사용된다. 배경 주형은 대부분 종종 부주의에 의한 것이다. 이것은 잔류 결과일 수 있거나, 샘플로부터 정제해서 제거되어야 할 핵산 오염물의 존재로 인한 것일 수 있다. 예를 들어, 검출되는 것 이외의, 개체에서 가져온 핵산은 테스트 샘플에서 배경으로서 존재할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프라이머" 는 정제된 제한 분해물과 같이 자연 발생하거나 또는 합성적으로 생성되든지 간에, 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 확장 생성물의 합성이 유도되는 조건하에 놓인 경우 (즉, 뉴클레오타이드 및 DNA 중합효소와 같은 유도제의 존재 하에서 및 적합한 온도 및 pH 에서) 합성 개시점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 말한다. 프라이머는 증폭시 최대 효율을 위해 바람직하게는 단일 가닥이지만, 대안적으로는 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥인 경우, 프라이머는 먼저 가닥을 분리시키기 위해 처리된 후, 확장 생성물을 생성하는데 사용된다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드이다. 프라이머는 유도제의 존재 하에서 확장 생성물의 합성을 시작할 정도로 충분히 길어야만 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머의 공급원 및 방법의 용도를 포함하는 많은 요소에 따라 다를 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로브" 는 정제된 제한 분해물과 같이 자연 발생하거나 또는 합성적으로, 재조합적으로 또는 PCR 증폭에 의해 생성되든지간에, 또다른 관심있는 올리고뉴클레오타이드에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 (즉, 뉴클레오타이드 서열) 를 말한다. 프로브는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 프로브는 특정 유전자 서열의 검출, 규명 및 단리에 유용하다. 본 발명에서 사용되는 임의의 프로브는 효소 (예를 들어, ELISA 뿐만 아니라, 효소-기반 면역화학적 어세이), 형광, 방사능 및 발광 시스템을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 검출 시스템에서 검출가능하도록, 임의의 "리포터 분자" 로 표지될 것으로 고려된다. 본 발명은 임의의 특정 검출 시스템 또는 표지에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 중합효소 연쇄 반응과 관련하여 사용되는 경우 용어 "표적" 은 중합효소 연쇄 반응에 사용되는 프라이머에 의해 결합된 핵산 영역을 말한다. 따라서, "표적" 은 다른 핵산 서열로부터 색출된다. "분절" 은 표적 서열 내의 핵산 영역으로서 정의된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "중합효소 연쇄 반응" ("PCR") 은 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제 4,683,195 호, 제 4,683,202 호 및 제 4,965,188 호의 방법을 말하고, 이에는 클로닝 또는 정제 없이, 게놈 DNA 혼합물 내의 표적 서열의 분절의 농도를 증가시키기 위한 방법이 포함된다. 이러한 표적 서열 증폭 방법은 목적하는 표적 서열을 함유하는 DNA 혼합물에 2 개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 과량으로 도입하고, 이어서 DNA 중합효소의 존재 하에 열 주기 (thermal cycling) 를 정확한 순서로 수행하는 것으로 이루어진다. 2 개의 프라이머는 이중 가닥 표적 서열 중 그의 각각의 가닥에 상보적이다. 증폭을 위해, 혼합물을 변성시키고, 그런 다음, 프라이머를 표적 분자 내 그의 상보성 서열에 어닐링시킨다. 어닐링한 후, 중합효소를 사용해 프라이머를 확장시켜서, 상보성 가닥의 새로운 쌍을 형성한다. 변성화 단계, 프라이머 어닐링 및 중합효소 확장은 수 회 반복되어 (즉, 변성, 어닐 및 확장이 하나의 "주기" 를 구성하고 ; 이런 "주기" 가 많이 존재할 수 있음), 목적하는 표적 서열의 증폭된 분절을 고농도로 수득할 수 있다. 목적하는 표적 서열의 증폭된 분절의 길이는 서로에 대해 프라이머의 상대적인 위치에 의해 결정되고, 따라서, 상기 길이는 조절가능한 파라미터이다. 상기 방법의 반복적인 측면으로 인해, 상기 방법을 "중합효소 연쇄 반응" (이후, "PCR") 이라고 한다. 표적 서열의 목적하는 증폭된 분절이 혼합물 내에서 두드러진 (농도 면에서) 서열이 되기 때문에, 이들을 "PCR 증폭된" 것이라고 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증폭 시약" 은 프라이머, 핵산 주형 및 증폭 효소를 제외하고 증폭에 필요한 시약 (데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트, 완충제 등) 을 말한다. 전형적으로, 다른 반응 성분과 함께 증폭 시약을 반응 용기 (시험관, 마이크로웰 등) 에 넣고 함유시킨다.
PCR 을 이용해, 게놈 DNA 중의 특이적 표적 서열의 단일 복사를 여러 상이한 방법론 (예를 들어, 표지된 프로브와의 혼성화 ; 비오티닐화 프라이머의 혼입 후 아비딘-효소 컨쥬게이트 검출 ; 증폭된 분절 내로 32P-표지된 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트, 예컨대 dCTP 또는 dATP 를 혼입) 에 의해 검출가능한 수준으로 증폭시키는 것이 가능하다. 게놈 DNA 외에도, 임의의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 적합한 세트의 프라이머 분자로 증폭될 수 있다. 특히, PCR 과정 그 자체에 의해 제작된 증폭된 분절 그 자체는 후속한 PCR 증폭에 대한 효과적인 주형이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "PCR 생성물," "PCR 절편," 및 "증폭 생성물" 은 변성, 어닐링 및 확장의 PCR 단계를 2 주기 이상 완료한 후의, 생성 화합물 혼합물을 말한다. 이러한 용어는 하나 이상의 표적 서열의 하나 이상의 분절의 증폭이 있는 경우를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "RT-PCR" 은 RNA 서열의 복제 및 증폭을 말한다. 이 방법에서, 역전사가 PCR 에 커플링되어 있는데, 가장 흔히는 참조로서 본원에 인용된 미국 특허 제 5,322,770 호에 기술된 바와 같은 열안정 중합효소를 이용하는 1 가지 효소 방법을 사용한다. RT-PCR 에서, RNA 주형은 상기 중합효소의 역전사효소 활성으로 인해, cDNA 로 전환되며, 그 후, 상기 중합효소의 중합활성을 사용하여 증폭된다 (즉, 기타 PCR 방법들에서와 같음).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소" 는 특정 뉴클레오타이드 서열에서 또는 그 근처에서 이중 가닥 DNA 를 절단하는 각각의 박테리아 효소를 말한다.
"제한효소 부위" 는 주어진 제한 엔도뉴클레아제에 의해 인식 및 절단되는 뉴클레오타이드 서열을 말하며, 흔히 DNA 절편의 삽입 부위이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 제한효소 부위는 선별 마커 내로, 및 상기 DNA 구축물의 5' 및 3' 말단 내로 조작된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "염색체 함입" 은 유입 서열이 숙주 세포의 염색체 내로 도입되는 방법을 말한다. 형질전환 DNA 의 상동 영역은 염색체의 상동 영역과 함께 정렬된다. 이어서, 상동성 박스 사이의 서열이 이중 교차 (즉, 상동성 재조합) 내의 유입 서열에 의해 대체된다. 본 발명의 일부 구현예에서, DNA 구축물의 염색체 분절을 불활성화시키는 상동 섹션이 바실러스 (Bacillus) 염색체의 토착 염색체 영역의 측면 상동 영역에 정렬된다. 이어서, 토착 염색체 영역이 이중 교차 (즉, 상동성 재조합) 내의 DNA 구축물에 의해 결실된다.
"상동성 재조합" 은 동일한 또는 거의 동일한 뉴클레오타이드 서열의 부위에서의 2 개의 DNA 분자 또는 쌍을 이룬 염색체들 간에 DNA 절편을 교환하는 것을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 염색체 함입은 상동성 재조합이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "상동 서열" 은 비교를 위해 최적으로 정렬되었을 때 또다른 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 약 100%, 약 99%, 약 98%, 약 97%, 약 96%, 약 95%, 약 94%, 약 93%, 약 92%, 약 91%, 약 90%, 약 88%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 또는 약 70% 의 서열 동일성을 갖는 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 일부 구현예에서, 상동 서열은 약 85% 내지 약 100% 의 서열 동일성을 갖고, 다른 구현예에서 약 90% 내지 약 100% 의 서열 동일성이 있으며, 더욱 바람직한 구현예에서는, 약 95% 내지 약 100% 의 서열 동일성이 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "아미노산" 은 펩티드 또는 단백질 서열 또는 이들의 일부를 말한다. 용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드" 는 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이종 단백질" 은 숙주 세포에서 자연 발생하지 않는 단백질 또는 폴리펩티드를 말한다. 이종 단백질의 예에는 프로테아제를 비롯한 히드롤라아제와 같은 효소가 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 단백질을 암호화하는 유전자는 자연 발생적인 유전자인 반면, 다른 구현예에서는 돌연변이 및/또는 합성 유전자가 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "상동 단백질" 은 세포 내의 고유의 또는 자연발생하는 단백질 또는 폴리펩티드를 말한다. 바람직한 구현예에서, 세포는 그람-양성 세포이고, 특히 바람직한 구현예에서, 세포는 바실러스 (Bacillus) 숙주 세포이다. 대안적인 구현예에서, 상동 단백질은 E. 콜라이 (E. coli), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 트리코데르마 (Trichoderma), 및 아스페르길루스 (Aspergillus) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 기타 개체에 의해 생성된 고유의 단백질이다. 본 발명은 재조합 DNA 기술에 의해 상동 단백질을 생성하는 숙주 세포를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은, "오페론 영역" 은 공통 프로모터로부터 단일 전사 단위로서 전사되어, 공동-조절되는 인접 유전자의 군을 포함한다. 일부 구현예에서, 오페론에는 조절 유전자가 포함된다. 가장 바람직한 구현예에서, RNA 수준에 의해 측정된 바로는 높게 발현되나, 미공지된 또는 불필요한 기능을 갖는 오페론이 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같은, "항생제 영역" 은 항생제 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 함유하는 영역이다.
폴리뉴클레오타이드는 고유의 상태에서 또는 당업자에게 공지된 방법에 의해 조작되는 경우, 전사 및/또는 번역되어 RNA, 폴리펩티드 또는 그의 절편을 생성할 수 있다면, RNA 또는 폴리펩티드를 "암호화한다 (encode)" 라고 언급된다. 이러한 핵산의 안티-센스 가닥이 또한 서열을 암호화하는 것으로 언급된다.
당업계에 공지된 바와 같이, DNA 는 RNA 중합효소에 의해 전사되어 RNA 를 생성할 수 있으나, RNA 는 역전사효소에 의해 역전사되어 DNA 를 생성할 수 있다. 따라서, DNA 는 RNA 를 암호화할 수 있으며 역도 성립한다.
용어 "조절 분절" 또는 "조절 서열" 또는 "발현 조절 서열" 은 암호화된 아미노산 서열의 발현에 영향을 주는 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 의 폴리뉴클레오타이드 서열에 조작적으로 연결된 DNA 의 폴리뉴클레오타이드 서열을 말한다. 조절 서열은 아미노산을 암호화하는 조작적으로 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 억제, 퇴행 또는 촉진할 수 있다.
"숙주 균주" 또는 "숙주 세포" 는 본 발명에 따른 DNA 를 포함하는 발현 벡터에 대한 적합한 숙주를 말한다.
효소가 상응하는 야생형 세포에서 발현되는 수준보다 더 높은 수준으로 세포에서 발현되는 경우, 상기 효소는 숙주 세포에서 "과발현" 된다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩티드" 는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. [IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN)] 에 따라 정의된 아미노산에 대한 3 자리 코드가 본 명세서 전체에 걸쳐 사용된다. 또한 유전적 코드의 퇴행으로 인해 폴리펩티드가 하나 초과의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있음을 이해한다.
"전구서열" 은 신호 서열과 성숙 프로테아제 사이에 존재하는, 프로테아제의 분비에 필요한 아미노산 서열이다. 상기 전구 서열의 절단으로 성숙 활성 프로테아제가 생성될 것이다.
용어 "신호 서열" 또는 "신호 펩티드" 는 성숙 또는 전구 형태의 단백질의 분비에 참여하는 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산의 임의 서열을 말한다. 신호 서열에 대한 이러한 정의는 기능상의 것으로서, 단백질 분비의 유효화에 참여하는, 상기 단백질 유전자의 N-말단 부분에 의해 암호화되는 모든 이러한 아미노산 서열들을 포함하는 것으로 의도된다. 이들은, 보편적인 것은 아니나 종종, 단백질의 N-말단 부분 또는 전구체 단백질의 N-말단 부분에 결합한다. 상기 신호 서열은 내인성일 수도 있고 외인성일 수도 있다. 상기 신호 서열은 상기 단백질 (예를 들어, 프로테아제) 에 정상적으로 결합된 것일 수 있고, 또는 또다른 분비 단백질을 암호화하는 유전자로부터 비롯된 것일 수도 있다. 하나의 실례의 외인성 신호 서열은 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus) (ATCC 21536) 의 서브틸리신의 신호 서열의 나머지에 융합되는 바실러스 서브틸리스 서브틸리신의 신호 서열중 처음의 7 개의 아미노산 잔기를 포함한다.
용어 "하이브리드 신호 서열" 은, 발현될 유전자의 신호 서열에 융합된 발현 숙주로부터 서열 일부가 수득되는 신호 서열을 말한다. 일부 구현예에서, 합성 서열이 이용된다.
단백질 또는 펩티드의 "성숙" 형태라는 용어는 단백질 또는 펩티드의 최종적인 기능적 형태를 말한다. 예시하자면, 본 발명의 NprE 프로테아제의 성숙 형태에는 SEQ ID NO:3 의 아미노산 서열이 적어도 포함된다.
단백질 또는 펩티드의 "전구체" 형태라는 용어는, 상기 단백질의 아미노 또는 카르보닐 말단에 조작적으로 연결된 전구서열을 가진 단백질의 성숙한 형태를 말한다. 전구체는 또한 상기 전구서열의 아미노 말단에 조작적으로 연결된 "신호" 서열을 가질 수 있다. 상기 전구체는 또한 번역후 활성에 관여하는 추가의폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 이로부터 절단되어 단백질 또는 펩티드의 성숙한 형태를 남기는 폴리뉴클레오타이드) 를 가질 수 있다.
"자연 발생 효소" 및 "자연 발생 단백질" 은 자연적으로 발견되는 서열과 동일한 미개질 아미노산 서열을 갖는 효소 또는 단백질을 말한다. 자연 발생 효소에는 특정 미생물에서 자연 발현되거나 발견된 효소인 고유의 효소가 포함된다.
용어 "~ 로부터 유래된" 및 "~ 로부터 수득된" 은 문제의 개체의 균주에 의해 생성되거나 생성될 수 있는 프로테아제, 뿐만 아니라 그러한 균주로부터 단리된 DNA 서열에 의해 암호화되고 그러한 DNA 서열을 함유하는 숙주 개체에서 생성되는 프로테아제를 말한다. 추가로, 상기 용어는 합성 및/또는 cDNA 기원의 DNA 서열에 의해 암호화되고 문제의 프로테아제의 확인된 특징을 갖는 효소를 말한다. 예로 들자면, "바실러스 종으로부터 유래된 프로테아제" 는 바실러스 종에 의해 자연-생성되는 단백분해 활성을 갖는 효소, 뿐만 아니라, 바실러스 종 기원에 의해 생성되나, 유전적 조작 기술의 사용을 통해 중성 메탈로프로테아제를 암호화하는 핵산으로 형질전환된 비-바실러스 아밀로리퀘파시엔스 개체에 의해서도 생성되는 중성 메탈로프로테아제를 말한다.
본 정의 범주 내의 "유도체" 는 일반적으로 유도체가 야생형, 고유형 또는 부모 (parent) 형태로서 유사한 목적에 유용한 범위로, 야생형, 고유형 또는 부모형태에서 관찰된 단백분해 활성 특징을 보유한다. 중성 메탈로프로테아제의 기능성 유도체는 본 발명의 중성 메탈로프로테아제의 일반적인 특징을 갖는 자연 발생적으로, 합성적으로 또는 재조합적으로 생성된 펩티드 또는 펩티드 절편을 포함한다.
용어 "기능성 유도체" 는 중성 메탈로프로테아제를 암호화하는 핵산의 기능적 특징을 갖는 핵산의 유도체를 말한다. 본 발명의 중성 메탈로프로테아제를 암호화하는 핵산의 기능성 유도체는 자연 발생적, 합성적으로 또는 재조합적으로 생성된 핵산 또는 절편을 포함하고, 본 발명의 중성 메탈로프로테아제 특징을 암호화한다. 본 발명에 따른 중성 메탈로프로테아제를 암호화하는 야생형 핵산에는 자연 발생적 대립유전자 및 당업계에 공지된 유전자 코드의 퇴행에 근거한 호모로그가 포함된다.
2 개 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서 용어 "동일한" 은 하기 서열 비교 또는 분석 알고리즘 중 하나를 사용하여 측정되는 바와 같이 최대 대응에 대해 정렬되었을 때 동일한, 2 개 서열 내의 잔기를 말한다.
용어 "최적 정렬" 은 가장 높은 % 동일성 점수를 제공하는 정렬을 말한다.
2 개의 아미노산, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 유전자 서열 (적합하게는) 과 관련된 "서열 동일성 %," "아미노산 서열 동일성 %," "유전자 서열 동일성 %," 및/또는 "핵산/폴리뉴클레오타이드 서열 동일성 %" 는, 서열이 최적으로 정렬된 경우 2 개의 서열 중 동일한 잔기의 % 를 말한다. 따라서, 80% 아미노산 서열 동일성은 2 개의 최적으로 정렬된 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 중 80% 가 동일하다는 것을 의미한다.
따라서, 2 개의 핵산 또는 폴리펩티드의 문맥에서 구 "실질적으로 동일한" 은 표준 파라미터를 사용하는 프로그램 또는 알고리즘 (예를 들어, BLAST, ALIGN, CLUSTAL) 을 사용하여 대조군 서열과 비교하여 약 70% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 75% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 바람직하게는 약 85% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 바람직하게는 약 97% 이상, 바람직하게는 약 98% 이상 및 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드를 말한다. 2 개의 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 하나의 지표는 첫번째 폴리펩티드가 두번째 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응한다는 것이다. 전형적으로는, 보존 아미노산 치환에 의해 상이한 폴리펩티드는 면역학적으로 교차 반응한다. 따라서, 폴리펩티드는 예를 들어, 2 개의 펩티드가 보존 치환에 의해서만 상이한 경우 두번째 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 2 개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또다른 지표는 2 개의 분자가 엄격한 조건 (예를 들어, 중간 ~ 높은 엄격함 범위 내) 하에서 서로 혼성화한다는 것이다.
용어 "단리된" 또는 "정제된" 은 본래 환경 (예를 들어, 자연적으로 발생되는 경우 자연 환경) 으로부터 제거된 물질을 말한다. 예를 들어, 상기 물질은 자연 발생하는 또는 야생형 개체에, 또는 자연 발생적 또는 야생형 개체로부터 발현 시 정상적으로 존재하지 않는 성분과 함께 존재하는 것보다 높은 또는 낮은 농도로 특정 조성물에 존재하는 경우, "정제된다" 라고 한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드는 단리되지 않으나, 자연계 중의 공존 물질의 일부 또는 모두로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드는 단리된다. 일부 구현예에서, 이러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나, 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있고, 또한, 이러한 벡터 또는 조성물은 자연 환경의 일부가 아닐수도 있다는 점에서 단리될 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 핵산 또는 단백질은, 예를 들어, 전기영동 젤 또는 블롯에서 본질적으로 하나의 밴드로 나타나는 경우 정제되었다고 말한다.
DNA 서열을 말할 때 사용되는 경우, 용어 "단리된" 은, 자연적인 유전 환경으로부터 제거되어 다른 외부적인 또는 원치않는 암호화 서열이 없으며, 유전공학적 단백질 생성 시스템에서 사용하기에 적합한 형태로 있는 DNA 서열을 말한다. 이러한 단리된 분자는 자연 환경으로부터 단리된 것들이고, cDNA 및 게놈 클론이 포함된다. 본 발명의 단리된 DNA 분자는 보통 관련된 기타 유전자가 없고, 프로모터 및 종결자와 같은 자연 발생적 5' 및 3' 비번역 영역이 포함될 수 있다. 관련 영역의 규명은 당업자에게 명백할 것이다 (예를 들어, Dynan and Tijan, Nature 316:774-78 [1985] 참조). 용어 "단리된 DNA 서열" 은 대안적으로는 "클로닝된 DNA 서열" 로 언급된다.
단백질을 말할 때 사용되는 경우, 용어 "단리된" 은, 고유의 환경 이외의 상태에서 발견되는 단백질을 말한다. 바람직한 형태에서, 단리된 단백질은 다른 단백질, 특히 다른 상동 단백질이 실질적으로 없다. 단리된 단백질은 SDS-PAGE 에 의해 측정된 바와 같이 약 10% 초과의 순도, 바람직하게는 약 20% 초과의 순도, 및 더욱 더 바람직하게는 약 30% 초과의 순도를 갖는다. 발명의 추가 측면은 SDS-PAGE 에 의해 측정된 바와 같이 고도로 정제된 형태 (즉, 약 40% 초과의 순도, 약 60% 초과의 순도, 약 80% 초과의 순도, 약 90% 초과의 순도, 약 95% 초과의 순도, 약 97% 초과의 순도, 및 심지어 약 99% 초과의 순도) 의 단백질을 포함한다.
하기 카세트 돌연변이 방법은 본 발명의 효소 변이체의 구축을 유용하게 하기 위해 사용될 수 있으며, 그렇더라도 다른 방법들도 사용될 수 있다. 우선, 본원에 기술된 바와 같이, 상기 효소를 암호하하는 자연 발생 아미노산을 수득하고, 이를 전체로 또는 부분적으로 서열화한다. 다음, 암호화되는 효소 내 하나 이상의 아미노산을 돌연변이화 (결실, 삽입 또는 치환) 시키기에 바람직한 지점에 대해 상기 서열을 스캐닝한다. 상기 지점의 측면에 있는 서열을 제한효소 부위의 존재에 대해 평가하며, 이 부위는 유전자의 짧은 절편을, 발현될 경우 다양한 돌연변이를 암호화할 올리고뉴클레오타이드 풀 (pool) 로 대체하는 부위이다. 상기 제한효소 부위는 유전자 분절의 대체를 유용하게 하는, 바람직하게는 단백질 유전자 내에 있는 독특한 부위이다. 그러나, 효소 유전자에서 과도하게 불필요하지 않은 임의의 통상의 제한효소 부위가 사용될 수 있으며, 단, 제한효소 부위 분해에 의해 생성되는 유전자 절편은 적절한 서열 내에서 재조립될 수 있어야 한다. 제한효소 부위가 선별된 지점에서 가까운 거리 내의 위치 (10 내지 15 개 뉴클레오타이드) 에 존재하지 않는다면, 상기 부위는 해독 프레임 또는 암호화되는 아미노산 중 어느 것도 최종 구축물 내에서 변화되지 않을 방식으로, 뉴클레오타이드를 유전자 내에서 치환함으로써 생성된다. 유전자의 서열을 목적하는 서열과 일치하도록 변화시키기 위해, 유전자를 돌연변이시키는 것은 일반적으로 공지된 방법에 따라, M13 프라이머 확장에 의해 달성된다. 적합한 측면 영역을 위치시키고 2 개의 통상의 제한효소 부위 서열에 도달하는데 필요한 변화를 평가하는 작업은 유전자 코드의 중복 (redundancy), 유전자의 제한효소 인식 부위 지도, 및 많은 수의 상이한 제한효소에 의해 일상적으로 이루어진다. 통상의 측면의 제한효소 부위가 이용가능하다면, 상기 방법이 단지, 부위를 함유하지 않는 측면 영역과 함께 있을 때만 사용될 필요가 있음을 주지한다.
일단 자연 발생 DNA 및/또는 합성 DNA 를 클로닝하면, 돌연변이될 위치의 측면에 있는 제한효소 부위는 관련 제한효소를 이용해 분해되고, 다수의 말단-상보성 올리고뉴클레오타이드 카세트가 유전자 내로 연결된다. 돌연변이는 올리고뉴클레오타이드 모두가 동일한 제한효소 부위를 갖도록 합성될 수 있기 때문에, 상기 방법에 의해 간략화되고, 제한효소 부위를 만들기 위해 어떠한 합성 링커도 필요하지 않다.
본원에 사용된 바와 같이, "~ 에 상응하는" 은 단백질 또는 펩티드 내의 열거된 위치에 있는 잔기, 또는 단백질 또는 펩티드 내 열거된 잔기에 유사한, 상동성인, 또는 동일한 잔기를 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, "상응하는 영역" 은 일반적으로 관련 단백질 또는 부모 단백질을 따라 유사한 위치를 말한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "조합 돌연변이화" 는 출발 서열의 변이체의 라이브러리가 생성되는 방법을 말한다. 상기 라이브러리에서, 변이체는 미리 정의된 일련의 돌연변이로부터 선택된 하나 또는 여러 돌연변이를 함유한다. 또한, 상기 방법은 미리 정의된 일련의 돌연변이의 일원이 아닌 랜덤 돌연변이를 도입하기 위한 수단을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법에는 본원에 참조로서 인용된, 2000 년 10 월 26 일에 출원된 미국 출원 제 09/699,250 호에 언급된 것들이 포함된다. 대안적인 구현예에서, 조합 돌연변이화 방법은 시판되는 키트 (예를 들어, QUIKCHANGE® Multisite, Stratagene, La Jolla, CA) 를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "돌연변이체의 라이브러리" 는 게놈의 대부분이 일치하나 하나 이상의 유전자의 상이한 호모로그가 포함되는 세포의 집단을 말한다. 이러한 라이브러리는 예를 들어, 향상된 특색을 갖는 유전자 또는 오페론을 규명하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "출발 유전자" 및 "부모 유전자" 는 본 발명을 사용하여 향상 및/또는 변화되는 관심있는 단백질을 암호화하는 관심있는 유전자를 말한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "다중 서열 정렬" 및 "MSA" 는 알고리즘 (예를 들어, Clustal W) 을 사용하여 정렬된 출발 서열의 복수의 호모로그 서열을 말한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "보존 서열" 및 "정준 서열 (canonical sequecne)" 은 원형적인 (archetypical) 아미노산 서열을 말하며, 관심있는 특정 단백질 또는 서열의 모든 변이체는 이것에 대해 (against) 비교된다. 상기 용어는 또한 관심있는 DNA 서열에 가장 흔히 존재하는 뉴클레오타이드를 나타내는 서열을 말한다. 유전자의 각 위치에 대해, 보존 서열은 MSA 내 상기 위치에서 가장 풍부한 아미노산을 제공한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "보존 돌연변이" 는 출발 유전자 서열 및 보존 서열의 차이를 말한다. 보존 돌연변이는 출발 유전자 서열 및 MSA 로부터 수득되는 보존 서열을 비교하여 규명된다. 일부 구현예에서, 보존 돌연변이는 출발 유전자 내에 도입되어, 보존 서열과 더욱 유사하게 된다. 보존 돌연변이에는 또한, 출발 유전자 내 아미노산의 빈도와 관련된 위치에서, 출발 유전자 내 아미노산을 MSA 에서 더욱 종종 발견되는 아미노산으로 변화시키는 아미노산 변화가 포함된다. 따라서, 용어 보존 돌연변이는 출발 유전자의 아미노산을 MSA 내 아미노산보다 더욱 풍부한 아미노산으로 대체하는 모든 단일 아미노산 변화를 포함한다.
용어 "개질된 서열" 및 "개질된 유전자"는 자연 발생적 핵산 서열의 결실, 삽입 또는 개입을 포함하는 서열을 나타내는 것으로서, 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 바람직한 구현예에서, 개질 서열의 발현 생성물은 절단된 단백질이다 (예를 들어, 개질이 서열의 결실 또는 개입인 경우). 일부 특히 바람직한 구현예에서, 절단된 단백질은 생물학적 활성을 유지한다. 대안적인 구현예에서, 개질 서열의 발현 생성물은 신장된 단백질이다 (예를 들어, 핵산 서열 내의 삽입을 포함하는 개질). 일부 구현예에서, 삽입은 절단된 단백질을 초래한다 (예를 들어, 삽입이 중지 코돈을 형성하는 경우). 따라서, 삽입은 발현 생성물로서 절단된 단백질 또는 신장된 단백질을 초래할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "돌연변이 서열" 및 "돌연변이 유전자"는 상호교환적으로 사용되고, 숙주 세포의 야생형 서열에서 발생하는 하나 이상의 코돈에서 변경이 이루어진 서열을 말한다. 돌연변이 서열의 발현 생성물은 야생형과 비교해 변경된 아미노산 서열을 갖는 단백질이다. 발현 생성물은 변경된 기능적 역량 (예를 들어, 향상된 효소적 활성) 을 가질 수 있다.
용어 "돌연변이성 프라이머" 또는 "돌연변이성 올리고뉴클레오타이드" (본원에서 상호교환적으로 사용됨) 는 주형 서열의 일부에 상응하고 그곳에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 조성물을 말한다. 돌연변이성 프라이머에 있어서, 프라이머는 주형 핵산에 정확하게 부합하지 않을 것이고, 프라이머에서의 미스매치(들)은 핵산 라이브러리 내에 원하는 돌연변이를 도입하는데 사용된다. 본원에 사용되는 바와 같은 "비-돌연변이성 프라이머" 또는 "비-돌연변이성 올리고뉴클레오타이드"는 주형 핵산에 정확하게 부합하는 올리고뉴클레오타이드 조성물을 말한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 오직 돌연변이성 프라이머만이 사용된다. 본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서, 프라이머는 하나 이상의 영역에 돌연변이성 프라이머가 포함되고, 올리고뉴클레오타이드 혼합물에 포함된 비-돌연변이성 프라이머가 또한 존재하도록 디자인된다. 돌연변이성 프라이머 중 하나 이상에 상응하는 돌연변이성 프라이머 및 비-돌연변이성 프라이머의 혼합물을 첨가하여, 다양한 조합 돌연변이 패턴이 제시된 생성 핵산 라이브러리를 제조하는 것이 가능하다. 예를 들어, 돌연변이 핵산 라이브러리의 구성원 중 일부는 특정 위치에서 그의 전구체 서열을 유지하는 반면 다른 구성원은 상기 위치에서 돌연변이되는 것이 바람직하다면, 비-돌연변이성 프라이머는 제시된 잔기에 대한 핵산 라이브러리 내 비-돌연변이 구성원의 특정 수준을 수득하는 능력을 제공한다. 본 발명의 방법은 일반적으로 길이가 10 ~ 50 개 염기인, 더욱 바람직하게는 길이가 약 15 ~ 45 개 염기인 돌연변이성 및 비-돌연변이성 올리고뉴클레오타이드를 사용한다. 그러나, 원하는 돌연변이화 결과를 수득하기 위해서는, 10 개 염기보다는 짧거나 50 개 염기보다는 긴 길이의 프라이머를 사용하는 것이 필요할 수 있다. 상응하는 돌연변이성 및 비-돌연변이성 프라이머에 있어서, 상응하는 올리고뉴클레오타이드의 길이가 동일해야할 필요는 없으나, 첨가되는 돌연변이에 상응하는 영역 중에 오버랩은 존재한다.
프라이머는 본 발명에 따른 미리 정의된 비율로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 생성 라이브러리가 특정한 특이적 돌연변이를 유의한 수준으로 가지며, 동일 또는 상이한 부위에서 상이한 돌연변이의 양이 더 적은 것이 바람직한 경우, 첨가되는 프라이머의 양을 조절하여, 목적하는 편향의 (biased) 라이브러리를 생성하는 것이 가능하다. 대안적으로는, 비-돌연변이성 프라이머를 더 적게 또는 더 많이 첨가함으로써, 상응하는 돌연변이(들)가 돌연변이 핵산 라이브러리에서 생성되는 빈도를 조정하는 것이 가능하다.
용어 "야생형 서열," 또는 "야생형 유전자" 는 숙주 세포 내 고유의 또는 자연 발생하는 서열을 말하며, 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, 야생형 서열은 단백질 공학 프로젝트의 출발점인, 관심있는 서열을 말한다. 야생형 서열은 상동 또는 이종 단백질을 암호화할 수 있다. 상동 단백질은 개입 없이 숙주 세포가 생성할 단백질이다. 이종 단백질은 개입이 없다면 숙주 세포가 생성하지 않을 단백질이다.
용어 "산화에 안정한" 은 단백분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 방법, 예를 들어 표백제 또는 산화제에 노출되거나 이와 접촉하는 동안 널리 행해지는 조건 하에서 주어진 시간에 걸쳐 특정량의 효소 활성을 유지하는 본 발명의 프로테아제를 나타낸다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 예를 들어, 적어도 1분, 3분, 5분, 8분, 12분, 16분, 20분 등의 주어진 시간에 걸쳐 표백제 또는 산화제와 접촉한 후, 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 의 단백분해 활성을 유지한다.
용어 "킬레이트제에 안정한" 은 단백분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 방법, 예를 들어 킬레이트제에 노출되거나 이와 접촉하는 동안 널리 행해지는 조건 하에서 주어진 시간에 걸쳐 특정량의 효소 활성을 유지하는 본 발명의 프로테아제를 말한다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 예를 들어, 적어도 10분, 20분, 40분, 60분, 100분 등의 주어진 시간에 걸쳐 킬레이트제와 접촉한 후, 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 의 단백분해 활성을 유지한다.
용어 "열적으로 안정한" 및 "열안정성" 은 단백분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 방법, 예를 들어 변경된 온도에 노출되는 동안 널리 행해지는 조건 하에서 주어진 시간에 걸쳐 규명된 온도에 노출 후, 특정량의 효소 활성을 유지하는 본 발명의 프로테아제를 말한다. 변경된 온도에는 증가 또는 감소된 온도가 포함된다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 예를 들어, 적어도 60분, 120분, 180분, 240분, 300분 등의 주어진 시간에 걸쳐 변경된 온도에 노출된 후, 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 의 단백분해 활성을 유지한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "화학적 안정성" 은 단백질의 활성에 악영향을 주는 화학물질에 대한, 단백질 (예를 들어, 효소) 의 안정성을 말한다. 일부 구현예에서, 상기 화학물질에는 제한 없이, 과산화수소, 과산, 음이온성 세제, 양이온성 세제, 비-이온성 세제, 봉쇄제 등이 포함된다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 화학적 안정성 수준 또는 범위에 제한되지 않거나, 또는 화학적 안정성 범위에 제한되지 않고자 한다. 특히, 용어 "세제 안정한" 및 "LAS 안정한" 은 본 발명의 단백분해, 가수분해, 세정 또는 다른 방법 동안에 널리 행해지는 조건 하에 주어진 시간에 걸쳐 세제 조성물에 노출시킨 후 특정량의 효소 활성을 유지하는 본 발명의 프로테아제를 말한다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 예를 들어, 적어도 60 분, 120 분, 180 분, 240 분, 300 분 등의 주어진 시간에 걸쳐서 조성물에 노출시킨 후 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 의 단백분해 활성을 유지한다.
산화, 킬레이트제, 열 및/또는 pH 에 안정한 프로테아제의 문맥에서 용어 "향상된 안정성" 은 다른 중성 메탈로프로테아제 및/또는 야생형 효소와 비교하여 시간에 걸쳐 보다 높은 단백분해 활성을 유지하는 것을 말한다.
산화, 킬레이트제, 열 및/또는 pH 에 안정한 프로테아제의 문맥에서 용어 "감소된 안정성" 은 다른 중성 메탈로프로테아제 및/또는 야생형 효소와 비교하여 시간에 걸쳐 보다 낮은 단백분해 활성을 유지하는 것을 말한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "세정 조성물" 에는, 달리 나타내지 않는 한, 과립 또는 분말 형태의 다목적 또는 "중질 (heavy-duty)" 세척제, 특히 세정 세제; 액체, 젤 또는 페이스트 형태의 다목적 세척제, 특히 소위 중질 액체형; 액체 미세-직물 세제; 손 식기세척제 또는 경질 (light-duty) 식기세척제, 특히 고발포형의 것; 가정 및 영업용 다양한 정제, 과립, 액체 및 헹굼 보조 유형을 포함하는 기계 식기세척제; 항균 손 세척 유형, 세정 바, 구강세척제, 의치 세정제, 차량 또는 카페트 샴푸, 욕실 세정제를 포함하는 액체 세정제 및 살균제 ; 헤어 샴푸 및 헤어 린스; 샤워 젤 및 거품 목욕제 및 금속 세정제 ; 뿐만 아니라, 세정 보조제, 예컨대 표백 첨가제 및 "오염물-막대" 또는 전처리 유형이 포함된다.
다르게 언급하지 않는 한, 모든 성분 또는 조성물 수준은 상기 성분 또는 조성물의 활성 수준에 관련된 것이며, 불순물, 예를 들어 잔류 용매 또는 부산물은 제외되는데, 이는 시판되는 공급원 중 존재할 수 있다.
효소 성분 중량은 총 활성 단백질을 기준으로 한다. 다르게 나타내지 않는 한, 모든 % 및 비율은 중량에 대해 계산된다. 다르게 나타내지 않는 한, 모든 % 및 비율은 총 조성물을 기준으로 계산된다.
용어 "세정 활성" 은 단백분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 방법 동안 널리 행해지는 조건 하에서 프로테아제에 의해 달성되는 세정 성능을 말한다. 일부 구현예에서, 세정 성능은 오염물을 표준 세정 조건에 적용한 후, 다양한 크로마토그래프, 분광광도계 또는 다른 정량 방법론에 의해 측정된 바와 같이 예를 들어 잔디, 혈액, 우유, 또는 계란 단백질과 같은 효소 민감성 오염물에 관한 다양한 세정 어세이를 적용함으로써 측정된다. 실례의 어세이에는 WO 99/34011 및 미국 특허 제 6,605,458 호 (둘 다 본원에 참조로서 삽입됨) 에 기재된 것들뿐만 아니라, 실시예에 포함된 방법들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 프로테아제의 "세정 유효량"은 특정 세정 조성물에서 원하는 수준의 효소 활성을 달성하는 본원에서 이전에 기재된 프로테아제의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자에 의해 쉽게 확인되며, 많은 요소, 예컨대 사용된 특정 프로테아제, 세정 적용, 세정 조성물의 특정 조성, 및 액체 또는 건조 (예를 들어 과립, 바) 조성물이 필요한지의 여부 등에 근거한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "세정 보조 물질" 은, 특정 유형의 바람직한 세정 조성물 및 생성물 형태 (예를 들어 액체, 과립, 분말, 바, 페이스트, 분무, 정제, 젤; 또는 발포 조성물)로부터 선택되는 임의의 액체, 고체 또는 기체 물질을 의미하고, 상기 물질은 또한 바람직하게는 조성물에 사용되는 프로테아제 효소와 융화성이다. 일부 구현예에서, 과립 조성물은 "압축" 형태이고, 다른 구현예에서, 액체 조성물은 "농축" 형태이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "저 세제 농도" 시스템에는 약 800 ppm 미만의 세제 성분이 세척수에 존재하는 세제가 포함된다. 일본 세제는 통상 약 667 ppm 의 세제 성분이 세척수에 존재하기 때문에 전형적으로 저 세제 농도 시스템으로 간주된다.
본원에 사용되는 바와 같은 "중간 세제 농도" 시스템에는 약 800 ppm 내지 약 2000 ppm 의 세제 성분이 세척수에 존재하는 세제가 포함된다. 북미 세제는 통상 대략 975 ppm 의 세제 성분이 세척수에 존재하기 때문에 일반적으로 중간 세제 농도 시스템인 것으로 간주된다. 브라질 세제는 전형적으로 대략 1500 ppm 의 세제 성분이 세척수에 존재한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "고 세제 농도" 시스템에는 약 2000 ppm 초과의 세제 성분이 세척수에 존재하는 세제가 포함된다. 유럽 세제는 대략 3000 ~ 8000 ppm 의 세제 성분이 세척수에 존재하기 때문에 일반적으로 고 세제 농도 시스템인 것으로 간주된다.
본원에 사용되는 바와 같은 "직물 세정 조성물"에는 얼룩진 직물 (예를 들어 옷감, 린넨 및 기타 텍스타일 물질)의 적심 및/또는 예비처리에 사용하기에 적합한 조성물 및 세탁 첨가 조성물을 포함하여, 손세탁 및 기계세탁 세제 조성물이 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같은 "비-직물 세정 조성물" 에는 식기세척 세제 조성물, 구강 세정 조성물, 의치 세정 조성물 및 개인 세안 조성물을 포함하나 이에 제한되지 않는 비-텍스타일 (즉, 직물) 표면 세정 조성물이 포함된다.
본원의 세정 조성물의 "압축" 형태는 밀도에 의해, 그리고 조성에 있어서 무기 충진제 염의 양에 의해 가장 잘 반영된다. 무기 충진제 염은 분말 형태의 세제 조성물이 통상적인 성분이다. 통상적인 세제 조성물에서, 충진제 염은 상당한 양으로, 전형적으로 총 조성의 17 ~ 35 중량% 로 존재한다. 반대로, 압축 조성물에서, 충진제 염은 총 조성의 15% 를 넘지 않는 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 충진제 염은 조성의 10 중량% 를 넘지 않는 양으로, 또는 더욱 바람직하게는 5 중량% 로 존재한다. 일부 구현예에서, 무기 충진제 염은 술페이트 및 클로라이드의 알칼리 및 알칼리 토금속 염으로부터 선택된다. 바람직한 충진제 염은 나트륨 설페이트이다.
도 2 는 B. 아밀로리퀘파시엔스 중성 프로테아제 (NprE) 의 자가분해 절편에 대한 아미노산 서열을 제공한다 : 절편 1 (SEQ ID NO:13); 절편 2 (SEQ ID NO: 14); 절편 3 (SEQ ID NO: 15); 절편 4 (SEQ ID NO: 16); 및 절편 5 (SEQ ID NO: 17). 자가분해 절편의 N-말단을 굵은 글씨로 두드러지게 한다. 넘버링은 성숙한 형태의 NprE 의 위치에 상응한다.
도 3 은 시트레이트 민감성에 대해 NprE 내 3 개의 위치에서의 모든 가능한 아미노산 대체를 스크리닝함으로써 수득되는 활성 데이타를 예시하는 대표도를 제공한다. 패널 A 는 위치 M138 의 활성 스크린의 데이타를 제공한다. 패널 B 는 위치 D220 의 활성 스크린의 데이타를 제공한다. 패널 C 는 위치 V190 의 활성 스크린의 데이타를 제공한다. 스크리닝은 25 mM HEPES, pH 8.0 내에서 50 mM 시트레이트의 부재 및 존재 하에 25℃ 에서 60 분 동안 수행되었다. y-눈금은 임의적이고, 야생형 단백질에 대한 증가를 나타낸다.
도 4 는 시트레이트 농도 및 인큐베이션 시간의 함수로서의 중성 프로테아제 변이체의 활성을 보여주는 그래프를 제공한다. 패널 A 는 야생형 프로테아제 (●), V190I (○), M138L (▼), D220P (Δ), M138L-D220P (■) 및 S129I-F130L-M138L-V190I-D220P (◆) 에 대해, 실온에서 60 분 후에 측정된 활성의 시트레이트 농도 의존성을 도시한다. 패널 B 는 야생형 NprE 및 변이체 S129I-F130L-M138L-V190I-D220P 에 대한 시트레이트의 효과를 보여주는 10% SDS-PAGE 분석을 도시한다. 대략 0.4 mg/ml 의 단백질을 4℃ 에서 100 분 동안 시트레이트 농도를 증가시키면서 인큐베이션하였다. 레인 1 ~ 4 는 시트레이트 (0 ~ 75 mM) 의 함수로서 야생형에 대한 자가분해 패턴을 도시하고, 레인 6 ~ 10 은 본래의 (비-자가분해된) S129I-F130L-M138L-V190I-D220P 를 보여준다. 레인 5 는 표준 분자량 마커를 나타낸다.
도 5 는 야생형 및 변이체 프로테아제의 열안정성을 보여주는 그래프를 제공한다. 패널 A 는 130 mM 시트레이트의 존재 하에 0.4 mg/ml 의 프로테아제 변이체 S1291, D220E, V190I-D220P, S129I-F130L-D220P, 및 S129I-F130L-M138L-V190I-D220P 에 대한 대표적인 열량 프로파일을 제공한다. Auto-Cap VP-DSC (MicroCal, Northampton, MA, USA) 를 사용하여 200℃/시간의 스캔 속도에서 20 ~ 90℃ 에서 데이타를 수합하였다. 나타낸 모든 데이타를 완충제 기준선에 대해 보정하였다. 완충제는 5 mM HEPES, pH 8.0 이었다. 패널 B 는 130 mM 시트레이트, pH 8.0 의 존재 하에 열적 용융점 (Tm's) 에서의 증분 증가 (incremental increase) 를 보여주는 많은 단일, 이중 및 삼중 프로테아제 변이체에 대한 막대 그래프를 제공한다.
도 6 은 야생형 NprE 및 그의 변이체의 활성 및 열안정성을 나열한 표를 제공한다.
도 7 은 본 발명의 실례의 시트레이트-안정성 NprE 변이체의 아미노산 서열을 제공한다. 패널 A 는 S129I-F130L-D220P NprE 변이체의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 18) 을 제공한다. 패널 B 는 M138L-V190I-D220P NprE 변이체의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 19) 을 제공한다. 패널 C 는 S129I-F130L-M138L-V190I-D220P NprE 변이체의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:20) 을 제공한다.
도 8 은 야생형 NprE 및 5중 NprE 변이체 (S129I-F130L-M138L-V190I-D220P) 둘 다 pH 6.5 에서 AGLA 기질에 대한 최적의 활성을 가짐을 예시하는, Kcat/Km 대 (vs) pH 의 그래프를 제공한다.
도 9 는 칼슘의 첨가가 낮고 높은 pH 둘 다에서 야생형 NprE 및 5중 NprE 변이체 (S1291-F130L-M138L-V190I-D220P) 둘 다를 안정화시킴을 예시하는, 잔여 NprE 활성 대 (vs) pH 의 그래프를 제공한다.
발명의 일반적인 설명
본 발명은 금속 킬레이터의 존재 하에 향상된 안정성을 갖는 하나 이상의 중성 메탈로프로테아제 효소를 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 중성 메탈로프로테아제는 시트레이트를 포함하는 세정 및 기타 적용에서 사용될 수 있다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 시트레이트-유도 자가분해를 견디도록 조작된 변이체 중성 메탈로프로테아제(들) 를 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다.
본원에서 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 실행은 분자 생물학, 미생물학, 및 재조합 DNA 에서 흔히 사용되는 통상의 기술을 포함하며, 이들 기술은 당업계 내에 존재한다. 상기 기술은 당업자에게 알려져 있고, 많은 교재 및 참조 문서에 기술되어 있다 (예를 들어, [Sambrook 등, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor, 1989; 및 Ausubel 등, "Current Protocols in Molecular Biology," 1987] 참조). 상기 및 하기 둘 다에서 언급되는 모든 특허, 특허 출원, 기사 및 공개물은 그 전체가 참조로서 본원에 삽입된다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당업자가 흔히 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, [Singleton and Sainsbury, Dictionoary of Microbiology and Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley and Sons, NY (1994) ; 및 Hale and Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)] 은 본 발명에서 사용되는 일반적인 사전의 많은 용어를 당업자에게 제공한다. 본원에서 기술된 것과 유사 또는 동일한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실행에서 사용되더라도, 바람직한 방법 및 물질이 본원에 기술된다. 따라서, 하기 바로 정의되는 용어는 전체로서 명세서에서 참조에 의해 더욱 완전히 기술된다.
또한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 단수 표현은 문맥에서 달리 분명하게 지시하지 않는 한, 복수를 포함한다. 수 범위는 범위를 한정하는 숫자를 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 핵산은 5' 에서 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 쓰여지고 ; 아미노산 서열은 각각 아미노에서 카르복실 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 쓰여진다. 본 발명은 기술되는 특별한 방법, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않고, 당업자에 의해 사용되는 문맥에 따라 다양할 수 있음을 이해한다.
더욱이, 본원에 제공되는 제목은 본 발명의 다양한 측면 또는 구현예를 제한하는 것이 아니고, 전체로서 명세서에서 일컬어질 수 있다. 따라서, 바로 하기에서 정의되는 용어는 전체로서 명세서에서 참조에 의해 더욱 완전히 정의된다. 그렇더라도, 본 발명의 이해를 돕고자, 많은 용어가 하기에 정의된다.
정의
본원에 다르게 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자에게 통상 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 본원에 기재된다. 따라서, 바로 하기에서 정의되는 용어는 전체로서 명세서를 참조로 더욱 상세히 기재된다. 또한, 본원에 사용되는 바와 같이, 단수형에는 문맥이 명확하게 다르게 지시하지 않는 한 복수형 참조가 포함된다. 다르게 지시되지 않는다면, 핵산은 5' 에서 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 표기하며; 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 각각 표기한다. 본 발명은 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약이 당업자에 의해 사용되는 문맥에 따라 다양할 수 있기 때문에 이에 제한되지 않는 것으로 이해된다.
본 명세서를 통틀어서 주어지는 모든 최대 수치 한계는 모든 더 낮은 수치 한계를 포함하고, 상기 더 낮은 수치 한계는 본원에서 표현되어 쓰여진 것으로 생각된다. 본 명세서를 통틀어서 주어지는 모든 최소 수치 한계는 모든 더 높은 수치 한계를 포함할 것이고, 상기 더 높은 수치 한계는 본원에서 표현되어 쓰여진 것으로 생각된다. 본 명세서를 통틀어서 주어지는 모든 수치 범위는 그러한 더 광범위한 수치 범위 내에 속하는 모든 더 좁은 수치 범위를 포함할 것이고, 상기 더 좁은 수치 범위는 모두 본원에서 표현되어 쓰여진 것으로 생각된다.
언급된 모든 문서는 상대적으로, 참조로서 본원에 삽입되어 있으며 ; 임의의 문서의 언급은 본 발명에 대해 선행 기술임을 허락받은 것으로서 해석되는 것은 아니다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "프로테아제," 및 "단백분해 활성" 은 펩타이드, 또는 펩타이드 연결을 갖는 기질을 가수분해하는 능력을 나타내는 단백질 또는 펩타이드를 말한다. 많은 잘 공지된 절차가 단백분해 활성의 측정을 위해 존재한다 (Kalisz, "Microbial Proteinase," In: Fiechter (ed.), Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, [1988] 참조). 예를 들어, 단백분해 활성은 통상의 기질을 가수분해하는 각각의 프로테아제의 능력을 분석하는 비교 어세이에 의해 확인될 수 있다. 프로테아제 또는 단백분해 활성의 분석에 유용한 실례의 기질에는, 디-메틸 카제인 (Sigma C-9801), 소 콜라겐 (Sigma C-9879), 소 엘라스틴 (Sigma E-1625), 및 소 케라틴 (ICN Biomedical 902111) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 기질을 사용하는 비색 어세이는 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, WO 99/34011 호; 및 미국 특허 번호 제 6,376,450 호 참조, 둘 다 본원에 참조로서 인용됨). pNA 어세이 (예를 들어, Del Mar 등, Anal. Biochem., 99:316-320 [1979] 참조) 가 또한 구배 용출 동안 수합된 분획에 대한 활성 효소 농도를 측정하는데 사용될 수 있다. 상기 어세이는 효소가 용해성 합성 기질인 숙시닐-알라닌-알라닌-프롤린-페닐알라닌-p-니트로아닐리드 (sAAPF-pNA) 를 가수분해함에 따라 p-니트로아닐린이 방출되는 속도를 측정한다. 가수분해 반응으로 인한 황색조의 생성 속도는 분광광도계 상에서 410 nm 에서 측정되고, 활성 효소 농도에 비례한다. 또한, 280 nm 에서의 흡광도 측정을 사용하여, 총 단백질 농도를 측정할 수 있다. 활성 효소/총-단백질 비율은 효소 순도를 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "NprE 프로테아제," 및 "NprE" 는 본원에 기술된 중성 메탈로프로테아제를 말한다. 일부 바람직한 구현예에서, NprE 프로테아제는 예를 들어, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스로부터 수득되는 정제된 MULTIFECT® Neutral 또는 PMN 으로서 지정되는 프로테아제이다. 따라서, 일부 구현예에서, 용어 "PMN 프로테아제" 는 SEQ ID NO:3 에서 제공되는 바와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스로부터 유도되는 자연 발생 성숙 프로테아제를 말한다. 대안의 구현예에서, 본 발명은 NprE 프로테아제의 일부를 제공한다.
용어 "바실러스 프로테아제 호모로그 (homologue)" 는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 유래의 성숙 프로테아제와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 자연 발생 프로테아제, 또는 상기 자연 발생 프로테아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 말하고, 상기 프로테아제는 이러한 핵산에 의해 암호화되는 중성 메탈로프로테아의 기능적인 특징을 보유한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "NprE 변이체," 및 "NprE 프로테아제 변이체" 는 야생형 NprE 와 특히 그의 기능 면에서는 유사하나, 그의 아미노산 서열에 돌연변이가 있어서 야생형 프로테아제와 서열 면에서 상이하게 되는 프로테아제를 말할 때 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "바실러스 종 (Bacillus ssp.)" 은 "바실러스" 속 내의 모든 종을 말하며, 이는 바실래아세애 과 (Family Bacillaceae), 바실래알레스 목 (Order Bacillales), 바실리 강 (Class Bacilli) 의 일원으로서 부류되는 그람-양성 박테리아이다. "바실러스 (Bacillus)" 속에는 B. 서브틸리스 (B. subtilis), B. 리체니포르미스 (B. licheniformis), B. 렌투스 (B. lentus), B. 브레비스 (B. brevis), B. 스테아로테르모필루스 (B. stearothermophilus), B. 알칼로필루스 (B. alkalophilus), B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens), B. 클라우시 (B. clausii), B. 할로두란스 (B. halodurans), B. 메가테리움 (B. megaterium), B. 코아굴란스 (B. coagulans), B. 서큘란스 (B. circulans), B. 라우투스 (B. lautus), 및 B. 투린지엔시스 (B. thuringiensis) 가 포함되나 이에 제한되지 않는, 당업자에게 공지된 바와 같은 "바실러스 (Bacillus)" 속 내의 모든 종이 포함된다. 바실러스 (Bacillus) 속에 대한 지속적인 분류학적 개편이 있다는 것으로 인지된다. 따라서, 상기 속에는 현재 "제오바실러스 스테아로테르모필루스 (Geobacillus stearothermophilus)" 라고 불리는 B. 스테아로테르모필루스 (B. stearothermophilus) 와 같은 개체를 포함하나 이에 제한되지 않는, 재분류된 종이 포함되는 것으로 인지된다. 산소의 존재 하에서의 내성 내생포자의 생성은, 상기 특징이 또한 최근에 명명된 알리시클로바실러스 (Alicyclobacillus), 암피바실러스 (Amphibacillus), 아네우리니바실러스 (Aneurinibacillus), 아녹시바실러스 (Anoxybacillus), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 필로바실러스 (Filobacillus), 그라실리바실러스 (Gracilibacillus), 할로바실러스 (Halobacillus), 파에니바실러스 (Paenibacillus), 살리바실러스 (Salibacillus), 테르모바실러스 (Thermobacillus), 우레이바실러스 (Ureibacillus), 및 비르지바실러스 (Virgibacillus) 에 적용됨에도 불구하고, 바실러스 (Bacillus) 속의 한정적인 특징인 것으로 간주된다.
관련 (및 유도체) 단백질은 "변이체 단백질" 을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 변이체 단백질은 소수의 아미노산 잔기에 의해 부모 (parent) 단백질과 그리고 서로 상이하다. 차이가 나는 아미노산 잔기의 수는 하나 이상, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 개 이상의 아미노산 잔기일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 변이체 간의 상이한 아미노산의 수는 1 내지 10 이다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 관련 단백질 및 특히 변이체 단백질은 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%. 95%, 97%, 98%, 또는 99% 의 아미노산 서열 동일성을 포함한다. 추가로, 본원에 사용된 바와 같이 관련 단백질 또는 변이체 단백질은 중요한 영역의 수 내의 부모 단백질 또는 또다른 관련 단백질과 상이한 단백질을 말한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 변이체 단백질은 부모 단백질과 상이한 상응하는 중요 영역을 1, 2, 3, 4, 5, 또는 10 개 갖는다.
본 발명의 효소의 변이체를 생성하는데 적합한 다수의 방법이 당업계에 알려져 있으며, 이에는 부위-포화 돌연변이, 스캐닝 돌연변이, 삽입 돌연변이, 랜덤 돌연변이, 부위-특이적 돌연변이, 및 특이적-진화, 뿐만 아니라 다양한 기타 재조합 접근법이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
야생형 및 돌연변이 단백질의 특징화는 임의의 수단 또는 적합한 "테스트" 를 통해 수행되고, 바람직하게는 흥미있는 특성의 평가를 바탕으로 한다. 예를 들어, pH 및/또는 온도, 뿐만 아니라 세제 및/또는 산화 안정성은 본 발명의 일부 구현예에서 측정된다. 실제로, 이들 특징 중 하나 이상에서 다양한 정도의 안정성 (pH, 온도, 단백분해 안정성, 세제 안정성, 및/또는 산화 안정성) 을 갖는 메탈로프로테아제 효소가 사용될 것으로 고려된다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산" 은 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태 (리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드) 를 말한다. 상기 용어에는 단일-, 이중- 또는 삼중-가닥 DNA, 게놈 DNA, cDNA, RNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기, 또는 기타 자연, 화학적으로, 생화학적으로 개질된 비-자연 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 하기는 폴리뉴클레오타이드의 비-제한적인 예이다 : 유전자, 유전자 절편, 염색체 절편, EST, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 개질된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체, 우라실, 다른 당 및 연결기, 예컨대 플루오로리보오스 및 티오에이트, 및 뉴클레오타이드 분지를 포함한다. 대안적인 구현예에서, 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 방해된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "DNA 구축물" 및 "형질전환 DNA" 는 숙주 세포 또는 개체에 서열을 도입하는데 사용되는 DNA 를 말하는 것으로서, 상호교환적으로 사용된다. DNA 는 시험관 내에서 PCT, 또는 당업자에게 공지된 다른 적합한 기술(들) 에 의해 생성될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, DNA 구축물은 관심있는 서열 (예를 들어, 유입 (incoming) 서열) 을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열은 조절 구성원 (예를 들어, 프로모터 등) 과 같은 추가의 구성원에 조작적으로 연결된다. DNA 구축물은 선별 마커를 추가로 포함할 수 있다. 이는 상동성 박스 옆에 유입 서열을 추가로 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 형질전환 DNA 는 말단에 첨가되는 다른 비상동성 서열을 포함한다 (예를 들어, 스터퍼 (stuffer) 서열 또는 측면 (flank)). 일부 구현예에서, 유입 서열의 말단은 형질전환 DNA 가 닫힌 고리를 형성하도록 밀접해 있다. 형질전환 서열은 야생형, 돌연변이 또는 개질될 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 구축물은 숙주 세포 염색체에 상동인 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, DNA 구축물은 비-상동성 서열을 포함한다. 일단 DNA 구축물이 시험관 내에서 조립되면, 이는 하기를 위해 사용될 수 있다 : 1) 숙주 세포의 목적하는 표적 서열에 이종성 서열을 삽입함 ; 및/또는 2) 숙주 세포 염색체의 영역을 돌연변이시킴 (즉, 내인성 서열을 이종성 서열로 대체함), 및/또는 3) 표적 유전자를 결실시킴 ; 및/또는 숙주에 복제 플라스미드를 도입함.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "발현 카세트" 및 "발현 벡터" 는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특정 핵산 구성원이 있는 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 핵산 구축물을 말한다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스, 또는 핵산 절편에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부위는 다른 서열 중에서도, 전사될 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 발현 벡터는 숙주 세포에서 이종성 DNA 절편을 혼입 및 발현하는 능력을 갖는다. 많은 원핵 및 진핵 발현 벡터가 시판된다. 적절한 발현 벡터의 선택은 당업자의 지식으로 가능하다. 용어 "발현 카세트" 는 본원에서 "DNA 구축물" 및 그의 문법적인 상응물과 상호교환적으로 사용된다. 적절한 발현 벡터의 선택은 당업자의 지식으로 가능하다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터" 는 하나 이상의 세포 유형에 핵산을 도입하도록 디자인된 폴리뉴클레오타이드 구축물을 말한다. 벡터에는 클로닝 벡터, 발현 벡터, 셔틀 벡터, 플라스미드, 카세트 등이 포함된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 구축물은 프로테아제 (예를 들어, 전구체 또는 성숙 프로테아제) 를 암호화하는 DNA 서열을 포함하며, 이 서열은 적합한 숙주에서 DNA 의 발현에 영향을 줄 수 있는 적합한 전구서열 (예를 들어, 분비 서열 등) 에 조작적으로 연결되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "플라스미드" 는 클로닝 벡터로서 사용되는 환형의 이중-가닥 (ds) DNA 구축물을 말하며, 이는 일부 진핵세포 또는 원핵세포에서 염색체외 자가복제성 유전적 구성원을 형성하거나, 또는 숙주 염색체에 함입된다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산 서열을 세포에 도입하는 맥락에서, 용어 "도입된" 은 핵선 서열을 세포에 이동시키기에 적합한 방법을 말한다. 상기 도입 방법에는 원형질 융합, 형질감염, 형질전환, 접합, 및 유전자도입이 포함되나 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, Ferrari 등, "Genetics, " in Hardwood 등, (eds.), Bacillus, Plenum Publishing Corp., pages 57-72 [1989] 참조).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "형질전환된" 및 "안정하게 형질전환된" 은 본래의 것이 아닌 (이종성) 폴리뉴클레오타이드 서열이 세포의 게놈에 함입되거나, 또는 2 개 이상의 세대 동안 유지되는 에피좀 플라스미드로서의 세포를 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "선별 마커-암호화 뉴클레오타이드 서열" 은 숙주 세포에서 발현할 수 있는 뉴클레오타이드 서열로서, 여기서, 선별 마커의 발현은 상응하는 선별제의 존재 시 또는 필수 영양소의 결여 시에 성장하는 능력을, 발현된 유전자를 함유하는 세포에 부여한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "선별 마커" 및 "선별성 마커" 는 벡터를 함유하는 숙주를 쉽게 선별할 수 있게 하는, 숙주 세포에서 발현할 수 있는 핵산 (예를 들어, 유전자) 을 말한다. 상기 선별 마커의 예에는 항생제가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 용어 "선별 마커" 는 숙주 세포가 관심있는 유입 DNA 를 취하였거나 또는 일부 다른 반응이 발생하였다는 지시를 제공하는 유전자를 말한다. 전형적으로, 선별 마커는 외인성 DNA 를 함유하는 세포를 형질전환 동안에 임의의 외인성 서열을 받지 못한 세포와 구별할 수 있도록, 숙주 세포에 대사성 이점 또는 항생제 내성을 부여하는 유전자이다. "상주 (residing) 선별 마커" 는 형질전환되는 미생물의 염색체 상에 위치하는 마커이다. 상주 선별 마커는 형질전환 DNA 구축물 상의 선별 마커와 상이한 유전자를 암호화한다. 선별성 마커는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 상기 지시한 바와 같이, 바람직하게는 마커는 항생제 내성 마커이다 (예를 들어, ampR; phleoR; specR; kanR; eryR; tetR; cmpR; 및 neoR (예를 들어, Guerot-Fleury, Gene, 167:335-337 [1995); Palmeros 등, Gene 247:255-264 [2000]; 및 Trieu-Cuot 등, Gene, 23:331-341, [1983] 참조). 본 발명에 따라 유용한 다른 마커에는 트립토판과 같은 영양요구성 마커 ; 및 β-갈락토시다아제와 같은 검출 마커가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터" 는 하류 유전자의 전사를 지도하는 기능을 하는 핵산 서열을 말한다. 바람직한 구현예에서, 프로모터는 표적 유전자가 발현되는 숙주 세포에 적절하다. 다른 전사 및 번역 조절 핵산 서열 ("조절 서열" 이라고도 함) 과 함께 프로모터는 해당 유전자의 발현에 필요하다. 일반적으로, 전사 및 번역 조절 서열에는 프로모터 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 개시 및 정지 서열, 번역 개시 및 정지 서열, 및 인핸서 또는 활성화 서열이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적 관계를 맺도록 위치되는 경우 "조작적으로 연결된다". 예를 들어, 분비 리더 (즉, 신호 펩타이드) 를 암호화하는 DNA 는 그것이 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 프리단백질 (preprotein) 로서 발현된다면 폴리펩타이드에 대한 DNA 에 조작적으로 연결되며 ; 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 미친다면 암호화 서열에 조작적으로 연결되거나 ; 또는 리보좀 결합 부위는 그것이 번역을 용이하게 하도록 위치된다면 암호화 서열에 조작적으로 연결된다. 일반적으로, "조작적으로 연결된" 은 연결되는 DNA 서열이 인접해 있고, 분비 리더의 경우, 인접해 있고 해독 기 (reading phase) 에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접해 있을 필요가 없다. 연결은 통상의 제한효소 부위에서의 결합에 의해 이루어진다. 상기 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커가 통상의 실행에 따라 사용된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자" 는 폴리펩타이드를 암호화하고, 암호화 영역 전 후 영역뿐만 아니라, 개별 암호화 분절 (엑손) 사이의 개입 서열 (인트론) 영역을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, DNA 분절) 를 말한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "상동 유전자" 는 상이하지만 일반적으로는 연관된 종으로부터 비롯된 유전자 쌍을 말하며, 상기 상동 유전자는 서로에게 상응하며 서로 동일하거나 또는 매우 유사하다. 상기 용어는 종분화 (즉, 신규 종의 개발) 에 의해 분리된 유전자 (예를 들어, 오르토로그 (orthologous) 유전자), 뿐만 아니라 유전적 복제에 의해 분리된 유전자 (예를 들어, 파라로그 (paralogous) 유전자) 를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "오르토로그" 및 "오르토로그 유전자" 는 종분화에 의해 공통의 조상 유전자 (즉, 상동 유전자) 로부터 진화한 상이한 종의 유전자를 말한다. 전형적으로, 오르토로그는 진화 과정 동안에 동일한 기능을 유지한다. 오르토로그의 규명은 새로 서열화된 게놈에서 유전자 기능을 신뢰할만하게 예측하는데 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "파라로그" 및 "파라로그 유전자" 는 게놈 내에서의 복제 (duplication) 에 의해 관계되는 유전자를 말한다. 오르토로그는 진화 과정 동안에 동일한 기능을 유지하는 한편, 파라로그는 일부 기능이 본래의 것과 종종 관련있더라도 새로운 기능을 진화시킨다. 파라로그 유전자의 예에는, 모두 세린 단백분해효소이고 동일 종에서 함께 발생하는 트립신, 키모트립신, 엘라스타제, 및 트롬빈을 암호화하는 유전자가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이, "상동성" 은 서열 유사성 또는 동일성을 말하며, 동일성이 바람직하다. 상기 상동성은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 측정된다 (예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; 프로그램, 예컨대 GAP, BESTFlT, FASTA, 및 TFASTA {Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, WI)}; 및 Devereux 등, Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984] 참조).
본원에 사용되는 바와 같이, "유사 서열" 은 유전자의 기능이 B. 아밀로리퀘파시엔스 NprE 프로테아제를 바탕으로 한 유전자와 본질적으로 동일한 서열이다. 추가로, 유사 유전자는 B. 아밀로리퀘파시엔스 NprE 프로테아제의 서열과 적어도 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 의 서열 동일성을 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 특성 중 하나 초과가 서열에 적용된다. 유사 서열은 공지된 서열 정렬 방법에 의해 측정된다. 통상 사용되는 정렬 방법은 BLAST 이나, 상기 및 하기에 나타나 있듯이, 서열 정렬에 사용될 수 있는 다른 방법도 있다.
유용한 알고리즘의 한 예는 PILEUP 이다. PILEUP 는 점진, 2쌍 정렬을 사용하는 관련 서열의 군으로부터의 다중 서열 정렬을 만든다. 이는 정렬을 만드는데 사용되는 클러스터링 관계 (clustering relationship) 를 보여주는 나무 (tree) 를 그릴 수 있다. PILEUP 는 Feng 및 Doolittle 의 점진 정렬 방법의 단일화 (simplification) 를 사용한다 (Feng and Doolittle, J. Mol. Evol., 35:351-360 [1987]). 상기 방법은 Higgins 및 Sharp 에 의해 기술된 방법과 유사하다 (Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153 [1989]). 유용한 PILEUP 파라미터는 3.00 의 디폴트 갭 가중치 (weight), 0.10 의 디폴트 갭 길이 가중치, 및 가중치 엔드 갭을 포함한다.
유용한 알고리즘의 또다른 예는 Altschul 등에 의해 기술된 BLAST 알고리즘이다 (Altschul 등, J. Mol. Biol., 215:403-410 [1990]; 및 Karlin 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:5873-5787 [1993)). 특히 유용한 BLAST 프로그램은 WU-BLAST-2 프로그램이다 (Altschul 등, Meth. Enzymol., 266:460-480 [1996] 참조). WU-BLAST-2 는 다수의 검색 파라미터를 사용하는데, 이의 대부분은 디폴트 값에 맞춰진다. 조정가능한 파라미터는 하기 값을 사용해 맞춰진다 : 오버랩 스팬 (overlap span) = 1, 오버랩 프랙션 (overlap fraction) = 0.125, 워드 역치 (word threshold) (T) = 11. HSP S 및 HSP S2 파라미터는 동적 값 (dynamic 값) 이고, 관심있는 서열이 검색되는 특정 데이타베이스의 조성 및 특정 서열의 조성에 의존하여 프로그램 자체에 의해 구축된다. 그러나, 상기 값은 민감도를 증가시키도록 조정될 수 있다. 아미노산 서열 동일성 값 % 는 매칭하는 동일한 잔기의 수를 정렬된 영역 내 "더 긴" 서열의 잔기의 총 수로 나누어서 측정된다. "더 긴" 서열은 정렬된 영역에서 가장 실제적인 잔기를 갖는 서열이다 (정렬 스코어를 최대화하기 위해 WU-Blast-2 에 의해 도입된 갭은 무시함).
따라서, "핵산 서열 동일성 %" 는 출발 서열 (즉, 관심있는 서열) 의 뉴클레오타이드 잔기와 동일한 후보 서열 내 뉴클레오타이드 잔기의 % 로서 정의된다. 바람직한 방법은 WU-BLAST-2 의 BLASTN 모듈을 디폴트 파라미터에 맞추는데 사용되고, 오버랩 스팬 및 오버랩 프랙션은 각각 1 및 0.125 로 맞추어진다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "혼성화" 는 당업계에 공지된 바와 같이, 핵산 중 한 가닥이 염기쌍을 통해 상보성 가닥과 결합하는 방법을 말한다.
핵산 서열과 대조군 핵산 서열이 중간 내지 높은 엄격한 혼성화 및 세정 조건 하에 서로 특이적으로 혼성된다면, 핵산 서열은 대조군 핵산 서열에 "선택적으로 혼성화가능한" 것으로 간주된다. 혼성화 조건은 핵산 결합 복합체 또는 프로브의 용융 온도 (Tm) 를 바탕으로 한다. 예를 들어, "최대의 엄격성" 은 전형적으로 약 Tm - 5℃ (프로브의 Tm 보다 5℃ 낮음) 에서 발생하고 ; "높은 엄격성" 은 Tm 보다 약 5 ~ 10℃ 낮은 온도에서 발생하고 ; "중간 정도의 엄격성" 은 프로브의 Tm 보다 약 10 ~ 20℃ 낮은 온도에서 발생하고 ; "낮은 엄격성" 은 Tm 보다 약 20 ~ 25℃ 낮은 온도에서 발생한다. 기능적으로, 혼성화 프로브를 사용해 엄격한 동일성 또는 거의 엄격한 동일성을 갖는 서열을 규명하기 위해서는 최대의 엄격한 조건이 사용될 수 있으며 ; 한편, 중간 또는 낮은 엄격한 혼성화는 폴리뉴클레오타이드 서열 호모로그 (homolog) 를 규명 또는 검출하는데 사용될 수 있다.
중간 및 높은 엄격한 혼성화 조건은 당업계에 잘 공지되어 있다. 높은 엄격한 조건의 예는 50% 포름아마이드, 5X SSC, 5X Denhardt 용액, 0.5% SDS 및 100 μg/ml 변성된 운반체 DNA 내, 약 42℃ 에서 혼성화하고, 이어서 2X SSC 및 0.5% SDS 내, 실온에서 2 회 세정하고, 0.1X SSC 및 0.5% SDS 내, 42℃ 에서 추가로 2 회 세정하는 것을 포함한다. 중간 정도의 엄격한 조건의 예는 20% 포름아마이드, 5X SSC (15O mM NaCl, 15 mM 트리나트륨 시트레이트), 50 mM 나트륨 포스페이트 (pH 7.6), 5X Denhardt 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml 변성된 쉐어드 연어 정자 DNA (denatured sheared salmon sperm DNA) 를 포함하는 용액 내, 37℃ 에서 밤새 인큐베이션하고, 이어서 약 37 ~ 50℃, 1X SSC 에서 필터를 세정하는 것을 포함한다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 요소를 조절하는데 필요한 온도, 이온 세기 등을 조정하는 방법을 알고 있다.
본원에 사용되는 바와 같은, "재조합" 은 이종 핵산 서열의 도입에 의해 개질된 세포 또는 벡터, 또는 그렇게 해서 개질된 세포로부터 유래된 세포를 말하는 것을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 본래의 (비-재조합) 형태 내에서 동일한 형태로 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 또는 고의적인 인간 개입의 결과로서 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는, 즉, 다르게 비정상적으로 발현되는 본래의 유전자를 발현한다. "재조합," "재조합화," 및 "재조합된" 핵산의 발생은 일반적으로 2 개 이상의 핵산 절편의 어셈블리로서, 이러한 어셈블리는 키메라 유전자를 산출한다.
바람직한 구현예에서, 돌연변이체 DNA 서열은 하나 이상의 코돈에서의 부위 포화 돌연변이화로 발생된다. 또다른 바람직한 구현예에서, 부위 포화 돌연변이화는 2 개 이상의 코돈에 대해 수행된다. 추가의 구현예에서, 돌연변이체 DNA 서열은 야생형 서열과 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과, 또는 약 98% 초과의 상동성을 갖는다. 대안적인 구현예에서, 돌연변이체 DNA 는 임의의 공지된 돌연변이화 과정 예컨대, 방사선조사, 니트로소구아니딘 등을 사용하여 생체 내에서 발생된다. 다음, 목적하는 DNA 서열을 단리하고 본원에 제공된 방법에 사용한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표적 서열" 은 유입 서열을 숙주 세포 게놈에 삽입하는 것이 바람직한 경우, 서열을 암호화하는 숙주 세포 내 DNA 서열을 말한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 기능성 야생형 유전자 또는 오페론을 암호화하는 한편, 다른 구현예에서, 표적 서열은 기능성 돌연변이 유전자 또는 오페론, 또는 비-기능성 유전자 또는 오페론을 암호화한다.
본원에 사용된 바와 같이, "측면 서열 (flanking sequence)" 은 논의되는 서열의 상류 또는 하류에 있는 임의의 서열을 말한다 (예를 들어, 유전자 A-B-C 에 대해서, 유전자 B 는 A 및 C 유전자 서열의 측면에 있음). 바람직한 구현예에서, 유입 서열은 각 면 상에 있는 상동성 박스의 측면에 있다. 또다른 구현예에서, 유입 서열 및 상동성 박스는 각 면 상의 스터퍼 서열의 측면에 있는 단위 (unit) 를 포함한다. 일부 구현예에서, 측면 서열은 단지 단일 면 (3' 또는 5') 상에만 존재하나, 바람직한 구현예에서, 상기 서열은 측면에 있는 서열의 각 면 상에 존재한다. 일부 구현예에서, 측면 서열은 단지 단일 면 (3' 또는 5') 상에만 존재하나, 한편, 바람직한 구현예에서, 상기 서열은 측면에 있는 서열의 각 면 상에 존재한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "스터퍼 서열" 은 상동성 박스의 측면에 있는 임의의 외부 DNA (전형적으로 벡터 서열) 를 말한다. 그러나, 상기 용어는 임의의 비상동성 DNA 서열을 포함한다. 이론에 제한되지 않으면서, 스터퍼 서열은 세포가 DNA 취득을 개시하도록, 중요하지 않은 표적을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증폭" 및 "유전자 증폭" 은, 증폭된 유전자가 게놈에 처음에 존재하던 것보다 더 높은 복사수로 존재하게 되는 식으로 특정 DNA 서열이 과잉 복제되는 방법을 말한다. 일부 구현예에서, 약물 (예를 들어, 억제가능 효소의 억제자) 의 존재 하에서의 성장에 의한 세포의 선별은, 상기 약물의 존재 하의 성장에 필요한 유전자 생성물을 암호화하는 내인성 유전자의 증폭, 또는 상기 유전자 생성물을 암호화하는 외인성 (즉, 투입됨) 서열의 증폭, 또는 둘 다를 초래한다.
"증폭" 은 주형 특이성과 관련된 핵산 복제의 특별한 경우이다. 이것은 비-특이적 주형 복제 (즉, 주형-의존적이나 특이적 주형에는 의존하지 않는 복제) 와는 대조적인 것이다. 여기서 주형 특이성은 복제 충성도 (즉, 적합한 폴리뉴클레오타이드 서열의 합성) 및 뉴클레오타이드 (리보- 또는 데옥시리보-) 특이성과는 구별된다. 주형 특이성은 종종 "표적" 특이성과 관련되어 기술된다. 표적 서열은 다른 핵산으로부터 색출된다는 점에서 "표적" 이다. 증폭 기술은 이러한 색출을 위해 일차적으로 고안되었다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "공동-증폭" 은 다른 유전자 서열과 함께 증폭가능 마커를 단일 세포 내로 도입하는 것 (즉, 발현 벡터 내에 함유된 유전자들과 같은 하나 이상의 비-선별적 유전자를 포함함), 및 적절한 선택적 압력을 적용하는 것을 말하며, 세포는 증폭가능 마커 및 기타, 비-선별적 유전자 서열 모두를 증폭시킨다. 증폭가능 마커는 다른 유전자 서열에 물리적으로 연결될 수 있거나 대안적으로는 하나는 증폭가능 마커를 함유하고 다른 하나는 비-선별적 마커를 함유하는 2 개의 분리된 DNA 조각이 동일 세포 내에 도입될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증폭가능 마커," "증폭가능 유전자" 및 "증폭 벡터" 는 적합한 성장 조건 하에서 유전자의 증폭을 가능하게 하는 유전자를 암호화하는 유전자 또는 벡터를 말한다.
"주형 특이성" 은 대부분 효소 선택에 의한 증폭 기술로 달성된다. 증폭 효소는 사용되는 조건 하에서 핵산의 불균질 혼합물 중 오직 특정 핵산 서열만을 처리할 효소이다. 예를 들어, Qβ 복제효소의 경우, MDV-1 RNA 가 복제효소에 대한 특이적 주형이고 (예를 들어, Kacian 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:3038 [1972] 참조), 다른 핵산은 상기 증폭 효소에 의해 복제되지 않는다. 유사하게, T7 RNA 중합효소의 경우, 상기 증폭 효소는 그 자신의 프로모터에 대해 엄격한 특이성을 갖는다 (Chamberlin 등, Nature 228:227 [1970] 참조). T4 DNA 리가아제의 경우, 상기 효소는 연결 접합점에서 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 기질과 주형 사이에 미스매치가 있는 경우, 2 개의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 연결하지 않을 것이다 (Wu and Wallace, Genomics 4:560 [1989] 참조). 마지막으로, Taq 및 Pfu 중합효소는 고온에서 작용하는 그들의 능력에 비추어, 결합된 서열에 대해 높은 특이성을 나타내는 것으로 발견되므로, 프라이머에 의해 정의되며; 고온은 표적 서열과의 프라이머 혼성화를 선호하고 비-표적 서열과의 혼성화를 선호하지 않는 열역학적 상태를 초래한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증폭가능 핵산" 은 임의의 증폭 방법에 의해 증폭될 수 있는 핵산을 말한다. "증폭가능 핵산" 은 통상 "샘플 주형" 을 포함할 것으로 생각된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "샘플 주형" 은 "표적" (하기 정의됨) 의 존재를 분석하는 샘플로부터 기원하는 핵산을 말한다. 대조적으로, "배경 주형" 은 샘플에 존재할 수 있거나 존재할 수 없는, 샘플 주형 이외의 핵산을 말할 때 사용된다. 배경 주형은 대부분 종종 부주의에 의한 것이다. 이것은 잔류 결과일 수 있거나, 샘플로부터 정제해서 제거되어야 할 핵산 오염물의 존재로 인한 것일 수 있다. 예를 들어, 검출되는 것 이외의, 개체에서 가져온 핵산은 테스트 샘플에서 배경으로서 존재할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프라이머" 는 정제된 제한 분해물과 같이 자연 발생하거나 또는 합성적으로 생성되든지 간에, 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 확장 생성물의 합성이 유도되는 조건하에 놓인 경우 (즉, 뉴클레오타이드 및 DNA 중합효소와 같은 유도제의 존재 하에서 및 적합한 온도 및 pH 에서) 합성 개시점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 말한다. 프라이머는 증폭시 최대 효율을 위해 바람직하게는 단일 가닥이지만, 대안적으로는 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥인 경우, 프라이머는 먼저 가닥을 분리시키기 위해 처리된 후, 확장 생성물을 생성하는데 사용된다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드이다. 프라이머는 유도제의 존재 하에서 확장 생성물의 합성을 시작할 정도로 충분히 길어야만 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머의 공급원 및 방법의 용도를 포함하는 많은 요소에 따라 다를 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로브" 는 정제된 제한 분해물과 같이 자연 발생하거나 또는 합성적으로, 재조합적으로 또는 PCR 증폭에 의해 생성되든지간에, 또다른 관심있는 올리고뉴클레오타이드에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 (즉, 뉴클레오타이드 서열) 를 말한다. 프로브는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 프로브는 특정 유전자 서열의 검출, 규명 및 단리에 유용하다. 본 발명에서 사용되는 임의의 프로브는 효소 (예를 들어, ELISA 뿐만 아니라, 효소-기반 면역화학적 어세이), 형광, 방사능 및 발광 시스템을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 검출 시스템에서 검출가능하도록, 임의의 "리포터 분자" 로 표지될 것으로 고려된다. 본 발명은 임의의 특정 검출 시스템 또는 표지에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 중합효소 연쇄 반응과 관련하여 사용되는 경우 용어 "표적" 은 중합효소 연쇄 반응에 사용되는 프라이머에 의해 결합된 핵산 영역을 말한다. 따라서, "표적" 은 다른 핵산 서열로부터 색출된다. "분절" 은 표적 서열 내의 핵산 영역으로서 정의된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "중합효소 연쇄 반응" ("PCR") 은 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제 4,683,195 호, 제 4,683,202 호 및 제 4,965,188 호의 방법을 말하고, 이에는 클로닝 또는 정제 없이, 게놈 DNA 혼합물 내의 표적 서열의 분절의 농도를 증가시키기 위한 방법이 포함된다. 이러한 표적 서열 증폭 방법은 목적하는 표적 서열을 함유하는 DNA 혼합물에 2 개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 과량으로 도입하고, 이어서 DNA 중합효소의 존재 하에 열 주기 (thermal cycling) 를 정확한 순서로 수행하는 것으로 이루어진다. 2 개의 프라이머는 이중 가닥 표적 서열 중 그의 각각의 가닥에 상보적이다. 증폭을 위해, 혼합물을 변성시키고, 그런 다음, 프라이머를 표적 분자 내 그의 상보성 서열에 어닐링시킨다. 어닐링한 후, 중합효소를 사용해 프라이머를 확장시켜서, 상보성 가닥의 새로운 쌍을 형성한다. 변성화 단계, 프라이머 어닐링 및 중합효소 확장은 수 회 반복되어 (즉, 변성, 어닐 및 확장이 하나의 "주기" 를 구성하고 ; 이런 "주기" 가 많이 존재할 수 있음), 목적하는 표적 서열의 증폭된 분절을 고농도로 수득할 수 있다. 목적하는 표적 서열의 증폭된 분절의 길이는 서로에 대해 프라이머의 상대적인 위치에 의해 결정되고, 따라서, 상기 길이는 조절가능한 파라미터이다. 상기 방법의 반복적인 측면으로 인해, 상기 방법을 "중합효소 연쇄 반응" (이후, "PCR") 이라고 한다. 표적 서열의 목적하는 증폭된 분절이 혼합물 내에서 두드러진 (농도 면에서) 서열이 되기 때문에, 이들을 "PCR 증폭된" 것이라고 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증폭 시약" 은 프라이머, 핵산 주형 및 증폭 효소를 제외하고 증폭에 필요한 시약 (데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트, 완충제 등) 을 말한다. 전형적으로, 다른 반응 성분과 함께 증폭 시약을 반응 용기 (시험관, 마이크로웰 등) 에 넣고 함유시킨다.
PCR 을 이용해, 게놈 DNA 중의 특이적 표적 서열의 단일 복사를 여러 상이한 방법론 (예를 들어, 표지된 프로브와의 혼성화 ; 비오티닐화 프라이머의 혼입 후 아비딘-효소 컨쥬게이트 검출 ; 증폭된 분절 내로 32P-표지된 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트, 예컨대 dCTP 또는 dATP 를 혼입) 에 의해 검출가능한 수준으로 증폭시키는 것이 가능하다. 게놈 DNA 외에도, 임의의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 적합한 세트의 프라이머 분자로 증폭될 수 있다. 특히, PCR 과정 그 자체에 의해 제작된 증폭된 분절 그 자체는 후속한 PCR 증폭에 대한 효과적인 주형이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "PCR 생성물," "PCR 절편," 및 "증폭 생성물" 은 변성, 어닐링 및 확장의 PCR 단계를 2 주기 이상 완료한 후의, 생성 화합물 혼합물을 말한다. 이러한 용어는 하나 이상의 표적 서열의 하나 이상의 분절의 증폭이 있는 경우를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "RT-PCR" 은 RNA 서열의 복제 및 증폭을 말한다. 이 방법에서, 역전사가 PCR 에 커플링되어 있는데, 가장 흔히는 참조로서 본원에 인용된 미국 특허 제 5,322,770 호에 기술된 바와 같은 열안정 중합효소를 이용하는 1 가지 효소 방법을 사용한다. RT-PCR 에서, RNA 주형은 상기 중합효소의 역전사효소 활성으로 인해, cDNA 로 전환되며, 그 후, 상기 중합효소의 중합활성을 사용하여 증폭된다 (즉, 기타 PCR 방법들에서와 같음).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소" 는 특정 뉴클레오타이드 서열에서 또는 그 근처에서 이중 가닥 DNA 를 절단하는 각각의 박테리아 효소를 말한다.
"제한효소 부위" 는 주어진 제한 엔도뉴클레아제에 의해 인식 및 절단되는 뉴클레오타이드 서열을 말하며, 흔히 DNA 절편의 삽입 부위이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 제한효소 부위는 선별 마커 내로, 및 상기 DNA 구축물의 5' 및 3' 말단 내로 조작된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "염색체 함입" 은 유입 서열이 숙주 세포의 염색체 내로 도입되는 방법을 말한다. 형질전환 DNA 의 상동 영역은 염색체의 상동 영역과 함께 정렬된다. 이어서, 상동성 박스 사이의 서열이 이중 교차 (즉, 상동성 재조합) 내의 유입 서열에 의해 대체된다. 본 발명의 일부 구현예에서, DNA 구축물의 염색체 분절을 불활성화시키는 상동 섹션이 바실러스 (Bacillus) 염색체의 토착 염색체 영역의 측면 상동 영역에 정렬된다. 이어서, 토착 염색체 영역이 이중 교차 (즉, 상동성 재조합) 내의 DNA 구축물에 의해 결실된다.
"상동성 재조합" 은 동일한 또는 거의 동일한 뉴클레오타이드 서열의 부위에서의 2 개의 DNA 분자 또는 쌍을 이룬 염색체들 간에 DNA 절편을 교환하는 것을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 염색체 함입은 상동성 재조합이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "상동 서열" 은 비교를 위해 최적으로 정렬되었을 때 또다른 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 약 100%, 약 99%, 약 98%, 약 97%, 약 96%, 약 95%, 약 94%, 약 93%, 약 92%, 약 91%, 약 90%, 약 88%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 또는 약 70% 의 서열 동일성을 갖는 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 일부 구현예에서, 상동 서열은 약 85% 내지 약 100% 의 서열 동일성을 갖고, 다른 구현예에서 약 90% 내지 약 100% 의 서열 동일성이 있으며, 더욱 바람직한 구현예에서는, 약 95% 내지 약 100% 의 서열 동일성이 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "아미노산" 은 펩티드 또는 단백질 서열 또는 이들의 일부를 말한다. 용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드" 는 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이종 단백질" 은 숙주 세포에서 자연 발생하지 않는 단백질 또는 폴리펩티드를 말한다. 이종 단백질의 예에는 프로테아제를 비롯한 히드롤라아제와 같은 효소가 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 단백질을 암호화하는 유전자는 자연 발생적인 유전자인 반면, 다른 구현예에서는 돌연변이 및/또는 합성 유전자가 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "상동 단백질" 은 세포 내의 고유의 또는 자연발생하는 단백질 또는 폴리펩티드를 말한다. 바람직한 구현예에서, 세포는 그람-양성 세포이고, 특히 바람직한 구현예에서, 세포는 바실러스 (Bacillus) 숙주 세포이다. 대안적인 구현예에서, 상동 단백질은 E. 콜라이 (E. coli), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 트리코데르마 (Trichoderma), 및 아스페르길루스 (Aspergillus) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 기타 개체에 의해 생성된 고유의 단백질이다. 본 발명은 재조합 DNA 기술에 의해 상동 단백질을 생성하는 숙주 세포를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은, "오페론 영역" 은 공통 프로모터로부터 단일 전사 단위로서 전사되어, 공동-조절되는 인접 유전자의 군을 포함한다. 일부 구현예에서, 오페론에는 조절 유전자가 포함된다. 가장 바람직한 구현예에서, RNA 수준에 의해 측정된 바로는 높게 발현되나, 미공지된 또는 불필요한 기능을 갖는 오페론이 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같은, "항생제 영역" 은 항생제 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 함유하는 영역이다.
폴리뉴클레오타이드는 고유의 상태에서 또는 당업자에게 공지된 방법에 의해 조작되는 경우, 전사 및/또는 번역되어 RNA, 폴리펩티드 또는 그의 절편을 생성할 수 있다면, RNA 또는 폴리펩티드를 "암호화한다 (encode)" 라고 언급된다. 이러한 핵산의 안티-센스 가닥이 또한 서열을 암호화하는 것으로 언급된다.
당업계에 공지된 바와 같이, DNA 는 RNA 중합효소에 의해 전사되어 RNA 를 생성할 수 있으나, RNA 는 역전사효소에 의해 역전사되어 DNA 를 생성할 수 있다. 따라서, DNA 는 RNA 를 암호화할 수 있으며 역도 성립한다.
용어 "조절 분절" 또는 "조절 서열" 또는 "발현 조절 서열" 은 암호화된 아미노산 서열의 발현에 영향을 주는 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 의 폴리뉴클레오타이드 서열에 조작적으로 연결된 DNA 의 폴리뉴클레오타이드 서열을 말한다. 조절 서열은 아미노산을 암호화하는 조작적으로 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 억제, 퇴행 또는 촉진할 수 있다.
"숙주 균주" 또는 "숙주 세포" 는 본 발명에 따른 DNA 를 포함하는 발현 벡터에 대한 적합한 숙주를 말한다.
효소가 상응하는 야생형 세포에서 발현되는 수준보다 더 높은 수준으로 세포에서 발현되는 경우, 상기 효소는 숙주 세포에서 "과발현" 된다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩티드" 는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. [IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN)] 에 따라 정의된 아미노산에 대한 3 자리 코드가 본 명세서 전체에 걸쳐 사용된다. 또한 유전적 코드의 퇴행으로 인해 폴리펩티드가 하나 초과의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있음을 이해한다.
"전구서열" 은 신호 서열과 성숙 프로테아제 사이에 존재하는, 프로테아제의 분비에 필요한 아미노산 서열이다. 상기 전구 서열의 절단으로 성숙 활성 프로테아제가 생성될 것이다.
용어 "신호 서열" 또는 "신호 펩티드" 는 성숙 또는 전구 형태의 단백질의 분비에 참여하는 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산의 임의 서열을 말한다. 신호 서열에 대한 이러한 정의는 기능상의 것으로서, 단백질 분비의 유효화에 참여하는, 상기 단백질 유전자의 N-말단 부분에 의해 암호화되는 모든 이러한 아미노산 서열들을 포함하는 것으로 의도된다. 이들은, 보편적인 것은 아니나 종종, 단백질의 N-말단 부분 또는 전구체 단백질의 N-말단 부분에 결합한다. 상기 신호 서열은 내인성일 수도 있고 외인성일 수도 있다. 상기 신호 서열은 상기 단백질 (예를 들어, 프로테아제) 에 정상적으로 결합된 것일 수 있고, 또는 또다른 분비 단백질을 암호화하는 유전자로부터 비롯된 것일 수도 있다. 하나의 실례의 외인성 신호 서열은 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus) (ATCC 21536) 의 서브틸리신의 신호 서열의 나머지에 융합되는 바실러스 서브틸리스 서브틸리신의 신호 서열중 처음의 7 개의 아미노산 잔기를 포함한다.
용어 "하이브리드 신호 서열" 은, 발현될 유전자의 신호 서열에 융합된 발현 숙주로부터 서열 일부가 수득되는 신호 서열을 말한다. 일부 구현예에서, 합성 서열이 이용된다.
단백질 또는 펩티드의 "성숙" 형태라는 용어는 단백질 또는 펩티드의 최종적인 기능적 형태를 말한다. 예시하자면, 본 발명의 NprE 프로테아제의 성숙 형태에는 SEQ ID NO:3 의 아미노산 서열이 적어도 포함된다.
단백질 또는 펩티드의 "전구체" 형태라는 용어는, 상기 단백질의 아미노 또는 카르보닐 말단에 조작적으로 연결된 전구서열을 가진 단백질의 성숙한 형태를 말한다. 전구체는 또한 상기 전구서열의 아미노 말단에 조작적으로 연결된 "신호" 서열을 가질 수 있다. 상기 전구체는 또한 번역후 활성에 관여하는 추가의폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 이로부터 절단되어 단백질 또는 펩티드의 성숙한 형태를 남기는 폴리뉴클레오타이드) 를 가질 수 있다.
"자연 발생 효소" 및 "자연 발생 단백질" 은 자연적으로 발견되는 서열과 동일한 미개질 아미노산 서열을 갖는 효소 또는 단백질을 말한다. 자연 발생 효소에는 특정 미생물에서 자연 발현되거나 발견된 효소인 고유의 효소가 포함된다.
용어 "~ 로부터 유래된" 및 "~ 로부터 수득된" 은 문제의 개체의 균주에 의해 생성되거나 생성될 수 있는 프로테아제, 뿐만 아니라 그러한 균주로부터 단리된 DNA 서열에 의해 암호화되고 그러한 DNA 서열을 함유하는 숙주 개체에서 생성되는 프로테아제를 말한다. 추가로, 상기 용어는 합성 및/또는 cDNA 기원의 DNA 서열에 의해 암호화되고 문제의 프로테아제의 확인된 특징을 갖는 효소를 말한다. 예로 들자면, "바실러스 종으로부터 유래된 프로테아제" 는 바실러스 종에 의해 자연-생성되는 단백분해 활성을 갖는 효소, 뿐만 아니라, 바실러스 종 기원에 의해 생성되나, 유전적 조작 기술의 사용을 통해 중성 메탈로프로테아제를 암호화하는 핵산으로 형질전환된 비-바실러스 아밀로리퀘파시엔스 개체에 의해서도 생성되는 중성 메탈로프로테아제를 말한다.
본 정의 범주 내의 "유도체" 는 일반적으로 유도체가 야생형, 고유형 또는 부모 (parent) 형태로서 유사한 목적에 유용한 범위로, 야생형, 고유형 또는 부모형태에서 관찰된 단백분해 활성 특징을 보유한다. 중성 메탈로프로테아제의 기능성 유도체는 본 발명의 중성 메탈로프로테아제의 일반적인 특징을 갖는 자연 발생적으로, 합성적으로 또는 재조합적으로 생성된 펩티드 또는 펩티드 절편을 포함한다.
용어 "기능성 유도체" 는 중성 메탈로프로테아제를 암호화하는 핵산의 기능적 특징을 갖는 핵산의 유도체를 말한다. 본 발명의 중성 메탈로프로테아제를 암호화하는 핵산의 기능성 유도체는 자연 발생적, 합성적으로 또는 재조합적으로 생성된 핵산 또는 절편을 포함하고, 본 발명의 중성 메탈로프로테아제 특징을 암호화한다. 본 발명에 따른 중성 메탈로프로테아제를 암호화하는 야생형 핵산에는 자연 발생적 대립유전자 및 당업계에 공지된 유전자 코드의 퇴행에 근거한 호모로그가 포함된다.
2 개 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서 용어 "동일한" 은 하기 서열 비교 또는 분석 알고리즘 중 하나를 사용하여 측정되는 바와 같이 최대 대응에 대해 정렬되었을 때 동일한, 2 개 서열 내의 잔기를 말한다.
용어 "최적 정렬" 은 가장 높은 % 동일성 점수를 제공하는 정렬을 말한다.
2 개의 아미노산, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 유전자 서열 (적합하게는) 과 관련된 "서열 동일성 %," "아미노산 서열 동일성 %," "유전자 서열 동일성 %," 및/또는 "핵산/폴리뉴클레오타이드 서열 동일성 %" 는, 서열이 최적으로 정렬된 경우 2 개의 서열 중 동일한 잔기의 % 를 말한다. 따라서, 80% 아미노산 서열 동일성은 2 개의 최적으로 정렬된 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 중 80% 가 동일하다는 것을 의미한다.
따라서, 2 개의 핵산 또는 폴리펩티드의 문맥에서 구 "실질적으로 동일한" 은 표준 파라미터를 사용하는 프로그램 또는 알고리즘 (예를 들어, BLAST, ALIGN, CLUSTAL) 을 사용하여 대조군 서열과 비교하여 약 70% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 75% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 바람직하게는 약 85% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 바람직하게는 약 97% 이상, 바람직하게는 약 98% 이상 및 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드를 말한다. 2 개의 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 하나의 지표는 첫번째 폴리펩티드가 두번째 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응한다는 것이다. 전형적으로는, 보존 아미노산 치환에 의해 상이한 폴리펩티드는 면역학적으로 교차 반응한다. 따라서, 폴리펩티드는 예를 들어, 2 개의 펩티드가 보존 치환에 의해서만 상이한 경우 두번째 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 2 개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또다른 지표는 2 개의 분자가 엄격한 조건 (예를 들어, 중간 ~ 높은 엄격함 범위 내) 하에서 서로 혼성화한다는 것이다.
용어 "단리된" 또는 "정제된" 은 본래 환경 (예를 들어, 자연적으로 발생되는 경우 자연 환경) 으로부터 제거된 물질을 말한다. 예를 들어, 상기 물질은 자연 발생하는 또는 야생형 개체에, 또는 자연 발생적 또는 야생형 개체로부터 발현 시 정상적으로 존재하지 않는 성분과 함께 존재하는 것보다 높은 또는 낮은 농도로 특정 조성물에 존재하는 경우, "정제된다" 라고 한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드는 단리되지 않으나, 자연계 중의 공존 물질의 일부 또는 모두로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드는 단리된다. 일부 구현예에서, 이러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나, 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있고, 또한, 이러한 벡터 또는 조성물은 자연 환경의 일부가 아닐수도 있다는 점에서 단리될 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 핵산 또는 단백질은, 예를 들어, 전기영동 젤 또는 블롯에서 본질적으로 하나의 밴드로 나타나는 경우 정제되었다고 말한다.
DNA 서열을 말할 때 사용되는 경우, 용어 "단리된" 은, 자연적인 유전 환경으로부터 제거되어 다른 외부적인 또는 원치않는 암호화 서열이 없으며, 유전공학적 단백질 생성 시스템에서 사용하기에 적합한 형태로 있는 DNA 서열을 말한다. 이러한 단리된 분자는 자연 환경으로부터 단리된 것들이고, cDNA 및 게놈 클론이 포함된다. 본 발명의 단리된 DNA 분자는 보통 관련된 기타 유전자가 없고, 프로모터 및 종결자와 같은 자연 발생적 5' 및 3' 비번역 영역이 포함될 수 있다. 관련 영역의 규명은 당업자에게 명백할 것이다 (예를 들어, Dynan and Tijan, Nature 316:774-78 [1985] 참조). 용어 "단리된 DNA 서열" 은 대안적으로는 "클로닝된 DNA 서열" 로 언급된다.
단백질을 말할 때 사용되는 경우, 용어 "단리된" 은, 고유의 환경 이외의 상태에서 발견되는 단백질을 말한다. 바람직한 형태에서, 단리된 단백질은 다른 단백질, 특히 다른 상동 단백질이 실질적으로 없다. 단리된 단백질은 SDS-PAGE 에 의해 측정된 바와 같이 약 10% 초과의 순도, 바람직하게는 약 20% 초과의 순도, 및 더욱 더 바람직하게는 약 30% 초과의 순도를 갖는다. 발명의 추가 측면은 SDS-PAGE 에 의해 측정된 바와 같이 고도로 정제된 형태 (즉, 약 40% 초과의 순도, 약 60% 초과의 순도, 약 80% 초과의 순도, 약 90% 초과의 순도, 약 95% 초과의 순도, 약 97% 초과의 순도, 및 심지어 약 99% 초과의 순도) 의 단백질을 포함한다.
하기 카세트 돌연변이 방법은 본 발명의 효소 변이체의 구축을 유용하게 하기 위해 사용될 수 있으며, 그렇더라도 다른 방법들도 사용될 수 있다. 우선, 본원에 기술된 바와 같이, 상기 효소를 암호하하는 자연 발생 아미노산을 수득하고, 이를 전체로 또는 부분적으로 서열화한다. 다음, 암호화되는 효소 내 하나 이상의 아미노산을 돌연변이화 (결실, 삽입 또는 치환) 시키기에 바람직한 지점에 대해 상기 서열을 스캐닝한다. 상기 지점의 측면에 있는 서열을 제한효소 부위의 존재에 대해 평가하며, 이 부위는 유전자의 짧은 절편을, 발현될 경우 다양한 돌연변이를 암호화할 올리고뉴클레오타이드 풀 (pool) 로 대체하는 부위이다. 상기 제한효소 부위는 유전자 분절의 대체를 유용하게 하는, 바람직하게는 단백질 유전자 내에 있는 독특한 부위이다. 그러나, 효소 유전자에서 과도하게 불필요하지 않은 임의의 통상의 제한효소 부위가 사용될 수 있으며, 단, 제한효소 부위 분해에 의해 생성되는 유전자 절편은 적절한 서열 내에서 재조립될 수 있어야 한다. 제한효소 부위가 선별된 지점에서 가까운 거리 내의 위치 (10 내지 15 개 뉴클레오타이드) 에 존재하지 않는다면, 상기 부위는 해독 프레임 또는 암호화되는 아미노산 중 어느 것도 최종 구축물 내에서 변화되지 않을 방식으로, 뉴클레오타이드를 유전자 내에서 치환함으로써 생성된다. 유전자의 서열을 목적하는 서열과 일치하도록 변화시키기 위해, 유전자를 돌연변이시키는 것은 일반적으로 공지된 방법에 따라, M13 프라이머 확장에 의해 달성된다. 적합한 측면 영역을 위치시키고 2 개의 통상의 제한효소 부위 서열에 도달하는데 필요한 변화를 평가하는 작업은 유전자 코드의 중복 (redundancy), 유전자의 제한효소 인식 부위 지도, 및 많은 수의 상이한 제한효소에 의해 일상적으로 이루어진다. 통상의 측면의 제한효소 부위가 이용가능하다면, 상기 방법이 단지, 부위를 함유하지 않는 측면 영역과 함께 있을 때만 사용될 필요가 있음을 주지한다.
일단 자연 발생 DNA 및/또는 합성 DNA 를 클로닝하면, 돌연변이될 위치의 측면에 있는 제한효소 부위는 관련 제한효소를 이용해 분해되고, 다수의 말단-상보성 올리고뉴클레오타이드 카세트가 유전자 내로 연결된다. 돌연변이는 올리고뉴클레오타이드 모두가 동일한 제한효소 부위를 갖도록 합성될 수 있기 때문에, 상기 방법에 의해 간략화되고, 제한효소 부위를 만들기 위해 어떠한 합성 링커도 필요하지 않다.
본원에 사용된 바와 같이, "~ 에 상응하는" 은 단백질 또는 펩티드 내의 열거된 위치에 있는 잔기, 또는 단백질 또는 펩티드 내 열거된 잔기에 유사한, 상동성인, 또는 동일한 잔기를 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, "상응하는 영역" 은 일반적으로 관련 단백질 또는 부모 단백질을 따라 유사한 위치를 말한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "조합 돌연변이화" 는 출발 서열의 변이체의 라이브러리가 생성되는 방법을 말한다. 상기 라이브러리에서, 변이체는 미리 정의된 일련의 돌연변이로부터 선택된 하나 또는 여러 돌연변이를 함유한다. 또한, 상기 방법은 미리 정의된 일련의 돌연변이의 일원이 아닌 랜덤 돌연변이를 도입하기 위한 수단을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법에는 본원에 참조로서 인용된, 2000 년 10 월 26 일에 출원된 미국 출원 제 09/699,250 호에 언급된 것들이 포함된다. 대안적인 구현예에서, 조합 돌연변이화 방법은 시판되는 키트 (예를 들어, QUIKCHANGE® Multisite, Stratagene, La Jolla, CA) 를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "돌연변이체의 라이브러리" 는 게놈의 대부분이 일치하나 하나 이상의 유전자의 상이한 호모로그가 포함되는 세포의 집단을 말한다. 이러한 라이브러리는 예를 들어, 향상된 특색을 갖는 유전자 또는 오페론을 규명하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "출발 유전자" 및 "부모 유전자" 는 본 발명을 사용하여 향상 및/또는 변화되는 관심있는 단백질을 암호화하는 관심있는 유전자를 말한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "다중 서열 정렬" 및 "MSA" 는 알고리즘 (예를 들어, Clustal W) 을 사용하여 정렬된 출발 서열의 복수의 호모로그 서열을 말한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "보존 서열" 및 "정준 서열 (canonical sequecne)" 은 원형적인 (archetypical) 아미노산 서열을 말하며, 관심있는 특정 단백질 또는 서열의 모든 변이체는 이것에 대해 (against) 비교된다. 상기 용어는 또한 관심있는 DNA 서열에 가장 흔히 존재하는 뉴클레오타이드를 나타내는 서열을 말한다. 유전자의 각 위치에 대해, 보존 서열은 MSA 내 상기 위치에서 가장 풍부한 아미노산을 제공한다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "보존 돌연변이" 는 출발 유전자 서열 및 보존 서열의 차이를 말한다. 보존 돌연변이는 출발 유전자 서열 및 MSA 로부터 수득되는 보존 서열을 비교하여 규명된다. 일부 구현예에서, 보존 돌연변이는 출발 유전자 내에 도입되어, 보존 서열과 더욱 유사하게 된다. 보존 돌연변이에는 또한, 출발 유전자 내 아미노산의 빈도와 관련된 위치에서, 출발 유전자 내 아미노산을 MSA 에서 더욱 종종 발견되는 아미노산으로 변화시키는 아미노산 변화가 포함된다. 따라서, 용어 보존 돌연변이는 출발 유전자의 아미노산을 MSA 내 아미노산보다 더욱 풍부한 아미노산으로 대체하는 모든 단일 아미노산 변화를 포함한다.
용어 "개질된 서열" 및 "개질된 유전자"는 자연 발생적 핵산 서열의 결실, 삽입 또는 개입을 포함하는 서열을 나타내는 것으로서, 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 바람직한 구현예에서, 개질 서열의 발현 생성물은 절단된 단백질이다 (예를 들어, 개질이 서열의 결실 또는 개입인 경우). 일부 특히 바람직한 구현예에서, 절단된 단백질은 생물학적 활성을 유지한다. 대안적인 구현예에서, 개질 서열의 발현 생성물은 신장된 단백질이다 (예를 들어, 핵산 서열 내의 삽입을 포함하는 개질). 일부 구현예에서, 삽입은 절단된 단백질을 초래한다 (예를 들어, 삽입이 중지 코돈을 형성하는 경우). 따라서, 삽입은 발현 생성물로서 절단된 단백질 또는 신장된 단백질을 초래할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "돌연변이 서열" 및 "돌연변이 유전자"는 상호교환적으로 사용되고, 숙주 세포의 야생형 서열에서 발생하는 하나 이상의 코돈에서 변경이 이루어진 서열을 말한다. 돌연변이 서열의 발현 생성물은 야생형과 비교해 변경된 아미노산 서열을 갖는 단백질이다. 발현 생성물은 변경된 기능적 역량 (예를 들어, 향상된 효소적 활성) 을 가질 수 있다.
용어 "돌연변이성 프라이머" 또는 "돌연변이성 올리고뉴클레오타이드" (본원에서 상호교환적으로 사용됨) 는 주형 서열의 일부에 상응하고 그곳에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 조성물을 말한다. 돌연변이성 프라이머에 있어서, 프라이머는 주형 핵산에 정확하게 부합하지 않을 것이고, 프라이머에서의 미스매치(들)은 핵산 라이브러리 내에 원하는 돌연변이를 도입하는데 사용된다. 본원에 사용되는 바와 같은 "비-돌연변이성 프라이머" 또는 "비-돌연변이성 올리고뉴클레오타이드"는 주형 핵산에 정확하게 부합하는 올리고뉴클레오타이드 조성물을 말한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 오직 돌연변이성 프라이머만이 사용된다. 본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서, 프라이머는 하나 이상의 영역에 돌연변이성 프라이머가 포함되고, 올리고뉴클레오타이드 혼합물에 포함된 비-돌연변이성 프라이머가 또한 존재하도록 디자인된다. 돌연변이성 프라이머 중 하나 이상에 상응하는 돌연변이성 프라이머 및 비-돌연변이성 프라이머의 혼합물을 첨가하여, 다양한 조합 돌연변이 패턴이 제시된 생성 핵산 라이브러리를 제조하는 것이 가능하다. 예를 들어, 돌연변이 핵산 라이브러리의 구성원 중 일부는 특정 위치에서 그의 전구체 서열을 유지하는 반면 다른 구성원은 상기 위치에서 돌연변이되는 것이 바람직하다면, 비-돌연변이성 프라이머는 제시된 잔기에 대한 핵산 라이브러리 내 비-돌연변이 구성원의 특정 수준을 수득하는 능력을 제공한다. 본 발명의 방법은 일반적으로 길이가 10 ~ 50 개 염기인, 더욱 바람직하게는 길이가 약 15 ~ 45 개 염기인 돌연변이성 및 비-돌연변이성 올리고뉴클레오타이드를 사용한다. 그러나, 원하는 돌연변이화 결과를 수득하기 위해서는, 10 개 염기보다는 짧거나 50 개 염기보다는 긴 길이의 프라이머를 사용하는 것이 필요할 수 있다. 상응하는 돌연변이성 및 비-돌연변이성 프라이머에 있어서, 상응하는 올리고뉴클레오타이드의 길이가 동일해야할 필요는 없으나, 첨가되는 돌연변이에 상응하는 영역 중에 오버랩은 존재한다.
프라이머는 본 발명에 따른 미리 정의된 비율로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 생성 라이브러리가 특정한 특이적 돌연변이를 유의한 수준으로 가지며, 동일 또는 상이한 부위에서 상이한 돌연변이의 양이 더 적은 것이 바람직한 경우, 첨가되는 프라이머의 양을 조절하여, 목적하는 편향의 (biased) 라이브러리를 생성하는 것이 가능하다. 대안적으로는, 비-돌연변이성 프라이머를 더 적게 또는 더 많이 첨가함으로써, 상응하는 돌연변이(들)가 돌연변이 핵산 라이브러리에서 생성되는 빈도를 조정하는 것이 가능하다.
용어 "야생형 서열," 또는 "야생형 유전자" 는 숙주 세포 내 고유의 또는 자연 발생하는 서열을 말하며, 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, 야생형 서열은 단백질 공학 프로젝트의 출발점인, 관심있는 서열을 말한다. 야생형 서열은 상동 또는 이종 단백질을 암호화할 수 있다. 상동 단백질은 개입 없이 숙주 세포가 생성할 단백질이다. 이종 단백질은 개입이 없다면 숙주 세포가 생성하지 않을 단백질이다.
용어 "산화에 안정한" 은 단백분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 방법, 예를 들어 표백제 또는 산화제에 노출되거나 이와 접촉하는 동안 널리 행해지는 조건 하에서 주어진 시간에 걸쳐 특정량의 효소 활성을 유지하는 본 발명의 프로테아제를 나타낸다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 예를 들어, 적어도 1분, 3분, 5분, 8분, 12분, 16분, 20분 등의 주어진 시간에 걸쳐 표백제 또는 산화제와 접촉한 후, 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 의 단백분해 활성을 유지한다.
용어 "킬레이트제에 안정한" 은 단백분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 방법, 예를 들어 킬레이트제에 노출되거나 이와 접촉하는 동안 널리 행해지는 조건 하에서 주어진 시간에 걸쳐 특정량의 효소 활성을 유지하는 본 발명의 프로테아제를 말한다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 예를 들어, 적어도 10분, 20분, 40분, 60분, 100분 등의 주어진 시간에 걸쳐 킬레이트제와 접촉한 후, 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 의 단백분해 활성을 유지한다.
용어 "열적으로 안정한" 및 "열안정성" 은 단백분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 방법, 예를 들어 변경된 온도에 노출되는 동안 널리 행해지는 조건 하에서 주어진 시간에 걸쳐 규명된 온도에 노출 후, 특정량의 효소 활성을 유지하는 본 발명의 프로테아제를 말한다. 변경된 온도에는 증가 또는 감소된 온도가 포함된다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 예를 들어, 적어도 60분, 120분, 180분, 240분, 300분 등의 주어진 시간에 걸쳐 변경된 온도에 노출된 후, 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 의 단백분해 활성을 유지한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "화학적 안정성" 은 단백질의 활성에 악영향을 주는 화학물질에 대한, 단백질 (예를 들어, 효소) 의 안정성을 말한다. 일부 구현예에서, 상기 화학물질에는 제한 없이, 과산화수소, 과산, 음이온성 세제, 양이온성 세제, 비-이온성 세제, 봉쇄제 등이 포함된다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 화학적 안정성 수준 또는 범위에 제한되지 않거나, 또는 화학적 안정성 범위에 제한되지 않고자 한다. 특히, 용어 "세제 안정한" 및 "LAS 안정한" 은 본 발명의 단백분해, 가수분해, 세정 또는 다른 방법 동안에 널리 행해지는 조건 하에 주어진 시간에 걸쳐 세제 조성물에 노출시킨 후 특정량의 효소 활성을 유지하는 본 발명의 프로테아제를 말한다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 예를 들어, 적어도 60 분, 120 분, 180 분, 240 분, 300 분 등의 주어진 시간에 걸쳐서 조성물에 노출시킨 후 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 의 단백분해 활성을 유지한다.
산화, 킬레이트제, 열 및/또는 pH 에 안정한 프로테아제의 문맥에서 용어 "향상된 안정성" 은 다른 중성 메탈로프로테아제 및/또는 야생형 효소와 비교하여 시간에 걸쳐 보다 높은 단백분해 활성을 유지하는 것을 말한다.
산화, 킬레이트제, 열 및/또는 pH 에 안정한 프로테아제의 문맥에서 용어 "감소된 안정성" 은 다른 중성 메탈로프로테아제 및/또는 야생형 효소와 비교하여 시간에 걸쳐 보다 낮은 단백분해 활성을 유지하는 것을 말한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "세정 조성물" 에는, 달리 나타내지 않는 한, 과립 또는 분말 형태의 다목적 또는 "중질 (heavy-duty)" 세척제, 특히 세정 세제; 액체, 젤 또는 페이스트 형태의 다목적 세척제, 특히 소위 중질 액체형; 액체 미세-직물 세제; 손 식기세척제 또는 경질 (light-duty) 식기세척제, 특히 고발포형의 것; 가정 및 영업용 다양한 정제, 과립, 액체 및 헹굼 보조 유형을 포함하는 기계 식기세척제; 항균 손 세척 유형, 세정 바, 구강세척제, 의치 세정제, 차량 또는 카페트 샴푸, 욕실 세정제를 포함하는 액체 세정제 및 살균제 ; 헤어 샴푸 및 헤어 린스; 샤워 젤 및 거품 목욕제 및 금속 세정제 ; 뿐만 아니라, 세정 보조제, 예컨대 표백 첨가제 및 "오염물-막대" 또는 전처리 유형이 포함된다.
다르게 언급하지 않는 한, 모든 성분 또는 조성물 수준은 상기 성분 또는 조성물의 활성 수준에 관련된 것이며, 불순물, 예를 들어 잔류 용매 또는 부산물은 제외되는데, 이는 시판되는 공급원 중 존재할 수 있다.
효소 성분 중량은 총 활성 단백질을 기준으로 한다. 다르게 나타내지 않는 한, 모든 % 및 비율은 중량에 대해 계산된다. 다르게 나타내지 않는 한, 모든 % 및 비율은 총 조성물을 기준으로 계산된다.
용어 "세정 활성" 은 단백분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 방법 동안 널리 행해지는 조건 하에서 프로테아제에 의해 달성되는 세정 성능을 말한다. 일부 구현예에서, 세정 성능은 오염물을 표준 세정 조건에 적용한 후, 다양한 크로마토그래프, 분광광도계 또는 다른 정량 방법론에 의해 측정된 바와 같이 예를 들어 잔디, 혈액, 우유, 또는 계란 단백질과 같은 효소 민감성 오염물에 관한 다양한 세정 어세이를 적용함으로써 측정된다. 실례의 어세이에는 WO 99/34011 및 미국 특허 제 6,605,458 호 (둘 다 본원에 참조로서 삽입됨) 에 기재된 것들뿐만 아니라, 실시예에 포함된 방법들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 프로테아제의 "세정 유효량"은 특정 세정 조성물에서 원하는 수준의 효소 활성을 달성하는 본원에서 이전에 기재된 프로테아제의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자에 의해 쉽게 확인되며, 많은 요소, 예컨대 사용된 특정 프로테아제, 세정 적용, 세정 조성물의 특정 조성, 및 액체 또는 건조 (예를 들어 과립, 바) 조성물이 필요한지의 여부 등에 근거한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "세정 보조 물질" 은, 특정 유형의 바람직한 세정 조성물 및 생성물 형태 (예를 들어 액체, 과립, 분말, 바, 페이스트, 분무, 정제, 젤; 또는 발포 조성물)로부터 선택되는 임의의 액체, 고체 또는 기체 물질을 의미하고, 상기 물질은 또한 바람직하게는 조성물에 사용되는 프로테아제 효소와 융화성이다. 일부 구현예에서, 과립 조성물은 "압축" 형태이고, 다른 구현예에서, 액체 조성물은 "농축" 형태이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "저 세제 농도" 시스템에는 약 800 ppm 미만의 세제 성분이 세척수에 존재하는 세제가 포함된다. 일본 세제는 통상 약 667 ppm 의 세제 성분이 세척수에 존재하기 때문에 전형적으로 저 세제 농도 시스템으로 간주된다.
본원에 사용되는 바와 같은 "중간 세제 농도" 시스템에는 약 800 ppm 내지 약 2000 ppm 의 세제 성분이 세척수에 존재하는 세제가 포함된다. 북미 세제는 통상 대략 975 ppm 의 세제 성분이 세척수에 존재하기 때문에 일반적으로 중간 세제 농도 시스템인 것으로 간주된다. 브라질 세제는 전형적으로 대략 1500 ppm 의 세제 성분이 세척수에 존재한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "고 세제 농도" 시스템에는 약 2000 ppm 초과의 세제 성분이 세척수에 존재하는 세제가 포함된다. 유럽 세제는 대략 3000 ~ 8000 ppm 의 세제 성분이 세척수에 존재하기 때문에 일반적으로 고 세제 농도 시스템인 것으로 간주된다.
본원에 사용되는 바와 같은 "직물 세정 조성물"에는 얼룩진 직물 (예를 들어 옷감, 린넨 및 기타 텍스타일 물질)의 적심 및/또는 예비처리에 사용하기에 적합한 조성물 및 세탁 첨가 조성물을 포함하여, 손세탁 및 기계세탁 세제 조성물이 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같은 "비-직물 세정 조성물" 에는 식기세척 세제 조성물, 구강 세정 조성물, 의치 세정 조성물 및 개인 세안 조성물을 포함하나 이에 제한되지 않는 비-텍스타일 (즉, 직물) 표면 세정 조성물이 포함된다.
본원의 세정 조성물의 "압축" 형태는 밀도에 의해, 그리고 조성에 있어서 무기 충진제 염의 양에 의해 가장 잘 반영된다. 무기 충진제 염은 분말 형태의 세제 조성물이 통상적인 성분이다. 통상적인 세제 조성물에서, 충진제 염은 상당한 양으로, 전형적으로 총 조성의 17 ~ 35 중량% 로 존재한다. 반대로, 압축 조성물에서, 충진제 염은 총 조성의 15% 를 넘지 않는 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 충진제 염은 조성의 10 중량% 를 넘지 않는 양으로, 또는 더욱 바람직하게는 5 중량% 로 존재한다. 일부 구현예에서, 무기 충진제 염은 술페이트 및 클로라이드의 알칼리 및 알칼리 토금속 염으로부터 선택된다. 바람직한 충진제 염은 나트륨 설페이트이다.
발명의 상세한 설명
중성 메탈로엔도펩티다제 (즉, 중성 메탈로프로테아제) (EC 3.4.24.4) 는 촉매 활성을 위한 아연 이온에 대해 절대 조건을 갖는 프로테아제 부류에 속한다. 이들 효소는 중성 pH 에서 최적으로 활성이고, 효소의 크기 범위는 30 내지 40 kDa 이다. 중성 메탈로프로테아제는 단백질의 구조 안정성에 기여하는 2 내지 4 개의 칼슘 이온에 결합한다. 메탈로프로테아제의 활성 부위에 있는 결합된 금속 이온은 물 분자의 활성화를 허용하는 필수 특징이다. 다음, 물 분자는 친핵체로서 작용하고, 펩티드 결합의 카르보닐기를 절단한다.
중성 아연-결합 메탈로프로테아제 패밀리는 박테리아 효소 서모리신, 및 서모리신-형 프로테아제 ("TLP"), 뿐만 아니라 카르복시펩티다제 A (분해 효소) 및 조직 개조 및 분해에서 반응을 촉매하는 매트릭스 메탈로프로테아제를 포함한다. 안정성 및 기능 면에서 이들 프로테아제 중 유일하게 잘 특징화된 것은 서모리신 및 그의 변이체 (TLP) 이다. 실제로, 효소의 열적 안정성을 증가시키기 위해 유전자조작 바실러스 서브틸리스 중성 프로테아제에 대해 많은 연구가 집중되었다 (예를 들어, Vriend 등, In, Tweel 등 (eds), Stability and Stabilization of Enzyme, Elsevier, pp. 93- 99 [1993] 참조).
단백질의 자가분해를 초래하고 높은 온도에서 중성 프로테아제가 변성되게 할, 국소 풀림 (local unfoldin) 과정을 예방하기 위해 제안되는, 분자 모델링을 사용하여 규명되는 구조 결정소를 변경함으로써 프로테아제의 안정성을 증가시키는데 많은 노력을 중점두었다 (예를 들어, [van den Burg 등, in Hopsu-Havu 등, (eds), 단백분해 in Cell Function Manipulating the Autolytic Pathway of a Bacillus Protease. Biomedical and Health Research Vol. 13, IOS Press [1997] p. 576] 참조)
중성 메탈로프로테아제가 향상된 특징을 갖도록 조작하는 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 본원에 지시된 바와 같이, 칼슘 이온은 서모리신과 같은 다른 프로테아제에 대해 자가분해를 예방하는 것으로 보고되었다. B. 스테아로터모필루스 (B. stearothermophilus) 중성 프로테아제는 칼슘 첨가에 의해, 자가분해 및 단백분해에 대해 안정화되었다 (Durrschmidt 등, FEBS J., 272:1523-1534 [2005] 참조).
실제로, 본 발명은 그의 구조 안정성을 유지하기 위해 칼슘과는 독립적으로 중성 메탈로프로테아제의 유전자조작에 적합한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 유전자조작은 단백분해를 방지할 수 있는 특정 2 차 구조 원소에서 국소 풀림을 방지한다.
서브틸리신과 같은 자연 및 조작된 프로테아제는 종종 바실러스 서브틸리스에서 발현되고, 다수는 단백질성 균주를 제거하기 위해 조성물 제제에 적용되었다. 다른 프로테아제들은 예를 들어, 제빵 산업에서 사용되어 왔다 (예를 들어, 바실러스 서모프로테오리티쿠스 (Bacillus thermoproteolyticus) 의 서모리신 ; 예를 들어, Galante and Formantici, Curr. Organic Chem., 7, 1399-1422 [2003] 참조). 일반적으로, 세린 프로테아제는 이들 프로테아제가 안정화될 수 있는 상대적인 용이함으로 인해 적어도 부분적으로 세제에서 더욱 광범위하게 사용되어 왔다.
실제로, 메탈로프로테아제는 많은 이유로, 산업, 및 특히 세제 산업에서 덜 자주 사용된다. 이들 효소는 더욱 복잡한 단백질 시스템을 포함하는데, 그 이유는 효소가 각각 안정성 및 기능을 위해 칼슘 및 아연 이온에 대한 절대 조건을 갖기 때문이다. 추가로, 상기 세제 용액, 뿐만 아니라 세탁 방법에서 사용되는 물은 효소에 의한 이온의 결합을 종종 방해하거나 또는 이들 이온을 킬레이트화시켜서 단백분해 기능의 감소 또는 손실, 및 프로테아제의 탈안정화를 초래하는 성분을 종종 함유한다.
본 발명의 개발 동안에 측정된 바와 같이, 시트레이트의 존재 하에 NprE 에 대한 자가분해 모델은 하기 방정식으로 나타낼 수 있다 :
(식 중, N 은 고유의 형태이고, I 는 부분적으로 접혀진 중간체를 나타내고, AP 는 자가분해된 프로테아제임). NprE 에 대해, 시트레이트는 부분적으로 접히지 않은 중간체 (I) 상태를 초래하는 칼슘 이온을 제거함으로써 자가분해를 받기 쉬운 루프 및 표면 잔기를 생성하여, 단백질 구조를 불안정화시키는 경향이 크다. 자가분해된 단백질 절편의 생성은 빠르고 높을 것이다. 이들 영역에서 또는 그 근처에서 치환을 안정하게 하는 것은 자가분해를 덜 받기 쉬운 NprE 변이체를 초래하였다. 변이체에 대한 모델은 자가분해된 단백질 (AP) 의 생성이 실질적으로 느린 점을 제외하고는, 야생형에 대한 모델과 매우 유사한 경향이 있다. 시트레이트의 존재 및 부재 시에 열적 풀림은 시트레이트의 존재 하에 활성의 및 본래의 변이체가 접힌 구조를 가진다는 것을 드러내는 열쇠였다. 이러한 데이타는, 발견된 돌연변이 중 그 어느 것도 칼슘 결합에 직접 연관되어 있지는 않다는 점에서, 시트레이트-안정성 치환이 칼슘-스트레스 단백질의 안정성을 증가시키는 경향이 크다는 것을 제시한다. 따라서, 본원에 기술된 바와 같이, 칼슘의 손실로 인한 NprE 의 시트레이트-유도 불안정성은 칼슘 스트레스 단백질의 안정성을 향상시킴으로써 간접적으로 재매개될 수 있다.
구체적으로는, 활성 어세이 및 SDS-PAGE 를 사용해 연구된 야생형 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 NprE 프로테아제의 시트레이트-유도 불활성화 및 자가분해는 빠르고 비가역적이었다. Edman 분해에 의해 규명된 초기 자가분해 부위의 N-말단은 루프-영역 내, 및 분자의 표면 상에 존재한다. 단일-부위 포화 돌연변이, 및 이후의 조합 돌연변이는 루프- 및 표면-부위 영역에 분포되는, S129, F130, M138, V190, 및 D220 에서 5 개의 아미노산 치환이 있는 실례의 시트레이트-안정성 단백질을 초래하였다. S129I-F130L-M138L-V190I-D220P 분자는 실온에서 밤새 인큐베이션하였을 때, 100 mM 시트레이트의 존재 하에 완전히 활성이고, 구조적으로는 본래대로였다. 시트레이트의 존재 하, 단일 및 복수의 조합 변이체에 대한 열적 용융점의 열량 측정은 가능성을 나타내었고, 겉보기 ΔTm 은 +10℃ 이다. 이는 비가역적인 불활성화 및 자가분해의 방법을 수행하지 않는 안정한 고유의 상태의 생성으로 인해 고려되는 안정화 효과이다. 산업용 세제가 자주 시트레이트를 함유하기 때문에, 본 발명은 NprE 변이체를 함유하는 산업용 세제의 제조 및 개발에서 적용하기 위한 극히 유리한 기회를 제공한다.
본 발명의 세정 및 세제 제제의 상세한 설명
달리 주지되지 않는 한, 본원에 제공된 모든 성분 또는 조성물 수준은 상기 성분 또는 조성물의 활성 수준을 참조로 하고, 시판의 공급원에 존재할 수 있는 불순물, 예를 들어, 잔여 용매 또는 부산물은 제외되어 있다. 효소 성분 중량은 총 활성 단백질을 기준으로 한다. 모든 % 및 비율은 달리 지시되지 않는 한 중량으로 계산된다. 모든 % 및 비율은 달리 지시되지 않는 한 총 조성을 기준으로 계산된다.
예시된 세제 조성물에서, 효소 수준은 달리 명시되지 않는 한 총 조성물의 중량으로 순수한 효소에 의해 표현되고, 세제 성분은 총 조성물의 중량으로 표현된다.
중성 메탈로프로테아제를 포함하는 세정 조성물
본 발명의 중성 메탈로프로테아제는 다양한 세제 조성물의 제형에 유용하다. 본 발명의 세정 조성물은 유리하게는 예를 들어, 세탁 적용, 경질 표면 세정, 자동 식기세척 적용, 뿐만 아니라 틀니, 치아, 모발 및 피부와 같은 미용 적용에서 이용될 수 있다. 그러나, 더 낮은 온도의 용액에서 효능이 증가되고, 착색-안정성 프로파일이 우수한 독특한 이점으로 인해, 본 발명의 효소는 직물의 표백과 같은 세탁 적용에 이상적으로 적합하다. 더욱이, 본 발명의 효소는 과립 및 액체 조성물 둘 다에서 사용될 수 있다.
본 발명의 효소는 또한, 세정 첨가제 제품에서 사용될 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 효소를 포함하는 세정 첨가제 제품은 추가의 표백 효능이 필요한 경우, 세정 방법 중에 포함되기에 이상적으로 적합하다. 상기 예에는 제한 없이, 저온 용액 세정 적용이 포함된다. 첨가제 제품은 가장 단순한 형태로서는, 본 발명에 의해 제공되는 바와 같은 하나 이상의 중성 메탈로프로테아제 효소일 수 있다. 일부 구현예에서, 첨가제는 퍼옥시겐 공급원이 적용되고 증가된 표백 효능이 필요한 세정 방법에 첨가하기 위한 용량 형태로 포장된다. 일부 구현예에서, 단일 용량 형태는 미리-측정된 분말 및/또는 액체를 포함하는 알약, 정제, 겔캡 또는 다른 단일 용량 형태를 포함한다. 일부 구현예에서, 충진제 및/또는 담체 물질(들) 이 포함되어, 상기 조성물의 부피를 증가시킨다. 적합한 충진제 또는 담체 물질에는 제한 없이, 술페이트, 카르보네이트, 및 실리케이트의 다양한 염, 뿐만 아니라, 탈크, 클레이 (clay) 등이 포함된다. 일부 구현예에서, 액체 조성물용 충진제 및/또는 담체 물질에는 물, 및/또는 폴리올 및 디올을 포함한 저분자량 1 차 및 2 차 알콜이 포함된다. 상기 알콜의 예에는 제한 없이, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 이소프로판올이 포함된다. 일부 구현예에서, 조성물은 상기 물질을 약 5% 내지 약 90% 포함한다. 추가의 구현예에서, 산성 충진제는 조성물의 pH 를 감소시키기 위해 사용된다. 일부 대안의 구현예에서, 세정 첨가제는 하기 기술된 바와 같은 하나 이상의 활성화된 퍼옥시겐 및/또는 하기 더욱 상세히 기술되는 바와 같은 보조 성분을 포함한다.
본 발명의 세정 조성물 및 세정 첨가제는 본 발명에서 제공되는 바와 같은 중성 메탈로프로테아제 효소를 유효량 필요로 한다. 일부 구현예에서, 필요한 효소 수준은 본 발명에 의해 제공되는 중성 메탈로프로테아제 중 하나 이상의 종의 첨가에 의해 달성된다. 전형적으로, 본 발명의 세정 조성물은 본 발명에 의해 제공되는 하나 이상의 중성 메탈로프로테아제를 0.0001 중량% 이상, 약 0.0001 내지 약 1 중량%, 약 0.001 내지 약 0.5 중량%, 또는 심지어 약 0.01 내지 약 0.1 중량% 포함한다.
일부 바람직한 구현예에서, 본원에서 제공된 세정 조성물은 전형적으로 수성 세정 조작에서 사용되는 동안에, 세정수의 pH 가 약 5.0 내지 약 11.5 가 되도록 제형되거나, 또는 대안의 구현예에서, 심지어 약 6.0 내지 약 10.5 가 되도록 제형된다. 일부 바람직한 구현예에서, 액체 생성물 제제는 전형적으로 약 3.0 내지 약 9.0 의 순 pH 를 갖도록 제형되고, 한편, 일부 대안의 구현예에서, 제제의 순 pH 는 약 3 내지 약 5 이다. 일부 바람직한 구현예에서, 과립 세탁 생성물은 전형적으로 pH 가 약 8 내지 약 11 이 되도록 제형된다. 권고되는 용도 수준에서 pH 를 조절하는 기술에는 완충제, 알칼리, 산 등의 사용이 포함되고, 당업자에게 잘 알려져 있다.
일부 특히 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 중성 메탈로프로테아제는 과립 조성물 또는 액체 내에서 적용되고, 중성 메탈로프로테아제는 보관 동안에 과립 조성물의 다른 성분으로부터 효소를 보호하기 위해 캡슐화된 입자 형태로 존재한다. 또한, 캡슐화는 세정 방법 동안에 중성 메탈로프로테아제(들) 의 이용가능성을 조절하는 수단을 제공하기도 하고, 중성 메탈로프로테아제(들) 의 성능을 향상시킬 수도 있다. 본 발명의 캡슐화된 중성 메탈로프로테아제는 다양한 세팅에서 사용될 것으로 생각된다. 중성 메탈로프로테아제는 당업계에 알려진 임의의 적합한 캡슐화 물질(들) 및 방법(들) 을 사용해 캡슐화되고자 한다.
일부 바람직한 구현예에서, 캡슐화 물질은 전형적으로 중성 메탈로프로테아제 촉매 중 일부 이상을 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 수용성 및/또는 수분산성이다. 일부 추가의 구현예에서, 캡슐화 물질의 유리 전이 온도 (Tg) 는 0℃ 이상이다 (예를 들어, 유리 전이 온도에 관한 더 많은 정보를 얻고자 한다면 WO 97/11151, 특히 6 쪽, 25 줄 내지 7 쪽 2 줄 참조).
일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 탄수화물, 천연 또는 합성 검, 키틴 및 키토산, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 실리케이트, 포스페이트, 보레이트, 폴리비닐 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 파라핀 왁스 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 캡슐화 물질이 탄수화물인 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 모노사카라이드, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 바람직한 구현예에서, 캡슐화 물질은 전분이다 (일부 실례의 적합한 전분에 대한 설명은 예를 들어, EP 0922 499; US 4,977,252. US 5,354,559, 및 US 5,935,826 을 참조).
추가의 구현예에서, 캡슐화 물질은 플라스틱으로부터 제조된 미세구를 포함한다 (예를 들어, 열가소성 수지, 아크릴로니트릴, 메타크릴로니트릴, 폴리아크릴로니트릴, 폴리메타크릴로니트릴 및 그의 혼합물 ; 사용될 수 있는 시판의 미세구에는 제한 없이, EXPANCEL® [Casco Products, Stockholm, Sweden], PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES®, 및 Q-CEL® [PQ Corp., Valley Forge, PA], LUXSIL® 및 SPHERICELL® [Potters Industries, Inc., Carlstadt, NJ and Valley Forge, PA] 이 포함됨).
출원인의 세정 조성물의 제조 방법 및 사용 방법
일부 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 임의의 적합한 형태로 제형되고, 제형자가 선택한 임의의 방법에 의해 제조된다 (예를 들어, 일부 비-제한적인 예에 대해서는 U.S. 5,879,584, U.S. 5,691,297, U.S. 5,574,005, U.S. 5,569,645, U.S. 5,565,422, U.S. 5,516,448, U.S. 5,489,392, 및 U.S. 5,486,303 을 참조). 낮은 pH 세정 조성물이 필요한 일부 구현예에서, 상기 조성물의 pH 는 HCl 과 같은 산성 물질의 첨가를 통해 조정된다.
보조 물질
본 발명의 목적에 필요하지 않더라도, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 보조제의 비-제한적 목록은 본 발명의 세정 조성물에서 사용하기에 적합하다. 실제로, 일부 구현예에서, 보조제는 본 발명의 세정 조성물에 혼입된다. 일부 구현예에서, 보조 물질은 세정 성능을 돕고/거나, 또는 향상시키고, 세정될 기질을 처리하고/거나, 또는 세정 조성물의 미적인 부분 (예를 들어, 방향제, 착색제, 염료 등) 을 개질한다. 상기 보조제는 본 발명의 중성 메탈로프로테아제에 추가되는 것으로 이해된다. 이들 추가 성분의 정확한 성질, 및 그의 혼입 수준은 사용될 조성물의 물리적 형태 및 세정 조작 성질에 따라 다르다. 적합한 보조 물질에는 제한 없이, 계면활성제, 세척 강화제, 킬레이트화제, 염료 이동 억제제, 증착 보조제, 분산제, 추가 효소, 및 효소 안정화제, 촉매 물질, 표백 활성화제, 표백 증강제, 과산화수소, 과산화수소 공급원, 기성의 과산 (preformed peracid), 중합체성 분산제, 방오제/방오 재증착방지제, 발광제, 거품 억제제, 염료, 방향제, 구조 탄성화제, 섬유 유연제, 담체, 굴수성 유발물질, 가공 보조제 및/또는 안료가 포함된다. 본원에 분명히 제공된 것들 외에도, 추가의 예가 당업계에 알려져 있다 (예를 들어, 미국 특허 제 5,576,282 호, 제 6,306,812 B1 호 및 제 6,326,348 B1 호 참조). 일부 구현예에서, 상술한 보조 성분은 본 발명의 세정 조성물의 균형을 구성한다.
계면활성제 - 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 하나 이상의 계면활성제 또는 계면활성제계를 포함하고, 여기서, 상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양친매성 계면활성제, 쯔비터이온성 계면활성제, 준-극성 비이온성 계면활성제, 및 그의 혼합으로부터 선택된다. 일부 낮은 pH 의 세정 조성물 (예를 들어, 순 pH 가 약 3 내지 약 5 인 조성물) 구현예에서, 상기 조성물은 전형적으로 알킬 에폭시화된 술페이트를 함유하지 않는데, 그 이유는 상기 계면활성제가 상기 조성물 산성 함량에 의해 가수분해될 수 있는 것으로 믿어지기 때문이다.
일부 구현예에서, 계면활성제는 세정 조성물의 약 0.1 중량% 내지 약 60 중량% 의 수준으로 존재하며, 한편 대안의 구현예에서, 상기 수준은 세정 조성물의 약 1 중량% 내지 약 50 중량% 이며, 한편, 더욱 추가의 구현예에서, 상기 수준은 세정 조성물의 약 5 중량% 내지 약 40 중량% 이다.
세척 강화제 - 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 하나 이상의 세제 세척 강화제 또는 세척 강화제계를 포함한다. 하나 이상의 세척 강화제를 혼입하는 일부 구현예에서, 세정 조성물은 세정 조성물의 약 1 중량% 이상, 약 3 중량% 내지 약 60 중량%, 또는 심지어 약 5 중량% 내지 약 40 중량% 의 세척 강화제를 포함한다.
세척 강화제에는 폴리포스페이트, 알칼리 금속 실리케이트, 알칼리 토금속 및 알칼리 금속 카르보네이트, 알루미노실리케이트 세척 강화제 폴리카르복실화 화합물, 에테르 히드록시폴리카르복실레이트, 말레산 무수물과 에틸렌 또는 비닐 메틸 에테르와의 공중합체, 1,3,5-트리히드록시 벤젠-2,4,6-트리술폰산, 및 카르복시메틸옥시숙신산의 알칼리 금속, 암모늄 및 알카놀암모늄염, 에틸렌디아민 테트라아세트산 및 니트릴로트리아세트산과 같은 폴리아세트산, 뿐만 아니라 멜리트산, 숙신산, 시트르산, 옥시디숙신산, 폴리말레산, 벤젠 1,3,5-트리카르복실산, 카르복시메틸옥시숙신산과 같은 폴리카르복실레이트의 다양한 알칼리 금속, 암모늄 및 치환 암모늄염, 및 그의 용해성 염이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 실제로, 임의의 적합한 세척 강화제가 본 발명의 다양한 구현예에서 사용될 것으로 생각된다.
킬레이트화제 - 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 하나 이상의 킬레이트화제를 함유한다. 적합한 킬레이트화제에는 구리, 철 및/또는 망간 킬레이트화제 및 그의 혼합물이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 하나 이상의 킬레이트화제가 사용되는 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 목적 세정 조성물의 약 0.1 중량% 내지 약 15 중량% 또는 심지어 약 3.0 중량% 내지 약 10 중량% 의 킬레이트화제를 포함한다.
증착 보조제 - 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 하나 이상의 증착 보조제를 포함한다. 적합한 증착 보조제에는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리카르복실레이트, 방오 중합체 예컨대 폴리테레프탈산, 클레이 예컨대 카올리나이트, 몬모릴로나이트, 아타풀가이트, 일라이트, 벤토나이트, 할로이사이트, 및 그의 혼합물이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
염료 이동 억제제 - 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 하나 이상의 염료 이동 억제제를 포함한다. 적합한 중합체성 염료 이동 억제제에는 폴리비닐피롤리돈 중합체, 폴리아민 N-옥시드 중합체, N-비닐피롤리돈 및 N-비닐이미다졸의 공중합체, 폴리비닐옥사졸리돈 및 폴리비닐이미다졸 또는 그의 혼합물이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
하나 이상의 염료 이동 억제제가 사용되는 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 세정 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량%, 또는 심지어 약 0.1 중량% 내지 약 3 중량% 의 염료 이동 억제제를 포함한다.
분산제 - 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 하나 이상의 분산제를 함유한다. 적합한 수용성 유기 분산제 물질에는 단독- 또는 공-중합체성 산 또는 그의 염이 포함되나 이에 제한되지 않으며, 여기서, 폴리카르복실산은 2 개 이하의 탄소 원자에 의해 서로 분리되는 2 개 이상의 카르복실 라디칼을 포함한다.
효소 - 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 세정 성능 및/또는 직물 케어 이점을 제공하는 하나 이상의 세제 효소를 포함한다. 적합한 효소의 예에는 헤미셀룰라아제, 퍼옥시다제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 포스포리파아제, 에스터라아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 케라티나아제, 환원효소, 산화효소, 페놀옥시다아제, 리폭시게나아제, 리그니나아제, 풀룰라나아제, 타나아제, 펜토사나아제, 말라나아제, β-글루카나아제, 아라비노시다아제, 히알루로니다아제, 콘드로이티나아제, 락카아제 및 아밀라아제 또는 그의 혼합물이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 프로테아제, 리파아제, 큐티나아제 및/또는 셀룰라아제와 함께 아밀라아제와 같은 통상적으로 이용가능한 효소를 포함하는 효소의 조합물 (즉, "혼화물") 이 사용된다.
효소 안정화제 - 본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 세제 제제에서 사용되는 효소는 안정화된다. 효소 안정화를 위한 다양한 기술이 본 발명에서 사용될 것으로 생각된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에서 적용되는 효소는 효소에 아연 (II), 칼슘 (II) 및/또는 마그네슘 (II) 이온, 뿐만 아니라 다른 금속 이온 (예를 들어, 바륨 (II), 스칸듐 (II), 철 (II), 망간 (II), 알루미늄 (III), 주석 (II), 코발트 (II), 구리 (II), 니켈 (II), 및 옥소바나듐 (IV)) 을 제공하는 완성된 조성물에서 아연 (II), 칼슘 (II) 및/또는 마그네슘 (II) 이온의 수용성 공급원이 존재함으로써 안정화된다.
촉매성 금속 착체 - 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 하나 이상의 촉매성 금속 착체를 함유한다. 일부 구현예에서, 금속-함유 표백 촉매가 사용된다. 일부 바람직한 구현예에서, 금속 표백 촉매는 정의된 표백 촉매 활성의 전이 금속 양이온 (예를 들어, 구리, 철, 티탄, 루테늄, 텅스텐, 몰리브덴, 또는 망간 양이온), 표백 촉매 활성이 거의 없거나 아예 없는 보조 금속 양이온 (예를 들어, 아연 또는 알루미늄 양이온), 및 촉매적 및 보조 금속 양이온에 대한 정의된 안정성 상수를 갖는 시퀘스트레이트 (sequestrate) 를 포함하는 촉매계를 포함하고, 특히 에틸렌디아민테트라아세트산, 에틸렌디아민테트라 (메틸렌포스폰산) 및 그의 수용성 염이 사용된다 (예를 들어, U.S. 4,430,243 참조).
일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 망간 화합물에 의해 촉매화된다. 상기 화합물 및 사용 수준은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, U.S. 5,576,282 참조).
추가의 구현예에서, 코발트 표백 촉매가 본 발명의 세정 조성물에서 사용된다. 다양한 코발트 표백 촉매가 당업계에 알려져 있다 (예를 들어, U.S. 5,597,936, 및 U.S. 5,595,967 참조). 상기 코발트 촉매는 공지된 과정에 의해 쉽게 제조된다 (예를 들어, U.S. 5,597,936, 및 U.S. 5,595,967 참조).
추가의 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 마크로폴리시클릭 강성 리간드 (macropolycyclic rigid ligand, "MRL") 의 전이 금속 착체를 포함한다. 실제적인 문제로서, 그리고 제한 없이, 일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 조성물 및 세정 방법은 수성 세정 매질에서 활성 MRL 종을 대략 1 백만분율 (ppm) 이상 제공하도록 조정되고, 일부 바람직한 구현예에서, 약 0.005 ppm 내지 약 25 ppm, 더욱 바람직하게는 약 0.05 ppm 내지 약 10 ppm, 및 가장 바람직하게는 약 0.1 ppm 내지 약 5 ppm 의 MRL 을 세정액에 제공하도록 조정된다.
본 발명의 전이-금속 표백 촉매 내 바람직한 전이-금속에는 망간, 철 및 크롬이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 바람직한 MRL 에는 또한, 교차-가교되는 특수한 초강성 리간드가 포함되나 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, 5,12-디에틸-1,5,8,12-테트라아자비시클로[6.6.2]헥사데칸). 적합한 전이 금속 MRL 은 공지된 과정에 의해 쉽게 제조된다 (예를 들어, WO 00/32601, 및 U.S. 6,225,464 참조).
세정 조성물의 제조 방법 및 사용 방법
본 발명의 세정 조성물은 임의의 적합한 형태로 제형되고 제형자에 의해 선택된 임의의 적합한 방법에 의해 제조된다 (예를 들어, U.S. 5,879.584, U.S. 5,691,297, U.S. 5,574,005, U.S. 5,569,645, U.S. 5,565,422, U.S. 5,516,448, U.S. 5,489,392, U.S. 5,486,303, U.S. 4,515,705, U.S. 4,537,706, U.S. 4,515,707, U.S. 4,550,862, U.S. 4,561,998, U.S. 4,597,898, U.S. 4,968,451, U.S. 5,565,145, U.S. 5,929,022, U.S. 6,294,514, 및 U.S. 6,376,445 를 참조하고, 이 모든 것은 일부 비-제한적 예를 위해 참조로서 본원에 삽입됨).
사용 방법
바람직한 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 세정 표면 및/또는 직물에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 표면 및/또는 직물의 적어도 일부를 순수한 형태의 또는 세정액 내에 희석된 상태의 하나 이상의 구현예의 본 발명의 세정 조성물과 접촉시킨 다음, 상기 표면 및/또는 직물을 임의로 세정 및/또는 헹군다. 본 발명의 목적을 위해, "세정" 에는 문지르기 및 기계적 진탕이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 직물은 정상적인 소비자 사용 조건에서 세탁될 수 있는 임의의 직물을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 용액 내에서 약 500 ppm 내지 약 15,000 ppm 의 농도에서 용해된다. 세정 용매가 물인 일부 구현예에서, 수온은 전형적으로 약 5℃ 내지 약 90℃ 의 범위이다. 직물 세정을 위한 일부 바람직한 구현예에서, 물 대 직물 질량비는 전형적으로 약 1:1 내지 약 30:1 의 범위이다.
실험부
하기의 실시예들은 본 발명의 특정 바람직한 구현예 및 측면을 증명 및 추가 설명하기 위해 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
이어지는 실험 개시에서는, 하기의 약어를 적용한다: ℃ (섭씨 온도); rpm (분 당 회전수); H2O (물); HCl (염산); aa 및 AA (아미노산); bp (염기쌍); kb (킬로베이스 쌍); kD (킬로달톤); gm (그램); μg 및 ug (마이크로그램); mg (밀리그램); ng (나노그램); μl 및 ul (마이크로리터); ml (밀리리터); mm (밀리미터); nm (나노미터); μm 및 um (마이크로미터); M (몰농도); mM (밀리몰농도); μM 및 uM (마이크로몰농도); U (유닛); V (볼트); MW (분자량); sec (초); min(s) (분); hr(s) (시간); MgCl2 (염화마그네슘); NaCl (염화나트륨); OD280 (280 nm 에서의 광학 밀도); OD405 (405 nm 에서의 광학 밀도); OD600 (600 nm 에서의 광학 밀도); PAGE (폴리아크릴아미드 겔 전기영동); EtOH (에탄올); PBS (포스페이트 완충 식염수 [150 mM NaCl, 10 mM 인산나트륨 완충제, pH 7.2]); LAS (라우릴 나트륨 술포네이트); SDS (나트륨 도데실 설페이트); Tris (트리스(히드록시메틸)아미노메탄); TAED (N,N,N'N'-테트라아세틸에틸렌디아민); BES (폴리에스테르술폰); MES (2-모르폴리노에탄올술폰산, 모노히드레이트; f.w. 195.24; Sigma # M-3671); CaCl2 (염화칼슘, 무수물; f.w. 110.99; Sigma # C-4901); DMF (N,N-디메틸포름아미드, f.w. 73.09, d = 0.95); Abz-AGLA-Nba (2-아미노벤조일-L-알라닐-글리실-L-류실-L-알라니노-4-니트로벤질아미드, f.w. 583.65; Bachem # H-6675, VWR 카탈로그 # 100040-598); SBG1 % ("글루코오스가 있는 수퍼 브로쓰"; 6 g Soytone [Difco], 3 g 효소 추출물, 6 g NaCl, 6 g 글루코오스); 당업계에 공지된 방법을 이용해 멸균하기 전에 NaOH 를 사용해 pH 를 7.1 로 조정; w/v (중량 대 부피); v/v (부피 대 부피); Npr 및 npr (중성 메탈로프로테아제); SEQUEST® (SEQUEST 데이터베이스 검색 프로그램, University of Washington); MS (질량분광계); BMI (혈액, 우유, 잉크); SRI (얼룩 제거 지수; Strain Removal Index); Npr 및 npr (중성 메탈로프로테아제 유전자); NprE 및 nprE (바실러스 아밀로리퀘파시엔스 중성 메탈로프로테아제); PMN (정제된 MULTIFECT® 메탈로프로테아제); 및 Quint (S129I-F130L-M138L-V190I-D220P 5중 NprE 변이체).
하기의 약어들은, 해당 제품 또는 서비스가 실험 실시예에서 인용되는 회사에 적용된다: TIGR (The Institute for Genomic Research, Rockville, MD); AATCC (American Association of Textile and Coloring Chemists); Amersham (Amersham Life Science, Inc. Arlington Heights, IL); Corning (Corning International, Corning, NY); ICN (ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA); Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL); Equest (Equest, Warwick International Group, Inc., Flintshire, UK); EMPA (Eidgenossische Material Prufungs und Versuch Anstalt, St. Gallen, Switzerland); CFT (Center for Test Materials, Vlaardingen, The Netherlands); Amicon (Amicon, Inc., Beverly, MA); ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA); Becton Dickinson (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ); Perkin-Elmer (Perkin-Elmer, Wellesley, MA); Rainin (Rainin Instrument, LLC, Woburn, MA); Eppendorf (Eppendorf AG, Hamburg, Germany); Waters (Waters, Inc., Milford, MA); Geneart (Geneart GmbH, Regensburg, Germany); Perseptive Biosystems (Perseptive Biosystems, Ramsey, MN); Molecular Probes (Molecular Probes, Eugene, OR); BioRad (BioRad, Richmond, CA); Clontech (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA); Cargill (Cargill, Inc., Minneapolis, MN); Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI); GIBCO BRL or Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD); New Brunswick (New Brunswick Scientific Company, Inc., Edison, NJ); Thermoelectron (Thermoelectron Corp., Waltham, MA); BMG (BMG Labtech, GmbH, Offenburg, Germany) ;Greiner (Greiner Bio-One, Kremsmuenster, Austria); Novagen (Novagen, Inc., Madison, WI); Novex (Novex, San Diego, CA); Finnzymes (Finnzymes OY, Finland) Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA); Invitrogen (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); DuPont Instruments (Asheville, NY); Global Medical Instrumentation or GMI (Global Medical Instrumentation; Ramsey, MN); MJ Research (MJ Research, Waltham, MA); Infors (Infors AG, Bottmingen, Switzerland); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); Roche (Hoffmann La Roche, Inc., Nutley, NJ); Agilent (Agilent Technologies, Palo Alto, CA); S-Matrix (S-Matrix Corp., Eureka, CA); US Testing (United States Testing Co., Hoboken, NY); West Coast Analytical Services (West Coast Analytical Services, Inc., Santa Fe Springs, CA); Ion Beam Analysis Laboratory (Ion Bean Analysis Laboratory, The University of Surrey Ion Beam Centre (Guildford, UK); TOM (Terg-o-Meter); BaChem (BaChem AG, Bubendorf, Switzerland); Molecular Devices (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA); Corning (Corning International, Corning, NY); MicroCal (Microcal, Inc., Northhampton, MA); Chemical Computing (Chemical Computing Corp., Montreal, Canada); NCBI (National Center for Biotechnology Information); Argo Bioanalytica (Argo Bioanalytica. Inc, New Jersey); Vydac (Grace Vydac, Hesperia, CA); Minolta (Konica Minolta, Ramsey, NJ); 및 Zeiss (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY).
하기 서열이 본 발명에서 사용될 수 있고, 본 발명에 의해 제공된다.
실시예 1
어세이
하기의 어세이를 하기에 기재하는 실시예 또는 재조합성 프로테아제의 기타 분석에 이용했다. 하기에 제공되는 프로토콜로부터 임의의 일탈은 실시예에서 나타냈다. 해당 실험에서, 반응 완료 후 형성되는 생성물의 흡광도를 측정하기 위해 분광광도계를 이용했다. 견본의 반사율을 측정하기 위해 반사율측정기를 이용했다.
A. 단백질 함량 측정
1. 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (MTP) 에서의 단백질 함량 측정을 위한 BCA (비시코닌산) 어세이
본 어세이에서, MTP 스케일에서의 프로테아제 샘플에서 단백질 농도 측정을 위해 BCA (Pierce) 어세이를 이용했다. 본 어세이 시스템에서, 사용한 화학약품 및 시약 용액은 하기와 같았다: BCA 단백질 어세이 시약, 및 Pierce 희석 완충제 (50 mM MES, pH 6.5, 2mM CaCl2, 0.005% TWEEN
-80). 사용 장비는 SpectraMAX (유형 340) MTP 판독기였다. MTP 는 Costar (유형 9017) 로부터 입수했다.
테스트에서, 200 μl BCA 시약을 각각의 웰에 파이펫팅한 후, 20 μl 의 희석된 단백질을 후속했다. 완전한 혼합 후, MTP 를 37℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션했다. 가능한 한 공기방울을 제거하고, 웰 내 용액의 광학 밀도 (OD) 를 562 nm 에서 판독했다. 단백질 농도 측정을 위해, 샘플 판독값으로부터 배경 판독값을 차감했다. 단백질 표준 (정제된 프로테아제) 에 대한 OD562 의 그래프를 그려 표준 곡선을 제작했다. 샘플의 단백질 농도는 표준 곡선으로부터 외삽했다.
2. 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (MTP) 에서의 단백질 함량 측정을 위한 브래드포드 어세이
본 어세이에서, MTP 스케일의 프로테아제 샘플에서 단백질 농도를 측정하기 위해 브래드포드 염료 시약 (Quick Start) 어세이를 이용했다. 본 어세이 시스템에서, 화학약품 및 시약 용액은 하기와 같았다: Quick Start 브래드포드 염료 시약 (BIO-RAD 카탈로그 번호 500-0205), 희석 완충제 (1OmM NaCl, O.1 mM CaCl2, 0.005% TWEEN
-80). 사용한 장비는 Biomek FX Robot (Beckman) 및 SpectraMAX (type 340) MTP 판독기였다. MTP 는 Costar (type 9017) 로부터 입수했다.
테스트에서, 200 μl 브래드포드 염료 시약을 각각의 웰에 파이펫팅한 후, 15 μl 희석 완충제를 후속했다. 최종적으로 10 μl 의 여과된 배양 브로쓰를 웰에 첨가했다. 완전한 혼합 후, MTP 를 실온에서 10 분 이상 인큐베이션했다. 가능한 한 공기방울을 날려보내고, 웰의 OD 를 595 nm 에서 판독했다. 단백질 농도 측정을 위해, 시약 판독값에서 배경 판독값 (즉, 비접종 웰) 을 차감했다. 수득한 OD595 값은 샘플 내 단백질 함량의 상대적인 측정값을 제공한다.
B. 단백분해 활성에 대한 시트레이트 안정성 어세이
100 mM 시트레이트의 존재 하에 야생형 NprE 및 변이체를 인큐베이션한 후 시트레이트 안정성을 측정하였다. DMC 가수분해 어세이를 이용해 초기 및 잔여 활성을 측정하였다. 상기 어세이 시스템에서, 사용된 화학물질 및 시약 용액은 하기와 같았다 :
시트르산 모노히드레이트 Merck 1.00244
Pipes (산 무 (無)) Sigma P-1851
Tris (산 무 (無)) Sigma T- 1378
HEPES (울트라 > 99.5%) Sigma-H7523
TWEEN®-80 Sigma P-8074
디메틸카제인 (DMC) Sigma C-9801
Tris 완충제 (산 무 (無)) 1000 ml 물에 6.04 g 용해시킨 것 (=50 mM)
HEPES 완충제 1000 ml 물에 11.9 g 용해시킨 것 (=50 mM)
시트레이트 완충제(산 무 (無))1000 ml 물에 21.0 g 용해시킨 것 (=100 mM),
PIPES 완충제 (산 무 (無)) 약 960 ml 물에 3.32 g 용해시킨 것,
DMC 용액 55 mM PIPES 완충제 내 1% w/v, 최종 pH = 6.0
희석 완충제 1 0.1 mM CaCl2/25 mM Tris; pH 8.2
희석 완충제 2 0.1 mM CaCl2/50 mM 시트레이트/25 mM Tris; pH8.2
이들 희석 완충제의 농도는 최종 농도로서 지시된다. 초기 농도는 희석 비율에 따라 비례하여 더 높다. 대안적인 실험에서, HEPES 는 Tris 대신에 사용될 수 있다. 사용되는 장비는 Biomek FX Robot (Beckman), 및 인큐베이터/쉐이커 (Innova, 유형 4230; New Brunswick) 였다. 4 N HCl 을 사용해 PIPES 완충제의 pH 를 5.8 로 조정하였다 (55 mM 의 최종 농도). 4 N HCl 을 사용해Tris 완충제의 pH 를 8.2 로 조정하였다 (25 mM 의 최종 농도). 4 N NaOH 를 사용해 50 mM 시트레이트/25 mM Tris 완충제의 pH 를 8.2 로 조정하였다. 4 N NaOH 를 사용해 HEPES 완충제의 pH 를 8.2 로 조정하였다 (25 mM 의 최종 농도). 4 N NaOH 를 사용해 50 mM 시트레이트/25 mM HEPES 완충제의 pH 를 8.2 로 조정하였다.
단백질 측정 및 테스트 방법
시트레이트 안정성 어세이에서 목적하는 희석 비율을 구축하기 위해, 각각의 플레이트에 대해 야생형 NprE 대조군의 프로테아제 농도를 TCA 어세이를 이용해 측정하였다. 본 방법에서, 25 μl 의 여과된 배양 브로쓰를 200 μl 16.875% (w/v) TCA 에 첨가하였다. 주위 온도에서 10 내지 15 분 동안 인큐베이션한 후, 405 nm 에서의 광 산란/흡광도를 측정하였다. 정제된 NprE 를 이용해 구축한 보정선을 이용해 단백질 농도를 측정하였다.
스트레스 조건 :
여과된 배양 브로쓰를 희석 완충제 2 로 희석하였다. MTP 를 테이프로 덮고, 수 초 간 흔들고, 25℃ 의 인큐베이터에서 200 rpm 에서 60 분 동안 두었다. 인큐베이션한 후, 20 μl 의 혼합물을 각각의 웰로부터 취하여, 180 μl 1% DMC 예열된 기질 용액 (기질을 25℃ 에서 예열시킴) 이 든 새 MTP 로 옮겼다. 상기 MTP 를 인큐베이터/쉐이커에 바로 두고, 25℃ 에서 200 rpm 에서 진탕하면서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 하기 기술되는 바와 같이, 잔여 프로테아제 활성을 디메틸카제인 가수분해 어세이를 이용해 측정하였다.
비-스트레스 조건
여과된 배양 브로쓰를 희석 완충제 1 과 희석하였다. 즉시, 20 μl 의 혼합물을 각각의 웰에서 취하고, 180 μl 의 예열된 1% DMC 기질 용액 (기질을 25℃ 에서 예열시킴) 이 든 새 MTP 에 옮겼다. 상기 MTP 를 인큐베이터/쉐이커에 바로 두고, 25℃ 에서 200 rpm 에서 진탕하면서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 하기 기술되는 바와 같이, 초기 프로테아제 활성을 디메틸카제인 가수분해 어세이를 이용해 TNBS 로서 측정하였다.
모든 잔여 활성값 (디메틸카제인 가수분해 어세이를 이용해 측정됨) 을 하기 방정식을 이용해 계산하였다.
% 잔여 활성 = OD60분 값 * 100/OD00분 값
C. 디메틸카제인 (DMC) 가수분해 어세이
이 어세이 시스템에서, 사용된 화학 약품 및 시약 용액은 하기와 같았다:
디메틸카제인 (DMC): Sigma C-9801
TWEEN®-80: Sigma P-8074
PIPES 완충제 (산 무(無)): Sigma P-1851; 15.1 g 을 약 960 ㎖ 물에 용해
시킨다; 4N NaOH 로 pH 를 6.0 으로 조정한다:
1 ㎖ 5% TWEEN®-80 을 첨가하고, 부피가 1000
㎖ 이 되게 한다. PIPES 및 TWEEN®-80 의
최종 농도는 각각 50 mM 및 0.005% 이다.
피크릴술폰산 (TNBS): Sigma P-2297 (수 중 5% 용액)
시약 A: 45.4 g Na2B4O7.10 H2O (Merck 6308) 및 15
㎖ 의 4N NaOH 를 함께 용해시켜 최종 부피
가 1000 ㎖ 이 되게 한다 (필요시 가열함)
시약 B: 35.2 g NaH2PO4.1H2O (Merck 6346) 및 0.6 g
Na2SO3 (Merck 6657) 를 함께 용해시켜 최종
부피가 1000 ㎖ 가 되게 한다.
방법:
상기 기질을 제조하기 위하여, 4 g 디메틸카제인을 400 ㎖ PIPES 완충제 중에 용해시켰다. 여과된 배양 상청액을 PIPES 완충제로 희석시켰다. 그 후, 각 희석된 상청액 10 ㎕ 를 MTP 웰 내의 200 ㎕ 기질에 첨가하였다. 상기 MTP 플레이트를 테이프로 덮고, 수 초간 진탕한 후, 25℃ 의 오븐에 교반없이 30 분 동안 두었다. 상기 오븐에서 첫번째 플레이트를 꺼내기 약 15 분 전에, 시약 A 50 ㎖ 당 1 ㎖ TNBS 용액을 혼합하여 TNBS 시약을 제조하였다. MTP 를 웰 당 60 ㎕ TNBS 시약 A 로 채웠다. 인큐베이션한 플레이트를 수 초간 진탕하고, 그 후 10 ㎕ 를 TNBS 시약 A 가 있는 MTP 로 옮겼다. 상기 플레이트들을 테이프로 덮고, 실온의 벤치 쉐이커 (BMG Thermostar) 에서 500 rpm 으로 20 분간 진탕하였다. 마지막으로, 각 웰에 200 ㎕ 시약 B 를 첨가하고, 쉐이커로 1 분간 혼합한 후, MTP-판독기를 이용하여 405 nm 에서의 흡광도를 측정하였다.
수득한 흡광도 값을 바닥값 (효소 부재 하의 기질) 에 대하여 보정하였다. 결과의 흡광도는 가수분해 활성에 대한 측정치이다. 상기 흡광도 및 측정된 단백질 농도를 나누어, 샘플의 (임의의) 특이적 활성을 계산하였다.
D. 2-아미노벤조일-L-알라닐글리실-L-류실-L-알라니노-4-니트로벤질아미드 프로테아제 어세이 (Abz-AGLA-Nba)
하기 제공되는 방법은 시간 및 장소와는 상관 없이, 재현가능한 프로테아제 어세이 데이터를 제공하는 소정 정의 기술적인 설명을 제공한다. 상기 어세이가 주어진 실험실 조건에 맞추어질 수 있는 한편, 변형된 과정을 통해 수득된 임의의 데이터는 원래의 방법에 의해 만들어지는 결과와 일치되어야 할 것이다. 중성 메탈로프로테아제는 2-아미노벤조일-L-알라닐글리실-L-류실-L-알라니노-4-니트로벤질아미드 (Abz-AGLA-Nba) 의 글리신 및 류신 사이의 펩티드 결합을 절단한다. 용액 내 자유 2-아미노벤조일-L-알라닐글리신 (Abz-AG) 은 415 nm 에서 형광 방출 최대값을 가지고, 340 nm 에서 여기 최대값을 갖는다. Abz-AG 의 형광은 본래의 Abz-AGLA-Nba 분자에서 니트로벤질아미드에 의해 켄칭 (quench) 된다.
이들 실험에서, Abz-AGLA-Nba 의 프로테아제 절단에 의한 Abz-AG 의 유리를 형광 스펙트럼에 의해 모니터링하였다 (여기 = 340 nm/방출 = 415 nm). Abz-AG 의 출현 속도는 단백분해 활성의 측정값이었다. 어세이는 비-기질 제한된 초기 속도 조건 하에 수행하였다.
온도 조절기가 있는 마이크로플레이트 혼합기 (예를 들어, Eppendorf Thermomixer) 는 재현가능한 어세이 결과에 필요하였다. 효소 첨가 전에, 마이크로플레이트 혼합기에서 어세이 용액을 목적하는 온도 (예를 들어, 25℃) 로 인큐베이션시켰다. 효소 용액을 혼합기에서 플레이트에 첨가하고, 격렬하게 혼합하고, 빨리 플레이트 판독기에 옮겼다.
지속적인 데이터 기록, 선형 회귀 분석, 및 온도 조절 가능성이 있는 스펙트럼 형광계 (예를 들어, SpectraMax M5, Gemini EM (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)) 가 필요하였다. 판독기를 항상 목적하는 온도 (예를 들어, 25℃) 에서 유지시켰다. 판독기를 상부-판독 형광 검출을 위해 세팅하였고, 컷-오프 필터를 사용하지 않고, 여기를 350 nm 로 세팅하고, 방출을 415 nm 로 세팅하였다. PMT 를 중간 민감도 및 웰 당 5 회의 판독으로 세팅하였다. 자동보정이 켜졌고, 뿐만 아니라, 처음의 판독 전에 보정이 이루어졌다. 상기 어세이는 모니터링될 것으로 선택된 웰의 수에 따라 최소화된 판독 간격으로 3 분 동안 측정하였다. 밀리-RFU/분 (분 당 상대적인 형광 유닛의 1/1000) 의 속도를 계산하도록 판독기를 세팅하였다. 속도를 계산하기 위해 사용된 판독기의 수 (V최대 점) 를, 판독 간격에 의해 측정되는 바와 같이, 2 분에 상응하는 수로 세팅하였다 (예를 들어, 매 10 초 당의 판독은 12 개의 점을 사용하여 속도를 계산할 것임). 최대 RFU 는 50,000 으로 세팅하였다.
효소 및 기질 원액 용액의 모든 파이펫팅은 포지티브 교환형 피펫 (positive displacement pipet) (Rainin Microman) 을 사용하였다. 완충제, 어세이, 및 효소 작동 용액을 튜브, 시약 보관병 또는 원액 마이크로플레이트에서 단일 또는 다중-채널 공기-교환형 피펫 (Rainin LTS) 에 의해 파이펫팅하였다. 반복 피펫 (repeater pipet, Eppendorf) 을 사용하여, 웰이 거의 사용되지 않는 경우 어세이 용액을 마이크로플레이트 웰에 옮겨서, 시약 손실을 최소화할 수 있다. 자동화된 파이펫팅 기구 예컨대 Beckman FX 또는 Cybio Cybi-웰을 또한 사용하여, 효소 용액을 작업 원액 마이크로플레이트에서 어세이 마이크로플레이트로 옮겨서, 전체 마이크로플레이트를 한번에 시작할 수 있다.
시약 및 용액 :
52.6 mM MES/NaOH, 2.6 mM CaCl
2
, pH 6.5 - MES 완충제
MES 산 (10.28 g) 및 292 mg 무수 CaCl2 를 대략 90O mL 의 정제수에서 용해시켰다. 상기 용액을 NaOH 를 사용해 pH 6.5 (25℃ 에서 또는 온도 조정 pH 프로브 사용) 로 적정하였다. pH-조정된 완충제의 총 부피를 1 L 가 되게 하였다. 최종 용액을 0.22 μm 멸균 필터를 통해 여과하고, 실온에서 보관하였다.
DMF 중 48 mM Abz-AGLA-Nba: Abz-AGLA-Nba 원액
대략 28 mg 의 Abz-AGLA-Nba 를 작은 튜브에 놓았다. 이를 DMF (부피는 덩어리진 (massed) Abz-AGLA-Nba 에 따라 다양할 것임) 에서 용해시키고, 수 분 동안 와동시켰다. 상기 용액을 빛이 차단된 실온에서 보관하였다.
50 mM MES, 2.5 mM CaCl
2
, 5% DMF, 2.4 mM Abz-AGLA-Nba pH 6.5 - 어세이 용액
1 mL 의 Abz-AGLA-Nba 원액을 19 mL 의 MES 완충제에 첨가하고 와동시켰다. 용액을 빛을 차단한 채 실온에서 저장했다.
50 mM MES, 2.5 mM CaCl
2
, pH 6.5 - 효소 희석 완충제
5 mL 의 정제수를 95 mL 원액 MES 완충제에 첨가하여 상기 완충제를 제조하였다.
50 mM MES, 2.5 mM CaCl
2
, 5% DMF, pH 6.5 - 기질 희석 완충제
5 mL 의 순수한 DMF 를 95 mL 의 원액 MES 완충제에 첨가하였다. 상기 완충제를 사용하여 반응속도 파라미터를 측정하였다.
효소 용액
효소 원액 용액을 효소 희석 완충제와 희석시켜, 대략 1 ppm (1 μg/mL) 의 농도로 되게 하였다. MULTIFECT® 중성 메탈로프로테아제 (야생형 NprE) 를 6 ppm (6 μg/mL) 미만의 농도로 희석시켰다. 단계 희석이 바람직하였다. 상기 용액은 실온에서 1 시간 동안 안정하였으나, 더 장기간의 보관을 위해서 용액을 얼음 상에서 유지하였다.
과정
우선, 모든 완충제, 원액, 및 작업 용액을 제조하였다. 달리 언급되지 않는 한, 각각의 효소 희석물을 삼중으로 어세이하였다. 완전히 채워지지 않는 경우, 효소 작업 용액 원액 마이크로플레이트를 플레이트의 좌측에서 출발하는 전체 수직 칼럼에 배치하였다 (플레이트 판독기에 놔두기 위해). 상응하는 어세이 플레이트를 유사하게 세팅하였다. 마이크로플레이트 스펙트럼형광계를 이전에 기술된 바와 같이 세팅하였다.
우선, 어세이 용액 중 200 μL 의 분취물을 96-웰 마이크로플레이트의 웰에 놓았다. 플레이트를 빛이 차단된 채 온도 조절된 마이크로플레이트 혼합기에서 25℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션시켰다. 원액 마이크로플레이트에서 10 μL 의 작업 효소 용액을 혼합기 내 어세이 마이크로플레이트에 옮김으로써 어세이를 시작하였다. 최적으로는, 96-웰 파이펫팅 헤드를 사용하였거나, 또는 8-웰 멀티-채널 피펫을 사용하여, 좌측-근접 칼럼에서부터 우선 옮겼다. 용액을 15 초 동안 격렬히 혼합하였다 (Eppendorf Thermomixer 에서 900 rpm). 즉시, 어세이 마이크로플레이트를 마이크로플레이트 스펙트럼형광계로 옮기고, 350 nm 의 여기 및 415 nm 의 방출에서의 형광 측정값의 기록을 시작하였다. 스펙트럼형광계 소프트웨어는 각 웰에 대한 형광의 증가의 반응 속도를 밀리-RFU/분의 선형 회귀선으로 계산하였다. 일부 구현예에서, 첫번째 플레이트를 판독하는 한편, 온도 평형을 위하여 두번째 플레이트를 마이크로플레이트 혼합기에 두었다.
초기 개시 속도는 0.3 mM 생성물 이하의 생성물 농도 (즉, 유리된 2-아미노벤조일 형광) 에 대해 선형이었으며, 이는 대략 22,000 RFU 의 배경 형광이 있는 2.3 mM Abz-AGLA-Nba 에서 출발한 용액에서 대략 50,000 RFU 에 상응하였다. Abz-AGLA-Nba 를 DMF 에 용해시키고, 이를 제조한 날에 사용했다.
실시예 2
바실러스 서브틸리스에서의 NprE 프로테아제 제조
본 실시예에서는, 바실러스 서브틸리스에서 NprE 프로테아제를 제조하기 위해 수행한 실험들을 기재한다. 특히, 플라스미드 pUBnprE 를 바실러스 서브틸리스로 형질전환하기 위해 사용한 방법이 제공된다. 형질전환은 당업계에 공지된 바와 같이 수행했다 (참고문헌은, 예를 들어 WO 2002/014490 및 WO 2007/044993, 이들은 모두 참고문헌으로 포함). 하기에 제공된 DNA 서열 (바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (B. 아밀로리퀘파시엔스) 유래의 nprE 리더, nprE 프로 및 nprE 성숙 DNA 서열) 은 NprE 전구체 단백질을 암호화한다 :
상기 서열에서, 굵은 글자는 성숙 NprE 프로테아제를 암호화하는 DNA 를 나타내며, 표준 폰트는 리더 서열 (nprE 리더) 을 나타내며, 밑줄친 것은 프로서열 (nprE 프로) 을 나타낸다. 아미노산 서열 (NprE 리더, NprE 프로 및 NprE 성숙형 DNA 서열) 은 하기에 제공하며 (SEQ ID NO: 2), 이는 전장 NprE 전구체 단백질에 해당한다. 이 서열에서, 밑줄은 프로 서열을, 굵은 글자는 성숙 NprE 프로테아제를 나타낸다.
성숙 NprE 서열은 SEQ ID NO: 3 으로 나타낸다. 상기 서열은 본원에 기재된 변이체 라이브러리 제조에 대한 기본으로 이용했다.
pUBnprE 발현 벡터는, 두가지 특이적 프라이머를 이용하는 PCR 에 의해, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스의 염색체 DNA 유래의 nprE 유전자를 증폭시켜 구축했다:
PCR 은 Phusion High Fidelity DNA 중합효소 (Finnzymes Phusion) 를 이용하여 열순환기 상에서 수행했다. PCR 혼합물은 10 μl 5x 완충제 (Finnzymes Phusion), 1 μl 1O mM dNTP's, 1.5 μl DMSO, 1 μl 의 각 프라이머, 1 μl Finnzymes Phusion DNA 중합효소, 1 μl 염색체 DNA 용액 50 ng/μl, 34.5 μl MilliQ 물을 함유했다. 하기의 프로토콜을 이용했다:
PCR 프로토콜:
1) 98℃ 30 초;
2) 98℃ 10 초;
3) 55℃ 20 초;
4) 72℃ 1 분;
5) 2 내지 4 단계를 25 회 주기; 및
6) 72℃ 5 분.
이는 1.9 kb DNA 절편을 결과로 제공하며, 이를 BglII 및 BclI DNA 제한 효소를 이용하여 분해했다. 멀티카피 바실러스 벡터 pUB110 (참고문헌은, 예를 들어 Gryczan, J. Bacterid, 134:318-329, 1978) 를 BamHI 으로 분해했다. 이어서, PCR 절편 x BglII x BclI 을 pUB110 x BamHI 벡터에 연결하여, pUBnprE 발현 벡터를 형성했다.
pUBnprE 를 바실러스 서브틸리스 (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK) 균주로 형질전환했다. 바실러스 서브틸리스로의 형질전환은 WO 02/14490 에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 참고문헌으로 포함된다. pUBnprE 벡터를 갖는 바실러스 서브틸리스 형질전환체의 선택적인 성장은, 25 ml MBD 배지 (MOPS 기재의 규정 배지) 를 함유하며, 20 mg/L 네오마이신이 든 쉐이크 플라스크에서 수행했다. MBD 배지는 본질적으로 당업계에 공지된 바와 같이 제조했으며 (참고문헌은, Neidhardt 등, J Bacteriol, 119: 736-747, 1974), 단, NH4Cl2, FeSO4, 및 CaCl2 를 베이스 배지에서 배제하고, 3 mM K2HPO4 를 사용했으며, 베이스 배지에 60 mM 우레아, 75 g/L 글루코오스 및 1% 소이톤을 보충했다. 또한, 미량원소들은, 400 mg FeSO4·7H2O, 100 mg MnSO4·H2O, 100 mg ZnSO4.7H2O, 50 mg CuCl2·2H2O, 100 mg CoCl2·6H2O, 100 mg NaMoO4·2H2O, 100 mg Na2B4O7·10H2O, 10 ml 의 1M CaCl2, 및 10 ml 의 0.5 M 시트르산나트륨을 1 리터에 함유하는 100X 원액으로서 제조했다. 배양물은 인큐베이터/쉐이커 (Infors) 에서 37℃ 로 3 일 동안 인큐베이션했다. 상기 배양물은 프로테아제 어세이로 증명된 바와 같이, 그 결과로서 단백분해 활성이 있는 분비된 NprE 프로테아제를 제조했다. 겔 분석은 NuPage Novex 10% Bis-Tris 겔 (Invitrogen, 카탈로그 번호 NP0301BOX) 을 이용하여 수행했다. 분석용 샘플 제조를 위해, 2 배 부피의 상청액을 1 배 부피의 1 M HCl, 1 배 부피의 4x LDS 샘플 완충제 (Invitrogen, 카탈로그 번호 NP0007), 및 1% PMSF (20 mg/ml) 와 함께 혼합했다. 후속하여, 샘플을 70℃ 에서 10 분 동안 가열했다. 다음, 25 μL 의 각 샘플을, 10 μL 의 SeeBlue 및 2 가지의 예비염색된 단백질 표준 (Invitrogen, 카탈로그 번호 LC5925) 과 함께 겔에 로딩하였다. 그 결과, 본 실시예에 기재된 nprE 클로닝 전략이 바실러스 서브틸리스에서의 활성 NprE 제조에 적합하다는 것을 명확하게 증명했다.
실시예 3
부위 평가 라이브러리 (SEL) 의 생성
본 실시예에서는 nprE SEL 의 구축에 사용한 방법을 기재한다.
nprE SEL 의 생성 - 방법 I
상기 기재된 nprE 발현 카세트를 함유하는 pUBnprE 벡터를 주형 DNA 로 제공했다. 상기 벡터는 독특한 BglII 제한효소 부위를 포함하는데, 이는 부위 평가 라이브러리 구축에 이용했다. 간략하게, nprE 부위 평가 라이브러리 구축을 위해, 성숙 nprE DNA 서열에 관심있는 돌연변이 코돈을 도입하기 위한 2 가지의 돌연변이유발 PCR, 및 성숙형 nprE 서열에 원하는 돌연변이화 코돈을 포함하는 pUBnprE 발현 벡터 구축을 위한 2 가지 돌연변이유발 PCR 들의 융합에 이용되는 제 3 의 PCR 을 포함하는, 3 가지 PCR 반응을 수행했다.
돌연변이유발 방법은 코돈-특이적 돌연변이 접근법을 근거로 하는데, 여기서 특이적 DNA 삼중항 내에 한번에 모든 가능한 돌연변이를 전부 만들어내는 것은, 돌연변이화될 코돈의 서열에 해당하고 상기 특이적인 nprE 성숙형 코돈에서의 뉴클레오타이드의 무작위적 혼입을 보장하는 특이적으로 고안된 삼중 DNA 서열 NNS (N = A, C, T 또는 G; 및 S = C 또는 G) 를 둘러싼 길이 25 내지 45 뉴클레오타이드인 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하여 수행했다. 프라이머 명칭에 나열되는 숫자는 특이적인 nprE 성숙형 코돈 위치에 해당한다. 복수의 부위들도 포함하여 평가했다. 프라이머 서열의 예시적인 목록이 WO 2007/044993 에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참고문헌으로 포함된다.
부위 평가 라이브러리 구축에 이용했던 2 가지의 추가적인 프라이머는 BglII 제한효소 부위의 측면에 있는 pUBnprE DNA 서열의 일부와 함께 BglII 제한효소 부위를 함유하였다. 하기의 프라이머는 Invitrogen 에서 제조한 것이다 (50 nmole 스케일, 탈염):
pUB-BglII-FW 프라이머 및 특이적인 nprE 역방향 돌연변이유발 프라이머를 이용하는 2 가지 1 차적인 PCR 증폭으로 각각의 SEL 의 구축을 시작했다. 두번째PCR 에 대해, pUB-BglII-RV 프라이머 및 특이적인 nprE 정방향 돌연변이유발 프라이머 (정방향 및 역방향 돌연변이유발 프라이머에 대해 동등한 nprE 성숙형 코돈 위치) 를 사용했다.
성숙형 nprE 서열에서의 돌연변이의 도입은 Phusion High-Fidelity DNA 중합효소 (Finnzymes; 카탈로그 번호 F-530L) 를 이용하여 수행했다. 모든 PCR 은 중합효소를 공급하는 Finnzymes 프로토콜에 따라 수행했다. 1 차 PCR 을 위한 PCR 조건은 하기와 같았다:
1 차 PCR 1 :
pUB-BglII-FW 프라이머 및 특이적인 NPRE 역방향 돌연변이유발 프라이머 - 두가지 모두 1 μL (10 μM);
1 차 PCR 2:
pUB-BglII-RV 프라이머 및 특이적인 NPRE 정방향 돌연변이유발 프라이머 - 두가지 모두 1 μL (10 μM) ; 다음의 것과 함께 함
5 x Phusion HF 완충제 10 μL
10 mM dNTP 혼합물 1 μL
Phusion DNA 중합효소 0.75 μL (2 유닛/μL)
DMSO, 100% 1 μL
pUBnprE 주형 DNA 1 μL (0.1 내지 1 ng/ μL)
증류된, 오토클레이브한 물 50 μL 이하
PCR 프로그램은 다음과 같았다: 98℃ 에서 30 초, 30x (98℃ 에서 10 초, 55℃ 에서 20 초, 72℃ 에서 1.5 분) 및 72℃ 에서 5 분, PTC-200 Peltier 열적 사이클러 (MJ Research) 에서 수행함. PCR 실험은 관심있는 NprE 성숙형 코돈의 주변으로 약 30 개의 뉴클레오타이드 염기가 중첩되는 약 2 내지 3 kB 의 절편 2 개를 그 결과물로서 제공했다. 절편들은 상기 언급한 2 가지 절편들 및 정방향 및 역방향 BglII 프라이머를 이용하는 제 3 의 PCR 반응에서 융합시켰다. 융합 PCR 반응은 하기의 용액에서 수행했다:
pUB-BglII-FW 프라이머 및 pUB-BglII-RV 프라이머 - 두가지 모두 1 μL (10 μM), 하기와 함께 이용
5 x Phusion HF 완충제 10 μL
10 mM dNTP 혼합물 1 μL
Phusion DNA 중합효소 0.75 μL (2 유닛/ μL)
DMSO, 100% 1 μL
1 차 PCR 1 반응 믹스 1 μL
1 차 PCR 2 반응 믹스 1 μL
증류된, 오토클레이브한 물 50 μL 이하
PCR 융합 프로그램은 하기와 같았다: PTC-200 Peltier 열적 사이클러 (MJ Research) 에서, 98℃ 에서 30 초, 30x (98℃ 에서 10 초, 55℃ 에서 20 초, 72℃ 에서 2 분 40 초) 및 72℃ 에서 5 분.
증폭한 선형 6.5 Kb 절편은 Qiaquick PCR 정제 키트 (Qiagen, 카탈로그 번호 28106) 를 이용하여 정제하고, BglII 제한 효소로 분해하여 융합 절편의 양 말단에 점착성 (cohesive) 말단을 만들었다:
- 35 μL 정제된 선형 DNA 절편
- 4 μL REACT® 3 완충제 (Invitrogen)
- 1 μL BglII, 10 유닛/ml (Invitrogen)
반응 조건: 1 시간, 30℃.
BglII 분해되고, Qiaquick PCR 정제 키트 (Qiagen, 카탈로그 번호 28106) 를 이용해 정제된 절편을 연결하여, 원하는 돌연변이를 함유하는 환형의 다량체성 DNA 를 수득했다:
- 30 μL 의 정제된 BglII 분해 DNA 절편
- 8 μL T4 DNA 리가아제 완충제 (Invitrogen 카탈로그 번호 46300-018)
- 1 μL T4 DNA 리가아제, 1 유닛/μL (Invitrogen 카탈로그 번호 15224-017)
반응 조건: 16 내지 20 시간, 16℃.
후속하여, 연결 혼합물을 바실러스 서브틸리스 (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK) 균주로 형질전환했다. 바실러스 서브틸리스로의 형질전환은 참고문헌으로 포함되는 WO 02/14490 에 기재된 바와 같이 수행했다. 각각의 라이브러리에 대해, 96 개의 단독 콜로니를 찍어내고, 서열 분석 (BaseClear) 및 스크리닝을 목적으로 하여, 네오마이신 및 1.25 g/L 효모 추출물이 있는 MOPS 에서 배양했다. 각각의 라이브러리는 최대 19 개의 nprE 부위 특이적 변이체를 포함했다.
20 mg/L 네오마이신 및 1.25 g/L 효모 추출물이 있는 MBD 배지가 든 96 웰 MTP 에서 37℃ 에서 68 시간 동안 바실러스 서브틸리스 SEL 형질전환체를 배양하여 변이체를 제조했다.
nprE SEL 의 생성 - 방법 II
nprE SEL 을 생성하는 대안적인 방법을 또한 기재한다. 상기 방법들은 관심있는 다른 효소의 SEL 의 제조에 적합하다. 상기에서와 마찬가지로, nprE 발현 카세트를 함유하는 pUBnprE 벡터를 nprE SEL 및 NprE 변이체의 생성을 위한 주형 DNA 공급원으로서 제공했다. 두 방법 사이의 주된 차이는 본 방법이 상보적인 부위-특이적 돌연변이유발 프라이머를 이용하는 온전한 벡터의 증폭을 필요로 한다는 점에 있다.
재료:
pUBnprE 벡터를 함유하는 바실러스 균주
Qiagen 플라스미드 미디 키트 (Qiagen 카탈로그 번호 12143)
Ready-Lyse 라이소자임 (Epicentre 카탈로그 번호 R1802M)
dam 메틸라아제 키트 (New England Biolabs 카탈로그 번호 M0222L)
Zymoclean 겔 DNA 회수 키트 (Zymo Research 카탈로그 번호 D4001)
nprE 부위-특이적 돌연변이유발 프라이머, 1OO nmole 스케일, 5' 인산화, PAGE 정제 (Integrated DNA Technologies, Inc.)
QUIKCHANGE® 다중 부위-특이적 돌연변이유발 키트 (Stratagene 카탈로그 번호 200514)
MJ Research PTC-200 Peltier Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories)
1.2% 아가로스 E-겔 (Invitrogen 카탈로그 번호 G5018-01)
TempliPhi 증폭 키트 (GE Healthcare 카탈로그 번호 25-6400-10)
컴피턴트 바실러스 서브틸리스 세포 (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK)
방법:
1 개의 돌연변이를 함유하는 pUBnprE 플라스미드 (실시예 3 및 본원에 참고 문헌으로 포함되는 WO 2007/044993 에 기재된 바와 같은 nprE SEL 스크리닝을 통해 규명함) 를 수득하기 위해, 관심있는 각 바실러스 균주의 단일 콜로니를 이용해 5 ml LB + 10 ppm 네오마이신 시험관 (예를 들어, 개시자 배양) 에 접종했다. 225 rpm 에서 6 시간 동안 진탕하면서 배양물을 37℃ 에서 배양했다. 이어서, 100 ml 의 신선한 LB + 1O ppm 네오마이신을 출발 배양물 1 mL 에 접종했다. 상기 배양물을 225 rpm 로 진탕하면서 37℃ 에서 밤새 배양했다. 상기 인큐베이션 후, 세포 펠렛을 세포 펠렛 제공에 충분한 원심분리로 수합했다. 세포 펠렛을 10 ml 완충제 P1 (Qiagen 플라스미드 미디 키트) 에 재현탁시켰다. 이어서, 1O μL 의 Ready-Lyse Lysozyme 을 상기 재현탁된 세포 펠렛에 첨가하고, 37℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션했다. 증가된 부피의 세포 배양물에 맞춰 10 ml 의 완충제 P2 및 P3 를 이용하여 Qiagen 플라스미드 미디 키트 프로토콜을 계속했다. 단일 nprE 돌연변이를 포함하는 각각의 pUBnprE 플라스미드의 바실러스로부터 단리한 후, 각 플라스미드의 농도를 측정했다. 이어서, 플라스미드를 dam 메틸라아제 키트 (New England Biolabs) 를 이용하여 제조사의 지시에 따라 dam 메틸화하여, 시험관마다 약 2 μg 의 각 pUBnprE 플라스미드를 메틸화했다. Zymoclean 겔 DNA 회수 키트를 이용하여 dam-메틸화 pUBnprE 플라스미드를 정제 및 농축했다. 이어서, dam-메틸화 pUBnprE 플라스미드를 정량하고, 각각에 대해 50 ng/μl 의 작업 농도로 희석했다. 혼합된 부위-특이적 돌연변이유발 프라이머를 각각의 반응에 대해 따로 제조했다. 예를 들어, pUBnprE T14R 플라스미드를 주형 공급원으로 이용하여, 혼합된 부위-특이적 돌연변이유발 프라이머 시험관은 10 μl 의 nprE-S23R, 10 μl nprE-G24R, 10 μl nprE-N46K, 및 10 μl nprE-T54R (모든 프라이머는 각각 10 μM 임) 을 포함한다. QuikChange 다중 부위-특이적 돌연변이유발 키트 (Stratagene) 를 이용하는 PCR 반응을 제조사의 지시에 따라 수행했다 (예를 들어, 1 μl 의, 한가지 돌연변이를 포함하는 dam 메틸화 pUBnprE 플라스미드 (50 ng/μl), 2 μl nprE 부위-특이적 돌연변이유발 프라이머 (10 μM), 2.5 μl 10x QuikChange 다중 반응 완충제, 1 μl dNTP 믹스, 1 μl QuikChange 다중 효소 블렌드 (2.5U/μl), 및 17.5 μl 의 증류된, 오토클레이브한 물, 총 25 μl 의 반응 믹스를 제공함). nprE 변이체 라이브러리는 하기의 조건을 이용하여 증폭했다: 95℃, 1 분. (첫번째 주기만), 이어서, 95℃ 에서 1 분, 55℃ 에서 1 분, 65℃ 에서 13.5 분, 반복 주기 29 회. 반응 생성물은 4℃ 에서 밤새 저장했다. 이어서, 제조사의 프로토콜을 이용하여, 반응 혼합물을 DpnI 분해 처리 (QUIKCHANGE® 다중 부위-특이적 돌연변이유발 키트에서 제공) 하에 두어 부모 (parental) pUB-nprE 플라스미드를 분해했다 (즉, 1.5 μl DpnI 제한 효소를 각각의 시험관에 첨가하고, 37℃ 에서 3 시간 동안 인큐베이션; 이어서, 2 μl 의 DpnI-분해 PCR 반응물을 1.2% E-겔 상에서 분석하여 수행했던 PCR 반응을 확인하고 부모 주형이 분해되었는지 확인함). 이어서, 제조사의 프로토콜을 이용해 TempliPhi 롤링 주기 증폭으로 nprE 멀티 변이체의 라이브러리 크기 증가를 위한 대량의 DNA 를 생성하고 (즉, 약 11 μl 의 전체 반응물에 대해, 1 μl 의, DpnI 처리한 QuikChange 다중 부위-특이적 돌연변이유발 PCR, 5 μl TempliPhi 샘플 완충제, 5 μl TempliPhi 반응 완충제 및 0.2 μl TempliPhi 효소 믹스); 30℃ 에서 3 시간 동안 인큐베이션하고; 200 μl 의 증류된, 오토클레이브한 물을 첨가하고 신속하여 와동시켜 TempliPhi 반응을 희석했다. 이어서, 1.5 μl 의 희석된 TempliPhi 재료를 컴피턴트 바실러스 서브틸리스 세포에 형질전환하고, nprE 다중 변이체를, LA + 10 ppm 네오마이신 + 1.6 % 전지유 플레이트를 이용하여 선별했다. 콜로니를 찍어낸 후 서열분석하여 상이한 nprE 변이체 라이브러리 조합을 규명했다.
통합된 DNA 기법으로 돌연변이유발에 이용하는 모든 프라이머 (100 nmole 규모, 5'-인산화, 및 PAGE 정제) 를 합성했다. 평가한 부위에는 다음과 같은 것이 포함된다:
예시하는 돌연변이유발 프라이머는 참고문헌으로 포함되는 WO 2007/044993 에 기재되어 있다.
실시예 4
변이체 프로테아제의 발현, 발효 및 정제
본 실시예는 이전 실시예의 형질전환된 바실러스 서브틸리스의 프로테아제를 발현, 발효 및 정제하기 위해 사용한 방법을 기재한다.
중성 메탈로프로테아제
재조합 바실러스 서브틸리스를 영양 배지에서 통상적인 회분식 발효로 배양했다. 바실러스 서브틸리스의 글리세롤 바이알 (바실러스 아밀로리퀘파시엔스 중성 메탈로프로테아제 또는 그의 변이체를 함유) 1 개를 사용하여 200 mg/L 클로람페니콜을 함유하는 SBG 1% 배지 600 ml 을 접종했다. 배양물은 37℃ 에서 36 내지 48 시간 동안 배양했다. 대안적인 방법은, 35℃ 에서 60 시간 동안 규정된 배지 내에서 재조합 바실러스 서브틸리스를 배양하는 것을 포함하였다. 후속하여 배양액을 당업계에 공지된 바와 같이 12,000 rpm 에서의 원심분리로 회수했다 (SOR V ALL® 원심분리기 모델 RC5B). 분비된 중성 메탈로프로테아제를 배양액으로부터 단리하고, BES (폴리에테르술폰) 10 kDa 컷오프의 Amicon 필터 시스템 8400 을 이용하여 약 10 배 농축했다.
농축한 상청액을, 1 mM CaCl2 를 함유하는 25 mM MES pH5.4 완충제에 대해 4℃ 에서 밤새 투석했다. 이어서, 투석물을 양이온-교환 컬럼 Poros HS20 (총 부피가 약 83 mL 인 Applied Biosystems 컬럼; 결합 용량 약 4.5 g 단백질/mL 컬럼; 물) 에 로딩했다. 컬럼을 1 mM CaCl2 를 함유하는 25 mM MES 완충제, pH 5.4 을 사용하여 예비평형화했다. 결합한 단백질은 25 mM MES, pH 5.4, 1 mM CaCl2 부터 50 mM MES, pH 6.2, 2 mM CaCl2 및 100 mM NaCl 까지의 pH 및 염 구배를 이용하여 용출했다. 단백질의 용출은 pH 5.8 내지 6.0 에서 있었다. 순수한 단백질을 농축하고 2 mM CaCl2 을 함유하는 25 mM MES 완충제, pH 5.8 및 40% 프로필렌 글리콜로 완충-교환했다. 제제의 순도는 단백분해 활성 측정 및 10 % (w/v) NU-PAGE® Novex SDS-PAGE (Invitrogen Corp.) 으로 평가하고, 95% 를 초과하는 것으로 나타났다.
실시예 5
NprE 프로테아제의 시트레이트-유도 자가분해 부위의 규명
본 실시예에서, 야생형 및 재조합 변이체 NprE 의 시트레이트-유도 자가분해를 평가하기 위해 사용되는 방법이 기술된다. 이들 실험에서, B. 아밀로리퀘파시엔스의 중성 메탈로프로테아제 (B. 서브틸리스에서 발현되는 자연 및 재조합 변이체) 의 자가분해는 나트륨 시트레이트 (Sigma) 를 사용해 유도되었다. 자가분해 방법은 (i) 25 mM MES, pH 6.5 중 4℃ ; 또는 (ii) 5 mM HEPES pH 8.0 중 실온 중 어느 하나에서 반응을 수행함으로써 조절되었다. 이들 실험에서, 하기 중 하나를 다양하게 함으로써, 0.4 mg/ml NprE 의 자가분해를 최적화시켰다 : (a) 10 mM 시트레이트 내에서의 인큐베이션 시간 (0 ~ 120 분) ; 또는 (b) 100 분에 걸친 시트레이트 농도 (10 ~ 100 mM). 완충제 단독에서 희석된 중성 메탈로프로테아제의 대조군 (즉, 시트레이트 없음) 을 유사한 조건 하에 인큐베이션하였다. 잔여 프로테아제 활성을 합성 펩티드 (Abz-AGLA-Nba) 를 사용해 측정하고, 그 자체의 시트레이트 없는 대조군과 비교해 계산하였다.
도 1A 에서 나타낸 바와 같이, 중성 메탈로프로테아제 NprE 는 시트레이트, 약한 칼슘 킬레이터의 존재 하에 불활성화된다. 100 ~ 250 mM 시트레이트의 존재 하, 및 칼슘의 부재 하에, 야생형 중성 프로테아제의 활성은 실온에서 5 분 동안 인큐베이션했을 때, 30% 미만으로 감소하였다. 시트레이트에 의한 프로테아제의 불활성화는 염화칼슘을 사용한 적정에 의해 극복되었다. 더욱이, 2 mM 염화칼슘의 존재 하에, 야생형 중성 프로테아제는 완전히 안정하고 효소적으로 활성이었다. 이러한 결과는, 아연이 아니라 칼슘을 제거하는 것이 시트레이트의 존재 하에서 NprE 불안정성의 원인임을 제시한다.
4℃ 에서 수행되는 자가분해 반응을 동일 부피의 1 N HCl 을 첨가하여 종료하였다. TCA 를 사용해 샘플을 침전시키고, 펠렛을 세정하고, 아세톤을 사용해 건조시켰다. 생성 펠렛을 20 μL 완충제, pH 6.5, 및 4X LDS 샘플 완충제 (NuPage, Invitrogen) 에서 재현탁시켰다. 자가분해 절편을 10% (w/v) SDS-PAGE 상에서 분석하고, PVDF 막 상으로 전자블로팅 (electroblotting) 하였다. 처음 10 개의 아미노산 잔기를 Edman 분해 (Argo Bioanalytica) 에 의해 서열화하고, 표 5-1 에 나타낸다. 자가분해 절편의 부분 아미노산 서열을 트립신 인-젤 분해를 사용해 측정하고, LCQ-MS (Agilent) 를 사용해 분석하였다. 인-젤 분해 방법은 단백질을 함유하는 젤 조각을 냉침하고, 코마시 블루 염색을 제거한 후, 이어서 상기 젤 조각을 2 M 우레아가 든 25 mM NH4CO3 에서 재수화시키는 것을 포함하였다. 37℃ 에서 대략 6 시간 동안 재-탈수화시킨 젤 조각에 트립신을 첨가하였다. 분해 후, 아세토니트릴 및 TCA 를 사용해 펩티드를 추출하였다. 아세토니트릴-물 구배를 사용해 C4-소수성 칼럼 (Vydac) 상에서 펩티드를 분리하였다. Genencor 효소가 든 데이타베이스에 대한 SEQUEST® 데이타베이스 검색을 이용해 생성 펩티드 지도를 검색하였다. 절편의 각각의 처음 10 개의 아미노산의 아미노산 서열을 B. 아밀로리퀘파시엔스 NprE 에 대한 공지된 아미노산 서열과 비교하였다. 이로써, NprE 내 N-말단 및 따라서, 절단 부위(들) 의 아미노산을 규명할 수 있었다.
야생형 중성 프로테아제에 대한 시트레이트의 자가분해 작용을 도 1B 에서 나타낸 바와 같이 4℃ 에서 증가하는 시트레이트 농도의 존재 하에 연구하였다. 10 mM 시트레이트와 함께 90 분 동안 인큐베이션한 후, 남은 본래의 NprE 에 대한 2 개의 1 차 자가분해 절편 또한 관찰하였다 (레인 1). 본래의 NprE 의 분자량은 대략 32 kDa 이고, 한편, 1 차 자가분해 절편의 크기는 대략 24 kDa 및 9 kDa 이다. 시트레이트 농도를 100 mM 까지 증가시키면, 추가의, 2 차 자가분해 절편의 추가의 자가분해 및 생성을 초래하였다 (레인 4 ~ 7). 구체적으로는, 시트레이트를 증가시키면서, 24 kDa-자가분해 절편을 가수분해하여, 21 kDa, 15 kDa 및 11 kDa 의 3 개의 더 작은 절편을 추가로 제조하였다.
절편의 N-말단을 Edman 분해에 의해 규명하였다 (도 2). 절편 1, 3 및 4 모두 고유의 N-말단 서열을 갖고, 반면 절편 2 및 5 는 독특한 N-말단을 갖는다. 절편 2 를 해어지게 하고 (frayed), N-말단의 시작부분은 D220, A221 또는 G222 에 있거나 또는 그 근처에 있다. 15 kDa 절편의 C-말단을 그의 크기를 기준으로 추론하였고, 이는 위치 L198 에 있거나 또는 그 근처에 있다. 인-젤 트립신 분해 및 LCQ-MS 로써, 이들 자가분해 절편의 동일성을 확인하였다. NprE 절단 절편의 N-말단 및 LCQ-MS 분석을 바탕으로, 1 차 절단 부위를 아미노산 위치 M138, L198, D220, A221, 및 G222 에서 규명하였다.
실시예 6
시트레이트-유도 자가분해에 대해 내성인 NprE 변이체의 제조
본 실시예는 칼슘 킬레이터의 존재 하에 향상된 안정성에 대해 NprE 변이체를 스크리닝한 것을 기술한다. 1 차 절단 부위 M138, L198, D220, A221 및 G222, 뿐만 아니라 이들 부위 근처 및/또는 효소 표면 상의 아미노산을 실시예 3, 및 WO 2007/044993 (그 전체가 참조로서 본원에 삽입됨) 에서 기술된 유전자 구축 및 서열화 방법을 이용한 돌연변이유발을 표적으로 하였다. 자연 발생 아미노산 잔기가 19 개의 대안적인 아미노산 잔기 중 하나에 의해 개별적으로 대체된 S129, F130, M138, V190 및 D220 에 대한 부위-평가 라이브러리를 제조하였다. 마찬가지로, 이중 (M138L-D220P; F130L-D220P, S129I-D220P, V190I-D220P, S129I-V190I, S129V-V190I, S129V-D220P), 삼중 (M138L-V190I-D220P, S129I-F130L-D220P) 및 오중 (S 1291-F130L-M138L-V190I-D220P) 아미노산 치환 변이체를 구축하였다.
NprE SEL 구성원을 50 mM 나트륨 시트레이트의 부재 및 존재 하에 스크리닝하였다. 사용되는 완충제는 0.1 mM CaCl2 를 함유하는 25 mM HEPES, pH 8.0 이었다. 숙시닐화된-카제인/TNBSA 방법 (Pierce, Inc. Rockford, IL) 또는 형광 표지 Abz-AGLA-Nba 펩티드 어세이 (Vnend 등, J Biol Chem, 255:3482-3486, 1980) 중 하나를 이용해 프로테아제 활성을 측정하였다. 사용되는 분광 광도계는 SpectraMax M2e (Molecular Devices) 였고, 모든 어세이는 중간 단백질-결합 96-웰 플레이트 (Corning International) 에서 수행하였다. 실온에서 60 분 동안 인큐베이션한 후, 4 개의 복제물에 대해 잔여 프로테아제 활성을 계산하였다. 그 값을 야생형 NprE 에 대해 관찰된 값에 대해 정상화하였다. (야생형에 비해) 시트레이트에 대해 증가된 안정성을 보이는 개별 변이체 단백질을 추가의 특징화를 위해 선별하였다. NprE SEL 138 (자가분해 부위), 190 (표면 노출된 부위) 및 220 (자가분해 부위) 에 대한 DMC/TNBSA 종점 어세이를 적용하는 대표적인 시트레이트-스크리닝 데이타를 도 3 에 나타낸다.
유사하게는, 단일 (S129I/L, F130L, M138I/L, V190I, D220P/E), 이중 (S129I-V190I, S129V-V190I, M138L-D220P, S129I-D220P, F130L-D220P, V190I- D220P 및 S129V-D220P), 삼중 (S129I-F130L-D220P 및 M138L-V190I-D220P) 및 오중 (S129I-F130L-M138L-V190I-D220P) NprE 변이체에 대한 시트레이트 안정성을 합성 펩티드에 대한 프로테아제 활성의 측정 및 SDS-PAGE 분석에 의해 평가하였다. 시트레이트-스크리닝 데이타는, M138 을 Leu 으로, D220 을 Pro 또는 Glu 으로, S129 를 Ile 또는 Leu 으로, F130 을 Leu 으로, 그리고 V190 을 Leu 또는 Ile 으로 대체하는 것이 시트레이트-유도 자가분해를 덜 받기 쉬운 프로테아제를 초래하였음을 지시하였다.
중성 프로테아제 변이체 선별에 대한 안정성의 시트레이트 농도 의존성을 도 4A 에 나타낸다. 단일 아미노산 치환 변이체, S129I/V, M138I/L 및 D220E/P 는 100 mM 시트레이트의 존재 하에 실온에서 인큐베이션했을 때 야생형 단백질보다 20 ~ 30% 더 큰 잔여 활성을 초래하였다. V190I 는 100 mM 시트레이트의 존재 하에 실온에서 60 분 동안 인큐베이션한 후 가장 큰 잔여 활성 (대략 60%) 을 나타내었다. 이들 돌연변이의 조합은 가성성 (additivity) 을 나타낸다. 가장 시트레이트-안정성 변이체는 5 개의 개별 돌연변이의 조합인 S129I-F130L-M138L-V190I-D220P 이다. 이러한 오중 변이체 S129I-F130L-M138L-V190I-D220P 는 100 mM 시트레이트의 존재 하에 그의 활성 전부를 150 분 동안 유지하고, 향상된 안정성은 SDS-PAGE 에 의해 관찰된 바와 같이 자가분해 절편의 부재에 의해 입증된다. 특히, 도 4B 에서 나타낸 바와 같이, 야생형 NprE (레인 1 ~ 4) 의 자가분해 패턴 특징은 증가하는 농도의 시트레이트의 존재 하에, S129I-F130L-M138L-V190I-D220P 에 대한 자가분해의 부재 (레인 6 ~ 10) 와 대조된다. 실온에서 60 분 동안 인큐베이션한 후, 100 mM 시트레이트의 존재 하에 야생형 NprE 및 변이체 중성 메탈로프로테아제에 대한 잔여 활성 % 는 도 6 에 나타나 있고, 이는 단일 치환이 갖는, 자가분해에 대한 내성의 가성성을 분명하게 지시한다.
실시예 7
시차 주사 열량계 (DSC)
초민감성 주사 고-출력 마이크로열량계, VP-Cap DSC (MicroCal, Inc., Northampton, MA) 를 사용해 과량 열용량 곡선을 측정하였다. 대략 500 ㎕ 의 200-내지-400 ppm 단백질이 필요하였다. 전형적으로, 400 ppm 의 NprE 및 변이체 메탈로프로테아제 (130 mM 시트레이트의 부재 및 존재 하) 를 20 ~ 100℃ 온도 범위에 걸쳐서 스캐닝하였다. 다음, 방법의 가역성을 체크하기 위해, 동일 샘플을 재-스캐닝하였다. 중성 프로테아제에 대해, 열적 풀림 방법은 비가역적이었다. 사용되는 완충제 농도는 5 mM HEPES, pH 8.0 이었다. NprE 의 열적 용융점의 스캔 속도 의존성 데이타를 25 내지 200℃/hr 의 스캔 속도에 걸쳐서 평가하였다. 궁극적으로는 200℃/hr 의 스캔 속도를 선택하여, 응집 또는 자가분해를 초래할 수 있는 임의의 인공물을 최소화하였다. DSC 곡선의 열적 중간점 (Tm) 을 열적 안정성의 지표로서 사용하였다. 440-ppm 야생형 중성 프로테아제는 69.2 ± 0.5℃ 의 열적 용융점 (Tm) 을 나타내었다. 야생형 및 NprE 변이체에 대한 열적 용융점은 도 6 에 나타나 있으며, 이는 상기 돌연변이가 시트레이트의 부재 하에 열적 용융점에 대해 단지 최소의 효과를 가짐을 지시한다.
대조적으로, 시트레이트의 존재 하에 돌연변이 NprE 의 열적 풀림은 야생형 NprE 와 상당한 차이를 보였다 (도 6). 130 mM 시트레이트, pH 8.0 의 존재 하에, 야생형 단백질에 대해서는 어떠한 열적 풀림 프로파일도 수득되지 않았다. 이는 그의 빠르고 완전한 시트레이트-유도 자가분해 및 불활성화와 일치하였다. 비교로서, 모든 시트레이트 안정한 변이체는 열적 풀림 프로파일을 보여주었다. 야생형 NprE 및 변이체에 대한 열적 풀림 중간점은 도 5B 에 나타나 있다. 130 mM 시트레이트의 존재 하에, DSC 를 사용해 특징화된 가장 적은 시트레이트-안정성 변이체의 열적 용융점은 48℃ 이었고, 가장 안정한 단일 변이체의 열적 용융점은 52℃ 이었다 (도 6). 시트레이트-안정화 치환은 가성성을 보여주고, S129I-F130L-M138L-V190I-D220P 변이체 내 프로테아제 골격 내 5 개의 점 돌연변이의 조합은 59.2℃ 의 Tm 을 갖는다. 따라서, 5 개의 향상 돌연변이의 조합은 +10℃ 의 Tm 증가를 초래하였다 (도 5 및 6). 이를 조합하면, 이러한 결과는 시트레이트의 존재 하에 시트레이트-유도 자가분해에 대한 내성 및 열적 안정성 간에 상관관계가 존재함을 지시한다.
실시예 8
NprE 의 상동성 모델링
본 실시예는 B. 세레우스 (B. cereus) NprE 의 공지된 구조를 기준으로 이와 45% 동일한 B. 아밀로리퀘파시엔스 NprE 의 구조의 모델링을 기술한다. 또한, 마이크로 PIXES 분석을 사용하여, NprE 의 화학량론, 및 아연 및 칼슘 결합을 확인하였다. 이 모델을 사용하여, 용매 노출될 가능성이 있는 NprE 의 아미노산을 규명하였다.
서열 분석에서 사용되는 구조의 배위, 정렬 및 모델링은 PDB 로부터 다운로드하였다. B. 아밀로리퀘파시엔스 NprE 의 단백질 서열은 Swissprot No. P06832 에서 발견되고, 성숙한 형태의 서열은 SEQ ID NO:3 로서 나타나 있다. 프로그램에 공급된 매뉴얼에 따라, 정렬 계산 및 수동 재조정, 분석 및 모델링에 프로그램 스위트 (program suite) MOE (Chemical Computing Corp Montreal, Canada) 를 사용하였다. 에너지 최소화 계산을 위해, Charmm27 파라미터 세트를 선택하였다.
B. 세레우스 (1NPC), B. 서모프로테올리티쿠스 (B. thermoproteolyticus) (PDB ID IKEI), P. 아에루기노사 (P. aeruginosa) (1EZM), 및 S. 아우레우스 (S. aureus) (1BQB) 의 아연 중성 프로테아제의 구조가 이용가능하다. B. 아밀로리퀘파시엔스 NprE 의 성숙 프로테아제 도메인과 이들 구조의 가장 근접하게 상동성인 것은 B. 세레우스 NprE 이고, 이를 모델링을 위한 주형으로서 사용하였다. 이들을 구조적으로 정렬하였다. 서열 정렬의 비교로써, B. 아밀로리퀘파시엔스 NprE 서열, 및 B. 세레우스 NprE 서열 간에 많은 삽입 및 소실이 있음이 드러났다. 정렬 조사로써, 둘 다에서 오류가능성이 있음이 드러났고, 정렬을 수동으로 조정하였다. B. 아밀로리퀘파시엔스 NprE 는 2 개의 Ca2+ 이온이 단백질에 결합하는 것으로 예상되는, 루프 내에서 주형 1NPC 구조와 비교해 4 개의 잔기 소실을 가졌다. 이는 상기 매우 중요한 영역을 모델링함에 있어서 최초의 어려움을 초래하였다. 운좋게도, B. 아밀로리퀘파시엔스 NprE 와 동일한 화학량론의 금속 결합을 갖는 S. 아우레우스 NprE 는 상기 루프 내에서 동일한 소실을 갖는다. 이로써, 상기 영역에서 수동 재건축을 가이드하기 위해 S. 아우레우스 NprE 구조를 사용할 수 있어서, Ca2+ 가 효소에 결합하는 것을 더욱 정확하게 모델링할 수 있었다. 상기 모델을 에너지 최소화하려고 하면서도, 아연 및 칼슘 결합 부위에 대해서는 불량한 결과가 수득되었다. 따라서, 금속 이온, 및 그의 리간드를 에너지 최소화 동안 내내 고정해 둔 채로 놔두었다. 상기 모델에 물 분자를 첨가하지는 않았다.
B. 아밀로리퀘파시엔스 NprE 상동성 모델에는 성숙 효소의 300 개 잔기가 함유된다. 최종 모델의 라마칸드론 플롯 (Ramachandron plot) 으로써 3 가지 분리물 (outlier) 이 드러났다. 이들은 S23, N61, 및 S191 이었다. 표면 노출된 잔기의 분석은 표면에 있는 8 개의 지방족 또는 방향족 잔기를 보여준다. 이들은 Y49, L55, I117, F130, V190, L216, V260, 및 L282 이다. 이들 잔기는 표면 노출된 루프 내에 있고, 이 루프는 일반적으로 상동성 모델링 방법을 사용해 최소한 정확하게 모델링된 영역이고, 모델이 거의 신뢰할만하지 않는 영역을 지시할 수 있다.
B. 아밀로리퀘파시엔스 NprE 효소의 N-말단 부분은 8 개의 가닥 혼합된 베타 병풍을 함유하고, 이는 긴 나선의 표면 중 약 75% 를 에워싼다. 효소의 C-말단 부분은 대체로 6 개의 나선형 묶음 및 2 개의 짧은 가닥의 역평행의 베타-병풍으로 이루어진다. 효소의 활성 부위는 이들 2 개의 하위-도메인 간의 계면에서 발견된다. 기질 결합 틈 (cleft) 은 매우 크고 개방되어 있으며, 관찰된 엔도-프로테아제 활성과 일치한다.
기질 틈의 중간에서 촉매적으로 중요한 Zn2+ 이온이 발견된다. 상기 모델은 H143, H147, 및 E167 이 사면체 기하학 구조로 상기 Zn2+ 이온에 결합함을 예측한다. 서모리신에서, 4 번째 리간드는 물이나, B. 아밀로리퀘파시엔스 NprE 상동성 모델에는 물을 첨가하지 않았다. 잔기 D139, D178, E180, D181, E186, 및 D197 은 이중 칼슘 부위를 형성한다. 상기 모델의 CA351 은 D139, D178, D181 및 E186 의 측쇄, 및 D183 의 주-사슬 카르보닐에 의해 복합체화된다. 상기 모델의 CA352 는 D178, E180, D181, 및 E187 의 측쇄에 의해 복합체화된다. D187 의 측쇄는 또한 CA352 근처에 있으나, 만약 측쇄가 상기 이온과 배위한다면 이는 상기 모델에서는 분명하지 않다.
B. 아밀로리퀘파시엔스 NprE 의 금속 이온 화학량론의 예측을 테스트하기 위해, 마이크로-입자-유도 X-선 방출 (마이크로-PIXE) 분광학을 수행하여, 아연 및 칼슘 함량을 실험적으로 측정하였다. Surrey Ion Bean Centre 대학교 (Guildford, United Kingdom) 를 PIXES 분석에 적용하였다. 표 8-1 에서 나타낸 바와 같이, 관찰된 화학량론은 Zn2+ 에 대해 1.02, 및 Ca2+ 에 대해 1.62 였다. 부분 점유 (partial occupancy) 는 2 개의 예측된 Ca2+ 이온 중 하나 또는 둘 다에 대해 가정되었고, 그런 다음, 상기 분석은 예측과 일치한다. Zn2+ 및 Ca2+ 의 결합 친화성의 측정은 Zn2+ 가 Ca2+ 보다 10-배 더 타이트하게 결합함을 보여주고, 이는 PIXEs 샘플에서 관찰된 Ca2+ 의 약간의 손실과 일치한다.
실시예 9
pH 의존성 활성 및 안정성의 평가
A. 야생형 NprE 및 변이체 NprE 의 pH 의존성 활성 :
MES 모노히드레이트, Trizma 염기 및 나트륨 아세테이트 (모두 Sigma 제품) 를 조합하여 상이한 pH 완충제를 제조하였다. 완충제 내 각각의 성분의 최종 농도는 25 mM 아세테이트, 5O mM MES 및 25 mM Tris 였다. 수산화나트륨 또는 염산염을 사용해 완충제의 pH 를 9.40, 8.69, 8.36, 7.70, 7.45, 6.52, 6.00, 5.45, 4.78, 및 4.27 의 최종 pH 값으로 조정하였다. AGLA 기질 (American Peptide Company) 을 4.8 mM 의 농도에서 DMF 에 용해시켰다. 각각의 완충제 내 상이한 농도의 AGLA 기질을 최종 AGLA 농도가 0.096 mM, 0.048 mM, 0.024 mM, 0.012 mM, 및 0.006 mM 이도록 제조하였다.
각각의 기질 농도에서 각각의 pH 완충제 200 μl 를 1 개의 96 웰 플레이트에 첨가하고, 0.94 μg/ml 정제된 NprE 또는 변이체 10 μl 를 각각의 웰에 첨가한 후, 상기 플레이트를 15 초 동안 흔들었다. 5 분 동안 11 초마다 판독하는 플레이트 판독기 (Molecular dynamics) 를 이용해 여기 35O nm 및 방출 415 nm 에서 각각의 웰의 형광을 모니터링하였다. 각각의 곡선의 V최대 (최대 선형 경사) 를 기록하였다. V최대 대 (versus) AGLA 기질 농도의 플롯은 Kcat/Km 를 제공하였고, 이는 기질에서 사용되는 최종 효소 농도 및 곡선의 경사를 바탕으로 계산되었다. 도 8 에서 나타낸 바와 같이, 야생형 NprE 및 오중 NprE 변이체 (S129I-F130L-M138L-V190I-D220P) 둘 다는 pH 6.5 의 AGLA 기질에 대해 활성 최적을 갖는다.
B. 야생형 NprE 및 변이체 NprE 의 pH 의존성 안정성 :
상이한 pH 값에서의 야생형 NprE 및 오중 NprE 변이체 (S129I-F130L-M138L- V190I-D220P = "Quint") 의 안정성을 2 mM 염화칼슘의 부재 및 존재 하에 테스트하였다. 96 웰 플레이트에 단백질이 결합하는 것을 피하기 위해, 각각의 완충제에 0.005% Tween 80 을 또한 첨가하는 것을 제외하고는, 상기 기술된 바와 같이 상이한 pH 에서 동일한 세트의 완충제를 사용하였다. 1 세트의 완충제에, 2 mM 염화칼슘을 첨가하였다. 최종 단백질 농도가 10 μg/ml 이 되도록 정제된 단백질을 첨가하였다. 총 부피는 96 웰 플레이트에서 200 μl/웰이었다. 상기 플레이트를 실온에서 (예를 들어, 23℃ 에서) 3 시간 동안 인큐베이션하였다. 상이한 pH 에서 각각의 단백질의 활성을 AGLA 어세이를 사용해 측정하였다. 야생형 NprE 는 pH 6.5 에서 가장 안정하였고, 6.5 보다 더 작거나 더 큰 pH 에서는 안정성 감소가 관찰되었다. pH 4.3 에서, NprE 는 100% 활성을 상실하였다. Quint 는 pH 5.5 내지 pH 9.4 의 광범위한 pH 에서 가장 안정하다. 그럼에도 불구하고, 4.7 미만의 pH 값에서 Quint 의 안정성은 감소한다. 그러나, 2 mM 칼슘을 첨가하면, 낮은 pH 및 높은 pH 둘 다에서 NprE 및 Quint 변이체 둘 다가 안정화된다.
본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 공개물은 본 발명이 속한 당업자의 수준의 지표이다. 모든 특허 및 공개물은 각각의 개별 공개물이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로써 지시되는 동일한 범위로 참조로써 본원에 삽입된다. 그러나, 임의의 공개문헌의 언급은 본 발명에 대해 선행 기술인 허락으로서 구속되지는 않는다.
본 발명의 특정 구현예가 예시 및 기술되는 한편, 당업자는 다양한 다른 변화 및 변형이 본 발명의 취지 및 범주에서 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있음을 알 것이다. 따라서, 본 발명의 범주 내의 모든 그러한 변화 및 변형을 첨부된 청구항에서 포함하고자 한다.
당업자는 본 발명이 목적을 수행하고 언급된 이점 및 목적을 달성하기 위해 잘 채택되며, 뿐만 아니라 본래 있는 것임을 쉽게 알 것이다. 본원에서 기술되는 조성물 및 방법은 대표적인 것이고, 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것이 아니다. 당업자는 다양한 대체 및 변형이 본원에서 개시된 본 발명에 이루어질 수 있으며, 이러한 변형 및 대체는 본 발명의 범주를 벗어나지 않는 것임을 알고 있다.
본원에서 예시적으로 기술된 본 발명은 임의의 원소 또는 원소들의 부재, 본원에서 구체적으로 개시되지 않은 제한 또는 제한점의 부재 하에 실행될 수 있다. 적용된 용어 및 표현은 상세한 설명의 면에서 그리고 제한 없이 사용되고, 나타내고 기술된 특징의 해당부분 또는 그의 부분을 제외하는 상기 용어 및 표현의 사용에 있어서 의도는 없으나, 다양한 변형이 청구하는 본 발명의 범주 내에서 가능함이 인지된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 구현예 및 최적의 특징에 의해 구체적으로 개시되었다 하더라도, 본원에서 개시된 개념의 변형 및 변화는 당업자에게 의지될 수 있으며, 그러한 변형 및 변화는 첨부된 청구항에 의해 정의된 본 발명의 범주 내에서 고려되어야함을 이해해야 할 것이다.
본 발명은 본원에서 광범위하고 일반적으로 기술되었다. 일반적인 개시물에 속하는 더 좁은 종 및 하위종 그룹의 각각 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 이는 종의 대상체를 제거하는 단서 또는 부정적인 제한과 함께 본 발명의 일반적인 상세한 설명을 포함하며, 삭제된 물질이 구체적으로 본원에서 언급되는지와는 상관이 없다.
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Hommes, Ronaldus W.J.
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<210> 1
<211> 1566
<212> DNA
<213> Bacillus amyloliquefaciens
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gtgggtttag gtaagaaatt gtctgttgct gtcgccgctt cctttatgag tttaaccatc 60
agtctgccgg gtgttcaggc cgctgagaat cctcagctta aagaaaacct gacgaatttt 120
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caatacttga aacaaaacgg caaagtcttt aaaggcaatc cttctgaaag attgaagctg 240
attgaccaaa cgaccgatga tctcggctac aagcacttcc gttatgtgcc tgtcgtaaac 300
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gcgattaacg gtgaattaaa caacgatgtt tccgccaaaa cggcaaacag caaaaaatta 420
tctgcaaatc aggcgctgga tcatgcttat aaagcgatcg gcaaatcacc tgaagccgtt 480
tctaacggaa ccgttgcaaa caaaaacaaa gccgagctga aagcagcagc cacaaaagac 540
ggcaaatacc gcctcgccta tgatgtaacc atccgctaca tcgaaccgga acctgcaaac 600
tgggaagtaa ccgttgatgc ggaaacagga aaaatcctga aaaagcaaaa caaagtggag 660
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tcttctgaaa gcggcaaata tgtgctgcgc gatctttcta aacctaccgg aacacaaatt 780
attacgtacg atctgcaaaa ccgcgagtat aacctgccgg gcacactcgt atccagcacc 840
acaaaccagt ttacaacttc ttctcagcgc gctgccgttg atgcgcatta caacctcggc 900
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aagatcgtat cctccgttca ttacggcagc agatacaata acgcagcctg gatcggcgac 1020
caaatgattt acggtgacgg cgacggttca ttcttctcac ctctttccgg ttcaatggac 1080
gtaaccgctc atgaaatgac acatggcgtt acacaggaaa cagccaacct gaactacgaa 1140
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ttgtaa 1566
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<213> Bacillus amyloliquefaciens
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Met Gly Leu Gly Lys Lys Leu Ser Val Ala Val Ala Ala Ser Phe Met
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Ser Leu Pro Gly Val Gln Ala Ala Glu Asn Pro Gln
20 25 30
Leu Lys Glu Asn Leu Thr Asn Phe Val Pro Lys His Ser Leu Val Gln
35 40 45
Ser Glu Leu Pro Ser Val Ser Asp Lys Ala Ile Lys Gln Tyr Leu Lys
50 55 60
Gln Asn Gly Lys Val Phe Lys Gly Asn Pro Ser Glu Arg Leu Lys Leu
65 70 75 80
Ile Asp Gln Thr Thr Asp Asp Leu Gly Tyr Lys His Phe Arg Tyr Val
85 90 95
Pro Val Val Asn Gly Val Pro Val Lys Asp Ser Gln Val Ile Ile His
100 105 110
Val Asp Lys Ser Asn Asn Val Tyr Ala Ile Asn Gly Glu Leu Asn Asn
115 120 125
Asp Val Ser Ala Lys Thr Ala Asn Ser Lys Lys Leu Ser Ala Asn Gln
130 135 140
Ala Leu Asp His Ala Tyr Lys Ala Ile Gly Lys Ser Pro Glu Ala Val
145 150 155 160
Ser Asn Gly Thr Val Ala Asn Lys Asn Lys Ala Glu Leu Lys Ala Ala
165 170 175
Ala Thr Lys Asp Gly Lys Tyr Arg Leu Ala Tyr Asp Val Thr Ile Arg
180 185 190
Tyr Ile Glu Pro Glu Pro Ala Asn Trp Glu Val Thr Val Asp Ala Glu
195 200 205
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210 215 220
Thr Gly Thr Gly Thr Thr Leu Lys Gly Lys Thr Val Ser Leu Asn Ile
225 230 235 240
Ser Ser Glu Ser Gly Lys Tyr Val Leu Arg Asp Leu Ser Lys Pro Thr
245 250 255
Gly Thr Gln Ile Ile Thr Tyr Asp Leu Gln Asn Arg Glu Tyr Asn Leu
260 265 270
Pro Gly Thr Leu Val Ser Ser Thr Thr Asn Gln Phe Thr Thr Ser Ser
275 280 285
Gln Arg Ala Ala Val Asp Ala His Tyr Asn Leu Gly Lys Val Tyr Asp
290 295 300
Tyr Phe Tyr Gln Lys Phe Asn Arg Asn Ser Tyr Asp Asn Lys Gly Gly
305 310 315 320
Lys Ile Val Ser Ser Val His Tyr Gly Ser Arg Tyr Asn Asn Ala Ala
325 330 335
Trp Ile Gly Asp Gln Met Ile Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Ser Phe Phe
340 345 350
Ser Pro Leu Ser Gly Ser Met Asp Val Thr Ala His Glu Met Thr His
355 360 365
Gly Val Thr Gln Glu Thr Ala Asn Leu Asn Tyr Glu Asn Gln Pro Gly
370 375 380
Ala Leu Asn Glu Ser Phe Ser Asp Val Phe Gly Tyr Phe Asn Asp Thr
385 390 395 400
Glu Asp Trp Asp Ile Gly Glu Asp Ile Thr Val Ser Gln Pro Ala Leu
405 410 415
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 13
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20 25 30
Gly Thr Gln Ile Ile Thr Tyr Asp Leu Gln Asn Arg Glu Tyr Asn Leu
35 40 45
Pro Gly Thr Leu Val Ser Ser Thr Thr Asn Gln Phe Thr Thr Ser Ser
50 55 60
Gln Arg Ala Ala Val Asp Ala His Tyr Asn Leu Gly Lys Val Tyr Asp
65 70 75 80
Tyr Phe Tyr Gln Lys Phe Asn Ile Val Ser Ser Val His Tyr Gly Ser
85 90 95
Arg Ser Leu Ser Asn Pro Thr Lys Tyr Gly Gln Pro Asp Asn Phe Lys
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic autolytic fragment
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1 5 10 15
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Pro Ser Ser Thr Phe Lys Asp Ala Lys Ala Ala Leu Ile Gln Ser Ala
35 40 45
Arg Asp Leu Tyr Gly Ser Gln Asp Ala Ala Ser Val Glu Ala Ala Trp
50 55 60
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65
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Val Ser Ser Val His Tyr Gly Ser Arg Tyr Asn Asn Ala Ala Trp Ile
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<220>
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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1
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<220>
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<400> 22
Ala Gly Leu Ala
1
Claims (30)
- 금속 킬레이터의 존재 하의 야생형 중성 메탈로프로테아제의 내성과 비교해, 상기 금속 킬레이터의 존재 하에 향상된 내성을 갖는, 단리된 중성 메탈로프로테아제 변이체.
- 제 1 항에 있어서, 야생형 중성 메탈로프로테아제의 내성과 비교해 시트레이트-유도 자가분해에 대해 향상된 내성을 갖는, 단리된 중성 메탈로프로테아제 변이체.
- 제 1 항에 있어서, 바실러스 (Bacillus) 중성 메탈로프로테아제 변이체인, 단리된 중성 메탈로프로테아제 변이체.
- 제 3 항에 있어서, SEQ ID NO: 3 으로 나타낸 아미노산 서열의 위치 129, 130, 138, 190, 및 220 과 동일한 군으로부터 선택되는 3, 4, 또는 5 개의 위치에서의 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는, 단리된 바실러스 중성 메탈로프로테아제 변이체.
- 제 4 항에 있어서, 상기 치환이 S129I/F130L/D220P, M138L/V190I/D220P, 및 S129I/F130L/M138L/V190I/D220P 로부터 선택되는 복수의 돌연변이를 포함하는, 단리된 바실러스 중성 메탈로프로테아제 변이체.
- 제 3 항에 있어서, 상기 바실러스가 B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens) 인, 단리된 바실러스 중성 메탈로프로테아제 변이체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단리된 중성 메탈로프로테아제가 SEQ ID NO:3 으로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중성 메탈로프로테아제와 약 45% 이상의 아미노산 동일성을 갖는, 단리된 중성 메탈로프로테아제 변이체.
- 제 1 항에 따른 중성 메탈로프로테아제 변이체를 암호화하는 단리된 핵산 서열.
- 제 8 항에 따른 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
- 제 9 항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제 1 항에 있어서, 상기 변이체가 SEQ ID NO: 18 (S129I/F130L/D220P), SEQ ID NO: 19 (M138L/V190I/D220P), 및/또는 SEQ ID NO:20 (S129I/F130L/M138L/V190I/D220P) 으로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 중성 메탈로프로테아제 변이체.
- 제 1 항에 따른 단리된 중성 메탈로프로테아제 변이체를 포함하는 조성물.
- 제 12 항에 있어서, 하나 이상의 칼슘 이온 및/또는 하나 이상의 아연 이온을 추가로 포함하는 조성물.
- 제 13 항에 있어서, 시트레이트를 추가로 포함하는 조성물.
- 제 12 항에 있어서, 세정 조성물인 조성물.
- 제 15 항에 있어서, 프로테아제, 아밀라아제, 리파아제, 만나나아제, 펙티나아제, 큐티나아제, 산화환원효소, 헤미셀룰라아제, 및 셀룰라아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 효소 또는 효소 유도체를 추가로 포함하는 조성물.
- 제 12 항에 있어서, 약 0.0001 중량% 이상의 중성 메탈로프로테아제 변이체 ; 또는 약 0.001 내지 약 0.5 중량% 의 중성 메탈로프로테아제 변이체를 포함하는 조성물.
- 제 12 항에 있어서, 하나 이상의 보조 성분을 추가로 포함하는 조성물.
- 제 12 항에 있어서, 약 3 내지 약 5 의 순 pH 를 갖는 조성물을 제공하기에 충분한 양의 pH 개질제를 추가로 포함하는 조성물로서, 상기 조성물에는 약 3 내지 약 5 의 pH 에서 가수분해되는 물질이 본질적으로 들어 있지 않은 조성물.
- 제 19 항에 있어서, 하나 이상의 계면활성제를 추가로 포함하는 조성물.
- 제 20 항에 있어서, 상기 계면활성제가 에틸렌 옥시드 부분을 포함하는 나트륨 알킬 술페이트 계면활성제인 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 액체인 조성물.
- 제 12 항에 있어서, 동물 사료인 조성물.
- 제 12 항에 있어서, 섬유 가공 조성물 및/또는 가죽 가공 조성물인 조성물.
- 직물을 포함하는 물품 및/또는 표면을 제 15 항에 따른 세정 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 세정 방법.
- 제 25 항에 있어서, 상기 직물을 포함하는 물품 및/또는 표면을 헹구는 단계를 추가로 포함하는 세정 방법.
- 하기 단계를 포함하는, 중성 메탈로프로테아제 변이체의 제조 방법 :
상기 중성 메탈로프로테아제 변이체를 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시켜, 형질전환된 숙주 세포를 제조하는 단계 ;
상기 중성 메탈로프로테아제 변이체의 제조에 적합한 조건 하에 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계 ; 및
상기 중성 메탈로프로테아제 변이체를 제조하는 단계. - 제 27 항에 있어서, 상기 제조된 중성 메탈로프로테아제 변이체를 수합하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제 27 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 바실러스 종인 방법.
- 제 29 항에 있어서, 상기 바실러스 종이 B. 서브틸리스 (B. subtilis) 인 방법.
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