DK174941B1

DK174941B1 - DNA-fragment kodende for lysostaphin, rekombinante plasmider indeholdende dette, tranformerede mikroorganismer samt ekspession af det klonede lysostaphin

Info

Publication number: DK174941B1
Application number: DK198706592A
Authority: DK
Inventors: Paul A Recsei
Original assignee: Ambi Inc
Priority date: 1986-04-16
Filing date: 1987-12-15
Publication date: 2004-03-08
Also published as: HU205386B; DK659287A; ATE92524T1; PT84705B; JPH01503036A; IL82260A; FI884691A0; FI96322B; DK659287D0; FI96322C; AU7302187A; HUT50874A; PT84705A; AU616379B2; IE870980L; US4931390A; CA1297051C; EP0299978B1; IE60769B1; IL82260A0

Description

DK 174941 B1

Den foreliggende opfindelse angår et 1,5 kb DNA-fragment, som koder for lysostaphin. Opfindelsen angår også hidtil ukendte plasmider, der i transformerede mikrobielle værter udtrykker genet for lysostaphin.

Lysostaphin er en bakteriocin, der udskilles af en enkelt kendt 5 stamme af Staphylococcus simulans. som oprindeligt blev isoleret og navngivet Staphylococcus staphvlolvticus af Schindler og Schuhardt. Fremstillingen af lysostaphin af S. staphvlolvticus er tidligere beskrevet i USA patentskrift nr. 3.278.378 udstedt 11. oktober 1966 og i "Proceedings of the National Academy of Sciences", vol. 51, pp. 414-421 10 (1964). Den enkelte organisme S. staphvlolvticus (NRRL B-2628), som pro ducerer lysostaphin, blev for nylig identificeret som en biovar af S. simulans af Sloan et al., Int. 0. System. Bacteriol., vol. 32, pp. 170-174 (1982). Da navnet S. staphvlolvticus ikke findes på den godkendte liste over bakterienavne, er organismen, som producerer lysostaphin, 15 blevet omdøbt til S. simulans.

Bakteriociner er proteiner udskilt af bakterier, som dræber og undertiden lyser (opløser) beslægtede bakterier. Fx lyser og dræber lysostaphin praktisk taget alle kendte staphylococcale arter, men er inaktiv mod bakterier af alle andre slægter. Selv om dens katalytiske egenskaber 20 ikke er godt karakteriserede, er det blevet påvist, at lysostaphin er en endopeptidase, der tilsyneladende spalter polyglycin-tværbindi nger i peptidoglycanen, der findes i staphylococcers cellevægge.

Lysostaphi nproduktion sker i den stationære fase af S. simulans kulturer dyrket under visse betingelser og synes at være koordineret med 25 produktion af andre ekstracellulære enzymer. Kulturer, der producerer lysostaphin, synes at være resistente mod dens aktiviteter, mens kulturer dyrket under ikke-producerende betingelser er sensitive.

Tidligere studier har vist, at lysostaphin kan fremstilles ved fermentationsteknik, hvor S. simulans dyrkes i flydende kultur. Sådanne 30 fermentationsteknikker er beskrevet i US patentskrift nr. 3.278.378 udstedt 11. oktober 1966 og i "Proceedings of the National Academy of Sciences", vol. 51, pp. 414-421 (1964). Forskellige forbedringer i produktionen af lysostaphin ved fermentationsteknik er også sket som dokumenteret i USA patent nr. 3.398.056 udstedt 20. august 1968 og 3.594.284 35 udstedt 20. juli 1971. De to sidstnævnte referencer omhandler forbedringer i dyrkningsmedier og inokkulationsteknik, hvorved produktionen af lysostaphin ved fermentering kan accelereres og forbedres. Fremstilling og rensning af lysostaphin ved hjælp af kendte metoder resulterer imid- 2 DK 174941 B1 lertid i et produkt, der i et vist omfang er forurenet af andre staphy-lococcale produkter. Immunisering af dyr eller mennesker med lysostaphin, som er forurenet med non-lysostaphint immunologent materiale fra staphylococcer, kan eventuelt resultere i en uønsket og potentielt uhel-5 dig immunologisk reaktion.

Lysostaphin isoleret fra kulturfiltrater af S. simulans er blevet karakteriseret som et zinkholdigt protein bestående af en enkelt poly-peptidksde med en molekylvægt på ca. 25.000 dalton. Det er varmelabilt, non-dialyserbart og har et isoelektrisk punkt på ca. pH 11. Endvidere 10 bliver evnen hos lysostaphin til at lyse levende og varmedræbte staphylococcer samt staphylococcale cellevæge ødelagt ved behandling med enzymet trypsin.

Rekombinant-DNA-teknik, hvorved gener for en række forskellige proteiner kan klones ved indføring i et plasmid, kosmid eller en fag-15 vektor, som dernæst kan anvendes til at transformere en mikroorganisme, er blevet anvendt i vid udstrækning til at studere strukturen og ekspressionen af gener og til at fremstille en let kilde for forskellige rene proteiner til forskellige formål. Der har imidlertid ikke været nogen rapporter vedrørende anvendelse af sådan kloningsteknik til indfø-20 ring af genet, der koder for lysostaphin i en kloningsvektor til opbygning af nye vektorer, der kan transformere en fra S. simulans (NRRL B-2628) forskellig mikroorganisme for at muliggøre fremstilling af store mængder lysostaphin.

I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse beskrives re-25 kombinant-plasmi der, der i transformerede mikrobielle værter vil udtrykke et gen, der koder for lysostaphin. Rekombinans plasmiderne blev udledt ved at indføre en identificeret DNA-sekvens, der koder for lysostaphin i passende kloningsvektorer.

Egnede kloningsvektorer omfatter sådanne, der replikerer i bakte-30 rier, herunder inter alia. E. col i. Bacillus spp. og Streptomvces samt gær. Værtsmikroorganismer omfatter EL coli, Bacillus spp., Streptomvces og gær. Opfindelsen er imidlertid ikke begrænset til de ovennævnte vektorer og mikrobielle værter. Det vil være indlysende for fagmanden, at andre vektorer og værter kan anvendes ved udøvelse af opfindelsen.

35 I én udførelsesform blev DNA-sekvensen, der koder for lysostaphin, indført i E. coli plasmidet pUC8, en velkendt kloningsvektor, til dannelse af rekombinant-plasmid pRG5. E. coli JM105 transformeret ved pRG5 producerer lysostaphin.

3 DK 174941 B1 I en anden udførelsesform for opfindelsen blev lysostaphin genet fra pRG5 klonet i Bacillus pi asmider pBC16, pBD64 og pSVl, hvorved der fremstilledes rekombinant-plasmider, hhv. pJPl, pDF8 og pRPl. Arter af Bacillus, herunder B. subtil is. transformeret med en af disse tre rekom-5 binante Bacillus pi asmider indeholdende genet for lysostaphin, udskilte store mængder lysostaphin i dyrkningsmediet. Opfindelsen tilvejebringer endvidere en B. sphaericus stamme OO, der ved transformering med rekombinant-pl asmid pJPI producerer ca. fem gange den mængde lysostaphin, som kan opnås fra kulturer af S. simulans (NRRL B-2628), den naturlige pro-10 ducent.

Det lysostaphin, som er udtrykt som følge af transformation af mikrobielle værter ved hjælp af de ovennævnte pi asmider og andre pi asmider indeholdende lysostaphin genet, er i det væsentlige uden non-lyso-staphin kontaminanter, især immunogene staphylococcale kontaminanter.

15 Opfindelsen tilvejebringer endvidere et 1,5 kilobasepar (kbp) De fragment, som koder for lysostaphin, hvilket gens sekvens, og 389 amino-syre-proteinet deraf, præprolysostaphin, har en molekylvægt på ca.

42.200 dalton, der kodes af DNA-fragmentet. Aminotermi nal sekvensen af præprolysostaphin indeholder en klynge af fire positivt ladede aminosy-20 rerester fulgt af en uladet hovedsageligt hydrophob sekvens og har derfor egenskaber af et signalpeptid. Ved siden af lysostaphin-signalpepti-det findes prolysostaphin-aminosyresekvensen. "Pro"-sekvensen indeholder syv tandem-gentagelser af en homolog 13 aminosyresekvens, der fjernes under oparbejdningen til modent enzym.

25 1,5 kbp DNA-fragmentet, der indeholder det strukturelle lysosta- phingen, koder derfor for et præproenzym-protein (præprolysostaphin), der efterfølgende oparbejdes til modent aktivt lysostaphin med en molekylvægt på ca. 25.920 dalton. Det var derfor hidtil ukendt, at lysostaphin syntetiseres på prækursorform, der efterfølgende oparbejdes til et 30 aktivt enzym.

Inden for opfindelsens rammer falder endvidere DNA-fragmenter, der er homologe med det 1,5 kbp DNA-fragment, som koder for lysostaphin med formel I, og som koder for funktionelt ækvivalente proteiner.

Opfindelsen tilvejebringer endvidere præprolysostaphin, prolyso-35 staphin og lysostaphin, der er i det væsentlige uden non-lysostaphin immunogene staphylococcale kontaminanter. Opfindelsen angår yderligere de dele af 1,5 kbp DNA-fragmentet, der koder for hhv. lysostaphin-signal-peptidet, prolysostaphinsekvenserne og det modne aktive lysostaphin.

4 DK 174941 B1 DNA-fragmenter, der er homologe med disse tre portioner af 1,5 kbp DNA-fragmentet, der koder for lysostaphin, og som indkoder funktionelt ækvivalente peptider, falder også inden for opfindelsens rammer.

Opfindelsen beskrives i det følgende under henvisning til den føl -5 gende detaljerede beskrivelse, eksempler og figurer, hvori figur 1 er et immunoblottet elektropherogram, som viser produktionen af lysostaphin og prolysostaphin af E. coli/pRG5-transformanter og $. simulans.

Den foreliggende opfindelse tilvejebrigner i sine foretrukne udfø-10 relsesformer rekombinant-plasmider, der er blevet skabt ved at indføre 1,5 DNA-fragmentet, der koder for lysostaphin, i kloningsvektorer, der replikerer i forskellige værtsmikroorganismer. Særligt foretrukne værtsorganismer er E. coli og stammer af Bacillus subtil is. Bacillus sohaericus og andre Bacillus arter. 1,5 kbp DNA-fragment kan holdes sta-15 bilt og lysostaphin udtrykkes i høje niveauer i klonede transformerede bakterier indeholdende pi asmiderne. 1,5 kbp DNA-fragmentet, der koder for lysostaphin, isoleredes fra S. simulans (NRRL B-2628) og er til stede i denne organisme på et stort penicillinaseplasmid. Et proenzym med en molekylvægt på ca. 42.200 dalton er nu blevet påvist at blive 20 produceret af S. simulans. Når 1,5 kbp DNA-fragmentet, der koder for lysostaphin, indføres i plasmiderne ifølge den foreliggende opfindelse, bliver lysostaphin, udtrykt af de transformerede mikroorganismer, udskilt fra cellerne. Modent lysostaphin akkumuleres i store mængder i mediet, hvori transformanterne vokser. Nogle af de gensplejsede, trans-25 formerede Bacillus stammer producerer væsentligt mere lysostaphin pr. ml kultursupernatant end S. simulans. den naturlige kilde for enzymet.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer navnlig plasmid pRG5, der blev afledt fra E. coli kloningsvektoren pUC8 ved indføring af 1,5 kbp DNA-fragmentet, der koder for lysostaphin i lacZ'-genet for plasmid 30 pUC8. Sen-logaritmiske fase kulturer af E. coli stamme JM105, som er værtsbakterien for rekombinant-plasmider afledt fra pUC8, transformeret med pRG5, havde påviselige niveauer af lysostaphinaktivitet i superna-tanten, periplasmiske og cytoplasmiske fraktioner.

Endvidere tilvejebringer den foreliggende opfindelse navnlig re-35 kombinant-plasmider, hvori 1,5 kbp DNA-fragmentet, der koder for lysostaphin, er blevet indført, og som kan anvendes til transformering af Bacillus arter. Opfindelsen tilvejebringer således rekombinant Bacillus-plasmider pJPl, pDF8 og pRPl, hvori en transformeret vært udtrykker 5 DK 174941 B1 lysostaphin. Plasmiderne konstrueredes ved at indføre 1,5 kbp DNA-frag-mentet, der koder for lysostaphin, der opnås fra pRG5, i Bacillus plasmider hhv. pBC16, pBD64 og pSPVl. En yderligere udførelsesform af opfindelsen omfatter de transformerede Bacillus arter, som producerer og 5 udskiller lysostaphin ved transformation med disse plasmider. Plasmider pJPl, pDF8 og pRPl har været anvendt til at transformere B. subtilis og B. sphaericus. Det særligt foretrukne rekombinant-plasmid ifølge opfindelsen til anvendelse i Bacillus arter er pJBl. De særligt foretrukne transformerede værtsorganismer, som udtrykker lysostaphin, er kompetente 10 Bacillus subtilis BD170 og Bacillus sphaericus 00 stammer.

Især producerede B. sphaericus stammen 00 transformeret med pJPl mindst fem gange den mængde lysostaphin pr. liter dyrkningsmedium som S^. simulans. (NRRL B-2628). Det fra B. sphaericus stammen 00/pJPl isolerede rekombinantprodukt kan ikke skelnes fra S. simulans lysostaphin på basis 15 af elektroforetisk mobilitet, immunologisk tværreaktivitet med lysostaphin specifikke antistoffer og katalytisk aktivitet. Lysostaphin produceret af transformerede mikroorganismer ifølge opfindelsen er i det væsentlige uden non-lysostaphin kontaminanter, navnlig immonogene staphylococcal e kontaminanter.

20 Opfindelsen tilvejebringer endvidere det klonede 1,5 kbp DNA-frag- ment, som koder for lysostaphin, hvis sekvens har formel I. DNA sekvensen er karakteriseret af en åben læseramme, der går fra en TTG-initie-ringskodon ved nukleotider 245-247 til en TGA-termineringskodon med nukleotider 1412-1414, som koder for 389 aminosyren præprolysostaphin.

25 Det vil kunne indses, at DNA-fragmenter, som i sekvens er homologe med sekvensen i formel I, og som koder for funktionelt ækvivalente proteiner, falder inden for opfindelsens rammer.

E. coli JM105, der bærer pRG5, ATCC accessions nr. 67076, B. subtilis BD170, der bærer pJPl, ATCC accessions nr. 67078, B. sphaericus 30 00, der bærer pJPl, ATCC accessions nr. 67080, B. subtilis BD170, der bærer pDF8, ATCC accessions nr. 67077 og B. subtilis BD170, der bærer pRPl, ATCC accessions nr. 67079, er deponeret hos American Type Culture Collection.

Opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler, som ikke er 35 begrænsende for denne: 6 DK 174941 B1

Eksempel 1

Konstruktion af pRG5

Plasmid pRG5 konstrueredes ved at indføre 1,5 kbp DNA-fragmentet, der koder for lysostaphin, i lacZ'-genet af plasmid pUC8, en splejset 5 kloningsvektor beskrevet af Vieira og Messing, Gene, Vol. 19, pp. 259-268 (1982).

Totalt DNA i soleredes fra S. simulans (NRRL B-2628) som følger: S. simulans dyrkedes til midtlogaritmisk fase i casamino syremedium beskrevet af Robinson et al. J. bacteriol. Vol. 137, pp. 1158-1164 10 (1979). Cellerne høstedes ved centrifugering, vaskedes i Tris puffer (50mM Tris, 50 mM EDTA, pH 7,8) og resuspenderedes til 20% af det oprindelige dyrkningsvol umen i Tris puffer indeholdende 50 Mg/ml lysostaphin (opnået fra Mead-Johnson) og lysozym (0,5 mg/ml). Efter to timers inkubation ved 37°C tilsattes pronase (1 mg/ml) og natriumdodecylsul fat 15 (0,6%), og suspensionen inkuberedes i yderligere to timer ved 37°C. Det ved denne behandling således opnåede lysat af S. simulans ekstraheredes to gange med et lige så stort volumen phenol under anvendelse af standardteknik.

Nukleinsyren fældedes fra den vandige fase af det phenolekstrahe-20 rede lysat ved tilsætning af to volumendele iskold 95% ethanol, opsamledes ved centrifugering og opløstes i TE puffer (10 mM Tris, ImM EDTA, pH

8,0). Den opløste nukleinsyre fordøjedes i to timer ved 37°C med en kombination af pankreatisk ribonuklease (30 Mg/ml) og TI ribonyklease (2U/ml) til nedbrydning af alt tilstedeværende RNA i prøven. Den resul-25 terende DNA fældedes igen med ethanol og opløstes i TE puffer. Ca. 1,5 mg S. simulans DNA i soleredes fra en 0,5 1 kultur af mid-logfase celler.

Kloning udførtes under anvendelse af pUC8 som vektor og E. coli K12 stamme JM105 som vært. Total S. simulans DNA, isoleret som beskrevet ovenfor, fordøjedes delvis med Mbo I og fraktioneredes ved centrifuge-30 ring gennem en 12 ml 10-30% saccharosegradient ved 35.000 rpm i 20 timer. 10 /ig DNA-fragmenter varierende i størrelse fra 5-15 kilobase par (kbp) med en gennemsnitsstørrelse på 10 kbp sammenførtes og splejsedes med 2 M9 Barn Hi-fordøjet pUC8. Dette plasmid bibringer ampicillin resistens og bærer lacZ'-genet, der koder for aminotermi nal del en af JL 35 coli beta-galactosidase. Indføring af fremmed DNA i det i lacZ'-genet lokaliserede kloningssted resulterer i inaktivering af beta-galactosida-se.

Ca. 80% af de ved denne fremgangsmåde opnåede JM105 transformanter 7 DK 174941 B1 indeholdt rekombinant-plasmider som indikeret ved inaktiveringen af lacZ'-genet (lacZ'~), dvs. at transformanterne ikke producerer beta-ga-lactosidase.

Til screening for lysostaphin ekspression i transformanterne an-5 vendtes S. aureus RN492, beskrevet af Novick et al., Plasmid, Vol. 2, pp- 109-129) og opnået derfra som indikatorstamme. Denne bakteriestamme er en konstitutiv beta-lactamase-producent, og den er relativt resistent mod ampicillin. E. coli JM105 transformanter dyrket på L agar indeholdende 50 /ig/ml ampicillin udsattes for chloroformdamp i 30 minutter for 10 at lyse disse og dækkedes med en 0,1% (v/v) suspension af en stationær fase kultur af S. aureus RN492 i GL agar. Produktion af lysostaphin ved hjælp af E. coli JM105 transformanter som indikation for succesfuld indføring af lysostaphin genet i pUC8 bestemtes ved at iagttage lysis af indikatorcellerne anbragt oven på en JM105 transformant koloni. Ca. 9 ud 15 af 1000 kloner indeholdende rekombinant-plasmider (amp*. lacZ'”) indeholdt lysostaphin genet, et antal, der lod formode, at multiple kopier af lysostaphin genet var til stede pr. kromosomal ækvivalent af S. simu-lans DNA (ca. 2000 kbp).

Lysostaphin-producerende transformanter indeholdt rekombinant-20 plasmider med indføringer på 5,0, 6,5 eller 8,0 kbp. Restriktionsanalyse viste, at disse indføringer var til stede i begge orienteringer i kloningsvektoren og indeholdt et 4,3 kbp DNA-fragment fælles. DNA-sekven-sen, der koder for lysostaphin, lokaliseredes yderligere til et 1,5 kbp Hpa 11-Hind III DNA-fragment opnået fra 4,3 kbp DNA-fragmentet. Dette 25 1,5 kbp DNA-fragment reklonedes i Acc I-Hind III stederne for pUC8 til dannelse af rekombinant-plasmidet pRG5, der en foretrukket udførelsesform af den foreliggende opfindelse.

Eksempel 2 30 Sekvens og egenskaber af 1,5 kbp DNA- fragmentet, der koder for Ivsostaphin.

DNA-sekvensen af pRG5 1,5 kbp DNA-fragmentet, der koder for lysostaphin, bestemtes ved hjælp af dideoxy-kæde termineringsmetoden ifølge Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 74, pp. 5463-5467 (1977) ved 35 anvendelse af fagvektorerne M13mpl0 og M13mpll som beskrevet af Messing,

Meth. Enzymol., Vol. 101, pp. 20-78 (1983).

Nukleotidsekvensen af hele 1,5 kbp DNA-fragmentet, der koder for lysostaphin, er vist som formel I. Under henvisning til formel I inde- \ 8 DK 174941 B1 holder 1,5 kbp DNA-fragmentet en åben læseramme på 1.167 nukleotider, der går fra en TTG initieringskodon ved nukleotider 245-247 til en TGA termineringskodon ved nukleotider 1412 til 1414. DNA-fragmentet indeholder også en formodet promotor ved -35 og -10 regioner ved nukleotider 5 89-95 og 110-119, der er understregede i formel I. Lysostaphi n-promoto ren synes at være homolog med B. subtilis promotorer, der genkendes af o37 regulatorisk underenhed af RNA polymerase beskrevet af Wong et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 81, pp. 1184-118 (1984). En ribosom-bin-dende sekvens AGGAGGT ved nukleotider 231-237 med fuldstændig komplemen-10 taritet til mRNA bindingssekvensen for 16S ri bosomal RNA kan også findes i DNA sekvensen syv basepar før TTG initieringskodonen, der koder for f-Met.

Den åbne læseramme koder for præprolysostaphin, et 389 aminosyre-protein med en molekylvægt på ca. 42.200 dalton, som er prækursoren for 15 modent enzymatisk aktivt lysostaphin. Aminosyresekvensen for præprolysostaphin, der kan udledes af DNA sekvensen, er også vist i forme1 I.

Det var hidtil ukendt, at lysostaphin syntetiseredes på en prækursor-form.

20 Formel I

i: ccggaactcttgaatgtttagttttgaaaattccaaaaaaaaacctactttcttaatatt 6 i: cattcatattattttaaoacaatcagttagaatttcaaaaatcttaaagtcaatttttga 25 121: gtgtgtttgtatatttcatcaaaatcaatcaatattattttactttettcatcgttaaaa 181: aatgtaatatttataaaaatatgctattctcataaatgtaataataaattaggaggtatt 241: aaggttgaagaaaaeaaaaaaoaattattatacgagacctttagctattggactgagtac f-MetLysLysThrLysAsnAsnTyrTyrThrArgProLeuAlalleGlyleuSerThr 301: atttgccttagcatctattgtttatggagggattcaaaatgaaacacatgcttctgaaaa 150 PheAlaLeuAlaSerlleValTyrClyGlylleGlnAsnGluThrHisAlaSerGluLys 361 .* aagtaatatggatgtttcaaaaaaagtagctgaagtagagacttcaaaagccccagtaga

SerAsnMetAspValSerLysLysValAlaGluValGluThrSerLysAlaProValGlu 421: aaatacagctgaagtagagacttcaaaagctccagtagaaaatacagctgaagtagagac

AsnThrAlaGluValGlurbrSerLysAlaProValGluAsnThrAlaGluValGluIbr 35 481: ttcaaaagctccagtagaaaatacagctgaagtagagacttcaaaagetccagtagaaaa

SerLysAIaProValGluAsoThrAlaGluValGluThrSerLysAlaProValGluAsn i 541: tacagctgaagtagagacttcaaaagctccggtagaaaatacagetgaagtagagaettc

ThrAlaGluValGluThrSerlyaAlaProValGluAanThrAlaGluValGlulhrSer 9 DK 174941 B1 601: aaaagccccagtagaaaataeagctgaagtagagactteaaaagccctggttcaaaatag

LyaAlaProValGluAanThrAlaGluValGluThrSerLysAlaLeuValGlnAsnArg c 661: aacagctttaagagctgcaacacatgaacattcagcacaatggttgaataattacaaaaa

ThrAlaLeuArgAlaAlaThrHlsGluHisSerAlaGlnTrpLeuAsnAsnTyrLysLys 721: aggatatggttacggtocttatccattaggtataaatggcggtatgcactacggagttga

GlyTyrGlyTyrGlyProTyrProLeuGlylleAsnGlyGlyMetHisTyrGlyValAap 7 81: tttttttatgaatattggaacaccagtaaaagctatttcaageggaaaaatagttgaagc ^ PhePbeMetAanlleGlylbrProValLyaAialleSarSerGlyLysIleValGXuAla 8M: tggttggagtaattacggaggaggtaatcaaataggtcttattgaaaatgatggagtgca

GlyTrpSerAanTyrGlyGlyGlyAanGlfllleGlyLauIleGluAsnAjpGlyValHis 901: tagacaatggtatatgcatotaagtaaatataatgttaaagtaggagattatgteaaagc

ArgGlnTrpTyrMetRisLeuSarLysIyrAsnValLyaValGlyAapTyrValLysAIa 15 961; tggtcaaataatcggt tggtctggaagcaetggt tattctacagcaccacatttacactt

GlyGlnllelleGlyTrpSerGlySerThrClyTyrSerThrAlaProBisLeuHlsPbe 1021: ccaaagaatggttaattcattttcaaattcaaetgcccaagatccaatgcctttcttaaa

GlnArgMetValAsnSerPbeSerAsnSerTbrAlaGlaAapProMetProPheLeuLys 1061: gagcgcaggatatggaaaagcaggtggtaeagtaactccaacgecgaatacaggttggaa 20 SerAlaGlyTyrGlyLyaAlaGlyGlyThrValTbrProThrProAanThrGlyTrpLya 1141: aacaaacaaatatggcacactatataaatcagagtcagctagcttcacacctaatacaga

ThrAsnlysTyrGlyTbrLeuTyrlysSerGl'uSerAlaSerPb’eTbrProAsnThrAsp 1201: tataataacaagaacgactggtccatttagaagcatgccgcagtcaggagtcttaaaagc ^ IlelleThrArgThrThrGlyProPheArgSerMetProGlnSerGlyValLeuLysAla 1261: aggtcaaacaattcattatgatgaagtgatgaaacaagacggtcatgtttgggtaggtta

GlyGlnThPlleHisTyrAapGIuValMetLyaGlnAapGlyHisValTrpValGlyTyr 1321: tacaggtaacagtggccaacgtatttacttgcctgtaagaacatggaataaatctaetaa

IhrGlyAsnSérGlyGihArglleTyrLeuProValArgThrTrpAsnLysSerThrAsn 30 1381: tactttaggtgttctttggggaactataaagtgagcgcgctttttataaacttatatgat

TarLeuCl yValLeuTi-pGl ylhrll eLya I4iii: aattagagcaaataaaaattttttctcattcctaaagttgaagc 35

Den aminotermi nåle 36 aminosyre-sekvens af præproplysostaphin er signalpeptidet, dvs. den hovedsageligt hydrofobe region, der findes i prskursorer af udskilte proteiner.

10 DK 174941 B1

Signalpeptider er de oversatte aminoterminal sekvenser af udskilte proteiner, som er involveret i at styre den voksende polypeptidkæde gennem membranen efter syntese på membranbundne ri bosomer. I eukarioter fraspaltes signalpeptidet ved hjalp af en specifik protease, der findes 5 i den lumenale side af det rå endoplasmi ske reticulum (RER), selv før polypeptidsyntese er afsluttet.

I bakterier, som ikke har et RER, syntetiseres udskilte proteiner på ribosomer, der kan være bundet til den indre overflade af plasmamembranen. Signalpeptidet i nascente bakterielle polypeptidkæder synes at 10 være involveret i transport af proteinet gennem plasmamembranen. Bakterielle signalpeptider fjernes i almindelighed under eller kort efter transport gennem plasmamembranen, eftersom udskilte protiner, der akkumulerer i dyrkningsmedium, ikke længere indeholder denne sekvens.

Adskillige træk ved præprolysostaphin kan ses under henvisning til 15 formel II, der afbilder den aminoterminåle 152 aminosyre af præprolysostaphin (A) og nukleotidsekvensen af 1,5 kbp DNA-fragmentet fra basepar 389-361 (B).

Signalpeptidet eller signal sekvensen af udskilte eller membranbundne proteiner udmærker sig ved et højt indhold af hydrofobe amino-20 syrer, således som det ses i signalpeptidet af præprolysostaphin, der er vist i formel IIA. Selv om hydrofobiciteten af enhver signalsekvens genfindes konstant, kan de aktuelle aminosyrer indeholdt deri, den særlige sekvens af aminosyrerne og længden af peptidet variere betydeligt. Fx optræder usædvanligt lange signal sekvenser (31-44 aminosyrer) i Bacillus 25 arter. Watson, Nucleic Acid Res., Vol. 12, pp. 5145-5164, 1984.

Spaltningsstedet for præprolysostaphin-signalsekvensen er Ala-Ser-bindingen ved aminosyrerester 36-37 (formel IIA). Fjernelse fra 1,5 kbp DNA-fragmentet af den DNA, som koder for signal sekvensen af præprolysostaphin ville sandsynligvis resultere i et ikke-udskilt protein. En DNA- 30 sekvens, der koder for et funktionelt ækvivalent signalpeptid, der erstatter den DNA, som koder for lysostaphin-signalpeptidet, ville sandsynligvis også kode for en sekreterbar "præprolysostaphin", omend en med et andet, men funktionelt signalpeptid.

Efter spaltning af signalsekvensen, som kræves til sekretion, er 35 proteinet, som akkumulerer og efterfølgende oparbejdes, prolysostaphin.

Også vist i formel IIA er sekvensen fra Ala-49 til Arg-139 af prolysostaphin, der indeholder syv tandemgentagelser af en 13-aminosyresekvens.

Denne del af proteinet, som indeholder en stor mængde glutaminsyre og 11 DK 174941 B1 har en netto negativ ladning, fraspaltes under oparbejdningen af proly-sostaphin til modent lysostaphin. DNA sekvensen, som koder for amino-syregentagelserne, dvs. bp 389 til 361, er sammensat af syv gentagelser af en homolog 39 bp sekvens (formel IIB). De syv tandemaminosyregenta-5 gelser (IIA) og tilsvarende nukleotidsekvensgentagelser (IIB) er nummereret 1-7 i formel II.

Formel II

io a

f-MET LYS LYS IBS LYS ASN. ASN TY! TYR

THE ARG RO LED ALA ILE GLY LED SEX THE PHE ALA LED

ALA SER ILE VAL TYR GLY GLY ILE GLN ASN GLO THE HIS

1 w

ALA,, SER,, GLO LYS SER ASN NET ASP VAL SEX LYS LYS VAL

36 37

1 ALA GLD VAL GLO THE SEX LYS ALA RO VAL GLO ASN THR

2 ALA49 GLD VAL GLD THR SER LYS ALA RO VAL GLO ASN THR

3 ALA GLD VAL GLO THR SER LYS ALA RO VAL GLD ASN THR

4 ALA GLD VAL GLD THR SER LYS ALA RO VAL GLO ASN THR

pr> S ALA GLD VAL GLO THR SER LYS ALA RO VAL GLD ASN THR

6 ALA GLD VAL GLD THR SER LYS ALA RO VAL GLO ASN THR

7 ALA GLD VAL GLD THR SER LYS ALA LED VAL GLN ASN ARG^ ^

THR ALA LEU AEG^ ^ ^ ^LA THR HIS GLO HIS SEX ALA GLN

25 B

1 GCT G AA CTA GAG ACT TCA AAA GCC CCA GTA GAA AAT ACA

2 GCT GAA GTA GAG ACT TCA AAA GCT CCA GTA GAA AAT ACA

3 GCT GAA GTA GAG ACT TCA AAA GCT CCA GTA GAA AAT ACA

4 GCT GAA GTA GAG ACT TCA AAA GCT CCA GTA GAA AAT ACA

5 GCT GAA GTA GAG ACT TCA AAA GCT COG GTA GAA AAT ACA

6 GCT GAA GTA GAG ACT TCA AAA GCC CCA GTA GAA AAT ACA

30 7 GCT GAA CTA GAG ACT TCA AAA GCC CTG GTT CAA AAX AGA^ 35 12 DK 174941 B1

En række forskellige proteiner syntetiseres på prækursorformer med efterfølgende oparbejdning til modne aktive proteiner. Fx syntetiseres insulin, der i sin aktive form har et tokædet polypeptid, som en enkelt polypeptidkæde (proinsulin), der efterfølgende omdannes til modent insu-5 lin efter proteolytisk fjernelse af et internt polypeptid. Endvidere syntetiseres de alkaliske og neutrale proteaser af B. subtil is og amvioliouefaciens som præproenzymer. Det var ikke tidligere kendt, at lysostaphin syntetiseres som et præproenzym. Som vist i tabel I involverer omdannelse af de alkaliske og neutrale protease-proenzymer til modne 10 enzymer et til omdannelsen af prolysostaphin til lysostaphin svarende spaltningssted.

Tabel I

Sammenligning af præprolysostaphin med Bacillus præproproteaser 15 Antal rester

Præpro- Spaltnings-

Enzym sekvens Modent Endeligt sted 20 Subtilisin B. subtil is 106 275 HisGluTyr iAlaGlnSerVal B. amvioliouefaciens 107 275 HisAlaTyr IAlaGlnSerVal

Neutral protease 25 B. subtilis 221 300 ValGluHis lAlaAlaAlaThr B. amvioliouefaciens 221 300 ValGluHis lAlaAlaThrThr

Lysostaphin 143 246 AlaLeuArg lAlaAlaThrHis 30 Aminoterminalsekvensen af renset modent lysostaphin fra S. simu- lans bestemt ved Edman nedbrydning, Ala-Ala-Thr-His-Glu, svarer til aminosyrer 144-148 af præprolysostaphinsekvensen, som kodes af 1,5 kbp DNA-fragmentet i pRG5. Aminosyresammensætniungn af modent lysostaphin, som kan forudsiges ud fra DNA-sekvensen, viste fremragende korrelation med 35 den eksperimentelt bestemte aminosyresammensætning af renset lysostaphin opnået fra S. simulans (NRRL B-2628) kultursupernatanter af Trayer et al., J. Biol. Chem., Vol. 245, pp. 4842-4846. Modent aktivt lysostaphin, som bestemt ud fra den forudsete sekvens, har en molekylvægt på ca.

13 DK 174941 B1 26.920 daltons. Som vist i formel IIA involverer omdannelse af proenzy-met til modent lysostaphin spaltning af Arg-Ala bindingen ved rester 143-144 af præprolysostaphin kodet af 1,5 kbp DNA-fragmentet.

5 Eksempel 3

Ekspression af lysostaphin i E. coli JM105/pRG5 transformanter

En sen-logaritmisk fase kultur af E. coli JM105 transformeret med 10 pRG5 og dyrket i 20 ml LB medium indeholdende 50 Mg/ml ampici11 in blev udvundet ved centrifugering og vaskedes med Tris-saltvand puffer (TSB-10 mM Tris, 30 mM NaCl, pH 8,0). Tabletten resuspenderedes i 1 ml TSB og lydbehandledes i 2 minutter ved 0°C. Kultursupernatanten koncentreredes 20 gange ved ultrafiltrering under anvendelse af en Amicon YM10 membran.

15 Lysostaphi naktivitet fandtes i supernatanten (65% af total), peripi asmiske (15%) og cytoplasmiske (20%) fraktioner fremstillet som ovenfor.

Kanin-antistoffer mod lysostaphin renset fra S. simulans superna-tanter fremstilledes og rensedes ved affinitetskromotagrafi efter Recsei et al., J. Biol., Chem. Vol. 257, pp. 7196-7202 (1982) og anvendtes i 20 immunoblotningsforsøg til lokalisering og karakterisering af lysostaphin og prolysostaphin produceret af både E. coli JM105/pRG5 og S. simulans.

Rensede gede-antistoffer mod kanin-immunoglobuliner konjugeredes til alkalisk phosphortase (Sigma) ved hjælp af standardteknik. Immu-noblotningsprøver underkastedes først natriumdodecylsul fat (SDS) poly-25 acrylamidgel-elektroforese efterfulgt af overføring af separerede proteiner til nitrocelluloseplader under anvendelse af standardteknik. Im-munoreaktive proteiner på nitrocellulosefil trene påvistes ved at inkubere filtrene først med kanin-antistof mod lysostaphin og dernæst med anti-kaninimmunoglobulin konjugeret til alkalisk phosphatase. Det kromo-30 gene substrat, 5-brom-4-chlorindoxylphosphat plus nitro-blå-tetrazolium anvendtes til påvisning af alkalisk phosphatase aktivitet som beskrevet af Blake et al., Anal. Biochem., Vol. 136, pp. 175-179 (1984).

Figur 1 viser resultaterne af immunoblotningsforsøgene. De følgende prøver tilførtes de valgte spor, elektroforese behandledes, overfør-35 tes til filtre og reageredes med anti-lysostaphin-antistof, nemlig su-pernatanter fra 5. simulans kulturer taget i sen-logaritmiske (spor 1 og 6), tidligt stationære (spor 2), midt-stationære (spor 3) og sent-stati-onære (spor 4) faser, E. coli/pRG5 supernatant (spor 8) og celleekstrakt 14 DK 174941 B1 (spor 7) fra sen-logaritmisk fasekulturer. Mead-Johnson lysostaphin tilsattes spor 5 og 9. Positionerne af molekylvægtstandarder er også vist i figur 1.

Immunoblotningsforsøgene viste tilstedeværelsen af modent lyso-5 staphin (MW 26.920) i den koncentrerede kultursupernatant af sen-logaritmisk fase E. coli JM105/pRG5 transformanter (figur 1, spor 8). Et tværreagerende protein med identiske elektroforetisk mobilitet blev fundet i supernatant af lysostaphinproducerende S. simulans kulturer.

Immunologisk analyse af elektroforesebehandlede cellulære ekstrak-10 ter af sen-logaritmisk fase E. coli JM105/pRG5 transformanter viste tilstedeværelsen af to proteiner, der var reaktive med lysostaphinantistof. Det modne lysostaphin var til stede i relativt små mængder. Endvidere iagttoges en større mængde af et tværreaktivt protein med en tilsyneladende molekylvægt på 64.000 dalton også i den E. coli cellulære 15 fraktion (figur 1, spor 7). Et tværreaktivt protein med elektroforetisk mobilitet, som er identisk med dette større protein, iagttoges også i supernatanter af S. simulans udvundet primært efter dyrkning til sen-log fase. Det større tværreagerende protein er sandsynligvis prolysostaphin, eftersom det i både S. simulans og E. coli JM105/pRG5 kommer før lyso-20 staphin og forsvinder, når modent lysostaphin akkumulerer (figur 1, spor 1-4 og 8). Den tilsyneladende overæstimering af molekylvægten for prolysostaphin skyldes sandsynligvis nedsat binding af SDS på grund af det høje indhold af giutaminsyrerester i tandemgentagelserne af prolysosta-phinsekvensen.

25 Lysostaphin syntetiseredes derfor som et præproenzym. Signal se kvensen af præprolysostaphinet spaltes ved vektoriel transport af poly-peptidkæden gennem membranen. Den resulterende prolysostaphin oparbejdes efterfølgende ektracellulært til modent lysostaphin. Omdannelse til modent aktivt enzym sker ved spaltning af Argj43-Argj44 peptidbindingen.

30 Aminotermi nal del en af prolysostaphin fjernes tilsyneladende trinvis, dvs. at hele proenzymsekvensen ikke fjernes på samme tid. Denne oparbejdningsreaktion sker i supernatanten af stationære fasekulturer af !L simulans. Da modent enzym også produceres af kulturer af E. coli JM105/pRG5 transformanter, foregår proenzymoparbejdningen enten autoka-35 talytisk eller involverer lignende oparbejdningsaktiviteter, som er til stede i både E. coli JM105 og S. simulans. E. coli JM105/pRG5 transformanter har imidlertid den fordel, at oparbejdning synes at ske intracel-lulært snarere end ekstracellulært som i S. simulans.

15 DK 174941 B1

Eksempel 4

Konstruktion af pi asmider, som i transformerede Bacillus spp. udtrykker lysostaphin.

5 Bacillus ekspressionssystemer til produktion af klonede genproduk ter har væsentlige fordele i forhold til tilsvarnde systemer, der anvender E. coli som værtsorganisme. Bacillus arter udskiller normalt proteiner let i det omgivende medium. På grund af denne fordel konstrueredes rekombinant-plasmider indeholdende 1,5 kbp DNA sekvensen, som koder for 10 lysostaphin, ud fra pi asmider, der replikerer de forskellige Bacillus arter.

Plasmid pRG5 anvendtes som kilde for den DNA, der koder for lysostaphin. Plasmid pRG5 DNA, fordøjet med Hind III og Eco RI i henhold til af leverandøren specificerede betingelser, fraktioneredes ved præpara-15 tivt elektroforese i 1% agarose. 1,5 kbp DNA-fragmentet, der koder for lysostaphin, lokaliseredes ved ethidium-bromid-pletning og overførtes ved elektroforese til en DEAE-nitrocellulose filterstrimmel. Strimlen vaskedes med NET puffer (0,15M NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,02 MTris, pH 8,0), og den bundne DNA elueredes ved inkubation af strimlen i NET puffer 20 indeholdende 1 M NaCl i 1 time ved 65°C. Ethidiumbromid fjernedes fra DNA'en ved to gange at ekstrahere opløsningen med et lige så stort volumen n-butanol. DNA udfældedes ved tilsætning af to volumendele kold 95% ethanol til den vandige fase, opsamledes ved centrifugering, vaskedes med 80% ethanol og opløstes i TE puffer (eksempel 1).

25 a. Plasmid pJPl

Rekombinantplasmid, pJPl, en foretrukket udførelsesform af opfindelsen, konstrueredes ved at indføre 1,5 kbp DNA-fragmentet, der koder for lysostaphin i Bacillus plasmid pBC16, der bærer genet for tetracy-clinresistens. Plasmid pBC16 opnået fra samlingen hos Richard P. Novick, 30 Public Health Research Institute, New York, New York, isoleredes fra jord bacilli og er stærkt homologt med og uforligeligt med pUBllO, et 5L aureus plasmid, som specificerer kanamycinresistens. pBC16 DNA isoleredes fra B. subtilis ved hjælp af alkalisk-SDS-proceduren, som er beskrevet af Birnbolm, Meth. Enzymol, Vol. 100, pp. 243-255 (1983). Celler fra 35 en 250 ml overnattet kultur dyrket i VY medium (25g Difco hætteinfusion, 5g Difco gærekstrakt/1 H20) blev udvundet ved centrifugering, vaskedes i TE puffer og resuspenderedes 5 ml TEG puffer (25 mM Tris, 10 mM EDTA, 50 mM glucose, pH 8,0). Lysozym ( 1 mg/ml) tilsattes, og suspensionen inku- 16 DK 174941 B1 beredes ved stuetemperatur i 20 minutter. Efter tilsætning af 10 ml 0,2% NaOH-1% SDS inkuberedes blandingen ved 0°C i 45 minutter. 10 ml 3M kaliumacetat - 1,8M myresyre tilsattes dernæst, og blandingen inkuberedes yderligere ved 0°C i 30 minutter. Det således opnåede lysat centrifuge-5 redes ved 15.000 x g i 20 minutter. To volumendele 95% ethanol sattes til supernatanten, og det resulterende bundfald opnået efter 15 minutter ved sturetemperatur opsamledes ved centrifugering ved 10.000 gange xg i 10 minutter, vaskedes med 80% ethanol og oplistes i 0,5 ml TE puffer.

Ca. 200 M9 lukket cirkulær pBC16 DNA opnåedes ved hjælp af denne proce-10 dure.

Plasmid-DNA'en 1 ineariseredes ved Eco RI spaltning. En blanding af lineariseret pBC16 0ΝΑ (ca 1 Mg) og 1,5 kbp 0NA-fragmentet, der koder for lysostaphin (ca. 1 /xg) forsynedes med stumpe ender under anvendelse af DNA polymerase (Klenow fragment). T4 DNA ligase anvendtes dernæst til 15 at splejse plasmidet og fragment DNA sammen til gendannelse af lukkede cirkulære plasmid DNA molekyler.

Kompetente B. subtilis stamme BD170 celler opnået fra David Dubnau hos Public Health Research Institute, New York, New York, transformeredes med den splejsede DNA (ca. 1 Mg pr. 0,1 ml celler) i henhold til 20 fremgangsmåden ifølge Contente et al., Mol. Gen. Genet., Vol. 167, pp.

251-258 (1979). Cellerne inkuberedes ved 37°C i 90 minutter for at tillade ekspression af pi asmidets tetracyclinresi stensgen og blev udstrøget på TBAB agar indeholdende en selektiv mængde tetracyclin (5 Mg/ml) og suspenderede varmedræbte S. aureus celler for at vise lysostaphinproduk-25 tion.

Varmedræbte $. aureus celler til måling af lysostaphinaktivitet fremstilledes ved at autoklavere (40 minutter) en stationær fase kultur dyrket i 500 ml CYGP substrat. De døde celler centrifugeredes og resus-penderedes i ml sterilt vand. 2 ml af dette døde cellepræparat sattes 30 til 500 ml TBAB agar til fremstilling af indikatorpladerne.

Ca. 1% af de med den splejsede DNA transformerede B. subtilis celler producerede lysostaphin som vist ved lysis af staphylococcale celler, som omgiver B. subtilis kolonierne. pJPl opnåedes ved at genudstry-ge en af B. subtilis transformanterne på lysostaphin indikatorplader 35 adskillige gange, indtil der opnåedes en fuldstændig stabil klon.

Lysostaphin aktivitet var til stede primært i supernatantfraktio-nen af B. subtilis BD 170/pJPl transformanter dyrket til stationær fase i flydende medium. Immunoblot-analyse viste, at en lysostaphinprækursor- 17 DK 174941 B1 form udskiltes, hvilken form efterfølgende omdannedes til modent lysostaphin. Endvidere viste immunoblotningen også tilstedeværelsen af lysostaphin nedbrydningsproduktet i kultursupernatanter, der minimeredes, når phenyl-methylsulfonylfluorid, en serin-proteaseinhibitor, sat- t 5 tes til kulturen. Det er derfor sandsynligt, at en serin-protease udskilles i mediet eller er til stede på overfladen af B. subtil is BD170 celler.

b. pDF8 og pRPl

To andre rekombinant-plasmider, pDF8 og pRPl, indeholdende lyso-10 staphingenet, konstrueredes til transformation af Bacillus arter i det væsentlige som i eksempel 4A med hensyn til konstruktionen af pJPl.

pDF8 opnåedes ved at indføre 1,5 kbp DNA-fragmentet, som koder for lysostaphin i Eco RI restriktionspunktet for plasmid pBD64, et kanamy-cin, chloramphenicol resistens-plasmid, opnået fra samlingen hos David 15 Dubnau Public Health Research Institute, New York, New York. pDF8 opnåedes som ovenfor efter transformation af B. subtilis BD170 med recirkula-riserde plasmider og udstrygning af sådanne transformanter på lysostaphin indikatorplader indeholdende 5 Mg/ml chloramphenicol. pDF8 blev udvalgt efter gentagne udstrygninger af positive kloner.

20 På tilsvarende måde konstrueredes pRPl ved at indføre 1,5 kbp DNA- fragmentet, der koder for lysostaphin, i Hpal punktet for pSPVl, et chloramphenicol resi stent plasmid opnået fra Steven Projan, Public Health Research Institute, New York, New York. Alle efterfølgende trin til isolering af pRPl var identiske med konstruktionen af pJPl og pDF8.

25

Eksempel 5 , Lysostaphin ekspression i B. sphaericus 00/pJPl transformanter

Et antal Bacillus stammer transformeredes med pJPl til opnåelse af 30 en egnet vært til fremstilling af lysostaphin i stor målestok. Transformanter, som producerede stor lysis-halos på lysostaphin-indikatorplader, isoleredes og karakteriseredes yderligere. Blandt de screenede Bacillus stammer bevirker B. sohaericus stammen 00, en organisme isoleret og opbevaret i kultursamlingen hos Public Health Research Institute, New 35 York, New York, maksimal produktion af lysostaphin.

B. sphaericus 00/pJPl transformanter opnåedes ved behandling af protoplaster opnået ved lysozymbehandling af intakte celler med pJPl-DNA i nærværelse af polyethylenglycol i henhold til fremgangsmåden ifølge 18 DK 174941 B1

Chang et al., Molec. Gen. Genet., Vol. 168, pp. 11115 (1979). Efter behandlingen dyrkedes cellerne på DM3 regenereringsplader i nærværelse af tetracyclin (5 /tg/ml) før undersøgelse på lysostaphin-indikatorpla- der.

5 B. sphaericus 00/pJPl transformanter dyrket på VY eller CYGP-medi- um producerede og udskilte ca. 150 mg modent aktivt lysostaphin pr. liter dyrkningsmedium. Denne mængde er ca. fem gange den mængde, som produceres af S. simulans under de bedste i dag tilgængelige fermenteringsbetingelser. Aktivt lysostaphin akkumulerer i dyrkningsmediet med 10 ringe nedbrydning, selv efter forlænget inkubation af kulturer og bidrager med ca. 80% af det totale ekstracellulære protein. Lysostaphin isoleret fra B. sphaericus 00/pJPl transformanter er immunologisk, elektroforetisk og katalytisk uskelneligt fra det fra S. simulans kulturer opnåede produkt. Lysostaphin isoleres fra dyrkningsmediet i 15 overensstemmelse med kendte metoder til fraktioneret udfældning (udsaltning). Alternativt opnås en særligt effektiv rensning ved at kombinere en fældning og en kromatografisk adskillelse af fermentationssubstratet fra kulturer af lysostaphin producerende B. sphaericus 00/pJPl transformanter.

20 Celler fjernes fra fermentationssubstratet, fx ved centrifugering eller ultrafiltrering, og natri umammoniumsulfat sættes til supernatanten til 40-60%, fortrinsvis 50%, mætning. Efter en time ved 4°C udvindes det lysostaphinholdige bundfald ved centrifugering. Udvindingen på dette trin er mere end 80%.

25 Bundfaldet genopløses i minimalt volumen 10 mM natriumphosphatpuf- fer (pH 7,00, 50 mM NaCl) og dialyseres mod 100 volumendele af samme puffer. Efter fjernelse af eventuelt parti kelformigt materiale kromatog-raferes den dialyserede opløsning på en cation bytterharpiks (fortrinsvis Pharmacia FPLC Mono S) og elueres under anvendelse af en forpufret 30 gradient med voksende saltkoncentration fra 0,05 til 0,25 M NaCl. Udvinding af lysostaphin med hensyn til det enkelte kromatografiske trin var mere end 90%. Lysostaphi naktivitet hænger sammen med to større toppunk ter. Det senere eluerende toppunkt af lysostaphin består af ikke-cova-lente aggregater af proteinet. Disse aggregater dissocierer ved fortyn-35 ding i puffer og under betingelser for natriumdodecylsulfat-polyacryl-amid geleelektroforese.

Lysostaphinet, som renses fra dyrkningsmediet af B. sphaericus 00/pJPl transformanter, er i det væsentlige uden non-lysostaphin konta- 19 DK 174941 B1 minanter. Af særlig betydning er det, at B. sphaericus OO/pPJl lysostaphin er i det væsentlige uden immunogeniske staphylococcale kontaminan- ter.

Claims

20 DK 174941 B1 1. 1,5 kilobase DNA-fragment, som koder for Lysostaphin, hvilket fragment omfatter en nukleotidsekvens som vist ved formel I: 5 i: ccggaactcttgaatgtttagttttgaaaattccaaaaaaaaacctactttcttaatatt 61: gattcat.attattttaaeacaatcagttagaatttcaaaaatcttaaagtcaatttttga 121: gtgtgtttgtatatttcatcaaaatcaatcaatattattttactttcttcatcgttaaaa 10 181: aatgtaatatttataaaaatatgctattctcataaatgtaataataaattaggaggtatt 24i: aaggi.tgaagaaaacaaaaaacaattattatacgagacctttagctattggactgagtac f-MetLysLysThrLysAsnAanTyrTyrThrArgProLeuAlalleGlyLeuSerThr 301: atttgccttagcatctattgtttatggagggattcaaaatgaaacacatgcttctgaaaa PheAlaLeuAlaSerlleVaiTyrGlyGlylleGlnAsnGluThrHiaAlaSerGluLys 15 361. aagtaatatggatgtttcaaaaaaagtagctgaagtagagacttcaaaagccccagtaga Ser As iiMetAspVal SerLysLysVal Al aGluValGluThrSerLysAlaProValGlu 421: aaatacagctgaagtagagacttcaaaagctccagtagaaaatacagctgaagtagagac AsnThrAlaGluValGluThrSerLyaAlaProValGluAsnThrAlaGluValGluTbr 2o 481: ttcaaaagctccagtagaaaatacagctgaagtagagacttcaaaagctccagtagaaaa SerlysAiaProValGluAsnTbrAlaCluValGluThrSerLysAlaProValGluAsn 541: tacagctgaagtagagacttcaaaagctccggtagaaaat'acagctgaagtagagacttc ThrAlaGluValGluThrSerlysAlaProValGluAsnThrAlaGluValGluThrSer 601: aaaagccccagtagaaaatacagctgaagtagagacttcaaaagccctggttcaaaatag LysAlaProValGluAsoThrAlaGluValGluThrSerLysAlaLeuValGlnAsnArg 661: aacagctttaagagctgcaacacatgaacattcagcacaatggttgaataattacaaaaa ThrAlaLeuArgAlaAlaThrHisGluHisSerAlaGlnTrpLeuAsnAsnTyrLyslys 721: aggatatggttacggtccttatccattaggtataaatggcggtatgcactacggågttga GlyTyrGlyTyrGlyProTyrProLeuGlylleAsnGlyGlyMetHisTyrGlyValAap 30 781: tttttttatgaatattggaacaccagtaaaagctatttcaagcggaaaaatagttgaagc PhePheMetAsnlleGlyThrProValLysAlalleSerSerGlyLysIleValGluAla 841: tggttggagtaattacggaggaggtaatcaaataggtcttattgaaaatgatggagtgca GlyTrpSerAsnTyrGlyGlyGlyAanGlnlleGlyLeuIleGluAsnAspGlyValHis 901: tagacaatggtatatgcatctaagtaaatataatgttaaagtaggagattatgtcaaagc

35 ArgGlnTrpTyrMetHisLeuSerLysTyrAsnVallysValGlyAspTyrValLysAla 961: tggtcaaataatcggttggtctggaagcactggttattctacagcaccacatttacactt GlyGlnllelleGlyTrpSerGlySerThrGlyTyrSerThrAlaProHisLeuHisPbe 21 DK 174941 B1 1C 21: ccaaagaatggttaattcattttcaaattcaactgcccaagatccaatgcctttcttaaa GlnArgMetValAsnSerPbeSerAsnSerTbrAlaGlnAspProMetProPheLeuLys 1081: gagcgcaggatatggaaaagcaggtggtacagtaactccaacgccgaatacaggttggaa SerAlaGlyTyrGlyLyaAlaGlyGlyThrValThrProThrProAsnTbrGlyTrpLya 5 1nn: aacaaacaaatatggcacactatataaatcagagtcagctagcttcacacctaatacaga Th.-AsnlysTyrGlyThrLeuTyrLysSerGluSerAlaSerPbeThrProAsnThrAsp 1201: tataataacaagaaegactggtccatttagaagcatgccgcagtcaggagtcttaaaagc IlelleihrArgThrTbrGlyProPheArgSerMetProGInSerGlyValLeuLys'Ala 10 1261: aggtcaaacaattcattatgatgaagtgatgaaacaagacggtcatgtttgggtaggtta GlyGinThrlleHisTyrAspGluValMetLysGlnAspGlyHisValTrpValGlyTyr 1321: tacaggtaacagtggccaacgtatttacttgcctgtaagaacatggaataaatctactaa ThrGl yAsnSerGIyGinArglleTyrLeuProValArgThrTrpAsnLysSerThrAan 1381: tactttaggtgttctttggggaactataaagtgagcgcgctttttataaacttatatgat
2. DNA-fragment ifølge krav 1 og homologe deraf, som koder for modent a lysostaphin og funktionelle ækvivalenter deraf.
3. DNA-fragment ifølge krav 1 og homologe deraf, som koder for præprolysostaphin og funktionelle ækvivalenter deraf.
4. DNA-fragment ifølge krav 1 og homologe deraf, som koder for prolysostaphin og funktionelle ækvivalenter deraf. 35
5. DNA-fragment ifølge krav 1 og homologe deraf, som koder for lysostaphinsignalpeptidet og funktionelle ækvivalenter deraf. 22 DK 174941 B1
6. Rekombinant-pi asraid, som indeholder DNA-fragment, der koder for lysostaphin fra Staphylococcus siraulans (NRRL B-2628), og som vil udtrykke dette DNA i en transformeret mikrobiel vært.
7. Rekombinant-plasmid, som indeholder DNA-fragment ifølge krav 1.
8. Rekombinant-plasmid ifølge krav 7, som er pRG5-defineret ved deponering af Escherichia col i ATCC 67076 transformeret hermed.
9. Rekombinant-plasmid ifølge krav 7, som er pJPl defineret ved deponering af Bacillus subtilis ATCC 67077 eller Bacillus sohaericus ATCC 67080 transformeret hermed.
10. Rekombinant-plasmid ifølge krav 7 som er pDF8 defineret ved 15 deponering af Bacillus subtilis ATCC 67078 transformeret hermed.
11. Rekombinant-plasmid ifølge krav 7, som er pRPl defineret ved deponering af Bacillus subtil is ATCC 67079 transformeret hermed.
12. Transformeret mikroorganisme, som producerer lysostaphin fra Staphylococcus simulans (NRRL B-2628), hvilken mikroorganisme er blevet transformeret med et rekombinant-plasmid indeholdende DNA, der koder for lysostaphin.
13. Transformeret mikroorganisme ifølge krav 12, hvor mikroorganismen er Escherichia col i. gær, en Streotomvces art eller en Bacillus art.
14. Transformeret mikroorganisme ifølge krav 13, hvor mikroorganismen er Escherichia col i. Bacillus subtil is eller Bacillus sohaericus. 30
15. Transformeret mikroorganisme ifølge krav 14, hvor mikroorganismen er E. coli K-12 stamme JM105, Bacillus subtilis stamme BD170 eller Bacillus sphaericus stamme 00.

15 TarLeuGlyValLeuTrpGlyThrlleLys 1JJU1: aattagagcaaataaaaattttttctcattcctaaagttgaagc 20 med en åben læseramme, der går fra en TTG initieringskodon ved nukleo-tider 245-247 til en TGA termineringskodon ved nukleotider 1412-1414, hvilken åben læseramme koder for præprolysostaphin, der er en prækursor for modent aktivt lysostaphin, med en sekvens på 389 aminosyrer, der omfatter et signal peptid og prolysostaphin, som oparbejdes efter syntese 25 til modent lysostaphin.
16. Transformeret mikroorganisme ifølge krav 15, som er defineret som en hvilken som helst af de ATCC-deponerede stammer 67076, 67077, 67078, 67079 og 67080. 23 DK 174941 B1
17. Fremgangsmåde til fremstilling af et produkt, som har lysostaphin aktivitet, og som i det væsentlige er uden non-lysostaphin immunogeni ske staphylococcale kontaminanter, og som omfatter dyrkning af en transformeret mikroorganisme ifølge et hvilket som helst af kravene 12, 13, 14, * 5 15 og 16 (hvilken mikroorganisme er forskellig fra mikroorganismer af genus Staphylococcus) indtil det lysostaphin-kodende ONA-fragment udtrykkes under produktion af prolysostaphin og prolysostaphinet spaltes af mikroorganismen. 10 15 % f DK 174941 B1 i Mr (xlCT3) 66— __ __ _ __ 45 — 21 — — ~ I 2 3 4 5 6789 φ FIG. 1 »