BG60443B2 - Усъвършенствувани вектори,методи за получаванетоим и за експресиране на клонираните гени - Google Patents

Abstract

Векторите и методите могат да се използват за усъвършенстване получаването на различни полипептиди,протеини и аминокиселини в клетките на гостоприемника. Те се характеризират с подобрена експресия на клонираните гени, особено на тези от еукариотен произход в прокариотен гостоприемник.

Description

Това изобретение се отнася до усъвършенствани вектори и методи за получаването им, както и за експресиране на колонирани гени. Векторите и методите, показани тук, се характеризират с подобрена експресия на клонираните гени, особено на тези от еукариотен произход в прокариотен гостоприемник. Както ще видим от последващото изложение, тези вектори и методи могат да се използват за усъвършенстване получаването на различни полипепдити, протеини и аминокиселини в клетките на гостоприемника.

ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПРЕДШЕСТВАЩОТО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА Нивото на продукцията на протеин в клетката на гостоприемника се управлява от три главни фактора: броя на копията на неговия ген в клетката, ефективността, с която този ген се транскрибира, и ефективността, с която получената информационна РНК (тРНК), се транслира. Ефективността на трарскрибцията и трансланцията, които заедно представляват експресията, зависи на свой ред от нуклеотидни последователности, които обикновено се намират преди желаната кодираща секвенция. Тези нуклеотидни последователности, контролиращи експресията, определят inter alida мястото, при което РНК полимеразата действа, за да започне транскрипцията (промоторната последователност) и където се свързват рибозомите и взаимодействат с тРНК (продукт от транскрипцията), за да започне транслацията.

Не всички последователности, контролиращи експресията, функционират с еднаква ефективност. Често е предимство кодиращата желания протеин секвенция да се отдели от окръжаващите я нуклеотидни последователности и да се присъедини към други такива, които контролират експресията, за да се получи по-високо ниво на последната. След като постигне това, новополученият ДНК- фрагмент може да се инсертира в плазмид с голям брой копия или в производни на бактериофаги, за да се увеличи броят на копията на гена в клет ката и по този начин да се подобри добивът на експресирания протеин.

Тъй като свръхпроизводството дори на нормални, нетоксични генни продукти, може да вреди на клетките на гостоприемника и да намали стабилността на съответната система гостоприемник-вектор, една добра, контролираща експресията последователност, трябва да може освен да подобрява транскрибцията и транслацията на клонираните гени, да бъде контролируема, за да се модулира експресията по време на бактериалния растеж. Предпочитаните последователности за контролиране на експресията са тези, които могат да бъдат изключвани с оглед да се даде възможност на клетките на гостоприемника да се размножават без излишно производство на генни продукти и след това да бъдат отново включвани, за да се подпомогне експресията на големи количества от желаните протеинови продукти.

Няколко контролиращи експресията последователности, които отговарят на поставените по-горе критерии се използват за усъвършенстване експресията на протеини и полипептиди в бактериални гостоприемници. Те включват например оператора, промотора и мястото за свързване и действие на рибозомите в лактозния оперон на E.coli (e.g. K.Itakura et al., “Expression in Escherichia coli of a Chemically Synthesized Gene for the Hormone Somatostatin, Scince, 198, pp. 1056-63 (1977);

D.V.Goeddel et al., “Expression in Escherichia coli of Chemically Synthesized Genes for Human Insulin”, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 76, pp. 10610 (1979), съответстващите последователности на триптофансинтетазната система на E.coli (J.S.Emtage et. al., “Influenza Antigenic Determinants Are Expressed from Haemagglutinin Genes Clonden in Escherichia coli”, Nature, 283, pp. 171-74 (1980), J.A.Martial et al., “Human Growth Hormone: Complementary DNA Cloning and Expression in Bacteria”, Science, 205, pp. 602-06 (1979) и главните операторни и промоторни зони на фага Λ- (Н.Bernard et al., “Construction of Plasmod Cloning Vehicles that Promote Gene Expression from the Bacteroophage Lambda P_L Promotor”, Gene 5, pp. 59-76(1976). Това изобретение се отнася до последната от тези, контролиращи експресията последователности.

Бактериофагът съдържа три главни про2 мотора - P_L,P_R, u P’_R. Познат е репресорен протеин, продукт на фаговия ген cl, който контролира активността на промоторите P_L и P_R. Репресорът се свързва към съответните участъци от оператора - OL и OR- на тези промотори и блокира започването на транскрибцията от съответния промотор. Нещо повече, в резултат от този авторегулиращ се начин на синтез (M.Ptashne et. al., “Autoregulation and Function of a Repressor in Bacteriophage Lambda”, Science 194, pp. 156-61 (1976), едно копие от гена cl в хромозомата на лизогенен щам може да подтисне всички P_L или P_R промотори, в плазмид с множество копия (посочен по-долу). Трябва да се отбележи, че в системите, включващи lac промотор, репресията на промотора при неиндуцирани условия е само частична (K.Itakura et al., посочено по-горе; D.V.Goeddel et al., посочено погоре). Контролът, упражняван от репресора над промоторите P_L u P_R може да се променя чрез модификация на репресорния протеин или неговия ген. Например позната е мутацията, при която репресорният протеин е чувствителен на температура. Когато се използва тази мутиция, промоторите могат да се активират или инактивират чрез вариране на температурата на култивиране и следователно на стабилността на репресора.

Бактериофагът също съдържа гени N и его. Продуктът на гена N действа като антитерминатор в бактериофага А. Антитерминацията или предимство при припокриващо се терминиране на транскрибта или забавяне, причинено от присъствието на терминиращи последователности, последователности, подобни на терминиращите или забавящи транскрибцията секвенции в определените ДНК последователности, които трябва да бъдат транскрибирани. По-нататък ефекти на поляризация, представени чрез присъствието на безмислени кодони в промоторния транскрипт могат ад бъдат освободени от продукта на N гена (N.Franklin & C.Yanovski, “The N Protein of Lambda: Evidence Bearing on Transcription Termination, Polarity and the Alteration of E.coli RNA Polymerase”, in RNA Polymerase, Cold Spring Harbor Laboratory) pp. 693-706 (1976).

Известно е, че продуктът на cro гена, транскрибиран от P_R промотора, е вторичен репресор за двата промотора PL u PR (J.Pero, “Deletion Mapping of the Site of the tor Gene Product”, in The Bacteriophage Lambda, Cold Spring Harbor Laboratory pp. 549-608 (1971);

H.Echols, “Role of the cro Gene in Bacteriophage Lambda Development”, J.Mol Biol., 80, pp. 20316 (1963); A Johnson et al., “Mechanism of Action of the cro Protein of Bacteriophage Lambda”, Proc, Natl, Acad. Sci. USA, 75, pp. 1783-87 (1978). Тъй като продуктът на cro гена се копродуцира заедно с желаните продукти на комбинацията гостоприемник- вектор, ефекта на его генния продукт върху експресията на PL или PR промоторите има тенденция да расте с времето. По тази причина във всяка система, в която са желани високи нива на експресия, е необходима делеция или инактивация на сго гена. Ефективността на PL промотора за експресията на клонирани гени е показана чрез инкорпориране на триптофанов оперон (trp) от E.coli във фага A. (N.Franklin, “Altered Reading of Genetic Sighals Fused to the N Operon of Bacteriophage Lambda: Genetic Evidence for Modidfication of Polymerase by the Protein Product of the N.Gene”, J.Mol.Biol., 89, pp.3348 (1979); A. Hopkins et al., “Characterisation of Lambda trp - Transducing Bacteriophages Made in vitro”, J.Mol.Biol. 107, pp.549-69 (1976). B този модифициран фаг trp гените могат да бъдат транскрибирани както от техния собствен промотор, така и от P_L промотора. Установено е, че опосредстваната от P_L експресия е тричетири пъти по-висока от тази, която се получава от хомоложния trp промотор.

Ефектът на репресора върху P_L медиираната експресия също е показан при този модифициран фаг. Например в отсъствие на репресор, P_L контролираната експресия на антранилат синтетазата (първият ензим в trpоперона) е 11 пъти по-висока от тази, наблюдавана за ензима под trp контрол в отсъствие на trp репресор (J.Davidson et al., “Quantitative Aspects of Gene Expression in a Lambda trp Fusion Operon” Molec.gen.Genet., 130, pp. 9-20 (1974). Обаче в присъствие на активен cl ген, P_L медиираната експресия се намалява поне 900 пъти. Тези проучвания също показват, че продължителното високо ниво на P_L обусловена транскрипция е възможно само когато сго генът в гостоприемника не функционира.

Проблемът е в това, че макар по-горе описаните trp фаги да показват ползата от P_L промотора за експресията на инсертирани гени, използването им е някак ограничено от трудностите при конструирането и стабилното разпространение на сго акцепторни фаги. Без такива фаги наблюдаваните високи нива на експресия скоро спадат, тъй като нивото на копродуцирания продукт на сго гена се повишава и подтиска транскрибцията от P_L промотора.

Докато недостатъците на λ фага могат някак да се преодолеят чрез клониране наЛ контролни елементи върху автономно реплициращ се плазмид като ColEI или негови производни (J.Hedgpeth et. al., “Lambda Phage Promotor Used to Enhance Expression of a Plasmid-Cloned Gene”, Molec.gen. Genet., 163, pp. 197-203 (1978) или чрез конструиране на малки плазмиди, които включват само P_L (Н.Berard et al., по-горе) тези последни вектори имат недостатък поради разстоянието между участъка, достъпен за инсерция на клонираните гени и Р_ц промотора. Например във векторите, описани от H.Bermard et al. по-горе, разстоянието между мястото на генната инсерция и P_L промотора варира от 300 до 8600 бази. Нещо повече, най-често използваните EcoRI u BamHI инсерционни места във векторите на Bernard и сътр. не са по-близо от 600 до 1000 бази, съответно към Р_ь-промотора. Ефектът от N генния продукт върху транскрибцията на търсената ДНК секвенция не може лесно да се определи във векторите на Bernard и сътр., тъй като самият N генен продукт е кодиран върху плазмида и не е с хромозомален произход. Накрая в допълнение към това няма директни данни, че векторите на Bernard позволяват по-високо ниво на протеинна експресия, Bernard не дава указания, че векторите му се използват успешно при експресията на еукариотни генни продукти в прокариотни гостоприемници.

СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Изобретението разрешава проблеми, отнасящи се до осигуряване на усъвършенстван вектор и метод за получаване на такива вектори и за експресия на клонирани гени в клетки на гостоприемник.

По-точно в съответствие с това изобретение ние осигуряваме вектор, съдържащ поне една ДНК последователност, която от своя страна съдържа поне един промотор и оператор, произлизащи от бактериофаг, и характеризиращо се поне с едно място за ендонуклеазно разпознаване, което се намира на по-малко от

300 бази разстояние от гореспоменатата ДНК последователност, съдържаща промотора и оператора.

Главните промотори на фага λ във векторите от това изследване спомагат за транскрибцията на ДНК последователности, включени в тези вектори. Методите и векторите на това изобретение по-нататък се характеризират с присъствието на различни подходящи места за разпознаване за включването на желаната ДНК последователност във векторите близо до избрания промотор. Предпочита се разстоянието между избрания промотор и мястото за разпознаване да е по-малко от 300 двойки бази (рв) е още по-добре, ако то е помалко от 150 чифта бази. Предпочитани вектори на това изобретение са също така тези, в които активните N и сго гени липсват. Следователно чрез избиране на подходящ гостоприемник, т.е. който съдържа или не съдържа активен хромозомен N ген, някои от векторите на това изобретение могат да се използват за експресия на ДНК последователности в присъствие или отсъствие на N генен продукт.

Както ще се разбере от последващото описание, векторите и методите на това изобретение позволяват конструиране на методите на това изобретение позволяват конструиране на комбинации гостоприемник-вектор, които дават възможност за усъвършенстване на експресията на прокариотни и еукариотни продукти в клетките на гостоприемника.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ИЛЮСТРАЦИИТЕ

На фигура 1 схематично е изобразена областта на фага Л trp 44 clAt₂ сго-. Изобразени са не всички рестрикционни сайтове. Разстоянията са картирани в А единици, както е описано от E.Szybalski & W.Szybalski, “A Comperehensive Molekular Map of Bacteriophage Lambda”, Gene, 7, pp.217-70 (1979).

Ha фигура 2 схематично е изобразена конструкция от вектори в съответствие с изобретението - pPLc2A,pPLc20 u pPLa23.

На фигура 3 - конструкция от вектори в съответствие с изобретението - рРа2311, pPLa231, pPLa8.

На фигура 4 - конструкция от вектори в съответствие с изобретението - pPLa83, pPLa831, pPLa832, pPLc2, pPc23, pPLc236 u pPLc28.

На фигура 5 - конструкция от вектори в съответствие с това изобретение - pPLc24.

На фигура 6 е показана нуклеотидната последователност на O_LP_L областта на pPLa2311.

На фигура 7 е представено превръщането на PSTI областта в бета лактамазата в BamHI област.

На фигура 8 авторадиографично наблюдаване на синтеза на белтък при 28°С и 42°С, в E.coli К12 Δ HI (pPLa23) и E.coli М5219 (pPLa23).

Ha фигура 9 - авторадиографично наблюдаване на синтеза на белтък при 28°С и 42°С, в E.coli К12 Δ HI (PPLa23trAj) и E.coli U12 Δ HI (pPLa23trpA₂).

Ha фигура 10 - авторадиографично наблюдаване синтеза на белтък при 28°С и 42°С, в E.coli К12 Δ HI (pPLc23trpA_]).

На фигура 11 е авторадиографично наблюдаване на синтеза на белтък при 28°С и 42°1, в E.coli К12 Δ Hl (pPLc2311R,)

На фигура 12 схематично изобразена конструкция на pPLc28sv_t5 u pPLc28sv_t5-37.

На фигура 13 е показано конструирането на pPLc28sv₍5-37 от pPk^esv^ на нуклеотидно ниво.

На фигура 14 - авторадиографично наблюдаване синтеза на белтък при 28°С и 42°С на E.coli К12 Δ HL (pPLc28sv_t5-37-9) и имунопреципитацията на синтезираните от този гостоприемник протеини със серум от хамстер, носещ тумор SV40 след индукция при 42°С в сравнение с имунопреципитацията на автентичен малък-t антиген, синтезиран в бъбрек на инфектирана с SV40 африканска зелена маймуна със същия серум.

Най-добрият начин за провеждане на опитите съгласно изобретението.

За да може описаното изобретение да бъде по-пълно разбрано, е предоставено следното детайлно описание.

В описанието са използвани следните термини:

Нуклеотид - мономерна единица от ДНК или РНК, състояща се от захаридна част (пентоза), фосфат, и азотсъдържаща хетероциклена база. Базата е свързана към захаридната част чрез гликозидния въглероден атом на пентозата (Г-въглеродния атом), комбинацията между база и захар се нарича нуклеозид. Базата характеризира нуклеотида. Четирите

ДНК бази са аденин (“А”), гуанин (“G”), цитозин (“С”) и тимин (“Т”). Четирите РНКбази са A, G,C и урацил (“U”).

ДНК-последователност (секвенция)-линеен ред от нуклеотиди, свързани един с друг посредством фосфодиестерни връзки между 3' и 5' въглеродните атоми на съседните пентози.

Кодон - ДНК последователност от три нуклеотида (триплет), която кодира чрез матричната или информационна РНК (тРНК) една амикокиселина, сигнал за започване на транслацията или сигнал за завършване на транслацията. Например нуклеотидните триплети ТТА, TTG, СТТ, СТС, CTA u CTG кодират аминокиселината левцин (“Leu”), TAG,ТАА u TGA са сигнали за спиране на транслацията, a ATG е сигнал за започване на транслацията.

Полипепдит - линейно подредени аминокиселини, свързани една с друга чрез пептидни връзки между а -амино и карбоксилната група със съседните аминокиселини.

Структурен ген ДНК последователност, която кодира чрез съответната тРНК аминокиселинна секвенция, характерна за специфичен полипептид.

Транскрибция (презаписване) - процесът на получаване на м РНК от структурния ген.

Транслация (превеждане) - процес на получаване на полипептид от м РНК.

Експресия - процесът, на който се подлага структурния ген, за да произведе полипептид. Той е комбинация от транскрибция и транслация.

Плазмид - нехромозомна двойноверижна ДНК последователност, съдържаща иитактен “репликон” така, че плазмидът е реплициран в клетката на гостоприемника. Когато плазмидът е разположен в едноклетъчен организъм, характеристиките на този организъм могат да се изменят или трансформират като резултат от ДНК на плазмида. Например плазмид, носещ гена за резистентност към тетрациклин (TetR) трансформира клетка предварително чувствителна към тетрациклин в резистентна към него. Клетката на гостоприемника, трансформирана от плазмид или вектор, се нарича “трансформант”.

Фаг или бактериофаг - бактериален вирус, който често съдържа ДНК - последователност, капсулирана в протеинова обвивка, наречена капсид.

Клониращото средство или вектор плазмид, фаговата ДНК или друга ДНК последователност, която има способността да се реплицира в клетка на гостоприемник, има едно или малък брой места за разпознаване и рестрикция с ендонуклеази и която може да бъде срязана по определен начин без това да се придружава от загуба на основната биологична функция на ДНК, т.е. репликацията, произвеждането на протеини на обвивката или загуба на местата за свързване с промотора. Тя съдържа маркер, удобен за идентифициране на трансформираните клетки, напр. резистентност към тетрациклин или ампицилин.

Клониране - процес на получаване по безполов начин на популация от организми или ДНК-последователности, произлизащи от един организъм или последователност.

Рекомбинацията ДНК молекула или ДНК хибрид - молекула, състояща се от сегменти несъседна ДНК, които са свързани един с друг с краищата си.

Последователност, контролираща експресията - последователност от нуклеотиди, която контролира и регулира експресията на гените, когато е оперативно свързана с тях.

Клетките гостоприемници в това изобретение.

Голям брой подходящи клетки гостоприемници могат да се използват в комбинациите вектор гостоприемник на това изобретение. Избирането на съответния гостоприемник зависи от броя на факторите, определящи конкретния случай. Това включва например съвместимостта с избрания вектор, токсичността на протеините, кодирани от хибридния плазмид, лесно възстановяване на желания протеин, характеристика на експресията, биобезопасност и разходи. Балансът от тези фактори трябва да бъде повлиян от разбирането, че не всички гостоприемници са еднакво ефективни при експресия на различните рекомбинантни ДНК молекули. В тези генерални напътствия полезните гостоприемници могат да включват щамове от E.coli, Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilius и други бацили, дрожди, или други гъби, животински или растителни гостоприемници, а също и животински (вкл.човешки) или растителни клетки в култура или други гостоприменици.

Предпочитаните клетки гостоприемници на това изследване са E.coli щамове К12с1_а Δ HI (К12 М72 1ас,_п Δ trpEA2 Sm^R (лс1857 Nim7Nia53 Δ HI bio-) (“Κ12ΔΗΙ”) (H.Bemard et al., по-горе) и M5219 (KI2 M72 lac trp Sm^R ( Δ C1857 Δ HI bio 252) (“M5219”) (K.Greer, “The kil Gener of Bacteriophage lambda”, Virology, 66, pp.589-604 (1975). И двата щама приемат дефективен, неизрезваем профаг, носещ мутантен cl ген. Мутантният ген кодира температурночувствителен репресор, което позволява транскрипция от PL промотора да се активира чрез корекция на температурата - при 28°С репресорът е активен и транскрибцията от P_L промотора се репресира, но при 42°С репресорът се инактивира и транскрибцията от P_L промотора се инициира.

Делецията Δ НС на профага отстранява част от сго гена и всички останали гени надясно от него. (M.Castellazzi et al., “Isolation and Characterisation of Deletion in Bacteriophage Lambda Residing as Prophage in E.coli KI2”, Mol.gen Genet., 117, pp. 211-18 (1972).

Щамът M5219 съдържа в прибавка bio252 делеция, която отстранява всички гени отляво на сШ, включително kil в профага. Нещо повече, поради температурната индукция щам М4219 експресира функционален N генен продукт от хромозомния N ген. Щамът К12 Δ HI от друга страна има 2 amber мутации в N, които го превръщат във функционално N негативен. Следователно тези два щама дават възможност за експериментално включване и изключване на експерията от P_L промотора. Нещо повече, изборът на К12 Δ HI или М5219 дава възможности Р₂ медиираната транскрипция да протича в отсъствие или присъствие на N генен продукт. Тъй като нито

E.coli К12 Δ HI, нито E.coli М5219 експресират функционален сго генен продукт, вторично подтискане на P_L медиираната експресия в тях е избягнато.

Конструкцията на няколко включвания на вектори в настоящото изобретение.

Въпреки че има няколко добре познати източника за промотори на фагаА , за целите на следващите илюстративни примери за конструкцията на вектори в съответствие с това изобретение от λ промоторите е избран фаг λ trp44clAtj сго-. Произходът на фага trp44cIAt₂ сго- е описан от N.Franklin, (“The N operon of Lambda: Extent and Regulation as observed in Fusions to the Tryptophan Operon of Escherichia coli.”, in “The Bacteriophage Lambda (Cold Spring Harbor Laboratories), pp. 621-38 (1971). At2 мутацията в cl гена прави репресора термолабилен (M.Lieb, “Studies of Heat Inducible Lambda Bacteriophages. I. Order of Genetic Sites and Properties of Mutant Prophages”, J.Mol Biol., 16. pp 149-63 (1966). Сго- мутацията предотвратява вторичната репресия на P_L функцията. Разбира се, въпреки че е по-малко за предпочитане, при по-дълготрайни експресии между векторите в това изследване могат да се използват и сго⁺ фаги. Фагьт също така носи функционален N ген и активен P_L промотор. Фагьт дава възможност за 3-4 пъти по-високи нива на trp-ензимна експресия, отколкото се постига с обикновения хомоложен rtp промотор (N.Franklin погоре).

λ trp44cIAt₂ сго- ДНК се получава от фага чрез фенолна екстракция из пречистени с CsCI₂ фагови частици. Структурата на P_LO_L областта на този фаг е показана на фиг. 1.

P_L промотора и съседните оператори (O_L) заедно със старта на N генната секвенция са определени в отрязък от ДНК, приблизително 100 чифта бази дълъг, локализиран при около 73,4% от картата на Λ фага. (Фиг.1) (T.Mdjrdjis et al., “Recognition Sequences of Represor and Polymerase in Operators of Bacteriophage Lambda, Cell, 5, pp. 109-13 (1975); J.Dahlberg and F. Blattner, “Sequence of Promotor-Operator Proximal Region of the Major Leftward RNA of Bacteriophage Lambda”, Nucleic Acid Res., 2, pp. 1441-58. Подобно P_R промотора и съседния оператор (O_R) заедно със старта на сго генната секвенция са дефинирани в отрязък от ДНК при около 76.6% върху λ -картата (фиг.1) (T.Mdnidjis et al., по-горе).

Някои от многото начини за изолиране на тези области от λ фаговата ДНК са използвани за получаване на клонове, съдържащи исканата промоторна секвенция. Например различни комбинации от рестрикационни ензими могат да се използват за разцепване на желаните области от А фаговата ДНК (фиг.1). Тези фрагменти след това могат да се използват директно за получаване на клонове, или могат по-нататък да бъдат аранжирани или удължени по познати методи преди клонирането. След приготвянето на подходящ ДНК фрагмент, той може да бъде внедрен в някое от многото клониращи средства или вектори.

Например полезни клониращи средства могат да се състоят от сегменти от хромозомни, нехромозомни и синтетични ДНК секвенции като различни производни SV40 и познати бактериални плазмиди, т.е. плазмиди от E.coli, включително Col El, pCRl, pBR322, pMB9 и техните производни; по-широкообхватни плазмиди -RP4; фагови ДНК - например многобройни производни на λ фага; други ДНК фаги; филаментни едноверижни ДНК фаги - например М 13 и вектори, произлизащи от комбинации между плазмидна и фагова ДНК или дрождеви плазмиди като 2 μ плазмид и техни производни.

Нещо повече, във всяко специфично клониращо средство могат да бъдат използвани различни места за инсертиране λ фаговия ДНК фрагмент. Тези места са обикновено определени от рестрикационните ензими, които ги срязват. Например в pBR322 има различни рестрикционни места, подходящи за вмъкване на ДНК фрагмент. (F.Bolivar et al., “Construction and Characterisation of New Cloning Vehicles II. A.Multi-Purpose Cloning System”, Gene, 2, pp. 95-113 (1977); J.G.Sutcliffe “pBR322 Restriction Map Derived from the DNA Sequence: Accurate DNA Size Markers up to 4361 Nucleotide Pairs Long”, Nucleic Acid Res., 5, pp. 2721-28 (1978). Вж. също фигури 2 и 4. Естествено трябва да се разбере, че клониращото средство в това изобретение не се нуждае от рестрикционно място за вмъкване на λ фагов ДНК фрагмент. Вместо това, средството може да бъде присъединено към фрагмента по алтернативни начини, за да се получи желаният вектор в съответствие с това изобретение.

А. Вектори съгласно това изобретение, съдържащи P_L промотор с ориентация, обратна на часовниковата стрелка по отношение произхода на репликация*

1. рР1а23

Както е представено на фиг.2 в това изобретение е получен подобрен вектор в последователни етапи. Те са представени по-пълно по-долу.

• Ориентацията на първоначалния сегмент се взима като съществуващата в pBR322, както обикновено се представя (Sutcliffe et.al., по-горе) (а) Междинен плазмид pPLc2A λ -trp 44cIAt₂ cro- ДНК, изолирана погоре се разгражда с BamHI u EcoRI за да се изолира фрагменат, простиращ се от 71.3% до 81.02% от рестрикционната карта на λ фага2 (Фиг.1 и 2). По подобен начин pLR322 се разгражда с BamHI u EcoRI и2 фаговият ДНК фрагмент се инертира в мястото срязване на EcoRI - BamHI pBR322 фрагмент (фиг.2).

Полученият вектор се обозначава като pPLc2A, като “с” служи за да покаже ориентацията по часовниковата стрелка на P_L промотора по отношение произхода на репликацията. λ информацията върху тази молекула продължава от BamHI участъка на фага (71.3%) до EcoRI участъка (81.02%) и включва гена N,O_lP_l областта, гените rex u cl (мутант), O_RP_R областта, гените сго (мутант) и ell и част от гена 0 (фиг.1 и 2).

E.coli С 600 (СаС1₂ компетентна) се трансформира с по-горе приготвения pPLc2A при подходящи условия и съдържание. Трансформантите се селекционират при 34°С върху LB петрита, засяти с 10’ pfu от фагаЛ clear (M.Lieb, по-горе), съдържащи 100 мкг/ карбеницилин.

Избраният λ ДНК фрагмент включва cIAt₂ ген и поради това трансформантите, съдържащи този фрагмент, ще бъдат резистентни към 2 clear мутанта при 34°С. В допълнение, избраният pBR322 фрагмент включва гена за резистентност към ампицилин, така че гостоприемникът, трансформиран с плазмиди, съдържащи такъв интактен ген, ще се развиват в култури, съдържащи такъв антибиотик, че нетрансформираните гостоприемници да бъдат изключени.

Избират се 20 трансформанта и се отглеждат култури при 34°С в LB среда, съдържаща 100 мкг/мл карбеницилин и 10’²М MgCl₂. За сигурност, че траснсформантите са истински, съдържащи cl ген, а не бактерии, неспособни да абсорбират λ фага, порции, от културата се инфектират с λ clear или λ vir (F.Jacob & E.Wollman, “Etude Genetique d’un Bacteroiphage Tempere d’Escherichia coli. I.Le Systeme Genetique du Bacteroohage Lambda”, Ann. Inst.Pasteur, 87, pp. 653-90 (1954). Всичките 20 трансформанта показват резистентност към λ clear и чувствителност към λ vir.

ДНК форма I се изолира от един от тези 20 трансформанта чрез стандартната процедура, рестриктира се с EcoRI u BamHI и се оразмерява спрямо стандартни маркери. ДНК показва две вериги, отговарящи на очакваните размери на pBR322 и λ фаговият фрагмент.

(Ь) Междинен плазмид рРЬс20-елиминиране на Bglll фрагмента от pPLc2A λ областта на рРс2А включва четири Bglll места, намиращи се при 73.77%, 78.80%, 80.16% и 80.28% 2 (фиг.1 и 2) (V.Pirotta, “Two Restriction Endonucleases From Bacillus Clobigi; “Nucleic Acid Res., 3, pp. 1747-60 (1976); H.Szybalski & W.Szybalski, “A Comrehensive Molecular Map of Bacteriophage Lambda”, Gene, 7, pp.217-70 (1979).

За елиминиране на Bglll фрагментите между 73.77 и 80.28% 2 , pPLc2A ДНК се разгражда с Bglll, повторно се свързват при концентрация на ДНК по-малко от 1 мкг/мл и се трансформират в E.coli W6 (2 гех) (СаС1₂ компонентна), имаща хромозомен 2 репресор cl така, че да утихне P_L зависимата транскрибция (фиг.2) .Карбеницилини-резистентните клонове се подбират чрез култивиране върху L-бульон, съдържащ 100 мкг/мл карбеницилин и се скринират за загуба на 2_геж функцията, използвайки Т₄ rll 638 мутант. 2^ функцията спира растежа на Т₄ rll 638 мутанта (В.Howard, “Phage Lambda Mutant Deficient in rll Exclusion”, Science, 158, pp. 1588-1589 (1967). Следователно, неспособността на тези обработени с Bglll трансформанти да предотвратяват растежа на Т₄ rll 638 мутанта в сравнение с липсата на растеж на този мутант в гостоприемник трансформиран с pPLc2A, показва, че гех функцията е елиминирана от pPLc2A рекомбинантна ДНК молекула чрез Bglll делецията.

Рестрикционният анализ на рекомбинантните ДНК молекули от тези Bglll обработени трансформанти показват присъствието на единично Bglll място. Нещо повече, при разграждане с EcoRI u BamHI се получават два фрагмента - единият отговарящ на очаквания pBR322 фрагмент, с очакваната дължина от 1900 двойки бази (рв) на фага 2 ДНК фрагмент след елиминирането на порцията между 73.77% ламбда и 8.28% ламбда. Този модифициран плазмид е обозначен pPLc20. Неговият ламбда ДНК отрязък се простира между BamHI мястото (71.3%) и BgLII мястото (73.77%) и също между Bglll мястото (8.28%) и EcoRI мястото (81л02%). То включва гена N, областта O_LP_L и част от гена 0 (фиг.1).

Доколкото остатъкът от примера за конструирането на векторите по това изобретение фокусира върху P_L промотора - P_g промоторът е елиминиран с Bglll - Bglll фрагмента трябва да се подразбира, че сходни манипулации се използват за елиминиране на P_L промотора от pPLc2A и за конструиране на вектор, запазващ P_R промотора. В допълнение, векторите съгласно изобретението могат да се конструират по сходен начин, така че сдържат и P_L u P_R промоторите, с оглед на това двата промотора да действат еднопосочно или противотложно при медиирането на инсертираните ДНК последователности.

(с) pPLa23 - въвеждане на EcoRI сайт на малко разстояние надолу от P_L.

Фрагментът BgHl -BamHI, присъстващ върху pPLc20, съдържа единично HaelH място [73.1% Lambda, фиг.1] намиращо се на около 150 нуклеотида надолу от P_L. (B.Allet & R.Solem “Separation and Analysis of Promoter Sites in Bacteriophage Lambda DNA by Specific Endonucleases” J.Mol.Biol., 85,475-84 (1975). Този участък може да бъде превърнат в EcoRI участък чрез лигиране на тъпи краища на един отворен НаеШ край и един отворен EcoRI край, които предварително са направени тъпи чрез разширяване на отдалечения 3'-край с ДНК полимераза 1 в присъствието на дезоксирибонуклеотид трифосфата (K.Bckman et.al. “Construction of Plasmids Carrying the cl Gene of Bacteriophage Lambda”, Pros.Natl. Acad. Sci.USA, 73, pp. 4174-78 (1976). Детайли от процедурата са описани по-долу и илюстрирани на фиг.2

Шест pmol от pBR 322 се смилат с EcoRI. След термично унищожаване на ензима, ДНК се преципитира и се разтваря в 250 μ 1 буфер, съдържащ 50 М Tris-HCl (pH 7.8). 5 mM MgCl₂, 1 тМ β -меркаптеотенол, 2 μ от всеки от четирите дезоксирибонуклеозид триофосфати ( с a -³²P-dATP (345 Ci ³²P/mmol) u 50/zg ESA/ml. Шест единици от ДНК полимераза 1 от E.coli (Worthington) се прибавят и сместа се инкубира при 16°С за 90 мин. Този процес има за резултат запълването на отворения 3’EcoRI сайт в линеаризирания pLR322.

След топлинна активация на ензима сместа се довежда до 50 mM NaCL, 7 mM β меркаптоетанол и ДНК се разгражда с BamHI. Фрагментите се разделят чрез електрофореза върху 1,4% агарозен гел и се наблюдават чрез авторадиография. Срезът от гела, съдържащ по-големия от двата фрагмента - pBR322 съдържащ отворен BamHI участък и EcoRI мястото със запълнен край- се изрязва и замразява при 90°С. Парчето агароза след това се центрофугира 20 мин при 20 000 rpm (SS34 ротор (Sorvall). Супернатантата се отстранява и замразяването и центрофугирането се повтарят още два пъти. При тези условия около 30% от ДНК, съдържаща се в агарозния отрязък се изхвърля в супернатантата. Тя се преципитира от обединените супернатанти и се разтваря в 10 μΐ 10 мМ Tris-HCI(pH 7.4), 50 mM NaCl, 7 тМ β -меркаптоетанол.

Два pmol от pPLc20 се смилат с Bglll и BsmHI и фрагментите се разделят върху агарозен гел. Малкият фрагмент (Bglll-BsmHI) се елюира от гела, както е описано по-горе, и се смила с BspRI, изошизомер на НаеШ, A.Kiss et al., “A New Sequence- Specific Endonuclease (Bsp) from Bscillus Sphsericus”, Gene, 1, pp.32329 (1977), за да се получи смес от BamHIBspRI u BspRI-Bglll фрагменти, последният носещ P_L промотор. Ензимите Bglll u BmHI произвеждат идентични отворени краища, така че отворен Bglll край може да се лигира към отворен BamHI край и обратно. Нещо повече, резултата от двата вида лигиране вече не е субстрат нито за Bglll, нито за BamHI, но се разпознава от ензима Sau3Al (Mbol) (V.Pirotta, по-горе).

Два pmol от споменатия по-горе pBR322EcoRI-BamHI по-голям фрагмент се лигира към 0.8 pmol от сместа от BamHI-BspRl u BspRIBglll фрагменти. Следва лигиране, отвореният BamHI участък от pBR322 фрагмента е подходящ за лигиране и с двата фрагмента - отвореният Bglll участък и BsmHI мястото на PPLc20, а горещият край на EcoRI мястото от pBR322 фрагмента е подходящ за лигиране към BspRI (НаеШ) участъка на pPLc20 фрагмента, сместа се разграждат с BsmHI, за да се елиминират тези рекомбинантни молекули, състоящи се от нежелания BamHl-BspRI фрагмент, вмъкнат в PBR322 вектора. Получената смес се трансформира в E.coli М5219 и трансформантите се селекционират за резистентност към карбеницилин. Получават се всичко 23 трансформанта. Всички са чувствителни към тетрациклин (също носено от pBR322), тъй като BamHI рестрикацията на pBR322 разрушава интактния ген, кодиращ TetR в модифицира ния плазмид (фиг.2).

Продължаващото присъствие на тези клонове, които сдържат P_L- носещ BspRI-Bglll фрагмент се проверява чрез смилане на ДНК с Hindi. Тъй като pBR322 съдържа две Hindi места (J.Sutcliffe, по-горе) и очакваният PL фрагмент съдържа единично Hindi място (73,4% л, фиг.1) (В. Allet & R.SoIem, по-горе) коректно конструираните рекомбинантни ДНК молекули би трябвало да съдържат три Hindi места. От 23 получени трансформанта пет съдържат предсказаните три Hindi сайта. Три от тях имат уникален EcoRI сайт, показващ, че в тези три клонове е извършено коректно свързване между BspRI (НаеШ) участъка от извършеното коректно свързване между BspRI (НаеШ) участъка от pPLc20 фрагмента и тъпия EcoRI край на pBR322 фрагмента. Тези три клона също така не притежават участък за BamHI, както се очаква при лигиране на Bglll края на pPLc20 u BamHI края на pBR322. Един от тези клонове се избира за по-нататъшна работа и се обозначава като pPLa23 (фиг.2).

pPLa23 се състои от pBR322 фрагмент, простиращ се от BamHI мястото (базов чифт 377 на pBR322) до EcoRI мястото (базов чифт 4362 от pBR322). (J.Sutcliffe, по-горе) (фиг.2). Останалата част от pBR322 е изместена в pPLa23 от фрагмент на trp 44 clAt₂ сго- ДНК, намираща се между НаеШ мястото при 73,3% (сега реконструиран EcoRI участък) и Bglll мястото при 73.77% (сега Sau3A участък) (фиг.2). Размерът на този фрагмент е определен чрез електрофореза в агарозен гел на около 300 двойки бази (рв). В този фрагмент се съдържа O_LP_L областта и първите 115 нуклеотиди от N генния транскрипт (J.Dahlberg & F.Blattner погоре). Посоката на транскрипцията е от Bglll участъка към НаеШ участъка и протича по същия начин като транскрипцията от β -лактамазния промотор на pBR322 (J.Dahlberg &

F.Blattner по-горе) (J.Sutcliffe, по-горе).

Две свойства на плазмида са от специален интерес: 1) Областта, кодираща P_L промотора и β -лактамазния ген, присъства върху единичен Haell фрагмент, очертан от Haell местата при базови двойки 2700 и 436 на pBR322 (фиг.З) (J.Sutcliffe, по-горе, В. Allet & R. Solem, по-горе, V.Pirotta, по-горе). 2) Произходът на репликацията е локализиран върху 370 Ьр фрагмент, съседен на β -лактамаза носещия Haell фрагмент (фиг.З). Функционалният про изход на репликацията изисква връзката около Haell участъка при позиция 2720 да бъде поддържана (А.Ока et.al., “Nucleotide Sequence of Small Col El Derivatives. Structure of the Regions Essential Sequence of Small Col El Derivatives. Structure of the Regions Essential for Autonomus Replication and Colicin El Immunity”, Mol.gen.Genet., 172,pp. 151-59, 1979. Тези свойства на pPLa23 се използват за въвеждане на втори маркер за резистентност към антибиотици във вектора.

2. pPLa231 u pPLa2311 - въвеждане на маркер за резистентност към канамицин в pPLa23.

На фиг.З са изобразени етапите, използвани за приготвяне на други вектори съгласно изобретението от pPLa23. Тези етапи са описани по-пълно по-долу.

Haell фрагмент, кодиращ резистентност към канамицин, се получава от плазмид pMU230 (M.Kahn et. al., “Plasmid Cloning Vehicles Derived from Plasmids ColEl, F,R6K u RK2”, Methods in Enzymology, 68, pp.268-8-q 1979. Зародишът на репликация върху плазмид рМК20 се съдържа най-често в Haell фрагмент, състоящ се от 359 бази. Той обикновено обхваща свръзката между този фрагмент и един съседен Haell фрагмент M.Kahn et al. по-горе). Нуклеотидната последователност около това Haell място е идентично на последователността, намираща се в pBR322 около Haell мястото при позиция 2720 (А.Ока et al., по-горе J.Sutcliffe, по-горе).

Смес от pPLa23 и рМК20 се разгражда напълно с Haell, свързва се отново и се трансформира в E.coli М5219 (CsCl₂ компетентна) (фиг.З).

Правилно трансформираните колонии се избират на базата на тяхната резистентност към карбеницилин и канамицин, тъй като само клоновете съдържащи β- лактамазен ген от pBR322 и канамицинов ген от рМК20 проявяват двойна резистентност към антибиотици. Селекционират се 12 двойно-резистентни трансформанта. Плазмидната ДНК се изолира от тези трансформанти, както е описано вече, и се анализира с Haell рестрикция и оразмеряване на фрагментите в 6% акриламиден гел. Пет от тези клонове имат само три Haell фрагмента - Haell фрагмент, отговарящ на Haell фрагмента на pPLa23, който носи P_L промотора и ^-лактамазния ген, Haell фрагмент, отговарящ на Haell фрагмента от РМК20, носещ гена за резистентност към канамицин и малък Haell фрагмент, също произхождащ от, рМК20 и отговарящ за плазмидната репликация (фиг.З).

Петте избрани клонове по-нататък се изпитват за определяне на ориентацията Haell фрагмента, съдържащ канамицинов ген по отношение на реконструираното EcoRI място върху Haell фрагмента от pPLa23. Haell фрагмента от РМК20, съдържащ канациминов ген, съдържа уникално, асиметрично Hindlll (Kahn et al., по-горе) (фиг.З). Следователно това място осигурява начини за определяне ориентацията на фрагмента.

Петте клона се разграждат с Hindlll и EcoRI и получените фрагменти се оразмеряват както преди. Четири от тях съдържат голямата част от разградения с Hindlll Haell фрагмент от рМК20, съдържащ канамициновия ген, съседен на съдържащия началото на репликация малък Haell фрагмент към реконструираното EcoRI място. Един клон има обратната ориентация. Тези два вида клонове се обозначават условно като pPLa321 u pPLa2311 съответно (фигура 3).

pPLa2311 се избира произволно от погоре конструираните плазмиди и се определя нуклеотидната последователност на P_L областта.

Преди съгласуването, от pPLa2311 се приготвят два набора от рестрикционни фрагменти - EcoRI-HincII u HincII-EcoRI-Xhol фрагменти (не са показани на фиг.З). И в двата случая pPLd2311 се разгражда с първия рестрикционен ензим и резултатните фрагменти се бележат с ³²Р, като се използва Т₄ полинуклеотидкиназа (P-L Biochemicals). След това фрагментите се смилат с втория рестрикционен ензим или двойка ензими, в случая EcoRIXhol, и фрагментите се разделят върху 6% агарозен гел. Съгласуването се прави конвенционално, използва се процедурата на А. Махат u W.Gilbert, “A New Nethod for Sequencing DNA”, Proc. Natl.Acad.Sci. USA, 74 pp.560-64 (1977).

Нуклеотидната последователност на тази област е показана на фиг.6. Тя се простира от Haell частта в pBR322 до реконструирания EcoRI участък при свързването между А фаговия фрагмент и pBR322. Определената последователност има следните характеристики в сравнение с познатите последователности: 1) нуклеотидната секвенция на O_LP_L операторпромоторната област е идентична с тази секвенция от областта във фага A (T.Maniatis et al., по-горе); 2) последователността между Haell участъка и Sau3A участъка при свързването между ламбда фаговия фрагмент и pBR322 е идентична с тази на автентичния pBR322 (J.Sutcliffe, по-горе); 3) последователността на N-генния транскрипт е в съгласие с последователността, определена на РНК ниво от Dahlberg & Greenblatt (по-горе) с изключение на делеция на един адензоинов остатък при позиция 41 на транскрипта и 4) последователнността не включва старт сигнала транслация на N-гена (N.Franclin & G.Bennett, “Jhe N Protein of Bacteriophage Lambda, Defined by Ijs DNA Sequence, Is Highly Basic”, Gene, 8 pp. 107-19, 1979.

3. pPLa4 u pPLa8- Конверсия на PstI сайта в β -лактамазния ген от рР1а2311 в BamHI сайт.

На фигура 3 и 7 схематично е изобразена конверсията на PastI сайта в β -лактамазния ген на pPLa2311 в BamHI сайт. Плазмидът РР1а2311 се линеаризира с PstI. Следва екстракция с фенол и хлороформ, ДНК преципитира и се разтваря отново с концентрация 50 pmol/ml в 25 mM NaCOOCH₃ pH 4.5, 1 тМ ZnCOOCH₃, 125 mM NaCl и се обработва с S1 нуклеаза (Sigma) при 1,5 единици за pmol ДНК за 90 мин при 25°С за отстраняване на З'изпъкналите краища (фиг.7). Реакцията се спира с прибавяне на EDTA до 5 tM.SI нуклеазата се отстранява чрез инкубиране на сместа в присъствие на 0.2% SDS за 10 мин при 70°С, последователно от екстракция с фенол и хлороформ. ДНК се преципитира чрез прибавяне на четири обема 2 М NH₄COOCH₃ и 14 обема етанол. Възстановената ДНК лигира със слепия си край с 10-кратен излишък на BamHI линкерни молекули (Collaborative Research Inc.) (C.Bahl et al., “A General Method for Inserting DNE Sequences into Cloning Vehicles”, Gene, 1, pp.81-92, 1977 (фигура 7). Следва разграждане c Bam HI и обратно лигиране при ниски концентрации на ДНК (фигура 7), сместа се разгражда с PstI, за да се селекционират молекулите, които са избягнали S1 еднокулеазата и съдържат интактен PstI сайт. Два микрограма от обработената ДНК след това се трансформират в E.coli М 5219 и трансфор мантите се селекционират за резистентност към канамицин. Получават се общо 10 трансформанта, два от които нямат PstI сайт и имат очаквания BamHI сайт. Рекомбиннтните молекули на последните два трансформанта се обозначават pPLa8 u pPLa8 u pPLa4 (фиг.З, pPLa4 не е показан на фигурата). Фрагментите, получени след комбинирано EcoRi - BamHI разграждане на тези рекомбинантни молекули (от трансформантите) мигрират в 1.4% агарозен гел заедно с фрагментите, получени от pPLa2311 след разграждане с EcoRi - PstI. Следователно PstI участъка в pPLa2311 е бил разменен с BamHI участък.

На фиг. 7 е изобразен ефектът на описаното по-горе съгласуване върху β -лактамазния ген. Както е показано на фигурата, крайният резултат от конструкцията е замяната на Ala аминокиселинен остатък при позиция 182 в β лактамазния протеин с последователността Arg-Ile-Arg. Тъй като това заместване оставя рамката за четене на β -лактамазния ген интактна, то се очаква, че трансформантите от реконструираните клонове ще проявяват резистентност към карбеницилин. Изненадващо е обаче, че гостоприемници, трансформирани с pPLa4 u pPLa8, не са резистентни към карбеницилин.

4. pPLa83 - Въвеждане на BamHI сайт, съседен на EcoRi сайта от pPLa8.

Плазмид pAD3 (подарък от Н.Schaller) съдържа последователност от 47 рв, инсертирана в BamHI участъка на pBBR322. Тази последователност се състои от следните единици BamHI сайт - EcoRi сайт - лактозен оператор EcoRi сайт - BamHI сайт. За да се инсертира тази последователност в реконструирания BamHI сайт на pPLa8, pPLa8 и 10-кратен излишък от pAD3 се разграждат с BamHI, обратно се свързват и трансформират в E.coli W6 λ rex (фиг.4). Трансформантите се селекционират върху петрита, съдържащи минимална хранителна среда, 50 мкг/мл канамицин, 0.1% глюкоза, 40 мкг/мл X gal (5-bromo-4chloro-3indolyl-beta-D-galactoside) (J.Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory), p. 48 (1972), тъй като присъствието на X gal оцветител дава възможност за откриване на трансформантите, които съдържат лактозо-операторен фрагмент. Всъщност в тази среда трансформантите, съдържащи лактозен оператор, са сини и лесно се отличават от останалите трансформанти.

Рекомбинантната ДНК молекула се изолира от една от сините колонии, както е описано преди и се смила с EcoRi. Получените два фрагмента в действителност мигрират в агарозен гел заедно с двата фрагмента, получени от EcoRI-BamHI разграждането на pPLa8, като при това се потвърждава, че желаният фрагмент от 47 рв от pAD3 е правилно включен в реконструирания BamHI сайт на pPLa8. Плазмидът е обозначен pPLa83 (фиг.4).

5. pPLa831 - носещ BsmHI участък поблизо до P_L промотора в pPLa83.

За да се доведе BsmHI участъка по-близо до P_L промотора в pPLa83, с EcoRi - EcoRi фрагмент се отделя чрез смилане на pPLa 83 i EcoRi и религиране на разтворените ДНК концентрации (фиг.4). Трансформацията на получените рекомбинантни ДНК молекули в E.coli W6 (А гех) и отглеждането върху петрита, съдържащи минимална среда, снабдена както преди с X gal и канамицин, позволяват селекционирането на тези клонове, които повече не съдържат областта на лактозния оператор. Рестрикцията на ДНК от селекционирания трансформант с BamHI-XhoI и сравнението на миграцията на получените фрагменти с двата фрагмента, получени от EcoRi - Xhol смилането на pPLa8, потвърждават, че в модифицирания плазмид BamHI участък се намира както се очаква на около 150 Ьр от P_L промотора. Модифицираният плазмид се обозначава като pPLa831.

Трябва естествено да се разбира, че манипулации, сходни на тези, описани в точки 3,4 и 5, могат да се използват, за да се осигурят други места за ендонуклеазно разпознаване на разстояние по-малко от 300 рв от избран промотор и оператори във векторите на това изобретение. Примери за такива манипулации включват този, описан по-долу.

6. pPLa832 - включване на Hindlll сайт в съседство с BamHI сайта на pPLa831

Плазмидът pAD16 (подарък от Н. Schaller) съдържа фрагмент от 36 рв, инсертиран в BamHI сайта на pBR322, състоящ се от: BamHI сайт - Hindlll - сайт - Hindlll сайт - BamHI сайт. За да се инсертира тази последователност към BmHI сайта на pPLa831, pPLa831 и 10-кратен излишък на pAD33 се разграждат с BamHI, отново се свързват и се трансформират в E.coli М5219, селекциони рана за ресистентност към канамицин (фиг.4). Тъй като няма лесен скриниращ метод за определяне на сигурното вмъкване на желания BamHI фрагмент в pPLa831, анализът на трансформантите, които растат в присъствие на канамицин, зависи от рестрикционното разграждане на индивидуални, произволно избрани клонове. Между 32 анализирани клона е установено, че един продуцира два фрагмента след смилане с Hindlll (фиг.4). Размерът на тези фрагменти е невъзможно да се различи в 1.4% агарозен гел от фрагментите, получени след BamHI - Hindlll разграждане или EcoRI Hindlll разграждане на pPLa831. Този модифициран плазмид е обозначен като pPLa832.

В. Вектори, съдържащи P_L промотор с ориентация по часовниковата стрелка по отношение на източника на репликация.

1. рРЬс2-клониране на PL носещия фрагмент на pPLa832

Еквимоларна смес от pBR322 u pPLa832 се разгражда с BamHI и след това с Hindlll (фиг.4). Сместа се свързва отново и се трансформира в М5219, селекционирана за резистентност към карбеницилин. Тъй като правилно приготвената рекомбинантна ДНК молекула на тази конструкция не съдържа повече интактен ген за тетрациклин, трансформантите също се скринират за загуба на резистентност към тетрациклин. Рекомбинантната ДНК молекула е изолирана, както е описано по-рано, от подбраните трансформанти и се анализира чрез рестрикция. Подбраният плазмид съдържа единично Hindlll място. Комбинираното Hindlll-BamHI разграждане води до получаване на два фрагмента, мигриращи в агарозен гел заедно с двата фрагмента, получени от единично EcoRI разграждане. Присъствието на P_L носещ фрагмент се проверява с с Hindi разграждане. Този ензим разделя вектора на три фрагмента, размерите на които съвпадат със структурата на фрагментите показани на фиг.4. Този плазмид се обозначава като pPLc2. “с” служи за показване на P_L промотор с ориентация по часовниковата стрелка по отношение на началото на репликация.

2. pPLc23 - отстраняване на EcoRI участък от зРЬс2

Плазмидът pPLc2 съдържа два EcoRI сайта - единият произхожда от родителския pBR322 вектор, а другият, близо до BamHI сайта въведен чрез инсерция на Hindlll - BamHI фрагменти от pPLa832 (фиг.4). EcoRI сайта, произхождащ от pBR322, се отстранява чрез разграждане на pPLc2 с Hindlll u Xhol, последвано от разграждане с Ва131 за 30 мин при 25°С в 0.6 М NaCl, 12.5 mM за всяко СаС_|2 и MgS0«, ImM EDTA, 20 mM Tris-HCl (pH 8.1). Екзонуклеазата Bal31 разгражда 3' и 5' краищата по стъпаловиден начин (H.Gray et al., “Extracellular Nucleasws of Pseudomonas Ba 131.1. Characterization of Single Strand Specific Deoxyriboendonuclease and Double-Strand Deoxyriboendonuclease Activities”, Nucleic Acid Res., 2, pp. 1459-92, 1975.

Сместа се екстрахира c фенол и хлороформ, разрежда се до концентрация на ДНК 1 мкг/мл и лигира. След лигирането ДНК отново се разгражда с Xhol u Hindlll, за да се елиминират молекулите на родителския плазмид и се трансформира в М5219, подбрана с оглед резистентност към карбеницилин. Намерен е един трансформант, при който липсва Hindlll u Xhol сайт. Този плазмид съдържа единичен EcoRI сайт и притежава три Hindi сайта (фиг.4). Последното свойство показва, че P_L областта все още присъства. Този плазмид се обозначава като pPLc23.

За да се определи степента на екзонуклеазно разграждане с Ва131, ДНК от pPLc23 се разгражда едновременно с BamHI u PstI и фрагментите се изразяват от 1.4% агарозния гел. В сравнение с Pastl-BamHI фрагмента от родителския pPLc2, Pstl-BamMHI фрагмента от pPLc23 показва повече от 800 рв. Комбинираното разграждане с EcoRI-Pastl-Haell в сравнение с разграждането с EcoRI-PstI потвърждава, че Haell сайта при свързването между P_L носещия фрагмент и кинамициновия фрагмент се поддържа.

3. pPLc236 включване на Hindlll участък в PPL23. Плазмидът pPLc23 съдържа уникални EcoRI u BamHI сайтове локализирани около 150 нуклеотида след промотора (фиг.4). Сайтът за Hindlll инсерция е предоставен в pPLc23 чрез легиране на BamHI-HindlllHindlll-BamHI фрагмент, получен от pPLa832 в BamHI сайта на PPLc23. Трансформантите се получават в М5219 и се скринират чрез рестрикционен анализ за присъствие на Hindlll сайт. Структурата на представителния клон се потвърждава чрез електрофореза в агарозен гел на фрагментите, получени след PstlEcoRI, Pstl-BamHI или Pstl-Nindlll разграж дане. Фрагментите, получени след всяко едно от тези комбинирани разграждания, мигрират едновременно в 1.4% агарозен гел, показвайки, че EcoRI, BamHI u Hindlll участъците са локализирани в непосредствена близост един до друг. Плазмидът е обозначен като pPLc236 (фиг.4).

По-голямата част от плазмида pPLc236 произлиза от pBR322 откъм BsmHI участъка при позиция 377 (J.Sutcliffe, по-горе) най-малко до старта на/? -лактамазния ген около позиция 4160 (J.Sutcliffe, по-горе). Останалата част се състои от 1) последователности, произлизащи от част от канамициновия ген, разположени между Xhol участъка и един Haell край на този фрагмент; 2) Haell-BamHI фрагмент, съдържащ P_L промотора, състоящ се от 300 нуклеотиди и произлизащи от PPLa832; 3) секвенция, кодираща BamHI-Hindlll-HindlllBamHI участъците.

4. pPLc28 - делеция от pPLc236

Припокриването на две съседни Hindlll места в PPLc236 е BaLI сайта (не е показано на фиг.4). Плазмидът също съдържа уникален PvuII сайт при 2067-та двойка бази на pBR322 областта (J.Sutcliffe, по-горе) (фиг.4). И двата ензима - Ball u PvuII продуцират тъпи краища. ДНК на PPLc236 се разгражда с BaLI u PvuII и се свързва обратно при ниски ДНК концентрации. Трансформираните се получават в М5219, селекциониран за резистентност към карбеницилин. ДНК на представителния клон се анализира чрез рестрикция. BamHI смилането дава единичен фрагмент, мигриращ в 1.4% агарозен гел заедно с по-голямата част от PPLc236, разградена с BsmHI - PvuII. Комбинираното разграждане с Pstl-EcoRI, PstlBamHI или Pstl-Hindlll и в трите случая дава два фрагмента, малкият от които мигрира в 1.4% агарозен гел с Pstl-EcoRI фрагмента, получен от рР 1x236. Плазмидът е обозначен като РР1х28 (фиг.4).

РР1х28, както останалите плазмиди, описани в съответствие с това изобретение, могат да бъдат по-нататък манипулирани, за да се инсертират други рестрикционни сайтове. Например фрагмент, съдържащ Xba рестрикционен сайт - Sal рестрикционен сайт. Xba рестрикционен сайт - Pst рестрикционен сайт Xba рестрикционен сайт е инсертиран в рР1х28 при Hindlll рестрикционния сайт. Този плазмид е обозначен като pPLc2819. Друга подоб на манипулация позволява фрагмент, съдържащ PSt рестрикционен сайт - Sal рестрикционен сайт - Xba рестрикционен сайт - Sal рестрикционен сайт -Xba рестрикционен сайт да се инсертира при BamHI сайта на рР1х28. Този плазмид е обозначен като pPLc2833.

5. pPLc24 - инсерция на сайт за свързване с рибозомата и аминокрайната част на бактериофаг MS2 репликазен протеин в рР1х28.

EcoRI - BamHI фрагмент от 431 рв, кодиращ сайт за свързване с рибозомите и първите 98 аминокиселинни остатъци на бактериофаг MS2 репликазен ген се получават от плазмид pMS2-7 (R.Devos et al., “Construction and Characterization of a Plasmid Containing a Nearly Fuii-Size DNA Copy of Bacteriophage Ms2 RNA” J.Mol.Biol., 128,pp. 595619, 1979. Този фрагмент се вмъква в pPLc28, заменяйки вътре оригиналния EcoRl-ВатШфрагмент (фиг.5). Структурата на получения плазмид, обозначен рР1х24, се проверява чрез рестрикционен анализ чрез EcoRI и BamHI и сравняване на размера на получените фрагменти с тези, получени при разграждане на pMS2-7 и pPLc28 с EcoRI и BamHI. В pPLc24 трансрацията на MS репликазния протеинов фрагмент протича колинеарно с транскрипцията от P_L промотора и следователно е под P_L контрол.

Биологични свойства на клетките на гостоприемниците, трансформирани от векторите на това изобретение

1. Стабилност при 28°С

Щамовете К12 Δ HI или М4219, трансформирани с някои от описаните по-горе вектори, се отглеждат при 28°С в LB среда за 20 генерации, без да се селекционират за маркер за резистентност към антибиотици. Подходящи разреждания от културите след това се посяват при 28°С в присъствие или отсъствие на желания антибиотик. Във всички случаи броят на получените колонии е един и същ, без значение на селекцията за резистентност към антибиотици. Това показва, че векторите са напълно стабилни при тези условия при 28°С (Вж.табл.1).

Всички вектори могат също така да бъдат трансформирани в щамове гостоприемници, лизогенни за бактериофага λ . Такива щамове, където фагьт синтезира див-тип cl продукт, са жизнеспособни при повишаване на температурата (37°С). Обратно, нелизоген ните гостоприемници не могат да се трансформират с тези вектори. Вместо това редките трансформанти, получени при тези експерименти, неизменно съдържат вектори с делеции, отстраняващи цялата P_L област или по-голямата й част.

2. Поведение на клетките, съдържащи Р вектори след пролонгирана индукция при 42°С.

Ефективността на култивиране на щамовете К12 Δ HI и М5219, трансформирани с векторите по това изобретение, се определя с присъствието или отсъствието на селективност към антибиотици. Векторите, имащи P_L, инсертиран в посока по часовниковата стрелка по отношение на зареждането на репликацията (pPLc-тип), се отнасят сходно един на друг. Резултатите, получени с PLc236, са изброени в табл.1 по-горе. Щамът К12 HI, трансформиран с PpLc236, се култивира еднакво добре при 42°С и 28°С, без значение дали е приложена селекция към антибиотици или не. Щамът М5219, трансформиран с PLc236, се култивира в неселективни петрита с ефективност 1. Когато се прилага обаче селекция към антибиотици, ефективността на култивиране спада най-малко 1000 пъти. Колониите, получени при 42°С върху неселективни петрита след това не продължават да носят резистентност към антибиотиковия маркер.

Векторите, притежаващи P_L инсертиран в посока обратна на часовниковата стрелка спрямо източника на репликация (р PL -тип), показват по-сложен модел на формиране на колонии при 42®С. Трансформантите на щам М5219 не формират колонии при 42° дори в 5 отсъствие на селекция за антибиотици (ефективността на култивиране е по-малка от 10’³, табл.1). Поведението на трансформантите на щам К12 Δ HI при 42°С зависи от вида на присъствуващия вектор. Например, когато 10 трансформантите съдържат pPLa832, има поне 1000 пъти редукция на култивирането, със и без селекция към антибиотици. Трансформантите, съдържащи pPLa23 или pPLa2311, показват ефективност на култивиране от 1 до 10’³ с по-голяма хетерогенност на колониите.

Следователно експресията на pPLa - тип векторите при 42°С повлиява метаболизма на гостоприемника, правейки клетките неспособни да преживяват при висока температура дори при липса на селекция за плазмида. Този ефект е по-силно изявен когато се използват М5219 гостоприемници. Обратно, векторите от pPLc-тип не повлияват директно метаболизма на клетките на гостоприемника, тъй като се наблюдава 100% преживяемост на индуцираните клетки в отсъствие на селекциониране. Продължителната транскрипция от PL промотора едновременно с експресията на N гена в М5219 може да доведе до инхибиране на векторната репликация в М 5219 щамовете. Това се показва с невъзможността на такива клетки да се развиват при 42°С върху селективни петри.

Таблица 1

	28	42°С
Щам	Вектор	Без селекция	Със селекция	Без селекция	Със селекция

Κ12ΔΗΙ без	1	-	1	-
pPLa23	1	1	K103	K103
pPLa2311	1	1	K103	K103
pPLa832	1	1	<10-3	<103
pPLa236	1	1	1	1

М5219 без pPLa23 pPLa2311 pPLa832 pPLa236

1	-	1	-
1	1	<103	<103
1	1	<103	<103
1	1	<10-3	<103
1	1	-	<103

• Бактериалните култури се отглеждат до насищане в LB среда при 280С в присъствие на антибиотик. Подходящи разреждания се посяват в пирсъствие и отсъствие на антибиотик и се инкубират на 280С или на 420С. Определя се броят на получените колонии.

ЕКСПРЕСИЯ НА ГЕНИТЕ ВЪВ ВЕКТОРИТЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО 1. Обща процедура

Векторите съгласно изобретението могат да бъдат успешно използвани за получаване на различни полипептиди и протеини чрез инсертиране на ДНК последователности, съдържащи гени, които кодират желаните протеини или полипептиди във векторите при някое от местата за ендокулеазно разпознаване, съседно на промотора и оператора, трансформиране на подходящ гостоприемник с векторите, съдържащи тази ДНК последователност, култивиране на гостоприемника и събиране на полипептиднте продукти. Примери за такива полипептиди и протеини са левкоцитарен интерферон, инсулин, антигени на хепатита, антигени на шапа, фибробластен интерферон, човешки растежен хормон, имунен интерферон и разнообразни други прокариотни, еукариотни и вирусни ензими, хормони, полипептиди, антигени и протеини.

За илюстриране на тези процеси, синтезата на специфичните генни продукти във векторите на това изобретение са наблюдавани с пулсиращо маркиране на индуцираните клетки и анализ на белязаните протеини чрез електрофореза в полиакриламиден гел. Клетките, трансформирани с вектори съгласно изобретението, се отглеждат в LB среда без антибиотик при 28°С до плътност 2x10* /мл. Клетките се събират чрез центрофугиране и разтварят в първоначалния обем среда, съдържаща 19 тМ NH₄C1, 86 mM NaCl, 42 mM Na₂HPO₄, 1 тМ MgSO₄, 0.2% глюкоза, 0,05% казаминови киселини (Difco), 0.01% дрождев екстракт и 50 мг/мл L триптофан за маркиране на клетките с ^МС аминокиселинна смес или горната среда с

J5 изключение на това, че казаминовите киселини са заместени с 5% метионинова среда (Difco) и дрождев екстракт за маркиране на клетките с ^MS метионин. Инкубацията при 28°С продължава 60 мин. Половината от културата след това се поставя при 42°С. На различни интервали след индукцията, както е показано от броя на минутите преди ивиците на фиг. 8 - 11, порции от културите при 28°С и 42°С се бележат с ^НС аминокиселинна смес или ³⁵S метионин (Amersham).

Включването на маркера се прекъсва с фенолна екстракция. Синтезираният протеин се преципитира от фенолния слой с прибавяне на 5 обема етанол и се разтваря обратно в 1% SDS, 1% бета-меркаптоетанол, 10% глицерол, 62,5 тМ Tris-HCI (pH (pH 6.8). Пробите се варят 5 мин., центрофугират се при 12000 х g и се разделят чрез електрофореза в полиакриламиден гел (10% - 15% акриламид) съгласно процедурата на U.Laemmli, “ Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4”, Nature, 227, pp. 680-82, 1970. След електрофорезата теловете се приготвят за флуорография съгласно метода на W.Bonner & R. Laskey, “A Film Detection Method for Tritium Labelled Protein and Nucleic Acids in Polyacrylamide Gels”, Eur. J.Biochem, 46, pp.83-88, 1974, c изключение на това, че е използван EN’HANCE (NEN) вместо PPO-DMSO.

2. Прокариотни гени (а) β -лактамазният ген рР1а23 (фиг.З) включва β -лактамазният ген в смислова ориентация, надолу от P_L промотора. Следователно продукцията на протеина, кодиран от /?-лактамазния ген, може да бъде проследена като индикация за ефективността на вектора в експресираните прокариотни гени.

Трансформираните на Κ12Δ HI и М5219 с pPLa23 - E-coli U 12 Δ HI (pPLa23) u E.coli M521 (pPLa23) се приготвят, както е описано по-горе и се проследява протеиновия им синтез. Резултатите са показани на фиг.8. Може да се види, че настъпва драматично повишаване на степента на синтез на двата протеина с молекулно тегло около 27.5К и ЗОК, респективно, скоро след индукцията на трансформантите при 42°С. Размерите на тези експресирани протеини са в съгласие с очакваната дължина на зрялата β -лактамаза и нейният предшественик (J.Sutcliffe, по-горе). Нещо повече, индуцираният синтез на тези протеини се сравнява с повишена ензимна активност на β лактамазата, определено по метода на O’Callagan et al., “Novel Method for Detection of Beta-Lactamases by Using a Choromogenic Cephalosporin Substrate”, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, l,pp. 283-88. 1972. И двата протеина са специфично преципитирани чрез анти β -лактамазен серум. Като контрола се проследява протеиновия синтез в гостоприемници, нетрансформирани с вектор pPLa23. Не е наблюдаван синтез на двата погоре описани протеина от тези нетрансформирани гостоприемници.

Както е показано на фиг.8, общите схе5 ми на протеинов синтез в тези трансформанти са много сходни при 28°С и 42°С. Сходно поведение се наблюдава и в клетки, нетрансформирани с pPLa23. В допълнение, на фиг.8 е показано, че относителното количество на по10 големия от двата протеина свързани с β -лактамазата- непреработеният прекурсор за βлактамаза - става по-голямо с времето след индукцията. Това наклоняване на равновесието към изграждането на прекурсорен протеин може би указва насищане на jS-лактамазапроизвеждащия апарат на клетката.

За да се определи процента на синтез на лактамазата в сравнение с тоталния de novo протеинов синтез на трансформанта, протеиновите ивици за β -лактамазата (27.5К) и нейния прекурсор (ЗОК) се изрязват от изсушения гел и тяхната радиоактивност се сравнява с тоталната радиоактивност на гела. Тези резултати са показани в таблица II.

ТАБЛИЦА II

Процент синтез на^бетй - лактамаза в сравнение с тоталния de novo протеинов синтез

Минути след индукцията при 42°С	Щам
Κ12ΔΗΙ	М5219
0-10	8%		9%
10-20	9%		16%
20-30	10%		25%
30-40	16%		24%
40-50	23%		30%
50-60	27%		-
60-70	30%		-
70-80	33%		-
контрола при 28°С	5%		4%

Както е показано на таблица II, синтезът на)3 -лактамазата и нейният прекурсор показва максимално равнище при около 30% от тоталния de novo протеинов синтез и в двата щама. Обаче кинетиката на достигане на това 5 ниво е различна за двата щама - щам Κ12ΗΔΙ достига 30%-ното ниво около 20 мин след щам М5219. Макар да не се свързва с теорията, вероятно N генният продукт, копродуциран при индукцията на щам М5219, но не и при щам

Κ12Δ HI, преодолява някои забавящи транскрибцията сигнали в ДНК секвенцията след

P_L промотора и по този начин ускорява βлактамазната синтеза на щам М5219.

За определяне степента на тотален протеинов синтез в тези трансформанта, се измерва тоталната радиоактивност, включена в специфичен интервал от време и се сравнява с тази, включена по време на 0 -10 минутния интервал, която се приема за 100%. Резултатите са показани на таблица III.

ТАБЛИЦА III

Степен на тоталния протеинов синтез

Минути след индукцията при 42°С	Щам
Κ12ΔΗΙ	М5219
0-10	100%	100%
10-20	104%	92%
20-30	134%	56%
30-40	113%	31%
40-50	120%	10%
50-60	113%	7%
60-70	96%	3%
70-80	96%	3%
150-160	20%

Както е показано на таблица III, тоталният протеинов синтез в E.coli М5219 (pPLa23) 40 бързо спада след индукцията. Това е в съгласие с предварителните наблюдения че М5219 трансформантите не могат да преживеят при 42°С. Сходно инхибиране на протеиновия синтез не се наблюдава в М5219 (pBR322). 45 Съществена редукция в тоталния протеинов синтез е наблюдавана също в E.coli К12 Δ HI (pPLa23) след продължителна инкубация при 42°С. Обаче тези клетки са способни да преживеят при 42°С. 50 (Ь) Триптофан синтеза А ген (i) _PPLa23

EcoRI фрагмент (5300 рв), съдържащ trpA цистрон от Salmonella typhimurium е получен от pES9 (E.Selker et al., “Mitomycin C induced expression of trp A of Salmonella typhimurium Inserted into the Plasmid ColEl”, J.Bacteriology, 129, pp. 388-94 1977 и инсертиран в pPLa23 при неговия EcoRI сайт. Двата представителни плазмида, имащи този фрагмент, инсертиран в едната или другата посока на P_L промотора, са обозначени като pPLa23trpA, u pPLa23trpA_r Индукционните профили на щам К12Д ΔΗΙ, съдържащ pPLa23trpA₍ или pPLa23trpAj, са показани на фиг.9. Основният протеин с тегло около 25

000 далтона се индуцира от рРЬагЗ^рАр но липсва в индуциираните клетки, съдържащи pPLa23trpA₂. Наблюдаваното молекулно тегло на този протеин е в съответствие с теоретичната му стойност (28 500), предвидена от нук- 5 леотидната последователност на Salmonella typhimurium rtp А гена (B.Nichols & C.Yanofsky, Nucleotide Sequences of rtp A of Salmonella typhimurium and Escherichia coli: An Evolutionary Comparison”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, pp. 5244-48, 1979. Нещо повече, ензимната активност, проявяваща се с присъствието на генния продукт на rtp А, се повишава с акумулирането на този индуциран протеин, определено по метода на O.Smith & С. Yanofsky “Enzymm Involved in the Biosynthesis of Tryptophan”, Methods in Enzymology, 5. pp. 794-806, 1962.

След пролонгирана индукция на pPLa23trpA_] u pPLa23trpA₂ се синтезира протеин с молекулно тегло около 18К (фигура 9). Процентът на синтезиране на този протеин, свързан с тоталния de novo протеинов синтез на трансформанта, е независим от ориентацията на фрагмента EcoRi trp А спрямо посоката на транскрибция от P_L промотора. Следователно, предполага се, че синтезата на протеина се контролира от бактериален промотор, който може би е леко температурно зависим и при10 съства върху 500 Ьр фрагмента EcoRi trp A, който наистина е доста по-голям, отколкото е нужно за trp A. (E.Selker, по-горе).

Процентът на синтезата на trp А, в сравнение с тоталния de novo протеинов синтез на 15 трансформанта се определя както е описано по-горе за/? -лектамазата. Резултатите са показани на таблица IV. Отново rtp А синтезата достига максимално ниво от 30% от сравнен с тоталния de novo протеинов синтез.

ТАБЛИЦА IV

Процент синтеза на trp А, сравнен с тоталния de nfvo протеинов синтез

Минути след индукция при 42°С	Κ12ΔΗΙ /pPLa23Aj/	Κ12ΔΗΙ /рРЬа23Аг/
0-10	3%	2%
30-50	4%	2%
60-80	14%	1%
90-110	21%	2%
120-140	24%	2%
150-170	33%	2%
контрола	2%	3%
при 28°С

(ii) pPLa2311

Рекомбинантната молекула, идентична на pPLa23trpAl, но базирана на pPLa2311 се получава по същество, така както е описано погоре. К12 Δ HI трансформантите с pPLa2311 trpA 1 5 се отнасят сходно на pPLa23trpAl. С изключение на това, че в този експеримент максималното ниво от тоталния de novo синтез е само 20% след 150 мин. Отново продължителната индукция води до общо понижение в тоталния 10 протеинов синтез.

(iii) pPLc23.

Единият край на EcoRI фрагмент на pES9 се намира в trp гена и съдържа единичен Sall участък около 2500 Ьр от EcoRI участъка 15 (E.Selker et al., по-горе). Тъй като trp А гена не съдържа Sall участък (В.Nichols & С. Yanofsky, по-горе), trp А генът може да бъде локализиран напълно в този участък на EcoRI фрагмента на pES9, продължаващ от първия 20

EcoRI участък до Sall участъка. Затова предварително полученият EcoRI фрагмент от pES9 се разгражда със Sall и полученият фрагмент се включва в pPLc23 вместо EcoRI-Sall фрагмента (фиг.4). Въз основа на наблюдаваната посока на транслация на trp Ь гена в pPLa23trpA₎ u pPLa23trpA₂ гена, базираната на pPLc23 рекомбинантна ДНК молекула, имаща trpA ген, колинеарен с транскрипцията от P_L промотора, се обозначава като pPLc23trpA_r

При индукция (42°С) на E.coli Κ12ΔΗΙ (pPLc23trpAj) trpA се синтезира до максимално ниво около 40% от тоталния de novo протеинов синтез след 3 ч индуциране. Това високо ниво се поддържа около 2 ч (фиг. 10). Резултатите са показани на таблица V по-долу. Следователно, обратно на поведението на рР La-тип векторите, протеиновият синтез при pPLc-тип трансформантите не спада до 5 ч след индукцията.

ТАБЛИЦА V

Минути след индукция при 42°С	Процент синтез на trp А*	Степен на тотален протеинов синтез
30-50	11%	100% (база)
60-80	17%	198%
120-140	31%	228%
180-200	41%	162%
240-260	36%	205%
300-320	39%	213
контрол при	3%	-
28°С (300-320)

* В сравнение с тоталния de novo протеинов синтез * В сравнение с тоталния de novo протеинов синтез

Действителното количество индуциран протеин, акумулирано в горните трансформанти, се измерва също с продължаващо маркиране на индуцираните клетки. E.coli К12 Δ HI (pPLc23trpAj) се култивира в LB среда при 28°С до плътност 1x10’ клетки/мл. Клетките тогава се бележат с 10 MkCi ^|4С аминокиселинна смес. При плътност на културата 4 х 10’ кл/мл температурата се превключва на 42°С и инкубацията продължава. Когато културата достигне насищане (6 ч след индукцията), протеините се екстрахират от клетката и се разделят върху SDS полиакрлиамиден гел. Определя се процента радиоактивност, включен в ивиците на trpA. При използваните условия се приема, че клетките са равномерно маркирани, така че радиоактивността, включена в протеина отговаря на действителното количество протеин, присъствуващ в клетката. Тгр А протеинът е измерен 10% от тоталните клетъчни протеини. Тези 10% концентрация на trpA от тоталните клетъчни протеини на E.coli К12 Δ HI (pPLc23ytpA₍) служат също така и да се покажат важните разлики между λ P_L съдържащите вектори на H.Bemafd et al., посочено по-горе, и тези съгласно изобретението. В контраст с 10% действителна концентрация на trpA, постигната при настоящото изследване, H.Berhard et al. отчитат само 6.6% концентрация на trp А - определена на базата на ензимната активност на trpA и една допусната специфична активност на протеина. Трябва също да се отбележи, че концентрация 6.6% на trp А, отчетена от Н.Bernard et al. се наблюдава при вектори, които включват активен N ген и следователно при транскрибцията присъствува антитерминиращ N генен продукт. Само 2% концентрация се наблюдава от H.Bemdrd et dl с вектор, който не включва активен N ген. Противоположно на това 10% концентрация на trpA, наблюдавана при използването на усъвършенствуваните вектори на това изобретение, е получена в отсъствието на N генни продукти. Следователно, настоящите вектори и методи представляват забележително подобрение пред тези, описани в досегашното състояние на техниката.

(с) Ген за репликазен протеин на бактериофага MS2.

Плазмидът pMS2-7 съдържа копие с приблизително пълния размер на РНК от бактериофаг MS2 (R.Devos et al., по-горе). Генът за фаговата репликаза се съдържа в EcoRIPstl фрагмент. Този фрагмент се инсертира в pPLa2311 чрез проста замяна на EcoRI-PstI на този вектор. Трансформантите E.coli К12 Δ HI (pPLc2311R1) се скринират за чувствителност към карбеницилин, тъй като генът за резистентност към ампицилин вече не е интактен в pPLa2311R₁. Идентичността на инсертирания фрагмент се установява с колектрофореза в агарозни гелове заедно с познати фрагменти от pMS2-7 ДНК. В pPLa2311R₁ транскрипцията на MS2 репликазния протеин протича колинеарно с транскрипцията на P_L промотора.

Индуциираните клетки на E.coli К12 Δ HI (pPLc231 IRj) синтезират протеин с молекулно тегло около 59К (фиг.11). Размерът на този протеин е съвместим с молекулното тегло на MS2 репликазата (6069) далтона), пресметнато от последователни данни за вирусната РНК (W.Fiers et al., “Complete Nucleotide Sequence of Bacteriophage MS2 RHA: Primary and Secondary Structure of the Replicase Gene”, Nature, 260, pp 500-507, 1976.

Присъствието на функционален MS2 репликазен протеин в протеиновите продукти на клетките, трансформирани с pPLa2311R, се проверява също посредством комплементарен анализ с MS2 amber мутанти. Този анализ показва, че клетките, трансформирани с pPLa231 lRj, произвеждат продукт, който е специфично комплементарен на продукта от MS2 мутант, носещ лезия в репликазния ген, а клетките, нетрансформирани с pPLa2311Rp не са комплементарни на продукта на този мутант.

По отношение синтеза на MS2 репликазния протеин E.coli К12 Δ HI (pPLc2311R₁) и E.coli М5219 (pPLc231 lRj) се отнасят по сходен начин след 30-минутна индукция процента на синтеза на MS2 репликазата е 29% от тоталния протеинов синтез, като нивото спада бързо при последваща индукция (фиг. 11). Тъй като такова спадане не се наблюдава при синтеза на β -лактамаза или trpA, редукцията може да е причинена от специални свойства на MS2 репликазата. Например наблюдаваната тенденция фаговата репликаза да се свързва със собствената си тРНК на място близо до средата на цистрона, може да повлиява понататъшната транслация на комплексната mPHK (Meyer et al., “The Binding Sites of Q beta RHA”, Experientia, 31, pp. 143 et seq., 1975.

3. Еукариотни гени

а) Малък t антиген на Simian Virus 40 гена Hindlll ДНК фрагмент, съдържащ пълната кодираща секвенция на SV40 малък Т антиген (G.Volckaert et al., “Nucleotide Sequence of the Simian Virus 40 Small-t gene, Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 75, pp 2160-64, 1978 ce включва в Hindlll участъка на pBR322 (фиг. 12). Ориентацията на инсерта се определя чрез рестрикционен анализ, основаващ се на присъствието на асиметрично ориентиран TaqI участък. От тази хибридна ДНК молекула се изрязва EcoRI-BamHI фрагмент, ограждащ по-горе отбелязаният Hindlll фрагмент, части от PBR322 се инсертират в pPLc28 вместо неговия EcoRIBamHI фрагмент, така че транслацията на малкия t фрагмент протича колинеарно с транскрибцията от P_L промотора (фиг. 12). Получената рекомбинантна ДНК молекула се обозначава PPLC28SV.5,

За да се съкрати разстоянието между P_L промотора и иницииращия кодон (ATG) на гена, кодиращ малкия t антиген, pPLc28SV_{5 се модифицира, за да се елиминира EcoRIHindlll фрагмента между гена и P_L промотора. Тези манипулации са изобразени на фигури 12 и 13. Те се състоят от разграждане на pPLac28V_t5 с Clal, нарязване обратно на 3' края на ДНК молекулата на два етапа, използвайки 3' екзонуклеазната активност на Т4 ДНК полимеразата в присъствието на GTP u ТТР, респективно, по-нататъшно въздействие със S1 нуклеаза, прибавяне на EcoRI линкери към тъпите краища, разграждане на фрагмента с EcoRI и регулиране на комплементарните краища. Трансформирането на E.coli К12 ΔΗΙ с тези модифицирани хибридни ДНК молекули и индуциирането им позволява експресията на значително големи количества протеин с молекулно тегло 14К (фиг. 14). Този протеин не се продуцира без индукция и от гостоприемници, които не са трансформирани с вектори, съдържащи SV40 ДНК.

Въпреки че автентичният малък-t антиген има молекулно тегло 19К и протеина, получен от тези трансформирани клетки, прециптира много слабо с антитела, образувани срещу големия-Т антиген на SV40, двудимензионални “отпечатъци от пръсти” (електрофореза при pH 3.5, последвана от хроматография в бутанол/оцетна киселина/пиридин/вода (15:3:10:12№ на пептиди, получени от този протеин и автентичен малък-t антиген потвърждават, че двата са родствени. Въпреки че не бихме искали да се обвързваме с теория, може би вторичната структура на тРНК, започваща при P_L промотора е такава, че вътрешен иницииращ кодон на малкия t антиген е фаворизиран повече от инициацията при истинския стартов сигнал. Тази хипотеза е съвместима с вторичната структура, която се извежда като се използва процедурата на

D.Iserentant & W.Fiers, “Secondary Structure of mRHA and Efficiency of Translation Initiation”, Gene, pp.1-12 (1980), от неуклеотидната последователност на някои от тези SVt, съдържащи вектори.

Една от модифицираните pPLc28SV_t5 рекомбинантни ДНК молекули, получена по горния начин, експресира малки количества 17К компонент в прибавка към главния 14К протеин. Тази молекула е обозначена pPLcSV₍5-37. Докато присъствието на 17К компонент може само първоначално да се установи със специфична имунопреципитация с антисерум срещу големия Т антиген, то понататъшна модификация на молекулата дава възможност за увеличен синтез на 17К протеин. Тази модификация, която се състои от разграждане на pPLcSV₍5-7 с EcoRI, разтягане на вдлъбнатите краища с ДНК полимераза I (К.Backman et al., по-горе) и регулиране на тъпите краища, може би променя вторичната структура на тРНК. Гостоприемниците, трансформирани с pPLcSV_t5-37-9, дават възможност за синтез на 17К протеин приблизително 4% от тоталния протеинов синтез de novo. Тези резултати са показани на фиг. 14. Както е показано на линия с от фигура 14, 17К компонента имунопреципитира със серум от SV40-TyMop, съдържащ хамстер до същата степен както автентичният t антиген, отгледан в бъбрека на инфектирана с SV40 африканска зелена маймуна.

(Ь) Ген за човешки фибробластен интерферон (HF1F)

Както е показано от R.Derynck etal., “Expression of Human Fibroblast Interferon Gene in Escherichia coli”, Nature, 287, 193-197 (Sept.18, 1980), генът, кодиращ човешки фибробластен интерфрон, е включен във векто22 рите рР1а8 u pPLc24 и са получени рекомбинантни ДНК молекули, които могат в трансформирани гостоприемници след подходяща индукция да експресират протеини, имащи антивирусна, физикохимична, имунологична и биологична активност, тясно отговаряща на автентичния човешки фибробластен интерфрон.

(с) Ген за FMDV антиген (вирусен антиген на шапа)

Както е описано от H.Kupper et al., “Cloning of a DNA of Major Antigen of Foot and Mouth Desease Virus and Expression in E.coli”, Nature, 289, pp.555-559 (Feb. 12. 1981), ДНК последователност, която кодира полипепдит, показващ специфичност на FMD вирусен антиген, е включен във вектор pPLc24 за получаване на рекомбинантни ДНК молекули. Последните имат способността в трансформиран гостоприемник след подходяща индукция да експресират полипептиди, имащи специфичност на FMD вирусен антиген.

Микроорганизмите и векторите, получени чрез процесите, описани тук, са зарегистрирани чрез култури, депозирани в Американската банка за тъкан ни култури (American Type Culture Collection), Maryland, USA, 8.cenтември 1980 и идентифицирани като PL-А до PL-D:

A. E.coli M5219(pPLa2311)

B. E.coli KI2 Δ HI (pPLa8)

C. E.coli K12 Δ HI (pPLa28)

D. E.coli M5219 (pPLc24).

Тези култури имат номера 31694-31697 съответно.

В допълнение, микроорганизмите и векторите, получени чрез тук посочените процеси и съдържащи ДНК последователност на експресия в тях, са удостоверени чрез култури, депозирани в немската микробна колекция (Deutsche Sammlung Von Microorganismen) в Гьотинген, Германия и идентифицирани както следва:

HEIF-D: E.coli М5219 (G-pPLa-HFIF-67-12) [DSM 1851]

HFIE-E: E.coli K12 D HI (G-pPLa-HFIF-67-12) [DSM 1852]

HFIF-F: E.coli M5219 (G-pPLa-HFIF-67-12 19) [DSM 1853]

HFIF-G: E.coli M5219 (G-pPLa-HFIF-67-8) [DSM 1854]

FMDV-A E.coli W6 (A _ra-pPL-VPl-l) [DSM 1879] FMDV-B E.coli NF1 UN-cro-c^-pPL-VPl-l) [DSM 1880]

FMDV-C E.coli NF1(A N-cro-cI₀pPL-VPl-5) [DSM 1881]

Културите HF1F-D-HFIF-G са депозирани на 5 юни 1980 г.

Културите FMDV-D-FMDV-C са депозирани на 31 юли 1980 г.

Както е представено в частите, формиращи това изобретение, става ясно, че основната конструкция може да се измени и да се използва за поучаване на други структури, които да използват процедурите и съставните части на това изобретение. Затова с дадените претенции се дефинира по-скоро областта на това изобретение, отколкото специфичните му съставки, представени по-горе чрез примери.

Claims (15)

1. Плазмиден вектор, който съдържа поне една ДНК последователност, състояща се от поне един промотор и оператор, произхождащ от бактериофаг А , характеризиращ се с отсъствие на активни сго u N гени и също характеризиращ се с поне един сайт на разпознаване от рестрикционна ендонуклеаза, който се намира на разстояние по-малко от 300 рв след споменатата ДНК последователност, съдържаща промотора и оператора и не по-близо от който и да е N ген от споменатата ДНК последователност, отколкото некодиращия му 5' край. Указаният плазмиден вектор дава възможност за експресия в E.coli на ДНК последователност, включена при един от сайтовете за рестриктазно разпознаване, кодираща триптофансинтетаза А от Salmonella typhimurium, с ниво поне 10% от тоталния разтворим клетъчен протеин, в отсъствие на активен N ген.

2. Вектор съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че указаните промотор и оператор са P_LO_L или P_g0_R.

3. Вектор съгласно претенции 1 и 2, характеризиращ се с това, че указаният сайт за разпознаване съдържа EcoRI, BamHI, Hindlll, Pastl.Xba u Sal.

4. Вектор съгласно претенции 1 и 2, характеризиращ се с това, че указаният сайт за разпознаване се намира около 150 рв след ДНК секвенцията, съдържаща указаните промотор и оператор и не по-близо от кодиращата последователност на всякакъв N ген от споменатата ДНК последователност, отколкото неко23 удиращият му 5' край.

5. Вектор съгласно претенции 1 и 2, характеризиращ се със сайт за свързване на рибозома.

6. Вектор, съгласно претенция 5 характеризиращ се с това, че сайтът за свързване на рибозомата произлиза от репликазния ген на бактериофага MS2.

7. Вектор съгласно претенции 1 и 2, характеризиращ се с това, че включва при един от указаните сайтове за ендонуклеазна ДНК последователност, кодираща еукариотен или вирусен протеин, полипептид, ензим, хормон, антиген или фрагмент от тях.

8. Метод за получаване на усъвършенстван плазмид-клониращ вектор съгласно претенция 1, характеризиращ се с включване на съществуващо плазмидно средство поне на една ДНК последователност, съдържаща P_RO_R или P_LO_L и осигуряваща в указаното клониращо средство поне един сайт за разпознаване от рестрикционна ендонуклеаза, което се намира на разстояние по-малко от 300 нуклеотидни чифта след споменатата ДНК последователност, съдържаща промотора и оператора и не по-близо от всякакъв N ген от споменатата ДНК последователност, отколкото некодиращия му 5' край.

9. Метод, съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че указаният сайт за разпознаване съдържа EcoRI, BamHI,Hindlll, PstI, Xba u Sal.

10. Метод, съгласно претенция 8 характеризиращ се с това, че указаният сайт за разпознаване се намира около 150 рв след ДНК секвенцията, съдържаща указаните промотор и оператор и е не по-близо до кодиращата последователност на всякакъв N ген от споменатата ДНК последователност, отколкото некодиращия му 5' край.

11. Метод, съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че в указания вектор е инсертиран сайт за свързване на рибозома.

12. Метод, съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че сайтът за свързване на рибозомата произлиза от репликазния ген на бактериофага MS2.

13. Метод за получаване на рекомбинантна ДНК молекула, характеризиращ се с включване на ДНК последователност, кодираща еукариотен или вирусен протеин, полипептид, ензим, хормон, антиген или фрагмент от тях в поне един от указаните сайтове за рестриктазно разпознаване на плазмидния вектор съгласно претенция 1.

14. Метод за поучаване на полипептид, характеризиращ се с култивиране на подходящ гостоприемник, трансформиран с вектор според претенция 7 и събиране на този полипептид.

15. Метод, съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че указаният полипептид съдържа левкоцитарен интерферон, фибробластен интерферон, имунен интерферон, инсулин, човешки растежен хормон, животински растежен хормон, антигени на хепатита, шапа и други вируси и други прокариотни, еукариотни и вирусни ензими, хормони, полипептиди, протеини или аминокиселини.