FI96322C - Lysostafiinia koodittava DNA-fragmentti, sitä sisältävä yhdistelmäplasmidi ja transformoitu bakteeri sekä menetelmä lysostafiiniaktiivisuuden omaavan tuotteen valmistamiseksi - Google Patents
Lysostafiinia koodittava DNA-fragmentti, sitä sisältävä yhdistelmäplasmidi ja transformoitu bakteeri sekä menetelmä lysostafiiniaktiivisuuden omaavan tuotteen valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI96322C FI96322C FI884691A FI884691A FI96322C FI 96322 C FI96322 C FI 96322C FI 884691 A FI884691 A FI 884691A FI 884691 A FI884691 A FI 884691A FI 96322 C FI96322 C FI 96322C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- lysostaphin
- dna
- transformed
- dna fragment
- atcc
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
Description
96322
Lysostafiinia koodittava DNA-fragmentti, sitä sisältävä yhdistelmäplasmidi ja transformoitu bakteeri sekä menetelmä lysostafiiniaktiivisuuden omaavan tuotteen valmistamiseksi 5
Keksinnön tausta
Keksintö koskee lysostafiinia koodittavaa DNA-frag-menttia, sitä sisältävää yhdistelmäplasmidia ja transformoitua bakteeria sekä menetelmää lysostafiiniaktiivisuuden 10 omaavan tuotteen valmistamiseksi. Kuvataan erityisesti uusia plasmideja, jotka transformanttimikrobi-isännissä saavat aikaan lysostafiinigeenin ilmentymisen.
Lysostafiini on bakteriosiini, jota erittää yksi ainoa tunnettu Staphylococcus simulans -kanta, jonka 15 Schindler ja Schuhardt alunperin eristivät ja nimesivät Staphylococcus staphylolyticusiksi. S. staphylolyticusin lysostafiinituotantoa on aikaisemmin kuvattu US-patentti-julkaisussa 3 278 378 (11. lokakuuta 1966) ja julkaisussa Proceedings of the National Academy of Sciences, 51 (1964) 20 414-421. Ainoa organismi S. staphylolyticus (NRRL B-2628), joka tuottaa lysostafiinia, on vähän aikaa sitten identifioitu S. simulans -variantiksi (Sloan et ai., Int. J. System. Bacteriol., 32 (1982) 170-174). Koska nimi S. staphylolyticus ei ole hyväksytyllä bakteerinimilistalla 25 (Approved List of Bacterial Names), on lysostafiinia tuottava organismi nimetty uudelleen S. simulansiksi.
Bakteriosiinit ovat bakteerien erittämiä proteiineja, jotka tappavat ja joskus hajottavat sukulaisbaktee-reja. Lysostafiini esimerkiksi hajottaa ja tappaa käytän-30 nöllisesti katsoen kaikkia tunnettuja stafylokokkilajeja, mutta on epäaktiivinen kaikkien muiden sukujen bakteereja vastaan. Vaikka senkatalyyttisiä ominaisuuksia ei ole hyvin karakterisoitu, on lysostafiinin osoitettu olevan en-dopeptidaasi, joka ilmeisesti pilkkoo stafylokokkien so-35 luseinämissä esiintyvän peptidoglykaanin polyglysiiniris-tisidoksia.
2 96322
Lysostafiinituotanto tapahtuu tietyissä olosuhteissa kasvatettujen S. simulans -viljelmien stationaarisessa vaiheessa ja näyttää esiintyvän rinnakkain muiden ekstra-sellulaaristen entsyymien tuotannon kanssa. Lysostafiinia 5 tuottavat viljelmät näyttävät olevan resistenttejä sen vaikutuksia vastaan, kun taas ei-tuottavissa olosuhteissa kasvatetut viljelmät ovat herkkiä.
Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että lysosta-fiinia voidaan tuottaa fermentointimenetelmin, joissa S. 10 simulansia kasvatetaan nesteviljelmässä. Tällaisia fermen-tointimenetelmiä kuvataan US-patenttijulkaisussa 3 278 378 (11. lokakuuta 1966) ja julkaisussa Proceedings of the National Academy of Sciences 51, (1964) 414-421. On myös tehty erilaisia parannuksia lysostafiinin tuotantoon fer-15 mentointimenetelmin, kuten esitetään US-patenttijul kaisuissa 3 398 056 (20. elokuuta 1968) ja 3 594 284 (20. heinäkuuta 1971). Viimeksi mainituissa kahdessa viitteessä esitetään parannuksia elatusalustaan ja siirrostusmenetel-miin, joilla voidaan nopeuttaa ja parantaa lysostafiinin 20 tuotantoa fermentoimalla. Lysostafiinin tuotanto ja puhdistus tunnetuin menetelmin johtaa kuitenkin tuotteeseen, joka on jossakin määrin muiden stafylokokkituotteiden kon-taminoima. Eläinten tai ihmisen immunisointi immunogeeni-sella ei-lysostafiinimateriaalilla kontaminoituneella ly-25 sostafiinilla saattaisi johtaa epätoivottavaan, ja mahdol lisesti haitalliseen, immunologiseen reagointiin.
S. simulans -viljelmäsuodoksista eristetty lysosta-fiini on karakterisoitu sinkkipitoiseksi proteiiniksi, joka koostuu yhdestä polypeptidiketjusta, jonka molekyyli-30 massa on noin 25 000 daltonia. Se on lämmölle herkkä, ei dialysoitavissa ja sen isoelektrinen piste on suunnilleen pH 11. Lisäksi trypsiinientsyymikäsittely hävittää lyso-stafiinin kyvyn hajottaa eläviä ja lämmöllä tapettuja stafylokokkeja ja stafylokokkien soluseinämiä.
Il - 96322 3
Yhdistelmä-DNA-menetelmät, joilla voidaan kloonata erilaisia proteiineja koodittavia geenejä sijoittamalla ne plasmidi-, kosraidi- tai faagivektoriin, jota voidaan sitten käyttää mikro-organsimin transformointiin, on käytetty 5 laajasti geenien rakenteen ja ilmentymisen tutkimiseen ja erilaisten puhtaiden proteiinien helpon lähteen saamiseksi erilaisiin tarkoituksiin. Ei ole kuitenkaan esitetty raportteja, jotka koskevat tällaisten kloonausmenetelmien käyttöä lysostafiinia koodittavan geenin sijoittamiseen 10 kloonausvektoriin, jotta saadaan uusia vektoreita, joilla voidaan transformoida muu mikro-organismi kuin S. simulans (NRRL B-2628) suurten lysistapiinimäärien tuotannon mahdollistamiseksi .
Lyhyt yhteenveto keksinnöstä 15 Tämä keksintö koskee DNA-fragmenttia, jolle on tun nusomaista, että se on a) eristetty 1,5 kb:n DNA-fragmentti, joka koodit-taa lysostafiinia, jolla on seuraava aminohapposekvenssi, ja joka sisältää seuraavan nukleotidisekvenssin: 20 1: ccggaactcttgaatgtttagttttgaaaaitscaaaaaaaaacctactttcttaatatc 61: gattcatat:attttaacacaatcagttagaatt tcaaaaatcttaaagtcaatttttra 121: gcgtgtttgtatatttcatcaaaatcaatcaatattattttactttcttcatcgttaaaa 25 l8l: aatgtaatatttataaaaatatgctattctcataaatgtaataataaattaggaggtatt 241: aaggttgaagaaaacaaaaaacaattattatacgagacctttagctattggactgagtac f-MetLyslysThrLysAsnAanTyrTyrThrArgProLeuAlalleGiyLeuSerThr 301: atttgccttagcatctattgtttatggagggattcaaaatgaaaeacatgcttctgaaaa
PheAlaLeuAlaSerlleValTyrGlyGiylleGlaAsnGluThrHisAlaSerGiuLys 30 361: aagtaatatggatgtttcaaaaaaagtagctgaagtagagacttcaaaagecccagtaga
SerAsnMetAapValSerLysLysValAlaGluValGluThrSerLysAlaProValGlu 421: aaatacagotgaagtagagacttcaaaagctccagtagaaaatacagctgaagtagagac
AsnlhrAlaGluValGluThrSerLysAlaProValGluAsoThrAlaGluValGluTbr 481: ttcaaaagctccagtagaaaatacagctgaagtagagacttcaaaagctecagtagaaaa 35 SerLyaAlaProValGluAsnThrAlaGluValGluThrSerLysAlaProValGluAan 4 96322 5Ui: tacagctgaagtagagacttcaaaagctccggtagaaaatacagctgaagtagagacttc
ThrAlaGiuValGluThrSerLyaAlaProValGluAsnThrAlaGluValGluThrSer 601: aaaagccccagtagaaaatacagctgaagtagagacttcaaaagccctggttcaaaatag
LysAlaProValGluAanThrAlaGiuValGluThrSerLysAlaLeuValGlnAsnArg 5 661: aacagctttaagagctgcaacacatgaacattcagcacaatggttgaataattacaaaaa
IhrAlaLeuArgAlaAlaThrKisGluHisSerAlaGlnTrpLeuAsnAanTyrLysLys 721: aggatatggttacggtccttatccattaggtataaatggcggtatgcactacggagttga
GlyTyrGlyTyrGlyProTyrProLeuGlylleAanGlyGlyMetHisTyrGiyValAap 781: tttttttatgaatattggaacaccagtaaaagctatttcaagcggaaaaatagttgaagc
PhePbeMetAanlleGlyThrProValLyaAlalleSerSerGlyLyalleValGluAla 8Ui: tggttggagfcaattacggaggaggtaateaaataggtcttattgaaaatgatggagtgca.
GlyTrpSerAanTyrGlyGlyGlyAanGlnUeGlyLeuIleGluAanAspGlyValHis 901: tagacaatggtatatgcatctaagtaaatataatgttaaagtaggagattatgtcaaagc
ArgGlnTrpTyrMetHiaLeuSerLyaTyrAanValLyaValGlyAapTyrValLyaAla 15 961: tggtcaaataatcggttggtctggaageactggttattctacagcaecacatttacactt
GlyGlnllelleGlyTrpSerGlySerThrGlyTyrSerThrAlaProHiaLeuHiaPbe 1021: ccaaagaatggttaattcattttcaaattcaactgcccaagatccaatgcctttcttaaa
GlnArgMetValAanSerPheSerAanSerTbrAlaGlnAapProMetProPheLeuLya 1081: gagcgcaggatatggaaaagcaggtggtacagtaactcoaacgccgaatacaggttggaa
SerAlaGlyTyrClyLyaAlaGlyGlyThrValThrProThrProAanThrGlyTrplya 2 0 1 Hi: aacaaacaaatatggcacactatataaatcagagtcagctagcttcacacctaatacaga
ThrAanLyaTyrGiyThrLeuTyrLyaSerGluSerAlaSerPheThrProAanThrAap 1201: tataataacaagaacgaciggtccatttagaagcatgccgcagtcaggagtcttaaaagc
IlelleThrArgThrThrGIyProPheArgSerMetProGlnSerGlyValLeuLyaAla 25 1251: aggtcaaacaattcattatgatgaagtgatgaaacaagacggteatgtttgggtaggtta
GlyGlnThrlleHisTyrAapGluValKetLyaGlnAapGlyHisVairrpValGlyTyr 1321: tacaggtaacagtggccaaegtatttacttgcctgtaagaacatggaataaatctactaa
ThrGlyAsnSerGlyGlnArglierypLeuProVaiArgThrTrpAanLyaSerThrAan 1381: tactttaggtgttctttggggaactataaagtgagcgcgctttttataaacttatatgat
TarLeuGlyValLeuTrpGlyThrlleLya HU1: aattagagcaaataaaaattttttctcattcctaaagttgaagc jossa on avoin lukukehys, joka ulottuu nukleotideissa 245 - 247 olevasta TTG-aloituskodonista nukleotideissa 1412 - 1414 olevaan TGA-lopetuskodoniin, joka avoin lukukehys 35 koodittaa preprolysostafiinia, joka on kypsän aktiivisen 11 96322 5 lysostafiinin esiaste, jolla on 389 aminohappoa sisältävä, signaalipeptidin ja prolysostafiinin käsittävä sekvenssi, joka käsitellään synteesin jälkeen kypsäksi lysostafiinik-si, 5 b) eristetty DNA-fragmentti, joka koodittaa kypsää lysostafiinia ja sisältää kohdassa a) esitetyn DNA:n nukleotidit 674 - 1411, c) eristetty DNA-fragmentti, joka koodittaa prepro-lysostafiinia ja sisältää kohdassa a) esitetyn DNA:n nuk- 10 leotidit 245 - 1411, d) eristetty DNA-fragmentti, joka koodittaa prolysostaf iinia ja sisältää kohdassa a) esitetyn DNA:n nukleotidit 356 - 1411, tai e) eristetty DNA-fragmentti, joka koodittaa lyso-15 stafiinin signaalipeptidiä ja sisältää kohdassa a) esitetyn DNA:n nukleotidit 245 - 355.
Keksintö koskee edelleen yhdistelroäplasmidia, jolle on tunnusomaista, että se sisältää edellä esitettyä mikro-organismin Staphylococcus simulans (NRRL B-2628) lysosta-20 fiiniä koodittavaa DNA:ta, joka transformoidussa mikrobi-isännässä pystyy ilmentämään mainitun DNA:n.
Keksintö koskee myös transformoitua bakteeria, jolle on tunnusomaista, että se tuottaa mikro-organismin Staphylococcus simulans (NRRL B-2628) lysostafiinia ja on 25 transformoitu edellä esitetyllä yhdistelmäplasmidilla, joka sisältää lysostafiinia koodittavaa DNA:ta.
Lisäksi keksintö koskee menetelmää tuotteen valmistamiseksi, jolla on lysostafiiniaktiivisuus, viljelemällä edellä kuvattua transformoitua bakteeria, joka ei kuulu 30 sukuun Staphylococcus, kunnes lysostafiinia koodittava DNA ilmentyy tuottaen prolysostafiinia ja mainittu bakteeri pilkkoo prolysostafiinin mainitun tuotteen muodostamiseksi .
Tämän keksinnön mukaisesti kuvataan yhdistelmäplas-35 mideja, jotka transformanttimikrobi-isännissä saavat ai- 96322 6 kaan lysostafiinia koodittavan geenin ilmentymisen. Yhdis-telmäplasmidit valmistettiin sijoittamalla lysostafiinia koodittava identifioitu DNA-sekvenssi sopiviin kloonaus-vektoreihin.
5 Sopiviin kloonausvektoreihin kuuluvat sellaiset, jotka replikoituvat bakteereissa, mukaan luettuina mm. E. coli, Bacillus spp. ja Streptomyces. Isäntämikro-organis-meihin kuuluvat E. coli, Bacillus spp. ja Streptomyces. Alan ammattimiehille lienee ilmeistä, että tämä keksinnön 10 toteuttamiseen voidaan käyttää muitakin vektoreita ja isäntiä.
Eräässä suoritusmuodossa lysostafiinia koodittava DNA-sekvenssi sijoitetaan E. coli -plasmidiin pUC8, tunnettuun kloonausvektoriin, jolloin muodostui yhdistelmä-15 plasmidi pRG5. pRG5:llä transformoitu E. coli JM105 tuottaa lysostafiinia.
Tämän keksinnön eräässä toisessa suoritusmuodossa pRG5:stä saatu lysostafiinigeeni kloonattiin Bacillusplas-mideihin pBC16, pBD64 ja pSPVl, jolloin muodostuivat yh-20 distelmäplasmidit pJPl, pDF8 ja vastaavat pRPl. Bacillus-suvun jäsenet, mukaan luettuna B. subtilis, jotka oli transformoitu jollakin näistä kolmesta lysostafiinigeenin sisältävästä Bacillus-plasmidista, erittivät suuria määriä lysostafiinia elatusalustaan. Keksintö tarjoaa lisäksi 25 käytettäväksi B. sphaericus -kannan 00, joka transformoituna yhdistelmäplasmidilla pJPI tuottaa noin viisinkertaisen määrän lysostafiinia S. simulansin (NRRL B-2628), luonnollisen tuottajan, viljelmiin nähden.
Lysostafiini, jota syntyy seurauksena mikrobiisän-30 tien transformoinnista edellä mainituilla plasmideilla ja muilla lysostafiinigeenin sisältävillä plasmideilla, on suurin piirtein vapaa ei-lysostafiiniepäpuhtauksista, erityisesti immunogeenisista stafylokokkikontaminanteista.
Keksintö tarjoaa lisäksi käytettäväksi 1,5 kilo-35 emäsparin (kb:n) pituisen lysostafiinia koodittavan DNA- • 96322 7 fragmentin, tällaisen geenin sekvenssin ja 389 aminohaposta koostuvan proteiinin, preprolysostafiinin, jonka mole-kyylimassa on noin 42 200 daltonia ja jota mainittu DNA-fragmentti koodittaa. Preprolysostaf iinin aminoterminaali-5 nen sekvenssi sisältää neljän positiivisesti varautuneen aminohapporyhmän rykelmän, jota seuraa varaukseton suurelta osin hydrofobinen sekvenssi, ja sillä on siten signaa-lipeptidin ominaisuudet. Lysostafiinin signaalisekvenssin vieressä on prolysostafiinin aminohapposekvenssi. "Pro"-10 sekvenssi sisältää seitsemästi tandem-toistuvan homologisen 13 aminohaposta koostuvan sekvenssin, ja se poistuu prosessoinnissa valmiiksi entsyymiksi.
1,5 kb:n pituinen DNA-fragmentti, joka sisältää lysostafiinia vastaavan rakennegeenin, koodittaa siten 15 prepropentsyymiproteiinia (preprolysostafiinia), joka käsitellään sitten valmiiksi aktiiviseksi lysostafiiniksi, jonka molekyylimassa on noin 26 920 daltonia. Ennen tätä ei ole tiedetty, että lysostafiini syntetisoituu esiaste-muodossa, joka myöhemmin käsitellään aktiiviseksi entsyy-20 miksi.
Keksinnön mukaisesti saadaan siten preprolysosta-fiini, prolysostafiini ja lysostafiini, joka on suurin piirtein vapaa immunogeenisista stafylokokkiperäisistä ei-lysostafiiniepäpuhtauksista. Keksinnön piiriin kuuluvat 2 5 myös ne 1,5 kb:n DNA-fragmentin osat, jotka koodittavat lysostaf iinin signaalipeptidiä, prolysostaf iinisekvenssejä ja vastaavasti valmista aktiivista lysostafiinia.
Piirrosten lvhvt kuvaus Tätä keksintöä kuvataan seuraavassa viitaten seu-30 raaviin yksityiskohtaiseen kuvaukseen, esimerkkeihin ja piirroksiin, joissa kuvio 1 on immuunitäplä-elektroforeesikuvio, joka esittää E. coli-pPG5 -transformanttien ja S. simulansin lysostafiini- ja prolysostafiinituotantoa.
8 96322
Edullisten suoritusmuotojen kuvaus Tämä keksintö tarjoaa käytettäväksi yhdistelmäplas-mideja, jotka on muodostettu sijoittamalla lysostafiinia koodittava 1,5 kb:n DNA-fragmentti kloonausvektoreihin, 5 jotka replikoituvat erilaisissa isäntämikro-organismeissa.
Erityisen edullisia isäntäorganismeja ovat E. coli ja Bacillus subtilis ja Bacillus sphaericus -kannat sekä muiden Bacillus-lajien kannat. 1,5 kb:n DNA-fragmentti säilyy stabiilisti ja lysostafiinia muodostuu suuria määriä kloo-10 natuissa transformanttibakteereissa, jotka sisältävät näi tä plasmideja. 1,5 kb:n DNA-fragmentti, joka koodittaa lysostafiinia, eristettiin S. simulansista (NRRL B-2628), ja se esiintyy tässä organismissa suuressa penisillinaasi-plasmidissa. Nyt on osoitettu, että S. simulans tuottaa 15 proentsyymiä, jonka molekyylimassa on noin 42 200 dalto-nia. Kun 1,5 kb:n DNA-fragmentti, joka koodittaa lysosta-fiinia, sijoitetaan tämän keksinnön mukaisiin plasmidei-hin, transformanttimikro-organismien tuottama lysostafiini erittyy soluista. Valmista lysostafiinia kerääntyy suuria 20 määriä transformanttien kasvualustaan. Jotkut geneettisesti modifioidut Bacillus-transformanttikannat tuottavat merkittävästi enemmän lysostafiinia millilitraa kohden viljelmäsupernatanttia kuin S. simulans, tämän entsyymin luonnollinen lähde.
25 Tämä keksintö tarjoaa erityisesti käytettäväksi plasmidin pRG5, joka johdettiin E. coli -kloonausvektoris-ta pUC8 sijoittamalla lysostafiinia koodittava 1,5 kb:n DNA-fragmentti plasmidin pUC8 IacZ'-geeniin. Myöhäisessä logaritmisessa vaiheessa olevat viljelmät, joissa kasvaa 30 E. coli -kanta JM105, pUC8-peräisten yhdistelmäplasmidien isäntäbakteeri, joka on transformoitu pRG5:llä, sisälsivät havaittavissa olevia lysostafiiniaktiivisuuspitoisuuksia supernatantti-, periplasma- ja sytoplasmafraktioissa.
Lisäksi tämä keksintö tarjoaa käytettäväksi yhdis-35 telmäplasmideja, joihin on sijoitettu lysostafiinia koo- tl 96322 9 dittava 1,5 kb:n DNA-fragmentti ja joita voidaan käyttää Bacillus-lajien transformointiin. Keksintö tarjoaa siten käytettäväksi Bacillus-yhdistelmäplasmidit pJPl, pDF8 ja pRPl, jotka saavat transformanttiisännässä aikaan lysosta-5 fiinintuotannon. Plasmidit konstruoitiin sijoittamalla pRG5:stä saatava lysostafiinia koodittava 1,5 kb:n DNA-fragmentti Bacillus-plasmideihin pBC16, pBD64 ja vastaavasti pSPVl. Tämän keksinnön eräs lisäsuoritusmuoto sisältää Bacillus-transformanttilajit, jotka tuottavat ja eritit) tävät lysostafiinia transformoituina näillä plasmideilla. Plasmideja pJPl, pDF8 ja pRPl on käytetty B. subtilisin ja B. sphaericusin transformointiin. Erityisen edullinen tämän keksinnön mukainen yhdistelmäplasmidi Bacillus-lajeis-sa käytettäväksi on pJPl. Erityisen edullisia transfor-15 mantti-isäntäorganismeja, jotka tuottavat lysostafiinia, ovat kompetentit Bacillus subtilis BD 170 ja Bacillus sphaericus 00 -kannat.
Erityisesti B. sphaericus -kanta 00 tuotti pJPl:llä transformoituna vähintään viisinkertaisen lysostafiinimää-20 rän litraa kohden viljelmää S. simulansiin (NRRL B-2628) nähden. B. sphaericus -kannasta 00/pJPl eristettyä yhdis-telmätuotetta ei pystytä erottamaan S. simulansin lysosta-fiinista elektroforeettisen liikkuvuuden, immunologisen ristireaktiivisuuden lysostafiinispesifisten vasta-ainei-25 den kanssa eikä katalyyttisen aktiivisuuden perusteella. Tämän keksinnön mukaisten transformanttimikro-organismien tuottama lysostafiini on oleellisesti vapaa ei-lysostafii-niepäpuhtauksista, erityisesti immunogeenisistä stafylo-kokkikontaminanteista.
30 Mikro-organismit E. coli JM105, joka sisältää pRG5:n, ATCC 67076, B. subtilis BD 170, joka sisältää pJPlrn, ATCC 67078, B. sphaericus 00, joka sisältää pJPlrn, ATCC 67080, B. subtilis BD 170, joka sisältää pDF8:n, ATCC 67077, B. subtilis BD 170, joka sisältää 35 pRPl:n, ATCC 67079 on talletettu kokoelmaan the American Type Culture Collection.
10 96322
Seuraavat esimerkit annetaan keksinnön valaisemiseksi eikä niitä ole tarkoitettu sitä rajoittaviksi.
Esimerkki 1 pRG5:n konstruointi 5 Plasmidi pRG5 konstruoitiin sijoittamalla lysosta- fiinia koodittava 1,5 kb:n DNA-fragmentti plasmidin pUC8, käsitellyn kloonausvektorin, jota kuvaavat Vieira ja Messing [Gene 19 (1982) 259-268], lacZ'-geeniin.
Kokonais-DNA eristettiin S. simulansista (NRRL ΒΙΟ 2628) seuraavasti: S. simulans kasvatettiin keskelle logaritmista vaihetta Robinsonin et ai. [J. Bacteriol. 137 (1979) 1158- 1164] kuvaamassa Casamino Acids-alustassa. Solut otettiin talteen sentrifugoimalla, pestiin Tris-puskurissa (50 15 mmol/1 Tris, 50 mmol/1 EDTA, pH 7,8) ja suspendoitiin takaisin Tris-puskuriin, jota oli 20 % alkuperäisestä viljelmän tilavuudesta ja joka sisälsi 50 μΐ/ml lysostafiinia (saatiin Mead-Johnsonilta) ja 0,5 mg/ml lysotsyymiä. Kun seosta oli inkuboitu 2 tuntia lämpötilassa 37 °C, lisät-20 tiin pronaasia (1 mg/ml) ja natriumdodekyylisulfaattia (0,6 %) ja suspensiota inkuboitiin vielä 2 tuntia lämpötilassa 37 °C. Tällä käsittelyllä saatu S. simulans -lysaat-ti uutettiin kahdesti yhtä suurella tilavuudella fenolia käyttämällä tavanomaisia menetelmiä.
25 Nukleiinihappo saostettiin fenolilla uutetun lysaa- tin vesifaasista lisäämällä kaksinkertainen tilavuus jääkylmää 95-%:ista etanolia, otettiin talteen sentrifugoimalla ja liuotettiin TE-puskuriin (10 mmol/1 Tris, 1 mmol/ 1 EDTA, pH 8,0). Liuotettua nukleiinihappoa pilkottiin 2 30 tuntia lämpötilassa 37 °C haiman ribonukleaasin (30 Mg/ml) ja Tl-ribonukleaasin (2 yksikköä/ml) yhdistelmällä näytteessä mahdollisesti olevan RNA:n hajottamiseksi. Tuloksena oleva DNA saostettiin uudelleen etanolilla ja liuotettiin TE-puskuriin. Noin 1,5 mg S. simulans -DNA:ta eris-35 tettiin 0,5 l:sta keskellä logaritmista vaihetta olevaa soluviljelmää.
11 96322 11
Kloonaus tehtiin käyttämällä vektorina pUC8:aa ja isäntänä E. coli K12 -kantaa JM105. Edellä kuvatulla tavalla eristetty S. simulansin kokonais-DNA pilkottiin osittain MboI:llä ja fraktioitiin sentrifugoimalla 20 tuntia 5 kierrosnopeudella 35 000 min'1 sakkaroosigradientin 10 -*· 30 % (12 ml) läpi. Yhdistettiin 10 μq DNA-fragmentteja, joiden koko oli alueella 5 - 15 kb ja keskimäärin 10 kb, ja ligatoitiin 2 μg:aan BamHI-pilkottua pUC8:aa. Tämä plas-midi antaa ampisilliiniresistenssinja sisältää lacZ'-gee-10 nin, joka koodittaa E. colin beeta-galaktosidaasin amino-terminaalista osaa. Vieraan DNA:n insertointi lacZ'-geenissä sijaitsevaan kloonauskohtaan johtaa beeta-galaktosidaasin inaktivoitumiseen .
Noin 80 % JM105-transformanteista, joita saatiin 15 tällä menettelyllä, sisälsi yhdistelmaplasmideja, mikä osoitettiin IacZ'-geenin inaktivoitumisella (lacZ'”), ts. sillä, etteivät transformantit tuottaneet beeta-galaktosi-daasia.
Transformanteista tapahtuvanlysostafiinituotannon 20 tutkimiseksi käytettiin indikaattorikantana S. aureus RN492:a, jota kuvaavat Novock et ai. [Plasmid 2 (1979) 109-129], joilta kanta myös saatiin. Tämä bakteerikanta on hyvin tärkeä beeta-laktamaasin tuottaja ja suhteellisen resistentti ampisilliinille. E. coli JM105 -transforman-. 25 tit, joita oli kasvatettu ampisilliinia (50 μq/ml) sisäl tävällä L-agarilla, käsiteltiin kloroformihöyryllä 30 min niiden hajottamiseksi ja peitettiin suspensiolla, joka sisälsi 0,1 tilavuus-% stationaarisessa vaiheessa olevaa S. aureus RN492 -viljelmää GL-agarissa. E. coli JM105 30 -transformanttien lysostafiinituotanto, joka osoittaa ly-sostafiinigeenin onnistuneen insertoinnin pUC8:aan, määritettiin tarkkailemalla JM105-transformanttipesäkkeen päällä olevien indikaattorisolujen lysoitumista. Noin 9 kloonia 1 000 yhdistelmäplasmideja sisältävästä kloonista 35 (amp+, lacZ' ) sisälsi lysostafiinigeenin; tämä lukumäärä 12 96322 viittaa siihen, että useita lysostafiinigeenikopioita oli läsnä yhtä kromosomiekvivalenttia kohden S. simulans -DNA:ta (noin 2 000 kb).
Lysostafiinia tuottavat transformantit sisälsivät 5 yhdistelmäplasmideja, joissa oli 6,0, 6,5 tai 8,0 kb: n inserttejä. Restriktioanalyysi osoitti, että näitä insert-tejä oli läsnä kumpaankin suuntaan orientoituneina kloo-nausvektorissa ja ne sisälsivät yhteisen 4,3 kb:n DNA-fragmentin. Lysostafiinia koodittava DNA-sekvenssi paikal-10 listettiin lisäksi 4,3 kb:n DNA-fragmentista saatuun 1,5 ke:n Hpall - Hindlll -DNA-fragmenttiin. Tämä 1,5 kb:n DNA-fragmentti kloonattiin uudelleen pUC8:n Accl -Hindlll -kohtiin, jolloin muodostui yhdistelmäplasmidi pRG5, joka on tämän keksinnön eräs edullinen suoritusmuoto.
15 Esimerkki 2
Lysostafiinia koodittavan 1,5 kb: n pituisen DNA-fragmentin sekvenssi ja karakteristiset piirteet pRG5:n lysostafiinia koodittavan 1,5 kb:n fragmentin DNA-sekvenssi määritettiin Sangerin et ai. dideoksi-20 ketjunlopetusmenetelmällä [Proc. Natl. Acad. Sei. 74 (1977) 5463-5467] käyttämällä faagivektoreita M13mpl0 ja M13mpll Messingin kuvaamalla tavalla [Meth. Enzymol. 101 (1983) 20-78].
Koko lysostafiinia koodittavan 1,5 kb:n DNA-frag-25 mentin nukleotidisekvenssi annetaan kaavana I. Viitatak-semme kaavaan I, 1,5 kb:n DNA-fragmentti sisältää 1167 nukleotidin pituisen avoimen lukukehyksen, joka ulottuu nukleotideissa 245 - 246 olevasta TTG-aloituskodonista nukleotideissa 1412 - 1414 olevaan TGA-lopetuskodoniin. 30 Tämä DNA-fragmentti sisältää myös otaksutun promoottorin, jossa on -15 ja -10-alueet nukleotidialueilla 89 - 95 ja 110 - 119, jotka on alleviivattu kaavassa I. Lysosta- fiinipromoottori näyttää homologiselta B. subtilis -promoottoreille, jotka Wongin et ai. kuvaama [Proc. Natl. 35 Acad. Sei. 81 (1984) 1184-1188] Rna-polymeraasin a37-sää- li 96322 13 telyalayksikkö tunnistaa. DNA-sekvenssistä on löydettävissä myös ribosomisitoutumissekvenssi AGGAGGT nukleotidi-alueella 231 - 137, joka sekvenssi on täydellisesti komplementaarinen 16S-ribosomi-RNA:n mRNA-sitoutumissekvens-5 sille, seitsemän emäsparia ennen F-Met:a koodittavaa TTG-aloituskodonia.
Avoin lukukehys koodittaa preprolysostafiinia, 389 aminohappoa sisältävää proteiinia, jonka molekyylimassa on noin 42 200 daltonia ja joka on valmiin entsymaattisesti 10 aktiivisen lysostafiinin esiaste. Kaavassa I annetaan myös DNA-sekvenssistä päätelty preprolysostafiiniaminohapposek-venssi. Tähän asti ei ole tiedetty, että lysostafiini syntetisoituu esiastemuodossa.
14 96322
Kaava I
»: ccggaactcttgaatgtttagttttgaaaattscaaaaaaaaacctactttcttaaiat: 5l: ga^teatattattttaacaeaatcacttagaatttcaaaaatettaaagtcaatttttga 5 121: gtgtgtttgtatatttcatcaaaatcaatcaatattattttactttcttcatcgttaaaa 181: aatgtaatatttataaaaatatgctattctcataaatgtaataataaattaggaggtatt 241: aaggttgaagaaaacaaaaaacaattattatacgagaectttagctattggactgagtac f-MetLysLyaThrLyaAanAanTyrTyrThrArgProLeuAlalleGiyLeuSerThr 10 301: atttgccttagcatctattgtttatggagggattcaaaatgaaacacatgcttctgaaaa
PheAlaLeuAlaSerlleValTyrGlyGiylleGlnAanGluThrHiaAlaSerGiuLya 361: aagtaatatggatgtttcaaaaaaagtagctgaagtagagacttcaaaagccecagtaga
SerAanMetAapValSerLyaLyaValAlaGluValGluThrSerLyaAlaProVaiGlu 421: aaataoagctgaagtagagacttcaaaagctccagtagaaaatacagctgaagtagagac 15 AanThrAIaGluValGluThrSerLyaAlaProValGluAanThrAlaGluValGiuThr 481: ttcaaaagctccagtagaaaatacagctgaagtagagacttcaaaagctccagtagaaaa
SerLyaAIaProValGluAanTbrAlaGiuValGiuThrSerLyaAIaProValGluAan 541: tacagctgaagtagagacttcaaaagctccggtagaaaatacagctgaagtagagactts
ThrAlaGluValGluThrSerLyaAlaProValGluAanThpAlaGluValGluThrSer 20 601: aaaagccccagtagaaaatacagctgaagtagagacttcaaaagccctggttcaaaatag
LyaAlaProValGluAanThrAlaGluValGluThrSerLyaAlaLeuValGlnAanArg 661: aacagctttaagagctgcaacacatgaacattcagcacaatggttgaataattacaaaaa
ThrAlaLeuArgAlaAlaThrHiaGluHiaSerAlaGlnTrpLeuAanAanTyrLyaLya 721: aggatatggttacggtccttatccattaggtataaatggcggtatgcactacggagttga 25 GlyTyrGlyTyrGlyProTyrProLeuGlylleAanGlyGlyMetHiaTyrClyValAap 781: tttttttatgaatattggaacaccagtaaaagctatttcaagcggaaaaa&agttgaagc
PhePheMetAanlleGlyThrProValLyaAlalleSerSerGlyLyalieValGluAla 841: tggttggagtaattacggaggaggtaatcaaataggtcttattgaaaatgatggagtgca
GlyTrpSerAsnTyrGlyGlyGlyAanGlnlleGlyLeuIleGluAanAapGlyValHia 30 901: tagacaatggtatatgcatctaagtaaatataatgttaaagtaggagattatgtcaaagc
ArgGlnTrpTyrMetHiaLeuSerLyaTyrAanVallyaValGlyAapTyrValLyaAla 961: tggtcaaataatcggttggtctggaagcactggttattctacagcaccacatttacactt
GlyGlnllelleGlyTrpSerGlySerThrGlyTyrSerThrAlaProHiaLeuHiaPhe 1C21: ccaaagaatggttaattcattttcaaattcaactgcccaagatccaatgectttcttaaa 35 GlnArgMetValAanSerPheSerAanSerTbrAlaGlaAapProMetProPheLeuLya 1081: gagcgcaggatatggaaaagcaggtggtacagtaactccaacgccgaatacaggttggaa
SerAlaGlyTyrGlyLyaAlaGlyGlyTfcrValThrProThrProAanThrGlyTrpLya
II
96322 15
Kaava I (jatkuu) 1 HI: aacaaacaaatatggcacactatataaatcagagtcagctagcttcacacctaatacaga
ThrAsnLysTyrGlynirLeuTyrLysSerCluSerAlaSerPheThrProAsnThrAsp 5 1201: tataataacaagaacgactggtccatttagaagcatgscgcagtcaggagtcttaaaagc
IlelleThrArgThrrhrGlyProPheArgSerMetProGlnSerGlyValLeuLysAla 1261: aggtcaaacaattcattatgatgaagtgatgaaaeaagacggtcatgtttgggtaggtta
GlyGlnThrlleHisTyrAspGluValMetLyaClnAapGlyHisValTrpValGlyTyr 13215 tacaggtaacagtggccaacgtattpacttgcctgtaagaacatggaataaatctactaa 10 ThrGlyAsnSerGlyGlnArglleTyrLeuProValArgThrTrpAsnLysSerThrAan 1381: tactctaggtgttctttggggaactataaagtgagcgegetttttataaacttatatgat
TarLeuGlyValLeuTrpGlyThrlleLya H»1: aattagagcaaataaaaattttttctcattcctaaagttgaagc 15 Preprolysostafiinin aminoterminaalinen 36 aminoha pon sekvenssi on signaalipeptidi, ts. suurelta osin hydrofobinen alue, joka esiintyy erittyneiden proteiinien esiasteissa.
Signaalipeptidit ovat transloituneiden erittyvien 20 proteiinien aminoterminaalisia sekvenssejä, jotka osallistuvat kasvavan polypeptidiketjun ohjaamiseen kalvon läpi kalvoon sitoutuneiden ribosomien synteesin jälkeen. Euka-ryooteissa signaalipeptidin lohkaisee pois spesifinen pro-teaasi, jota on karkean endoplasmaverkon (rough endoplas-25 mic reticulum, RER) ontelopuolella, jopa ennen kuin poly-peptidisynteesi on mennyt loppuun.
Bakteereissa, joissa ei ole RER:ää, erittyvät proteiinit syntetisoidaan ribosomeilla, jotka voivat olla sitoutuneina plasmakalvon sisäpintaan. Syntyvien bakteeri-30 polypeptidiketjujen signaalipeptidi näyttää osallistuvan proteiinin kuljetukseen plasmakalvon läpi. Bakteerien sig naalipeptidit poistuvat yleensä plasmakalvon läpi tapahtuvan kuljetuksen aikana tai pian sen jälkeen, sillä erittyneet proteiinit,joita kertyy kasvualustaan, eivät enää 35 sisällä tätä sekvenssiä.
16 96322
Preprolysostafiinin useat piirteet ovat nähtävissä kaavasta II, joka esittää preprolysostafiinin 152 amino-terminaalista aminohappoa ja 1,5 kb:n DNA-fragmentin nuk-leotidisekvenssin emäsparista 389 emäspariin 661 (B).
5 Erittyneiden tai kalvoon sitoutuneiden proteiinien signaalipeptidille tai signaalisekvenssille on tunnusomaista hydrofobisten aminohappojen suuri pitoisuus, joka näkyy kaavassa IIA esitetyssä preprolysostafiinin signaa-lipeptidissä. Vaikka kaikkien signaalisekvenssin hydrofo-10 bisuus on vakiohavainto, kulloinenkin aminohapposekvenssi ja peptidin pituus voivat vaihdella laajasti- Epätavallisen pitkiä (31 - 44 aminohappoa) signaalisekvenssejä esiintyy esimerkiksi Bacillus-lajeissa [Watson, Nucleic Acids Res. 12 (1984) 5145-5164].
15 Preprolysostaf iinin signaalisekvenssin lohkaisukoh- ta on aminohapporyhmien 36 - 37 kohdassa oleva Ala-Ser-si-dos (kaava IIA). Preprolysostafiinin signaalisekvenssiä koodittavan DNA:n poistaminen 1,5 kb:n DNA-fragmentista johtaisi mitä todennäköisimmin erittymättömään proteii-20 niin. Funktionaalisesta ekvivalenttista signaalipeptidiä koodittava DNA-sekvenssi, joka korvaa lysostafiinin signaalipeptidiä koodittavan DNA:n, koodittaisi mitä todennäköisimmin myös eritettävissä olevaa "preprolysostafiinia", tosin erilaisella, mutta funktionaalisella signaalipepti-: 25 dillä varustettua.
Erittymiseen tarvittavan signaalisekvenssin lohkea-misen jälkeen kerääntyvä ja myöhemmin käsiteltävä proteiini on prolysostafiini. Kaavassa IIA esitetään myös proly-sostafiinin sekvenssi Ala-49:stä Arg-139:ään, joka sisäl-30 tää seitsemästi tandem-toistuneen 13 aminohapon sekvenssin. Tämä proteiinin osa, joka sisältää suuren määrän glu-tamiinihappoa ja on nettovaraukseltaan negatiivinen, lohkeaa pois käsiteltäessä prolysostafiini valmiiksi lysosta-fiiniksi. DNA-sekvenssi, ts. emäsparialue 389 - 661, joka 35 koodittaa toistuvia aminohappojaksoja, koostuu seitsemän
II
96322 17 kertaa toistuvasta homologisesta 39 emäsparin sekvenssistä (kaava IIB). Nämä seitsemästi tandem-toistuvat aminohappo-sekvenssit (IIA) ja vastaavat toistuvat nukleotidisekvens-sit (IIB) esitetään numeroin 1-7 kaavassa II.
5
Kaava II
A
f-MET, LYS LYS THR LYS ASN ASN TYR TYR THR ARG PRO LEU ALA ILE GLY LEU SER THR PHE ALA LEU
20 ALA SER ILE VAL TYR GLY GLY ILE GLN ASN GLU THR HIS
ALA3e SER37 GLU LYS SER ASN MET ASP VAL SER LYS LYS VAL
1 ALA.» GLU VAL GLU THR SER LYS ALA PRO VAL GLU ASN THR
2 ALA GLU VAL GLU THR SER LYS ALA PRO VAL GLU ASN THR
3 ALA GLU VAL GLU THR SER LYS ALA PRO VAL GLU ASN THR
A ALA GLU VAL GLU THR SER LYS ALA PRO VAL GLU ASN THR
5 ALA GLU VAL GLU THR SER LYS ALA PRO VAL GLU ASN THR
6 ALA GLU VAL GLU THR SER LYS ALA PRO VAL GLU ASN THR
7 ALA GLU VAL GLU THR SER LYS ALA PRO VAL GLU ASN ARG,3g 15
THR ALA LEU ARGtl3 ALA144 ALA THR HIS GLU HIS SER ALA GLN
B
1 GCT GAA GTA GAG ACT TCA AAA GCC CCA GTA GAA AAT ACA
2 GCT GAA GTA GAG ACT TCA AAA GCC CCA GTA GAA AAT ACA
3 GCT GAA GTA GAG ACT TCA AAA GCC CCA GTA GAA AAT ACA
4 GCT GAA GTA GAG ACT TCA AAA GCC CCA GTA GAA AAT ACA
5 GCT GAA GTA GAG ACT TCA AAA GCC CCA GTA GAA AAT ACA
6 GCT GAA GTA GAG ACT TCA AAA GCC CCA GTA GAA AAT ACA
7 GCT GAA GTA GAG ACT TCA AAA GCC CCA GTA GAA AAT AGAee,
Monet erilaiset proteiinit syntetisoituvat esiaste-muodossa ja käsitellään myöhemmin valmiiksi aktiivisiksi 25 proteiineiksi. Esimerkiksi insuliini, joka aktiivisessa muodossaan on kaksiketjuinen polypeptidi, syntetisoituu yhtenä polypeptidiketjuna (proinsuliinina), joka muutetaan myöhemmin valmiiksi insuliiniksi sisäisen polypeptidin proteolyyttisen poiston jälkeen. Myös B. subtilisin ja B.
30 amyloliquefaciensisin alkaliset ja neutraalit proteaasit syntetisoituvat preproentsyymeinä. Aiemmin ei ole kuitenkaan tiedetty, että lysostafiini syntetisoituu preproent-syyminä. Kuten taulukossa I osoitetaan, alkalisten ja neutraalien proentsyymien muuttumiseen valmiiksi entsyymeiksi 35 liittyy samanlainen lohkaisukohta kuin prolysostafiinin muuttumiseen lysostafiiniksi.
1β 96322
Taulukko I
Preprolysostafiinin vertaaminen Bacillus-preproteaaseihin
Ryhmien lukumäärä
Entsyymi_Preprosekvenssi_Valmis_Lopullinen lohkeamiskohta 5 Subtil isiini B. subtil is 106 275 HisGluTyr X AlaGlnSerVal B. amyloliquefaciens 107 275 HisAlaTyr t AlaGlnSerVal
Neut raali proteaas i B. subtil is 221 300 ValGluHis X AlaAlaAlaThr 10 B. amyloliquefaciens 221 300 ValGluHis X AlaAlaThrThr
Lysostapiini 143 246 AlaLeuArg X AlaAlaThrHis S. simulansista peräisin olevan puhdistetun valmiin lysostafiinin Edman-hajotuksella määritetty aminoterminaa-15 linen sekvenssi, Ala-Ala-Thr-His-Glu, vastaa pRG5:n 1,5 kb:n DNA-fragmentin koodttaman preprolysistapiinisekvens-sin aminohappoja 144 - 148. DNA-sekvenssin perusteella ennustettu valmiin lysostafiinin aminohappokoostumus korreloi erinoamisesti S. simulans (NRRL B-2628)-viljelmäsuper-20 natanteista saadun [Trayer et ai., J. Biol. Chem. 245, 4842-4846] puhdistetun lysostafiinin kokeellisesti määritetyn aminohappokoostumuksen kanssa. Valmiin aktiivisen lysostapiinin molekyylimassa on ennustetusta sekvenssistä määritettynä noin 26 920 daltonia. Kuten kaavasta IIA käy 25 ilmi, proentsyymin muuttumisessa valmiiksi lysostafiiniksi : tapahtuu Arg-Ala -sidoksen katkeaminen 1,5 kb:n DNA-frag mentin koodittaman preprolysostafiinin ryhmien 143 - 144 kohdalla.
Esimerkki 3 30 Lysostafiinin tuottaminen E. coli JM105/pRG5 -transformanteissa pRG5:llä transformoitua E. coli JM105:ä sisältävä myöhäisessä logaritmisessa vaiheessa oleva viljelmä, jota kasvatettiin LB-alustassa (20 ml), joka sisälsi 50 μg/ml 35 ampisilliinia, otettiin talteen sentrifugoimalla ja pes-
II
19 96322 tiin Tris-suola-puskurilla (TSB, 10 mmol/1 Tris, 30 mmol/1 NaCl, pH 8,0). Pelletti suspendoitiin uudelleen 1 ml:aan TSB:tä ja äänikäsiteltiin 2 min lämpötilassa 0 °C. Viljelmä konsentroitiin 20-kertaiseen pitoisuuteen tekemällä 5 ultrasuodatus Amicon YM10 -kalvolla. Lysostafiiniaktiivi-suutta havaittiin edellä kuvatulla tavalla preparoiduissa supernatantti- (65 % kokonaisaktiivisuudesta), periplasma-(15 %) ja sytoplasmafraktioissa (20 %).
Valmistettiin kaniinin vasta-aineita S. simulans 10 -supernatanteista puhdistettua lysostafiinia vastaan ja ne puhdistettiin affiniteettikromatografiällä Rescein et ai. [J. Biol. Chem. 257 (1982) 7196-7202] mukaisesti ja niitä käytettiin immuunitäpläkokeissasekä E. coli JM105/pRG5:n että S. simulansin tuottaman lysostafiinin ja prolysosta-15 fiinin paikallistamiseksi ja karakterisoimiseksi.
Puhdistettuja vuohen vasta-aineita kaniinin immuno-globuliineille kytkettiin alkaliseen fosfataasiin (Sigma) tavanomaisin menetelmin.Immuunitäplien muodostamista varten näytteille tehtiin ensin natriumdodekyylisulfaatti-20 (SDS)-polyakryyliamidigeelielektroforeesi, minkä jälkeen erotetut proteiinit siirrettiin nitroselluloosa-arkeille tavanomaisin menetelmin. Nitroselluloosasuodattimilla olevat immuunireaktiiviset proteiinit detektoitiin inkuboi-malla suodattimia ensin kaniinin lysostafiinivasta-aineen 25 ja sitten alkaliseen fosfataasiin kytketyn anti-kaniini- immunoglobuliinin kanssa. Alkalinen fosfataasi -aktiivisuuden detektointiin käytettiin kromogeenista substraattia, 5-bromi-4-kloori-indoksyylifosfaattia plus nitrosini-tetratsoliumia, Blanken et ai. [Anal. Biochem. 136 (1984) 30 175-179] kuvaamalla tavalla.
Kuvio 1 esittää immuunitäpläkokeiden tuloksia. Seu-raavat näytteet laitettiin merkityille kaistoille, käsiteltiin elektroforeettisesti, siirrettiin suodattimille ja saatettiin reagoimaan anti-lysostafiinivasta-aineen kans-35 sa: S. simulans -viljelmäsupernatantit, joita otettiin 2„ 96322 myöhäisessä logaritmisessa (kaistat 1 ja 6) , varhaisessa stationaarisessa (kaista 2) , keskistationaarisessa (kaista 3) ja myöhäisessä stationaarisessa (kaista 4) vaiheessa; E. coli/pRG5 -supernatantti (kaista 8) ja solu-uute (kais-5 ta 7) myöhäisessä logaritmisessa vaiheessa olevista viljelmistä. Mead-Johnsonin lysostafiinia laitettiin kaistoille 5 ja 9. Kuviossa 1 esitetään myös molekyylimassa-standardien asemat.
Immuunitäpläkokeet osoittivat valmiin lysostafiinin 10 (mp. 26 920) läsnäolon myöhäisessä logaritmisessa vaiheessa olevien E. coli JM105/pRG5 -transformanttien konsentroidussa viljelmäsupernatantissa (kuvio 1, kaista 8) . Ristireagoiva proteiini, jolla oli samanlainen liikkuvuus elektroforeesissa, havaittiin lysostafiinia tuottavien S.
15 simulans -viljelmien supernatantissa.
Myöhäisessä logaritmisessa vaiheessa olevien E. coli JM105/pRG5 -transformanttien elektroforeesikäsitelty-jen solu-uutteiden immunologinen analyysi osoitti kahden lysostafiinivasta-aineen kanssa reagoivan proteiinin läs- 20 näolon. Valmista lysostafiinia oli läsnä suhteellisen pieniä määriä. Lisäksi havaittiin suurehko määrä ristireak-tiivista proteiinia, jonka näennäinen molekyylimassa oli 64 000 daltonia, E. coli -solufraktiossa (kuvio 1, kaista 7) . Ristireaktiivinen proteiini, jonka liikkuvuus elekt- . 25 roforeesissa oli samanlainen kuin tämän suuremman prote iinin, havaittiin myös S. simulans -supernatanteissa, jotka oli otettu talteen pääasiassa myöhäisen logaritmiseen vaiheeseen asti tehdyn viljelyn jälkeen. Suurempi ristireaktiivinen proteiini on mitä todennäköisimmin prolysosta- 30 fiini, sillä sekä S. simulansissa että E. coli JM105/ . pRG5:ssä se ilmaantuu ennen lysostafiinia ja häviää val miin lysostafiinin kerääntyessä (kuvio 1, kaistat 1 - 4 ja 8) . Prolysostafiinin molekyylimassan näennäinen yliarviointi johtuu todennäköisimmin alentuneesta sitoutumises- 35 ta SDS:ään, mihin on syynä suuri glutamiinihapporyhmäpi-toisuus prolysostafiinisekvenssin tandem-toistojaksoissa.
li 96322 21
Lysostafiini syntetisoituu siten preproentsyymiä. Preprolysostafiinin signaalisekvenssi lohkeaa polypeptidin vektorikuljetuksen aikana kalvon läpi. Tuloksena oleva prolysostafiini käsitellään sitten solun ulkopuolella val-5 miiksi lysostafiiniksi. Muuttaminen valmiiksi aktiiviseksi entsyymiksi tehdään katkaisemalla Arg143 - Ala144 -peptidi-sidos. Prolysostafiinin aminoterminaalinen osa poistuu ilmeisesti vaiheittain, ts. koko proentsyymisekvenssi ei poistu kerralla. Tämä prosessointireaktio tapahtuu statio-10 naarisessa vaiheessa olevien S. simulans -viljelmien su-pernatanteissa. Koska myös E. coli JM105/pRG5 -transfor-manttiviljelmät tuottavat valmista entsyymiä, proentsyymin käsittely on joko autokatalyyttinen tai siihen osallistuu samankaltaisia käsittelyaktiivisuuksia, joita on läsnä 15 sekä E. coli JM105:ssä että S. simulansissa. E. coli JM105/pRG5 -transformanteilla on kuitenkin se etu, että käsittely näyttää tapahtuvan solunsisäisesti eikä solun ulkopuolella, kuten S. simulansissa.
Esimerkki 4 20 Plasmidien, jotka Bacillus spp. -transformanteissa saavat aikaan lysostafiinituotannon, konstruointi Bacillus-ilmentymisjärjestelmillä kloonattujen geenien tuotteiden tuottamiseksi on merkittäviä etuja verrattuina samankaltaisiin järjestelmiin, joissa käytetään E. 25 colia isäntäorganismina. Bacillus-lajit erittävät normaa listi helposti proteiineja ympäröivään alustaan. Tämän edun vuoksi yhdistelmäplasmidit, jotka sisältävät lysosta-fiinia koodittavan 1,5 kb:n DNA-sekvenssin, konstruoitiin plasmideista, jotka replikoituvat erilaisissa Bacillus-la-30 jeissa.
Lysostafiinia koodittavan DNA:n lähteenä käytettiin plasmidia pRG5. Plasmidin pRG5 DNA, joka oli pilkottu HindIII:lla ja EcoRI:llä valmistajan ohjeiden mukaisesti, fraktioitiin tekemällä preparatiivinen elektroforeesi l-%-3 5 risessa agaroosissa. Lysostafiinia koodittava 1,5 kb: n 22 96322 DNA-fragmentti paikallistettiin etidiumbromidivär jäyksellä ja siirrettiin elektroforeesin avulla DEAE-nitroselluloo-sasuodatinliuskalle. Liuska pestiin NET-puskurilla (0,15 mol/1 NaCl, 0,1 mmol/1 EDTA, 0,02 mol/1 Tris, pH 8,0) ja 5 sitoutunut DNA eluoitiin inkuboimalla liuskaa l tunti lämpötilassa 65 °C NET-puskurissa, joka sisälsi 1 mol/1 NaCl. Etidiumbromidi poistettiin DNA:sta uuttamalla kahdesti liuos yhtä suurella tilavuudella n-butanolia. DNA seostettiin lisäämällä vesifaasiin kaksikertainen tilavuus kylmää 10 95-%:ista etanolia, otettiin talteen sentrifugoimalla, pestiin 80-%:isella etanolilla ja liuotettiin TEpuskuriin (esimerkki 1).
a. Plasmidi pJPl
Yhdistelmäplasmidi pJPl, joka on eräs tämän keksin-15 non edullinen suoritusmuoto, konstruoitiin insertoimalla lysostafiinia koodittava 1,5 kb:n DNA-fragmentti Bacillus-plasmidiin pBC16, joka sisältää tetrasykliiniresistenssi-geenin. Plasmidi pBC16, joka saatiin Richard P. Novickin kokoelmasta, Public Health Research Institute, New York, 20 New York, oli eristetty maaperän Bacilluksista, ja se on voimakkaasti homologinen ja yhteensopimaton pUBHOin, S. aureusin kanamysiiniresistenssin antavan plasmidin, suhteen. pCB16-DNA eristettiin B. subtilisista Birboimin [Meth. Enzymol. 100 (1983) 243-255) kuvaamalla emäs-SDS 25 -menettelyllä. Solut otettiin talteen VY-alustassa [25 g vasikanlihauutetta (Difco), 5 g hiivauutetta (Difco)/l vettä] yön yli kasvatetusta viljelmästä (250 ml) sentrifugoimalla, pestiin TE-puskurissa ja suspendoitiin uudelleen 5 ml:aan TEG-puskuria (25 mmol/1 Tris, 10 mml/1 EDTA, 50 30 mmol/1 glukoosia, pH 8,0). Lisättiin lysotsyymiä (1 mg/ml) ja suspensiota inkuboitiin huoneen lämpötilassa 20 min. Kun seokseen oli lisätty 10 ml liuosta, joka sisälsi 0,2 % NaOH ja 1 % SDS, saatua seosta inkuboitiin lämpötilassa 0 °C 45 min. Sitten lisättiin 10 ml liuosta, joka sisälsi 3 35 mol/1 kaliumasetaattia ja 1,8 mol/1 muurahaishappoa, ja 11 96322 23 seosta inkuboitiin edelleen lämpötilassa 0 °C 30 min. Siten saatua lysaattia sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 15 000 x g 20 min. Lisättiin kaksinkertainen tilavuus 95-%:ista etanolia supernatanttiin, ja tuloksena oleva sakka, joka 5 muodostui 15 min:ssa huoneen lämpötilassa, otettiin talteen sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 10 000 x g 10 min, pestiin 80-%:isella etanolilla ja liuotettiin TE-puskuriin (0,5 ml). Tällä menettelyllä saatiin noin 200 Mg umpiren-kaista pBCl6-DNA:ta.
10 Plasmidi-DNA linearisoitiin pilkkomalla EcoRI:llä.
Linearisoidun pBC16-DNA:n (noin 1 Mg) ja lysostafiinia koodattavan 1,5 kb:n DNA-fragmentin (noin 1 Mg) seos tehtiin tylppäpäiseksi käyttämällä DNA-polymeraasia (Klenow-fragmentti). Plasmidin ja fragmentin DNA:ta ligatoitiin 15 sitten T4-DNA-ligaasin avulla, jolloin muodostui suljettuja rengasmaisia plasmidi-DNA -molekyylejä.
Kompetentit B. subtilis -kannan BD 170 solut, jotka saatiin David Dubnaulta, Public Health Institute, New York, New York, transformoitiin ligatoidulla DNA:11a (noin 20 1 M9 DNA:ta 0,1 ml kohden soluja) Contenten et ai. menetelmällä [Mol. Gen. Genet. 167 (1979) 251-258]. Sitten soluja inkuboitiin lämpötilassa 37 °C 90 min plasmidin tetrasykliiniresistenssigeenin ilmentymisen mahdollistamiseksi ja siirrostettiin TBAB-agarille, joka sisälsi vali-25 koivan määrän tetrasykliiniä (5 μg/ml) ja suspendoituja lämmöllä tapettuja S. aureus -soluja lysostafiinituotannon osoittamiseksi.
Lysostafiinin mittaukseen tarkoitetut lämmöllä tapetut S. aureus -solut preparoitiin autoklavoimalla (40 30 min) stationaarisessa vaiheessa olevaa viljelmää, joka kasvoi 500 ml:ssa CYGP-lientä. Kuolleet solut sentrifugoitiin ja suspendoltiin uudelleen steriiliin veteen (10 ml). Tätä kuolleita soluja sisältävää valmistetta lisättiin 2 ml 500 ml:aan TBAB-agaria indikaattorimaljojen valmistami-35 seksi.
96322 24
Noin 1 % ligatoidulla DNA:11a transformoiduista B. subtilis -soluista tuotti lysostafiinia, minkä osoittaa B. subtilis -pesäkkeiden ympärillä olevien stafylokokkisolu-jen hajoaminen. pJPl saatiin siirrostamalla uudelleen yksi 5 B. subtilis -transformanteista lysostafiini-indikaattori-maljoille muutamia kertoja, kunnes saatiin täysin stabiili klooni.
Lysostafiiniaktiivisuutta esiintyi pääasiassa nestemäisessä alustassa stationaariseen vaiheeseen kasvatet-10 tujen B. subtilis BD 170/pJPl -transformanttien superna-tanttifraktiossa. Immuunitäpläanalyysi osoitti, että soluista erittyi lysostafiinin esiastemuotoa, joka sitten muuttui valmiiksi lysostafiiniksi. Immuunitäpläkokeet osoittivat lisäksi, että viljelmäsupernatanteissa oli läs-15 nä lysostafiinin hajoamistuotteita, joiden määrä väheni hyvin pieneksi, kun viljelmään lisättiin seriiniproteaasi-inhibiittoria. Siten on todennäköistä, että seriinipro-teaasia erittyy alustaan tai on läsnä B. subtilis BD 170 -solujen pinnalla.
20 b. pDF8 ia pRPl
Kaksi muuta lysostafiinigeenin sisältävää plasmi-dia, pDF8 ja pRPl, konstruoitiin Bacillus-lajien transfor-mointia varten oleellisesti tavalla, joka esitettiin esimerkissä 4a pJPlrn konstruoinnin yhteydessä.
- 25 pDF8 saatiin insertoimalla lysostafiinia koodittava 1,5 kb:n DNA-fragmentti plasmidin pBD64, kanamysiini- ja koramfenikoliresistenssin antavan plasmidin, joka saatiin David Dubnaun kokoelmasta, Public Health Research Institute, New York, New York, EcoRI-pilkkoutumiskohtaan. pDF 30 saatiin, kuten edellä, kun B. subtilis BD 170 oli transformoitu uudelleen renkaaksi suljetuilla plasmideilla ja siirrostettu tällaisia transformantteja lysostafiini-indi-kaattorimaljoilla, jotka sisälsivät 5 Mg/ml kloramfeniko-lia. pDF8 valikoitiin siirrostamalla positiiviset kloonit 35 uudelleen useaan kertaan.
25 96322
Samalla tavalla konstruoitiin pRPl insertoimalla lysostafiinia koodittava 1,5 kb:n DNA-fragmentti pSPVlrn, kloramfenikoliresistenssiplasmidin, joka saatiin Steven Projanilta, Public Health Research Institute, New York.
5 New York, Hpal-kohtaan. Kaikki myöhemmät pRPl:n eristys-vaiheet olivat identtisiä pJPl:n ja pD8:n konstruoinnissa käytettyjen vaiheiden kanssa.
Esimerkki 5 B. sphaericus OO/pJPl -transformanttien lysosta- 10 fiinituotanto
Joukko Bacillus-kantoja transformoitiin pJPlrllä sopivan isännän saamiseksi laajamittaiseen lysostafiini-tuotantoon. Transformantit, jotka saivat aikaan suuria hajotuskehiä lysostafiini-indikaattorimaljoilla, eristet-15 tiin ja karakterisoitiin tarkemmin. Tutkituista Bacillus-kannoista B. spahericus -kanta 00, organismi, joka on eristetty ja jota ylläpidetään Public Health Research Institute, New York, New York, viljelmäkokoelmassa, saa aikaan suurimman lysostafiinituotannon.
20 B. sphaericus 00/pJPl -transformantit saatiin ai kaan käsittelemällä protoplastit, joita saatiin käsittelemällä kokonaiset solut lysotsyymillä, pJPl-DNA:lla poly-etyleeniglykolin läsnä ollessa Changin et ai. menetelmällä [Molec. Gen. Genet. 168 (1979) 11-115]. Soluja viljeltiin 25 käsittelyn jälkeen DM3-regenerointimaljoilla tetrasyklii-nin (5 μg/ml) läsnä ollessa ennen tutkimista lysostafiini-indikaattorimaljoilla.
VY- tai CYGP-alustassa kasvavat B. sphaericus 00/ pJPl -transformantit tuottivat ja erittivät noin 150 g 30 valmista aktiivista lysostafiinia litraa kohden kasvualustaa. Tämä määrä on noin viisinkertainen siihen määrään nähden, jonka S. simulans tuottaa tällä hetkellä käytettävissä olevilla parhailla fermentointimenetelmillä. Aktiivinen lysostafiini kerääntyy kasvualustaan ja hajoaa 35 vain vähän jopa viljelmien pitkäaikaisen inkuboinnin yhteydessä, ja sen osuus on noin 80 % ekstrasellulaarisen 26 96322 proteiinin kokonaismäärästä. B. sphaericus OO/pJPl -trans-formanteista eristettyä lysostafiinia ei pystytä immunologisesta , elektroforeettisesti eikä katalyyttisesti erottamaan S. simulans -viljelmistä saatavasta tuotteesta. Ly-5 sostafiini eristetään kasvualustasta tunnetuin fraktioin- tisaostusmenetelmin (erottaminen suolana). Erityisen tehokas puhdistus saadaan vaihtoehtoisesti aikaan yhdistämällä saostus ja lysostafiinia tuottavien B. sphaericus OO/pJPl -transformanttien viljelmistä saadun fermentointiliemen 10 kromatografinen erotus.
Solut poistetaan fermentointiliemestä esimerkiksi sentrifugoimalla tai ultrasuodattamalla ja supernatanttiin lisätään kiinteää ammoniumsulfaattia 40 - 60 %, edullisesti 50 % kyllästyspitoisuudesta. Kun seosta on pidetty 1 15 tunti lämpötilassa 4 °C, lysostafiinia sisältävä sakka otetaan talteen sentrifugoimalla. Saanto on tässä vaiheessa yli 80 %.
Sakka liuotetaan takaisin mahdollisimman pieneen määrään 10 mM natriumfosfaattipuskuria (pH 7,00, 50 mmol/1 20 NaCl) ja dialysoidaan samaa puskuria vastaan, jota käytetään 100-kertainen tilavuus. Mahdollisen hiukkasmaisen materiaalin poistamisen jälkeen käsitellään dialysoitu liuos kromatografisesti kationinvaihtopylväällä (edullisesti Pharmacia FPLC Mono S)eluoiden gradienttipuskurilla, 25 jossa suolapitoisuus kasvaa 0,05:stä 0,25:een mol/1 NaCl. Lysostafiinisaanto oli yhdessä kromatografiavaiheessa yli 90 %. Lysostafiiniaktiivisuus liittyy kahteen päähuippuun. Myöhemmin eluoituva lysostafiinihuippu koostuu ei-kova-lenttisista proteiiniaggregaateista. Nämä aggregaatit ha-30 joavat laimennettaessa puskurilla ja natriumdodekyylisul-faattipolyakryyliamidigeelielektroforeesin olosuhteissa.
Lysostafiini, joka on puhdistettu B. sphaericus 00/pJPl -transformanttien kasvualustasta, on oleellisesti vapaa ei-lysostafiiniepäpuhtauksista. Erityisen merkityk-35 sellistä on, että B. sphaericus 00/pJPl -lysostafiini on oleellisesti vapaaimmunogeenisistä stafylokokkikontaminan-teista.
Il
Claims (12)
1. DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että se on 5 a) eristetty 1,5 kb:n DNA-fragmentti, joka koodit- taa lysostafiinia, jolla on seuraava aminohapposekvenssi, ja joka käsittää seuraavan nukleotidisekvenssin: 1: ccggaactcttgaatgtttagttttgaaaattscaaaaaaaaacctactttcttaatat: 10 6’.: sattcatattattttaacacaatcagttagaatttcaaaaatcttaaagtcaatttttga 121: gtgtgtitgtatatttcatcaaaatcaatcaatattattttactttcttcatcgttaaaa 181: aatgtaatatttataaaaatatgctattctcataaatgtaataataaattaggaggtatt 2M: aaggttgaagaaaacaaaaaacaattattatacgagaectttagctattggaetgagtac 15 f-MetLysLysThrLysAsnAanTyrTyrThrArgProLeuAlalleGlyleuSerTtr 301: atttgcctiagcatctattgtttatggagggattcaaaatgaaacacatgcttctgaaaa PheAlaleuAlaSerlleValTyrGlyGIylleGlsAanGluThrHiaAlaSerGluLys 361: aagtaatatggatgtttcaaaaaaagtagctgaagtagagacttcaaaagecccagtaga SerAanMetAapVaiSerLysLyaValAlaGluValGluThrSerLyaAlaProVaiGlu 20 421: aaatacagctgaagtagagacttcaaaagctccagtagaaaatacagetgaagtagagac AsnThrAlaGluValGluThrSerLyaAlaProValGluAanThrAlaGluValGluTbr 481: ttcaaaagctccagtagaaaatacagctgaagtagagacttcaaaagctccagtagaaaa SerLyaAlaProValGluAanThrAlaGIuValGluThrSerLyaAlaProValGluAan 541: tacagctgaagtagagacttcaaaagctccggtagaaaatacagctgaagtagagacttc
25 ThrAlaGluVaiGluThrSerLyaAlaProValGluAanThrAlaGluValGluThrSer 601: aaaagccccagtagaaaatacagctgaagtagagacttcaaaagccctggttcaaaatag LyaAlaProValGluAanThrAlaGiuValGluThrSerLyaAlaLeuValGinAanArg 661: aacagctttaagagctgcaacacatgaacattcagcacaatggttgaataattacaaaaa ThrAlaLeuArgAlaAlaTbrHiaGluHisSerAlaGlnTrpLeuAanAanTyrLysLya 30 721: aggatatggttacggtccttatccattaggtataaatggcggtatgcactacggagttga GlyTyrGlyTyrGlyProTyrProLeuGlylleAanGlyGlyMetHisTyrGiyValAap 781: tttttttatgaatattggaacaccagtaaaagctatttcaagcggaaaaacagttgaagc PhePbeHetAanlleGlyThrProValLyaAlalleSerSerGlyLyalleValGluAla 841: tggttggagtaattacggaggaggtaatcaaataggtcttattgaaaatgatggagtgca
35 GlyTrpSerAaaTyrGlyGlyGlyAsnGlnlleGlyLeuIleGluAaaAapGlyValHia 28 96322 901: tagacaatggtatatgoatctaagtaaatataatgttaaagtaggagattatgtc&aagc ArgGlnlrpTyrMetHiaLeuSerLysTyrAanValLysValGlyAapTyrValLyaAla 961: tggtcaaataatcggttggtctggaagcactggttattetacagcaccacatttacactt GlyGlnllelleGlyTrpSerGlySerThrGlyTyrSerThrAlaProHiaLeuHisPhe 5 1C21: ccaaagaatggttaattcattttcaaattcaactgcecaagatccaatgcctttottaaa GlnArgMetValAanSerPheSerAsnSerThrAlaGlnAspProMetProPheLeuLya 1081: gagcgcaggatatggaaaagcaggtggfacagtaactccaacgccgaatacaggttggaa SerAlaGIyTyrGlyLyaAlaGlyGlyThrValThrProThrProAanThrGlyTrpLys 1U1: aacaaacaaatatggcacactatataaatcagagtcagctagcttcacacctaatacaga
2. Yhdistelmäplasmidi, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaista, mikro-organismin Staphylococcus simulans (NRRL B-2628) lysosta- 10 fiiniä koodittavaa DNA:ta, joka transformoidussa mikrobi-isännässä pystyy ilmentämään mainitun DNA:n.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdistelmäplasmidi, tunnettu siitä, että se on pRG5, joka on läsnä talletetussa transformoidussa mikro-organismissa
15 Escherichia coli ATCC 67076.
4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdistelmäplasmidi, tunnettu siitä, että se on pJPl, joka on läsnä talletetussa transformoidussa mikro-organismissa Bacillus subtilis ATCC 67077 tai Bacillus sphaericus ATCC 20 67080.
5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdistelmäplasmidi, tunnettu siitä, että se on pDF8, joka on läsnä talletetussa transformoidussa mikro-organismissa Bacillus subtilis ATCC 67078.
6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdistelmäplas midi, tunnettu siitä, että se on pRPl, joka on läsnä talletetussa transformoidussa mikro-organismissa Bacillus subtilis ATCC 67079.
7. Transformoitu bakteeri, tunnettu siitä, 30 että se tuottaa mikro-organismin Staphylococcus simulans (NRRL B-2628) lysostafiinia ja on transformoitu patenttivaatimuksen 2 mukaisella yhdistelmäplasmidilla, joka sisältää lysostafiinia koodittavaa DNA:ta.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen transformoitu 35 bakteeri, tunnettu siitä, että mikro-organismi on E. coli tai Bacillus-laji. 96322 30
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen transformoitu bakteeri, tunnettu siitä, että mikro-organismi on E. coli, B. subtilis tai B. sphaericus.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen transformoitu 5 bakteeri, tunnettu siitä, että mikro-organismi on E. coli K-12 -kanta JM105, B. subtilis -kanta BD 170 tai B. sphaericus -kanta 00.
10 ThrAsnLysTyrGiyTfcrLeuTyrLysSerCluSerAlaSerPheTbrProAsnThrAap 1201: tataataacaagaacgactggtccatttagaagcatgccgcagtcaggagtcttaaaagc IlelleThrArgThrThrGlyProPheArgSerMetProGlnSerGlyValLeuLysAla 1261: aggtcaaacaattcattatgatgaagtgatgaaaeaagacggtcatgtttgggtaggtta GlyGlnThrlleHisTyrAapGluValMetLysGlnAapGlyHisValTrpValGlyTyr 15 1321: tacaggtaacagtggccaacgtatttacttgcctgtaagaacatggaataaatctactaa IhrGlyAsnSerGlyGlnArglleTyrLeuProValArgThrTrpAsnLysSerTiirAsn 1381: tacttt2ggtgttctttggggaacta:aaagtgagcgcgctttttataaaettatatgat rarLeuGlyValLeuTrpGlyThrlleLys
20. Utti: aattagagcaaataaaaattttttctcattcctaaagttgaagc jossa on avoin lukukehys, joka ulottuu nukleotideissa 245 - 247 olevasta TTG-aloituskodonista nukleotideissa 1412 -1414 olevaan TGA-lopetuskodoniin, joka avoin lukukehys 25 koodittaa preprolysostafiinia, joka on kypsän aktiivisen lysostafiinin esiaste, jolla on 389 aminohappoa sisältävä, signaalipeptidin ja prolysostafiinin käsittävä sekvenssi, joka käsitellään synteesin jälkeen kypsäksi lysostafiinik-si, 30 b) eristetty DNA-fragmentti, joka koodittaa kypsää . lysostafiinia ja käsittää kohdassa a) esitetyn DNA:n nuk leotidit 674 - 1411, c) eristetty DNA-fragmentti, joka koodittaa preprolysostaf iinia ja käsittää kohdassa a) esitetyn DNA:n nuk-35 leotidit 245 - 1411, II 96322 29 d) eristetty DNA-fragmentti, joka koodittaa proly-sostafiinia ja käsittää kohdassa a) esitetyn DNA:n nukleotidit 356 - 1411, tai e) eristetty DNA-fragmentti, joka koodittaa lyso-5 stafiinin signaalipeptidiä ja käsittää kohdassa a) esitetyn DNA:n nukleotidit 245 - 355.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen transformoitu bakteeri, tunnettu siitä, että se vastaa talle- 10 tusta ATCC 67076, ATCC 67077, ATCC 67078, ATCC 67079 tai ATCC 67080.
12. Menetelmä tuotteen valmistamiseksi, jolla on lysostafiiniaktiivisuus, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 7, 8, 9, 10 tai 11 mukaista transformoi- 15 tua bakteeria, joka ei kuulu sukuun Staphylococcus, viljellään kunnes lysostafiinia koodittava DNA ilmentyy tuottaen prolysostafiinia ja mainittu bakteeri pilkkoo proly-sostafiinin mainitun tuotteen muodostamiseksi. 1 96322 31
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US85240786A | 1986-04-16 | 1986-04-16 | |
| US85240786 | 1986-04-16 | ||
| US07/034,464 US4931390A (en) | 1986-04-16 | 1987-04-10 | Expression of the cloned lysostaphin gene |
| US3446487 | 1987-04-10 | ||
| PCT/US1987/000873 WO1987006264A1 (en) | 1986-04-16 | 1987-04-15 | Expression of the cloned lysostaphin gene |
| US8700873 | 1987-04-15 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI884691A0 FI884691A0 (fi) | 1988-10-12 |
| FI884691A FI884691A (fi) | 1988-10-12 |
| FI96322B FI96322B (fi) | 1996-02-29 |
| FI96322C true FI96322C (fi) | 1996-06-10 |
Family
ID=26710985
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI884691A FI96322C (fi) | 1986-04-16 | 1988-10-12 | Lysostafiinia koodittava DNA-fragmentti, sitä sisältävä yhdistelmäplasmidi ja transformoitu bakteeri sekä menetelmä lysostafiiniaktiivisuuden omaavan tuotteen valmistamiseksi |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4931390A (fi) |
| EP (1) | EP0299978B1 (fi) |
| JP (1) | JP2963695B2 (fi) |
| AT (1) | ATE92524T1 (fi) |
| AU (1) | AU616379B2 (fi) |
| CA (1) | CA1297051C (fi) |
| DE (1) | DE3786918T2 (fi) |
| DK (1) | DK174941B1 (fi) |
| FI (1) | FI96322C (fi) |
| HU (1) | HU205386B (fi) |
| IE (1) | IE60769B1 (fi) |
| IL (1) | IL82260A (fi) |
| NZ (1) | NZ219998A (fi) |
| PT (1) | PT84705B (fi) |
| WO (1) | WO1987006264A1 (fi) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5260212A (en) * | 1987-02-09 | 1993-11-09 | Quest International Flavors & Food Ingredients Co., Division Of Indopco | Cloned gene encoding for bacteriocin from Pediococcus acidilactici |
| US5858962A (en) * | 1987-05-11 | 1999-01-12 | Ambi Inc. | Composition for treating mastitis and other staphylococcal infections |
| US5011772A (en) * | 1988-02-05 | 1991-04-30 | Public Health Research Institute Of The City Of N.Y. | High yield protein production system |
| JPH03500606A (ja) * | 1988-05-05 | 1991-02-14 | アプライド マイクロバイオロジー，インコーポレイテッド | プロテアーゼ欠損グラム陽性菌類及び組換え体産生用宿主有機体としての用途 |
| CA2009336A1 (en) * | 1989-07-03 | 1991-01-03 | Peter A. Vandenbergh | Cloned gene encoding for bacteriocin from pediococcus acidilactici |
| DE4425645A1 (de) * | 1994-07-20 | 1996-02-22 | Mueller Karl & Co Kg | Deletiertes Lysostaphingen von Staphylococcus simulans |
| ES2201189T3 (es) * | 1995-06-23 | 2004-03-16 | Ambi Inc. | Metodo para el control de bacterias gram positivas resistentes a antibioticos y tratamiento de la infeccion. |
| WO1997008553A1 (en) * | 1995-08-22 | 1997-03-06 | The Regents Of The University Of California | Targeting of proteins to the cell wall of gram-positive bacteria |
| US5910479A (en) * | 1996-10-18 | 1999-06-08 | Ambi Inc. | Method for the treatment of Streptococcus pneumoniae infection |
| US6028051A (en) * | 1997-07-23 | 2000-02-22 | Ambi Inc. | Method for the treatment of staphylococcal disease |
| US7091332B1 (en) | 1998-06-22 | 2006-08-15 | University Of Vermont | Treatment of staphylococcus infections |
| WO1999067381A1 (en) * | 1998-06-22 | 1999-12-29 | University Of Vermont And State Agricultural College | Treatment of staphylococcus infections |
| US6875903B2 (en) * | 1998-06-22 | 2005-04-05 | University Of Vermont | Treatment of Staphylococcus infections |
| JP4416866B2 (ja) * | 1998-07-30 | 2010-02-17 | オリエンタル酵母工業株式会社 | カルシウム測定用液状試薬 |
| US6569830B1 (en) | 1999-03-05 | 2003-05-27 | Ambi, Inc. | Compositions and methods for treatment of staphylococcal infection while suppressing formation of antibiotic-resistant strains |
| MXPA02003885A (es) * | 1999-10-19 | 2005-06-03 | Bharat Biotech International L | Expresion de lisostafina madura recombinante. |
| CA2469720A1 (en) * | 2001-12-21 | 2003-10-09 | Biosynexus Incorporated | Truncated lysostaphin molecule with enhanced staphylolytic activity |
| BR0308710A (pt) * | 2002-03-26 | 2007-01-09 | Biosynexus Inc | conjugados poliméricos antimicrobianos |
| EP1494614A4 (en) * | 2002-03-26 | 2010-08-11 | Biosynexus Inc | BREAKING BY ENZYMES OF BIOTERIAL BIOFILMS |
| US20100221237A1 (en) * | 2003-03-26 | 2010-09-02 | Biosynexus Incorporated | Enzyme disruption of bacterial biofilms |
| CN101440179B (zh) | 2003-03-28 | 2011-09-21 | 三井化学株式会社 | 聚烯烃树脂组合物 |
| CN100485031C (zh) * | 2004-09-02 | 2009-05-06 | 上海高科联合生物技术研发有限公司 | 一种溶葡萄球菌酶工业化纯化工艺 |
| EP1885403B1 (en) | 2005-04-12 | 2013-05-08 | Nektar Therapeutics | Poly(ethyleneglycol) conjugates of Lysostaphin |
| CN100475965C (zh) * | 2005-07-22 | 2009-04-08 | 上海高科联合生物技术研发有限公司 | 一种大肠杆菌高效外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法 |
| US20080095756A1 (en) * | 2006-09-05 | 2008-04-24 | Biosynexus Incorporated | Compositions Comprising Lysostaphin Variants And Methods Of Using The Same |
| AU2008273946A1 (en) * | 2007-07-09 | 2009-01-15 | Microsens Medtech Limited | Detection of micro-organisms based on their NAD-dependent DNA ligase activity |
| US20110044968A1 (en) * | 2008-03-10 | 2011-02-24 | Pharmal N Corporation | Compositions for treatment with metallopeptidases, methods of making and using the same |
| WO2012050787A1 (en) | 2010-09-29 | 2012-04-19 | Ibis Biosciences, Inc. | Fungal nucleic acid extraction |
| CN105579053B (zh) * | 2013-08-06 | 2021-08-31 | 达特茅斯学院理事会 | 非糖基化溶葡球菌素变体蛋白 |
| WO2015100448A2 (en) | 2013-12-28 | 2015-07-02 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Multimodal antimicrobial therapy |
| CN112626055A (zh) | 2014-05-14 | 2021-04-09 | 达特茅斯学院理事会 | 去免疫化溶葡萄球菌酶和使用方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3278378A (en) * | 1962-04-19 | 1966-10-11 | Schindler Charles Alvin | Staphylococcus-derived antibiotic |
| US4467036A (en) * | 1981-11-12 | 1984-08-21 | The Board Of Regents Of The University Of Washington | Bacillus thuringiensis crystal protein in Escherichia coli |
| US4617266A (en) * | 1983-04-28 | 1986-10-14 | Genex Corporation | Production of Protein A |
-
1987
- 1987-04-10 US US07/034,464 patent/US4931390A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-14 CA CA000534626A patent/CA1297051C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-15 DE DE87903128T patent/DE3786918T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-04-15 NZ NZ219998A patent/NZ219998A/xx unknown
- 1987-04-15 AT AT87903128T patent/ATE92524T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-04-15 EP EP87903128A patent/EP0299978B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-15 AU AU73021/87A patent/AU616379B2/en not_active Ceased
- 1987-04-15 HU HU872384A patent/HU205386B/hu not_active IP Right Cessation
- 1987-04-15 IE IE98087A patent/IE60769B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-04-15 WO PCT/US1987/000873 patent/WO1987006264A1/en active IP Right Grant
- 1987-04-15 JP JP62502621A patent/JP2963695B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-15 IL IL8782260A patent/IL82260A/xx not_active IP Right Cessation
- 1987-04-16 PT PT84705A patent/PT84705B/pt unknown
- 1987-12-15 DK DK198706592A patent/DK174941B1/da not_active IP Right Cessation
-
1988
- 1988-10-12 FI FI884691A patent/FI96322C/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0299978A1 (en) | 1989-01-25 |
| ATE92524T1 (de) | 1993-08-15 |
| CA1297051C (en) | 1992-03-10 |
| JP2963695B2 (ja) | 1999-10-18 |
| AU616379B2 (en) | 1991-10-31 |
| IL82260A (en) | 1992-08-18 |
| HU205386B (en) | 1992-04-28 |
| AU7302187A (en) | 1987-11-09 |
| HUT50874A (en) | 1990-03-28 |
| PT84705B (pt) | 1989-11-30 |
| EP0299978B1 (en) | 1993-08-04 |
| DE3786918D1 (de) | 1993-09-09 |
| FI96322B (fi) | 1996-02-29 |
| IE870980L (en) | 1987-10-16 |
| DK174941B1 (da) | 2004-03-08 |
| DK659287A (da) | 1987-12-15 |
| US4931390A (en) | 1990-06-05 |
| NZ219998A (en) | 1991-05-28 |
| PT84705A (en) | 1987-05-01 |
| JPH01503036A (ja) | 1989-10-19 |
| IL82260A0 (en) | 1987-10-30 |
| DE3786918T2 (de) | 1993-11-11 |
| FI884691A0 (fi) | 1988-10-12 |
| FI884691A (fi) | 1988-10-12 |
| DK659287D0 (da) | 1987-12-15 |
| IE60769B1 (en) | 1994-08-10 |
| WO1987006264A1 (en) | 1987-10-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI96322C (fi) | Lysostafiinia koodittava DNA-fragmentti, sitä sisältävä yhdistelmäplasmidi ja transformoitu bakteeri sekä menetelmä lysostafiiniaktiivisuuden omaavan tuotteen valmistamiseksi | |
| Recsei et al. | Cloning, sequence, and expression of the lysostaphin gene from Staphylococcus simulans. | |
| Lee et al. | Sequence determination and comparison of the exfoliative toxin A and toxin B genes from Staphylococcus aureus | |
| Mulbry et al. | Parathion hydrolase specified by the Flavobacterium opd gene: relationship between the gene and protein | |
| Titball et al. | Molecular cloning and nucleotide sequence of the alpha-toxin (phospholipase C) of Clostridium perfringens | |
| US5004692A (en) | Cloning and expression of phosopholipase C genes | |
| Sizmann et al. | Primary structure requirements for the maturation in vivo of penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11105 | |
| Steiert et al. | A Gene Coding for a Membrane–Bound Hydrolase is Expressed as a Secreted, Soluble Enzyme in Streptomyces Lividans | |
| Tsuboi et al. | Characterization of the genes coding for two major cell wall proteins from protein-producing Bacillus brevis 47: complete nucleotide sequence of the outer wall protein gene | |
| Chu et al. | Cloning and sequence analysis of the muramidase-2 gene from Enterococcus hirae | |
| Tweten | Cloning and expression in Escherichia coli of the perfringolysin O (theta-toxin) gene from Clostridium perfringens and characterization of the gene product | |
| WO1986006743A1 (en) | Bacterial enzymes | |
| Kovacevic et al. | Secretion of staphylococcal nuclease by Bacillus subtilis | |
| US5585253A (en) | Extracellular serine protease and a Bacillus subtilis alkaline neutral an serine protease mutant strain | |
| Marahiel et al. | Cloning of the tyrocidine synthetase 1 gene from Bacillus brevis and its expression in Escherichia coli | |
| DK175020B1 (da) | Fremgangsåde til udtrykkelse og ekstracellulær udskillelse af proteiner i G(-)bakterie, rekombinant DNA-konstruktion og plasmidvektor kodende herfor, samt G(-)bakterie indeholdende disse | |
| CA2020828A1 (en) | Streptokinase proteins, corresponding genes, corresponding plasmid recombinants, corresponding transformants and processes for preparing same | |
| McVay et al. | Toxin A secretion in Pseudomonas aeruginosa: the role of the first 30 amino acids of the mature toxin | |
| Zaghloul et al. | Translational coupling in Bacillus subtilis of a heterologous Bacillus subtilis-Escherichia coli gene fusion | |
| Hulett et al. | Two alkaline phosphatase genes positioned in tandem in Bacillus licheniformis MC14 require different RNA polymerase holoenzymes for transcription. | |
| Grayson et al. | A gene from Renibacterium salmoninarum encoding a product which shows homology to bacterial zinc-metalloproteases | |
| Šebo et al. | Delineation of the minimal portion of the Bacillus sphaericus 1593M toxin required for the expression of larvicidal activity | |
| Gormley et al. | Secretion and processing of the Bacillus subtilis endo‐β‐1, 3‐1, 4‐glucanase in Escherichia coli | |
| Jung et al. | Expression of the colH gene encoding Clostridium histolyticum collagenase in Bacillus subtilis and its application to enzyme purification | |
| US5047334A (en) | Novel prokaryotic expression and secretion system |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| FG | Patent granted |
Owner name: APPLIED MICROBIOLOGY, INC. |
|
| MA | Patent expired |