PT89768B - Processo de producao de proteinas de ligacao a hiv - Google Patents

Description

MEMORIA descritiva

Campo do Invento

Este invento refere-se ã produção de proteínas de ligação a HIV, derivadas de proteínas CD-4 solúveis (sCD-4). Mais particularmente, ele refere-se à construção de vectores para a expressão de proteínas de ligação a HIV em E. coli, S treptomyces e lev_e dura.

Antecedentes do Invento

A glicoproteína da célula T humana, CD-4 (anteriormente, algumas vezes, referida por T4) é uma de várias proteínas não polimórficas do receptor de superfície do linfócito T que têm sido implicadas na mediação de interacções eficientes célula T-céljj la alvo.

A sequência de ADNcdo receptor humano CD-4 (T-4) é conhecida (Maddon, et al., Cell 42/93 (1985)). A sequência completa da pré-proteína de CD-4 tem 458 aminoácidos de comprimento compre, endendo os domínios de co mando/B^tfr^ V<5rio com 23 aminoácidos, de superfície (V^-V^) com 372 aminoácidos, de transmembrana com 23 aminoácidos e citoplásmico com 40 aminoácidos. 0 domínio de super fície apresenta quatro regiães de homologia limitada, 20-30%, às regiães de variável (v) e união (□) da imunoglobulina. Quatro das cinco fronteiras intrão-exão no domínio de superfície ocorrem próximo das junçães destas regiães V-0.

vírus da imunodeficiência humana (HIV), o agente etiológico do síndroma da imunodeficiência adquirida (SIDA), apresenta uma afinidade marcada com os linfócitos CD-4. A ligação do vírus a CD-4 é mediada pela glicoproteína gpl20 do envelope virai. A proteína CD-4 pode ser co-precipitada a partir de células infecta das com HIV, lisadas, com anticorpo anti-env e reciprocamente, a gpl20 pode ser co-precipitada com anticorpo monoclonal anti-CD-4, demonstrando assim que a ligação do vírus a CD-4 é mediada pela glicoproteína gpl20 do envelope virai.

Recentemente, vários investigadores científicos revelaram as suas observaçães relativas à interacção entre CD-4 e a infec68 798

SKB CASE 14414 /Ύ

ção da SIDA usando um derivado de CD-4 expresso em sistemas de células de mamífero.

Deen, et al. , Nature 331:82 (1988) revelam o isolamento e expressão de sCD-4 em vários meios celulares. A sCD-4 é um derivado solúvel de CD-4 ao qual falta osdomíniosda transmembrana e citoplasmático de CD-4. Usando a linha de células de Ovário de Criceto Chinês (CHO) deficiente dfhr eles mostraram que a sCD-4 expressa retém as propriedades estruturais e biolégicas de CD-4 na superfície da célula, liga-se à proteína do envelope de HIV gpllO e pode inibir a ligação de linfócitos CD-4⁺.

Traunecker, et al., Nature 331:84 (1988) revelam a utilização de sCD-4 para inibir a junção do vírus à célula alvo. Os dados apresentados mostram a inibição da infecção por HIV, in vitro , usando uma forma recombinante de sCD-4.

Fisher, et al. , Nature 331:76 (1988) revelam a purificação de sCD-4 a partir de (CHO) e o seu uso como inibidor potente tanto da replicação do vírus como da fusão da célula induzida por vírus.

Hussey, et al. , Nature 331:78 (1988) revelam a utilização do sistema de expressão de baculovírus para produzir sCD-4 que se verificou inibir a fusão da célula induzida por vírus (formação de sincícios) e a infecção por HIV por ligação a células que expressam gpl20. Foi também mostrado que a proteína sCD-4 não parece inibir as interacções da célula?especifica da classe II.

Smith, et al., Science 238:1704 (1987) também revelam a utilização do sistema de células de mamífero CHO para produzir sCD-4. Eles revelam a produção de uma proteina sCD-4 em células de CHO que se pode mostrar que se liga à proteína de envelope de HIV gpl20 e neutraliza a infecciosidade de HIV-1 in vitro. Os dados indicam que sCD-4 pode ser usada como base para o tratamento terapêutico da infecção da SIDA.

No entanto há ainda necessidade de se conseguirem sistemas bacterianos e eucariéticos inferiores para expressão de proteínas sCD-4.

$ « ,-r

798

SKB CASE 14414

-4Sumário do Invento

Este invento reside na verificação de que a função de ligação a HIV da proteína CD-4 pode ser expressa em E, coli e na descoberta de que esta proteína de ligação a HIV pode ser segrega da no meio de fermentação. Em particular, portanto, este invento á um vector de expressão em E. coli compreendendo uma proteína de ligação a HlV operativamente ligada a um elemento regulador.

Este invento reside também na verificação de que a função de ligação a HIV do proteína CD-4 pode ser expressa em Streptomyces e na descoberta de que essa proteína de ligação a HIV pode ser segregada no meio de fermentação. Em particular, portanto, este invento é um vector de expressão em Streptomyces compreendejn do uma proteína de ligação a HIV operativamente ligada a um elemento regulador.

Este invento também reside na verificação de que a função de ligação a HIV da proteína CD-4 pode ser expressa em levedura.

Em particular, portanto, este invento é um vector de expressão em levedura compreendendo uma proteína de ligação a HIV operativamen te ligada a um elemento regulador.

Este invento também reside na verificação de que a sequêri cia de comando OMPA pode ser usada para exportar proteinas heterólogas de B .col i. Em particular, portanto este invento é u.n vector de expressão em F·. coli para expressar proteínas exportadas em E. coli compreendendo uma sequência de codificação de ADN operati vamente ligada a um elemento regulador, em que a sequência de codificação de AON codifica para a proteína X-Y onde X é uma sequêrj cia de comando OMPA e Y é uma proteina heteróloga.

Descrição Detalhada do Invento

De acordo com o presente invento as proteínas de ligação a HIV derivadas do receptor CD-4 são expressas em quantidades úteis para uso como agentes terapêuticos e/ou profiláticos para inibir a infecção inicial por HIV e para inibir a transmissão célula a célula de HIV a seguir à infecção do hospedeiro; para uso em rastreiros de inibidores da ligação HIV-linfócito; para uso como inibidores das funçães de linfócito CD-4⁺; ou para outros usos como descrito abaixo. As proteínas têm todas função de liga ção a HIV de CD-4. Exemplos preferidos dessas proteínas são as

798

SKB CASE 14414

-5proteínas sCD-4 e seus derivados. As proteínas sCD-4 são derivados de CD-4 às quais faltam os domínios de transmembrana e citopls má tico de CD-4. Exemplos de proteínas sCD-4 são descritas em documejg tos distintos por Deen et al., Traunecker et al., Fisher et al., e Hussey et al., em Nature 531:76-88 (1988) e por Smith et al., Science 238:1704 (1987).

A proteina sCO-4 aqui exemplificada, designada por SKBsCD -li ê referida por Deen et al. citado acima,em83. E apresentada na sequência de aminoácidos e nucleótidos seguinte. A sequência mostra uma região 5' não traduzida e uma sequência de comando derivadas do ADNc de CD-4 referido por Maddon et al., Cell 42:93 (1985). 0 primeiro aminoácido de SKBsCD-4 madura, expresso e segregado por células CHO, é a lisina codificada pelos pares de bases 151-153. 0 domínio de transmembrana foi deleccionado, restringindo ADNc de CD-4 com Hpall no par de bases 1252 e ligando aí um ligando que restaurou os pares de bases 1253-1257 e que colocou um codão de paragem de tradução, TAA, após a valina do C-terminal. Como referido por Maddon et a1., os primeiros três aminoácidos da CD-4 madura são glutamina (apresentado aqui como o aminoácido (-)2) - glicina (apresentado aqui como o aminoácido (—)l) - asparagina (apresentado aqui como lisina, aminoácido (+)l). Por outro lado, a sequência apresentada a seguir é a mesma da revelada por Maddon et al..

798

SKB CASE 14414 .z .as.t &-·

-βίο 30 50

CAAGCCCACAGCCCTGCCATTTCTGTGGGCTCAGGTCCCTACTGCTCAGCCCCTTCCTCC

90 110

CTCGGAAAGGCCACAATGAACCGGGGAGTCCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAA

MetAsnArgGlyValProPheArgHisLeuLeuLeuValLeuGln

130 150 170

CTGGCGCTCCTCCCAGCAGCCACTCAGGGAAAGAAAGTGGTGCtGGGCAAAAAAGGGGAT LeuAlaLeuLeuProAlaAlaThrGlnGlyLysLysValValLeuGlyLysLysGlyAsp

-1 +1

190 210 230

ACAGTGGAACTGACCTGTACAGCTTCCCAGAAGAAGAGCATACAATTCCACTGGAAAAAC ThrValGluLeuThrCysThrAlaSerGlnLysLysSerlleClnPheHisTrpLysAsn

250 270 290

TCCAACCAGATAAAGATTCTGGGAAATCAGGGCTCCTTCTTAACTAAAGGTCCATCCAAG SerAsnGlnlleLysIleLeuGlyAsnGlnGlySerPheLeuThrLysGlyProSerLys

310 330 350

CTGAATGATCGCGCTGACTCAAGAAGAAGCCTTTGGGACCAAGGAAACTTCCCCCTGATG LeuAsnAspArgAlaAspSerArgArgSerLeuTrpAspGlnClyAsnPheProLeuIle

370 390 410

ATCAAGAATCTTAAGATAGAAGACTCAGATACTTACATCTGTGAAGTGGAGGACCAGAAG IleLysAsnLeuLysIleGluAspSerAspThrTyrlleCysGluValGluAspGlnLys

430 450 470

GACGAGCTCCAATTGCTAGTCTTCCCATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTTCAG GluGluValGlnLeuLeuValPheGlyLeuThrAlaAsnSerAspThrHisLeuLeuGln

104

490 510 530 gggcagagcctgaccctgaccttggagagcccccctggtagtagcccctcagtgcaatgt

GlyGlnSerLeuThrLeuThrLeuGluSerProProGlySerSerProSerValGlnCys

550 570 590

AGGAGTCCAAGGGCTAAAAACATACAGGGGGGCAAGACCCTCTCCGTGTCTCAGCTGCAG ArgSerProArgGlyLysAsnlleGlnGlyGlyLysThrLeuSerValSerGlnLeuGlu

610 530 650

CTCCAGGATAGTGGCACCTGGACATGCACTGTCTTGCAGAACCAGAAGAAGGTGGAGTTC LeuGlnAspSerGlyThrT rpT hrCysThrValLeuGlnAsnGlnLysLysValGluPhe 151

670 690 710

AAAaTAGACATCGTGGTGCTAGCTTTCCAGAAGGCCTCCAGCATAGTCTATAAGAAAGAG LysIleAspIleValValLeuAlaPheGlnLysAlaSerSerlleValTyrLysLysGlu

183

798

5KB CASE 14414 fe*

-7730 750 770

GGGGAACACGTGCACTTCTCCTTCCCACTCGCCTTTACACTTGAAAACCTGACGCGCACT GlyGluGlnValGluPheSerPheProLeuAlaPheThrUalGluLysLeuThrGlySer

790 810 830

GGCGAGCTGTGGTGGCAGGCGGAGAGGGCTTCCTCCTCCAAGTCTTGGATCACCTTTGAC GlyGluLeuTrpTrpClnAlaGluArgAlaSerSerSerLysSerTrpIleThrPheAsp

850 870 890

CTGAAGAACAAGGAAGTGTCTGTAAAACGGGTTACCCAGGACCCTAAGCTCCAGATGGGC LeuLysAsnLysGluValSerUalLysArgValThrGlnAspProLysLeuGlnMetGly

910 930 950

AAGAACCTCCCGCTCCACCTCACCCTGCCCCAGGCCTTGCCTCACTATGCTGGCTCTGGA LysLysLeuProLeuHisLeuThrLeuProGlnAlaLeuProGlnTyrAlaGlySerGly

970 990 1010

AACCTCACCCTGGCCCTTGAAGCGAAAACAGGAAAGTTGCATCAGGAAGTGAaCCTGGTG AsnLeuThrLeuAlaLeuGluAlaLysThrGlyLysLeuHisGlnGluValAsnLeuVal

1030 1050 1070

CTGATGAGAGCCACTCAGCTCCAGAAAAATTTGACCTGTGAGGTGTGGGCACCCACCTCC ValMetArgAlaThrGlnLeuGlnLysAsnLeuThrCysGluValTrpClyProThrSer

1090 1110 1130

CCTAAGCTGATGCTGAGCTTGAAACTGGAGAACAAGGAGGCAAAGGTCTCGAAGCGGGAG ProLysLeuMetLeuSerLeuLysLeuGluAsnLysGluAlaLysUalSerLysArgGlu

1150 1170 1190

AAGGCGGTGTGGGTGCTGAACCCTGAGGCGGGGATGTGGCAGTGTCTGCTGAgTGACTCG LysAlaValTrpl/alLeuAsnProGluAlaGlyMetTrpGlnCysLeuLeuSerAspSer

1210 1230 1250

GGACAGGTCCTGCTGGAATCCAACATCAAGGTTCTGCCCACATGGTCCACCCCGGtgtaa GlyGlnUalLauLeuGluSerAsnlleLysl/alLeuProThrTrpSerThrProValEnd 351 369

1270 tggcgcctctaga

798

SKB CASE 14414

-8Porções truncadas de sCD-4 e seus derivados, que retenham substancialmente a afinidade de ligação a HIV de sCD-4 podem também ser expressos de acordo com este invento. De entre estas po_r ções truncadas são preferidas proteínas ou polipéptidos compreendendo a região de ligação a HIV das regiões VI e V2 que está compreendida aproximadamente nos aminoácidos 1-182. Em relação à s.e quência apresentada anteriormente, um exemplo particular é a proteína aqui referida por VID4 que tem os aminoácidos (-)2-104 (N-glutamina-glicina-lisina- a -alanina-asparagina-serina-C) fundidos aos aminoácidos 351-369 (-glicina-glutamina-valina a -treon_i na-prolina-valina-C). Um segundo exemplo é a proteína aqui referida por V1V234 que tem aminoácidos (-)2-183 (N-glutamina-glicina-lisina- a -lisina-alanina-serina-C) fundidos aos aminoácidos 351-369. Um terceiro exemplo ê a proteína aqui referida por YV1, que compreende aminoácidos (-)9-151 (N-alanina-1eucina-1eucinaa -leucina-ácido glutômico-1eucina-C). Um quarto exemplo é a pro teína aqui referida por SKBYsCD-4 que tem aminoácidos (-)9-369. Cada uma destas proteínas de ligação a HIV, baseada em, p. bx. ligação a 0KT4A, tem a propriedade de ligação a HIV das proteínas sCD-4, especificamente da SKBsCD-4, e, mais particularmente, tem o domínio de ligação a HIV das regiões VI e V2 das proteínas sCD-4, especificamente de SKBsCD-4.

Em adição a estas proteínas aqui especificamente exemplificadas, um perita na arte pode construir facilmente sequências de codificação de AON para mais derivados de sCD-4. Estes deriva, dos retêm substancialmente a função de ligação a HIV das proteínas sCD-4, i.e. a ligação da proteína à proteína env de HIV, gpl20, não é significativamente afectado adversamente. Por exemplo, pode construir-se um derivado possuindo·apenas a região VI, p.e. aproximadamente os aminoácidos 1-94,ou um derivado possuindo apenas uma porção da região VI de CD-4. Podem também construir-se derivados das proteínas aqui especificamente exemplificadas, tais como derivados diferindo numa ou em poucas delecções, adições ou substituições de aminoácidos.

Alternativamente, pode construir-se uma proteína híbrida, i.e., uma fusão de tradução, entre uma proteína sCD-4 e um veicu68 798

5KB CASE 14414

-Βίο de proteína, outro antigénio ou outras moléculas de sCD-4 para preparar uma molécula poli-sCD-4. Ainda noutra alternativa, o mutante de delecção de sCD-4 pode ser conjugado sinteticamente com uma molécula de veículo.

A afinidade das moléculas sCD-4 com HIV pode ser demonstra da por um ensaio de ligação competitiva usando uma molécula de sCD-4 possuindo uma afinidade conhecida ou usando anticorpos que reconhecem o receptor de CD-4, tal como OKT-4 e 0KT4A. As prote_í nas sCD-4 úteis do invento são precipitadas selectivamente de meio condicionado por 0KT4A como se mostra nos Exemplos, abaixo.

A CD-4, fragmentos e derivados podem ser preparados quimicamente, após expressão ou geneticamente, antes da expressão, por manipula ção da sequência de codificação para o domínio de comando e/ou e>£ tracelular.

A sequência de codificação de ADN para a proteína sCD-4 ou de ligação a HIV daí derivada pode ser obtida, por exemplo, sintetizando o gene usando a sequência de ADN conhecida, por técni cas de clonação Standard baseadas na sequência e por re-isolamento por detecção de proteína i.e. transfecção de clones de ADNc de linhas de células que expressam CD-4 e identificação por anticorpos dirigidos contra a proteína (ver Maddan, et al., supra).

Os clones de ADNc que portam a sequência de codificação da proteína sCD-4 particular podem ser identificados pelo uso de sondas de hibridação de oligonucleótido. As sondas podem ser concebidas com base na sequência particular da proteína. Tendo-se identificado um clone transportando a sequência de codificação de interesse, a sequência de codificação da proteína pode ser excisa^ da pelo uso de endonucleases de restrição e inserida nos vectores de clonação e/ou expressão. Num vector de expressão a sequêji cia de codificação da proteina sCD-4 está operativamente ligada a funçães reguladoras necessárias ou desejáveis para a transcrição, tradução e processamento da sequência de codificação.

Na realização do presente invento em E, coli, uma sequência de codificação de ADN que codifica a proteina de ligação a HIV, p.e., sCD-4 ou seus derivados, é ligada operativamente a um

798

SKB CASE 14414

-10elemento regulador num vector de ADN para transformação de E, coli. Estão disponíveis numerosos vectores de expressão bacteriana gram -negativos compreendendo esses elementos reguladores. 0 elemento regulador compreende um promotor que efectua a ligação e transcri. ção da ARN polimerase. Preferem-se promotores reguláveis, i.e., indutíveis ou desrepressíveis. Está disponível para expressão de polipéptidos heterólogos em E. coli, uma variedade de promotores úteis. Estes incluem o promotor trp e o promotor lambda PL. Ver, p.e., Patente dos E.U. 4 57B 355; Courtney et al., Nature 313:149 (1985). Muito preferivelmente, o elemento regulador compreende uma sequência de comando para transporte da proteína de ligação a HIV para a membrana da célula ou através dela, visto que se verificou, de acordo com este inventa, que a proteína de ligação a HIV pode ser segregada. Um comando que se mostrou que transporta va uma proteína para a membrana exterior de E. coli é o do gene de penicilinase de Bacillus licheniformis. Ver, Sarvas, et al. ,

3. Bacteriol. 155:657 (19B3).

E aqui particular o exemplo do comando do polissacárido A da membrana exterior designado aqui por comando ou sinal OMPA. Ver, Movva, et al. , 3. Molec. Biol. 14 3: 317 (1980). A sequência de c_o dificação de OMPA compreende uma sequência de comando que é útil para segregação da proteína de ligação a HIV no meio de fermentação. Verificou-se agora que o comando OMPA pode ser usado para segregar completamente uma série de proteínas de baixo peso molecular ou polipéptidos nos meios de cultura. Por exemplo, o sinal OMPA tem sido usado para obter exportações de grandes quantidades (p. ex. mais do que 1 a cerca de 10 mg/l) de factor alfa de crescimento transformante humano activo (TGF-alfa), factor de necrose de tumor (TNF) e interleucina-l-beta (lL-1-beta), em adição a SKBsCD-4, V134 e V1V234.

sinal OMPA compreende essencialmente os seguintes 21 aminoácidos: N-met-lys-lys-thr-ala-ile-ala-ile-ala-val-ala-leu-ala-gly-phe-ala-thr-val-ala-gln-ala-C. Uma sequência de codificação de ADN para este comando pode ser sintetizada, preferivelmente de modo que um ou mais locais de restricção sejam colocados adjacentes ao aminoâcido do C-terminal para inserção de uma sequência de

798

5KB CASE 14414

-11codificação de ADN desejada e de modo que um terminador seja colocado a jusante da sequência de codificação desejada. Nos Exemplos, abaixo, apresenta-se uma sequência de codificação, sintética, ilustrativa.

Em adição ao minigene da proteína de ligação a HIV, i.e.

a sequência de codificação ligada operativamente a um elemento re guiador, o vector usado para a transformação contém preferivelme_n te pelo menos um marcador de transformação fenotípica, i.e., um marcador de selecção genética, tal como um gene de resistência a antibiótico, um agente cromogénico ou um gene que complemente uma mutação auxotrófica. 0 vector também compreende regiões necessárias à replicação autónoma.

Construções ilustrativas de vectores de expressão úteis para expressão de proteínas sCD-4 em E. coli são descritos em detalhe nos Exemplos. As proteínas foram expressas no meio e foram aparentemente dobradas adequadamente.

Na realização do presente invento em 5treptomyces, uma s_e quência de codificação de ADN que codifica a proteína de ligação a HIV, p.e., sCD-4 ou seus derivados, é ligada operativamente a um elemento regulador num vector de ADN para transformação de 5 treptomyves. 0 elemento regulador compreende um promotor que fez a ligação e transcrição da ARN polimerase. Preferem-se promotores reguláveis, i.e., indutíveis ou desrepressíveis. Está disponível para expressão de polipéptidos heterólogos em 5 treptomyces uma variedade de promotores úteis. Exemplos incluem o promotor indutível por galactose do operão qalactosq^/C3%reptomyces (Fornu/ald, et al. , Proc. Natl. Acad. Sei, USA 84:2130 (1987)), o promotor constitutivo do gene de ^-galactosidase de S_. lividans (Eckhardt, et al. 3. Bacteriol, 169:4249 (1987); Braiuner, et al. , Patente E.U. 4 717 666) e do gene inibidor da tripsina de 5. lonqisporus (Pedido de Patente Europeia N9. 87 307 260.7), ou um promotor regulado temporalmente tal como o referido em _M. echinosporsa (Baum, et al♦, 3. Bacteriol. 170:71 (1988)). As regiões para a terminação de transcrição em Streptomyces são derivadas da extremidade 3' de vários genes de Streptomyces por exemplo o sinal de terminação da extremidade do operão de galactose de Streptomyces ou o encontrado na extremidade do gene da neomicina fosfotransferase de S.

798

SKB CASE 14414

-12fra diae (Thompson e Gray, Proc. Natl. Acad. Sei USA 80:3190 (1983)). As sequências para a exrortaçSo de proteína en S tre p to n y ces incluem isoladas do gene de /3-galactosidase de S, 1ividans, do gene LEP-10 de 5, 1ivi dans (Pedido de Patente Europeia NS. 87 307 260.7) e do gene inibidor da tripsina de S. lonqisporus.

gene de sCO-4 é incorporado numa molécula de AON maior que compreende um sistema marcador de selecção genética. 0 sistjj ma marcador de selecção pode ser qualquer um de vários sistemas marcadores conhecidos em que o gene marcador confere um novo fenjq tipo seleccionável à célula transformada. Os exemplos incluem os genes de resistência a droga de S treptomyces tal como metilase r_i bossómica resistente a tioestrepton (Thompson, et al., Gene 20:51 (1982)), fosfotransferase neomicina (Thompson, et al♦, supra) e metilase ribossómica resistente a ertromicina (Thompson, et al., supra). A molécula de AON pode também conter uma sequência para replicação autónoma em Streptomyces, tal como os derivados de pIJTOl (Keiser, et al. , Mol. Gen, Genet. 185:22 3 (1982)) ou um vector deriva do de SLPl (Bibb, et al. , Mol. Gen. Genet. 184:230 (1981)). A molécula de AON também pode conter um marcador que permite amplificação do gene. Estes marcadores que servem para amplificar o número de cópias de gene em Streptomyces incluem o gene para resistência a espectinomicina (Hornemann, et al., 3. Bacteriol. 169:

:2360 (1987)) e arginina auxotrófica (Altenbuchner, et al., Mol.

Gen. Genet. 195:134 (1984)).

Para os estudos iniciais de expressão, a sequência de codificação de CD-4, mais completamente descrita nos Exemplos abaixa, foi fundida à sequência de sinal y^gal numa posição localizada 8 aminoácidos a jusante do sítio de clivagem do péptido de sinal ^Jgal. As funções de replicação em Streptomyces para este vector de expressão foram proporcionadas pelo plasmideo pI3702 (Katz, et al. , 3. Gen. Microbiol» 129:2703 (1983)), que é um deri^ vado de pI3l0l (Keiser, et al., Mol. Gen. Genet. 185:223 (1982)).

A estirpe hospedeira usada foi S. lividans 1326 do tipo selvagem (Bibb, et al., Mol, Gen. Genet. 184:230 (1981)). A proteína de fusão ^i,gal-sCD-4 foi detectada tanto no sobrenadante da cultura como em células intactas. Outra série de experiências mostrou

798

SKB CASE 14414

Xi-13que o promotor LTI podia ser usado para obter uma expressão mais eficiente das proteínas sCD-4.

tação da proteína ser facilitada pelo péptido de sinal LTI. As sequências de codificação para várias proteínas de ligação a HIV têm sido clonadas no vector LTI incluindo ^^^2^4 ^e ^1^4* ^se~ quências de codificação para todas estas proteínas foram inseridas numa posição localizada B aminoácidos a jusante do sitio de clivagem do péptido de sinal LTI, Tal como as fusões ^,gal, as proteínas sCD-4 podem ser transportadas no sobrenadante da cultura via péptido de sinal LTI. As funções de replicação em 5 trep tomyces foram de novo proporcionadas pelos derivados de pIJlOl: pIJ7D2 e pIJ351 (Keiser, et al., supra).

ma de expressão/foi inicialmente examinada em S. lividans 1326. Tanto SKBsCD-4 como V^V₂J4 estavam igualmente distribuídos entre o sobrenadante da cultura e as células intactas. Embora estas proteínas sejam incompletamente exportadas, as formas intra- e ex. tracelular parecem ter o mesmo peso molecular quando avaliado pelas suas mobilidades em geles SDS-poliacrilamida. Não está claro se o péptido de sinal é removido proteoliticamente da forma intra. celular. Os níveis máximos de SKBsCD-4 foram estimados em 30 mg/l no sobrenadante da cultura e nas células intactas. Os níveis de V^V₂04 foram estimados em pelo menos 30 mg/l (sobrenadante da cul. tura e células intactas).

Um problema encontrado para a expressão de sCD-4 em 5.

lividans é a sua susceptibilidade a actividades da protease. Este problema pode ser eliminado au pelo menos significativamente diminuído por expressão de sCD-4 em outras espécies de Streptomyces♦ A proteína sCD-4 pode ser expressa, por exemplo, em S.

f . n coelicolor, 5. Lonqisporus e S, albus. E esperado que a estabilidade da molécula melhorará usando estes hospedeiros alternativos. A expressão de proteínas sT4 em 5. lonqisporus pode ser van tajosa uma vez que este hospedeiro segrega comparativamente menos proteínas no sobrenadante da cultura o que auxilia no processo de purificação.

798

5Κ8 CASE 14414 ,-7

-14Na realização do presente invento em levedura, uma sequên cia de codificação de AD(\J que codifica a proteína de ligação a HIV, p. ex., sCD-4 ou seus derivados, ê operativamente ligada a um elemento regulador num vector de AON para transformação da levedura. Pode-se usar qualquer hospedeiro levedura para o qual es. tejam disponíveis sistemas de transformação, clonação e expressão Exemplos particulares incluem leveduras dos gêneros Hansenula, Pichia, Kluveromyces, Schizosaccharomyces, Candida e Saccharomyces. 0 hospedeiro levedura preferido ê Saccharomycas cerevisiae.

elemento regulador compreende um promotor que efectua a ligação e transcrição da ARN polimerase. Preferem-se promotores reguláveis, i.e., indutíveis ou desrepressores. ^stá disponível para expressão de polipêptidos heterólogos em levedura, uma variedade de promotores úteis. Estes incjjje^m o promotor do gene da metalotioneína indutivel por cobre/e o promotor constitutivo dos genes glicolíticos gliceraldeido-3 fosfato desidrogenase (TDH3) e álcool desidrogenase (ADH). As regiões para terminação transcricional em levedura são derivadas da extremidade 3' de qualquer dos vários genes de levedura por exemplo o gene para iso -1-citocromo C (CYCl).

gene de sCD-4 é incorporado numa molécula de ADN maior que compreende um sistema marcador de selecção genética. 0 siste. ma marcador de selecção pode ser qualquer um de vários sistemas marcadores conhecidos, em que o gene marcador confere um novo fenotipo seleccionável à célula transformada. Os exemplos incluem genes de levedura para enzimas biossintéticas tais como fosforribosil antranilato isomerase (TRPl) ou orotidina-5·-fosfato desca£ boxilase (URA3) ou genes de resistência a drogas heterólogos tal como resistência a G418 ou resistência a benomil (BENl). A molécula de ADN também pode conter uma sequência para replicação autó noma em levedura, tal como a região de levedura 2-micron-circulo ori ou uma região de replicação autónoma cromossómica (ARS) tal como AR51 e um centromero de levedura (CEN), tal como CEN3, para permitir a replicação autónoma do plasmídeo.

No sistema de expressão preferido, a sequência de codifi-

798

SKB CASE 14414 »V

-15cação da proteina de ligação a HIV ê fundida a uma sequência de codificação que estabiliza a expressão visto que se descobriu que a SKBsCD-4 sozinha expressa muito pouco; esta expressão fraca p_o de ser devida a transcrição e tradução ineficaz ou à rápida degra dação da proteína. Em qualquer caso, foi demonstrado que o prodçj to de uma fusão de gene, na qual a sequência de codificação de uma ubiquitina é fundida 5' à sequência de codificação de SKBsCD-4 é expressa a níveis reiativamente elevados e ê clivada para produzir ubiquitina e o produto de gene sCD-4.

Uma sequência de ADN de ubiquitina pode ser isolada a pa_r tir de levedura ou de outras células eucarióticas, incluindo cél_u las de mamífero, por técnicas de clonação de gene Standard. Alternativamente, pode ser sintetizada por técnicas conhecidas Standard. A sequência de nucleótidos do gene de ubiquitina modular usada para ilustrar o presente invento é a descrita por Ecker et al., 3. Biol. Chem. 262:3524 (1987). A sequência é essencialmente como se segue:

AATTCATTATGCACATCTTCCTCAAGACCTTAACCGGTAAAACCATAACTCTAGA

AGTTGAATCTTCCGATACCATCGACAACGTTAAGTCGAAAATTCAAGACAAGGAA

GGCATTCCACCTGATCAACAAAGATTGATCTTTGCCGGTAAGCAGCTCGAGGACG

GTAGAACGCTGTCTGATTACAACATTCAGAAGGAGTCGACCTTACATCTTGTCTT

AAGACTAAGAGGTGGTTGAGGTAC

Inserindo uma sequência de AON para um péptido de sinal na extremidade 5' da sequência da proteína de ligação a HIV pode conseguir-se a secreção da proteína no meio de cultura. As sequências de sinal úteis para este fim são, por exemplo, as do fa£ tor de emparelhamento de levedura, factor alfa (Kurjan e Herskou/itz, Gell 30:933 (1982). Em adição, pode obter-se a expressão por integração do módulo de expressão em levedura de sCD-4 no cromossoma da levedura, seguida por amplificação usando marcadores tais como o gene DHFR de levedura para seleccionar o número de cópia aumentado.

Em geral, as proteínas sCD-4 do invento podem ser purificadas a partir dos meios de cultura esgotados usando várias técni cas de purificação de proteína, por exemplo cromatografia de afi68 798

SKB CASE 14414

ife

-16nidade; cromatografia de permuta iónica, cromatografia de exclusão por tamanhos, cromatografia hidrofóbica ou cromatografia de fase inversa.

A sCD-4, os seus fragmentos e derivados podem ser purificados por cromatografia de afinidade usando adsorventes gerais es. pecíficos de grupo, por exemplo ligandos de afinidade por corantes ou de ligação de hidratos de carbono» ou usando ligandos que se ligam especificamente a sCO-4, por exemplo, anticorpo monoclonal ou proteína gpl20 de HIU ou suas porçSes.

A purificação compreende, após crescimento das células num meio de crescimento selectivo a uma temperatura de cerca de 28 - cerca de 459C: a clarificação do meio de fermentação e depois a separação da proteína de ligação a HIU de outras proteínas presentes no meio. No processo preferido as proteínas sCD-4 são purificadas a partir do meio de cultura usando uma série de passos cromatográficos que são baseados nas propriedades físicas da molé. cuia de sCD-4.

Um processo alternativo de purificação das proteínas sCD-4 envolve o uso de anticorpos monoclonais dirigidos contra sCD-4. A proteína pode ser purificada num passo por passagens de meios de cultura clarificados através de um suporte de gel de afinidade ao qual fica ligado o anticorpo monoclonal dirigido contra a proteína. A proteína de interesse ligar-se-á à coluna no local de ligação do anticorpo enquanto que as proteínas contaminantes passam através da coluna. A proteína é então eluída da coluna sob condições que evitem a inactivação.

A caracterização das propriedades biológicas e imunológicas in vitro das proteínas sCD-4 indica que as proteínas têm valor na prevenção e tratamento da SIDA. Os estudos indicaram que as proteínas sCD-4 actuam como inibidor da disseminação extraceljj lar e céluia a célula do vírus. Uma vez que a sCD-4, seus fragmejn tos e derivados descritos neste invento mostraram bloquear a 1iqa ção do vírus a células alvo CD-4⁺ em cultura, crê-se que a administração destas proteínas a pessoas infectadas actuaria de modo a inibir a disseminação extracelular do vírus. Portanto, as pro68 798

SKS CASE 14414

-17teínas sCD-4 têm valor como agente tanto profilático como terapêu. tico para o tratamento da SIDA ou do complexo relacionado com a SIDA (ARC).

Como agente profilático, as proteínas sCD-4 são administra das a indivíduos de alto risco relativamente à doença ou a indiv_í duos que apresentam exposição a HIV pela presença de anticorpos para o vírus. A administração de uma quantidade eficaz da proteí. na numa etapa precoce da doença ou antes do seu início actua de modo a inibir a infecção dos linfócitos CD-4⁺ por HIV. Como age,n te terapêutico a administração de sCD-4 a pessoas infectadas com HIV actua de modo a inibir a disseminação extracelular do vírus.

A fusão entre células infectadas por HIV e outros linfócitos CD-4⁺ também parece ser uma vis da disseminação do vírus. Além disso, a fusão pode ser responsável, em parte, pelo enfraqu_e cimento da função do linfócito CD-4⁺ e em última análise pela depleção de linfócitos CD-4⁺ em indivíduos infectados. A fusão das células é dependente tanto dos produtos de gene de envelope virai como do receptor de CD-4 e pode ser inibida pelo 0KT-4A ou por ari ticorpos monoclonais similares (Mabs) (Sattentau, et al. , Science 234:1120 (1986). As proteínas sCD-4 aqui descritas interferem com a fusão das células e portanto diminuem a disseminação célula a célula do vírus e a perda da função de linfócito CD-4⁺.

receptor de CD-4 é monomórfico e assim crê-se que as proteínas sCD-4 são um inibidor universal do vírus que reconhece o domínio de superfície do receptor de CD-4, incluindo todo o HIV.

As proteínas sCD-4 podem ser usadas em combinação com outros agentes, por exemplo, em associação com agentes dirigidos contra outras proteínas de HIV, tal como a transcriptase inversa, protease ou tat. Um agente terapêutico eficaz contra HIV deverá prevenir a transmissão da infecção, mediada por vírus e célula a célula. As proteínas sCD-4 também podem ser usadas em combinação com outros agentes anti-virais, por exemplo, azidotimidina (AZT).

As proteínas sCD-4 deste invento também têm utilidade como inibidores da função da célula CD-4⁺ por se ligarem a moléculas alvo extracelulares que normalmente interactuam com o domínio

798

5KB CASE 14414 //

-18de superfície do receptor de CD-4. Numerosos estudos sugerem um papel crucial para o receptor de CD-4 na imunotolerância, particularmente na patogênese e progressão de doenças auto-imunes e na rejeição de enxertos especifica de hospedeiro.

Como agente profilático ou terapêutico, as proteínas sCD-4 são administradas parentericamente, de preferência intravenosamen te. 0 agente pode ser administrado por infusão ou por injecção, p. ex., diariamente, semanalmente ou mensalmente. A quantidade e taxa de administração é seleccionada de modo a manter uma quantidade eficaz de proteína sCD-4 em circulação. Um modo alternativo de administração seria extracorporal, empregando proteínas sCD-4 como agentes de diálise.

A proteína sCD-4 deste invento também pode ser usada como reagente para identificar moléculas naturais, sintéticas ou recom binantes que actuam como agentes terapêuticos ou inibidores de i_n teracçães de células CD-4⁺.

Por exemplo, as proteínas sCD-4 podem ser usadas em ensa_i os de rastreio, tal como ensaios para interacção de proteína medi, dos por metodologias baseadas em ELISA, para proporcionar um reagente solúvel em água, bioquimicamente puro que pode ser usado em combinação com outros reagentes para determinar competidores das interacçães do domínio de superfície do receptor de CD-4. Por exemplo, uma vez que as proteínas sCD-4 se ligam à proteína env de HIV ou a misturas contendo proteínas env de HIV, as proteínas podem ser usadas para rastrear inibidores da ligação de vírus.

Com base em resultados in vitro que mostram que as protejt nas sCD-4 se ligam a células que expressam proteínas env de HIV, estas proteínas também podem servir como moléculas de alvejamento selectivo para células infectadas por HIV in vivo. As proteínas sCD-4 como proteína veículo, específica, alvo, podem servir, por exemplo, como a proteína veículo de distribuição de agentes citotóxicos às células infectadas.

Em adição, com base em resultados que mostram que o receptor de CD-4 se associa especificamente a antigénios de MHC da classe II em células que apresentam antigénios como sugerido peΛ

Λ'

798

SK9 CASE 14414

-19la restrição de classe de células CD-4⁺, as proteínas sCD-4 podem ser usadas em combinação com antigênios da classe II para testar relativamente a inibidores das interacçães linfócito CD-4 - célula alvo. Em adição a estes exemplos, que são baseados em ensaios de ligação directa entre a proteína e as suas moléculas alvo, podem conceber-se ensaios mais complexos que assentam nas respostas bioquímicas do reconhecimento da proteína. Os mutantes de delecção podem ser usados em ensaios de diagnóstico para a detecção de proteínas CD-4 ou das moléculas com que eles interactuam. Por exemplo, a quantificação das células CD-4 e CD-4⁺ e dos anticorpos para CD-4 teria valor para diagnóstico de SIDA.

Em adição, as proteínas sCD-4 podem ser usadas para gerar novos reagentes de diagnóstico, por exemplo, Mabs ou outros tipos de moléculas para uso em ensaios imunológicos Standard, i.e., ELJ. SA, imunoensaios de captura, radio-imunoensaios. Uma vez que a sCD-4 apresenta o epitopo OKT-4, ο 0KT-4A e a maioria, se não a totalidade dos outros epitopos de superfície do receptor de CD-4, as proteínas são especial mente úteis em ensaios de imunodiagnós ti^ co para a quantificação absoluta dos níveis de CD-4 num sistema.

receptor de CD-4 reside em três ambientes químicos diversos: o oxidánte, superfície hidrofilica da célula; a membrana hidrofóbica; e o citoplasma hidrofílico redutor. Estes ambientes diversos evitariam muito provavelmente o isolamento do receptor no seu estado completamente nativa. As proteínas sCD-4 consistem em apenas segmentos seleccionados do domínio extracelular, são segregadas como proteínas solúveis no sobrenadante da cê lula e a sua conformação parece imitar numa extensão significativa a superfície do domínio de superfície do receptor. Assim, as proteínas sCD-4 são adequadas para análise estrutural detalhada, em particular para cristalografia de raios X. A determinação da estrutura tridimensional das proteínas sCD-4 sozinhas ou numa fo_r ma complexada com outras moléculas interactivas poderia proporei^ nar a base para a concepção racional de antagonista e agonistas selectivos para sCD-4.

798

SKB CASE 14414

-20Exemplos

Os exemplos que se seguem são ilustrativos e não limitantes do inventa. As enzimas usadas nas manipulaçães genéticas foram obtidas de fontes comerciais e foram usadas substancialmente de acordo com as instruçães do vendedor. Excepto quando for ind_i cado em contrário, os procedimentos foram realizados substancialmente como descrito por Maniatis, et al., Molecular Cloninq, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

Exemplo 1: Construção de vectores de expressão em E. coli

Usando manipulaçães de AON recombinante, a sequência de codificação para a SKBsCD-4 de comprimento total e os mutantes de delecção V1V204 ou V104, seguidos por um códão de terminação TAA em estrutura (ver sequência acima) foram colocados a jusante da sequência de sinal OMPA num vector de expressão em E. coli para criar plasmideos DMPAST4BBV1, OMPAV1V2 e 0MPAV1. A construção destes vectores é como se segue:

Construção do plasmideo 3RT4: para criar o plasmideo JRT4 o plas^ mídeo DSP1 (Pfarr, et al. , DNA 4.:461 (1985)) foi cortado com Xhol, a região anterior polyA de SV40 foi deleccionada e os locais Xhol foram preenchidos usando fragmento Klenouj de AON poli me rase. A região de poliadenilação da hormona de crescimento bovi. na (BGH) (Pfarr, et a 1. , DNA 5.:115 (1986)) Foi cortada com PvuII e Kpnl e o local Kpnl foi tornado rombo por tratamento com ADN pg limerase de T4. Este fragmento de 230 pb foi ligado a DSPl para criar DSPlBGH.

DSPlBGH foi cortado com Smal e Sall e a cassete galK (con sistindo no promotor anterior de SV40, na região de codificação de galK e na região polyA de BGH) foi ligada em pUCl9 (Yanisch-Peg ron, et al., Gene 33:103 (1985)) no local Sall usando um ligante sintético consistindo de uma extremidade Sall, um local BglII e uma extremidade Smal. Está ligação de três partes resultou no plasmideo DSPlBZBGH.0T.

DSP1BZBGH.3T, que foi cortado com StuI e Bell para deleccionar a região de codificação de galK, foi ligado a um fragmen. to de EcoRl (preenchido)-BamHI de 1,7 kb, contendo o ADNc de CD-4

798

SKB CASE 14414

-21do plasmídeo pT4B (maddon, et al., Cell 42:93 (1985) para criar o plasmídeo BRT4.

Construção do plasmídeo pUCsT4: para criar o plasmídeo pUCsT4, um fragmento HaelI e Hpall (1125 pb) do ADNc de CD-4 do pias mideo pT4b foi ligado, através do uso de ligantes sintéticos, ao vector pUClB que tinha sido cortada com Kpnl e Xbal. A extremidade HaelI do ADNc de CD-4 foi ligada ao local Kpnl de pUC18 usando um liga_n te sintético com uma extremidade Kpnl e uma extremidade HaelI. A extremidade HaelI do ADNc de CD-4 foi ligada ao local Xbal de pUC18 usando um ligante sintético com uma extremidade Hpall e uma extremidade Xbal. Este ligante também inseriu um codão de paragem TAA após o nucleótido 1257 da região de codificação de CD-4.

D plasmídeo resultante era o pL)CsT4.

Construção de pST4sal: para criar o plasmídeo pST4 sal, o plasm_í deo DRT4 foi cortado com BglII e Saci e foi isolado um fragmento de 959 pb (consistindo no promotor anterior de Sl/40 e nos primeiros 602 nucleótidos do ADNc de CD-4). 0 plasmídeo pl)CsT4 foi cor tado com SaCI e Xbal e isolou-se um fragmento de 660 pb (consistindo no ADNc de CD-4 desde o nucleótido 603 a 1257 seguido pelo códão TAA do,ligante sintético). Estes dois fragmentos foram ligados em DSPlBZBGliOT que tinha sido cortado com BglII e Xbal para deleccionar o promotor anterior de SU40 e a regido de codificação de CD-4 a todo o comprimento. 0 plasmídeo resultante era o pST4sal.

Construção de p5T4DHFR; para criar o plasmídeo pST4DHFR, um fragmento BglII-BamHI contendo uma cassete de expressão (3~9l°bi^na DHFR foi ligada no local BamHI de pST4sal. A cassete de expressão de ^3-globina DHFR consiste em: o promotor de (7-globina do rat_i nho (fragmento HincII de 550 pb do plasmídeo pPK288 (Berg, et al. , Mol. Cell, Biol. .3:1246 (1983)) modificado na sua extremidade 5' com um ligante sintético para conter um local BglII; a região de codificação de DHFR de ratinho (fragmento HindIII (preenchido) de 735 pb do plasmídeo pSV2-DHFR (Subramani, et al,, Mol. Cell, Biol. 1.:854 (1981)) ; a região anterior polyA de SV40 Nhel (preenchido)-BamHI (preenchido) de DSP1 (Pfarr, et al., DNA 4:461 (1985)); e a região terminadora de DHFR de ratinho (fragmento HindIII (pre68 798

SKB CASE 14414

-22enchido) de 907 pb de plasmideo mDH9 (Frayne, et al. , Mol. Cell. Biol. 4.:2921 (1984)), modificada na sua extremidade 3' com um ligante sintético para criar um local BamHI.

Construção de psT4BBVlDHFR: para criar o plasmideo psT4BBVlDHFR, o plasmideo pST4DHFR foi cortado com EcoRI e Xbal e o fragmento mais pequeno contendo a região de codificação de sCD-4 foi deleccionado. 0 plasmideo sT4sal foi cortado com Xbal e Bbvl e isolojj -se um fragmento de codificação de 1120 pares de bases contendo a sequência para o CD-4 solúvel menos a região de comando. Este fragmento foi ligado ao pST4DHFR cortado com EcoRl/Xbal, usando um ligante sintético com uma extremidade EcoRI, um local Kpnl e uma extremidade Bbvl. Este fragmento é compatível com a saliência Bbvl no fragmento sCD-4 isolado acima, 0 plasmideo resultante foi denominado pST4BBVlDHFR.

Construção de 0MPAST4: para criar o plasmideo 0MPAST4, o plasmídeo OMPA.GS foi digerido com Ncol e Sall e o fragmento mais peque no contendo a região ligante foi deleccionada. 0 OMPA.GS é um d_e rivado de pASl (Rosenberg et al., Meth, Enzymol. 101:123 (1983); Patente dos E.U. 4 578 355) possuindo uma sequência sintética inserida no local Ndel na extremidade 3’ da sequência de ligação do ribossoma cll. A sequência sintética compreende o comando OMPA seguido por uma sequência muitiligante. A sequência sintética foi substancial mente a que se segue:

¹-T ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT

GGT TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC GGC TCT AGA GTC GAC CTA

GTT AAC TAG-3* plasmideo pUCsT4 foi cortado com Ncol e Sall e isolou-se o fragmento de 1149 pares de bases contendo a sequência de sCD-4 (nucleótidos de CD-4 124-1257). Este fragmento foi ligado ao OMPA.GS cortado com Ncol/Sall para criar 0MPAST4.

Construção de 0MPAST4Bbvl: para criar o plasmideo 0MPAST4BbvI, o plasmideo 0MPAST4 foi cortado com Nael e Xbal. 0 fragmento mais pequeno resultante deste corte, contendo a região de codificação de sCD-4, foi deleccionado. 0 plasmideo ST48BV1DHFR foi cortado com Kpnl e a saliência 3' resultante foi terminada de modo rombo

798

SKB CASE 14414

-23com AON polimerase de T4. 0 ADN terminado de modo rombo foi então cortado com Xbal e o fragmento de 1124 pares de bases contendo os nucleótidos 145-1257 do ADNc de CD4 foi isolado. 0 fragmento is_o lado foi ligado ao plasmideo 0MPAST4 cortado com Nael/Xbal para criar o plasmideo 0MPAST4BbVl.

Construção de pucST4184: .para criar o plasmideo puc5T4184, um fragmento EcoRI-Nhel do ADNc de CD-4 /um fragmento de 682 pb codificando os aminoácidos (-25) a (+176)_/ foi ligado ao ligante sintético sk727/725 (extremidades Nhel e Aval) no local Nhel. 0 sk727/725 codifica para os aminoácidos de CD-4 177-183). A extre midade Aval de sk727/725 foi ligada a um fragmento Aval-Xba 1 de pucST4 (compreendendo os pb 1198-1257 do ADNc humano e codificando os aminoácidos 351-369 do receptor de CD-4 seguidos por um códão de terminação TAA). Esta sequência que é flanqueada por extremidades EcoRI e Xbal, foi inserida em pUCl9 nas extremidades EcoRI e Xba 1 no poliligante pUC19 (sk727/725). 0 sk727/725 é substancialmente como se segue:

5' ctagctttccagaaggcc 3’

3' gaaaggtcttccggagcc 5'

Construção de puc5T4106: para criar o plasmideo pucST4106, um fragmento EcoRI-Ava II (compreendendo 1-413 pb, e codificando os aminoácidos (-)25 a 87) do ADNc de CD-4 foi ligado ao ligante sintético sk79l/792 ( extremidades Avall-Aval) no local Avall. 0 sk791-792 codifica para os aminoácidos de CD-4 88-104. A extremi dade Aval de sk79l/792 foi ligada a um fragmento Aval-Xbal de pucST4 (compreendendo 1198-1257 pb do ADNc humano e codificando os aminoácidos 351-369 do receptor de CD-4 seguido pelo códão de terminação TAA). Esta sequência que é flanqueada por extremidades EcoRI e Xbal foi inserida em pUC19 nas extremidades EcoRI e Xbal no poliligante pUCl9. 0 sk79l/792 é substancialmente como se segue:

’ gaccagaaggaggaggtgcaattgctagtgttcggattgactgccaac gtcttcctcctccacgttaacgatcacaagcctaactgacggttgagc 5'

Construção de sT4184.DHFR: para criar o plasmideo sT4184.DHFR, um fragmento EcoRI-Xbal de pucST4184 (codificando os aminoácidos

798

SKB CASE 14414

-24-25 a 183 fundidos a 351 a 369) foi ligada às extremidades EcoRI e Xbal de psT4.DHFR em lugar do fragmento EcoRI-Xbal codificando SKBsCD-4.

Construção de sT4106.DHFR: para criar o plasmideo sT4106.DHFR um fragmento EcoRI-Xbal de pucST4106 (codificando os aminoácidos -25 a 104 Fundidos a 351 a 369) foi ligado às extremidades EcoRI e Xbal de psT4.DHFR em lugar do fragmento EcoRI-Xbal codificando SKBsCD-4.

Construção de 0MPAV1; para criar 0MPAV1, o plasmideo 0i^vlPAST4BbvI foi cortado com AflII e Xbal e o fragmento mais pequeno contendo os nucleótidos 371-1257 da região de codificação do ADNc de CO-4 foi deleccionado. 0 plasmideo pst4106.DHFR foi cortado com AF1II e Xbal e isolou-se um fragmento de 160 pares de bases contendo os nucleótidos 371-459, 1198-1257 da sequência de ADNc de CD-4. Os dois fragmentos foram ligados para criar o plasmideo 0MPAV1.

Construção de 0MPAV1V2: para criar 0MPAV1V2, o plasmideo 0MPAST4Bbvl foi cortado com Saci e Xbal e o Fragmento mais pequebo contendo os nucleótidos 603-1257 da sequência de ADNc de CD-4 Foi d_e leccionado. 0 plasmideo ST4184.DHFR Foi cortado com Saci e Xbal e isolou-se um Fragmento de 164 pares de bases contenda os nucle_ó tidos 603-696, 1198-1257 da sequência de ADNc de CD-4. Os dois Fragmentos Foram ligadas para criar o plasmideo 0MPAU1V2.

Exemplo 2: Expressão de proteínas sCD-4 em E, coli

As construções 0MPAV1 e 0MPAV1V2 Foram transFormadas em lisogênios lambda de E. coli, AR58 (cI857) e AR120 usando procedimentos Standard. As induções por calor (Rosenberg, et al.,

Meth. Enzymol. 101:123 (1983)) ou induções por ácido naladixico (Mott, et al·., Proc, Natl. Acad. Sei. USA 82:88 (1985)) Foram rea lizadas como descrito abaixo.

Indução por calor: para a linha de células AR58, 200 ml de LB (contendo 50 ^g/ml de ampicilina) Foram semeados com 7 ml de uma cultura noctura (N.O.) de 10 ml de células AR58 contendo o plasmí deo 0MPAST4Bvl, 0MPAV1 ou 0MPAV1V2 e cultivados numa incubadora com agitação a 329C. A uma densidade óptica a 650 nm (0.D.._cn) □ PU de 0,8 unidades de absorvância, 200 ml de LB, aquecidos a 552C,

799

SKB CASE 14414

-25foi adicionado à cultura e o balão foi transferido para uma incubadora com agitação a 429C. Tomaram-se amostras de um ml da cultura 30, 60 e 90 minutos após a alteração da temperatura para aná lise. Aos 90 minutos, as células foram arrefecidas durante 15 mi. nutos em água gelada, e em seguida pelotizadas a 3500 rpm durante 15 minutos a 4SC numa centrífuga 0-6 Beckman (Beckman Instruments, Fullerton, Califórnia). As pelotas de células foram armazenadas congeladas a -20SC até ao processamento. 0s meios de condicionamento foram armazenados congelados a -2090 até ao processamento.

Indução com Acido Nalidíxico: para a linha de células AR120, 400 ml de LB (contendo 50 de ampicilina) foram semeados com 13 ml de uma cultura N.0. de 20 ml de células AR120 contendo o plasmideo 0MPAST4Bbvl, 0MPAV1 ou 0MPAV1V2 e cultivados numa incubadora com agitação a 3790. A um O.D.^^g de 0,4, adicionaram-se à cultura 400 ^ul de ácido nalidíxico (50 mg/ml). A cultura foi mari tida a 379C numa incubadora com agitação e tomaram-se amostras de *

ml, 1, 3 e 5 horas após a adição do ácido nalidíxico. A 59. h£ ra, as células foram arrefecidas durante 15 minutos em água gelada e em seguida pelotizadas a 3500 rpm durante 15 minutos a 490 numa centrífuga 0-6 Beckman. As pelotas de células foram armazenadas congeladas a -2090 até ao processamento. 0s meios condici^ nados foram armazenados congelados a -2090 até ao processamento.

A seguir à indução, as células foram pelotizadas a partir das amostras de 1 ml e analisadas relativamente à expressão das proteínas sT4 de comprimento total e mutante (SKBsCD-4, V104 e V1U204) por Western blot, usando um anticorpo policlonal de coje lho para uma forma desnaturada de T4 solúvel produzida em bactér_i as. Detectaram-se proteínas com os tamanhos apropriados, em lis_a dos de células tanto em amostras induzidas por calor como por áci. do nalidíxico. Os níveis detectados representam 1-5% da proteina total.

Processamento de Meios Condicionados: os meios condicionados con gelados foram descongelados à temperatura ambiente e tomaram-se alíquotas de 30 ml e centrifugaram-se a 49C durante 1 hora a 24 000 rpm num rotor de cuba oscilante Beckman SW28. A seguir à centrifugação, os sóbrenadantes foram reunidos e concentrados 1068 798

SKB CASE 14414

J.L·.

-26-20 vezes a 42C por filtração por pressão em membrana.

Os meios concentrados foram ensaiados em relação às proteínas SKBsCD-4, V104 ou V1V204 de comprimento total por análise Western blot (como acima). ELISA de competição e imunoprecipita ção.

Em cada amostra, detectou-se proteína de tamanho apropri_a do nos meios condicionados concentrados por Western blot a níveis representando 1-5% (0,1-0,5 ng/ml de meios condicionados não concentrados) os detectados no interior da célula. Todas as 3 proteínas ligam 0KT4A no ensaio ELISA de competição. As proteínas V104 e V1V204 foram ainda ensaiadas por imunoprecipitação com um painel de anticorpos monoclonais de CD-4 (Ortho, Raritan, Neuj Oersey). A proteína expressa por 0MPAV1, 1/104, foi imunoprecipitada por 0KT4A e por 0KT4D mas não por 0KT4, 0KT4B, 0KT4C, 0KT4E ou 0KT4F. A proteína expressa por 0MPAV1V2, V1V204, foi imunopre cipitada por todos os anticorpos monoclonais excepto por 0KT4. Em adição, a afinidade desta proteína por 0KT4C foi mais baixa do que para os outros anticorpos monoclonais.

Processamento de Pelotas de Células: as pelotas de células do ponto dos 90 minutos de indução por calor 0MPAST4Bbvl/AR58, foi descongelada em gelo e ressuspensa em tampão (Tris-HCl 100 mM, pH 8, EDTA 0,5 mM e sacarose 0,5 M) a 49C numa razão de pelota p_a ra tampão de 100 O.D.^jg/ml. A lisozima (10 mg/ml em Tris-HCl 0,05 Μ, ρΗ B) foi adicionada até uma concentração final de 0,2 mg/ /ml e a suspensão foi incubada em gelo durante 15 minutos. Um volume igual de água gelada foi adicionado e a suspensão foi incuba da em gelo durante 15 minutos. Adicionou-se PMSE (50 mM) até uma concentração final de 1 mM, seguido pela adição de MgClg (l M) até uma concentração final de 2 mM. A suspensão de células foi passada através de uma agulha de calibre 18, 3 vezes para reduzir a viscosidade e depois centrifugada a 20 000 χ g durante 10 minutos a 45C.

A seguir à centrifugação a pelota foi ressuspensa em Tris-HC1 20 mM, pH 8, EDTA 5 mM, /3ME 5 mM, num volume equivalente ao anterior à centrifugação. A suspensão foi submetida a tratamento

798

SKB CASE 14414

-27ultrassónico (sonicated) durante 60 segundos (rebentamentos de 10 segundos com intervalos de 30 segundos para arrefecimento) e depois centrifugada a 20 000 x g durante 15 minutos a 4SC. 0 ensaio Western blot da pelota e sobrenadante resultantes indicou indicou que 70% da proteína SKBsCD-4 estava na fracção sobrenadari te. A fracção sobrenadante foi centrifugada a 100 000 x g durante 60 minutos. A análise Western blot da pelota e sobrenadante resultantes indicou que <5% da proteína SKBsCD-4 tinha permaneci do na solução. A fracção sobrenadante foi diluída com um volume igual de MES 40 mM pH 6,0 e carregada numa S Sepharose de 1 ml (Pharmacia, Piscatatuay, Neu/ Oersey) equilibrada com MES 20 mM pH 6,0. A coluna foi lavada com 10 ml de MES 20 mM pH 6,0. A SKBsCD-4 ligada foi eluída com MES 20 mM pH 6,0, NaCl 0,5 M, recolhendo, -se fracçães de 1 ml. A análise Western blot das fracçães de passagem, lavagem e eluição indicou que <5% da SKBsCD-4 se ligou à coluna e se eluíu nas fracçães 2 e 3.

As fracçães de passagem, lavagem e eluição foram ensaiadas relativamente à SKBsCD-4 funcional por ELISA de competição. Tanto a fracção de passagem como a de eluição 2 continham SKBsCD-4 que se ligou a 0KT4A.

Imunoprecipitação: os meios concentrados (100 jul) foram diluídos com um volume igual de tampão de precipitação (fosfato de sódio 10 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, 0,1% de NP-40, 0,5% de leite magro s.e co) e pré-clarificados com 3 y^g de IgG de coelho durante 15 minutos a 4SC, seguindo-se a adição de 30(volume de enchimento) de pérolas de proteína A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, Neiu 3ej? sey) durante 30 minutos a 49C. 0s sobrenadantes pré-clarificados foram incubados com 5 ^g de anticorpos monoclonais 0KT4, 4A, 4B,

4C, 4D, 4E, 4F, 0KT8 (Ortho Pharmaceuticals), IgG de ratinho (Cooper Biomedical, Malvern, Pennsylvania) ou IgG de.coelho anti-ratinho (Cooper Biomedical) durante 30 minutos a 4 C. A 0KT4, 4A,

4C, 0KT8, IgG de ratinho e a IgG de coelho anti-ratinho foram pre cipitadas por incubação com 20(volume de enchimento) de pérolas de proteína A-Sepharose durante 30 minutos a 49C. A 0KT4B, 40, 4E e 4F foram incubadas com lO^g de IgG de coelho anti-ratinho durante 30 minutos a 4SC antes da adição das pérolas de proteína A

798

SKB CASE 14414

-28Sepharose. A seguir à precipitação, as pérolas foram lavadas duas vezes com 200yul de tampão de precipitação e uma vez com 200 jbl de tampão de precipitação sem NP-40 e leite magro seco. As p_é rolas lavadas foram levadas à ebulição durante 5 minutos em 20^.1 de tampão de amostra (Tris-HCl 125 mM, pH 6,8, 20% de glicerol, ^JME (beta-mercaptoetanol) 1,4M). A seguir à ebulição, os sobrena dantes foram submetidos a electroforese num gel de SOS-poliacrilamida a 12,5% e analisados por Western blot como descrito acima.

Ambas as proteínas V104 e V1V204 foram imunoprecipitadas por 0KT4A. A proteína expressa por 0MPAV1 foi imunoprecipitada por 0KT4A e 0KT4D, mas não por 0KT4, 0KT4B, 0KT4C, 0KT4E ou 0KT4E. A proteína expressa por 0MPAV1V2 foi imunoprecipitada por todos os anticorpos monoclonais excepto por 0KT4. Em adição, a afinida. de desta proteína por 0KT4C foi menor do que para os outros anticorpos monoclonais.

ELISA de Competição: revestiram-se placas de microtitulação (Elotv Laboratories, McLean, Virgínia) durante a noite à temperatura ambiente com 1 OO^ul/cavidade de NaHCOj OjUV^ÍarCO^(pH 9,4) contendo 150 ng de sCD-4 purificada.

Incubaram-se alíquotas (2,5-80yxl) de meios concentrados ou extracto de células com 5 ng de 0KT4A na presença de 1 mg/ml de albumina de soro bovino (BSA) num volume final de lOO^ul, durante a noite à temperatura ambiente. As amostras com menos de 100 yd foram diluídas até 100yd. com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Após incubação, as placas foram decantadas, enxaguadas 3 vezes com PBS e secas. A cada cavidade adicionaram-se 380 yi<L de PBS/0,5% de gelatina. As placas foram incubadas a 372C durante uma hora.

A seguir à incubação a 378C, as placas foram decantar, eri xaguadas 3 vezes com PBS e secas por batida (patted). As incubaçães de amostras de 100 yd contendo o anticorpo monoclonal foram adicionadas às cavidades individuais da placa preparada e incubadas durante 5 horas a 372C.

A seguir à incubação, as placas foram decantadas, enxaguadas 5 vezes com PBS e secas por batida. Adicionaram-se a cada cavidade 100^ul de uma solução contendo IgG anti-ratinho/cavalo

798

SKB CASE 14414

-29biotinilada. Esta preparação de anticorpo foi preparada adicionando uma gota de IgG anti-ratinho/cavalo (Vector Labs, Burlingai me, Califórnia) a 10 ml de PBS contendo 1% de soro de cavalo. As placas foram incubadas durante 30 minutos a 373C.

A seguir à incubação, as placas foram decantadas, enxagua das 5 vezes com PBS e secas por batida. Adicionaram-se lOO^ul de complexo A8C (Vector Labs, Burlingame, Califórnia) a cada cavidade. As placas foram então incubadas à temperatura ambiente duraj} te 30 minutos.

As placas foram de novo decantadas, enxaguadas 5 vezes com PBS e secas por batida. Adicionaram-se a cada cavidade 100 ^1 de p-nitrofenilfosfato misto (2 mg/ml de p-nitrofenilfosfato (Sigma Chemical Co. , St. Louis, Missouri) em bicarbonato d e sodio Ο,ΊΜ, pH 9,4, MgCl^ 10 mM). As placas foram incubadas a 3790 no escuro durante 30 minutos. A seguir à incubação, as placas foram lidas a uma absorvância de 405 nm. As concentrações de sCD-4 foram determinadas contra uma curva Standard gerada incubando quantidades conhecidas de sCD-4, purificada, com o anticorpo 0KT4A. Verificou-se que ambas as proteínas (V104 e V1V234) se ligavam ao anticorpo monoclonal 0KT4A neste ELISA de competição.

Exemplo 3: Construção de vectores de expressão em levedura

Os plasmídeos usados para construir vectores de expressão em levedura para expressão de proteínas sCD-4 são baseados no vector vaivém de levedura, básico de cópias elevadas pYSK102 (Rosenberg, et al., Genetic Enqineerinq 8:151 (1986). Todos estes contêm um fragmento EcoRI-PstI, de 823 pares de bases do gene TRPl de levedura (Tsumper e Carbon, Gene 10:157 (1980)), que proporciona um marcador seleccionável; um fragmento EcoRI-PstI de 2Qkb de levedura do circulo de 2 micra (Hartley e Donaldson, Nature 286:

:860 (1980)) que proporciona uma origem de replicação em levedura; uma porção de pBR322 (deleccionada de BamHI a PvuII) (em Cloninq Vectors, Pouu/els, Enger, Valk, Eds., 1985), que proporcio na a replicação e selecção em E, coli e um módulo promotor de levedura- terminador inserido entre os locais HindIII e BamHI de pBR322. 0 promotor é quer um fragmento BamHI-Rsal de 431 pares de bases de CUP1 derivado como um fragmento BamHI-EcoRI, de

798

SKB CASE 14414

-30pYSK12 (Butt, et al. , Proc. Natl. Acad. 5ci. USA 81.:3332 (1984); Rosenberg et al., Cenetic Enqineerinq 8:151 (1986); Gorman et al., Gene 48:13 (1986)) quer uma sequência do promotor TDH3 de 1,1 kb (Holland, et al., 3. Biol. Chem. 255:2596 (19B0)) derivada como um fragmento BamHI-EcoRI do plasmideo pYSKlB (Rosenberg, et al., supra; Gorman, et al., supra). 0 terminador é um fragmento

Kpnl-HindIII de 361 pares de bases do gene CYC1 (Smith, et al.,

Cel 1 .16:753 (1979)). Na região entre o promotor e o fragmento de CYCl podem ser inseridas várias sequências sintéticas como descri, to abaixo.

Construção de pY5K147 e pY5K148: os plasmideos pYSK137 (promotor de CUPl)e pY5K138 (promotor de TDH3) contêm uma sequência sintéti ca de oligonucleõtidos entre o local EcoRI na extremidade 3' da sequência do promotor e um local Kpnl na extremidade 5' da sequêri cia do terminador. Esta sequência sintética contém locais especi. ais de restrição Xhol, Ncol e Sall a montante dos codães de term_i nação de tradução em todas as três estruturas de leitura. 0 ligante sintético tem a sequência:

GAATTCTCCACCCATCGCCACTCGACGTAGTTAAGTAGCTACC

Um fragmento Ncol-Sall do plasmideo pUCsT4, contendo as bases 124 a 1257 da sequência de sCD-4 foi inserido em pYSK137 ou pYSK138 cortado com NcoI-ΚρπΙ para produzir pYSK147 e pYSK148, respectivamente.

Construção de pYSKl54 e pY5K155: os vectores para a expressão do gene de fusão de ubiquitina contêm um gene de ubiquitina de levedura, sintético, adaptado a cassete (Ecker, et al., 3. Biol. Chem. 262: 3524 (1987)) entre o promotor e o terminador de CYCl. A sequêri cia de uniquitina é idêntica à publicada por Ecker, et al., excepto na facto do fragmento AflII-Kpnl terminal ter sido substitui^ do por uma sequência de oligonucleõtidos contendo um local de res trição Ncol na extremidade 3'. 0 fragmento Ncol-Kpnl de pYSK147, contendo a sequência de sCO-4 desejada foi inserido entre este 1.0 cal Ncol e o local Kpnl na extremidade 5' do fragmento CYCl, para dar pYSK154. Um derivado de pYSK154, no qual a sequência para os primeiros sete aminoácidos do terminal amino da sequência de sCD-4 em pYSK154 (as sequências de péptido de comando) foi deleccio68 798

SKB CASE 14414

-31na'da, foi construído por clivagem de pYSK154 com Kpnl, seguido por preenchimento com o fragmento Klenou/ de ADN polimerase I de E. coli (polIK) e inserção de uma sequência Xpnl-Xbal de sCD-4 (bases 145 a 1257 de sCD-4) de psT4BBVlDHFR que tinha sido tratado com polIK para preencher as extremidades pegajosas. Este plasmideo foi designado por pYSK155.

Construção de pYSK-159 e pYSKlól: os vectores contendo uma sequêri cia de sCD-4 truncada (bases 124-603) foram construídos inserindo uma sequência sintética de oligonucleótidos contendo um codão de terminação no local Saci da sequência sCD-4 (base 602), 0 ligante sintético (dupla cadeia) tem a sequência:

CTAAGCCGC

TCGAGATTCGCCGGC

Esta sequência sintética foi inserida em pYSK148 e pYSK154 cortados com Saci e NarI para dar pYSK159 e pYSKlól, respectivamente. Assim, o ADN de CD-4 em pYSK159 tem os codões para os ami noácidos -9 (alanina) a 151 (leucina) (YVl).

Exemplo 4: Expressão de sT4 em culturas de leveduras

ADN de plasmideo (2-lO^ug/ml) foi usado para transformar levedura (Saccharomyces cerevisiae) usando técnicas Standard (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor, 1986), seleccionando para prototrofia de triptofano. As estirpes empregues eram estirpes F762 (Mata, trplAl, ura3-52) ou PEC1-8B (Mata, proA4::URA3, ura3-52, trpl-289, his3). As culturas de transformantes seleccionados foram cultivadas em (Yeast Nitrogen Base (YNB, Difco, Detroit, Michigan) contendo suplementos (2$ de glucose, 20_/lAg/ml de uracil, 2 0y_Ag/ml de histidina). Para plasmídeos utilizando o promotor CUPl, incluiu-se sulfato de cobre a 100 micromolar. As culturas foram colhidas em fase log tardia por centrifugação e foram lavadas e quebradas. 0 lisado de células foi analisado quanto a sCD-4 por ensaio immunoblot Standard de proteína.

Em S. cerevisiae contendo pYSK147 e pYSK148, a proteina sCD-4, SKBYsCD-4, (aminoácidos -9 a 369) foi expressa a niveis

798

SKB CASE 14414

-32baixos (inferiores a cerca de 0,5 ng/l). Verificou-se que a actividade estava associada à fracção particulada, mas poderia ser facilmente solubilizada por extracção com detergentes não iónicos. A quantidade de SKBYsCD-4 (aminoácidos -9 a 369) em cultjj ras de 5. cerevisiae contendo pY5Kl54 estava entre cerca de 2 e g

cerca de 6 mg/litro (a 2 x 10 células/ml). Isto foi um melhoramento de 5 vezes a quantidade da proteína CD-4 expressa com pYSK147 e pYSK148, i.e. sem a presença da sequência estabilizante de ubiquitina. 0 tamanho estimado da proteína sCD-4 sintetizada foi idêntico em todos os casos, indicando que a porção ubiquitina da proteína tinha sido clivada de SKBsCD-4. Isto foi confirmado por procedimentos de immunoblotting usando um anticorpo para uniquitina de levedura.

□s niveis de expressão das proteínas sCD-4 truncados (YVl) em pY5K159 e pYSK161 foram semelhantes às da proteína sCO-4 expres^ sa como fusão de ubiquitina. A quantidade de sCD-4 detectada foi semelhante em cada uma das estirpes hospedeiras examinadas.

A SKBsYCD-4 da estirpe F762 contendo pY5K154 foi parcialmente purificada por passagem através de uma coluna de 5-Sephatose. Um extracto em bruto, preparado em tampão Tris 10 mM, pH 6,0, 1% de Tmeen-20, foi centrifugado a 30 000 x g. 0 sobrenadante foi ajustado a pH 4,0 e foi aplicado a uma coluna S-Sepharose equilibrada em tampão de acetato 50 mM. A amostra foi eluída em lotes com tampão MES 50 mM Ç/^-ácido 2-(N-morfolino)-etanossulfónico^, pH 6,0) contendo NaCl 0,5 Μ. A presença de SKBYsCD-4 no eluído foi confirmada por ensaio de immunoblot. 0 material era activo como foi determinado por um ensaio baseado num ELISA de competição utilizando SKBsCD-4 purificado de células CHO e anticorpo 0KT4A, sugerindo que a conformação da SKBsYCD-4 derivada de levedura imita a do material derivado de células de mamífero (CHO) .

Exemplo 5: Construção de Vectores de Streptomyces

Usando manipulações de ADN recombinante, segmentos da sequência de ADNc de CD-4 humana foram fundidos à sequência de sinal do gene do inibidor da tripsina de S. lonqisporus (LTI) e do gene da y2> —galactosidase Qigal) de 5. lividans. 0s minigenes de

798

SKB CASE 14414

-33sCD-4 foram unidos a plasmídeos de S treptomyces pI87D2 (Katz, et al. , supra) e pl8351 (Kieser, et al. , supra) para criar plasmí d_e os pl_TI:sT4/l, pLTI:sT4/7, pLTI:VlU2 e pBgal:sT4/7. A construção dos vectores foi a que se segue:

Construção de pLTI:sT4/l: D plasmideo pLIT:sT4/l foi construido a partir de três outros plasmídeos: pUCs/4, pI8351 e pLTl450. A construção do plasmideo pLTl450 é a que se segue:

Construção de pLTI450: um fragmento Sacl-Kpnl de 0,92 kb contendo o gene LTI foi inserido em pUC18 que tinha sido digerido com Saci e Kpnl. Este plasmideo, pLTI520, foi parcialmente digerido com EagI e totalmente digerido com Sall e depois ligado a um ligante sintético (dupla cadeia) que tinha ex tremidades EagI e Sall:

5'-GGCCGCCGCCCCCGCG

CGGOGGGGGCGCAGCT-5'

Os plasmídeos obtidos desta ligação foram rastreados para inserção do ligante sintético no local EagI localizado aproximada mente 0,5 kb do local Saci. Este local EagI está localizado no par de bases 86 em relação à extremidade 5' do gene LTI. 0 plasmideo resultante contém o promotor LTI e a sequência de codificação para o péptido de sinal e o local de clivagem do péptido de sinal. Os locais EagI e Sall podem ser ambos usadas para fundir minigenes de sCO-4 ã sequência de sinal LTI.

Construção de pLTI:sT4/l: para criar o plasmideo pLTI:sT4/l, a sequência de codificação de sCD-4 foi isolada num fragmento BbvI-Pstl de aproximadamente 1,1 kb de pUCsT4. Este fragmento contém os pares de bases 149-1257 da sequência de ADNc de CD-4 humana. 0 plasmideo pUCsT4 foi digerido com Bbvl seguido por tratamento com transcriptase inversa para preencher as extremidades protuberantes 5'. 0 ADN foi então digerido com PstI. Este fragmento BbvI(RT)-Pstl de 1,1 kb, que codifica SKBsCD-4, foi ligado a pLTl450 que tinha sido tratado com Sall e transcriptase inversa e em seguida digestão com PstI. Esta ligação resultou no plasmideo pLTl450sT4/l. 0 passo final na construção de pLTI:sT4/l requereu a inserção de funçães de replicação de 5trepto.myces em pLTl450sT4/ /l. Isto foi conseguido digerindo pIJ351 (Kieser, et al., supra) com PstI e ligando-o a pLTl450sT4/l digerido com PstI.

798

SKB CASE 14414

-34Construção de pLTI:sT4/7: □ plasmideo pLTI:sT4/7 foi construído a partir de três outros plasmideos: pUCsT4, pI37Q2 e pLTl450.

Para criar o plasmideo pLTI:sT4/7, a sequência de codificação de sCD-4 foi isolada num fragmento NcoI-PstI de 1,1 kb de pUCsT4.

Este fragmento contém os pares de bases 124-1257 da sequência de AONc de CD-4 humana. Estos pares de bases foram colocados entre umcódão de iniciação ATC e um códão de terminação TAA como anteriormente descrito no Exemplo 1. 0 códão de iniciação forma parte da sequência de reconhecimento de Ncol. A sequência de codif_i cação de sCD-4 contida neste fragmento contém 9 aminoácidos da sg quência de comando de CD-4. 0 pUCsT4 foi tratado com Ncol e trans: criptase inversa seguida por digestão com PstI. Este fragmento foi então ligado com pLTl450 que tinha sido tratado com HincII e PstI. Esta ligação resultou no plasmideo pLTI450sT4/7. 0 replicão de Streptomyces foi proporcionado pelo plasmideo pI37D2 (Katz, et al. , supra). Foi inserido em pLTl450sT4/7 via os locais PstI únicos em ambos os plasmideo para criar o plasmideo pLTI:sT4/7.

Construção do plasmideo pLTI:VlV2: 0 plasmideo pLTI:VlV2 foi cong truído a partir dos plasmideos psT4.184, pLTl450 e pI3351. Isolou-se um fragmento Xbal-EcoRI de 0,54 kb a partir de psT4.184. Este fragmento foi tratado com Bbvl e transcriptase inversa. A extremidade Bbvl corresponde ao par de bases 149 da sequência de ADNc de CD-4 humana. Cste fragmento terminado de forma romba foi então ligado a pLTl450 que tinha sido tratado com Sall e transcri ptase inversa para criar o plasmideo pLTl450VlV2. As funçães de replicação de Streptomyces foram proporcionadas por pI3351. Este plasmideo foi clonado em pLTl450VlV2 via o local PstI único em ajm bos os plasmideos pI3351 e pLTl450VlV2. 0 plasmideo resultante foi o pLTI:VlV2.

Construção de pftqalsT4/7: 0 plasmideo p/lgalsT4/7 foi construído a partir dos plasmideos pUCsT4, pI3702 e p3SSXMCP. p3SSXMCP é um derivado de pUC9 (Vieira and Messing, Gene 19:259 (1982) que cog tém o promotor de /3-galactosidase e a sequência de sinal. Vinte seis pares de bases a jusante da sequência de codificação para o local de clivagem de péptido de sinal existe um local Xmnl (Eckhardt, et al., 3. Bacterlol, 169:4249 (1987)). Foi inserido neste local um ligante sintético que contém uma sequência de re6Β 79Β

SKB CASE 14414

-35conhecimento de BamHI (Nem England Biolabs, Beverly, Massachuse_t ts) para gerar o plasmídeo p3SSXlO. Este vector foi tratado com BamHI e transcriptase inversa seguindo-se a digestão com Xhol.

Eoi ligado a este vector um fragmenta que tinha uma extremidade Ncol tratado com transcriptase inversa para gerar uma extremidade romba e uma extremidade Sall. A ligação do local BamHI preen chido com α local Ncol preenchido recriou ambos os locais BamHI e Ncol. D plasmídeo resultante era p35SXMCP. 0 pUCsT4 foi tratado com Xbal e transcriptase inversa seguindo-se digestão com Ncol. Este fragmento Ncol-Xbal(RT) de 1,1 kb foi então inserido em p3SSXMCP que tinha sido tratado com Saci e AON polimerase I de T4 seguindo-se digestão com Ncol. As funçães de replicação de 5 treptomyces foram proporcionadas por pI3702 que foi inserido em p3SSXsT4 via o local BglII único em ambos os plasmideos. 0 plajs mídeo resultante foi o pp,galsT4/7.

Exemplo 6: Expressão de miniqenes de sCD-4 em 5treptomyces: Os plasmideos pLTI:sT4/l, pLTI:sT4/7, pLTI:VlU2 e p^igal:sT4/7 foram transformados em S. lividans 1326 (Bibb, et al«, supra). Em adição os pLTI:sT4/l, pLTI:sT4/7, pLTI:VlV2 foram introduzidos em 5. coelicolor M124 (Hopujood et al. , Genetic Manipulation of Strepto myces - A Laboratory Manual, F. Croiue & Sons, Ltd., Normich, England (1985)), 5. albus 21074 (Chater and Wilde, 3. Gen. Microbiol. 116:323 (1980)) e num derivado branco de 5. lonqisporus (ATCC accession number 23931). Todos os plasmideos foram introdu zidos nos vários hospedeiros usando o procedimento anteriormente descrito por Thompson, et al., 3. Bacteriol. 151:668 (19B2). Os transformantes foram seleccionados por deposição nas placas de transformação 3 ml de agar a 0,4% contendo lOO^iAg/ml de tioestreptona. Os clones que expressaram minigenes de CD-4 foram identificados propagando os transformantes resistentes a tioestreptona em dez mililitros de caldo de tripticase de soja mais 5 ml de tioestreptona durante 48-72 horas. Os sobrenadantes da cultura e os lisados de células foram separados num gel de poliacrilamida a 12% (30:0,8 acrilamida:bis) - dodecilsulfa to de sódio a 1% e em seguida transferidos para nitrocelulose (Tou/bin, et al. , Proc.

Natl. Acad. 5ci. USA 76:4350 (1979)). 0 filtro de nitrocelulose

798

SKB CASE 14414

-26Foi sondado usando sCD-4-anti-soro ds coslho como descrito por D e e η, et al. , supra.

Os transformantes pLTI:sT4/l, pLTI:sT4/7 e p^gal:sT4 de 5. lividans expressaram todos uma proteína de aproximadamente 45kD que é o tamanho previsto para a proteína sCD-4 codificada por esses plasmídeos. S imilarmente , os transformantes pLTI:VlV2 de 5 . lividans expressaram uma proteína de aproximadamente 20 kD que é o tamanho previsto da proteína V1V2. A expressão de SKBsCD-4 e V1V2B4 foi também examinada em S. coelicolor, 8. albus e S. lonqisporus. Tal como com S. lividans, as proteínas de 45 kD (os transformantes pLTI:sT4/l e pLTI:sT4/7) e de 20 kD (os transformantes pLTI:VlV2) foram expressas por outras espécies de Streptomyces .

A quantificação subsequente de sKBsCD-4 presente nos sobrenadantes de cultura e lisados de células de 5. lividans mostrou níveis de 1-5 mg/l. A V1V234 estava presente a 2-10 mg/l nos sobrenadantes da cultura e lisados de células. Menos do que 1 mg/ml foi expresso pelos transformantes p^gal:sT4 de S. lividans.

Usando uma linha de células pLTI:sT4/7 de 5. lividans, a expressão de SKBsCD-4 foi vistá num fermentador de 12 litros.

De modo semelhante ao dos estudos de expressão em pequena escala, as células foram cultivadas em caldo de tripticase de soja mais 5 yug/ml de tioestreptona. Os sobrenadantes da cultura e os lisados de células foram analisados quanto à expressão de SKBsCD-4 7,5, 24, 31,5, 54 e 72 horas após a inoculação. 0 nível de expressão volumétrico máximo foi de 60 mg/ml e ocorreu 24 horas após inoculação. 0 SKBsCD-4 foi igualmente distribuído entre o sobrenadante de cultura e células intactas.

ítostrou-se por ELISA de competição que os sobrenadantes pa_r cialmente purificados contendo V1V204 e SKBsCD-4 se ligam a 0KT4A indicando que estas proteínas derivadas de S treptomyces são proteínas de ligação a HIV.

A proteína de ligação a HIV, V1J4 de modo semelhante foi ligada ao promotor LTI e mostrou-se por ensaio uiestern que é expressa em S. lividans.

798

SKB CASE 14414 .4⁷

-37Os Exemplos anteriores demonstram que as proteínas de ligação a HIV derivadas de CD-4, p.e., SKBsCD-4, SK8YsCD-4, V104, V1V204 e YV1, que foram expressas e segregadas pelos organismos recombinantes do invento são proteínas de ligação a HIV possuindo a função de ligação a HIV de sCD-4. Mais particularmente, elas têm o domínio de ligação a HIV da região VI de SKBsCD-4.

A descrição e Exemplos anteriores revelam completamente o invento incluindo as suas concretizações preferidas. As modifica ções e melhoramentos às concretizações especificamente reveladas estão dentro do âmbito das reivindicações que se seguem.

Claims (3)

1. REIVINDICAÇDCS

   1 - Processo para a produção de uma proteína de ligação a HIV, caracterizado por compreender cultivar células de E. coli que foram transformadas com um vector compreendendo uma sequência de codificação para a proteína de ligação a HIV operativamente li. gada a um elemento regulador e recolher daí a proteina de ligação a HIV.
2. 2 - Processo para a produção de uma proteína de ligação a HIV caracterizado por compreender cultivar células de Streptomyces que foram transformadas com um vector compreendendo uma sequêrj cia de codificação para a proteína de ligação a HIV operativamente ligada a um elemento regulador e recolher daí a proteína de ligação a HIV.
3. 3 - Processo para a produção de um proteina de ligação a HIV, caracterizado por compreender cultivar células de levedura que foram transformadas com um vector compreendendo uma sequência de codificação para a proteína de ligação a HIV operativamente l_i gada a um elemento regulador, e recolher dai a proteina de ligação a HIV.