JPH10127295A

JPH10127295A - リシントキシン

Info

Publication number: JPH10127295A
Application number: JP9265064A
Authority: JP
Inventors: Michael Piatak Jr; ピアターク，ジュニアマイケル
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1986-03-07
Filing date: 1997-09-11
Publication date: 1998-05-19
Anticipated expiration: 2015-01-31
Also published as: EP0237676B1; EP0866128A2; FI864626A; JP3010360B2; DK551786A; JP3005621B2; DE3650692D1; JPS62232387A; EP0866128A3; DK551786D0; NO864986D0; FI864626A0; CA1324095C; AU601956B2; ATE169672T1; DE3650692T2; EP0237676A2; AU6511986A; NO864986L; EP0237676A3

Abstract

(57)【要約】【課題】新規なリシン及びその製造方法の提供。【解決手段】限定のアミノ酸配列を有するリシンＡ
鎖、リシントキシンＡ及びリシントキシンＥ、並びにそ
の製造方法の提供。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、組換技法を用いるト
キシン断片の製造に関する。さらに詳しくは、本発明は
組換手段を用いるリシントキシン蛋白質の製造に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】リシントキシン（ｒｉｃｉｎｔｏｘｉ
ｎ；ＲＴ、又はリシン）は、酵素活性を有する細胞変性
（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ）“Ａ”アミノ酸配列と、“Ａ”
配列を殺されるべき標的細胞に付着せしめること及び細
胞質へのＡ断片のトランスロケーション（ｔｒａｎｓｌ
ｏｃａｔｉｏｎ）を助けることの両方を担当すると予想
される“Ｂ”配列とから成る天然トキシンである。この
ようなトキシン類の他の例にはジフテリアトキシン及び
シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からのエキソトキシンが
含まれる。他の毒性蛋白質、例えばフィトラッカ・アメ
リカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａａｍｅｒｉｃａｎ
ａ）由来の毒性蛋白質（ＰＡＰＩ，ＰＡＰII、及びＰＡ
Ｐ−Ｓ）並びにゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）は上記のト
キシンの“Ａ”配列に匹敵するインビトロ活性を示す
が、しかし、おそらく“Ｂ”鎖が存在しないため、イン
ビボで不活性である。

【０００３】この発明の“リシン”ペプチドは、ヒマと
して一般に知られているリシナス・コミュニス（Ｒｉｃ
ｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ）の種子に由来する。２種
類の類似の蛋白質（しばしばレクチンと称される）がこ
れらの種子から抽出され、これらは上記のリシン及びリ
シン・コミュニス（Ｒｉｃｉｎｃｏｍｍｕｎｉｓ）ア
グルチニン（ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＲＣＡ）であ
る。これら両蛋白質はＡ部分及びＢ部分を含有し、これ
らは１個のペプチドを構成しているのではなくジスルフ
ィド結合により連結されている。リシン及びＲＣＡの両
者のＡ部分はインビトロにおいてリボゾームの大サブユ
ニットを触媒的に不活性化することができ、そしてリシ
ンのインビボ細胞変性活性はこのリボゾーム不活性化活
性に基くと信じられる。リシンとＲＣＡは高度に相同で
あるがしかし差異が存在すると信じられる。ＲＣＡは劇
的に毒性が低く、そしてリシンの２量体について予想さ
れる特徴に相当する特徴を示す様である。

【０００４】ヒマ抽出物の注意深い分画操作により幾つ
かのリシン−アイソトキシンの存在が示される。リシン
ＤとリシンＥとの区別はすでに開示されている〔Mise
等、Ag ric. Biol. Chem.（1977）41 : 2041-2046 ; Wei
等、J. Biol. Chem. (1978) 253 : 2061-2066 ; Lin
等、Eur. J. Biochem. (1980) 105 : 453-456 ; Genaud
等、J. Immunol. Meth. (1982) 49 : 323-332 〕。リシ
ンＤは７．４に近いｐＩを有しそしてアガロースに対す
る高い親和性を有し、他方リシンＥは８．８に近いｐＩ
及びアガロースに対する低い親和性を有する。リシンＤ
よりもさらに酸性形であることが示されているアイソト
キシンと主張されているものの幾つかの報告が存在する
〔Olsnes等、J. Biol. Chem. (1974) 249 : 803-810 ;
Ishiguro等、Toxicon (1976) 14 : 157-165 : Cawley
等、Arch. Biochem. Biophys. (1978) 190 : 744-75
5〕。

【０００５】リシンＤ及びＥの間の差異はＢ鎖に存する
ようである〔Funatsu 等、Agric. Biol. Chem. (1978)
42 : 851-859〕。リシンＤ及びＥからのリシントキシン
−Ａ鎖（ＲＴＡ鎖）は組成、ｐＩ及び見かけ分子量にお
いて同じである。しかしながらリシンＤは２つの異るＲ
ＴＡ種、すなわちＲＴＡ１及びＲＴＡ２をもたらす。こ
れらのアイソエンザイムはＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子
量及び炭水化物含量を異にし、そして非常に狭い塩グラ
ジエントによるイオン交換クロマトグラフィーにより分
離され得る〔Olsnes等、Biochemistry (1973) 12 : 312
1-3126〕。

【０００６】リシンＥの今まで知られていないアイソト
キシンもプロシオン（Ｐｒｏｃｉｏｎ）色素クロマトグ
ラフィーにより同定された。便宜上、従来のリシンＥ調
製物に最も類似するリボトキシン（ｒｉｂｏｔｏｘｉ
ｎ）がリシンＥ１と命名され、そして新規なリボトキシ
ンはリシンＥ２と命名された。リシンＥ２はリシンＥ１
のｐＩと同じｐＩを有する。リシンＥ１に比べて、リシ
ンＥ２はマウスに対して１％の毒性でありそして培養さ
れたセルラインに対して２〜４％の毒性であり、中程度
〜高イオン強度においてアガロースに一層強く結合し、
そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約２kD大きい。

【０００７】リシンの構成成分及びＲＣＡの構成成分は
抽出された材料に基いてよく特徴付けられており、そし
てこれらの性質は広範に総説されている〔Olsnes, S.,
Pers pectives in Toxicology, A. W. Bernheimer編 (19
77) J. Wiley & Sons, ニューヨーク、122-147 頁 ; O
lsnes, S. 等、Molecular Action of Toxins and Virus
es, Cohen 等編 (1982) Elserier, アムステルダム、51
-105頁〕。リシンは５８，０００ダルトンの見かけ分子
量を有し、そして３２，０００ダルトンの分子量を有す
るＡ鎖と３４，７００ダルトンの分子量を有するＢ鎖と
から成る。ＡＣＡは分子量３２，０００のＡサブユニッ
ト２個と分子量３６，０００のＢサブユニット２個を有
する４量体である。これらの天然環境において、Ａ鎖及
びＢ鎖は一般にグリコシル化されている。リシン及びＲ
ＣＡの両者のＡサブユニット及びＢサブユニットは１個
のジスルフィド結合によってのみ結合されており、そし
てペプチド結合によっては連結されておらず、そして例
えば、単鎖ペプチドとして見出されるジフテリアトキシ
ンと異る。

【０００８】リシン及びＲＣＡの両者は、Ａ部分及びＢ
部分について別個のペプチドを有するが、各場合におい
て、それぞれ単鎖前駆体に由来することが知られている
〔Butterworth, E. H.等、Eur. J. Biochem. (1983) 13
7 : 57〕。この前駆体はＡ鎖（アミノ末端）配列とＢ鎖
（カルボキシ末端）配列との間に１２個のアミノ酸の配
列を含有することが示された（本発明の出願人と同じ出
願人の１９８５年８月１５日に公開されたＰＣＴＵＳ
８５／００１９７）。本発明は後で、リシンＡ配列が２
６５個のアミノ酸を含み、これに先行して３５アミノ酸
のリーダー（シグナル）ペプチドが存在することを示
す。１２個のアミノ酸の介在ペプチドの切り取りの後１
個のジスルフィド結合により連結されたＡ鎖及びＢ鎖が
残ることが予想される。

【０００９】

【発明の概要】この発明に関し、３個の十分な長さのリ
シン関連クローンが単離され、その内の２個は既知配列
の蛋白質に対応する。ｐＲＴ３の挿入部は、コードされ
ているアミノ酸配列において、リシンアグルチニンの一
次配列に対応する。ｐＲＴ１７のｃＤＮＡ挿入部は、国
際特許出願ＴＣＰＵＳ８５／００１９７（前掲）及び
本明細書に記載されているリシンＡコード配列及びＤＮ
Ａ中にコードされているリシントキシンＢ鎖との間の混
成体に対応する。そしてこれはリシンＤの前駆体をコー
ドするＤＮＡである。

【００１０】他方、ｐＲＴ３８は新規な蛋白質をコード
し、リシンＤとの比較において推定される蛋白質の予想
特性の故に、リシンＥをコードするＤＮＡであると予想
される。具体的には、前記のごとく、リシンＥはリシン
Ｄに比べてかなり高いｐＩを有し、従って、リシンＤ中
の中性アミノ酸から新規蛋白質中の塩基性アミノ酸への
変化を含む相同性からの偏りは、コードされている蛋白
質のこの同定と一致する。

【００１１】本発明は、リシンのＡ鎖、並びに２種類の
リシンアイソトキシンの及びＲＣＡの十分な長さの“前
駆体”鎖を得るための組換技法を用いる手段を提供す
る。天然リシンＡ及び天然リシンは、入手源としての植
物の多様性に依存して、類似であるがしかし完全には同
一でない多数の形態で存在するが、しかしながら１つの
植物に由来する蛋白質であっても複数の一次構造を示
す。言うまでもなく、組換生産されたリシンＡは１つの
所望のアミノ酸配列の生産を許容にし、そしてその活性
に必要とされる構造的特徴の探索を可能にする。この発
明の技法及び材料はさらに蛋白質のアミノ酸配列の選択
的変形を許容し、そしてそれ故に、これらの材料の細胞
変性活性を変えることができる性質及び他の性質を提供
するための操作を可能にする。

【００１２】組換リシンＢ鎖の生産は国際特許出願ＰＣ
ＴＵＳ８５／００１９７（前掲）に開示されている。
この発明は、方向付けられた変形をも可能にする予想可
能な、効率的な、そして経済的な方法を用いてリシンＡ
及び完全な長さのリシンの生産を可能にすることによ
り、従来不可能であって実際的な方法及び改良された方
法でのこれらの蛋白質の使用を可能にする。さらに、Ｂ
鎖をコードするＤＮＡをも使用する適当な組換操作によ
り、完全な長さのリシントキシンをクローン化しそして
発現せしめることができ、そして複数の蛋白質の部分を
含有する種々のハイブリド蛋白質を得ることができる。

【００１３】さらに、細菌分泌蛋白質のリーダー配列の
ためのコドンを用いる新規な造成物を用いることによ
り、可溶性で生物学的に活性なリシンＡ鎖及びリシン前
駆体を原核性宿主を用いて直接得ることができ、この場
合、外来蛋白質を再折りたたみ（ｒｅｆｏｌｄ）及び可
溶化のためにさらに処理する必要がない。この発明は１
つの観点において種々のリシン成分に関し、そして特
に、組換技法を用いて製造される可溶性の生物学的に活
性な蛋白質に関する。リシンＡ、リシン又はＲＣＡのア
ミノ酸配列は、所望により、ヒマの特定のサンプルから
抽出されるリシンＡ、リシン又はＲＣＡペプチドのアミ
ノ酸配列と絶対的に同一であることもできるが、しかし
ながら、組換生成物はその生産の環境のために必然的に
幾分変形され、そしてさらに、アミノ酸配列又はグリコ
シル化のレベルにおいて変更を含むように製造者の意思
により変形され得る。

【００１４】例えばリシンＡについては、Ｅ．コリＭＣ
１０００λ溶原株のごとき原核生物により適合性のＰ_L
プロモーターの制御のもとに生産される場合、リシンＡ
は適当な精製法への適用のために例えば洗剤又はチャオ
トロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）剤による可溶化を
必要とする。しかしながら、この発明の造成物は適切な
宿主においては可溶性のリシンＡを直接もたらし、この
リシンＡは精製にかけるため及び細胞変性活性を発揮す
るために追加の処理を必要としない。このような可溶性
リシンＡは、通常の機械的破砕により宿主から抽出され
そして精製され得る。従って、この発明の１つの観点は
リシンＡ及び他のリシン関連蛋白質の組換技法による製
造ための方法及び材料、並びにこうして製造された生成
物形態に関する。

【００１５】他の観点において、これらの蛋白質及びリ
シンＡの発現を行うことができる発現系、これらの発現
系により形質転換された宿主細胞、並びにこれらの培養
物；リシンＡもしくはリシン又はこれらの前駆体をコー
ドする変形されたＤＮＡ配列；並びに、変形されている
か又は変形されていないこれらのリシン関連断片のため
の発現配列に関する。特に、この発明の観点は細胞変性
活性を有する可溶性組換リシンＡ並びにその製造のため
の方法及び材料に関する。

【００１６】この発明はさらに、リシンＥのアミノ酸配
列を有する新規な蛋白質、そのリシンＢ部分、及びその
製造のために有用な組換材料に関する。さらに、組換リ
シンＡがそれが結合している細胞材料から溶け出すこと
を容易にするためにフェニルセファロースを使用するこ
とができることが見出され、そしてこの発明の他の観点
はこの技法に向けられる。

【００１７】

【具体的な説明】“リシンＡ”は、ヒマの種子から抽出
されるリシンＡペプチドのアミノ酸配列と実質的に同じ
アミノ酸配列を有する蛋白質を意味する。ヒマの種子の
リシンＡは約２６５アミノ酸の長さを有しそして約３
２，０００ダルトンの分子量を有する。しかしながら、
正確な配列はヒマの品種により異ること、及び１つの品
種の中にリシンＡの複数のわずかに異る形態が存在する
ことが知られている。

【００１８】“リシンＢ”は、ヒマの種子から抽出され
るリシンＢペプチドのアミノ酸配列と実質的に同じアミ
ノ酸配列を有する蛋白質を意味する。ヒマの種子のリシ
ンＢは約２６０アミノ酸の長さを有し、そして約３４，
７００ダルトンの分子量を有する。リシンＡと同様に、
正確な配列はヒマの品種により異ることが知られてい
る。

【００１９】“実質的に同一な”なる語は、問題の蛋白
質がおよそ同じ長さ（活性のために必須の特徴が一層短
いペプチド、すなわち“断片”中に、又は一層長い配
列、すなわち融合蛋白質中に存在することが知られてい
るとしても約１０％以内）を有しなければならず、しか
しさらに重要であり且つこの定義にとって必須のことに
は、６０Ｓリボゾームサブユニットと相互作用しそして
これを無能力化するリシンＡ鎖の能力を維持していなけ
ればならないことを意味する。この酵素活性を大きく損
わない鎖の長さの変更が包含される。蛋白質分子の機能
的能力を攪乱することなく蛋白質配列中の幾つかの小さ
な変更が可能であることがよく知られている。但し、他
の変形が全体として破壊的である。特定の変更がいずれ
の範疇に属するかをある程度確実に予想することは今日
では不可能である。この発明の定義は、第一の範疇に属
する任意の変形を許容する。このような変更は遺伝子配
列中の偶然変異から生ずる場合があり、又はその意図的
な変更から生ずる。要約すれば、リシンＡの“酵素活
性”（後記）を維持するアミノ酸配列の変形が含まれ
る。

【００２０】さらに、よく知られているように、蛋白質
配列は翻訳後プロセミングにより、例えば他の分子と
の、例えばグリコシド、ソピド、又はリン酸イオンのご
とき無機イオンとの結合により変形され得る。イオン状
態もまた、媒体のｐＨ、又は単離形の結晶化もしくは沈
澱が生じたｐＨに依存して異るであろう。さらに、空気
の存在が−ＳＨ基のごとく感受性基の酸化を生じさせる
であろう。特定の一次構造のこのような変形のすべて、
すなわち、例えばグリコシル化形及び非グリコシル化形
の両者、中性形、酸性塩及び塩基性塩、リピド又は他の
ものとの結合ペプチド形、酸化又は誘導体化による側鎖
の変化、並びに同じ遺伝子コドン配列によりコードされ
るであろうアミノ酸配列の他の変更がリシンＡの定義に
含まれる。

【００２１】この発明の方法により調製されたリシンＡ
又はリシンを記載する場合に使用される“不純物”なる
語は、ヒマの種子において生産される蛋白質と通常関連
する物質を意味し、この場合は上記の蛋白質の変形には
含まれない。従って、“不純物”は、アグルチニン、及
びリシン又はリシンＡに非特異的に通常の場合に関連し
ている他のヒマ種子の細胞性物質を意味し、リシンＡ自
体については、“不純物”はリシンＢを包含する。

【００２２】この明細書において使用する場合、“可溶
性”なる語は、生理的浸透圧条件下での水性緩衝液、例
えば０．１４Ｍ塩化ナトリウム又はシュークロース中
で、１２０mg／mlの蛋白質濃度において、１００，００
０×ｇにて３０分間の遠心の後に上清に残る蛋白質に関
連する。これらの条件は特に、洗剤又は他の変性剤、例
えばグアニジン又は尿素の有効濃度での不存在に関す
る。

【００２３】“リシン”は、前記のごとくＡ鎖及びＢ鎖
の両者を含有し細胞変性活性を有する蛋白質に関する。
前記のごとく、従来より、当業界においてリシンはＲＣ
Ａから区別される。リシンＤ及びリシンＥの両者はＡ鎖
及びＢ鎖を含有する。これらの蛋白質間の差異はＢ部分
に存在するようである。リシン及びＲＣＡの両者につい
て、“前駆体”蛋白質は、Ａ部分とＢ部分との間に“リ
ンカー”ペプチドを含有する単鎖蛋白質を意味する。こ
のリンカーは、天然形においては１２量体である。この
発明の特定のリシンに関連するリンカーは、得られた３
種類のリシン関連のクローンのすべてにおいて同一の配
列を有する。

【００２４】この天然配列を便利に変形して、例えばト
リプシン開裂部位を得ることができる。このような変形
された蛋白質もまた“前駆体蛋白質”である。さらに、
前駆体蛋白質をコードするＤＮＡを変形して、Ａ部分と
Ｂ部分との間の配列内に翻訳終止コドン及び翻訳開始コ
ドンを存在せしめることができる。この造成物はＡ部分
及びＢ部分の別個の生産をもたらすが、それにもかかわ
らずこの発明においてはこの造成物は“前駆体蛋白質”
をコードするものとして定義される。終止コドン及び開
始コドンはリンカー配列内の任意の便利な位置に配置す
ることができる。すなわち、得られるＡ又はＢ部分は幾
分かの追加の配列を含むことができる。

【００２５】“生物学的に活性な”なる語は、その天然
状態にある蛋白質の機能を象徴する酵素的又は他の生物
学的挙動を維持していることに関する。リシンＡの生物
学的活性は、１つの観点において、酵素活性、すなわち
ラビット網状赤血球インビトロ翻訳系（例えばベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ、ロックビル、ＭＤから市
販されている系）において蛋白質合成を阻害するその能
力を意味する。酵素的に活性であることに加えて、リシ
ンＡトキシンの可溶性調製物はまた、特異的結合成分、
例えば免疫グロブリンと接合してイムノトキシンを形成
した場合に特異的細胞変性活性を示すことができる。

【００２６】“細胞変性活性”は、標的とされる細胞の
破壊を惹起するこれらのイムノトキシンの特異的能力に
関し、生物体に対する一般的毒性とは異る。細胞変性活
性は、標的細胞を含む細胞培養物を用いてインビトロ
で、又は標的細胞の移植片又は天然に存在する群を用い
てインビトロで証明することができる。要約すれば、リ
シンＡの生物学的活性は少なくとも３つの規準によって
証明される。すなわち、蛋白質合成を阻害する酵素活
性、このトキシンに接合された免疫グロブリンの結合成
分に特異的な抗原を含有する培養細胞がこれらの免疫接
合体によって選択的に殺される場合のインビトロ細胞変
性活性、及びイムノトキシンが該免疫接合体中の結合成
分を構成する抗体と反応する細胞に結合しそしてそれを
選択的に殺すことができる場合のインビボ細胞変性活性
により証明される。特定の蛋白質に対して生じた抗体と
の免疫的交差反応性が残っている場合でも、前記の生物
学的活性のすべて又は幾つかが存在しない場合があるこ
とが認識される。

【００２７】“分泌”とは、細胞膜を通しての輸送を意
味する。蛋白質が培地中に現われるか否かは細胞壁の存
否に依存する。細胞壁が存在する場合には蛋白質はペリ
プラズムに見出され、細胞壁が存在しない場合には培地
中に存在するであろう。“アルカリ性ホスファターゼ
Ａ”（ｐｈｏＡ）は、例えばKikuchi, Y. 等、Nucleic
Acids Res. (1981) 9 : 5671-5678 により開示されてい
るような、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のアルカリ
性ホスファターゼ構造遺伝子に関する。この構造遺伝子
はＥ．コリ遺伝子地図上の８．５分に位置し〔Bachman
n, B. J. 等、Microbiol Rev. (1980) 44 : 1-56 〕、
そしてその本来的な発現は比較的複雑である。しかしな
がら、プロモーター領域及びＮ−末端領域は配列決定さ
れており〔Kikuchi, Y. 等（前掲）〕、そしてシグナル
ペプチドの配列が推定されている〔Inouye, H.等、J. B
acteriol. (1982) 149 : 434-439〕。

【００２８】ここに記載する定義は、特定の構造遺伝子
及びその部分のみならず、他の細菌由来の又はインビト
ロ合成された機能的同等物をも包含する。機能に影響を
与えることなくヌクレオチド配列にわずかな変更を行う
ことができること、及び異る株又は種の原核細胞由来の
配列が上記の由来の配列と絶対的に同一ではない配列を
含有する場合があり、そして確かにほとんど確実にそう
であることが理解される。さらに、この発明と関連し
て、適当な制限開裂部位を設けるためにこの配列に機能
の喪失をもたらさない変更が行われた。

【００２９】アルカリ性ホスファターゼ構造遺伝子のた
めの次の配列、すなわちプロモーター、リボゾーム結合
部位、リーダー配列、及び転写停止配列がこの発明と関
連する。上流の制御配列及びリーダー配列が下記の例示
において使用され、転写停止配列はＢ．チューリンジェ
ンシス（B. thuringiensis）結晶蛋白質遺伝子により代
替される。Wong等、PNAS USA, 83 : 3233-3237 (1986)
、及び１９８６年３月に公開されたヨーロッパ特許出
願Ｎｏ．８５３０６１８３．６。プロモーター、リボゾ
ーム結合部位及びシグナル配列を含む５２０bp断片のヌ
クレオチド配列がKikuchi, Y. （前掲）に開示されてい
る。ＮａｒＩ部位を有する様に変形されたリーダーのヌ
クレオチド配列が第５図に示されている。

【００３０】この変形により、アルカリ性ホスファター
ゼのコード配列以外のコード配列がリーダー配列とリー
ディングフレームを合わせて置き換えられ、そしてこの
意味においてこのリーダー配列がなお機能的であること
を可能にする。しかしながら、ＮａｒＩ部位への転換は
アルカリ性ホスファターゼ自体に関してはプロセシング
を防止する。なぜなら、アルカリ性ホスファターゼ配列
のＮ−末端のコドンが今やプロリンに転換されるからで
ある。ＮａｒＩ部位のこの部分は連結部において除去さ
れるので挿入された配列に係る機能は損われない。

【００３１】“終止された”リーダー配列は、リーダー
ペプチドをコードするＤＮＡがその正常なカルボキシ末
端の近傍であってリーディングフレーム内に終止コドン
を有することを意味する。この発明の発現系においては
終止コドンがまた発現されるべき所望の外来蛋白質のＡ
ＴＧ開始コドンの近傍にある。従って、リーダー又は所
望の“成熟”蛋白質は、それらの天然対応物に比べて、
この結合領域中にコードされたわずかに少数の又はわず
かに多数のアミノ酸を有することができる。

【００３２】ＤＮＡ配列を記載する際に用いられる“作
用可能に連結された”なる語は、配列の機能が保存され
る様な態様での並置を意味する。すなわち、例えば、制
御配列に“作用可能に連結された”コード配列は、これ
らの配列がコード配列を発現することができる様に配置
されている。“制御”配列は、転写及び翻訳の開始及び
停止を制御するＤＮＡ配列を意味する。例えば、原核生
物系においては、制御配列はプロモーター又はプロモー
ター／オペレーター、及びリボゾーム結合部位をコード
するヌクレオチドを含んで成り、真核生物系においては
プロモーター、ターミネーター及びエンハンサーが関与
する様である。

【００３３】“組換宿主細胞”は組換技法により造成さ
れたＤＮＡ配列により形質転換された細胞に関する。こ
の定義は、例えば濾過により又は遠心分離ペレットとし
て分離された細胞、及びこれらの細胞の培養物を包含す
る。確かに、“細胞”及び“細胞培養物”は、文脈が許
す限り、この明細書においては相互交換可能に使用され
る。さらに、“細胞”への言及はその子孫を含む。この
ような子孫は同一のゲノム構造を有するか、又は本来的
な不安定性、意図的な変異、又はゲノム構造の偶然的変
化のために変形されたゲノムを含有する。

【００３４】リシンＡと“会合”した細胞材料は組換リ
シンＡに非特異的に結合することができる不溶性断片で
あり、この場合、この会合から開放された場合にリシン
Ａは前記の定義により可溶性であるとしても、破片が除
去される場合リシンＡも沈降すると見られる。次に、組
換リシンＡを得るために行われる方法を簡単に下記す
る。

【００３５】リシンＡコード配列の検索１．生育中のヒマの種子からｍＲＮＡを単離し、そして
一般に常法に従って対応するｃＤＮＡを調製することに
よりｃＤＮＡを造成した。単鎖コピーを合成する場合の
プライマーとしてＢ鎖のＮ−末端領域（これはＡ鎖コド
ンのすぐ下流にある）をコードするｍＲＮＡに相補的な
オリゴヌクレオチド５′−GACCATTTCGACCTACG −３′を
使用し、そしてオリゴｄＣホモポリマーテイルを３′に
付加して、２本鎖化におけるプライマーとしてオリゴｄ
Ｃが使用できるようにした。次に、標準的テイル形成法
によりｃＤＮＡに設けられたホモポリマーオリゴｄＣテ
イルを、開裂されたベクター上に設けられたオリゴｄＧ
テイルとアニールせしめることにより、前記の得られた
２本鎖ｃＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＢＲ３２
２のＰｓｔＩ部位に挿入した。連絡混合物をＥ．コリに
形質転換した。プローブを用いるハイブリダイゼーショ
ンにより約５，０００個の好結果の形質転換体をスクリ
ーニングした。

【００３６】２．プローブとしてオリゴヌクレオチド混
合物５′GCATCTTCTTGGTTGTCNGGATGAAAGAAATAGGC −３′
（ここで、ＮはＡ，Ｔ，Ｇ、又はＣである）を使用し
た。この配列はまずOlsnes（前掲）による総説中に記載
されているアミノ酸配列に基いて推定され、そしてＤ．
２．において下記するようにして確認された。３．陽性クローンを制限酵素分析及び部分的配列決定に
より分析した。２つのｃＤＮＡが見出された。１つはリ
シンＡから見出されたものと予想され、そして他方は、
リシンＡから得られたものと実質的に異るためアグルチ
ニンＡに関連するものと予想された。配列決定し、そし
て推定されるアミノ酸配列を天然リシンＡのそれと比較
することにより確認した場合、リシンＡのための完全な
配列を含有するコロニーが得られた。このコロニーから
単離されたプラスミドＤＮＡをｐＲＡ１２３と命名し、
そして保存番号ＣＭＣＣ２１０８として保存した。ｐＲ
Ａ１２３は１９８４年８月１４日にＡＣＴＴに寄託さ
れ、受託番号Ｎｏ．３９７９９を有する。

【００３７】なお、所望のリシンＡコード配列を得るた
めに前項に記載した方法を繰り返す必要はない。リシン
Ａをコードする十分な長さのヌクレオチドが図１に示さ
れており、そしてＡＴＣＣに寄託されている。当業界に
おいて知られている方法を用いて、開始コドン及び終止
コドンを含む約８０７ヌクレオチドを包含する適切な配
列を合成することもできる。〔例えば、Edge, M. D.
等、Nature (1981) 292: 256 ; Nambiar, K. P.等、Sci
ence (1984) 223 : 1299 ; 又はJay, Erunst 等、J. Bi
ol. Chem. (1984) 259 : 6311を参照のこと〕。リシン
Ａ配列の所望の部分又は発現ベクターの造成のための付
加配列を得るために有用な所望の配列変更は、後で発現
ベクターの造成について記載する方法に類似する方法
で、部位特異的変異誘発を用いて行うことができる。

【００３８】リシンＡの発現配列及びそれを含有するベ
クターの造成４．完全なリシンＡ鎖のためのコード配列を含有するｐ
ＲＡ１２３中のｃＤＮＡ挿入部をプライマー指令変異誘
発により変形して、ＲＴＡ配列に先行する新たに造成さ
れるＡＴＧ開始コドンの前にＨｉｎｄ III部位を置き、
そしてＣ−末端に終止コドンを置く。

【００３９】５．次に、リシンＡ鎖の適切に終るコード
配列をＨｉｎｄ III／ＢａｍＨＩカセットとして取り出
し、そして適切な発現ベクター中に連結することができ
た。２種類の宿主発現ベクター系、すなわち、Ｈｉｎｄ
III部位のすぐ前にｔｒｐプロモーター及びリボゾーム
結合部位を備えたｐＴＲＰ３、並びにＨｉｎｄ III部位
のすぐ上流にλＰ_Lプロモーター及びＮ遺伝子リボゾー
ム結合部位を含有し、さらに温度により制御されるレプ
リコンを含有するｐＰＬＯＰを使用した。

【００４０】６．他の方法として、発現配列はｐｈｏＡ
プロモーター／オペレーター及びリーダー配列並びに適
当なレトロレギュレーター（ｒｅｔｒｏｒｅｇｕｌａｔ
ｏｒ）を用いる。ｐｈｏＡ上流配列及びＢ．チュメファ
シエンス結晶蛋白質遺伝子由来のポジティブレトロレギ
ュレーターを含有するｐＳＹＣ１０８９が制御配列源と
して便利に使用される。ポジティブレトロレギュレータ
ーはヨーロッパ特許出願８５３０６１８３．６に詳細に
記載されており、この記載を引用によりこの明細書に組
み入れる。ｐＳＹＣ１０８９の造成を後で記載する。

【００４１】７．次に、発現ベクターを適切な宿主に形
質転換した。すなわち、ｐＴＲＰ３又はｐＳＹＣ１０８
９由来の発現ベクターはＥ．コリＫ１２株ＭＭ２９４に
形質転換し、そしてｐＬＯＰ由来の発現ベクターをＥ．
コリＭＣ１０００λ溶原株（下記参照のこと）に形質転
換した。次に、形質転換された宿主をリシンＡの生産の
ために適当な条件下で培養した。

【００４２】組換蛋白質の生産８．得られた発現ベクターｐＲＡＴ１，ｐＲＡＬ６、及
びｐＲＡＰ２２９により形質転換された組換細胞により
生産される異種蛋白質が目的とするリシンＡであること
がウエスタンブロットにより、及び部分精製された画分
の酵素活性により示された。

【００４３】さらに、ｐＲＡＴ１，ｐＲＡＰ２１８，ｐ
ＲＡＰ２２１０、又はｐＲＡＰ２２９により形質転換さ
れたＥ．コリにより生産されたリシンＡ蛋白質は可溶性
形であり、そして細胞内環境と会合した。適当な分子量
及び免疫反応性を示すことに加えて、ウエスタンブロッ
ト及び酵素活性により、ｐＲＡＰ２２９形質転換体由来
のリシンＡはインビボ及びインビトロの両方において細
胞変性活性を有することが示された。

【００４４】９．ｐＲＡＰ２２９形質転換体により生産
されたリシンＡを、部分精製された音波処理物をフェニ
ルセファロースで処理することを含む一連のクロマトグ
ラフィー段階を用いて均一に精製した。精製された材料
をトランスフェリン又は乳癌細胞と反応する抗体に接合
せしめることによりイムノトキシンを形成せしめた。こ
のイムノトキシンは前記のインビボ及びインビトロ細胞
変性活性を有することが示された。

【００４５】１０．全体リシンの発現のため、ｐＲＡ１
２３のｃＤＮＡ挿入部をＡ鎖開始コドンの領域において
のみ変形し、そして前記５項に記載したのと同様にし
て、ｐＲＡＬ６及びｐＲＡＴ１に類似しているがしかし
Ａ鎖のＣ−末端に終止コドンを有しないプラスミドを得
る。次に、リシン配列を完成する残りのコドンをこれら
の類似のプラスミド中に挿入する。

【００４６】１１．分泌形のリシン又はリシンＡの発現
を、適切なベクター／宿主系、例えばリシン前駆体及び
シグナル配列を正しくプロセシングすることができる酵
母、植物又は哺乳類細胞において達成することができ
る。分泌を得るため、ｐＲＡ１２３をプライマー指令変
異誘発によって変形して、本来のＮ−末端にではなく、
シグナル配列に先行するＡＴＧ開始コドンの上流にＨｉ
ｎｄ III部位を設ける。適当なプライマーは図１に示さ
れている。リシン自体が発現されるべき場合、これはｐ
ＲＡ１２３中で行われる変形のみであり、リシンＡが分
泌されるべき場合、前記のような終止コドンを設ける変
形も行われる。次に、これらの適当に変形されたｐＲＡ
１２３配列を用いて、５項に記載したのと同様の方法
で、しかし真核性制御配列を導入することにより発現プ
ラスミドを造成する。分泌されるリシンを生産するよう
に計画されたこれらのプラスミドのため、残りのＢ部分
コード配列を類似体にリーディングフレームを合わせて
終止コドンを伴わないで与える。

【００４７】十分な長さのリシンコードクローン及びＲ
ＣＡコードクローンの検索１２．リシンＡについて前記したのと同様にして調製し
たメッセンジャーＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリー
を得、そして次にこのライブラリーをプローブして所望
のｃＤＮＡ挿入部を検索することにより、リシンＤ、推
定上のリシンＥ、及びＲＣＡをコードする十分な長さの
配列を得た。Okayama 及びBerg〔Mol. and Cell Biol.
(1983) 3 : 280-289〕の方法を用いてライブラリーを調
製し、そしてリシンＡコード配列のために使用したのと
同じ３５−ｍｅｒを用いてプローブした。クローニング
ベクターによる数千個の形質転換体から多数の陽性にハ
イブリダイズするクローンが得られた。

【００４８】１３．陽性にハイブリダイズするコロニー
を制限分析にかけ、リシンＤに対応する制限パターン、
ＲＣＡに対する制限パターン、及びどれにも対応しない
第３のタイプが示された。これら３つのタイプのそれぞ
れの代表的なクローンからのｃＤＮＡ挿入部を配列決定
した。配列情報の結果を図１２〜１３、図１４〜１５、
及び図１６〜１７に示す。図１２〜１３は、ＲＣＡコー
ド挿入部を表わし；図１４〜１５は、リシントキシンＤ
をコードする挿入部の配列、すなわちすでに開示されて
いるリシンのＢ鎖のそれを含有する配列を示し；そして
図１６〜１７は、リシンＥの前駆体であると予想される
前駆体、すなわちリシンＡに対応するトキシン部分を有
するがしかしすでに得られているリシンＢのアミノ酸配
列とは異る一次アミノ酸配列を含むＢ鎖を有する蛋白
質、をコードする挿入部のヌクレオチド配列を示す。

【００４９】リシンＡについて前記したように、これら
の配列を単離するための方法を繰り返す必要はない。な
ぜなら、インビトロでの化学的手段及び酵素的手段を用
いる合成的方法により図に示すＤＮＡ配列を造成するこ
とができるからである。リシン及びＲＣＡのための発現ベクターの造成１４．リシンＡについて記載したのと同様にして、前記
のｃＤＮＡ挿入部を発現ベクターに入れることができ
る。単離された挿入部に含まれるコード配列の連接的発
現のためには、ＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ断片としてサブクロ
ーニングされた挿入部を、Ｋｌｅｎｏｗにより平滑末端
化した後、適当なＭ１３ベクター（例えばＭ１３ＭＰ
１８）中にＳｍａＩ部位において挿入する。

【００５０】リシンＡについて前記したようにして成熟
蛋白質の初めにＡＴＧ開始コドン及びＨｉｎｄ III部位
を置くために、又は適当であればリーダー配列のＡＴＧ
のすぐ前にＨｉｎｄ III部位を置くために、部位特定変
異誘発を行うことができる。Ｍ１３ベクターをコード配
列の３′ＰｓｔＩ部位において開裂せしめ、Ｋｌｅｎｏ
ｗにより平滑末端にし、新たに形成された部位において
Ｈｉｎｄ IIIにより消化し、そして適当な長さの配列を
単離することにより、Ｍ１３ベクターから変異したＤＮ
Ａを切り出すことができる。次に、単離された断片をＨ
ｉｎｄ III／ＢａｍＩ（平滑）消化されたｐＴＲＰ３又
はｐＰＬＯＰに連結して、リシンＡについて前記したよ
うに便利な原核細胞での発現を行うことができる。

【００５１】１５．挿入部のコード配列はまた、リシン
Ａについて前記したようにして、そして後でさらに詳細
に記載するようにして、ｐｈｏＡプロモーター−オペレ
ーター及びリーダー配列及び適当なレトロレギュレータ
ーを含有する発現ベクター、例えばｐＳＹＣ１０８９中
に連結することができる。１６．次に、リシンＡについて記載したようにして、発
現ベクターを適当な宿主に形質転換し、そして培養上清
又は細胞溶解物から蛋白質を回収する。合成された前駆
体蛋白質は、幾つかの宿主内で細胞自体によって行われ
る翻訳後プロセシングにより、あるいは適当な酵素又は
細胞抽出物を用いるインビトロ切り出しにより、介在す
る１２ｍｅｒを切り取ることにより開裂せしめることが
できる。

【００５２】変形された前駆体ベクター１７．ＲＣＡ又はリシントキシンへの前駆体の転換を促
進するため、特にリンカー部分において変更を行ってＡ
部分及びＢ部分を切り離すための適当な手段を設けるこ
とができる。２つの便利な手段は、（１）リンカーの
“ａｒｇ−ａｒｇ”形（ここで、アルギニン残基に続く
プロリンがもう１つのアルギニンにより置き換えられて
いる）を形成することによるトリプシン開裂部位の造
成；及び（２）Ａ領域及びＢ領域が別個にしかし同時に
生産されるためのリンカー領域中での終止コドン及び開
始コドンの挿入である。

【００５３】可溶性リシンＡリシンＡのためのコード配列をｐｈｏＡのリーダー配列
をコードするＤＮＡに直接リーディングフレームを合わ
せて配置して仮想的な融合ペプチドを形成するように
し、こうすることによってリーダー配列がリーダー−リ
シンＡキメラのＮ−末端部分である場合、このように配
置されたリシンＡ配列は分泌されない。しかしながら、
ＤＮＡがＥ．コリＭＭ２９４において発現される場合、
ｔｒｐプロモーターの制御のもとにある造成物がそうで
あるようにこれらの造成物は可溶性の細胞変性物質をも
たらす。これは、４２℃の温度におけるＭＣ１０００λ
中Ｐ_Lプロモーターの制御のもとにあるリシンＡ配列を
有する造成物の場合と対照的であり、この場合得られる
生成物は比較的不溶性である。

【００５４】リシンＡについて前記したのと同様の方法
で、ｐＲＴ３，ｐＲＴ１７、及びｐＲＴ３８中にコード
されている前駆体蛋白質又はそれらの変異形をコードす
る類似の発現ベクターを造成することができる。この造
成物はリシンＡのためのそれと正確に同一であるが、造
成に使用される細胞部位から下流のＤＮＡ配列も含まれ
る。これらのベクターによる宿主細胞の形質転換が可溶
性前駆体をもたらす。ａｒｇ−ａｒｇ変形された前駆体
はトリプシンにより容易に開裂されることができ、前駆
体のＡ部分及びＢ部分がこの明細書に記載する別個の蛋
白質として生産され得る。

【００５５】ｐｈｏＡ発現系において、必須構成成分
は、リシンＡコード配列の上流にありこの配列の近傍に
ありそしてこの配列のリーディングフレーム外にある終
止されたｐｈｏＡリーダー配列であり、この場合リシン
Ａコード配列はＡＴＧコドンにより開始される。これら
２つのコード配列は、言うまでもなく適合性の細菌プロ
モーターを備えていなければならず、これは便利にはリ
ーダー配列にすでに関連しているｐｈｏＡプロモーター
でよく、しかし任意の適合性の原核性プロモーター／リ
ボゾーム結合部位系であってもよい。

【００５６】さらに、ポジティブレトロレギュレーター
配列の存在によって生産が改良され、このレトロレギュ
レーター配列は最も有利にはＢ．チュリンジェンシス結
晶蛋白質と関連するポジティブレトロレギュレーター配
列であることができ、これは１９８６年３月１９日に公
開されたヨーロッパ特許出願Ｎｏ．８５３０６１８，６
（前掲）に詳細に記載されている。この発明の上記の発
現系及び他の発現系は典型的には、レプリコン及び選択
マーカーのごとき標準的要素を含む細菌性輸送ベクター
上に置かれる。これらの付加的要素の性質は本発明の部
分を構成しないが、これらの付加的要素の最適化が好ま
しいことが理解される。

【００５７】次に、このベクターを用いて適切な原核性
宿主を形質転換し、この形質転換体を選択された特定の
宿主のために適切な条件下で、最もしばしば発現系の制
御のもとに置かれたプロモーターが抑制される条件下で
増殖せしめる。次に、選択されたプロモーターの制御の
もとで発現を行う条件を与えることによってリシンＡの
生産を誘導し、そして主成物の所望の蓄積が得られるの
に十分な時間にわたって生産を進行せしめる。次に、例
えば音波処理又は機械的手段例えばフレンチプレスによ
り細胞を破砕し、そして細胞破片を除去することにより
蛋白質生成物を単離する。

【００５８】次に、この発明の系により生産されたリシ
ンＡを、自由に溶解する蛋白質に適用されるような当業
界において知られている標準的技法を用いてさらに精製
する。しかしながら、部分的に精製された抽出物をフェ
ニルセファロースで処理することにより抽出及び精製の
効率が増強される。フェニルセファロースは、リシンＡ
が非特異的に結合している細胞材料からのリシンＡの解
離を助けるようである。音波処理物中のリシンＡの溶解
性（膜又は他の会合している材料から分離された後）
は、該音波処理物を１００，０００×ｇにて３０分間高
速遠心分離にかけて不溶性蛋白質を回転沈降させた場合
に上清に残るその能力により示される。

【００５９】溶解性は、精製方法及び特異的細胞変性活
性の試験に関して特に重要である。組換蛋白質を可溶化
するために一般に使用される１つの方法は、それらを洗
浄、例えば尿素、グアニジン塩酸塩、又はＳＤＳの存在
下に置くことである。しかしながら、溶液中の洗剤は精
製工程及び生物学的活性試験の両者を妨害する。可溶化
媒体からの洗剤の除去は、多くの場合、そして特にリシ
ンＡの場合、蛋白質の再沈澱をもたらし、そしてその効
率的な精製を不可能にし、そしてさらにこの材料を用い
て形成された免疫接合体を細胞変性試験において不活性
なものとする。

【００６０】この項において記載した方針の詳細及びこ
れに使用される手順は後の項において記載する。Ｃ．方法Ｃ．１．ｍＲＮＡの精製リシン、リシンアグルチニン、及びリシンＡをコードす
るｍＲＮＡを下記のようにして調製した。要約すれば、
Belamy, A. R. 等、Methods in Enzymology (1968) XI
I, PartB : 156-160 の方法を幾らかの変更を加えて使
用した。このような１つの変更は、植物組織源からメッ
センジャーＲＮＡを調整する場合の問題点を構成する酸
化されたフェノール性化合物を調製物から除去すること
に成功する。他の変更は、ｄＴアフィニティーカラムク
ロマトグラフィーを妨害するかもしれないリボゾームＲ
ＮＡとｍＲＮＡとの結合の破壊をもたらす。

【００６１】酸化されたフェノール化合物を除去するた
め、調製物をセファデックスＧ−１００で処理した。ゲ
ルは酸化されたフェノール化合物を保持し、そしてｍＲ
ＮＡをボイドボリウム中に通過せしめる。（フェノール
性化合物及びトランスファーＲＮＡの両者が阻止され
た。）リボゾームＲＮＡ複合体を除去するため、前記のＧ−１
００カラムから出たＲＮＡの懸濁液を変性剤と反応せし
め、次にこの調製物をｄＴアフィニティーカラムに適用
した。

【００６２】Ｃ．２．ベクター及び宿主細胞下記の特定の具体例は、原核生物に適合性のベクターを
造成する方法及びこのベクターを原核性宿主細胞に形質
転換する方法を記載する。Ｅ．コリＫ１２株ＭＭ２９
４、及びＥ．コリＭＣ１０００λ溶原株について特に記
載する。しかしながら、他の微生物株、例えばバシル
ス、例えばバシルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ）の色々な種、又は他の細菌株を用いることも
できる。このような原核系において、宿主と適合性の種
に由来する複製点及び他の制御配列を含有するプラスミ
ドベクターが使用される。

【００６３】例えば、Ｅ．コリは典型的には、Boliver
等、Gene (1977) 2 : 95によりＥ．コリ種から誘導され
たプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質
転換される。ｐＢＲ３２２はアンピシリン耐性及びテト
ラサイクリン耐性のための遺伝子を含有し、そしてそれ
故に所望のベクターを造成する際に維持されるか又は破
壊されるマーカーを提供する。転写開始配列、場合によ
ってはオペレーター、及びリボゾーム結合部位配列を包
含するものとしてこの明細書において定義される一般に
使用される原核性制御配列は、β−ラクタマーゼ（ペニ
シリナーゼ）及びラクトース（ｌａｃ）プロモーター系
〔Chang 等、Nature (1977) 198 : 1056〕；トリプトフ
ァン（ｔｒｐ）プロモーター系〔Goeddel 等、Nucleic
Acids Res. (1980) 8 : 4057〕；並びにλ由来Ｐ_Lプロ
モーター及びＮ−遺伝子リボゾーム結合部位〔Shimatak
e 等、Nature (1981) 292 : 128 〕のごとき一般に使用
されるプロモーターを含む。しかしながら、原核生物と
適合性の任意の入手可能なプロモーター系を使用するこ
とができる。

【００６４】リシンＡ及びリシンは真核細胞に対して毒
性であり、そしてそれ故に原核性宿主が好ましい。しか
しながら、幾つかの場合には真核性宿主を使用すること
ができ、確かに、リシンは本来真核生物において生産さ
れるものである。すなわち、例えばシグナル配列がリシ
ンＡ又はリシンのために保持されそして細胞により毒性
が経験される前に分泌が可能であれば、真核性宿主を使
用することも適当である。

【００６５】これに代る場合として、ある種の真核性環
境はリシン又はリシンＡの変更されたプロセシングをも
たらし、これらの潜在的な毒性に対して細胞を保護する
ことができる。このような機構は現時点では確立されて
いないが、しかしながら、対象蛋白質の適切な折りたた
み、グリコシル化、又は他の三次元的及び誘導体的構造
への変化により毒性が抑制される可能性がある。

【００６６】真核生物を使用する場合、真核微生物、例
えば酵母を使用することができる。パン酵母であるサッ
カロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が最も一般的に使用される
が、しかし他の多くの菌株も一般に使用可能である。酵
母での発現のために適当な多くのプラスミドベクターも
知られている〔例えば、Stinchcomb等、Nature (1979)
282 : 39、及びTschempe等、Gene (1980) 10 : 157を参
照のこと〕。酵母ベクターのためのプロモーターには、
解糖系酵素の合成のためのプロモーター〔Hess等、J. A
dv. Enzyme Reg . (1968) 7 : 149 ; Holland等、Bioche
mistry (1978) 17 : 4900 〕が含まれる。酵母適合性プ
ロモーター、複製開始点及び他の制御配列を含有するベ
クターが適当である。

【００６７】同様に、多細胞生物由来の真核性宿主細胞
培養物中でポリペプチドをコードする遺伝子を発現せし
めることができることが見出されている。例えば、Ｔｉ
ｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅｓ，アカデミックプレス，Cr
uz及びPatterson 編（１９７３）を参照のこと。有用な
宿主セルラインにはＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、及び
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれ
る。このような細胞のための発現ベクターは一般に、哺
乳類細胞と適合性のプロモーター、例えば一般に使用さ
れるシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）からの初期及び
後記プロモーター〔Fiers 等、Nature (1978) 273 : 11
3 〕を包含する。

【００６８】最後に、高等植物からの細胞及び高等植物
の部分が組換宿主として有用であることが見出されてお
り、そしてこれらの系での発現のために適当な制御配列
が入手可能である。適当なプロモーター及びポリアデニ
レーションシグナルは、Ａ．チュメファシエンス（Ａ．
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＴｉプラスミドｐＴｉＴ３７
〔Bevan, M. 等、Nucleic Asids Res. (1983) 11 : 369
; Depicker, A. 等、J. Mol. Appl. Genet. (1982) 1
: 5613〕のＴ−ＤＮＡ領域中の３．２キロベース（ｋ
ｂ）Ｈｉｎｄ III−２３ＤＮＡ断片由来のノパリン・シ
ンサーゼ（ｎｏｐａｌｉｎｅｓｙｎｔｈａｓｅ）（Ｎ
ＯＳ）のそれらである。適当な植物細胞には、タバコ、
ペチュニア、及び棉に由来する細胞、又はこれらの植物
の実生が含まれる。

【００６９】他のプロモーターには、アルコールデヒド
ロゲナーゼ−１又はアルコールデヒドロゲナーゼ−２の
ためのトウモロコシプロモーター〔Gerlach, W. L.等、
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)(1982) 79 : 2981〕、カ
リフラワーモザイクウイルスプロモーター〔Daubert,
S. 等、Virology (1982) 122 : 444 〕、及びリブロー
スビホフフェートカルボキシラーゼの小サブユニットと
関連する小麦プロモーター〔Broglie, R. 等、Biotechn
ology (1983) 1 : 55 〕が含まれる。現在入手可能な他
のポリアデニレーションシグナルには、上記の遺伝子の
いずれかの上に見出されるもの、又はSchuler 等〔Schu
ler, M. S.等、Nucleic Acid Res. (1982)10 : 8225〕
により記載されたものが含まれる。

【００７０】原核細胞又は実質的な細胞壁障壁を含有す
る他の細胞については、Cohen, S.N., Proc. Natl. Aca
d. Sci. (USA)(1972) 69 : 2110により記載されている
ような、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理法によ
り形質転換が行われる。このような細胞壁を有しない哺
乳類細胞については、Graham及びvander Eb, Virology
(1978) 52 : 546 のリン酸カルシウム沈澱法が好まし
い。植物細胞については、ポリエチレングリコールの存
在下でプロトプラスト調製物の直接形質転換が用いられ
る。Krens 等、Nature (1982) 296 : 72。

【００７１】この発明により達成される好結果の発現
は、目的とするトキシン断片の発現を制御するための適
当な制御配列の正しい使用に依存する。従って、宿主が
何であろうと、その宿主と適合性でありそしてその宿主
にふさわしい制御配列が、目的の配列の５′に適切に配
置された“開始”コドンを用いながらコード配列に対し
て作用可能に配置される。すべての“本来の”制御配列
が除去される。この発明のベクターは、特定の宿主に適
合性であるように選択された制御系から直接下流にある
ＡＴＧ開始コドンのすぐ後に、リシンＡ又はリシンペプ
チドのためのコード配列を置く。

【００７２】所望の断片の良好な生産を行う場合、生産
の“時期”を、宿主に対するすべての致命的効果を最少
にするように調節することも重要である。最も典型的に
は、原核生物についてさえ、実質的な増殖が起こるまで
リシン配列又はリシンＡ配列の発現を遅延せしめること
によりそれを行う。従って、環培条件に従う制御配列を
用いることが望ましい。増殖期間中発現を抑制する条件
を維持し、そして次に所望の時点で発現を許容する条件
に変えることにより、潜在的な致命的効果の不都合な観
点を最少にする。

【００７３】特に好ましい方法においては、これらの調
製可能な制御配列は原核性宿主と適合性である。ｔｒｐ
プロモーターは調節可能なプロモーターであり、この場
合作用可能に連結された配列は培地中のトリプトファン
のレベルにより調節され得る。増殖中に高いトリプトフ
ァンレベルを維持することにより発現が抑制される。ト
リプトファンの消耗又は競争的阻害がプロモーターをタ
ーンオンし、そして発現を許容する。

【００７４】λファージ由来のＰ_Lプロモーターは制御
可能であるが、生産されるリシンＡは不溶性である。こ
のプロモーターは温度感受性であることができる蛋白質
により制御される。（野性形レプレッサーの変異形、例
えばＣＩ₈₅₇が存在し、このものはこの特徴を有するこ
とが当業界において知られている。）この変異形のリプ
レッサーを合成することができる宿主（例えば、Ｅ．コ
リＫ１２ＭＣ１０００λファージ溶原株Ｎ₇Ｎ₅₃ＣＩ
₈₅₇ＳｕｓＰ₈₀）中で使用される場合、高温が変異ＣＩ
レプレッサーを不活性化するため温度が上昇した場合に
Ｐ_Lプロモーターがスイッチオンされるであろう。すな
わち、宿主細胞は低温において、外来蛋白質の低い生産
を伴って又は生産を伴わないで増殖することができる。
次に、増殖が達成され、そしてリシン又はリシンＡの生
産が望まれる時に温度を上昇せしめる。

【００７５】ｐｈｏＡ制御配列を使用する場合、細胞を
リン酸イオンの存在下に維持することにより発現を遅ら
せることができ、そして発現が望まれる場にリン酸レベ
ルを消耗せしめる。温度感受性コピー数制御を有するプ
ラスミドを使用することもできる。細胞が低温において
増殖する場合プラスミド中に含まれるコード配列は低レ
ベルで複製され、高温においてはこのコピー数が増加す
る。従って、生産される蛋白質の量はそのコード配列の
利用可能なコピー数を制御することにより間接的に制御
される。

【００７６】Ｃ．３．使用される方法所望のコード配列を含むｍＲＮＡ断片の単離は後に詳細
に記載する。鎖型としてポリＡＲＮＡを使用して、今
や当業界においてよく理解されている手段によりｃＤＮ
Ａライブラリーを造成する。ここで、このような方法の
幾つかを用いることができ、その詳細はManiatis, E.
F. 等、Molecular Cloning 、コールドスプリングハー
バーラボラトリーズ（１９８２）；及びOkayama, H及び
Berg, P. Mol. Cell. Biol. (1983) 3 : 280に言及する
ことにより得られる。ｃＤＮＡライブラリーを所望の配
列について、Grunstein 及びHogness, Proc. Natl. Aca
d. Sci. (1975) 72 : 3961の方法に準ずる方法を用いて
プローブする。

【００７７】ベクターの造成には当業界において知られ
ている連結及び制限技法が使用される。利用可能なＤＮ
Ａの量は目的とする断片をクローニングすることにより
増加せしめることができ、これはこの断片を適当なクロ
ーニングベクター、例えばｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１３又
はｐＵＣ８中に挿入し、Ｅ．コリ中に形質転換しそして
複製せしめ、そして場合によってはクロラムフェニコー
ル増幅を通してさらに増加せしめることにより又はファ
ージ複製により行われる。次に、所望の断片をクローニ
ングベクター又はファージから取り出し、そして遺伝子
の発現において使用することが意図される宿主と適合性
である適当なプロモーターに連結することができる。

【００７８】次に、このような宿主をこれらの発現ベク
ターにより形質転換し、そしてプラスミドの安定化及び
所望のトキシン断片の安全な生産のために好都合な条件
下で培養する。このような条件には、対数期増殖のほと
んどが達成されるまで制御プロモーターを抑制し、そし
て次にペプチドの合成に好都合なように条件を変えるこ
とを含む。ペプチドが分泌される場合、これを培地から
回収することができる。そうでない場合、又はペリプラ
ズム空間に分泌される場合、細胞を溶解しそして細胞溶
解物から所望の断片を回収する。

【００７９】所望のコード配列及び制御配列を含有する
適当なベクターの造成は、当業界においてよく理解され
ている標準的連結及び制限技法を用いる。単離されたプ
ラスミド、ＤＮＡ配列、又は合成されたオリゴヌクレオ
チドを開裂せしめ、加工し、そして所望の形に再連結す
る。部位特異的ＤＮＡ開列は１又は複数の適切な制限酵
素により当業界において一般に理解されている条件下で
行い、この条件の詳細はこれら市販制限酵素の製造者に
より説明されている。例えばニュー・イングランド・ビ
オラブスの製品カタログを参照のこと。一般に１μｇの
プラスミド又はＤＮＡ配列を約２０μｌの緩衝液中で１
ユニットの酵素により開裂せしめる。

【００８０】この発明の例においては典型的には過剰の
制限酵素を使用してＤＮＡ基質の完全な消化を保証す
る。約３７℃にて約１〜２時間のインキュベーション時
間が有用であるが、これと異ることもできる。各インキ
ュベーションの後、フェノール／クロロホルム抽出によ
り蛋白質を除去し、次にエーテル抽出を行い、そして次
に、エタノールを用いる沈澱により、又はビオゲルＰ−
６カラムに通し次に凍結乾燥によってサンプルを濃縮す
ることにより核酸を回収する。所望により、標準的技法
を用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動により、開裂
された断片のサイズ分離を行うことができる。サイズ分
離の一般的記載はMethods in Enzymology(1980) 65 : 4
99-560 中に見出される。

【００８１】制限開裂された断片は、５０mM Ｔｒｉｓ
（ｐＨ７．６），５０mM ＮａＣｌ，６mM ＭｇＣ
ｌ₂，６mM ＤＴＴ及び０．１mM ｄＮＴＰ中２０〜２
５℃にて約１５〜２５分間のインキュベーション時間を
用い、千種類のヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴ
Ｐ）の存在下でＥ．コリＤＮＡポリメラーゼの大断片
（Ｋｌｅｎｏｗ）により処理することにより、平滑末端
化することができる。クレノウ断片は５′接着末端をフ
ィルインするが、千種類のｄＮＴＰが存在する場合でさ
え、３′接着末端の１本鎖をチューバックする。所望に
より、接着末端の種類により指令される制限内で１種類
のみの又は選択されたｄＮＰＰを供給することにより選
択的修復を行うことができる。Ｋｌｅｎｏｗにより処理
した後、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、
エタノールで沈澱せしめそして／又はビオゲルＰ−６ス
ピンカラムに通す。

【００８２】適切な条件下でのＳ１ヌクレアーゼによる
処理がＤＮＡのすべての単鎖部分の急速な加水分解、及
び末端で始まる２本鎖部分のゆるやかな加水分解をもた
らす。Ｓ１ヌクレアーゼによる加水分解は典型的には１
５mM酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５），３００mM ＮａＣ
ｌ、及び１mM ＺｎＳＯ₄の緩衝液中で約２００ユニッ
ト／μｌのＳ１ヌクレアーゼを用いて行われる。通常、
約１０μｇのＤＮＡを加水分解するために５０〜１００
ユニットのＳ１ヌクレアーゼが使用される。

【００８３】エキソヌクレアーゼIII は２本鎖ＤＮＡを
攻撃するが、しかしヌクレオチド配列の３′末端から始
まる加水分解を行う。従って、２本鎖ＤＮＡの消化は２
個の５′突出接着末端をもたらす。加水分解は、１５mM
Ｔｒｉｓ（ｐＨ８），１０mM ＮａＣｌ，１mM Ｍｇ
Ｃｌ₂、及び０．１mM ＤＴＴを含有する緩衝液中で約
２０００ユニット／μｌのエキソヌクレアーゼIII を用
いて行われる。一般に、１０μｇのＤＮＡと反応せしめ
るために１５０ユニットのエキソヌクレアーゼIII を使
用する。

【００８４】合成オリゴヌクレオチドはMatteucci 等
〔J. Am. Chem. Soc. (1981) 103 : 3185-3191〕のトリ
エステル法により行う。アニーリングの前の又はラベル
化のためのキナーゼ処理は、過剰の、例えば１mmolの基
質に対して約１０ユニットのポリヌクレオチドキナーゼ
を用いて、５０mM Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６），１０mMＭ
ｇＣｌ₂，５mMジチオスレイトール、１〜２mM ＡＴ
Ｐ，１．７pmol ³²ＰＡＴＰ（２．９mCi ／mmol），
０．１mMスペルミジン、０．１mM ＥＤＴＡの存在下で
行う。

【００８５】連結は、正しくマッチするように末端が整
えられた所望のＤＮＡ断片のおよそ等モル量（２〜１０
倍過剰のリンカー又は小オリゴマー）を用いて、過剰量
の、すなわち典型的な１５〜３０μｌの反応混合物中
０．４〜４ＷｅｉｓｓユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ
で処理することにより、そして平滑末端連結が使用され
る場合には０．４〜１ユニットのＲＮＡリガーゼを用い
て行われる。平滑末端連結又は接着末端連結のため、６
６mM Ｔｒｉｓを５mMマグネシウムイオン、５mMジチオ
スレイトール、１mM ＡＴＰ及び０．１mg／ml ＢＳＡ
と共に用いて連結混合物を約ｐＨ７．６に緩衝化する。
インキュベーションは約１４〜２５℃にて一夜行う。

【００８６】“ベクター断片”を用いるベクターの造成
において、場合によってはベクター断片を細菌アルカリ
性ホスファターゼ（ＢＡＰ）で処理して５′リン酸を除
去しそしてベクターの再連結を防止する。ＢＡＰ消化は
約５０mMのＴｒｉｓ中ｐＨ８．３において、Ｎａ⁺及び
Ｍｇ⁺⁺の存在下でベクターμｇ当り約１ユニットのＢＡ
Ｐを用いて６０℃にて約１時間行う。核酸断片を回収す
るため、調製物をフェノール／クロロホルムで抽出し、
そしてエタノール沈澱せしめ、そしてビオゲルＰ−６ス
ピンカラムに適用することにより脱塩する。他の方法と
して、不所望の断片の追加の制限酵素開裂により二重消
化されたベクターにおいて再連結を防止することができ
る。

【００８７】オリゴヌクレオチドにより誘導される変更
誘発は、所望の変異を代表する限定されたミスマッチを
除くほか変異されるべき１本鎖ファージＤＮＡに相補的
なプライマー合成オリゴヌクレオチドを用いて行う。要
約すれば、オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用
してファージに相補的な鎖の合成を指令し、得られる２
本鎖ＤＮＡをファージ支持宿主細菌に形質転換し、そし
て培養物を増殖せしめる。次に、培養物をプレート上に
拡げ、ファージを担持する単一細胞からのコロニーの増
殖を可能にする。

【００８８】理論的には、新しいコロニーの５０％は１
本鎖として変異した形態を有するファージを含有し、５
０％もとの配列を有するであろう。生じたプラークをキ
ナーゼ処理された合成プライマーと、もとの鎖と正確に
マッチする場合ハイブリダイゼーションを許容するがし
かしミスマッチはハイブリダイゼーションを回避するの
に十分であるような温度においてハイブリダイズせしめ
る。次に、プローブとハイブリダイズするファージを含
有するコロニーを拾い、培養し、そしてＤＮＡを回収す
る。

【００８９】さらに具体的には、約１pmolのファージ１
本鎖ＤＮＡ鋳型を約１０pmolの合成オリゴヌクレオチド
プライマーと１５μｌの１０mM Ｔｒｉｓ，１０mM Ｍ
ｇＣｌ₂，９０mM ＮａＣｌ中で混合する。この混合物
を３〜５分間６７℃に加熱しそして次に３０分間４２℃
に加熱する。次に、混合物を氷上で冷却し、そして容積
を２０〜２５μｌにするのに十分な緩衝液中５００μＭ
の４種類のｄＮＴＰ及び３〜５ユニットのポリメラーゼ
Ｉ（Ｋｌｅｎｏｗ）を含有する冷溶液を加える。この混
合物を０℃にて５分間置き、そして次に３０分間３７℃
にした。

【００９０】次に、Ｋｌｅｎｏｗを７５℃にて１５分間
不活性化し、そして次に３００μｌの細胞当り１μｌの
反応混合物を用いてこの混合物を適切な宿主、例えば
Ｅ．コリＪＭ１０３，Ｅ．コリＪＭ１０５、又はＥ．コ
リＤＧ９８（ＡＴＣＣ ♯３９７６８）に形質転換し、
これらを酵母エキス−トリプトン寒天プレート上で増殖
せしめる。生ずるファージプラークをニトロセルロース
上に上げることによってフィルターに移し、そして６×
ＳＳＣ，５×デンハート，０．１％ＳＤＳ，５０μｇ
／mlキャリヤー（酵母ＲＮＡ、サケ精子ＤＮＡ等）５ml
／フィルター中で所望の温度にて１〜２時間プレ−ハイ
ブリダイズせしめる。

【００９１】次に、固定され、プレ−ハイブリダイズさ
れたフィルターを２×１０⁵cpm ／mlのキナーゼ処理さ
れた合成プライマーオリゴヌクレオチド（約２〜１０×
１０⁷cpm／μｇ）と３〜１６時間ハイブリダイズせし
め、そして次に６×ＳＳＣ中で一回室温にて５分間、そ
して次に適当なストリンジェンシーの温度にて５分間洗
浄する。もとのファージを含む同時的対照試行を用い
て、変異していない鎖にハイブリダイゼーションが起こ
らないことを確認する。

【００９２】下記の造成において、プラスミドの造成の
ための正しい連結を、Ｅ．コリ・ゼネティック・ストッ
ク・センターから得られるＥ．コリＭＭ２９４株ＣＧＳ
Ｃ♯６１３５、又は他の適当な宿主を連結混合物により
形質転換することにより確認する。好結果の形質転換体
を、アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性又は他の
抗生物質耐性によりあるいはプラスミドの造成の態様に
従う他のマーカーを用いて、当業界において理解されて
いるようにして選択する。次に、形質転換体からプラス
ミドを、クロラムフェニコール増幅〔Clewell, D. B.,
J. Bacteriology (1972) 110 : 667〕後のClewell, D.
B.等、Proc. Natl. Acad. Sci (1969)62 : 1159の方法
に従って調製し、そして制限酵素分析により分析し、そ
して／又はMessing 等、Nucleic Acids Res. (1981) 9
: 309 の方法により、又はMaxam 等、Methods in Enzy
mology (1980) 65 : 499 の方法により配列決定する。

【００９３】後記の例における形質転換は、Cohen, S.
N.等、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)(1972) 69 : 2110
により記載されている塩化カルシウム法を用いて行っ
た。クローニング及びプラスミドの発現のために下記の
２つの宿主を使用した。すなわち、クローニング及び発
現のため、特に、Ｅ．コリＭＭ２９４株（前記）、Talm
adge, K.等、Gene (1980) 12 : 235 ; Meselson, M.
等、Nature (1968) 217 : 1110を宿主として使用した。
しかしながら、発現がＰ_Lプロモーター及びＮ_RBSの制
御のもとにある場合、Ｅ．コリＭＣ１０００λ株Ｎ₇Ｎ
₅₃ＣＩ₈₅₇ＳｕｓＰ₈₀を発現宿主として使用した。この
株は、１９８３年１２月２１日にＡＴＣＣ３９５３１と
して寄託され、これをＭＣ１０００−３９５３１と称す
る場合がある。この株は、許容温度（３０℃〜３２℃）
において活性な温度感受性Ｃ_Iレプレッサーをコードす
るλプロファージを含有する。しかしながら、非許容温
度（３６℃〜４８℃）においては、レプレッサーは不活
性であり、そしてＰ_Lプロモーターからの転写が起こり
得る。上昇した温度においてプロファージが誘導に失敗
するのもこの株の特徴でる。

【００９４】次の例はリシン及びリシンＡを包含するリ
ボトキシンの精製方法を記載することによりこの発明を
説明する。例はまた、このようなリボトキシンの組換生
産、そして特に原核生物におけるリシンＡ断片及びリシ
ンの生産のために適当な発現ベクターの調製を説明す
る。しかしながら、この発明のリシンペプチド遺伝子は
他の宿主域に適当な種々のベクターに連結され得る。但
し、真核生物においては、保持又は分泌によって毒性が
緩和されなければならない。Ｄ．例調製物Ａヒマからのリシン及びその成分鎖の精製リシンＥ１及びリシンＥ２を包含するリシンのアイソト
キシンの単離のための出発材料を次のようにして調製し
た。３℃〜６℃における蛋白質の貯蔵及び透析を除くほ
か、特にことわらない限りすべての段階を２０℃〜２５
℃にて行った。この精製のための一般的方式を次に示
す。カッコ内は少量成分を示す。

【００９５】

【表１】

【００９６】５００ｇの全体ヒマ種子〔リシナス・コミ
ュニス・バラエティー・サングイネウス（Ricinus comm
unis var. sanguineus）〕を１９００mlの水、５００ｇ
の氷及び１００mlの氷酢酸中で、非常に毒性の高い液滴
が飛散しないように保護しながらブレンドした。一夜沈
降せしめた後、抽出物をザイツのミルクフィルター及び
ワットマンＧＦ／Ｂフィルターに通し、そして５０％Ｎ
ａＯＨによりｐＨ６．０に調整し、そしてゲルマン０．
２mmフィルターカプセルに通した。７００mM酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ５．０）中に投入されたマトレクス（Ｍａｔ
ｒｅｘ）ゲル（アミコン社）の１３ｌカラムに適用して
リシン及びアグルチニンを吸着せしめた。このカラムを
１２ｌの１０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ６．１）により
洗浄し、そして次に段階的に溶出を行った。すなわち、
２０ｌの１０mMリン酸ナトリウム及び１０mMガラクトー
ス（ｐＨ６．１）により、リシンＥにより幾分汚染され
たリシンＢを溶出し、そして次に１２ｌの１０mMリン酸
ナトリウム（ｐＨ７．４），０．１ＭＮａＣｌ及び
０．１８Ｍラクトース（ＰＢＳ−ラクトース）によりリ
シンＥ及びアグルチニンを溶出した。

【００９７】リシンＤ含有画分を限外濾過（アミコンＹ
Ｍ１０膜）により４mg／mlの蛋白質濃度とし、そして１
０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ６．１）中で平衡化された
スルホエチルセルロース（ワットマンＳＥ−５３）の５
００mlカラムに適用した。カラムを同じ緩衝液中１０〜
５０mM ＮａＣｌの３．５ｌの直線グラジエントにより
溶出して３〜４mSの電気伝導度において主ピークを純リ
シンＤとして得た。（汚染しているリシンＥは同じ緩衝
液中１２５mM ＮａＣｌの段階的適用により溶出するこ
とができる。）

【００９８】マトレクスゲルカラムからのリシンＥ含有
画分を限外濾過して１０mg／mlの蛋白質濃度とし、ｐＨ
６．１に調整し、そして水で稀釈て１０mM ＮａＣｌ
（ｐＨ６．１）と同じ電気伝導度にした。１３ｇの蛋白
質を、同じ緩衝液中で平衡されたワットマンＳＥ−５３
の１９００mlカラムに適用し、そして１０mMリン酸ナト
リウム（ｐＨ６．１）中２０〜１００mM ＮａＣｌの７
ｌの直接グラジエントにより溶出した。ほとんどのアグ
ルチニンを含有する第１の主ピークを廃棄した。

【００９９】幾つかのリシンＥ含有ピークをプールし、
限外濾過して１０mg／mlの蛋白質濃度とし、０．１Ｎリ
ン酸ナトリウム、１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）（Ｐｉ
−ＥＤＴＡ）に対して透析し、そして酸処理された（１
ＭＨＣｌ中５０℃にて１時間、次にリン酸ナトリウム
により洗浄）ファルマシセファロースＣＬ−４Ｂの３０
０mlカラムに適用した。カラムを、Ｐｉ−ＥＤＴＡ中０
〜１mMラクトースの１ｌの直線グラジエントにより溶出
した。リシンＥ１の最初のピーク（これは遅れるがしか
し保持されない）の後、０．２Ｍラクトースにおいてリ
シンＥ２の非常に小さいピークが溶出された。（残留す
るリシンＤは０．３５mMラクトースにより溶出され、ア
グルチニンは１０mMラクトースによる段階的溶出により
取り出される。）

【０１００】プールされたＳｅ−５３ピークからのリシ
ンＤ調製物の一部分を用いてリシンＡ鎖及びリシンＢ鎖
を調製した。プールされた部分を限外濾過して６〜７mg
／mlの蛋白質濃度とし、そして７．５mM Ｔｒｉｓ，１
０mM ＥＤＴＡ，２％メルカプトエタノールにし、ｐＨ
８．４に調製し、そして２５℃にて９０分間インキュベ
ートした。還元されたリシン溶液を、１０mM Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ，１mM ＥＤＴＡ，２％メルカプトエタノール
（β−ＭＥ）（ｐＨ８．４）により平衡化されたＤＥＡ
Ｅ−セファロース（ファルマシア）の８００mlカラムに
負荷した。このカラムを、Ａ₂₈₀が緩衝液のそれになる
までＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ−β−ＭＥにより洗浄した。

【０１０１】最初の保持されないピークはＲＴＡであ
り、これをさらに、２０mM酢酸ナトリウム、２．５mM
Ｎａ−ＥＤＴＡ，２．０mMジチオスレイトール（ｐＨ
５．５）により平衡化されたＣＭ−セファロース（ファ
ルマシア）を用いて精製した。ＤＥＡＥセファロースか
らのＲＴＡ画分を酢酸にてｐＨ５．０に調製し、そして
５mS未満の電気伝導度となるように稀釈し、ＣＭ−セフ
ァロースの５００mlカラムに負荷し、そして次にカラム
緩衝液中０〜２００mM ＮａＣｌの６ｌの直線グラジエ
ントにより溶出して２つの主たる蛋白質含有ピークを得
た。これは常に分離するわけではない。これらをＲＴＡ
１及びＲＴＡ２と命名した。ＲＴＡ１及びＲＴＡ２は炭
水化物含量を異にするアイソエンザイムである。

【０１０２】ＲＴＢはＤＥＡＥセファロースから１０mM
Ｔｒｉｓ，２．５mM ＥＤＴＡ，２．５mM ＤＴＴ，
２％ＢＭＥ，１００mM ＮａＣｌ（ｐＨ８．４５）にお
いて溶出した。リシンアイソトキシンＤ、Ｅ１及びＥ２の分離次の方法を２０℃〜２５℃にて７．６cm／時の溶出流速
を用いて行った。

【０１０３】１／５Ｐｉ−ＥＤＴＡにより前もって平衡
化されたブルー・トリスアクリル（ＢｌｕｅＴｒｉｓ
ａｃｒｙｌ）Ｍの１８mlカラムに、１／５Ｐｉ−ＥＤＴ
Ａ中でダイアフィルトレートされ（アミコンＹＭ３０，
６０psi ，２５℃）そして限外濾過により１．５mlされ
た、１２．５mlのリシンＤ，６．０mgのリシンＥ２及び
８．０mgのリシンＥ１を含有する混合物（調製物Ａ）を
負荷した。カラムを２５mlの緩衝液で洗浄、そして次に
同じ緩衝液中０〜０．２５ＭＮａＣｌの８０mlの直線
グラジエントにより溶出した。回収率は９８％であっ
た。

【０１０４】溶出のプロフィールを図１９Ａに示す。ｐ
Ｉを異にするリシンＥ１及びＥ２が部分的に分離され
る。ピークは、図１９Ｂに示すように、同じカラムでの
純粋な蛋白質の別の試行、及び等電点沈澱により同定さ
れた。第１の溶出ピークは純粋なリシンＤ（ｐＩ７．
４）であり、そして残りのピークはリシンＥ（ｐＩ値
８．７，８．６、及び８．２５）であった。リシンＥ１
及びリシンＥ２はアガロースアフィニティーカラム上で
のそれらの挙動により区別された。

【０１０５】（ヒマ種子抽出物をこの方法にかけた場
合、アグルチニン及びリシンＤを含む他の蛋白質が同時
溶出された。）リシンＤ、Ｅ１、及びＥ２の特徴付け図２０、図２１、及び図２２はヒマから調製されリシン
アイソトキシンの物理的性質及びレクチンとの比較を示
す。

【０１０６】図２０Ａは、ヒマ（リシナス・コミュニス
・バラエティー・サングイネウス）の粗抽出物を酸処理
されたセファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア）のカラ
ムに適用し、そして狭いラクトースグラジエントにより
溶出した場合の溶出パターンを示す。画分について行わ
れた等電点沈澱の結果〔図２０Ｂに示す〕は、ピークＡ
及びＢがそれぞれリシンＥ１及びＥ２として同定される
リシンＥアイソトキシンを含有し、そしてプールＣはリ
シンＤを含有することを確立した。第１のシャープなピ
ークは非リシン蛋白質を含有しており、そしてヒマアグ
ルチニン（図２０ＢのプールＤ）は０．２Ｍラクトース
へのステップによりグラジエントの終りにおいて溶出し
た。ラクトースではなくガラクトースによる溶出がリシ
ンＥ１及びリシンＥ２（プールＡ及びＢ）の分離を改良
したが、リシンＥ１及びＤ（プールＢ及びＣ）の分離を
破壊した。

【０１０７】等電点沈澱はＬＫＢＰＡＧプレート上
で、ｐＨ３．５〜９．５にて、８℃〜１０℃に冷却され
たＬＫＢモデル２１１７マルチポールベッドにおいてＰ
ＡＧプレートと共に提供された指示に従って行った。図
２０Ｂに示されるように、プールＡ及びＢはリシンＥに
特徴的なｐＩ値を有し、プールＣはリシンＤを含有す
る。プールＤ（図２０Ａ中には示されていない）はヒマ
アグルチニンを含有し、これはリシンとの実質的なアミ
ノ酸相同性を示すが毒性は低い。

【０１０８】図２０に示す分離は調製物Ａに記載される
リシンＥ１及びＥ２の大規模精製のための基礎を提供す
る。上記のアガロース上及びプロシオン色素カラム上で
のリシンＤ，Ｅ１及びＥ２の挙動は、これらのリボトキ
シンが異るレクチン活性を有することを示している。リ
シンＤはアガロースに対する最も親和性及びシバクロン
ブルー（ＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅ）Ｆ３ＧＡに対
する最も低い親和性を有し、リシンＥ１はシバクロンブ
ルーＦ３ＧＡに対する最も高い親和性及びアガロース
に対する最も低い親和性を有する。アガロースはガラク
トースを含有するポリサッカライドであり、プロシオン
色素はアガロース及びシバクロンブルーの両者に対する
まだ同定されていない親和性を模倣すると考えられる。
（ＲＴＡ自体はヘテロダイマーに比べて高いプロシオン
ブルーに対する親和性を有する。すなわち、ＲＴＡの結
合部位は全体アイソトキシン中ではマスクされているに
違いない。）

【０１０９】図２１Ａは、調製物Ａから高度に精製され
たリシンＥ２，Ｅ１及びＤのＩＥＦパターンを示し、リ
シンＤは幾つかの電荷サブクラスを包含し、これらはｐ
Ｈ６．１におけるスルホエチルセルロースからのリシン
Ｄの塩グラジエント溶出により分離され得る。リシンＤ
のアイソトキシン、すなわち低下するｐＩの順に標示さ
れるＤｂ〜Ｄｅの内、リシンＤｂは天然に最も豊富な形
態であり、そして文献中で一般に“リシンＤ”と称され
るものである。図２１Ａに示されるように、リシンＥ１
及びリシンＥ２は同一のＩＥＦパターンを示し、８．
７，８．６及び８．２のｐＩ値を有する。これに対し
て、すべてのリシンＤアイソトキシンは有意に一層酸性
であり、その上それらのｐＩ値のほかに機能的又は構造
的差異を示さない。

【０１１０】図２１Ｂは、リシンＥ２，Ｅ１、及びＤｂ
のＡ鎖及びＢ鎖のＩＥＦパターンを示す。リシンＤｂの
Ｂ鎖は５．１のｐＩを示し、リシンＥ１及びＥ２のＢ鎖
のｐＩ値８．７，８．６及び８．２と実質的に異る。Ａ
鎖のｐＩパターンは３種類すべてのアイソトキシンにつ
いて実質的に同一であり、リシンＥ２からのＲＴＡにつ
いて示されるパターンの見かけ上の相違はゲルの過剰負
荷によるものである。リシンＥ１及びリシンＥ２はｐＩ
及び電荷サブクラスの分布において同一であるのみなら
ず、これらの分子電荷特性が主としてそれらのＢ鎖構造
により決定されことが明らかである。

【０１１１】図２２Ａは、調製物ＡからのリシンＥ１及
びリシンＥ２並びにリシンＤの種々のサブクラスを用い
る非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。リシンＥ２以
外のすべてのアイソトキシンは５８kDのおよその分子量
を示し、リシンＥ２は２kDだけ重いようである。図２１
ＢはリシンＥ２，Ｅ１及びＤｂのＡ鎖及びＢ鎖について
得られた対応する結果を示す。リシンＤｂからのＲＴＡ
は２つのアイソエンザイムＲＴＡ１及びＲＴＡ２を含有
する。ＲＴＡ２はＲＴＡ１の３０％であり、そして一層
重くグリコシル化されている。見かけ分子量に対するグ
リコシル化の効果はＲＴＡ２，ＲＴＡ１、及び組換ＲＴ
Ａを比較することにより見ることができる。この組換Ｒ
ＴＡはシタス社においてＥ．コリ中にクローン化され、
そして発現された非グリコシル化種である。

【０１１２】このＲＴＡの非グリコシル化組換種は、１
９８５年６月１９日に公開されたヨーロッパ特許出願Ｎ
ｏ．１４５，１１１中に開示されているリシントキシン
ＤＮＡ配列からＲＴＡについて推定されるアミノ酸配列
と同じアミノ酸配列を有する。リシンＥ１及びＥ２から
のＡ鎖はＲＴＡ１と同じ分子量を示す。リシンＤｂ，Ｅ
１及びＥ２のＢ鎖はそれぞれ３４kD、３１．５kD及び３
６kDの見かけ分子量を有する。（ＲＴＢのレーン中の小
バンドはＲＴＢダイマーへのわずかな酸化及び痕跡量の
ＲＴＡの汚染によるものである。）図１１に示される結果は、リシンＤ，Ｅ１及びＥ２間の
構造的差異はそれらのＢ鎖に存在するという仮説を支持
する。リシンＤ，Ｅ１、及びＥ２間のレクチンの差異も
Ｂ鎖構造の差異と一致する。リシンＥ１及びＥ２からの
Ｂ鎖のＩＥＦ挙動が同一であることは、これらのポリペ
プチドがアミノ酸組成において非常に類似しているか又
は同一であることを示す。

【０１１３】Ｄ．１．メッセンジャーＲＮＡの単離５０ｇの未成熟のヒマの種子（リシナス・コミュニス）
を１００mlのホモジネーション緩衝液〔１５０mM Ｎａ
Ｃｌ，５０mM Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３），５mMＥＤＴＡ
及び５０mMの新たに添加されたβ−メルカプトエタノー
ル〕に入れ、これに１２ml ０．２Ｍバナジウム−リボ
ヌクレオチド錯体、３０mgのプロテイナーゼＫ、及び１
５mlの２０％ＳＤＳを加えた。この混合物をワーニング
ブレンダー中で３〜４分間高速でブレンドし、そして次
に時々ブレンドしながら室温にて２〜３時間インキュベ
ートすることによりホモジナイズした。

【０１１４】（前記のバナジウム−リボヌクレオシド溶
液は次の様にして調製した。８９３mg ＶＯＳＯ₄・３
Ｈ₂Ｏを３２０mlの水に添加し、そしてこの混合物を煮
沸してバナジウム塩を溶解せしめた。１mmolずつのアデ
ノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを１７mlの
水に溶解することにより４種類のリボヌクレオシドを含
有する溶液を調製した。加熱を必要とする。次に、１ml
の前記ＶＯＳＯ₄溶液をリボヌクレオシド溶液に加え、
そしてこの生成物を沸騰水溶液で攪拌しながら１０Ｎ
ＮａＯＨによりｐＨ６．５に滴定し、そして最後に１Ｎ
ＮａＯＨによりｐＨ７とした。錯体の生成は色が明青
色から黒緑色に変化することにより示される。最後にこ
の溶液を水で２０mlに稀釈した。）

【０１１５】ホモジナイズされた前記の混合物を８００
０×ｇ，５℃にて１５分間遠心し、そしてペレットを廃
棄した。上清をチーズクロスに通して脂質を除去し、そ
して濾液を１％のヒドロキシグアニジンを含有するフェ
ノール／ＣＨＣｌ₃／イソアミルアルコール（２４：２
４：１）で十分に抽出してバナジウム塩及び蛋白質を除
去し、そして水性相を０．４ＭＮａＣｌ及び１０mM
ＥＤＴＡにした。２．５容量の純アルコールを加えて核
酸を沈澱せしめ、そして混合物を−２０℃にて一夜貯蔵
した。

【０１１６】沈澱を７０００ｇ×ｇ、２℃にて１５分間
遠心し、そしてペレットを０．２５ＭＮａＣｌ，０．
０２５ＭＴｒｉｓ（ｐＨ８）の水性溶液９．５ml＋
９．５mlのリン酸緩衝液〔２．５Ｍ合計リン酸塩；Ｋ₂
ＨＰＯ₄：３３％のＨ₃ＰＯ₄（２０：１）＋９．５ml
の２−メトキシエタノール〕中に再懸濁した。混合物を
振とうし、そして時々混合しながら氷上で３〜５分間冷
却し、そして次に２０００×ｇ、２℃にて２５分間遠心
した。上層を取り出し、そしてこれに１０mlの０．２Ｍ
酢酸ナトリウム及び５mlの１％セチルトリメチルアンモ
ニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を加え、そしてこの混合物
を氷上で１０分間冷却した。生じた白色沈澱を２０００
×ｇ、２℃にて１０分間の遠心により回収した。０．１
Ｍ酢酸ナトリウムを含有する７０％エタノールの添加及
び２５００×ｇ、４℃にて１０分間の再遠心により沈澱
を洗浄した。

【０１１７】上清を除去した後、ペレットを２mlのＧ−
１００カラム出発緩衝液〔２０mMＴｒｉｓ（ｐＨ８）、
１mM ＥＤＴＡ，０．５％ＳＤＳ〕中に再懸濁し、そし
て次に０．５ＭＮａＣｌを含有するように調整した。
２０００×ｇ、室温にて５分間遠心することにより固形
物を除去し、そして上清をセファデックスＧ−１００カ
ラム（１．５cm×４０cm）に適用し、そしてカラムに適
用した緩衝液に類似するがしかしＳＤＳを欠く緩衝液を
用いてカラムを溶出した。ＯＤ₂₆₀をモニターすること
により溶出物をアッセイした。液過液中に所望のメッセ
ンジャーＲＮＡを得、植物抽出物中に存在する酸化され
たフェノール性化合物を残した。（これらの化合物はｄ
Ｔカラム上でポリＡＲＮＡと類似する挙動をし、蛋白
質合成を阻害し、そしてそれ故にｍＲＮＡのアッセイを
阻害することが知られている。）

【０１１８】ｍＲＮＡを含有する最初のピークを洗剤で
あるホルムアミドで処理してリボゾームＲＮＡ複合体を
破壊した。これを行うため、ｍＲＮＡ含有画分をプール
し、エタノールで沈澱せしめ、そして沈澱を最少量の水
中に再溶解した。この溶液に、２０mM ＰＩＰＥＳ〔ピ
ペラジン−Ｎ，Ｎ−ビス（２−エタンスルホン酸〕を含
有する脱イオンホルムアミド（ｐＨ６．５〜７．０）９
容量を加えた。次に、混合物を５分間３７℃に加熱し、
そして１０容量のｄＴカラム緩衝液〔０．５ＭＮａＣ
ｌ，１０mM Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），１mM ＥＤＴ
Ａ〕を加えた。ホルムアミドの存在が存在するすべての
リボゾーム性ＲＮＡからポリＡＲＮＡを解離せしめる。
次に、変性された混合物を当業界においてよく確立され
ている方法に従ってオリゴｄＴカラムに通し、そして溶
出後約１００μｇのポリＡＲＮＡを回収した。

【０１１９】Ｄ．２．リシンＡ、並びにリシン及びＲ
ＣＡの十分な長さのＤＮＡの調製Ｄ．２．ａリシンＡリシンＡコードクローンを得るため、前記に記載したよ
うにして調製したポリＡｍＲＮＡを使用してManiatis
等（前掲）の方法に従ってｃＤＮＡライブラリーを得
る。要約すれば、ポリＡＲＮＡを適切な緩衝条件下、
Ｂ鎖のＮ−末端領域をコードするｍＲＮＡに相補的な、
すなわちＡ鎖のコドンからすぐ下流のプライマー５′−
GACCATTTCGACCTACG −３′の存在下で逆転写酵素で処理
する。次に、複合体を塩基で処理することにより残留す
るｍＲＮＡを除去する。

【０１２０】標準的条件下でターミナルトランスフェラ
ーゼを使用して単鎖の３′末端にポリｄＤオリゴマーを
付加する。プライマーとしてオリゴ−ｄＴを使用し逆転
写酵素を使用して、上記の単鎖ｃＤＮＡを２本鎖形に転
換する。次に、ｃＤＮＡにオリゴ−ｄＣを付加しそして
開裂されたベクターにオリゴｄＧを付加し次にアニール
せしめることにより、２本鎖ｃＤＮＡをｐＢＲ３２２の
ＰｓｔＩ部位に挿入する。得られた混合物を使用して
Ｅ．コリＭＭ２９４を形質転換し、そして５０００個の
Ａｍｐ^R株を得た。

【０１２１】好結果のコロニーをニトロセルロースプレ
ート上に移し、そして³²Ｐと共にキナーゼ処理された千
種類の合成オリゴヌクレオチド：

【０１２２】

【化７】

【０１２３】この混合物により、Grunstein 及びHognes
s の方法（前掲）を用いてプローブした。この混合物は
リシンＡに含まれるアミノ酸配列のコドンに対して相補
的なアンチセンス鎖を代表し、これはほとんどのコドン
のあいまいさを含み、これはコドン配列の部分に対する
プライマーの混合物を用いて合成されたｃＤＮＡを配列
決定し、そして合成されたｃＤＮＡの実験的に決定され
た配列を用いることにより解決される。幾つかの代表的
な陽性にハイブリダイズするクローンからプラスミドを
単離し、そして部分配列分析により分析した。こうして
得られた２群はリシンＡ及びアグルチニンＡに相当する
様であった。各群からの２つのプラスミドｐＲＡ１２３
及びｐＲＡ４５を挿入領域において配列決定した。

【０１２４】図１及び図２にこの配列決定の結果を示
す。図１はｐＲＡ１２３中の挿入部の配列を示す。この
塩基配列はこの図中のヌクレオチド配列のすぐ下に示さ
れるアミノ酸配列の推定を可能にする。これを図中にＲ
ＴＡとして標示された単離された蛋白質のそれと比較す
ることができ、６個の残基のみ異る。これらの差異は公
表された配列の誤まり及び／又は示されたリシンＡ蛋白
質の多様性によるであろう。リシンＡの完全なコード配
列、並びにＡ鎖をＢ鎖に連結する１２個のアミノ酸及び
シグナル配列のコドンが存在する。ｐＲＡ１２３を正し
い開始コドン及び終止コドンを与えるように変形した後
に記載する発現ベクター中のコード配列源として使用し
た。

【０１２５】図２は、ｐＲＴＡ１１５（図４を参照のこ
と）及びｐＲＡ４５中の配列の組み合わせから推定され
るリシンアグルチニンＡのための配列を示す。この図中
にはこの混合物の塩基配列が示されており、そしてその
すぐ下の列は推定されるアミノ酸配列を示している。リ
シントキシンＡとの差異を示すため、この図中にはまた
ＲＴＡと標示されたリシントキシンＡの配列も含めてあ
る。アグルチニン配列中の位置８４及び１５６のシスチ
ン残基は得られたトキシン配列からの大きな差異を示
す。

【０１２６】Ｄ．２．ｂ十分な長さのリシン及びＲＣ
Ａのクローンリシン及びＲＣＡの完全なポリペプチド配列をコードす
るクローンを得るため、前記の項に記載したようにして
調製されたポリＡｍＲＮＡを使用して、この明細書に
記載するベクターを用いてOkayama 及びBerg（前掲）の
方法に従ってｃＤＮＡライブラリーを得る。この方法は
次の点においてManiatis等の方法と異る。（１）プラス
ミドベクターＤＮＡは第１ｃＤＮＡ鎖の合成のためのプ
ライマーとして機能し、そして（２）第２ＤＮＡ鎖はｃ
ＤＮＡ：ｍＲＮＡハイブリドのニック−トランスレーシ
ョン修復により形成される。要約すれば、プラスミドｐ
ｃＤＶ１を、Ｈｉｎｄ III部位から最も遠いＫｐｎＩ末
端にオリゴｄＴテイルを付加することによりプライマー
ＤＮＡとして使用する。

【０１２７】このプライマーを過剰のポリＡｍＲＮＡ
及び逆転写酵素と共に適切な緩衝条件下でインキュベー
トすることによりｃＤＮＡの最初の鎖を生じさせる。プ
ラスミド−ｃＤＮＡ：ｍＲＶＡハイブリドの単離の後、
ｃＤＮＡの３′末端にｄＣテイルを付加する。これは、
ベクターハイブリドをｄＣＴＲと共にターミナルヌクレ
オチジルトランスフェラーゼの存在下でインキュベート
し、そして次にこれをＨｉｎｄ IIIで開裂せしめてオリ
ゴ−ｄＣテイルをも含有するｐｃＤＶ１ＤＮＡの断片
を放出せしめることにより達成される。生ずるハイブリ
ドベクターは部分的Ｈｉｎｄ III部位を含有する。この
プラスミドを、部分的Ｈｉｎｄ III部位の反対側にオリ
ゴ−ｄＧテイルを含有するプラスミドｐＬ１由来のリン
カーとアニールせしめ、そしてこれをＥ．コリＤＮＡリ
ガーゼにより連結することにより環化する。

【０１２８】次に、ハイブリドベクターをＥ．コリＤＮ
Ａリガーゼ、Ｅ．コリＤＮＡｐｏｌＩ、及びＥ．コリＲ
ＮアーゼＨを含有する混合物中で、修復合成及びｐａｌ
Ｉによるニックトランスレーションのために最適な温度
条件下でインキュベートする（すなわち、１２℃及び室
温でのそれぞれ１時間ずつの遂次的インキュベーショ
ン）場合、ＲＮＡに代るｃＤＮＡの第２鎖が生ずる。再
構成されたベクターは次の重要な特徴を有する。（１）
ｐＢＲ３２２から、ＤＮＡ複製開始点、及びアンピシリ
ン耐性のための遺伝子、並びに（２）ＳＶ₄₀から、ＤＮ
Ａ複製開始点、前記及び後期プロモーター、１６ｓＲ
ＮＡスプライス連結部、及びポリＡ付加シグナル。この
ベクターを使用してＥ．コリＭＭ２９４を形質転換す
る。この方法を用いて数千個のＡｍｐ^Rコロニーが得ら
れた。

【０１２９】Ａｍｐ^Rプラスミドを含有するコロニーを
Grunstein 及びHogness （前掲）の方法によりプローブ
としてＤ．２．ａ．に前記した合成オリゴヌクレオチド
の混合物を用いてプローブした。幾つかの代表的な陽性
にハイブリダイズするコロニーからプラスミドを単離
し、そして制限酵素分析により分析した。制限酵素分析
パターンに基いて、クローンｐＲＴ３，ｐＲＴ１７及び
ｐＲＴ３８の３つのプラスミドを選択して挿入部領域の
配列決定を行った。これらの配列を図１２〜１３、図１
４〜１５及び図１６〜１７に示す。

【０１３０】図１２〜１３はｐＲＴ３中の挿入部の配列
を示す。この塩基配列は図中のヌクレオチド配列のすぐ
下に示すアミノ酸配列の推定を可能にする。このアミノ
酸配列と米国特許出願Ｎｏ．５１８，１２１中に示され
るＲＣＡのＢ鎖のそれとの比較によりＲＣＡとしてコー
ドされたポリペプチドが同定された。このヌクレオチド
配列は完全なＡ及びＢ鎖並びに１２個の介在アミノ酸、
並びにリーダー配列の部分をコードする。

【０１３１】ｐＲＴ１７中の挿入部の配列及び推定され
るアミノ酸配列を示す。このアミノ酸配列に基いて、こ
のヌクレオチド配列は完全なＡ及びＢ鎖、１２個の介在
アミノ酸配列、並びにリシンアイソトキシンＤのリーダ
ー配列の部分をコードしていると結論される。図１６〜
１７はｐＲＴ３８中の挿入部の配列及びこれから推定さ
れるアミノ酸配列を示す。第１５図に示すように、ｐＲ
Ｔ１７及びｐＲＴ３８中にコードされるアミノ酸配列の
比較から、ｐＲＴ３８中にコードされているポリペプチ
ドはｐＲＴ１７に対して１５のアミノ酸置換を含有する
ものと決定することができる。すべての置換はＢ鎖中に
存在する。従って、ｐＲＴ３８は完全なＡ及びＢ鎖、１
２個の介在アミノ酸、並びにリシンアイソトキシンの完
全なリーダー配列をコードしている。Ｂ鎖のｐＩが上昇
していることを予想させる置換の性質に基いて、ｐＲＴ
３８中にコードされているポリペプチドはリシンアイソ
トキシンＥとして仮りに同定される。

【０１３２】Ｄ．３．クローニングベクターの変形完全なリシンＡコード配列を含有するｐＲＡ１２３を変
形して、この配列が、アミノ酸２６５の後の適切な位置
に終止コドンを有しそして成熟配列にすぐ先行する位置
に開始コドンを有するＨｉｎｄ III／ＢａｍＨＩカセッ
トとして得られるようにした。ｐＲＡ１２３をＢａｍＨ
Ｉで消化し、そして約８９６のbpの断片を単離し、そし
てＭ１３ｍｐ１８中にこのｍ１３ベクター中のｌａｃプ
ロモーターに対してアンチセンス方向にサブクローニン
グした。図１中上列の文字（２）及び（３）として示さ
れる配列をプライマーとして用いて、ファージ単鎖ＤＮ
Ａをプライマー指令変異誘発にかけた。

【０１３３】Ａ鎖配列の始め近くに示されるオリゴヌク
レオチド（２）は、ＡトキシンＮ−末端アミノ酸のすぐ
上流のＡＴＧ開始コドン及びこのＡＴＧの直接上流のＨ
ｉｎｄ III部位を挿入する変形をもたらす。トキシンコ
ード配列のＣ−末端の近傍のプライマー（３）はセリン
のコドンをＴＡＡ終止コドンで置き換える。生ずる変形
されたファージを各変異誘発の後に適接な上記のプライ
マーをプローブとして用いて同定した。所望の造成物を
Ｈｉｎｄ III及びＢａｍＨＩにより２重消化し、そして
適切なリシンＡコード断片を単離した。

【０１３４】このベクターを用いて完全なリシン配列の
発現のためのベクターを調製すべき場合、セリンのコド
ンを終止コドンに変えるプライマー（３）により指令さ
れる変異を省略する。リシンＡ又はリシンの分泌が望ま
しい場合、プライマー（２）によって指令される変異を
省略し、そして図１中に（１）として標示されるプライ
マーにより指令される変異をシグナル配置のための開始
コドンの領域に置換する。この変形は、シグナル配列の
ＡＴＧコドンのすぐ前にＨｉｎｄ III部位を提供する。
すなわち、細胞内でのリシンＡの生産のためのベクター
の造成を可能にする上記の変形に加えて、リシンＡの分
泌をもたらすベクターの造成、又は完全なリシン配列の
細胞内生産もしくは分泌をもたらすベクターの造成のた
めの配列を提供することができる。言うまでもなく、分
泌のために設計されるベクターは、前記のような適切な
宿主中での発現のために造成されなければならない。

【０１３５】およそ同様な方法で、ｐＲＴ３，ｐＲＴ１
７及びｐＲＴ３８からの挿入部を変形して発現ベクター
に挿入するためのコード配列を含有する所望のカセット
が得られる。図１中プライマー２として前記したプライ
マーを用いて、前駆体Ｎ−末端アミノ酸にすぐＡＴＧ開
始コドン及びすぐ上流のＨｉｎｄ III部位を、３種類す
べての前駆体含有コード挿入部に入れることができる。
しかしながら、前駆体ＤＮＡのＢ部分は幾つかのＢａｍ
ＨＩ部位を含有するので、リシンＡについて使用したよ
うなＢａｍＨＩ部位は実際的ではなく、そしてそれ故に
他の方法が行われる。要約すれば、ｐＲＴ３，ｐＲＴ１
７及びｐＲＴ３８をＸｈｏＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗで
平滑末端化し、そして断片をＳａｍＩ部位においてＭ１
３ｍｐ１９に連結する。Ｍ１３に含有される挿入部をｌ
ａｃＺリーディングフレームに対する方向について制限
酵素分析により分析し、そしてアンチ−センス方向を含
有するものを選択する。

【０１３６】この方向はファージベクターのリンカー領
域にＰｓｔＩ部位を提供し、変形された挿入部の切り出
しを便利にする。この方向に挿入部を含有するファージ
ベクターを、プライマー２を用いて上記のようにして部
位特異的変異誘発にかけて所望の変形された挿入部を得
る。次に、変形された組換形のファージベクターをＰｓ
ｔＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗにより平滑末端化し、そし
て次にＨｉｎｄ IIIで消化する。正しい長さのＤＮＡセ
グメントを含有する断片を単離して発現ベクターに連結
する。これらのベクターは、原核生物に形質転換された
場合、コードされている３種類の前駆体の発現をもたら
す。

【０１３７】リシン前駆体又はＲＣＡプレカーサーのリ
シン又はＲＣＡへの転換を促進するため、該プレカーサ
ー蛋白質のＡ部分及びＢ部分の間の１２連アミノ酸配列
中に蛋白質分解開裂のための部位を設けるのが好まし
い。１つの便利な方法はリンカー中のアルギニンの下流
のプロリン残基をもう１つのアルギニン残基で置き換え
てトリプシンによる開裂部位を設けることである。これ
は、挿入部をファージベクター中に保持しながら図１４
〜１５に示すようなプライマー４を用いて追加の変異誘
発を行うことによって達成される。挿入部をＰｓｔＩ
（平滑）／ＨｉｎｄIII開裂により再び回収する。発現
ベクターにクローン化した場合、この変形されたＤＮＡ
を適当な形質転換体中で発現せしめることによりトリプ
シンによる開裂に対して感受性の前駆体を得、これから
活性形のリシンを形成することができる。但し、この活
性形リシンはＡ鎖及びＢ鎖に付着した追加のアミノ酸配
列を含有する。

【０１３８】下記のごとき他の幾つかの造成のために
は、Ｍ１３に含有される挿入部をプライマー４によって
のみ変異せしめて、トリプシン開裂部位のためのａｒｇ
−ａｒｇを設ける必要がある。この場合、下記のごとき
別の方法によってベクターが造成される。リシンＡの発
現ベクターに匹敵する、トリプシン開裂形を包含する前
駆体のための発現ベクターは、リシンＡのために造成さ
れた任意の発現ベクターを使用し、そしてリシンＡの終
止されたＣ−末端部分に代えて追加の所望の配列を含有
する下流部分を置くことによっても得ることができる。
これは、リシンＡベクターをＢａｍＨＩで消化し、Ｋｌ
ｅｎｏｗで平滑末端化し、そして次にＣｌａＩで消化し
てリシンＡのＣ−末端領域を欠く開環されたベクターを
得ることにより達成される。

【０１３９】次に、ＣｌａＩ部位から下流の前駆体遺伝
子の部分を含むｐＲＴ３，ｐＲＴ１７又はｐＲＴ３８中
の挿入部からの、又は対応するＭ１３ファージ中の変異
した挿入部からのＣｌａＩ／Ｘｈｏ（平滑）断片を前記
の開環されたリシンＡベクターに連結する。ＣａｌＩ部
位は鎖のリシンＡ部分に切り込むので、これは、終止さ
れたＡ鎖の残りの部分をこれらのベクター中に含まれる
下流部分で置き換えることを可能にする。これらの造成
が、Ｈｉｎｄ III変形挿入により造成されるものとして
上に記載したものと同等の発現ベクターをもたらす。前
駆体ＤＮＡからのリシン又はリシンアグルチニンの製造
を単純化するための他の方法においては、Ｍ１３〜の挿
入部を図１６〜１７に示すようなプライマー（５）を用
いて変異せしめる。このプライマーは、介在アミノ酸の
コドンをループアウトしながらＡ鎖のための終止コドン
及びＢ部分のためのＡＴＣ開始コドンを提供する。次
に、２種類の蛋白質のための発現ベクターの造成を同様
の方法により別々に行う。

【０１４０】Ｄ．４．リシンＡ並びにリシン及びＲＣ
Ａの前駆体のための発現ベクターの造成リシンＡのために前項において調製されたＨｉｎｄ III
／ＢａｍＨＩ断片、又は前駆体ベクター挿入部からの変
形されているかもしくは変形されていないＨｉｎｄ III
／ＰｓｔＩ（平滑）断片をＨｉｎｄ III／ＢａｍＨＩに
より消化された宿主発現ベクターｐＴＲＰ３及びｐＰＬ
ＯＰに連結する。（ＢａｍＨＩ部位は前駆体配列の挿入
のためには平滑末端化する。）ｐＴＲＰ３はＡＴＣＣ
３９９４６として寄託されており、ユニークＨｉｎｄ I
II部位にすぐ先行するｔｒｐプロモーターを含有する。
ｐＰＬＯＰはＡＴＣＣ３９９４７として寄託されてお
り、そして温度感受性高コピー数プラスミド中にユニー
クＨｉｎｄ III部位にすぐ先行してＰ_Lプロモーター及
びＮ遺伝子リボゾーム結合部位を含有する。

【０１４１】ｐＲＴＰ３との連結生成物によりＥ．コリ
ＭＭ２９４をＡｍｐ^Rに形質転換する。選択されたクロ
ーンからプラスミドを単離する。これらのプラスミドの
内の２つ、すなわちｐＲＡＴ７及びｐＲＴＡ１は完全な
配列を含有することが示された。完全なリシン変異体配
列を含有するプラスミドをｐＲＴＴ３，ｐＲＴＴ１７、
及びｐＲＴＴ３８と称する。

【０１４２】ｐＰＬＯＰとの連結生成物をＥ．コリＭＣ
１０００λ溶原株に形質転換し、そしてＡｍｐ^Rコロニ
ーの内の２個から単離されたプラスミドをｐＲＡＬ６
（ＡＴＣＣ３９８３３）、及びｐＲＡＬ７と命名し
た。これらもまた完全なＲＴＡコード挿入部を含有する
ことが示された。リシン配列を含有するプラスミドをｐ
ＲＴＬ３，ｐＲＴＬ１３及びｐＲＴＬ３８と命名する。

【０１４３】同様にして、分泌されるリシンＡ又はリシ
ンを発現するために設計されたプラスミドが、図１中の
プライマー１及び３を用いるプライマー指令変異誘発に
かけられたｐＲＡ１２５から、並びに完全なリーダー配
列を有するように変形されそして同様に処理されたｐＲ
Ｔ３，ｐＲＴ１７及びｐＲＴ３８から（ｐＲＴ３及びｐ
ＲＴ１７はそうでなければ完全なリーダーを含有しな
い）から、上記のようにして調製されたＨｉｎｄ III／
ＢａｍＨＩ断片を用いて造成される。これらのプラスミ
ドはリシンＡ又は前駆体蛋白質のためのコード配列を、
適当な真核性制御配列に作用可能に連結されたシグナル
配列と共に含有する。適切なベクター／宿主系、すなわ
ち、例えば酵母、植物又は哺乳動物細胞中で、これらの
プラスミドのコード部分の発現がリシンＡ、リシン前駆
体又はアグルチニン前駆体、の細胞内生産及び保持では
なく分泌をもたらす。

【０１４４】同様にして、完全なリシン鎖を発現するプ
ラスミドｐＲＡＢＴ及びｐＲＡＢＬを、プライマー２の
みを用いる変異により変形されたｐＲＡ１２３配列を用
いて調製された中間体から調製することができる。これ
らの中間体にリシンのＢ部分のためのコード配列を挿入
する。各場合において、上記のようにして得られた中間
体プラスミドをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩにより処理し、
そして次にＢＡＰにより処理して、後程Ｂ−部分コード
領域及びＢ−供与体ベクター配列の部分を取り込むであ
ろうベクター断片を得る。ｐＲＴＢ７０４をＢ−部分含
有断片の供与体として用いる。ｐＲＴＢ７０４は国際特
許出願ＰＣＴＵＳ／８５００１９７中に詳細に記載さ
れており、そして本明細書のＤ．８．に適切な記載を行
う。

【０１４５】“Ｂ”断片を得るため、ｐＲＴＢ７０４を
ＳａｌＩで消化し、次にＢａｍＨＩで部分消化し、そし
てアガロースゲル電気泳動により断片を分離する。こう
して、Ｎ−末端アミノ酸のすぐ３′側のＢａｍＨＩ部位
からｐＵＣベクター断片中のＳａｌＩ部位までのＢ部分
配列を含有する大断片を単離する。次にこの断片を、前
記のＢＡＰ処理されたベクターと連結し、そして連結混
合物をＥ．コリに形質転換し、そしてＡｍｐ^Rについて
選択する。良結果の形質転換体を増殖せしめ、プラスミ
ドを単離し、そしてこれを用いて適当な対応する宿主を
形質転換して完全なリシン鎖の発現を行う。

【０１４６】要約すれば、原核性宿主での発現のために
適当な代表的なベクターは次のものを含有する。

【０１４７】

【表２】

【０１４８】＊これらは、ｐＲＴＢ７０４からのＢａ
ｍＨＩ／ＳａｌＩ断片の挿入により完成されたベクター
を示す。すべてのリシンＡ発現ベクターは、ｐＲＴ３，
ｐＲＴ１７及びｐＲＴ３８によりコードされる前駆体蛋
白質の発現のためのベクターに転換することができ、こ
れは前記発現ベクターからの短いＣａｌＩ／ＢａｍＨＩ
（平滑）断片を前記ベクターのＣｌａＩ／ＸｈｏＩ（平
滑）断片により、又はリンカー変形を含有するファージ
ベクターからのＣｌａＩ／Ｐｓｔ（平滑）断片により置
き換えることにより行われる。

【０１４９】Ｄ．５．リシンＡコード配列の発現ｐＲＡＬ６，ｐＲＡＬ７，ｐＲＡＴ１及びｐＲＡＴ７
を、Ｅ．コリの適切な株（ｐＲＡＬはＭＣ１０００−３
９５３１に、そしてｐＲＡＴはＭＭ２９４に）に形質転
換し、そして標準的培養条件下で細胞を増殖せしめた。
音波処理された抽出物をウェスタンブロットを用いて蛋
白質生産について分析した。

【０１５０】ウェスタンブロット分析によるクローン化
蛋白質生成物の分析は、Bittner, M等、Ann. Biochem.
(1980) 102 : 459-471；及びErlich, H. A. 等、Infec
t. Immun. (1983) 41 : 683-690により一般に記載され
ている。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で分離され
た蛋白質を市販の装置（例えば、ビオラド社、又はヘフ
ァー・サイエンティフィック）を用いて電気泳動的に適
当な膜支持体、例えばニトロセルロース、ＣＮＢｒ−活
性化紙、又は市販されている種々の誘導体化されたナイ
ロン膜（例えば、ジーンスクリーン、デュポン／ニュー
イングランドニュークレアー；又はパルビオダインＡ、
パル社）のいずれかに移す。移行又は膜反応のための種
々の方法を使用することができ、これらは装置及び膜の
製造者により提供される。特異的クローン化抗原が特異
的抗血清、例えばラビット抗−リシンＡ血清、及び二次
検出系、例えば¹²⁵ＩプロテインＡ（商業的に入手可
能、ニューイングランドニュークレア）又はホースラデ
ィッシュパーオキシダーゼ接合抗−ラビット血清（反応
を可視化するために適切に発色される）により検出され
る。

【０１５１】図３は、ｐＲＡＬ６，ｐＲＡＬ７，ｐＲＡ
Ｔ１及びｐＲＡＴ７により形質転換された適切なＥ．コ
リ宿主からの細胞抽出物のウェスタンブロットを示す。
免疫反応はラビットにおいて天然リシンＡに対して生じ
た抗体を用いて得られた。図中“ｒｅｃＡ”として標示
された蛋白質精製物の移動度は、図中リシンＡ₁及びＡ
₂と標示された天然のグリコシル化形の移動度との関係
においてリシンＡの非グリコシル化形のそれに一致す
る。許容されるバックグラウンド以外の免疫反応は、リ
シン配列を担持しないプラスミドであるベクターｐＰＬ
ＯＰ及びｐＴＲＰ３を含有する同じ条件下で培養された
細胞からの抽出物中には認められない。クマッシーブル
ー染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル及び平行
して行われるウェスタンブロットのラジオオートグラフ
の分析が生産レベルの算定を可能にする。ｐＲＡＴ１形
質転換体については、組換ＲＴＡは全細胞蛋白質の約
０．５％を占める。ｐＲＡＬ６形質転換体については、
ＲＴＡは全細胞蛋白質の約５％であることができる。

【０１５２】精製された活性な蛋白質を得るため、前記
の形質転換体の培養物を音波処理により細胞溶解し、そ
して不溶性材料を取り出した。この材料をチャオトロピ
ック剤、すなわち０．５％ＳＤＳを含有する８Ｍ尿素で
処理してそれを可溶化し、そして蛋白質凝集体を分散せ
しめた。得られた懸濁液を遠心して残留不溶物をペレッ
ト化し、そして上清をセファクリルＳ−２００（ファル
マシア社）カラムに適用して蛋白質成分を分画した。約
８０％均一なリシンＡ蛋白質を含有する画分をポリアク
リルアミドゲル分析により同定し、そしてこれらの画分
をリシンＡに関連する酵素活性、すなわちラビット網状
赤血球インビトロ翻訳系（例えば、ベセスダリサーチラ
ボラトリーズ，ロックビル，マリーランド）における蛋
白質合成を阻害する能力）についてアッセイした。精製
された蛋白質はこのアッセイにおいて生物学的に活性で
あった。

【０１５３】同様に、ｐＲＴＴ３，ｐＲＴＴ１７、もし
くはｐＲＴＴ３８を用いるＥ．コリＭＭ２９４への形質
転換体、又はｐＲＴＬ３，ｐＲＴＬ１７、もしくはｐＲ
ＴＬ３８を用いるＥ．コリＭＣ１００への形質転換体は
リシンアグルチニン又はリシンアイソトキシンの細胞内
生産をもたらす。リンカー領域の変形を有する類似のベ
クターを含有する形質転換体は、誘導された場合、トリ
プシンにより開裂され得る前駆体又は活性化された蛋白
質を生産する。

【０１５４】Ｄ．６．可溶性組換リシンＡをもたらす
造成物前記のベクターのほかに、前に定義した意味において可
溶性である形態で組換リシンＡを細胞内にもたらすベク
ターを造成した。こうして生産されたリシンＡは酵素的
に活性であることに加えて、下記の細胞変性アッセイに
おいて活性である。次の項において、このような発現の
ためのベクターの造成、リシンＡ配列の発現、並びに生
産されたリシンＡの精製及び特徴付けを記載する。この
造成において使用されるすべてのベクターは、ｐｈｏＡ
及びＢ．チュリンジエンシス由来の適当な制御配列を含
有する宿主ベクターを用いる。

【０１５５】Ｄ．６．ａ．適切な制御配列を有する宿
主ベクターの造成ｐＳＹＣ１０８９は、ｐｈｏＡプロモーター、リーダー
配列のＣ−末端にＮａｒＩ部位を提供する変形を有する
リーダー及びコード配列、並びにこれに続くＢ．チュリ
ンジエンシスのポジティブ・レトロレギュレーターを含
有する。この後のベクターの造成において使用したこの
プラスミドの造成を第６図に示す。

【０１５６】ｐＳＹＣ９９７：ＮａｒＩ部位を含有する
ように変形されたｐｈｏプロモーター及びリーダー２．６kbのｐｈｏＡ構造遺伝子をＨｉｎｄ III／Ｘｈｏ
Ｉ断片として含有する２５kbプラスミドｐＥＧ２４７を
ｐｈｏＡ遺伝子源として用いた。このプラスミドはＭ．
Ｃａｓａｄａｂａｎから得たものであり、Groisman E.
A.等、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1984) 81 : 184
0-1843に記載されているのと同様な方法で造成される。
確かに、前記の文献に記載されている方法を適用するこ
とにより、ｐｈｏＡ遺伝子を任意の好ましいバックボー
ンベクターにクローン化することができる。

【０１５７】ｐＥＧ２４７からのＨｉｎｄ III／Ｘｈｏ
Ｉ２．６kb断片を精製し、そしてｐＵＣ１８にクロー
ン化した。ｐＵＣ１８はアンピシリン耐性マーカー及び
所望の配列の便利な挿入を許容するポリリンカーを含有
する２．７kbプラスミドである。ｐＵＣ１８をＨｉｎｄ
III／ＳａｌＩで消化し、そしてリンカーベクターを単
離されたｐｈｏＡ断片と連結した。連結混合物を使用し
てＥ．コリＪＭ１０３又はＪＭ１０５と類似の株である
Ｅ．コリＤＧ９９をＡｍｐ^Rに形質転換し、そしてｐＵ
Ｃ１８への挿入部についてスクリーニングされた好結果
の形質転換体中の中間体プラスミドｐＳＹＣ９９１の造
成を確認した。

【０１５８】所望のＮａｒＩ変形を含有するｐＳＹＣ９
９７をｐＳＹＣ９９１から部位特定変異誘発により調製
した。ＰｖｕII／ＰｖｕII−７７０塩基対断片をｐＳＹ
Ｃ９９１から得た。このものは、ｐｈｏＡプロモーター
の部分及び成熟アルカリ性ホスファターゼの上流Ｎ−末
端配列、並びにさらに完全なリーダー配列を含有する。
この断片をＭ１３ｍｐ１１のＳｍａＩ部位に連結し、
そして単鎖ファージを変異誘発のための鋳型として調製
した。変異誘発において、次の合成２６−ｍｅｒ：

【０１５９】

【化８】

【０１６０】（上線はＮａｒＩ部位を示す）をプライマ
ー及びプローブとして使用した。次に、変異したファー
ジ粒子を使用して、ＮａｒＩ部位を含有する所望のリー
ダー配列源としてＲＦ−ＤＮＡを調製した。ｐＳＹＣ１０１５：Ｃｍ^Rマーカーバックボーンベクタ
ークロラムフェニコール耐性、レプリコン、及びｐｈｏＡ
遺伝子中の適当な制限部位を提供するｐＳＹＣ１０１５
もまたｐＳＹＣ９９１から造成する。まずｐＳＹＣ９９
１をＨｉｎｄ III／ＢａｍＨＩで消化し、そしてｐｈｏ
Ａ遺伝子を含有する約２．６kbの断片を精製し、そして
Ｈｉｎｄ III／ＢａｍＨＩ消化されたｐＡＣＹＣ１８４
からの精製された３．６５kbベクター断片と連結した。
ｐＡＣＹＣ１８４はＡＴＣＣから入手可能であり、そし
てクロラムフェニコール遺伝子（Ｃｍ^R）、細菌レプリ
コン、及びテトラサイクリン耐性遺伝子中のＨｉｎｄ I
II及びＢａｍＨＩ部位を含有する。連結混合物を使用し
てＥ．コリＭＭ２９４をＣｍ^Rに形質転換し、そしてｐ
ＳＹＣ１０１５の構成を制限酵素分析及び配列決定によ
り確認した。

【０１６１】追加のｐｈｏＡ含有中間体Ｂ．チュリンジェンシスのポジティブ・レトロレギュレ
ーターのために適当な宿主ベクターを得るため、図６に
示すようにして、２つの中間体プラスミドｐＳＹＣ１０
５２及びｐＳＹＣ１０７８を造成した。リーダーが変形
されたｐＳＹＣ９９７からのＮａｒＩ部位及びｐｈｏＡ
プロモーターを含有する精製された小Ｈｉｎｄ III／Ｂ
ｓｓＨII断片をＨｉｎｄ III／ＢｓｓＨII消化ｐＳＹＣ
１０１５（従って変形されていないｐｈｏＡ配列が除去
されている）に連結することによりｐＳＹＣ１０５２を
造成した。得られたベクターｐＳＹＣ１０５２はＥ．コ
リ形質転換体をＣｍ^Rにすることが確認された。

【０１６２】ｐＳＹＣ１０７８は、ｐｈｏＡプロモータ
ーの前のＢａｍＨＩ部位が除去されたｐＳＹＣ１０１５
２の変形である。このＢａｍＨＩ部位を除去するため、
ｐＳＹＣ１０５２をＢａｍＨＩにより部分消化し、４種
類のｄＮＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅ
ｎｏｗ）を用いてフィルインし、そして平滑末端条件下
で再連結した。今やｐｈｏＡ遺伝子のちょうど３′にユ
ニークＢａｍＨＩ部位を含有する目的とする得られたプ
ラスミドが、好結果のＣｍ^R形質転換体をスクリーニン
グした後に確認された。

【０１６３】ｐＨＣＷ７０１：レトロレギュレーター源上流コード配列の発現を増強する、Ｂ．チュリンジエン
シスからの結晶蛋白質コード遺伝子（ｃｒｐ遺伝子）の
３′配列能力は公開されたヨーロッパ特許出願Ｎｏ．８
５３６１８５．６中に記載されている。要約すれば、こ
れらの配列は、約４３％のシトシン−グアニン残基含量
を有するステム及びループ構造を形成することができる
対応するＲＮＡ転写物に転写されるＤＮＡ配列によって
特徴付けられる。この遺伝子の３′末端からの約３０〜
３００ヌクレオチドが連結された場合、遺伝子発現に正
のレトロレギュレーション効果が示される。

【０１６４】ポジティブ・レトロレギュレーターは４０
０bp ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ制限断片として調製さ
れ、平滑末端化され、そしてインターロイキン−２の発
現ベクターであるｐＬＷ１に連結された（ｐＬＷ１は、
Ｅ．コリにおいて有効なレプリコン、Ｔｅｔ^R遺伝子、
Ｅ．コリｔｒｐプロモーター、リボゾーム結合部位及び
ヒトＩＬ−２の遺伝子を含有する７０６bp Ｈｉｎｄ I
II／ＰｓｔＩＤＮＡ断片を含むｐＢＲ３２２の誘導体
である。ｐＬＷ１はブタペスト条約のもとにＮｏ．３９
４０５としてＡＴＣＣに寄託されている）。

【０１６５】すなわちｐＨＣＷ７０１は、ｃｒｙ遺伝子
のポジティブレトロレギュレーターを含有する４００bp
ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片をＫｌｅｎｏｗ及び４種
類のｄＮＴＰにより平滑末端化し、そしてこの平滑末端
化された断片をＴ４リガーゼ及びＡＴＰを用いてＳｔｕ
Ｉ消化されたプラスミドｐＬＷ１に連結することにより
完成された。２つの可能性ある方向が生じ、これらは制
限酵素分析により容易に区別され得る。ＩＬ−２遺伝子
の３′末端の近傍に位置する再生されたＢａｍＨＩ部位
を有する方向のものをｐＨＣＷ７０１と称し、ブタペス
ト条約のもとにＮｏ．３９７５７としてＡＴＣＣに寄託
されている。

【０１６６】ｐＳＹＣ１０８９の完成ｐＳＹＣ１０８９を完成するため、ｐＨＣＷ７０１をＥ
ｃｏＲＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ及び４種類のｄＮＴＰ
を用いてフィルインし、次にＢａｍＨＩで消化し、そし
てポジティブ・レトロレギュレーターを含有する４００
bp断片を回収した。ｐＳＹＣ１０７８をＡｖａＩで消化
し、Ｋｌｅｎｏｗ及び４種類のｄＮＴＰによりフィルイ
ンし、そしてＢａｍＨＩで消化した。連結混合物をＥ．
コリＭＭ２９４に形質転換し、そしてＣｍ^Rを付与する
５．５kbプラスミドである目的プラスミドｐＳＹＣ１０
８９の造成を確認した。ｐＳＹＣ１０８９はｐｈｏＡプ
ロモーターのための配列及びリーダー配列（ＮａｒＩ部
位を伴う）、及びＢａｍＨＩ部位のすぐ上流の構造遺伝
子、並びにこれに続くｃｒｙ遺伝子のポジティブ・レト
ロレギュレーター配列を含有する。

【０１６７】Ｄ．６．ｂ．ｐＳＹＣ１０８９を用いる
発現ベクターの造成リシンＡコード配列を、ｐＲＡ１２３、さらに詳しくは
下記のｐＲＡ１２３のＭ１３サブクローン、及びｐＲＡ
Ｔ１から得た。ｐＲＡ１２３は１９８４年８月１７日に
ＡＴＣＣ３９７９９として寄託されている。３つの発現
ベクターを造成した。２つはリーダーとリーディングフ
レームを合わせてリシンＡ配列をするベクターであり、
図７に一般的に示されるようにして、ｐＲＡＴ１及びｐ
ＲＡ１２３の変形されたＭ１３サブクローンを用いて造
成した。この発明のベクターとして代表的な第３の発現
ベクターｐＲＡＰ２２９は、第８図に示されるようにし
て、ｐＲＡＴ１のみに由来するコード配列を用いて造成
した。

【０１６８】２種類のイン−フレーム（ｉｎ−ｆｒａｍ
ｅ）ベクターｐＲＡＰ２１８及びｐＲＡＰ２２１０のた
め、（１）ｐＳＹＣ１０８９の大ＮａｒＩ／ＢａｍＨＩ
レプリコン含有断片（Ｂ．チュリンジェンシスのポジテ
ィブ・レトロレギュレーター配列、クロラムフェニコー
ル耐性マーカー、適合性レプリコン、並びにｐｈｏＡプ
ロモーター及びリーダー配列をこの順序に提供する）；
（２）適切に終止されたリシンＡのＣ−末端部分をコー
ドする５００bp断片を提供するＣｌａＩ／ＢａｍＨＩ消
化ｐＲＡＴ１；及び（３）リシンＡのアミノ末端コード
部分を含む適当に変形されたＭ１３／ｐＲＡ１２３サブ
クローンのＲＦ−ＤＮＡ中のＣｌａＩ部位の上流の３５
０bp断片、の３方連結を用いた。

【０１６９】ｐＲＡＰ２１８のため、この最後の断片を
プライマーとして：

【０１７０】

【化９】

【０１７１】を用いる部位特定変異誘発により変形され
たＭ１３／ｐＲＡ１２３サブクローンから誘導した。こ
れは、リシンＡコード配列のＮ−末端にＭｓｔＩ部位を
置く。変形されたｐＲＡ１２３からの目的とする３５０
bp ＭｓｔＩ／ＣｌａＩ断片を３方連結混合物として、
ＣｌａＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐＲＡＴ１及びＮａｒＩ／Ｂ
ａｍＨＩ消化ｐＳＹＣ１０８９（ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ
の存在下でＥ．コリＤＮＡポリメラーゼＩを用いてＮａ
ｒＩ部位を平滑末端化した後）と連結した。生ずる融合
物は、第９図（ａ）に示すように、リーダーのＣ−末端
アラニンのコドンとリーディングフレームを合わせて直
接連結されたリシンＡ配列のイソロイシンの代りにＮ−
末端アラニンを含有する。

【０１７２】ｐＲＡＰ２２１０を同様にして造成した。
但し、Ｎ−末端配列を、リシンＡのＮ−末端にＢｇｌII
部位を置くプライマーとして：

【０１７３】

【化１０】

【０１７４】を用いて変形されたＭ１３サブクローンか
らの３５０bp ＢｇｌII／ＣｌａＩ断片として得た。Ｂ
ｇｌII開裂部位をまずＫｌｅｎｏｗの存在下で基質とし
てｄＴＴＰ，ｄＡＴＰ、及びｄＧＴＰを用いて部分的に
修復し、そしてＣｌａＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐＲＡＴ１及
びＮａｒＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐＳＹＣ１０８９（ベクタ
ー断片のＮａｒＩ開裂部位をＫｌｅｎｏｗの存在下でｄ
ＣＴＰを用いて部分的に修復した後）との混合物中で連
結した。この連結は図９（ｂ）に示す配列を与え、ここ
で正しい融合物はリーダーのＣ−末端アラニンにリーデ
ィングフレームを合わせて融合されたもとのＮ−末端イ
ソロイシンコドンを含有する。

【０１７５】前駆体蛋白質のためのコード配列を含有す
る対応する発現ベクターを正確に上記と同様にして造成
した。但し、ｐＳＹＣ１０８９の大ＮａｒＩ／ＢａｍＨ
Ｉレプリコン含有断片はＫｌｅｎｏｗにより平滑末端化
されたＢａｍＨＩ部を有しており、そしてｐＲＴ３，ｐ
ＲＴ１７又はｐＲＴ３８からのＣｌａＩ／ＸｈｏＩ（平
滑）断片、あるいは、例えばａｒｇ−ａｒｇをコードす
る変形又は終止／開始コドン挿入を有する変形されたＭ
１３ファージからの断片を、ｐＲＡＴからのＣｌａ／Ｂ
ａｍＨＩ断片の代りに使用した。得られたベクターを一
般にｐＲ３Ｐ−２１８，ｐＲ１７Ｐ−２１８，ｐＲ３８
Ｐ−２１８，ｐＲ３Ｐ−２２１０等と命名する。

【０１７６】リシンＡのための本発明のアウト−オブ−
フレーム（ｏｕｔ−ｏｆ−ｆｒａｍｅ）プラスミドを同
様の３方連結により得た。但し、Ｎ−末端配列はｐＲＡ
Ｔ１からの約３５０bp ＣｌａＩ／ＣｌａＩ断片により
得、ベクター断片のＮａｒＩ部位は修復しなかった。リ
シンＡ配列はやはりｐＲＡＴ１からのＣｌａＩ（部分）
／ＢａｍＨＩ切り出し断片として調製することができ、
そしてそれが好ましいことが明らかである。

【０１７７】得られる融合物は（１）イソロイシン残基
に先行するリシンＡ鎖の開始コドンを保持しており、
（２）リーダー配列に対して７bp分離されており、そし
てそれ故にリーディングフレームが合っておらず（ｏｕ
ｔｏｆｆｒａｍｅ）；（３）トリペプチドＩｌｅ−
Ｓｅｒ−ＬｅｕによりｐｈｏＡリーダーを延長し；そし
て（４）リシンＡの開始コドンとフレームが合っていな
いがしかしその近傍にあるＴＧＡコドンにおいてリーダ
ー配列の終止を可能にする。ｐＲＡＰ２２９の融合部の
配列を図９（ｃ）に示す。前駆体のための対応するベク
ターをｐＲ３Ｐ−２２９，ｐＲ１７Ｐ−２２９、及びｐ
Ｒ３８Ｐ−２２９と命名する。ｐＲＡＰ２２９は１９８
５年３月８日にＮｏ．５３４０８としてＡＴＣＣに寄託
された。

【０１７８】この発明のアウト−オブ−フレームプラス
ミドｐＲＡＰ２２９を同様の３方連結により得た。但
し、Ｎ−末端配列をｐＲＡＴ１からの約３５０bpのＣｌ
ａＩ／ＣｌａＩ断片として得、ベクター断片のＮａｒＩ
部位を修復しなかった。リシンＡ配列をｐＲＡＴ１から
のＣｌａ（部分）／ＨａｍＨＩ切り出し断片として調製
することもでき、そしてそれも好ましいことが明らかで
ある。得られる融合体は（１）イソロイシン残基に先行
するリシンＡ鎖の開始コドンを保持しており；（２）リ
ーダー配列に対して７bp分離されており、そしてそれ故
にフレームが合っておらず；（３）トリペプチドＩｌｅ
−Ｓｅｒ−ＬｅｕによりｐｈｏＡリーダーを延長してお
り；そして（４）リシンＡの開始コドンとフレームが合
っていないがしかしその近傍にあるＴＧＡコドンにおけ
るリーダー配列の終止を可能にする。ｐＲＡＰ２２９の
融合部の配列を図９（ｃ）に示す。ｐＲＡＰ２２９は１
９８５年３月８日にＮｏ．５３４０８としてＡＴＣＣに
寄託された。

【０１７９】アウト−オブ−フレームｐｈｏＡリーダー
を用いてＭＭ２９４中で生産される可溶性リシンＡに関
してこの項に記載した方法は、ｐＲＡＴ１におけるよう
に、ｔｒｐプロモーターの制御のもとでＭＭ２９４中で
生産されるリシンＡを抽出するためにも使用することが
できる。抽出は８より高いｐＨにおいて行われ、リシン
Ａの収量は全細胞蛋白質の６〜８％の範囲である。この
収量は、抽出が異る条件で行われる、ｐＲＡＴ１につい
てＤ．５．に記載した収量より多い。ＭＣ１０００中で
Ｐ_Lの制御のもとで生産されるリシンＡについての抽出
条件の対応する変更は可溶化をもたらさない。

【０１８０】Ｄ．６．ｃ．Ｅ．コリにおける可溶性リ
シンＡの製造ｐＲＡＰ２１８，ｐＲＡＰ２２１０、及びｐＲＡＰ２２
９をＥ．コリＭＭ２９４中に形質転換し、そして形質転
換された培養物をMichaelis 等、J. Bact. (1983) 154
: 356-365 により記載されている条件に類似する条件
下で増殖せしめた。外から添加するリン酸濃度を低下せ
しめることにより細胞を誘導し、そして培養物を１６〜
１７時間保持した。

【０１８１】細胞を収得し、そして洗剤の不存在下での
音波処理により調製された全体細胞抽出物を、天然リシ
ンＡに対するラビット抗血清を用いるウェスタンブロッ
トにより、発現についてアッセイした。この結果を、ｐ
ＲＡＰ２１８及びｐＲＡＰ２２９について図１０に示
す。（ｐＲＡＰ２２１０についての結果はｐＲＡＰ２１
８についてのそれに正確に類似する。）

【０１８２】〔Ｅ．コリ中で生産された蛋白質がペリプ
ラズム空間中に存在し、そしてそれ故に“分泌される”
ということの１つの示唆は、それが浸透圧ショックによ
り放出され得ることである。この試験は、Nassal及びHe
ppel, J. Biol. Chem. (1966) 241 : 3055-3062 により
記載されているのと実質的に同じ方法により行った。要
約すれば、誘導された細胞培養物のペレットを、５０mM
Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、２．５mM ＥＤＴＡ、及び
２０ｗ／ｖ％シュークロースを含有する緩衝液中に約７
×１０⁹細胞／mlの濃度に懸濁し、そして室温にて１０
分間保持した。次に、細胞をペレット化し、そして氷冷
水に再懸濁し、そして氷上に１０分間置いた。遠心分離
の後、浸透圧処理物と称する上清、及び浸透圧細胞ペレ
ットと称するペレットをこの明細書に記載するようにし
てアッセイした。〕

【０１８３】図１０において、レーン１及びレーン２は
それぞれ天然のリシン及び組換リシンを示す。（組換リ
シンはｐＲＡＬ−６で形質転換されたＥ．コリＭＭ２９
４を用いて製造し、そして音波処理により調製した全体
細胞抽出物を分析にかけた。）レーン１において、天然
蛋白質のグリコシル化の程度を異にする２つの形態Ａ₁
及びＡ₂が明瞭に現われる。レーン２において、組換リ
シンＡの大きな汚れたスポットはゲルの過剰負荷による
人工的結果であるが、このものは非グリコシル化リシン
Ａのための適切な分子量において移動する。レーン３〜
８は、誘導されたｐＲＡＰ２１８培養物の抽出物を示
す。

【０１８４】浸透圧処理物であるレーン３はリシンＡが
ペリプラズムに存在しないことを示す。浸透圧処理ペレ
ットであるレーン４は蛋白質が細胞内に存在すること、
又は少なくとも細胞構造成分に結合していることを示
す。レーン５，６及び７は３分間音波処理物の種々の画
分であり、音波処理物の画分間の蛋白質の分布を示す。
レーン５は低速ペレットであり、レーン６は低速上清で
あり、レーン７は１００，０００×ｇ上清である。レー
ン８は３分間音波処理＋全蛋白質を放出するためのＳＤ
Ｓに相当する。レーン９は対照であって、誘導されない
形質転換体がリシンＡを含有しないことを示す。

【０１８５】レーン１０〜１５はｐＲＡＰ２２９にりよ
り形質転換されたＥ．コリから得られた対応する結果で
ある。やはり、浸透圧処理物（レーン１０）はリシンＡ
を含有せず、他方細胞内成分はリシンＡ蛋白質の存在を
示す。レーン１４において、遊離リシンＡ蛋白質が１０
０，０００×ｇでの遠心において上清から除去されない
ことに注目することが重要である。ペレット画分中のリ
シンＡの存在は膜又は他の結合材料からのリシンＡの不
完全な抽出に基く。

【０１８６】非ブロット−クマッシーブルー染色ポリア
クリルアミドヂル中に存在する物質の量の算定により、
イン−フレームプラスミドｐＲＡＰ２１８及びｐＲＡＰ
２２１０については、生産は全細胞蛋白質の約１〜２％
であること、及びリシンＡがプロセシングされた蛋白質
（２８kD）及びプロセシングされていない蛋白質（３０
kD）の間にほぼ同量ずつ分布することが示される。しか
しながら、ｐＲＡＰ２２９については、分子量２８kDの
生成物のみが得られ、そしてこれは全細胞蛋白質の５〜
６％以上を占める。

【０１８７】類似の形質転換体、例えばｐＲ３Ｐ−２１
８，ｐＲ１７Ｐ−２２１０及びｐＲ３８Ｐ−２２９形質
転換体から対応する前駆体蛋白質が得られる。変形され
た前駆体コードＤＮＡが使用される場合、トリプシンで
開裂され得る前駆体又は活性化された蛋白質が生産され
る。ｐＲＡＰ２２９形質転換体からの精製された生成物
をＮＨ₂末端配列決定により分析した。この分析は、配
列決定可能な蛋白質の約３３％がＮ−末端にメチオニン
を有し、そして残りがイソロイシンを有することを示
す。（Ｎ−ホルミルメチオニンに続くペプチドは配列決
定され得ない。）

【０１８８】真空系が除去されるように改良されたアプ
ライドバイオシステムス・モデル４７０Ａ気相シーケン
サーを用いてＮＨ₂−末端配列決定を行った。アプライ
ド・バイオシステムス０２ＮＶＡＣプログラムを使用
し、製造者により提供される試薬及び溶剤を使用した。
２０％水性トリフルオロ酢酸を用いる自動的変換により
装置内に形成されるＰＴＨ−アミノ酸誘導体を逆相ＨＰ
ＬＣを用いて同定した。ＨＰＬＣ系はウオーターズＷＩ
ＳＰサンプル注入器、２台のベックアンモデル１１２ポ
ンプ、ベックマンモデル４２１コントローラー、アルテ
ックス４．６mm×１５cmウルトラフフェアーＯＤＳカラ
ム、２５４nm及び３１３nmに設定された２個のベックマ
ンモデル１６０検出機（タンデム配置）、キップ・アン
ド・ゾネン２チャンネルレコーダー、及びスペクトラー
フィジックス・モデルＳＰ４１００コンピューター積分
器から成る。ＰＴＨ−アミノ酸を２５mM酢酸ナトリウム
（ｐＨ４．２５）中アセトニトリル：メタノール（１：
１）のグラジエントで溶出した。

【０１８９】Ｄ．６．ｄ．リシンＡの精製精製のために十分なリシンＡ蛋白質を得るため、細胞を
１０ｌの発酵槽中で増殖せしめ、そしてリン酸塩濃度の
消耗により誘導した。１００mM硫酸アンモニウム、５mM
ＫＨ₂ＰＯ₄，１mMクエン酸ナトリウム及び１mM Ｔ
Ｋ−９のオートクレーブ殺菌された溶液を含有し、そし
て３mM ＭｇＳＯ₄，５ｇ／ｌのグルコース、20mg／ｌ
の塩酸チアミン、７２mM硫酸第一鉄及び２５mg／ｌのク
ロラムフェニルコールから成る無菌の添加物が補充され
た培地中で細胞を増殖せしめた。無機塩／グルコース培
地中に増殖した形質転換体の、浸とうフラスコからの１
mg乾物重量／ｌを接種した。

【０１９０】接種の後、発酵槽の温度を３７℃に維持
し、そしてＫＯＨの添加及び同時グルコースフィードに
よりｐＨを６．８に調整した。溶有酸素を４０％空気飽
和に調節した。約２０のＯＤ₆₈₀においてリン酸塩の消
耗の後誘導が起った。明瞭な誘導の後４〜５時間目に低
速で遠心分離することにより細胞を収得した。４０ｇの
湿重量の細胞を、０．５ＭＮａＣｌを含有する緩衝液
Ｘ〔緩衝液Ｘは０．１ＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）、２
５mM ＥＤＴＡ、０．１％β−メルカプトエタノールを
含有する〕１００mlの存在下で音波処理した。３０分間
の音波処理の後、１mlのＤＭＳＯ中１mgのフェニルメチ
ルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を加え、そして音
波処理した混合物を１２，０００×ｇにて３０分間遠心
した。なお、遠心速度が比較的低いため、上清はこの明
細書において定義する溶解度の基準に合致しない成分を
なお含有するであろう。

【０１９１】完全には透明になっていない上清を、リン
酸緩衝化塩（ＰＢＳ）（ｐＨ７）で平衡化した２００ml
のベッドボリウムを有するフェニルセファロース（ファ
ルマシア社）カラムに負荷した。カラムを１ベッドボリ
ウムのＰＢＳで押し出し、そして次にＰＢＳ中０〜５０
％クロピレングリコールグラエントにより蛋白質を溶出
した。画分をＳＤＳゲル電気泳動にかけ、そしてクマッ
シーブルーにより染色し、ｐＲＡＬ６形質転換体から精
製されたあらかじめ確認されたリシンＡの泳動により目
的とするバンドを同定することによりアッセイした。組
換リシンＡは約１５％のプロピレングリコールにおいて
カラムから溶出した。リシンＡ含有画分をプールし、そ
してその後の精製段階のため緩衝液Ｙ〔２０mM酢酸ナト
リウム（ｐＨ５．５）、１ml ＥＤＴＡ、０．１％β−
メルカプトエタノール〕中に１０倍に稀釈した。

【０１９２】このリシンＡはこの明細書に定義する基準
に照らして可溶性であった。フェニルセファロースを使
用しない対照実験は可溶性生成物をもたらしたが、しか
しながら免疫沈澱するリシンＡが遠心分離の間にペレッ
ト中に沈降する大断片と結合して残った。さらに、可溶
性であると定義されるリシンＡの収量は、精製工程にお
いて吸着剤としてフェニルセファロースを使用すること
により大きく改良された。

【０１９３】プールされた画分を、緩衝液Ｙによりあら
かじめ平衡化された２００mlのベッドボリウムを有する
カルボキシメチルセファロースカラムに適用した。画分
を緩衝液Ｙ中１００〜２５０mM ＮａＣｌのグラジエン
トにより溶出し、そして画分を上記のようにしてＳＤＳ
ゲル／クマッシーブルー染色を用いてアッセイした。リ
シンＡ画分は約１５０mM ＮａＣｌにて溶出し、そして
約９５％純度のリシンＡが得られた。これは研究用とし
て十分な純度である。

【０１９４】プールされたリシンＡ含有画分を緩衝液Ｘ
中に１０倍に稀釈し、そして次にこのプールをカビクロ
ンブルーＦ３ＧＡ〔ブル・トリスアクリル（商標）ＬＫ
Ｂ〕カラムに適用することによりさらに精製した。〕中
に１０倍に稀釈した。画分を緩衝液Ｘ中０〜１ＭＮａ
Ｃｌで溶出した。リシンＡ画分を、ＳＤＳゲル／クマッ
シーブルー染色により再度同定し、そして約０．５Ｍ
ＮａＣｌにおいて溶出することが示された。これらの画
分は、図１１に示すごとく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単一
のバンドを示した。図１１はトリスアクリル画分からの
ゲルと可溶性音波処理蛋白質画分からのそれとを対比す
る。トリスアクリルカラムから溶出する物質は、ラビッ
ト網状赤血球蛋白質合成阻害アッセイにおいて、天然リ
シンＡとおよそ同じレベルで活性であった（下記参照の
こと）。

【０１９５】Ｄ．６．ｅ．この発明のリシンＡを用い
るイムノトキシン上記のようにして精製したｐＲＡＰ２２９生成物を用い
て、ヒト−トランスフェリンリセプターに対して特異的
な免疫グロブリンであるモノクローナル抗体４５４Ａ１
２との免疫接合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅ）、及び抗−乳癌モノクローナル抗体２８０Ｄ１１と
の免疫接合体を調製した。接合体はリンカーとしてイミ
ノチオチン又はＳＰＤＰを使用して２つの一般的方法に
より調製した。

【０１９６】接合体を形成するため、Bjorn, M. J.等、
Biochim. Biophys. Acta (1984) 790 : 154-163 に記載
されている方法を使用した。要約すれば、抗−乳癌モノ
クローナル抗体２８０Ｄ１１、抗−トランスフェリンリ
セプター４５４Ａ１２、又は他の所望の抗体をまずＳＰ
ＤＰにより誘導体にし、そしてこれを使用してリシンＡ
の遊離システインのスルヒドリル基と共にジスルフィド
結合を形成せしめた。ＰＢＳ中２０mg／mlの抗体を含有
する溶液に１０〜２０倍モル過剰のＳＰＤＰを加え、そ
して室温にて１時間インキュベートし、そして次にＰＢ
Ｓに対して透析して未反応ＳＰＤＰを除去した。この方
法により各抗体に約２〜５のピリジル−ジスルフィド成
分が導入されたものと計算された。接合を完成するた
め、４℃にて還元剤中に貯蔵しておいたリシンＡ１〜２
mg／ml溶液をＰＢＳ中で平衡化されたセファデックスＧ
−２５カラムに通して還元剤を除去し、そしてリシンＡ
を２〜４倍モル過剰の細胞変性部分の量で誘導体化され
た抗体と混合した。接合は放出されるピリジン−２−チ
オールの分光測定により、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
確認した。

【０１９７】他の方法においては、適切なモノクローナ
ル抗体（＞３０mg／ml）を４℃にて１００容量の１００
mMリン酸ナトリウム（ｐＨ８）、１mM ＥＤＴＡ（Ｐ−
ＥＰＴＡ）に対して透析した。抗体溶液を１mM ５，
５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＮＴＢ）
とし、そして次に２．５当量の２−イミノチオラン（水
中１０mMストック溶液）を加えた。反応を０℃にて２４
時間進行させた。２−イミノチオランにより導入されそ
して次にＤＮＴＢによりブロックされたチオールの数を
チオニトロ安息香酸の放出により分光光度計により決定
した（吸光係数：４１２nmにて１３，６００／Ｍ）。

【０１９８】過剰の２−イミノチオラン及びＤＴＮＢを
３×１００容量のＰ−ＥＤＴＡに対する４℃での透析に
より除去した。接合されるべきリシンＡ（＞１０mg／m
l）を４℃にて１００容量のＰ−ＥＰＴＡに対して透析
し、そして遊離チオール／リシンＡの数値をＤＴＮＢを
用いて分光光度計により決定した。抗体とリシンＡとの
カップリングを、抗体のブロックされたチオールに対し
て１．２倍過剰のリシンＡ遊離チオールを添加すること
により実施した。反応を４１２nmにて連続的にモニター
した。この反応は２時間以内に完了した。

【０１９９】この発明のリシンＡ、洗剤中でのみ可溶性
である組換（ｐＲＡＬ６）リシンＡ、及び天然リシンＡ
を用いて接合体を調製した。イムノトキシンは下記のイ
ンビトロ及びインビボの細胞変性アッセイにおいて試験
することができる。アッセイのため、イムノトキシンの
いくらかをまず精製した。組換（ｐＲＡＬ６）リシンＡ
由来の免疫接合体、やはり洗剤中でのみ可溶性であり、
精製することが不可能であった。本発明の可溶性リシン
Ａの接合体及び天然リシンＡの接合体を、まずブルー・
トリスアクリル上での分画とＰＣＡ−４４上でのサイズ
分離との組合わせにより精製した。遊離抗体、遊離リシ
ンＡ、及び接合体を含有するもとの混合物をまず、リシ
ンＡ及びその接合体の両者に対して親和性を有するブル
ー・トリスアクリルによる処理にかけた。次に、カラム
から溶出されたリシンＡ及びリシンＡ接合体を含有する
混合物をＡＣＡ−４４を用いるサイズ分画にかけて未接
合リシンＡを分離した。得られる接合体は、下記のアッ
セイにおいて使用した場合約＞９５％の純度であった。

【０２００】インビトロアッセイはBjorn 等（前掲）に
記載の方法に従った。典型的な方法において、ヒト乳癌
細胞（ＭＣＦ−７）を８mlのガラスバイアルに接種し、
そして免疫接合体の稀釈物を添加した。３７℃にて２２
時間インキュベートした後、培地を除去し、そして未ラ
ベルのメチオニンを欠くがしかし１μＣｉの³⁵Ｓメチオ
ニンが補充された培地で置換した。２時間のパルスの
後、培地を吸引除去し、１mg／mlのメチオニンを含有す
る１０％トリクロロ酢酸により単層を２回洗浄し、そし
てバイアルを乾燥した。２０ｖ／ｖ％のトリトンＸ−１
００を含有する４ａ２０（商標）シンチレーション液
（リサーチ・プロダクツ・インターナショナル・コーポ
レーション）３mlを添加した後、バイアルを計数した。
毒性を、蛋白質合成を５０％阻害するために必要な蛋白
質の濃度（ＴＣＩＤ₅₀）として表現した。

【０２０１】インビボアッセイにおいて、腫瘍が移植さ
れた動物を対象として使用し、そして接合体を注射して
腫瘍の増殖に対するそれらの効果を評価する。結果を、
対照と比較して実験動物における腫瘍の増殖の％として
計算することができる。リシンＡ及びその接合体をさら
に、Ｂａｌｂ／ＣマウスへのＩＶ注射により毒性につい
て試験した。本発明の組換可溶性リシンＡの接合体及び
天然リシンＡの接合体の両者についてＬＤ₅₀値を決定し
た。不溶性組換（ｐＲＡＬ６）リシンＡから調製された
接合体については毒性を決定することができなかった。
なぜなら、これらの接合体は十分な量で得られず、精製
することができず、そして洗剤を含有していたからであ
る。

【０２０２】酵素活性並びに前記のインビトロ及びイン
ビボ活性試験の結果を表３に後記する。表３に示す酵素
活性は、市販のラビット網状赤血球インビトロ翻訳系に
おける蛋白質合成を５０％阻害するのに必要なリシンＡ
の量（ng／ml）に関する。毒性はＢａｌｂ／Ｃマウスへ
のリシンＡの１回のＩＶ注射から得られるＬＤ₅₀値とし
て算出した。

【０２０３】上記のようにして調製したリシンＡ蛋白質
とのイムノトキシンを用いて細胞変性をインビトロで測
定した。未接合天然リシンＡ又はｐＲＡＰ２２９リシン
Ａを用いる対照はおよそ２０nMの細胞変性活性を示し
た。アッセイ法は上記の通りとした。感受性セルライン
としてＭＣＦ−７を使用し、そして表に示す結果は感受
性セルラインの５０％殺滅を惹起することができる接合
体の濃度（nM）である。対照非感受性セルライン、例え
ばＣＣ９５は典型的には１００nMより高いこのアッセイ
の免疫接合体のＴＣＩＤ₅₀値を示した。

【０２０４】

【表３】

【０２０５】この発明の可溶性ｐＲＡＰ２２９リシンＡ
は実施誤差の範囲内において、天然リシンＡの性質に匹
敵する性質を有し、この性質には酵素活性及び特異的細
胞変性接合体の形成が含まれる。インビボアッセイにお
ける予備的な結果は、可溶性ｐＲＡＰ２２９リシンＡと
共に形成された免疫接合体が、腫瘍の増殖を阻害するそ
の活性において、天然リシンＡと共に形成された免疫接
合体に匹敵することを示唆する。

【０２０６】Ｄ．７．ｐＲＴＢ７０４の調製ｐＲＴＢ７０４はＣＭＣＣＮｏ．１９５０であり、１
９８４年９月１４日にＡＴＣＣに寄託された。ｐＲＴＢ
７０４はＰ_LプロモーターＮ_RBSの制御のもとにリシン
Ｂ配列を有する発現プラスミドである。これは、リシン
Ｂコード配列を含有するｐＲＴＢ６０１及びＰ_LＮ_RBS
を含有するｐＦＣ５から造成される。ｐＦＣ５はＮｏ．
３９８６４としてＡＴＣＣに寄託されている。ｐＲＴＢ
７０４を造成するため、ｐＲＴＢ６０１をＨｉｎｄ III
で消化してリシンＢコード配列を切り出し、ＦｕｎＤII
で処理してベクターのＡｍｐ^R領域を破壊し、そしてＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いてｐＦＣ５のＨｉｎｄ III消化
物と連結した。この混合物をＥ．コリＭＭ２９４に形質
転換し、そしてＡｍｐ^Rを選択し、そして正しい造成を
配列決定により確認した。

【０２０７】ｐＲＴＢ６０１Ｄ．１に記載したようにして調製したポリＡｍＲＮＡ
を使用して、次のようにしてｃＤＮＡライブラリーを得
た。ポリＡｍＲＮＡの部分を適切な緩衝液条件下で逆
転写酵素により処理し、そして塩基で処理して残留する
ｍＲＮＡを破壊した。生ずる単鎖ｃＤＮＡを４種類のｄ
ＮＴＰの存在下でＥ．コリのポリメラーゼＩを用いて修
復し、そして生ずる“ヘアーピン”をＴ４リガーゼを用
いてＳａｌＩリンカー（ニューイングランドビオラブス
から得られる）に連結した。Ｓ１ヌクレアーゼによる処
理及びＫｌｅｎｏｗによる修復の後、Ｔ４リガーゼを用
いて平滑末端をＥｃｏＲＩリンカーに連結した。

【０２０８】次にＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化した
後、両端にＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ制限部位を有する２
本鎖ＤＮＡ断片を、ｐＵＣ１３（ミネソタ大学J. Messi
ngより自由に入手することができる）のＥｃｏＲＩ／Ｓ
ａｌＩ消化されＢＡＰ処理された調製物に連結した。ｐ
ＵＣ１３はｐＢＲ３２２の変形体であってＡｍｐ耐性
（Ａｍｐ^R）を付与することができ、そして便利な制限
部位を有するリンカーの上流にｌａｃプロモーター制御
配列を有し、これらの制限部位には挿入において使用さ
れるＳａｌＩ部位から下流のＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩを
含有し、これらの部位は類似のＭ１３ファージクローニ
ングベクターのそれと同じである。得られる連結混合物
を用いてＥ．コリＭＭ２９４を形質転換し、そしてＡｍ
ｐ^R株を選択した。

【０２０９】好結果のコロニーをニトロセルロースプレ
ートに移し、そしてGrunstein 及びHogness （前掲）の
方法を用いて、³²Ｐでキナーゼ処理された１６個の合成
オリゴヌクレオチド：

【０２１０】

【化１１】

【０２１１】の混合物によりプローブした。この混合物
は、アミノ酸配列： Trp-Met-Phe-Lys-Asn-Asp-Gly のコドンに相補的なアンチセンス鎖である。プローブさ
れた約５０００個のコロニーの内約１％がプローブにハ
イブリダイズした。これらのコロニーの幾つかの代表か
らプラスミドを単離し、そして制限分析及びＭａｘａｍ
−Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定により分析した。３種類のプ
ラスミドｐＲＴＢ４，ｐＲＴＢ５、及びｐＲＴＡ１１５
を挿入領域において配列決定した。その結果を図４に示
す。

【０２１２】ｐＲＴＢ５の塩基配列から推定されるアミ
ノ酸配列は、幾らかのくい違いは存在するが、リシンＢ
と高レベルの対応を示す。これらは公表されている配列
の誤まりに基き、そして示されているリシンＢ鎖蛋白質
の多様性に基く。ｐＲＴ５中には最初の１１のアミノ酸
を除くリシンＢの完全なコード配列が存在する。ｐＲＴ
Ｂ５を発現ベクター中の多くのコード配列源として使用
した。ｐＲＴＡ１１５挿入部はリシンＢ遺伝子の上流コ
ード領域を含有する。ｐＲＴＡ１１５はＲＣＡ前駆体蛋
白質と関連すると信じられるが、ｐＲＴＡ１１５からＲ
ＣＡについて推定されるアミノ酸配列はＮ−末端を完成
するために必要とされる１１個のアミノ酸についてのリ
シンＢのそれと一致する。従って、これらの配列は欠け
ている１１個のＮ−末端コドンをコードするオリゴヌク
レオチドの造成のためのモデルとして使用され、そして
ＲＣＡの、そしておそらくリシンＡ及びＢの単鎖ペプチ
ド前駆体中の１２個のアミノ酸のペプチドのアミノ酸配
列の推定を可能にする。

【０２１３】ｐＲＴＢ５のコード配列はｐＵＣ１３中に
挿入された場合にｌａｃプロモーターの制御のもとに発
現されないように配置されている。従って、ｐＲＴＢ５
をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで切断し、そしてベクターを
ＢｓｔＮＩにより複数の断片に開裂せしめた。挿入断片
を、標準的条件下でＴ４リガーゼを使用してＥｃｏＲＩ
／ＰｓｔＩ消化したｐＵＣ８と連結した。ｐＵＣ８はミ
ネソタ大学Messing, J. から自由に入手できる他方の変
形されたｐＢＲ３２２ベクターである。ｐＵＣ８はＥｃ
ｏＲＩ及びＰｓｔＩ部位を有し、これらの部位はＥｃｏ
ＲＩ／ＰｓｔＩ挿入部をβ−ガラクトシダーゼの最初の
５〜８アミノ酸との融合蛋白質をコードするようにｌａ
ｃプロモーターの制御のもとにおく。

【０２１４】このものはまた、ＰｓｔＩ部位のすぐ下流
にＨｉｎｄ III部位を含む。連結混合物をＥ．コリＭＭ
２９４に形質転換し、そして形質転換体をアンピシリン
耐性について選択した。プラスミドＤＮＡを幾つかのコ
ロニーの中の好結果の形質転換体から単離し、そして制
限部位のマッピングにより分析した。適切な制限パター
ンを示すコロニーを選択した。ｐＲＴＢ１５１と称する
１つのコロニーを融合蛋白質のための遺伝子の発現につ
いて試験した。ウェスタンブロットにおいて、交差反応
する蛋白質は生産されていたが目的とする分子量に対応
する蛋白質バンドは見出されなかった。このプラスミド
はβ−ガラクトシダーゼ配列及びリシンＢ配列を異る位
相で有するように設計されたために、リーディングフレ
ームが不適切であることが予想される。

【０２１５】１０μｇのｐＲＴＢ151 のＤＮＡをＥｃｏ
ＲＩで完全消化し、６０μｌのＳ１緩衝液に溶解し、そ
して１分間当たりデュプレックスＤＮＡの約１塩基対を
除去する条件下で室温にて４分間消化した。前記の緩衝
液から回収されたＤＮＡを６０μｌのエキソヌクレアー
ゼ III緩衝液中に溶解し、そして室温にて４分間消化し
た。これに続く分析は、プラスミドＤＮＡがハイブリダ
イゼーションのために利用し得る５′末端を残して各
３′末端を約１２０塩基失ったことを示した。エキソヌ
クレアーゼ III緩衝液から回収されたＤＮＡを５０μｌ
の水中に溶解し、そして２０μｌを下記の連結／修復反
応に使用した。

【０２１６】すなわち、２０μｌのサンプル（２ｐmol
）を２０ｐmol ずつの合成オリゴヌクレオチド：

【０２１７】

【化１２】

【０２１８】と混合した。これらのオリゴヌクレオチド
は上に示すように相補的配列を有し、そしてオリゴ２は
図５（ａ）中に示されるらうにＡＴＧ開始コドンの上流
にはＨｉｎｄ III部位をコードする。オリゴ１の５′末
端はｐＲＴＢ１５１の５′末端の１５塩基に相補的であ
り、そしてリシンＢ配列の隣接する欠失コドンに相補的
である。オリゴ２の５′末端はエキソヌクレアーゼ処理
されたｐＲＴＢ１５１のベクター残基の５′接着末端に
相補的である。

【０２１９】混合物を６０℃にて５分間加熱して単鎖Ｄ
ＮＡの対合を完全に変性し、５分間３７℃に冷却して相
補鎖をハイブリダイズせしめ、そして氷上で冷却した。
この溶液をポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）緩衝液条件
にし、そして５０μＭずつの４種類のｄＮＴＰ，０．１
mM ＮＡＤ，０．３ユニット／μｌのＫｌｅｎｏｗ及び
０．０８ユニット／μｌのＥ．コリＤＮＡリガーゼの存
在下で１２℃にて２時間反応せしめた。この連結混合物
を使用してコンピテントＥ．コリＭＭ２９４を直接形質
転換し、そして数千個のＡｍｐ^Rコロニーを見出した。

【０２２０】これらの内数百個をレプリカし、そしてニ
トロセルロースフィルター上に増殖せしめ、そしてプロ
ーブとして³²Ｐキナーゼ処理オリゴ−２を用いて標準的
コロニーハイブリダイゼーションにかけた。プローブと
ハイブリダイズする２個のクローンを制限分析により分
析し、そして配列決定し、そして正しい造成物をｐＲＴ
Ｂ６０１と命名した。従って、ｐＲＴＢ６０１はリシン
Ｂコード配列をＨｉｎｄ IIIカセットとして含有する。
上流Ｈｉｎｄ III部位はオリゴ−２中のＡＴＧコドンの
すぐ上流に導入されており、そしてＨｉｎｄ III部位は
ｐＵＣ８ベクタープラスミドに由来する。

【０２２１】表４に示すプラスミドが、特許手続上の微
生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約及びそ
の規則（ブタペスト条約）の規定のもとにアメリカン・
タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）、米
国，マリーランド，ロックビルに寄託されており、そし
て維持され、ブタペスト条約の規定に従って入手可能に
される。これらの菌株の入手可能性は、いずれかの政府
の権威のもとにその特許法に従って認められた権利に反
してこの発明の実質する許諾であると解してはならな
い。これらのプラスミドはまた、米国，カリホルニア，
エメリービル，シタス・コーポレーションのマスター・
カルチュア・コレクション（ＣＭＣＣ）に寄託されＣＭ
ＣＣ寄託番号が付与された。

【０２２２】

【表４】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、完全なＲＴＡ蛋白質をコードするｐＲ
Ａ１２３のクローン化された挿入部の完全配列を示す。
さらに、推定されるリシンＡの対応する配列、単離され
た天然ＲＴＡの配列、及びプライマー指令変異誘発によ
り変形されるヌクレオチド配列の部分を示す。

【図２】図２は、ＲＣＡ−Ａ鎖コード配列に対応するプ
ラスミドｐＲＴＡ１１５及びｐＲＡ４５中のｃＤＮＡ挿
入部のヌクレオチド配列の混成体、これらから推定され
るアミノ酸配列、並びに天然ＲＴＡの配列を示す。

【図３】図３は、この発明のプラスミドにより形質転換
されたコリＭＭ２９４及びＥ．コリＭＣ１０００λ溶原
株からの抽出物のウェスタンブロットを、リシンＡの対
照を用いて示す。

【図４】図４は、リシンＢをコードする配列についてｃ
ＤＮＡライブラリーをプローブすることにより得られた
ｃＤＮＡ挿入部を含有する３個のプラスミドのヌクレオ
チド配列を示す。

【図５】図５は、ｐｈｏＡオペロンの５′配列、及びリ
ーダーのＣ−末端にＮａｒＩ部位を設けるための変形を
示す。

【図６】図６は、この発明の蛋白質の発現のための宿主
ベクターであるｐＳＹＣ１０８９の造成を示す。

【図７】図７は、ｐＲＡＰ２２１０及びｐＲＡＰ２１８
の造成を示す。

【図８】図８は、ｐＲＡＰ２２９の造成を示す。

【図９】図９は、図７及び図８中に示されるプラスミド
の連結領域を示す。

【図１０】図１０は、ｐＲＡＰ２１８及びｐＲＡＰ２２
９により形質転換されたＥ．コリの抽出物を用いて得ら
れるウェスタンブロットの結果を示す。

【図１１】図１１は、ｐＲＡＰ２２９で形質転換され細
胞の粗波処理物及び精製されたリシンＡから得られた比
較のためのＳＤＳ−ゲルを示す。

【図１２】図１２は、ｐＲＴ３のＲＣＡコードの挿入部
のＤＮＡ配列及び推定されるアミノ酸配列を示す。
“Ｘ”はベクターの部分ではあるがコード配列ではない
ヌクレオチドを示す。

【図１３】図１３は、ｐＲＴ３のＲＣＡコード挿入部の
ＤＮＡ配列及び推定されるアミノ酸配列を示す。“Ｘ”
はベクターの部分ではあるがコード配列ではないヌクレ
オチドを示す。

【図１４】図１４は、ｐＲＴ１７のリシンＤコード挿入
部のＤＮＡ配列及び推定されるアミノ酸配列を示す。

【図１５】図１５は、ｐＲＴ１７のリシンＤコード挿入
部のＤＮＡ配列及び推定されるアミノ酸配列を示す。

【図１６】図１６は、ｐＲＴ３８のリシンＥコード挿入
部のＤＮＡ配列及び推定されるアミノ酸配列を示す。

【図１７】図１７は、ｐＲＴ３８のリシンＥコード挿入
部のＤＮＡ配列及び推定されるアミノ酸配列を示す。

【図１８】図１８は、ｐＲＴ１７及びｐＲＴ３８により
コードされるアミノ酸配列の比較を示す。

【図１９】図１９Ａ及びＢは、リシンアイソトキシン
Ｄ、Ｅ１及びＥ２を分離するブルー・トリスアクリル
（ＢｌｕｅＴｒｉｓａｃｒｙｌ）Ｍクロマトグラフィ
ーからの溶出物の溶出プロフィール及び等電点沈澱によ
る分析を示す。

【図２０】図２０Ａ及びＢは、リシンＤ、リシンＥ１、
リシンＥ２及びヒマ−アグルチニンを分離するアガロー
スアフィニティークロマトグラフィーからの溶出物の溶
出プロフィール及び等電点沈澱パターンを示す。

【図２１】図２１Ａ及びＢは、リシントキシン類並びに
それらのＡ鎖及びＢ鎖の等電点沈澱パターンを示す。

【図２２】図２２は、リシントキシン類及び第１０図の
成分のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された分子量の比較
を示す。図１２〜１３、図１４〜１５及び図１６〜１７
のコードされた蛋白質のリーダー配列は同一である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ // Ａ６１Ｋ 38/43 ＡＢＡＡ６１Ｋ 37/48 ＡＢＡＡＥＤＡＥＤ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】グリコシル化されていない可溶性の蛋白
質であって、次のアミノ酸配列（Ａ）：【化１】を有するリシンＡ鎖、又は次のアミノ酸配列（Ｂ）：【化２】【化３】を有するリシントキシンＤを発現することができる発現
ベクターであって、前記アミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａを含んで成る発現ベクター。
【請求項２】ｔｒｐプロモーターを含んで成る、請求
項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】ｐｈｏＡのリーダー配列をコードするＤ
ＮＡをさらに含んで成る、請求項１又は２に記載の発現
ベクター。
【請求項４】グリコシル化されていない可溶性の蛋白
質であって、次のアミノ酸配列（Ａ）：【化４】を有するリシンＡ鎖、又は次のアミノ酸配列（Ｂ）：【化５】【化６】を有するリシントキシンＤを発現することができる大腸
菌であって、前記のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを
含んで成る発現ベクターにより形質転換された大腸菌。
【請求項５】前記発現ベクターがｔｒｐプロモーター
を含んで成る、請求項４に記載の大腸菌。
【請求項６】前記発現ベクターがｐｈｏＡのリーダー
配列をコードするＤＮＡを含んで成る、請求項４又は５
に記載の大腸菌。
【請求項７】リシンＥ前駆体蛋白質をコードするＤＮ
Ａを含んで成るＤＮＡ。
【請求項８】図１６〜１７に記載のリシンＥ前駆体Ｄ
ＮＡ配列を含んで成る、請求項７に記載のＤＮＡ。
【請求項９】図１６〜１７に記載のリシンＥ前駆体ア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡを含んで成る、請求項７
に記載のＤＮＡ。
【請求項１０】リシントキシンＥＢ−鎖ポリペプチ
ドをコードする第一ＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ。
【請求項１１】前記第一ＤＮＡ配列が、リシンＥＢ
−鎖をコードする図１６〜１７に記載のＤＮＡ配列の部
分である、請求項１０に記載のＤＮＡ。
【請求項１２】前記第一ＤＮＡ配列が図１６〜１７に
記載のリシンＥＢ−鎖のアミノ酸配列をコードする、
請求項１０に記載のＤＮＡ。
【請求項１３】リシンＥＡ−鎖をコードする第二Ｄ
ＮＡ配列をさらに含んで成る、請求項１０に記載のＤＮ
Ａ。
【請求項１４】トリプシン解裂性リンカーをコードす
る第三ＤＮＡ配列をさらに含んで成る、請求項１３に記
載のＤＮＡ。
【請求項１５】請求項７〜１４のいずれか１項に記載
のＤＮＡを含んで成り、該ＤＮＡが、組換え酵母又は細
菌宿主細胞と適合性の制御配列に作用可能に連結されて
いる、発現ベクター。
【請求項１６】前記制御配列が、ｔｒｐプロモータ
ー、ｐｈｏＡプロモーター、及びＤＮＡ翻訳ターミネー
ターの下流のバシルス・チュリンジエンシス（Ｂ．ｔ
ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）結晶蛋白質陽性レトロレギ
ュレーターから成る群から選択された制御配列を含んで
成る、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】請求項７〜１４のいずれか１項に記載
のＤＮＡを含んで成る酵母又は細菌宿主細胞。
【請求項１８】請求項１７に記載の宿主細胞を培養
し、そしてリシンＥ蛋白質を培養する段階を含んで成
る、リシンＥ蛋白質の製造方法。
【請求項１９】請求項１７に記載の宿主細胞を培養
し、そしてリシンＥＢ−鎖を回収する段階を含んで成
る、リシンＥＢ−鎖の製造方法。
【請求項２０】精製された組換えリシンＥ前駆体蛋白
質。
【請求項２１】図１６〜１７に示すアミノ酸配列を有
する、請求項２０に記載のリシンＥ前駆体蛋白質。
【請求項２２】精製された組換えリシンＥ蛋白質。
【請求項２３】図１６〜１７に記載のリシンＥＡ−
鎖アミノ酸配列及び図１６〜１７に記載のリシンＥＢ
−鎖アミノ酸配列を含んで成る請求項２２に記載のリシ
ンＥ蛋白質。
【請求項２４】精製された組換えリシンＥＢ−鎖ポ
リペプチド。
【請求項２５】図１６〜１７に記載のリシンＥＢ−
鎖アミノ酸配列を有する、請求項２４に記載のポリペプ
チド。
【請求項２６】リシンＥＢ−鎖を含んで成る精製さ
れた組換えポリペプチド。
【請求項２７】図１６〜１７に記載のリシンＥＢ−
鎖アミノ酸配列を含んで成る、請求項２６に記載のポリ
ペプチド。
【請求項２８】図１２〜１３に記載のＲＣＡ前駆体ア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡを含んで成るＤＮＡ。
【請求項２９】図１２〜１３に記載のＲＣＡ前駆体Ｄ
ＮＡ配列を含んで成る、請求項２８に記載のＤＮＡ。
【請求項３０】図１２〜１３に記載のＲＣＡのＡ−鎖
アミノ酸配列をコードする第一ＤＮＡ配列を含んで成る
ＤＮＡ。
【請求項３１】前記第一ＤＮＡ配列が図１２に記載の
ＲＣＡＡ−鎖ＤＮＡ配列である、請求項３０に記載の
ＤＮＡ。
【請求項３２】図１２〜１３に記載のＲＣＡＢ−鎖
アミノ酸配列をコードする第一ＤＮＡ配列を含んで成る
ＤＮＡ。
【請求項３３】前記第一ＤＮＡ配列が、図１２〜１３
に記載のＲＣＡＢ−鎖ＤＮＡ配列である、請求項３２
に記載のＤＮＡ。
【請求項３４】請求項２８〜３３のいずれか１項に記
載のＤＮＡを含んで成り、該ＤＮＡが組換え酵母又は細
菌宿主細胞に適合性の制御配列に制御可能に連結されて
いる、発現ベクター。
【請求項３５】前記制御配列が、ｔｒｐプロモータ
ー、ｐｈｏＡプロモーター、及びＤＮＡ翻訳ターミネー
ターシグナルの下流のバシルス・チュリンジエンシス
（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）結晶蛋白質陽性
レトロレギュレーターから成る群から選択される制御配
列を含んで成る、請求項３４に記載の発現ベクター。
【請求項３６】請求項２８〜３３のいずれか１項に記
載のＤＮＡを含んで成る酵母又は細菌宿主細胞。
【請求項３７】請求項３６に記載の宿主細胞を培養
し、そしてＲＣＡを回収することを含んで成る、ＲＣＡ
の製造方法。
【請求項３８】請求項３６に記載の宿主細胞を培養
し、そしてポリペプチドを回収することを含んで成る、
ポリペプチドの製造方法。
【請求項３９】請求項３６に記載の宿主細胞を培養
し、そしてポリペプチドを回収することを含んで成る、
ＲＣＡＢ−鎖を含んで成るポリペプチドの製造方法。
【請求項４０】図１２〜１３に記載のアミノ酸配列を
有する精製された組換えＲＣＡ前駆体蛋白質。
【請求項４１】図１２〜１３に記載のＲＣＡＢ−鎖
を有する精製された組換えＲＣＡＢ−鎖。
【請求項４２】図１２〜１３に記載のＲＣＡＢ−鎖
アミノ酸配列を有する精製された組換えＲＣＡＢ−
鎖。
【請求項４３】図１２〜１３に記載のＲＣＡＡ−鎖
アミノ酸を含んで成る精製された組換えポリペプチド。
【請求項４４】図１２〜１３に記載のＲＣＡＢ−鎖
アミノ酸配列を含んで成る精製された組換えポリペプチ
ド。
【請求項４５】図１２〜１３に記載のＲＣＡＡ−鎖
アミノ酸配列及び図１２〜１３に記載のＲＣＡＢ−鎖
アミノ酸配列を含んで成る精製された組換えＲＣＡ。