HUT50500A - Process for expressing hiv-bonding proteines - Google Patents

Description

A jelen találmány tárgya eljárás oldható CD-4(sCD-4) fehérjékből származó HÍV kötő fehérjék előállítására. A találmány elsősorban vektorok olyan konstrukciójára vonatkozik, amelyek HÍV kötő fehérjék kifejezésére alkalmasak E. coli-ban, ötreptomycesben és élesztőben.

Az alábbiakban röviden vázoljuk a találmány szakirodalmi hátterét .

A humán T-sejt glikoprotein, a CD-4 (korábban gyakran nevezték T4-nek)j egyike a számos nem polimorf T limfocita felületi receptor fehérjének, amelyek érintve vannak a hatékony T sejt-célsejt kölcsönhatás közvetítésében.

A humán CD-4(T-4) receptor cDNS szekvenciája ismert ^Maddon és munkatársai: Cell 42, 93(1985)3’ ΐθΐΰθ³ CD-4 elő-fehérje szekvencia 458 aminosav hosszúságú, amely tartalmazza a vélt 23 aminosavas kiválasztási vezető, 372 aminosavas felületi (V^-V^), 23 aminosavas transzmembrán és 40 aminosavas citoplazmás tartományokat. A felületi tartomány négy, korlátozott (20-30 %) homológiájú területet mutat a változó (V) és csatlakozó (J) immunglobulin területekhez. Az öt intron-exon határterület a felületi tartományban ezen V-J területek csatlakozásához közel található.

A humán immunhiány vírus (HÍV), a szerzett immunhiány szindróma (AIDS) előidézője, határozott affinitást mutat a CD-4 limfocitákhoz. A vírus kötést a CD-4-hez a vírus burkolat gp120 glikoproteinje közvetíti. A CD-4 fehérjét lizált, HIV-vel fertőzött sejtekkel együtt lehet kicsapni anti-env antitesttel és fordítva, gp120-at anti-CD-4 monoklonális antitesttel együtt lehet kicsapni, így mutatva be, hogy a vírus-kötést CD-4-hez a vírus burok gp120 fehérjéje közvetíti.

• ·

Nemrégiben több tudományos kutató is beszámolt olyan felfedezéseiről, amelyek a CD-4 és az AIDS fertőzés kölcsönhatására vonatkoznak, emlős sejtrendszerekben kifejezett CD4 származékot alkalmazva.

Deen és munkatársai [Natúré 331, 82( beszámoltak az sCD-4 izolálásáról és kifejezéséről számos celluláris környezetben. Az sCD-4 a CD-4 oldható származéka, amelyből hiányzik a CD-4 transzmembrán és citoplazmás tartománya.dfhr-hiányos kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtvonalat alkalmazva bemutatták, hogy a kifejezett sCD-4 megőrzi a CD-4 szerkezeti és biológiai tulajdonságait a sejtfelületen, kötődik a HÍV gp110 burkolati fehérjéjéhez és gátolni képes a CD-4⁺ limfociták kötését.

Traunecker és munkatársai I Natúré 331, beszámolnak sCD-4 felhasználásáról a vírus célsejthez való kötődésének gátlására. A megadott adatok a HÍV fertőzés in vitro gátlását mutatják az sCD-4 rekombináns formáját alkalmazva.

Fisher és munkatársai [Natúré 331 , az sCD-4 tisztításáról számolnak be CHO-ból, valamint ennek alkalmazásáról hatásos inhibitorként.

Hussey és munkatársai ^Natúré 331 , 78(1988)J beszámolnak a

Baculovírus kifejező rendszer alkalmazásáról sCD-4 előállítására, amelyről úgy találták, hogy gátolja a vírus-indukált sejtfúziót (syncytium képződés) és a HÍV fertőzést a gp120 kifejező sejtekhez való kötődéssel. Azt is kimutatták, hogy az sCD-4 fehérje, úgy tűnik, nem gátolja a II. osztály-fajlagos T-sejt kölcsönhatásokat .

Smith és munkatársai [Science 238, 1704( szintén beszámolnak a CHO emlős sejt rendszer alkalmazásáról sCD-4 termelésére.

• 9 9 9 9

99 · ··· • · · • · 9 9 9 9 999

- 4 Olyan sCD-4 fehérje termeléséről számolnak be CHO sejtekben, amelyről kimutatható, hogy HÍV gp1 20 burkolati fehérjékhez kötődik és semlegesíti a HIV-1 fertőzőképességét in vitro. Az adatok azt jelzik, hogy az sCD-4-et lehet alkalmazni alapként AIDS fertőzés terápiás kezeléséhez.

Továbbra is igény van azonban bakteriális és alacsonyabbrendű eukarióta rendszerekre sCD-4 fehérjék kifejezéséhez.

Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmányt.

A jelen találmány azon a felfedezésen alapul, hogy a CD-4 fehérje HÍV kötő funkcióját ki lehet fejezni E. coliban, és azon a felfedezésen, hogy az ilyen HÍV kötő fehérjét ki lehet választani a fermentációs tápközegbe. Pontosítva tehát a jelen találmány olyan E. coli kifejező vektorra vonatkozik, amely HÍV kötő fehérjét tartalmaz működőképesen összekapcsolva valamely szabályozó elemmel.

A jelen találmány azon a felfedezésen is alapul, hogy a CD-4 fehérje HÍV kötő funkcióját ki lehet fejezni Streptomycesben, és azon a felfedezésen, hogy az ilyen HÍV kötő fehérjét ki lehet választani a fermentációs tápközegbe. Pontosítva tehát a jelen találmány olyan Streptomyces kifejező vektorra vonatkozik, amely HÍV kötő fehérjét tartalmaz működőképesen összekapcsolva valamely szabályozó elemmel.

A jelen találmány azon a felfedezésen is alapul, hogy a CD-4 fehérje HÍV kötő funkcióját ki lehet fejezni élesztőben. Pontosítva tehát a jelen találmány olyan élesztő kifejező vekorra vonatkozik, amely HÍV kötő fehérjét tartalmaz működőképesen összekapcsolva valamely szabályozó elemmel.

A jelen találmány azon a felfedezésen is alapul, hogy az OMPA vezető szekvenciát lehet alkalmazni a héter.ológ fehérjék ·· ·· « · • ·· · · · · • · · • · ···· ···

- 5 kivitelére E. coliból. Részletesebben tehát a jelen találmány olyan E. coli kifejező vektorra . is vonatkozik, amely E. coliban képzett, kivihető fehérjéket fejez ki; ez a vektor egy kódoló DNS szekvenciát tartalmaz valamely szabályozó elemmel operatívan összekapcsolva, ahol a kódoló DNS szekvencia az X—Y fehérjét kódolja, ahol X egy OMPA vezető szekvencia és Y egy heterológ fehérje.

Az alábbiakban a találmány részletes leírását adjuk meg.

A jelen találmány szerint CD-4 receptorból származó HÍV kötő fehérjét fejezünk ki alkalmas mennyiségben gyógyászati és/ vagy megelőző szerként való felhasználásra, hogy meggátoljuk a kezdeti HÍV fertőzést és meggátoljuk a HÍV sejtből sejtbe való átjutását a gazdaszervezet fertőzését követően; a HIV-limfocita kötés gátlóanyagainak átvizsgálásában való felhasználásra; CD-A·^ limfocita funkciók gátlóanyagaként való felhasználásra; vagy más célú felhasználásra, amint ezt a későbbiekben leírjuk. A fehérjék mind rendelkeznek a CD-4-ből való HÍV kötő funkcióval. Az ilyen fehérjékre előnyös példák az sCD-4 fehérjék és ennek származékai. Az sCD-4 fehérjék a CD-4 származékai, amelyekből hiányzik a CD-4 transzmembrán és citoplazmás tartománya. Az sCD-4 fehérjékre példákat írnak le különböző közleményekben £Fisher és munkatársai és Hussey és munkatársai: Natúré 331, 76-88 (1988); Smith és munkatársai: Science 238, 1704(1987)^Az itt példaként felhozott sCD-4 fehérjéről, amelyet SKBsCD-

4-nek is neveznek, Deen és munkatársai számolnak be a fentebb idézett munkában, a 83- oldalon. Ezt az alábbi aminosav- és nukleotid szekvenciával mutatjuk be. A szekvencia mutat egy 5'-nem transzlatált területet és egy CD-4 cDNS-ből származó vezető szék• · · · · · ·· ···· • · • ··· venciát, amelyről Macidon és munkatársai számolnak be |_Cell 42, 93 (1985)^· Az érett SKBsCD-4 első aminosava, ahogyan CHO sejtek révén kifejeződik és kiválasztódik, a 151-153 bázispárok által kódolt lizin. A transzmembrán tartomány ki van iktatva a CD-4 cDNS restrikciós hasításával Hpall-vel az 1252 bázispárnál és egy kapcsoló (linker) beiktatásával ide, amely helyreállítja az 1253— 1257 bázispárokat és amely transzlációs stop kodont, TAA-t vezet be a C-terminális valin után. Amint erről Maddon és munkatársai beszámolnak, az érett CD-4 első három aminosava glutamin £amely itt (-)2 aminosavként van bemutatva} -glicin Eamely itt (-)1 ami-

zik (+)1 aminosavként^ . Egyébként az alább bemutatott szekvenc-ia azonos azzal, amelyről Maddon és munkatársai beszámoltak.

CAAGCCCAGAGCCCTGCCATTTCTGTGGGCTCAGGTCCCTACTGCTCAGCCCCTTCCTCC

90 110

CTCGGCAAGGCCACAATGAACCGGGGAGTCCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAA

MetAsnArgGlyValProPheArgHisLeuLeuLeuValLeuGln

130· 150 170

CTGGCGCTCCTCCCAGCAGCCACTCAGGGAAAGAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAGGGGAT

LeuAlaLeuLeuProAlaAlaThrGlnGlyLysLysValValLeuGlyLysLysGlyAsp

-1 +1 • ···· ·· ·· ···· « · ·· ·· ·· • · ··· · ··· • · · · · ··· · ·· ··♦····

- Ί 190 210 230

ACAGTGGAACTGACCTGTACAGCTTCCCAGAAGAAGAGCATACAATTCCACTGGAAAAAC

ThrValGluLeuThrCysThrAlaSerGlnLysLysSerlleGlnPheHisTrpLysAsn

250 270 290

TCCAACCAGATAAAGATTCTGGGAAATCAGGGCTCCTTCTTAACTAAAGGTCCATCCAAG

SerAsnGlnlleLysIleLeuGlyAsnGlnGlySerPheLeuThrLysGlyProSerLys

310 330350

CTGAATGATCGCGCTGACTCAAGAAGAAGCCTTTGGGACCAAGGAAACTTCCCCCTGATC

LeuAsnAspArgAlaAspSerArgArgSerLeuTrpAspGlnGlyAsnPheProLeuIle

370 390410

ATCAAGAATCTTAAGATAGAAGACTCAGATACTTACATCTGTGAAGTGGAGGACCAGAAG

IleLysAsnLeuLysIleGluAspSerAspThrTyrlleCysGluValGluAspGlnLys

430 450470

GAGGAGGTCCAATTGCTAGTGTTCGGATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTTCAG

GluGluValGlnLeuLeuValPheGlyLeuThrAlaAsnSerAspThrHisLeuLeuGln

104

490 510530

GGGCAGAGCCTGACCCTGACCTTGGAGAGCCCCCCTGGTAGTAGCCCCTCAGTGCAATGT

GlyGlnSerLeuThrLeuThrLeuGluöerProProGlySerSerProSerValGlnCys

550 570590

AGGAGTCCAAGGGGTAAAAACATACAGGGGGGGAAGACCCTCTCCGTGTCTCAGCTGGAG

ArgSerProArgGlyLysAsnlleGlnGlyGlyLysThrLeuSerValSerGlnLeuGlu • ···· ·· ·· ···· ·· ·· » · · · • · ··· · ··· • · · · · ··· · ·· ···· ···

610 630 650

CTTCAGGATAGTCCCACCTGGACATCCACTGTCTTGCAGAACCAGAAGAAGGTGGAGTTC

LeuGlnAspSerGlyThrTrpThrCysThrValLeuGlnAsnGlnLysLysValGluPhe

151

670 690 710

AAAATAGACATCGTGGTGCTAGCTTTCCAGAAGGCCTCCAGCATAGTCTATAAGAAAGAG

LysIleAspIleValValLeuAlaPheGlnLysAlaSerSerlleValTyrLysLysGlu

183

730 750 770

GGGGAACAGGTGGAGTTCTCCTTCCCACTCGCCTTTACAGTTGAAAAGCTGACGGGCAGT

GlyGluGlnValGluPheSerPheProLeuAlaPheThrValGluLysLeuThrGlySer

790 810 830

GGCGAGCTGTGGTGGCAGGCGGAGAGGGCTTCCTCCTCCAAGTCTTGGATCACCTTTGAC

GlyGluLeuTrpTrpGlnAlaGluArgAlaSerSerSerLysSerTrpIleThrPheAsp

850 870 890

CTGAAGAACAAGGAAGTGTCTGTAAAACGGGTTACCCAGGACCCTAAGCTCCAGATGGGC

LeuLysAsnLysGluValSerValLysArgValThrGlnAspProLysLeuGlnMetGly

910 930 950

AAGAAGCTCCCGCTCCACCTCACCCTGCCCCAGGCCTTGCCTCAGTATGCTGGCTCTGGA

LysLysLeuProLeuHisLeuThrLeuProGlnAlaLeuProGlnTyrAlaGlySerGly

970 990 1010

AACCTCACCCTGGCCCTTGAAGCGAAAACAGGAAAGTTGCATCAGGAAGTGAACCTGGTG AsnLeuThrLeuAlaLeuGluAlaLysThrGlyLysLeuHisGlnGluValAsnLeuVal

1030 1050 1070

GTGATGAGAGCCACTCAGCTCCAGAAAAATTTGACCTGTGAGGTGTGGGGACCCACCTCC ValMetArgAlaThrGlnLeuGlnLysAsnLeuThrCysGluValTrpGlyProThrSer

1090 1110 1130 CCTAAGCTGATGCTGAGCTTGAAACTGGAGAACAAGGAGGCAAAGGTCTCGAAGCGGGAG ProLysLeuMetLeuSerLeuLysLeuGluAsnLysGluAlaLysValSerLysArgGlu

1150 1170 1190

AAGGCGGTGTGGGTGCTGAACCCTGAGGCGGGGATGTGGCAGTGTCTGCTGAGTGACTCG LysAlaValTrpValLeuAsnProGluAlaGlyMetTrpGlnCysLeuLeuSerAspSer

1210 1230 1250

GGACAGGTCCTGCTGGAATCCAACATCAAGGTTCTGCCCACATGGTCCACCCCGGtgtaa GlyGlnValLeuLeuGluSerAsnlleLysValLeuProThrTrpSerThrProValVége

351 369

1270 tggcgcctctaga

Csonkított sCD-4-ek és ezek származékai, amelyek lényegében megőrzik az sCD-4 HÍV kötő affinitását, szintén kifejezhetők a jelen találmány szerint. Ezek közül a csonkított származékok közül előnyösek azok a fehérjék vagy polipeptidek, amelyek a V1 és ···· ·· ·· · · · · · · • · ··· · ··· • · · · · ··· · ·· ···· ···

- 10 V2 területek HÍV kötő területét tartalmazzák, amelyek mintegy az 1-182 aminosavakon belül vannak. A fentebb bemutatott szekvenciára utalva egyik adott példa az itt V1J4-nek nevezett fehérje, amely a (-)2-104(N-glutamin-glicin-lizin-átkötő rész-alanin-aszparagin-szerin-C) aminosavakkal bír a 351-369(-glicin-glutaminvalin-átkötő rész-treonin-prolin-valin-C) aminosavakhoz fuzionálva. Egy második példa az itt V1V2J4-nek nevezett fehérje, amely a (-)2-183(N-glutamin-glicin-lizin-átkötő rész-lizin-alanin-szerin-C) aminosavakkal bír a 351-369 aminosavakkal fuzionálva. Egy harmadik példa az itt YV1-nek nevezett fehérje, amely a (-)9-151(N-alanin-leucin-átkötő rész-leucin-glutaminsav-leucin-C) aminosavakat tartalmazza. Egy negyedik példa az itt SKBYsCD-4-nek nevezett fehérje, amely a (-)9-369 aminosavakkal bír. Ezen HÍV kötő fehérjéknek mindegyike, pl. 0KT4A kötésre alapozva, rendelkezik az sCD-4 fehérjék, különösen az SKBsCD-4 HÍV kötő tulajdonságával, és méginkább rendelkezik az sCD-4 fehérjék, főleg az SKB sCD-4 V1 és V2 területeinek HÍV kötő tartományával.

Azokon a fehérjéken kívül, amelyeket itt speciális példaként megadunk, azok, akik a szakterületen jártasak, könnyen meg tudnak alkotni DNS kódoló szekvenciákat további sCD-4 származékokhoz. Az ilyen származékok lényegében megőrzik az sCD-4 fehérjék HÍV kötő funkcióját, azaz a fehérje kötődése a gp120 HÍV env fehérjéhez nincs jelentősen károsítva. így pl. bárki alkothat olyan származékot, amely csak a V1 területtel bír, pl. a mintegy 1-94 aminosavakat vagy származékait, amelyek a CD-4 V1 területének csak egy részével bírnak. Bárki megalkothatja ezeknek a fehérjéknek olyan származékait is, amelyek lényegében az itt példaként felhozottakkal azonosak, csak éppen egy vagy alig néhány amino• ····

- 11 sav ki- vagy be van iktatva, vagy helyettesítve van.

Egy másik módszer szerint egy hibrid fehérjét, pl. egy transzlációs fúziós fehérjét alkothatunk meg egy sCD-4 fehérje és hordozó fehérje, másik antigén vagy valamely másik sCD-4 molekula között, hogy poli-sCD-4 molekulát alkossunk meg. Egy még további módszer szerint az sCD-4 kiiktatásos (deléciós) mutánst szintetikusan konjugálhatunk egy hordozó molekulához.

Az sCD-4 molekulák affinitását HIV-hez versengő kötési vizsgálattal mutathatjuk ki olyan sCD-4 molekulát alkalmazva, amely ismert aktivitással bír, vagy olyan antitesteket alkalmazva, amely felismeri a CD-4 receptort, mint pl. az OKT-4 és 0KT4A. A jelen találmány alkalmas sCD-4 fehérjéi szelektíven kicsapódnak kondicionált tápközegből 0KT4A-val, amint ezt a későbbi példákban bemutatjuk. A CD-4 fragmentumait és származékait kémiai úton is előállíthatjuk kifejeződés után, vagy genetikailag állíthatjuk elő a kifejeződés előtt a kódoló szekvencia manipulálásával a vezető és/vagy extracelluláris területnél.

Az sCD-4-et vagy az ebből származód HÍV kötő fehérjét kódoló DNS szekvenciát megkaphatjuk pl. a gén szintetizálásával az ismert DNS szekvenciát alkalmazva, a szekvencián alapuló standard klónozási technikákkal és újra izolálással a fehérje kimutatásával; pl. CD-4 kifejező sejtvonalakból való cDNS kiónok átfertőzése és azonosítás a fehérje ellen irányuló antitestekkel (lásd Maddon és munkatársai fentebb idézett munkáját).

Az adott sCD-4 fehérje kódoló szekvenciáját hordozó cDNS kiónokat oligonukleotid hibridizációs vizsgáló minták alkalmazásával azonosíthatjuk. Ezeket a vizsgáló mintákat a fehérje adott szekvenciájára alapozva tervezhetjük. Amikor azonosítottunk egy • ♦· · • · · · * ··« · ·· ·♦·· ··«

- 12 szóban forgó kódoló szekvenciát hordozó kiónt, a fehérje kódoló szekvenciáját kimetszhetjük restrikciós enzimek alkalmazásával és beiktathatjuk klónozó és/vagy kifejező vektorokba. Egy kifejező vektorban az sCD-4 fehérje kódoló szekvenciája operatívan össze van kapcsolva az átíráshoz, transzlációhoz és a kódoló szekvencia feldolgozásához szükséges vagy kívánatos szabályozó funkciókkal.

A jelen találmány kivitelezésénél E. coliban egy DNS kódoló szekvencia, amely a HÍV kötő fehérjét, pl. az sCD-4-et vagy származékait kódolja, operatívan össze van kapcsolva egy szabályozó elemmel egy DNS vektoron belül az E. coli transzformálásához. Számos gram negatív, ilyen szabályozó elemeket tartalmazó bakteriális kifejező vektor áll rendelkezésre. A szabályozó elem magában foglal egy promotort, amely hat az RNS polimeráz kötésre és átírásra. Szabályozható, pl. indukálható vagy depresszálható pro— motorok az előnyösek. Használható promotorok széles választéka áll rendelkezésre heterológ polipeptidek kifejezésére E. coliban. Ezek között találjuk a trp promotort és a lambda PL promotort £lásd pl. a 4,578,355 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírást, valamint Courtney és munkatársai közleményét: Natúré 313, 149 (1985)J· A szabályozó elem legelőnyösebben magában foglal egy vezető szekvenciát a HÍV kötő fehérje szállításához a sejtmembránra vagy azon keresztül, mivel a jelen találmány szerint felfedeztük, hogy a HÍV kötő fehérjét ki lehet választani. Az egyik vezető szekvencia, amelyről kimutatjuk, hogy fehérjét szállít ás az E. coli külső membránon a Bacillus licheniformis penicillináz génjének vezető szekvenciája £lásd Sarvas és munkatársai: J. Bacteriol. 155, 657(1983)J.

Példaként itt elsősorban a külső membrán A poliszacharid13 • ···· ·· ·· ···· ·· · · Jl · » · • · ··· · ··· • · · · · ··· ♦ ·· ···· ··· hoz tartozó vezető szekvenciát hozzuk fel, amelyet OMPA vezető szekvenciának vagy szignál szekvenciának neveznek j^lásd Mo.vva és munkatársai: J. Molec. Bioi. 143, 317(1980)J. Az OMPA kódoló szekvencia tartalmaz egy olyan vezető szekvenciát, amely alkalmas a

HÍV kötő fehérje kiválasztására a fermentációs közegbe. Azt már korábban felismerték, hogy az OMPA vezető szekvenciát lehet alkalmazni sokféle kis molekulatömegű fehérje vagy polipeptid kiválasztására a tenyésztő tápközegbe. így pl. az OMPA szignál szekvenciát alkalmazhatjuk, hogy az SKBsCD-4-en, V1J4-en és V1V2J4-en kívül nagy mennyiségű (pl. több, mint 1-10 mg/1) aktív humán transzformáló növekedési faktor-alfa (TGF-alfa), tumor nekrőzis faktor (TNF) és interleukin-1-béta (IL-1-béta) kiszállítását is elérhessük .

Az OMPA szignál lényegében az alábbi 21 aminosavat foglalja magában: N-met-lys-lys-thr-ala-ile-ala-ile-ala-val-ala-leu-alagly-phe-ala-thr-val-ala-glu-ala-C. Egy ilyen vezető szekvenciához való DNS kódoló szekvenciát szintetizálhatunk úgy, hogy egy vagy több restrikciós helyet helyezünk el a C—terminális aminosavval szomszédosán egy kívánt DNS kódoló szekvencia beiktatásához és úgy, hogy egy terminátor legyen elhelyezve a kívánt kódoló szekvenciától lefelé. A későbbi példákban bemutatunk egy szintetikus kódoló szekvenciát illusztrálás céljából.

A HÍV kötő fehérje mini-génen kívül, vagyis a szabályozó elemhez operatívan kötött kódoló szekvencián kívül a transzformáláshoz alkalmazott vektor előnyösen tartalmaz legalább egy fenotípusos transzformációs markert, pl. genetikai szelekciós markért, úgymint egy antibiotikum rezisztencia gént, egy kromogén szert vagy egy olyan gént, amely auxotróf mutációt egészít ki.

• ···· ·· ·· ···· •« · · Jf ⁹ · * • Φ *·· · ·»· • · · · * ··· « ·· ···· ··*

A vektor tartalmaz még autonóm replikádéhoz szükséges területeket is.

sCD-4 fehérjék E. coliban való kifejezéséhez alkalmas vektorok bemutatására szolgáló konstrukciókat részletesen írunk le a példákban. A fehérjék e tápközegbe fejeződnek ki és láthatóan megfelelően vannak tekeredve.

A jelen találmány kivitelezésénél Streptomycesben egy DNS kódoló szekvencia, amely a HÍV kötő fehérjét, pl. az sCD-4-et vagy származékait kódolja, operatívan össze van kapcsolva egy szabályozó elemmel egy DNS vektoron belül a Streptomyces transzformációjához. A szabályozó elem magában foglal egy promotort, amely hat az RNS polimeráz kötésre és átírásra. Szabályozható, pl. indukálható vagy derepresszálható promotorok az előnyösek. Sokféle alkalmas promotor áll rendelkezésre heterológ polipeptidek kifejezésére Streptomyceshez. Erre példaként említhetjük a Streptomyces galaktóz operon galaktóz-indukálható promotorját ^Fornwald és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2130(1987)J, ^a 8. lividans β -galaktozidáz gén konstitutív promotorját ^Eckhardt és munkatársai: J. Bacteriol. 169, 4249(1987); Brawner és munkatársai: 4,717,666 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírásj , és a S. longisporus tripszin inhibitor gént (87 307 260.7 számú európai szabadalmi bejelentés), vagy egy időlegesen szabályozott promotort, pl. azt, amelyről M. echinosporával kapcsolatban számoltak be^Baum és munkatársai: J. Bacteriol. 170, 71(1988)3· Az átírás befejezéséhez szolgáló területek Streptomycesben számos Streptomyces gén 3' végéről származhatnak, pl. lehet a Streptomyces galaktóz operon végénél levő terminációs szignál vagy az a szignál, amely a S. fradiae neomicin foszfo·· ···· • · · * · · • ♦·* · ··· « · · · • ·· ···· ···

- 15 transzferáz gén végénél található ^Thompson és Gray:

Acad. Sci. USA 80, 819O(1983)J. A fehérje kivitelére ···· ·

Proc. Natl.

szolgáló szekvenciák Streptomycesben lehetnek azok, amelyeket

S. lividans p -galaktozidáz génből, a S. lividans LEP-10 génből (87 307 260.7 számú európai szabadalmi bejelentés) és a S. longisporus trip szin inhibitor génből izoláltak.

Az sCD-4 gén be van építve egy nagyobb DNS molekulába, amely egy genetikai szelekciós marker rendszert tartalmaz. A szelekciós marker rendszer lehet a nagyszámú ismert marker rendszerek bárme lyike, úgy, hogy a marker gén szelektálható új fenotípust ad át a transzformált sejtnek. Példák lehetnek a Streptomyces gyógyszerrezisztencia gének, pl. a tiosztrepton rezisztencia riboszomális metiláz ^Thompson és munkatársai: Gene 20, 51 (1 982)Jneomicin foszfotranszferáz (Thompson és munkatársai, fentebb idézett munka), és eritromicin rezisztencia riboszomális metiláz (Thompson és munkatársai, fentebb idézett munka). A DNS molekula tartalmazhat egy Streptomycesben való autonóm replikálódást szolgáló szekvenciát, pl. a pIJ101 származékait ^Keiser és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 185, 223(1982)J, vagy egy SLP1 származék-vektort £j3ibb és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 184, 230(1981)J. A DNS molekula tartalmazhat egy olyan markert is, amely lehetővé teszi a gén-sokszoroződást. Az ilyen markerek, amelyek a gén kőpiaszám sokszorozását szolgálják Streptomycesben, magukban foglalják a streptomicin rezisztencia génjét f^Hornemann és munkatársai: J. Bacteriol. 169, 2360(1987)J és az arginin auxotrófiát ^Altenbuchner és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 195, 134(1984) .

A kiindulási kifejezési tanulmányoknál a CD-4 kódoló szekvenciát, amint az alábbi példákban részletesen leírjuk, a Ögal • ···« ·« ·· ···· ·· ······ • · ··» · ··· • · · · · ··· · ·· ···· ··· szignál szekvenciához fuzionáljuk a |3 gal szignál peptid hasítási helytől 8 aminosavhelyre lefelé elhelyezkedő helynél. A ötreptomyces replikáciős funkciókat ehhez a kifejező vektorhoz a plJ702 plazmid szolgáltat ja £katz és munkatársai: J. Gén. Microbiol. 129, 2703(1983)^, amely a pIJ101 származéka ^Keiser és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 185, 223(1982)J. Az alkalmazott gazdatörzs vad típusú 8. lividans 1326 ^Bibb és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 184, 230(1981 )J. A figal-sCD-4 fúziós fehérjét kimutatjuk mind a tenyészet felülúszóban, mind az ép sejtekben. A kísérletek egy másik sorozata azt mutatja, hogy az LTI promotort használhatjuk, hogy az sCD-4 fehérjék hatékonyabb kifejezését kapjuk meg.

Az LTI kifejező/kiválasztő vektorok analógok a p gal rendszerrel, amennyiben a gén kifejeződést az LTI promotor irányítja és a fehérje kijutást az LTI szignál peptid könnyíti meg. Egy sor HÍV kötő fehérje kódoló szekvenciáit klónozunk az LTI vektorba, ideértve a V^VpJ^-et és V^J^-et. Ezen fehérjék mindegyikének kódoló szekvenciáit az LTI szignál peptid hasítási helytől 8 aminosavval lefelé levő helynél iktatjuk be. A gal fúziókhoz hasonlóan az sCD-4 fehérjéket átvihetjük a tenyészet felülúszóba az LTI szignál peptid révén. A Streptomyces replikáciős funkciókat ismét csak a pIJ101 származékok: a pIJ702 és pIJ351 szolgáltatják (Keiser és munkatársai fentebb idézett munkája).

Az SKBsCD-4, V1J4 és V^VgJ^· kifejezést az LTI kifejező rendszerből először S.lividans 1326-ban vizsgáljuk. Mind az SKBsCD-4, mind a V^VgJA egyformán oszlik meg a tenyészet felülúszó és az ép sejtek között. Bár ezek a fehérjék nem szállítódnak ki tökéletesen, az intra- és extracelluláris formák, úgy tűnik, azonos molekulatömeggel bírnak SD8-poliakrilamid gélen való mozgékonysá-

- 17 guk alapján megítélve. Nem világos, vajon a szignál peptid proteolitikusan el van-e távolítva az intracelluláris formából. Az SKBsCD-4 maximális szintjeit 30 mg/l-re becsüljük a tenyészet felülúszóban és az ép sejtekben. A V^VgJ^ szinteket legalább 30 mg/l-re becsüljük (tenyészet felülúszó és ép sejtek).

Az sCD-4 kifejezésénél 8. lividansban szemben találjuk magunkat egy problémával: ennek fogékonyságával proteáz aktivitásokra. Ezt a problémát ki lehet küszöbölni vagy legalábbis jelentősen csökkenteni lehet az sCD-4 kifejezésével más Streptomyces fajokban. Az sCD-4 fehérjéket kifejezhetjük pl. 8. coelicolorban, 8. longisporusban és 8. albusban. Várható, hogy a molekula stabilitása fokozódik ezeket a megváltozott gazdaszervezeteket alkalmazva. Az sT4 fehérje kifejezése 8. longisporusban előnyös lehet, mivel ez a gazdaszervezet lényegesen kevesebb fehérjét választ ki a tenyészet felülúszóba, amely tény segít a tisztítási lépésben.

A jelen találmány kivitelezésénél élesztőben egy DN8 kódoló szekvencia, amely a HÍV kötő fehérjét, pl. az sCD-4-et vagy származékait kódolja, operatívan össze van kapcsolva egy szabályozó elemmel egy DN8 vektoron belül az élesztő transzformálásához. Bármilyen élesztő gazdaszervezetet, amely a transzformáló, klónozó és kifejező rendszerekhez hozzáférhető, alkalmazható. A megfelelő példák között találjuk a Hansenula, Pichia, Kluyveromyces, 8chizosaccharomyces, Candida és 8accharomyces nemzetségek élesztőit. Az előnyös élesztő gazdaszervezet a 8accharomyces cerevisiae.

A szabályozó elem magában foglal egy promotort, amely hatással van az RN8 polimeráz kötésre és átírásra. Előnyösek a szabá• · • · ··· · ·*· • · · · · «·« * ·· «······

- 18 lyozható, vagyis indukálható vagy derepresszálható promotorok. Sokféle alkalmas promotor áll rendelkezésre heterológ fehérjék kifejezésére élesztőben. Ezek között találjuk a rézzel indukálható metallotionein gén (CUP1) promotort és a gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz (TDH3) és alkohol dehidrogenáz (ADH) glikolitikus gének konstitutív promotorát. Az átírás befejezéséhez szolgáló területek az élesztőben sokféle élesztő gén bármelyikének 3’ végéről származnak, ilyen pl. az izo-1-citokróm C (CYC1) génje.

Az sCD—4 gén egy nagyobb DNS molekulába van beépítve, amely egy genetikai szelekciós marker rendszert tartalmaz. A szelekciós marker rendszer lehet egy sor ismert marker rendszer bármelyike, pl. olyan marker gén, amely szelektálható új fenotípust ad át a transzformált sejtnek. A példák közt találjuk a bioszintetikus enzimekhez tartozó élesztő géneket, pl. a foszfo-ribozil antranilát izomerázt (TRP1) vagy orotidin-5'-foszfát dekarboxilázt (URA3) vagy a heterológ gyógyszer-rezisztencia géneket, mint a G419 rezisztencia vagy benomil rezisztencia (BEN1) géneket. A DNS molekula tartalmazhat továbbá egy szekvenciát élesztőben való autonóm replikációhoz, pl. az élesztő 2 mikronos köralakú őri területét; vagy egy kromoszomális autonóm replikációs területet (ARS), pl. ARS1-et, és egy élesztő centromérát (CEN), pl. CEN3at, hogy lehetővé váljék a plazmid autonóm replikációja.

Az előnyös kifejező rendszerben a HÍV kötő fehérje kódoló szekvencia egy olyan kódoló szekvenciához van fuzionálva, amely stabilizálja a kifejeződést, mivel azt már korábban felfedezték, hogy az SKBsCD-4 egyedül gyengén fejeződik ki; az ilyen gyenge kifejeződés a nem eléggé hatékony átírásnak és transzlációnak vagy a gyors fehérjelebomlásnak tulajdonítható. Bármely esetben

- 19 kimutatjuk, hogy egy gén-fúzió terméke, amelyben egy ubikvitin kódoló szekvenciája az SKBsCD-4 kódoló szekvenciájához van fuzionálva az 5' végnél, viszonylag magas szinten fejeződik ki és elhasad, ubikvitint és az sCD-4 génterméket termelve.

Egy ubikvitin DNS kódoló szekvenciát izolálhatunk élesztőből vagy más eukarióta sejtből, beleértve az emlős sejteket, standard gén klónozó technikákkal. Egy másik módszer szerint ezt ismert technikákkal szintetizálni lehet. A moduláris ubikvitin gén, amelyet a szóban forgó találmány bemutatására alkalmazunk, nukleotid szekvenciája az, amelyet Ecker és munkatársai írnak le £<J. Bioi. Chem. 262, 3524(1 987)J. A szekvencia lényegében az alábbi: AATTCATTATGCAGATCTTCGTCAAGACGTTAACCGGTAAAACCATAACTCTAGA AGTTGAATCTTCCGATACCATCGACAACGTTAAGTCGAAAATTCAAGACAAGGAA GGCATTCCACCTGATCAACAAAGATTGATCTTTGCCGGTAAGCAGCTCGAGGACG GTAGAACGCTGTCTGATTACAACATTCAGAAGGAGTCGACCTTACATCTTGTCTT AAGACTAAGAGGTGGTTGAGGTAC

Egy szignál peptid DNS szekvenciáját beiktatva a HÍV kötő fehérje 5' végénél elérhetjük a fehérje kiválasztását a tenyész-

tő tápközegbe.	Az erre a célra használható szignál szekvenciák
pl. az élesztő	párosodási faktor szignál szekvenciája, az alfa
faktor £Kurjan	és Herskowitz: Cell 30., 933(1982)J. Ezen kívül

kifejeződést érhetünk el az sCD-4 élesztő sejt kifejező modul integrálásával élesztő kromoszómába, amelyet sokszorozás követ, olyan markereket alkalmazva, mint pl. az élesztő DHFR gén₍ a megnövekedett kópiaszám szelektálására.

Általában a jelen találmány sCD-4 fehérjéit a felhasznált tenyészközegből tisztíthatjuk, különböző fehérjetisztítási technikákat alkalmazva, így pl. affinitáskromatográfiát, ion- 20 cserélő kromatográfiát, hidrofób kromatográfiát vagy fordított fázisú kromatográfiát.

Az sCD-4-et, fragmentumait és származékait affinitáskromatográfiával tisztíthatjuk általános csoport-specifikus adszorbenseket alkalmazva, pl. szénhidrát kötést vagy festék affinitás ligandumokat; vagy olyan ligandumokat alkalmazva, amelyek fajlagosan kötődnek sCD-4-hez, pl. monoklonális antitest vagy HÍV gp120 fehérje vagy ezek részei.

A tisztítás a sejtek szelektív tápközegeken 28-45°C hőmérsékleten végzett növesztése után az alábbiakból' áll: a fermentációs tápközeg derítése, majd a HÍV kötő fehérje elkülönítése a tápközegben jelen levő többi fehérjétől. Az előnyös eljárásban az sCD-4 fehérjéket a tenyészközegből kromatográfiás lépések sorozatát alkalmazva tisztítjuk, amelyek az sCD-4 molekula tulajdonságain alapulnak.

Az sCD-4 fehérjék tisztításának egy másik módszere magában foglalja az sCD-4 ellen irányuló monoklonális antitestek alkalmazását. A fehérjét egy lépésben tisztíthatjuk a derített tenyésztő tápközeg átengedésével egy affinitás gél rögzítőanyagon, amelyre a fehérje ellen irányuló monoklonális antitest kötve van. A szóban forgó fehérje az antitest kötőhelynél az oszlopra kötődik, míg a szennyező fehérjék keresztülhaladnak az oszlopon. A fehérjét azután eluáljuk az oszlopról olyan körülmények között, hogy az inaktiválást megakadályozzuk.

Az sCD-4 fehérjék in vitro biológiai és immunológiai tulajdonságainak jellemzése azt jelzi, hogy a fehérjék értékesek az AIDS megelőzésében és kezelésében. A tanulmányok azt jelzik, hogy az sCD-4 fehérjék úgy működnek, mint a vírus extracelluláris és

vírusról-vírusra való terjedésének inhibitorai. Mivel a jelen találmányban leírt sCD-4-ről, fragmentumairól és származékairól kimutatjuk, hogy gátolja a vírus kötését a CD-4⁺ célsejtekhez tenyészetben, úgy véljük, hogy ezeknek a fehérjéknek a beadása fertőzött személyeknek úgy működik, hogy gátolja a vírus extracelluláris elterjedését. Ennek megfelelően az sCD-4 fehérjék értékesek mind megelőző, mind terápiás szerként AIDS vagy AIDS-sel kapcsolatos komplex (ARC) kezelésében.

Megelőző (profilaktikus) szerként az sCD-4 fehérjéket azoknak az egyéneknek adjuk be akiknek nagy kockázata van ehhez a betegséghez, vagy olyan egyéneknek, akikről kimutatjuk a HIV-nek való kitettséget a vírus elleni antitestek jelenlétével. A fehérje hatékony mennyiségének beadása a betegség korai stádiumában vagy ennek megjelenése előtt úgy működik, hogy gátolja a CD-4⁺ limfociták HÍV általi fertőzését. Terápiás anyagként alkalmazva az sCD-4 beadása HIV-vel fertőzött személyeknek gátolja a vírus extracelluláris elterjedését.

A fúzió a HIV-vel fertőzött sejtek és más CD-4⁺ limfociták között, úgy tűnik, szintén útja lehet a vírus elterjedésének. Sőt, a fúzió lehet felelős részben a CD-4⁺ limfocita funkció csökkenéséiért és végül a CD-4⁺ limfociták elfogyásáért, a fertőzött egyénekben. A sejtfúzió függ mind a vírus burkolat géntermékektől, mind a CD-4 receptortól és gátolva lehet az 0KT-4A-val, vagy hasonló monoklonális antitestekkel (Mab) ^Sattentau és munkatársai: Science 234, 1120(1986)]. Az itt leírt sCD-4 fehérjék akadályozzák a sejtfúziót és ezáltal csökkentik a vírus sejtről-sejtre terjedését és a CD-4⁺ limfocita funkció veszteségét.

A CD-4 receptor monomorf és így az sCD-4 fehérjékről úgy

véljük, hogy mindazoknak a vírusoknak univerzális gátlóanyagai, amelyek felismerik a CD-4 receptor felületi tartományát, tehát a HIV-nek is.

Az sCD-4 fehérjéket alkalmazhatjuk más szerekkel kombinálva is,, pl. más, HÍV fehérje ellen irányuló szerekkel összekapcsolva, pl. reverz transzkriptázzal, proteázzal vagy tat-tál. Egy HÍV elleni hatásos terápiás szer megelőzheti a fertőzés vírus-közvetítette, valamint sejtről-sejtre való átterjedését. Az sCD-4 fehérjéket alkalmazhatjuk más antivirális szerekkel pl. azidotimidinnel (AZT) kombinálva is.

A jelen találmány szerinti sCD-4 fehérjék hasznosítást nyerhetnek CD-4⁺ sejtműködés gátlóanyagaiként is extracelluláris célmolekulákhoz kötődve, amelyek normálisan kölcsönhatásba lépnek a CD-4 receptor felületi tartományával. Számos tanulmány sugallja a CD-4-receptor kritikus szerepét az immun-tűrőképességben, főleg £ az autoimmun betegségek patogenezisében és kifejlődésében és a gazdaspecifikus átültetés visszautasításában.

Profilaktikus vagy terápiás szerként az sCD-4 fehérjéket beadhatjuk parenterálisan, előnyösen intravénásán. A szert beadhatjuk infúzióval vagy injekcióval, pl. naponta, hetenként vagy hónaponként. A beadás mennyiségét és gyakoriságát úgy választjuk ki, hogy sCD-4 fehérje hatékony mennyisége maradjon fenn a vérkeringésben. A beadás egy másik módja lehet a testen kívüli kezelés, az sCD-4 fehérjéket dializálőszerként alkalmazva.

A jelen találmány szerinti sCD-4 fehérjét alkalmazhatjuk reagensként is, hogy azonosítsuk azokat a természetes, szintetikus vagy rekombináns molekulákat, amelyek terápiás szerként vagy a CD-4⁺ sejt kölcsönhatások gátlóanyagaiként működnek.

• ·· ·· · · ·· · ··· ·· ······ • · ··· · ··« • · · · · • ·· · ·· ······· így pl. az sCD-4 fehérjéket alkalmazhatjuk átvizsgáló vizsgálatokban, pl. fehérje kölcsönhatási vizsgálatokban ELISA-n alapuló módszerekkel mérve, hogy biokémiailag tiszta, vizes oldható reagenst kapjunk, amelyet más reagensekkel kombinálva alkalmazhatunk, hogy megvizsgáljuk a CD-4 receptor felületi tartomány kölcsönhatások versengő anyagait. így pl. mivel az sCD-4 fehérjék a HÍV env fehérjéhez vagy HÍV env fehérjéket tartalmazó keverékekhez kötődnek, a fehérjéket alkalmazhatjuk a vírus-kötés gátlóanyagainak átvizsgálásához.

Az in vitro adatokra alapozva, amelyek azt mutatják, hogy az sCD-4 fehérjék kötődnek HÍV env fehérjéket kifejező sejtekhez, ezek a fehérjék szolgálhatnak szelektív célzó molekulákként is HIV-vel fertőzött sejtekhez in vivő. Célspecifikus hordozó fehérjeként az sCD-4 fehérjék szolgálhatnak pl. hordozó fehérjeként citotoxikus szerek szolgáltatására a fertőzött sejtekhez.

Ezen kívül azokra az adatokra alapozva, amelyek azt mutatják, hogy a CD-4 receptor fajléagosan társul az MHC II. osztályú antigénekkel az antigén-szolgáltató sejteken, amint ezt a CD-4⁺ sejtek osztály-restrikciója sugallja, az sCD-4 fehérjéket alkalmazhatjuk a II. osztályú antigénekkel kombinálva, hogy megvizsgáljuk CD-4 limfocita-célsejt kölcsönhatások inhibitorait. Ezeken a példákon kívül, amelyek a közvetlen kötési vizsgálatokon alapulnak a fehérje és célmolekulái között, komplexebb vizsgálatokat is tervezhetünk, amelyek a fehérje felismerésre való biokémiai válaszokon alapulnak. A kiiktatásos (deléciós) mutánsokat alkalmazhatjuk diagnosztikai vizsgálatokban CD-4 fehérjék kimutatására vagy olyan molekulák kimutatására, amellyel ezek kölcsönhatásba lépnek. így pl. CD-4 és CD-4⁺ sejtek és CD-4 elleni an24 • ···· ·· ·· ···· • · ·· ·· · · • · ·· · · ··· • ♦ · · · ··· · ·· ······· titestek mennyiségi becslése diagnosztikus értékű az AIDS-nél.

Ezen kívül az sCD-4 fehérjéket alkalmazhatjuk új diagnosztikus reagensek kialakítására, pl. Mab-k vagy más típusú molekulák kialakítására standard immunológiai vizsgálatokban való felhasználáshoz, pl. ELISA-ban, befogásos immunassay-ban, radioimmunassayban. Mivel az sCD-4 mutatja az 0KT-4-et, az 0KT-4A-t és a CD-4 legtöbb, ha nem éppen összes felületi epitópját, a fehérjék különösen hasznosak immundiagnosztikai vizsgálatokban a CD-4 szint abszolút mennyiségének megállapítására a rendszerben.

A CD-4 receptorban három eltérő kémiai környezet található: az oxidáló, hidrofil sejtfelület; a hidrofób membrán; és a redukáló, hidrofil citoplazma. Ezek az eltérő környezetek a legvalószínűbben kizárják a receptor izolálását teljesen natív állapotában. Az sCD-4 fehérjék, amelyek az extracelluláris tartománynak csupán kiválasztott szegmenseit tartalmazzák, oldható fehérjeként válnak ki a sejt felülúszőba és konformációjuk, úgy tűnik, jelentős mértékben utánozza a receptor felületi tartomány felületét. így az sCD-4 fehérjék alkalmasak a részletes szerkezeti elemzésre, főleg röntgensugár krisztallográfiához. Az sCD-4 fehérjék három dimenziós szerkezetének meghatározása egyedül vagy komplex formában más kölcsönható molekulákkal alapot szolgáltathat sCD-4-re való szelektív antagonisták vagy agonisták racionális tervezéséhez.

Példák

Az itt következő példák bemutató jellegűek, és nem korlátozó jellegűek a találmányra vonatkozóan. A genetikai manipulációkhoz alkalmazott enzimeket kereskedelmi forrásból szerezzük be és lényegében a kereskedő útmutatásai szerint alkalmazzuk. Hacsak más·· ···· . 9 9 9 9 99 9 9

9 999 9 9·9

9 9 9 9

999 » · · ·······

- 25 képpen nem jelezzük, az eljárásokat lényegében úgy hajtjuk végre, amint azt Maniatis és munkatársai leírták £ Mólecular Cloning;

Cold Spring Harbor Laboratory (1982)J.

1. példa: E. coli kifejező vektorok megalkotása

Rekombináns DNS manipulációkat alkalmazva a teljes hosszúságú SKBsCD-4 és a V1V2J4 vagy V1J4 kiiktatásos mutánsok kódoló szekvenciáját amelyeket azonos keretben levő TAA terminációs kodon követ (lásd a fentebbi szekvenciát) egy E. coli kifejező vektorban helyezzük el az OMPA szignál szekvenciától lefelé, hogy megalkossuk az 0MPAST4BBV1, 0MPAV1V2 és 0MPAV1 plazmidokat. Ezeknek a vektoroknak a konstrukciója az alábbi:

A JRT4 plazmid megalkotása. Abból a célból, hogy a JRT4 plazmidot megalkossuk, a DSP1 plazmidot£ Pfarr és munkatársai: DNS 4, 461 (1985)J elhasítjuk Xhol-gyel, az SV40 poliA korai területet kiiktatjuk, és az Xhol helyeket betöltjük DNS polimeráz Klenow framgentumot alkalmazva. A szarvasmarha növekedési hormon (BGH) poliadenilező területet £ Pfarr és munkatársai: DNA 5., 115 (1986)2 elhasítjuk PvuII -vei és KpnI-gyel és a KpnI helyet tompa végűvé tesszük T4 DNS polimerázzal végzett kezeléssel. Ezt a 230 bp-s fragmentumot DSP1-hez ligáijuk, hogy megalkossuk a DSP1 BGH-t.

A DSP1BGH-t Smal-gyel és Sall-gyel elhasítjuk és a galK kazettát (amely az SV40 korai promotort, a galK kódoló területet és a BGH poliA területet tartalmazza), pUC19-be £Yanisch-Perron és munkatársai: Gene 33, 103(1985)2 ligáijuk a Sáli helynél egy Sáli véget, egy -BglII helyet és egy Smal véget tartalmazó szintetikus kapcsolót alkalmazva. Ez a három részes ligálás eredményezi a DSP1BZBGH.JT plazmidot.

··· ···· • · ··

- 26 A DSP1BZBGH.JT-t, amelyet Stul-gyel és BclI-gyel hasítunk, hogy a galK kódoló területet kiiktassuk, egy 1,7 kb-s EcoRI (betöltött) BamHI fragmentumba ligáijuk, amely tartalmazza pT4B plazmádból eredő CD-4 cDNS-t ^Maddon és munkatársai: Cell 42, 93(1985)J, így alkotjuk meg a JRT4 plazmidot.

A pUCsT4 megalkotása. Abból a célból, hogy a pUCsT4 plazmidot megalkossuk, a pT4b-ből való CD-4 cDNS egy Haell-Hpall fragmentumát (1125 bp) ligáijuk szintetikus kapcsolók alkalmazása segítségével a pUC18 vektorhoz, amelyet előzőleg KpnI-gyel és Xbalgyel hasítottunk. A CD-4 cDNS Haell végét a pUC18 KpnI helyéhez ligáljuk KpnI és Haell végekkel rendelkező szintetikus kapcsolót alkalmazva. A CD-4. cDNS Hpall végét a pUCl8 Xbal helyéhez ligáljuk egy Hpall véggel és Xbal véggel rendelkező szintetikus kapcsolót alkalmazva. Ez a kapcsoló beiktat egy TAA stop kodont is a CD-4 kódoló terület 1257. nukleotidja után. Az így létrejövő plazmid a pUCsT4.

A pST4sal megalkotása. Abból a célból, hogy a pST4sal plazmidot megalkossuk, a JRT4 plazmidot BglII-vel és Sacl-gyel hasítjuk és egy 959 bp-s fragmentumot (amely az SV40 korai promotort éa a CD-4 cDNS első 602 nukleotidját tartalmazza) izoláljuk. A pUCsT4 plazmidot Sacl-gyel és Xbal-gyel hasítjuk és egy 660 bp-s fragmentumot (amely a CD-4 cDNS-t tartalmazza a 603.-1257. nukleotidok között, ezt követi a szintetikus kapcsolónál a TAA kodon) izolálunk. Ezt a két fragmentumot DSP1BZBGH.JT-be ligáljuk, amelyet előzőleg BglII-vel és Xbal-gyel hasítottunk, hogy kiiktassuk az SV40 korai promotort és a teljes hosszúságú CD-4 kódoló területet. Az így létrejövő plazmid a pST4sal.

pST4DHFR megalkotása. Abból a célból, hogy a pST4DHFR plaz-

- 27 midot megalkossuk, egy p -globin DHFR kifejező kazettát tartalmazó BglII-BamHI fragmentumot ligálunk a pST4sal BamHI helyébe.

···· »··«

A β -globin-DHFR kifejező kazetta az alábbiakat tartalmazza: az egér p-globin promotort (550 bp-s HincII fragmentum a pPK288 plazmidból^£Berg és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 3., 1 246(1983)J, 5’ végén egy szintetikus kapcsolóval módosítva, hogy tartalmazzon egy BglII helyet; az egér DHFR kódoló területet £735 bp-s HindlII (betöltött) fragmentum a pSVL-DHFR plazmidból, lásd Subramani és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 1_, 854(1981)J; Nhel (betöltött)-BamHI (betöltött) SV40 poliA korai terület a DSP1-bői £Pfarr és munkatársai: DNA 4, 461(1985)3; éa az egér DHFR terminális területet £907 bp-s HIndIII(betöltött) fragmentum az mDH9 plazmidból, lásd Fragne és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 4^, 2921.^1984)J 3’ végén egy szintetikus kapcsolóval módosítva, hogy BamHI hely alakuljon ki.

pST4BBV1DHFR megalkotása. Abból a célból, hogy megalkossuk a pST4BBV1DHFR plazmidot, a pST4DHFR plazmidot EcoRI-gyel és Xbal-gyel hasítjuk és a kisebb fragmentumot, amely az sCD-4 kódoló területet tartalmazza, kiiktatjuk. Az sT4sal plazmidot Xbalgyel és BbvI-gyel hasítjuk és egy 1120 bázispáros kódoló fragmentumot, amely az oldható CD-4 mínusz a vezető terület szekvenciáját tartalmazza, izolálunk. Ezt a fragmentumot az EcoRI/Xbalgyel hasított p8T4DHFR-hez ligáijuk egy EcoRI véggel, egy KpnI helylyel és egy Bbvl véggel bíró szintetikus kapcsolót alkalmazva. Ez a fragmentum a fentebb izolált sCD-4 fragmentumon levő Bbvl tólnyúlással hasonlítható össze. Az így létrejövő plazmidot pST4

BRV1DHFR-nek nevezzük.

Az 0MPA8T4 megalkotása. Abból a célból, hogy megalkossuk az ···· ·· ·· · ··· • · · * · · • ·* · · ··· • · · · • ·· ·*·····

0MPAST4 plazmidot, az OMPA.GS plazmidot Ncol-gyel és Sall-gyel emésztjük és a kapcsoló területet tartalmazó kisebb fragmentumot kiiktatjuk. Az OMPA.GSapASI származéka ^Rosenberg és munkatársaiMeth. Enzymol. 101, 123(1993); 4,578,355 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírásj , amely egy szintetikus szekvenciával bír a cll riboszóma kötő szekvencia 3’ végénél levő Ndel helynél beiktatva. A szintetikus kapcsoló tartalmazza az OMPA vezetőt, amelyet egy többcélú kapcsoló (polilinker) szekvencia követ.

A szintetikus szekvencia lényegében a következő:

5' -T	ATG	AAA	AAG	ACA	GCT ATC	GCG	ATT	GCA GTG	GCA	CTG	GCT
GGT	TTC	GCT	ACC	GTA	GCG CAG	GCC	GGC	TCT AGA	GTC	GAC	CTA
GTT	AAC	TAG	-3'
A	pUCsT4	plazmidot	Ncol-gyel	és Sall-gyel	hasítjuk	és az

sCD-4 szekvenciát (124.-1257. CD-4 nukleotidok) tartalmazó 1149 bázispáros fragmentumot izoláljuk. Ezt a fragmentumot az Ncol/ Sall-gyel hasított OMPA.GS-be ligáijuk, hogy megalkossuk az OMPA ST4-et

Az 0MPAST4BbvI megalkotása. Abból a célból, hogy megalkossuk az 0MPAST4BbvI plazmidot, az 0MPAST4-et hasítjuk Nael-gyel és Xbal-gyel. A kisebb fragmentumot, amely ebből a hasításból származik, és amely az sCD-4 kódoló területet tartalmazza, kiiktatjuk. Az ST4BBV1DHFR plazmidot KpnI-gyel hasítjuk és a létrejövő 3' túlnyúlást tompa végűvé tesszük T4 DNS polimerázzal. A tompa végű DNS-t azután Xbal-gyel hasítjuk és az 1124 bázispáros fragmentumot, amely a CD-4 cDNS 145.-1257. nukleotidjait tartalmazza, izoláljuk. Az izolált fragmentumot a Nael/Xbal-gyel hasított 0MPAST4 plazmidhoz ligáijuk, hogy megalkossuk az 0MPAST4BbvI plazmidot.

• ···« ·· ··> ···· ·· · · t * · * • · ··· · ·*»

A puc8T4l84 megalkotása. Abból a célból, hogy a pucST4184 plazmidot megalkossuk egy, a CD-4 cDNS-ből származó EcoRI-Nhel fragmentumot £egy 682 bp-s fragmentum, amely a (-25)-től (+176)ig terjedő aminosavakat kódoljaj sk727/725 szintetikus kapcsolóhoz (Nhel és Aval végekkel) ligáijuk az Nhel helynél. Az sk727/ 725 a CD-4(177.-183.) aminosavait kódolja. Az sk727/725 Aval végét a pucST4 Aval-Xbal fragmentumához ligáijuk (amely a humán C.DNS 1198.-1257. bázispárjait tartalmazza és a CD-4 receptor 351.-369. aminosavait kódolja; ezt egy TAA terminációs kodon követi). Ezt a szekvenciát, amelyet EcoRI és Xbal végek követnek^ beiktatjuk pUC19-be a pUC19 polilinkerben levő EcoRI és Xbal végeknél (sk727/725). Az sk727/725 lényegében az alábbi:

5'-ctagctttccagaagggcc-3'

3'-gaaaggtcttccggagcc-5'.

A pucST4106 megalkotása. Abból a célból, hogy a pucST4lO6 plazmidot megalkossuk, a CD-4 cDNS EcoRI-AvalI fragmentumát £ amely az 1.-413· bázispárokat tartalmazza és a (-)25-97 aminosavakat kódoljaj egyesítjük az sk791/792 szintetikus kapcsolóval (AvallAval végek) az Avall helynél. Az sk791~792 a CD-4 88.-104. aminosavait kódolja. Az sk 791/792 Aval végét a pucST4 Aval-Xbal fragmentumához ligáijuk (amely a humán cDNS 1198-1257 bázispárjait tartalmazza, és a CD-4 receptor 351.-369. aminosavait kódolja, amelyet egy TAA terminációs kodon követ). Ez a szekvencia, amelyet EcoRI és Xbal végek szegélyeznek, pUC19-be van beiktatva az EcoRI és Xbal végeknél a pUC19 polilinkerben,A.z sk791/792 lényegében az alábbi:

5’-gaccagaaggaggaggtgcaattgctagtgttcggattgactgccaac gtcttcctcctccacgttaacgatcacaagcctaactgacggtt,gagc-3·’ · ···

- 30 sT4184.DHFR megalkotása. Abból a célból, hogy az sT4184.

DHFR-t megalkossuk, a pucST4l84 EcoRI-Xbal fragmentumát (amely a

-25.-183· aminosavakat kódolja a 351.-369.-hez fuzionálva) ligáljuk a psT4.DHFR EcoRI és Xbal végeihez az SKBCD-4-et kódoló

EcoRI-Xbal fragmentum helyébe.

Az sT4106.DHFR megalkotása. Abból a célból, hogy az sT4106. DHFR plazmidot megalkossuk, a puc8T4l06 EcoRI-Xbal fragmentumát (amely a -25.-104. aminosavakat kódolja a 351.-369.-hez fuzionálva) ligáijuk a psT4.DHFR EcoRI és Xbal végeihez az SKBcCD-4-et kódoló EcoRI-Xbal fragmentum helyett.

Az 0MPAV1 megalkotása. Abból a célból, hogy az 0MPAV1-et megalkossuk, az 0MPAST4BbvI plazmidot AflII-vel és Xbal-gyel hasítjuk és a CD-4 cDNS kódoló terület 371.-1257. nukleotidjait tartalmazó kisebb fragmentumot kiiktatjuk. A pst4106.DHFR plazmidot AflII-vel és Xbal-gyel hasítjuk és egy 160 bázispáros fragmentumot, amely a CD-4 cDNS szekvencia 371.-459 és 1198.-1257. nukleotidjait tartalmazza, izolálunk. A két fragmentumot ligáljuk, így alkotjuk meg az 0MPAV1 plazmidot.

Az 0MPAV1V2 megalkotása. Abból a célból, hogy az 0MPAV1V2-t megalkossuk, az 0MPAST4BbvI plazmidot 8acl-gyel és Xbal-gyel hasítjuk és a kisebbik fragmentumot, amely a CD-4 cDNS szekvencia 603.-1257. nukleotidjait tartalmazza, kiiktatjuk. Az ST4184.DHFR plazmidot Sacl-gyel és Xbal-gyel hasítjuk és egy 164 bázispáros fragmentumot, amely a CD-4 cDN8 szekvencia 603.-696. és 1198.-1252. nukleotidjait tartalmazza, izolálunk. A két fragmentumot ligáljuk, hogy megalkossuk az 0MPAV1V2 plazmidot.

2. példa. sCD-4 fehérjék kifejezése E. coliban

Az 0MPAV1 és 0MPAV1V2 konstrukciókat AR58 (cI857) és AR120 defektív E. coli lambda lizogénekbe transzformáljuk standard járásokat alkalmazva. Hőindukciót j^Rosenberg

Enzymol. 101 , 123(1983)J vagy nalidixinsavas -munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, és munkatársai:

elMeth.

indukciót ^Mott

88(1995)J alkalmaés zunk, amint az alábbiakban leírjuk.

Hőindukció. Az AR58 sejtvonalnál 200 ml

LB tápközeget (amely OMPAV1 vagy

Mg/ml ampicillint is tartalmaz) beoltunk 0MPAST4Bbv1 X’ÓMPAVIV2 egy é .1 szakán át nőtt plazmidot tartalmazó AR58 sejtelN7 ml-es tenyészetével, és rázó inkubátorban növesztjük 32°C hőmérsékleten. 650 nm-nél mért 0,8 abszorbancia egységnél^ Οϋθ^θ) 200 ml 35°C hőmérsékletre felmelegített LB tápközeget adunk a tenyészethez és a lombikot 42°C hőmérsékletű rázó inkubátorba visszük át. A tenyészet 1 ml-es min táit vesszük ki elemzésre a 30., 60. és 90. percben a hőmérsék let váltástól számítva. A 90. percben a sejteket 15 percen át hűtjük jeges vízben és azután üledékbe visszük 3500 fordulat/perccel 15 percen át 4°C hőmérsékleten centrifugálva J-6 Beckman centrifugában (Beckman Instruments, Fullerton, Kalifornia). A sejtüledékekekt -20°C hőmérsékleten tároljuk a feldolgozásig. A kondicionált tápközeget -20°C hőmérsékleten fagyasztva tároljuk.·

Nalidixinsavas indukció. Az AR120 sejtvonalnál 400 ml LB tápközeget (amely 50jWg/ml ampicillint is tartalmaz) beoltunk 0MPAST4Bbv1, 0MPAV1 vagy 0MPAV1V2 plazmidot tartalmazó AR120 sejegy éjszakán át nőtt tek 20 ml-es , V tenyészetéből vett 13 ml sejttel, és rázó inkubátorban növesztjük 37°C hőmérsékleten. 0,4 ΟΏθ^θ értéknél 400 ml nalidixinsavat (50 mg/ml) adunk a tenyészethez. A tenyészetet 37°C hőmérsékleten tartjuk rázó inkubátorban és 1 ml-es mintákat veszünk a nalidixinsav beadásától számított 1., 3· és 5· órában.

Az 5· órában a sejteket 15 percig hűtjük jeges vízben, majd 3500 λ

···· ·· ·· ···· • · ····· • · ··· * ··· • · · · · •·· · ·· ···· ···

- 32 fordulat/percnél üledékbe visszük 15 perc alatt 4°C hőmérsékleten

J6 Beckman centrifugában. A sejtüledéket fagyasztva tároljuk -20°C hőmérsékleten feldolgozásig. A kondicionált tápközeget -20°C hőmérsékleten fagyasztva tároljuk a feldolgozásig.

Az indukciót követően a sejteket 1 ml-es mintákból üledékbe visszük és elemezzük a teljes hosszúságú és mutáns sT4 fehérjék (SKBsCD-4, V1J4 és V1V2J4) jelenlétére Western-folt elemzéssel, baktériumokban termelt oldható T4 denaturált formája elleni nyúl poliklonális antitestet alkalmazva. Megfelelő méretű fehérjéket mutatunk ki mind a hővel, mind a nalidixinsavval indukált minták sejt-lizátumaiban. A kimutatott szintek a teljes fehérje 1-5 %át képviselik.

A kondicionált tápközeg feldolgozása. A fagyasztott kondicionált tápközeget szobahőmérsékleten felengedtetjük és 30 ml alikvotokat veszünk, majd 4°C hőmérsékleten 1 órán át centrifugáljuk 24000 fordulat/percnél Beckman SW28 rotorban. A centrifugálást követően a felülúszőkat összegyűjtjük és 10-20-szorosra koncentráljuk 4°C hőmérsékleten membrános nyomószűréssel.

A koncentrált tápközeget teljes hosszúságú 8KBsCD-4, V1J4 vagy V1V2J4 fehérjékre vizsgáljuk Western folt elemzéssel (akárcsak fentebb), versengő ELI8A-val és immun-kicsapással.

Az egyes mintákban a megfelelő méretű fehérjét a koncentrált, kondicionált tápközegben Western-folt elemzéssel mutatjuk ki olyan szinten, amely 1-5 %-át képviseli (0,1-0,5 ng/ml nem koncentrált tápközeg) a sejt belsejében kimutatott fehérjének. Mind a három fehérje kötődik 0KT4A-hoz a versengő ELISA vizsgálatban. A V1J4 és V1V2J4 fehérjéket tovább elemezzük CD-4 elleni monoklonális antitestek paneljével (Ortho, Rariton, New Yersey) végzett immun·· ···· • · · • ··· ······ • · · · •··· ··4 • 4 ···· ··· kicsapással. Az 0MPAV1 által kifejezett fehérjét, a V1J4-et az 0KT4A és 0KT4D kicsapja, de az 0KT4, 0KT4B, 0KT4C, 0KT4E vagy 0KT4F nem csapja ki. Az 0MPAV1V2 által kifejezett fehérjét, a V1V2 J4-et az összes 0KT4 monoklonális antitest kicsapja az 0KT4 kivételével. Ezen kívül ennek a fehérjének az affinitása az 0KT4C-hez kisebb, mint a többi monoklonális antitesteké.

Sejtüledék feldolgozás. Az 0MPAST4Bbv1/AR58 hőindukció 90 perces időpontjából származó sejtüledékeket jégen felengedtetünk, pufferban£ 100 mmól/1 trisz.HCl(pH 8), 0,5 mmól/1 EDTA és 0,5

ml üledék/puffer arányban. Lizozimot £^10 mg/ml 0,5 mól/1 trisz.Hűiben (pH adunk hozzá 0,2 mg/ml végső koncentrációban és a szusz penziót jégen inkubáljuk 15 percen át. Azonos térfogatú jéghideg vizet adunk hozzá és a szuszpenziót jégen inkubáljuk 15 percen át. PMSF-et (50 mmól/1) adunk hozzá 1 mmól/1 végső koncentrációban, ezt követi MgClg (1 mól/1) hozzáadása 2 mmól/1 végső koncentráci óra. A sejtszuszpenziót háromszor átengedjük egy 18. kaliberű tűn, hogy a viszkozitást csökkentsük, majd 20 000 g-nél, 4°C hőmérsékleten centrifugáljuk.

/

A centrifugálást követően az üledéket újra szuszpendáljuk mmól/1 trisz.HCl-t (pH 8), 5 mmól/1 EDTA-t és 5 mmól/1 p ME-t tartalmazó oldatban olyan térfogatban, amely a centrifugálás előtti térfogattal ekvivalens. A szuszpenziót ultrahangos kezelésnek vetjük alá 60 másodpercig (10 másodperces löketek, köztük 30 másodperccel hűtés mellett), majd 20000 g-nél centrifugáljuk 15 percig 4°C hőmérsékleten. Az így létrejövő üledék és felülúszó Western folt vizsgálata azt jelzi, hogy az SKBsCD-4 fehérje 70 %-a a felülúszó frakcióban van. A felülúszó frakciót 100000 g-nél ···· ·· ·· ···· • · · · · · • ··· · ··· • · · · centrifugáljuk 60 percen át. Az így létrejövő üledék és felülúszó Western folt vizsgálata azt jelzi, hogy az SKBsCD-4 fehérje ^5 %-a marad az oldatban. A felülúszó frakciót azonos térfogatú 40 mmól/1es MES-sel (pH 6,0) hígítjuk és 1 ml S Sepharose oszlopra (Pharmacia, Piscataway, New Yersey) terheljük, amely oszlop előzőleg 2 mmól/1 MES-sel (pH 6,0) van kiegyensúlyozva. Az oszlopot 10 ml 20 mmól/l-es MES-sel (pH 6,0) mossuk. A kötött SKBsCD-4-et 20 mmól/1 MES-t (pH 6,0) és 0,5 mól/1 NaCl-t tartalmazó oldattal eluáljuk, 1 ml-es frakciókat gyűjtve. Az átmenő folyadék, a mosófolyadék és az e.luált frakciók Western folt elemzése azt jelzi, hogy az SKBsCD-4 kevesebb, mint 5 %-a kötődik az oszlopra, és a 2. és 3. frakciókban eluálódik.

Az átmenő folyadékot, mosófolyadékot és az eluált frakciókat megvizsgáljuk funkcionális SKBsCD-4-re ELISA versengéssel. Mind az átmenő folyadék, mind a 2. frakció olyan SKBsCD-4-et tartalmaz, amely kötődik 0KT4A-hoz.

Immun-kicsapás. Koncentrált tápközeget (100^1) hígítunk azonos térfogatú kicsapó pufferral£l0 mmól/1 nátrium-foszfát (pH 7,5), 100 mmól/1 NaCl, 0,1 % NP-40, 0,5 % nem zsíros tejpoij és elő-derítjük 3/xs nyúl IgG-vel 15 percig 4°C hőmérsékleten, ezt követi 30 ml (csomagolt térfogat) A” fehérje-Sepharose gyöngy hozzáadása (Pharmacia, Piscataway, New Yersey) 30 percig 4°C hőmérsékleten. Az előderített felülúszókat 5^g 0KT4, 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 0KT8 monoklonális antitestekkel (Ortho Pharmaceuticals), egér IgG-vel (Cooper Biomedical, Malvern, Pennsylvania), vagy nyúl anti-egér IgG-vel (Cooper, Biomedical) inkubáljuk 30 percen át 4°C hőmérsékleten. Az 0KT4-et, 4A-t, 4C-t, 0KT8-at, egér IgG-t és nyúl anti-egér IgG-t kicsapjuk 20^4.1 (csomagolt • · ··· · *·· • · · · · ··· · ·· ······· térfogat) ”A” fehérje-Sepharose gyöngyökkel 30 percen át végzett inkubálással. Az 0KT4B-t, 4D-t, 4E-t és 4F-et 1O^Kg nyúl antiegér IgG-vel inkubáljuk 4°C hőmérsékleten 30 percen át az A” fehérje Sepharose gyöngyök hozzáadása előtt. A kicsapás előtt a gyöngyöket kétszer mossuk 200 ml kicsapó pufferral és egyszer 200 ml, ΝΡ-40-et és nem zsíros tejport nem tartalmazó kicsapó pufferral. A mosott gyöngyöket 5 percen át forraljuk 20 ml mintapufferban £l25 mmól/1 trisz-HCl (pH 6,8), 20 % glicerin, 1,4 mól/1 p ME (béta-merkapto-etanol)J. A forralást követően a felülúszókat elektroforézisnek vetjük alá 12,5 %-os SD8- poliakrilamid gélen, és Western-folt elemzéssel elemezzük, amint fentebb leírtuk.

Mind a V1J4, mind a V1V2J4 fehérjék immun-kicsapódnak 0KT4Aval. Az 0MPAV1-gyel kifejezett fehérje 0KT4A-val és 0KT4D-vel kicsapódik, de 0KT4-gyel, 0KT4B-vel, 0KT4C-vel, 0KT4E-vel vagy 0KT4F-fel nem. Az 0MPAV1V2-vel kifejezett fehérjét az össze 0KT4 monoklonális antitest kicsapja az 0KT4 kivételével. Ezen kívül ennek a fehérjének az affinitása 0KT4C-hez kisebb, mint a többi monoklonális antitesthez.

Versengő ELISA. Mikrotitráló lemezeket (Flow Laboratories, McLean, Virginia) burkolunk egy éjszakán át szobahőmérsékleten 100^1/üreg 0,1 mól/l-es NaHC0^/Na2C0^ oldattal (pH 9,4), amely 150 ng tisztított sCD-4-et is tartalmaz.

Koncentrált tápközeg vagy sejtkivonat alikvotjait (2,5-80^1) inkubáljuk 5 ng 0KT4A-val 1 mg/ml szarvasmarha szérum albumin (BSA) jelenlétében 100jHl végső térfogatban egy éjszakán át szobahőmérsékleten A kevesebb, mint 100^41-t tartalmazó mintákat 100jrtl-re hígítjuk foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldattal (PB8). Az inkubálás után a lemezekről a folyadékot leöntjük, há• · · · • · • · · · romszor öblítjük PBS-sel és szárazra veregetjük. Az egyes üregekhez 380 A¹ PBS/0,5 % zselatint adunk. A lemezeket 37°C hőmérsékleten inkubáljuk 1 érán át.

A 37°C hőmérsékleten végzett inkubálás után a lemezekről a folyadékot leöntjük, háromszor öblítjük PBS-sel és szárazra veregetjük. A monoklonális antitestet tartalmazó 1 00/ 1-es inkubált mintákat az előkészített lemezek egyes üregeihez adjuk és 5 órán át inkubálunk 37°C hőmérsékleten.

Az inkubálás után a lemezekről a folyadékot leöntjük, ötször öblítjük PBS-sel és szárazra veregetjük. Az egyes üregekhez 100

JH1, biotinilezett ló/anti-egér IgG-t tartalmazó oldatot adunk. Ezt az antitest-készítményt úgy állítjuk elő, hogy egy csepp ló/antiegér IgG-t (Vector Labs, Burlingame, Kalifornia) hozzáadunk 10 ml, 1 % lószérumot tartalmazó PBS-hez. A lemezeket 30 percen át inkubáljuk 37°C hőmérsékleten.

Az inkubálást követően a lemezekről a folyadékot leöntjük, ötször öblítjük PBS-sel és szárazra veregetjük. Az egyes üregekhez 100^1 ABC komplexet adunk (Vector Labs, Burlingam^ Kalifornia). A lemezeket ezután szobahőmérsékleten inkubáljuk 30 percig.

A lemezekről a folyadékot ismét leöntjük, PBS-sel ötször öblítjük és szárazra veregetjük. 1 00/» 1,p-nitrofenil-foszfát keveréket £2 mg/ml p-nitrofenil-foszfát (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) 0,1 mól/1 nátrium-bikarbonátot (pH 9,4) és 10 mmól/1 MgClg-t tartalmazó oldatbanj adunk az egyes üregekhez. A lemezeket 37°C hőmérsékleten inkubáljuk 30 percen át sötétben.

Az inkubálást követően a lemezeket 405 nm abszorbanciánál leolvassuk. Az sCD-4 koncentrációkat egy standard görbéhez viszonyítva határozzuk meg, amely görbét tisztított sCD-4 ismert mennyiségé37 nek 0KT4 antitesttel való inkubálásával alakítunk ki. Mindkét fehérjéről (V1J4 és V1V2J4) úgy találjuk, hogy kötődik 0KT4A monoklonális antitesthez.

3. példa, élesztő kifejező vektorok megalkotása

Az élesztőkben sCD-4 fehérjék kifejezéséhez alkalmas kifejező vektorok megalkotására alkalmazott plazmidok az alapvető nagy kópiaszámú élesztő ingázó (shuttle) vektoron alapulnak ^Rosenberg és munkatársai: Genetic Engineering 8, 151(1986)]. Az összes ilyen plazmid tartalmazza az élesztő TRP1 gén és Carbon:

Gene 10, 157(1980)] 823 bázispáros EcoRI-PstI fragmentumát, amely egy szelektálható markert szolgáltat; az élesztő 2 mikronos köra

lakú plazmidjának [Hartley és Donalds on: Natúré 286, 860(1980

2,0 kb-s EcoRI-PstI fragmentumát, amely egy replikációs origót szolgáltat élesztőben; a pBR322 egy részét (BamHI-től PvuII-ig kiiktatva) ]lásd Pouwels, Enger és Valk szerkesztésében a Cloning Vectors című szakkönyvet(1985)], amely egy élesztő promotorterminátor modult szolgáltat a pBR322 HindlII és BamHI helyei közé beiktatva. A promotor vagy a CUP1 431 bázispáros BamHI-Rsal fragmentuma, ahol a CUP1 BamHI-EcoRI fragmentumként pY8K12-ből származik ^Butt és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3332(1984); Rosenberg és munkatársai: Genetic Engineering 8, 151 (1986); Gorman és munkatársai: Gene 48, 13(1986)], vagy egy 1,1 kb-s TDH3 promotor szekvencia ΓHolland és munkatársai: J. Bioi.

Chem. 255, 2596(1980)], amely BamHI-EcoRI fragmentumként a pYSK18 plazmidból származik (Rosenberg és munkatársai, fentebb idézett munka; Gorman és munkatársai, fentebb idézett munka). A terminátor a CYC1 gén 361 bázispáros KpnI-HindlII fragmentuma £Smith és munkatársai: Cell 1 6, 753(1979)]. A promotor és a CYC1 fragmentum • · ·· • · ··· · ··· • · · · · • · · · · · ·······

- 38 közé különböző szintetikus szekvenciákat lehet beiktatni, amint ezt az alábbiakban leírjuk.

A pYSK147 és pY8K148 megalkotása. A pY8K137 (CUPI promotor) és pYSK138 (TDH3 promotor) plazmidok egy szintetikus oligonukleotid szekvenciát tartalmaznak a promotor szekvencia 3’ végénél levő EcoRI hely és a terminátor 5’ végénél levő KpnI hely között. Ez a szintetikus szekvencia tartalmazza az egyedi Xhol, Ncol és Sáli restrikciós helyeket a transzlációs terminációs kodontól fölfelé mindhárom leolvasó keretben. Ennek a szintetikus kapcsolónak a szekvenciája az alábbi: GAATTCTCGAGCCATGGCAGTCGACGTAGTTAAGTAGGTACC

A pUCsT4 plazmid egy Ncol-Sall fragmentumát, amely az sCD-4 szekvencia 124.-1257. bázisait tartalmazza, az Ncol-gyel és Kpnlgyel hasított pYSK137-be vagy pYSK138-ba iktatjuk, hogy megkapjuk a pYSK147-et illetve pYSKl48-at.

A pYSK154 és pYSK155 megalkotása. Az ubikvitin fúziós gén kifejezésére való vektorok egy, a szintetikus élesztő ubikvitin tartalmaznak génhez adoptált kazettátVTEcker és munkatársai: J. Bioi. Chem. 262, 3524(1987)Ja promotor és a CYC1 terminátor között. Az ubikvitin szekvencia azonos azzal, amelyet Ecker és munkatársai publikáltak, azzal a kivétellel, hogy a terminális AflII-KpnI fragmentumot egy olyan oligonukleotid szekvencia helyettesíti, amely egy Ncol restrikciós helyet tartalmaz a 3' végen. A pYSKl47 NcolKpnI fragmentumát, amely a kívánt sCD-4 szekvenciát tartalmazza, beiktatjuk e közé az Ncol hely és a CYC1 fragmentum 5' végénél levő KpnI hely közé, így kapjuk meg a pYSK154-et A pYSK154 egy származékát, amelyben az sCD-4 szekvencia első két amino-terminális aminosavához (ezek a vezető peptid szekvenciák) tartozó szék-

vencia a pYSK154-ben ki van iktatva, alkotjuk meg olyan módon, hogy a pYSK154-et KpnI-gyel elhasítjuk, ezt követi a betöltés E. coli DNS polimeráz I Klenow-fragmentumával (polIK), és egy psT4B BV1DHFR-ből való KpnI-Xbal sCD-4 szekvencia (az sCD-4 145.—1257.· bázisai) beiktatása, amely szekvenciát előzőleg polIK-val kezeltünk, hogy a tapadós végeket betöltsük. Ezt a plazmidot pYSK155nek nevezzük.

pYSK159 és pYSKIól megalkotása. Egy csonkított sCD-4 szekvenciát (124.-603· bázisok) tartalmazó vektorokat alkotunk meg az sCD-4 szekvencia SacI helyénél (602. bázis) egy terminációs kodont tartalmazó szintetikus oligonukleotid beiktatásával. A szintetikus kapcsoló (kétszálú) szekvenciája az alábbi:

CTAAGCGGC

TCGAGATTCGCCGGC

Ezt a szintetikus szekvenciát Sacl-gyel és Narl-gyel hasított pYSK148-ba és pYSK154-be iktatjuk, hogy megkapjuk a pYSK159-et illeti ve pYSK16l-et. így a CD-4 DNS a pYSK159-ben a -9 aminosavtól (alanin) a 151. aminosavig (leucin) terjedő szekvencia (YV1) aminosavaihoz szolgáló kodonokkal bír.

4. példa. sT4 kifejezése élesztőtenyészetekben

Plazmid DNS-t (2-1O^g/ml) alkalmazunk élesztő (Saccharomyces cerevisiae) transzformálására standard technikákat alkalmazva £sherman és munkatársai: Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor (1986)J, triptofán prototrófiára szelektálva. Az alkalmazott törzsek az F762 (Mata, trpljl, ura3-52) vagy PEC1-8B (Mata, proA/l::URA3, ura3~52, trp1-289, his3). Szelektált transzformánsok tenyészeteit növesztjük élesztő nitrogén bázison £_Yeast Nitrogén Base (YNB), Difco, Detroit, MichiganJ, amely megfelelő kiegészí···

-40téseket is (2 % glükóz, 20jKg/ml uracil, 20/tg/ml hisztidin) tartalmaz. A CUP1 promotort hasznosító plazmidoknál a tápközeg tartalmaz réz-szulfátot is 100 mikromól/1 koncentrációban. A tenyészeteket a késői lóg fázisban nyerjük ki centrifugálással, majd mossuk és összezúzzuk. A sejt-lizátumot elemezzük sCD-4-re standard fehérje immun-folt vizsgálattal.

A pYSKl47-et és pYSK148-at tartalmazó 8. cerevisiae-ban az sCD-4 fehérje és az SKBYsCD-k (-9.-369. aminosavak) alacsony szinten (kevesebb, mint mintegy 0,5 ng/1) fejeződik ki. Az aktivitásról úgy találjuk, hogy a részecske frakcióval társul, de könnyen szolubilizálható nem-ionos detergensekkel végzett extrahálással. Az SKBYsCD-4 (-9.-369. aminosavak) mennyisége a pYSK15k-et tarQ talmazó S.cerevisiae tenyészeteiben 2-6 mg/liter között van (2.10 sejt/ml-nél). Ez mintegy ötszörös javulás a pYSK147-tel és pYSK 148-cal kifejezett CD-4 fehérje mennyiségéhez viszonyítva, azaz a stabilizáló ubikvitin szekvencia jelenléte nélküli eredményekhez viszonyítva. A szintetizált sCD-4 fehérje becsült mérete minden esetben azonos, jelezve, hogy a fehérje ubikvitin része leha— sadt az öKBsCD-4-ről. Ezt immunfolt eljárásokkal igazoljuk, élesztő ubikvitin elleni antitestet alkalmazva.

A csonkított sCD-4 fehérje (YV1) kifejeződésének szintje pY8K159-ben és pYSKl6l-ben hasonló az sCD-4 fehérje kifejeződési szintjéhez, amikor ubikvitin fúziós termékként fejeződik ki. A kimutatott sCD-4 mennyisége hasonló az összes megvizsgált gazdaszervezetben .

A pY8K154-et tartalmazó F762 törzsből származó SKBsCD-4-et tisztítjuk 8-8epharose oszlopon való átengedéssel. 10 mmól/1 trisz puffért (pH 6,0) és 1 % Tween 20-at tartalmazó oldatban ·· ···· • · • · · · ······ • · · •··· • ·· • ·· ······· készített nyers extraktumot centrifugálunk 30000 g-nél. A felülúszót pH 4,0-ra állítjuk be és 50 mmól/1 acetát pufferral kiegyensúlyozott S-Sepharose oszlopra terheljük. A mintát 50 mmől/1 0,5 mól/1 NaCl-t tartalmazó MES £2-(N-morfolino)-etánszulfonsav(pH 6, °í pufferral eluáljuk. Az SKBYsCD-4 jelenlétét az eluátumban immunfolt-elemzéssel igazoljuk. Az anyag, amint ezt versengő ELISA alapú vizsgálattal meghatározzuk CHO sejtekből származó tisztított SKBsCD-4-et és 0KT4A antitestet hasznosítva, aktív, azt sugallva, hogy az élesztő eredetű SKBsYCD-4 konformációja utánozza az emlős sejt (CHO) eredetű anyag konformációját.

5. példa. Streptomyces vektorok megalkotása

Rekombináns DNS manipulációkat alkalmazva a humán CD-4 cDNS szekvencia szegmenseit fuzionáljuk a S.longisporus tripszin inhibitor (CTI) gén szignál szekvenciájához és az S. lividans P-ga-

génhez. Az sCD-4 minigéneket összekapcsoljuk pIJ702 (Katz és munkatársai, fentebb idézett munka) és pIJ351 (Kieser és munkatársai, fentebb idézett munka) Streptomyces plazmidokkal, hogy megalkossuk a pLTI:sT4/1, pLTI:sT4/7, pLTI:V1V2 és meg.

sT4/7 plazmidokat. A vektorokat az alábbi módon alkotjuk pLTI:sT4/1 megalkotása. A pLTI:sT4/1 plazmidot három másik plazmidból: a pUCsT4-ből, pIJ351-ből és pLTI450-ből alkotjuk meg. A pLTI450 plazmidot az alábbi módon alkotjuk meg.

pLTI450 megalkotása. Az LTI gént tartalmazó, 0,92 kb-s SaclKpnl fragmentumot beiktatjuk pUCl8-ba, amelyet előzőleg Sacl-gyel és KpnI-gyel emésztettünk. Ezt a plazmidot, a pLTI520-at, részlegesen emésztjük Eagl-gyel és teljes mértékben emésztjük Sall-gyel, majd egy szintetikus (kétszálú) kapcsolóhoz ligáljuk, amely EagI

- 42 • ···· ·· ·· ♦··· • · · · · ·· · · • · ··· · ··· • · · · · ··« · ·· ······· és Sáli végekkel bír.

5’-GGCCGCCGCCCCCGCG

CGGCGGGGGCGCAGCT-5'

Az ebből a ligálásból kapott plazmidokat átvizsgáljuk a szintetikus kapcsoló beiktatására az EágI helybe mintegy 0,5 kbvel a SacI helytől elhelyezve. Ezt az EagI helyet a 86. bázispárnál helyezzük el az LTI gén 5' végéhez viszonyítva. Az így létrejövő plazmid tartalmazza az LTI promotort és a szignál peptidhez, valamint a szignál peptid hasítási helyhez tartozó kódoló szekvenciát. Mind az EagI, mind a Sáli helyek alkalmazhatók az sCD-4 minígének · fúziójához az LTI szignál-szekvenciához.

A pLTI:sT4/1 megalkotása. Abból a célból, hogy a pLTI:sT4/1 plazmidot megalkossuk, az sCD-4 kódoló szekvenciát izoláljuk egy mintegy 1,1 kb-s BbvI-PstI fragmentumban a pUCsT4-ből. Ez a fragmentum tartalmazza a humán CD-4 cDNS szekvencia 149.-1257. bázispárjait. A pUCsT4 plazmidot BbvI-gyel emésztjük, majd reverz transzkriptázzal kezeljük, hogy az 5’ túlnyúló végeket betöltsük. A DNS-t azután Pstl-gyel emésztjük. Ezt az 1,1 kb-s BbvI(RT) -PstI fragmentumot, amely az SKBsCD-4-et kódolja, pLTI450-be ligáljuk, amelyet előzőleg Sall-gyel és reverz transzkriptázzal kezeltünkjmajd Pstl-gyel emésztettünk. Ez a ligálás eredményezi a pLTl450sT4/1 plazmidot. A végső lépés a pLTI:sT4/1 megalkotásában igényli a Streptomyces replikációs funkció beiktatását pLTI 450sT4/1-be. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy pIJ351-et (Kieser és munkatársai, fentebb idézett munka) emésztünk Pstl-gyel és ezt Pstlgyel emésztett pLTI450sT4/1-be ligáljuk.

pLTI:sT4/7 megalkotása. A pLTI:sT4/7 plazmidot három másik plazmidból alkotjuk meg: a pUCsT4, pIJ702 és pLTI450 plazmidokból.

···· • · ····

- 43 Abból a célból, hogy a pLTI:sT4/7 plazmidot megalkossuk, az sCD-4 kódoló szekvenciát izoláljuk egy mintegy 1,1 kb-s NcoI-PstI fragmentumon pUCsT4-ből. Ez a fragmentum a humán CD-4 cDNS szekvencia 124.-1257. bázispárjait tartalmazza. Ezeket a bázispárokat egy ATG iniciációs kodon és egy TAA terminációs kodon közé helyezzük, amint ezt korábban az 1. példában leírtuk. Az iniciációs kodon az Ncol felismerő szekvencia részét képezi. Az sCD-4 kódoló szekvencia, amelyet ez a fragmentum tartalmaz, 9 aminosavat tartalmaz a CD-4 vezető szekvenciájából. A pUCsT4-et Ncol-gyel és reverz transz— kriptázzal kezeljük, ezt követi az emésztés Pstl-gyel. Ezt a fragmentumot azután pLTI450-nel ligáijuk, amelyet előzőleg HincII-vel és Pstl-gyel kezeltünk. Ez a ligálás eredményezi a pLTl450sT4/7 plazmidot. A Streptomyces replikont a pIJ702 plazmid (Katz és munkatársai, fentebb idézett munka) szolgáltatja. Ezt a pLTI450s T4/7-be iktatjuk a mindkét plazmidon meglevő egyedi PstI helyek révén, így alkotjuk meg a pLTI:sT4/7 plazmidot.

A pLTI:V1V2 plazmid megalkotása. A pLTI:V1V2 plazmidot a psT4. 184, pLTl450 és pIJ351 plazmidokból alkotjuk meg. Egy 0,54 kb-s Xbal-EcoRI fragmentumot izolálunk psT4.184-ből. Ezt a fragmentumot BbvI-gyel és reverz transzkriptázzal kezeljük. A Bbvl vég megfelel a humán CD-4 149. bázispárjának. Ezt a tompa végű fragmentumot azután pLTI450-hez ligáijuk, amelyet előzőleg Sall-gyel és reverz transzkriptázzal kezeltünk, hogy megalkossuk a pLTI450V1V2-t. A Streptomyces replikációs funkciót a pIJ351 szolgáltatja. Ezt a plazmidot a pLTI450V1V2-be klónozzuk a mind a pIJ351-en, mind a pLTI450V1V2-n meglevő egyedi PstI hely révén. Az így létrejövő plazmid a pLTI:V1V2.

A ppgalsT4/7 megalkotása. A p|JgalsT4/7-et a pUCsT4, pIJ702 ··· és p3SSxMCP plazmidokból alkotjuk meg. A p3SSxMCP egy pUC9 /Vieira

galaktozidáz promotort és szignál szekvenciát. A szignál peptid hasítási helyet kódoló szekvenciától 26 bázispárral lefelé van egy XmnI hely £Eckhardt és munkatársai: J. Bacteriol. 169. 4249

Ebbe a helybe beiktatva van egy szintetikus kapcsoló, amely tartalmaz egy BamHI felismerő szekvenciát (New England Biolabs, Beverly, Massachussets), hogy kialakuljon a p3SSx10 plazmid. Ezt a vektort kezeljük BamHI-gyel és reverz transzkriptázzal, majd Xhol-gyel emésztjük. Ehhez a vektorhoz ligáivá van egy olyan fragmentum, amelynek Ncol vége van reverz transzkriptázzal kezelve, hogy egy tompa véget és egy Sáli véget kapjunk. A betöltött BamHI hely ligálása a betöltött végű Ncol hellyel helyreállítja mind a BamHI, mind az Ncol helyeket. Az így létrejövő plazmid a p3SSxMCP. A pUCsT4-et Xbal-gyel és reverz transzkriptázzal kezeljük, amelyet Ncol emésztés követ. Ezt az 1,1 kb-s NcoI-Xbal(RT) fragmentumot azután beiktatjuk a p3SSxMCP-be, amelyet előzőleg Sacl-gyel és T4 DNS polimerázzal kezeltünk, amelyet Ncol emésztés követ. A Streptomyces replikációs funkciót a pIJ702 szolgáltatja, amelyet a p3SSxsT4-be iktatunk a mindkét plazmidon jelen

6. példa. sCD-4 minigének kifejezése Streptomycesben

A pLTI:sT4/1, pLTI:sT4/7, pLTI:V1V2 és p/?gal:sT4/7plazmidotranszforrnáljuk kát S. lividans 1326-báV(Bibb és munkatársai, fentebb idézett munka). Ezen kívül á¹ pLTI:sT4/1-et, pLTI:sT4/7-et, pLTI:V1V2-t bevezetjük S. coelicolor M124-be£ Hopwood és munkatársai: ”Genetic Manipulation of Streptomyces - A Laboratory Manual, kiadó:

Crowe F. és fiai,

Norwich, Anglia s a S. longi-

sporus fehér származékába (ATCC 23931). Az összes plazmidot különböző gazdaszervezetekbe vezetjük be azt a munkamenetet alkalmazva, amelyet korábban Thompson és munkatársai írtak le jTj. Bacteriol. 151 , 668(1982)J. A transzformánsokat a transzformációs

tont tartalmazó 0,4 %-os agarral.

Azokat a kiónokat, amelyek CD-4 minigéneket fejeznek ki, tiosztrepton rezisztens transzformánsok 48-72 órán át végzett szaporításával azonosítjuk 10 ml triptikáz szója tápközeget és 5^Hg/ml tiosztreptont tartalmazó tápközegben. A tenyészet felülúszókat és a sejtlizátumokat 12 %-os poliakrilamid (30:0,8 akrilamid:biszakrilamid)-1 % nátrium-dodecil-szulfát gélen szeparáljuk, majd nitrocellulózra visszük át ^Towbin és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350(1979)J. A nitrocellulóz szűrőt átvizsgáljuk a nyúl sCD-4 antiszérumot alkalmazva, amint ezt Deen és munkatársai leírták (fentebb idézett munka).

A pLTI:sT4/1, ;.pLTI:sT4/7 és sT4 S. lividans transzformánsok mind egy .. mintegy 45 kD-s fehérjét fejeznek ki, amely az ezekkel a plazmidokkal kódolt sCD-4 fehérje előre várt mérete. Hasonlóképpen a pLTI:V1V2 S. lividans transzformánsok mintegy 20 kD-s fehérjét fejeznek ki, amely a V1V2 fehérje előre várt mérete. Az SKBsCD-4 és V1V2J4 kifejezést vizsgáljuk S. coelicolor-ban,

S. albus-ban, és S. longisporus-ban is. A S. lividans-hoz hasonlóan a 45 kD-s (a pLTI:sT4/1 és pLTI:sT4/7 transzformánsok) és 20 kD-s (apLTI:V1V2 transzformánsok) fehérjéket fejezik ki a többi Streptomyces transzformánsok is.

A S. lividans tenyészet felülúszóban és sejtlizátumban jelen levő SKBsCD-4 ezt követő mennyiségi vizsgálata 1-5 mg/1 szintet

mutat. A V1V2J4 2-10 mg/l-ben van jelen mind a tenyészet felülúszóban, mind a sejtlizátumban. 1 mg/l-nél kevesebb fejeződik ki

T4 S. lividans transzformánsok révén.

pLTI:sT4/7 S. lividans sejtvonalat alkalmazva vizsgáljuk az

SKBsCD-4 kifejezést 12 literes fermentorban is. A kis léptékű kifejezési tanulmányokhoz hasonlóan a sejteket triptikáz szója tápközeg +5 tiosztrepton tápközegben növesztjük. Mind a tenyé

szet felülúszókat, mind a sejt-lizátumokat elemezzük SKBsCD-4 kifejeződésre 7,5; 24; 31,5; 54; és 72 órával az inokulálás után.

A maximális térfogati kifejeződési szint 60 mg/1 és 24 órával az inokulálás után érjük el. Az SKBsCD-4 azonos mértékben oszlik meg a tenyészet felülúszó és az ép sejtek.között.

V1V2J4-et és SKBsCD-4-et tartalmazó részben tisztított felülúszókról mutatjuk ki versengő ELISA-val, hogy kötődnek 0KT4A-hoz, jelezve, hogy ezek a Streptomyces-eredetű fehérjék HÍV kötő fehérjék.

A V1J4-et, amely HÍV kötő fehérje, hasonlóképpen ligáijuk az LTI promotorhoz és Western-folt elemzéssel kimutatjuk, hogy kifejeződik S. lividans-ban.

A fenti példák azt demonstrálják, hogy a CD-4-ből származó HÍV kötő fehérjék, pl. az SKBsCD-4, SKBYsCD-4, V1J4, V1V2J4 és YV1, amelyek a jelen találmány szerinti rekombináns organizmusok által fejeződnek és választódnak ki, olyan HÍV kötő fehérjék, amelyek az sCD-4 HÍV kötő funkciójával bírnak. Részletesebben, ezek az SKBsCD-4 V1 területének HÍV kötő tartományával bírnak.

A fenti leírás és kiviteli példák teljes mértékben ismertetik a találmányt, beleértve ennek előnyös kiviteli módjait.

Claims (6)

1. ) Eljárás HÍV kötő fehérje előállítására azzal jellemezve, hogy olyan vektorral transzformált E. coli sejteket, amelyek a HÍV kötő fehérjéjét kódoló szekvenciát tartalmazzák egy szabályozó elemmel operatívan összekapcsolva, tenyésztünk és a HÍV kötő fehérjét ebből összegyűjtjük.

2. ) Eljárás HÍV kötő fehérje előállítására azzal jellemezve, hogy

Streptomyces olyan vektorral transzformált N* sejteket, amelyek a HÍV kötő fehérjéjét kódoló szekvenciát tartalmazzák egy szabályozó elemmel operatívan összekapcsolva, tenyésztünk és a HÍV kötő fehérjét ebből összegyűjtjük.

3. ) Eljárás HÍV kötő fehérje előállítására azzal jellemezve, hogy olyan vektorral transzformált élesztősejteket, amelyek a HÍV kötő fehérjéjét kódoló szekvenciát tartalmazzák egy szabályozó elemmel operatívan összekapcsolva, tenyésztünk és a HÍV kötő fehérjét ebből összegyűjtjük.

4. ) HÍV kötő fehérje azzal jellemezve, hogy ez sCD-4 fehérje vagy származéka, amely egy sCD-4 fehérje HÍV kötő funkciójával rendelkezik és amelyet rekombináns E. coliban termelünk gyógyszerként való felhasználásra.

5. ) HÍV kötő fehérje azzal jellemezve, hogy ez sCD-4 fehérje vagy származéka, amely egy sCD-4 fehérje HÍV kötő funkciójával rendelkezik és amelyet rekombináns élesztőben termelünk gyógyszerként való felhasználásra.

6. ) HÍV kötő fehérje azzal jellemezve, hogy ez sCD-4 fehérje vagy származéka, amely egy sCD-4 fehérje HÍV kötő funkciójával rendelkezik és amelyet rekombináns Streptomycesben termelünk gyógyszerként való felhasználásra.