JPH07501941A - オンコスタチンｍおよび白血病阻害因子の受容体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 オンコスタチンＭおよび白血病阻害因子の受容体発明の背景 （例えば、ホルモン、薬、サイトカイン、または生化学的な）特異的な分子に結 合する受容体がいろいろな細胞種で同定されてきた。受容体は細胞表面に見いだ される、または可溶性の受容体の場合は、血清中に遊離される。受容体の生理的 な役割を調べるため、および可能な治療上の役割を探すため、多くの受容体を単 離、同定することに努力が向けられてきた。患者に投与した可溶な受容体が、特 別な標的分子に結合することで、標的分子による障害を緩和できる可能性がある 。

ある受容体は、複合体という形で結合した２つの独立したポリペプチド鎖からな っていることがわかってきた。このような２本鎖受容体は、鎖１本のみの場合よ りも強い親和性で標的分子と結合することが多い。

白血病阻害因子（Ｌ　Ｉ　Ｆ）は、成人および胎児のいろいろな体系の調節にお Ｌ）て中心的な役割を果たすポリペプチドホルモンである。ＬＩＦは様々な細胞 種に作用し、多くの生物学的活性を持つ。生物学的活性の多様性は、肝細胞刺激 因子■（バウマン（Ｂａｕｍａｎｎ）およびウオング（ｌｏｎｇ）、Ｊ、Ｉ＋ｕ ＋ｕｎｏ１．１４３＋１１６３［１９８９］）　；コリン作用性神経分化因子（ ヤマモリ（Ｙａｍａｍｏｒｉ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：１４１２［１９９ ０］）：メラノーマ由来リボプロティンリパーゼ阻害剤（モリ（Ｍｏｒｉ）ら、 ＢｉｏｃｈｅＩＩｌ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｍｉ、１６０：１０８５ ［１９８９］）　；　ＤＡ細胞に対するヒトインターロイキン（モレアラ（Ｍｏ ｒｅａｕ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３３６：６９０［１９ｇ８］）　：分化因子（ト ミダ（Ｔｏｍｉｄａ）ら、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅａ＋、２５９：１０９７ｇ［１９８４］）　；分化阻害因子（ アベ（Ａｂｅ）らＪ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｎ、　２６４@；８９ ４１［１９８９］）　：分化阻害活性（スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびクープぐ− （Ｈｏｏｐｅｒ）、Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｉ。

１．１２１：１［１９８７］）　：および分化遅延因子（クープ−７ン（Ｋｏｏ ｐｍａｎ）およびコ・ソトン（Ｃｏｔｔｏｎ）、Ｅｘｐ、Ｃｅ１１．　Ｒｅｓ、 　１５４：２３３［１９８４］）を含むＬＩＦのいろいろな別名に反映されてい る。

白血病阻害因子受容体（Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒ）のクローニングはギアリング（Ｇｅａ ｒＬｎｇ）らによりＥＭＢｏ　１．ＩＱ：２８３９（１９９１）で報告されてい た。この組み換え一末鎖ＬＩＦ−ＲポリペプチドはＬＩＦと結合するが、ある普 通の細胞でみられる当然起こっているＬＩＦ受容体よりも親和性が低い。このク ローニングされた一末鎖ＬＩＦ−Ｒよりも高い親和性でＬＩＦと結合する受容体 がある種の応用には理想的であろう。

オンコスタチンＭは、ある腫瘍由来細胞および普通の細胞ラインの生育を調節す る分泌性の一末鎖ポリペプチドサイトカインである。オンコスタチンＭは、白血 球細胞によって活性化される。多くの細胞種がオンコスタチンＭタンパク質と結 合することがわかってきている。例えばリンスレイ（Ｌｉｎｓｌｅｙ）ら、Ｊ、 　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ。

、　２６４　：４２８２（１９８９）参照。しかしオンコスタチンＭの単離およ び同定は報告されていない。

発明の概要 本発明は、オンコスタチンＭおよび白血病阻害因子（ＬＩＦ）の双方と結合する 性質を持つ受容体を供給する。受容体は白血病阻害因子受容体（Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒ ）と（好ましくは共有結合的に）結合するｇｐ１３０からなる。ｇｐ１３０ポリ ペプチドは、架橋剤またはポリペプチドリンカ−を介してのような、何か適当な 方法で、ＬＩＦ−Ｒと共有結合的に結合しているであろう。本発明の１つの態様 において、この受容体は、組み換えＤＮＡ技術によって作製された融合タンパク 質である。オンコスタチンＭまたはＬＩＦによる障害は、治療上有効な量の本発 明の受容体をこのような障害に被っている患者に投与することによって、処置で きる。

図面の簡単な説明 図１はＬＩＦ結合アッセイの結果を示したグラフである。実施例１に示したよう に、ｇｐ１３０またはＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒをコードするベクターをトランスフェクト した宿主細胞の、ＬＩＦに結合する能力をアッセイした。

図２はオンコスタチン間結合アッセイの結果を示したグラフである。実施例２に 示したように、ｇｐｉａｏまたはＬＩＦ−Ｒをコードするベクターをトランスフ ェクトした宿主細胞の、オンコスタチンＭに結合する能力をアッセイした。

図３は、実施例２に示したように、ｇｐｉａｏをコードする発現ベクターをトラ ンスフェクトした宿主細胞に対する、オンコスタチンＭの結合親和性が低いこと を示したものである。

図４は、抗体由来のＦｃポリペプチドがｇｐ１３０断片をＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒとつな げるために用いられているという、本発明の受容体を図解したものである。

図５は、ｃＤＮＡおよび染色体クローンの塩基配列を比較することによって決定 した全長ＬＩＦ−ＲのＤＮＡ配列およびコードされるアミノ酸配列を示したもの である。シグナルペプチダーゼによる切断部位は垂直の矢印で示した。膜貫通領 域は太い下線で示した。潜在的なＮ−結合糖鎖付加部位はアスタリスクで示した 。ヘマトポイエチンファミリー受容体に関連した重要な残基は箱で示した。水平 の矢印はＬＩＦ−Ｒの３°　コード部位として染色体配列が用いられた部位を示 している。なぜなら塩基配列決定に用いられたｃＤＮＡクローンはこの部位でＡ ヌクレオチドのストレッチで終わっていたためである。

図６はヒビ（Ｉ（ｉｂｉ）らによってＣｅ１ｌ　６３：１１４９（１９９０）で 報告されたクローニングされたｇｐ１３０ｃＤＮＡのＤＮＡおよび予想されるア ミノ酸配列を示したものである。予想されるシグナル配列は下線で示した。太い 下線は予想される膜貫通領域を示す。一連のアスタリスクは可能なＮ糖鎖付加部 位を示す。

図７は、実施例７に示したように、ＬＩＦおよびオンコスタチンＭが結合すると いう点で、可溶なｇｐ１３０／Ｆｃ融合タンパク質と可溶なＬＩＦ−Ｒ／Ｆｃと の相互作用を証明するスキャーチャード解析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ　ａｎａｌｙ ｓｉｓ）を示す。

発明の詳細な説明 本発明は白血病阻害因子受容体（Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒ）と共有結合的に結合している 、ｇｐｉａｏからなる受容体を供給する。本発明のもう１つの態様として、この 受容体は、ＬＩＦ−Ｒと非共有結合的に複合体を形成するｇｐｉａｏからなる。

この受容体はオンコスタチンＭと結合可能で、白血病阻害因子（Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒ ）とも結合する。このようにこの受容体は、オンコスタチンＭまたはＬ　Ｉ　Ｆ −Ｒによる障害を処置するのに有用である。

ｇｌ）１３０は架橋剤またはポリペプチドリンカ−を介するような、何か適当な 方法でＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒと共有結合的に結合しているであろう。ｇｐｉａｏとＬＩ Ｆ−Ｒタンパク質は、結果としてできた受容体がオンコスタチンＭおよびＬＩＦ と結合する活性を阻害しないような形で、共有結合的に結合している。本発明の １つの態様として、受容体は組み換えＤＮＡ技術で作製された融合タンパク質で ある。

ｇｐｉａｏとＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒとの非共有結合は、受容体のオンコスタチンおよび ＬＩＦとの結合能を妨げることのないような形で、可能であろう。一つの方法と しては、第一の化合物がＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒと結合し、非共有結合により第一の化合 物と結合した第二の化合物がｇｐｉａｏと結合する。このような化合物の例はビ オチンとアビジンがある。受容体はこのように非共有結合的にビオチンがアビジ ンと相互作用することによって形成される。本発明の１つの態様として、Ｌ　Ｉ 　Ｆ−Ｒおよびｇｐｉａｏは組み換えポリペプチドであり、各々組み換え細胞か ら精製され、非共有結合的に結合して、受容体を形成している。宿主細胞は、Ｌ 　Ｉ　Ｆ−Ｒおよびｇｐｉａｏの両方が組み換え宿主細胞によって産生されるよ うな２つの異なる発現ベクターで形質転換しであるであろう。このような形質転 換された宿主細胞によって産生されたＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒおよびｇｐｉａｏ　（以下 に示したように、これらの一方または両方は可溶性の断片）は会合して、非共有 結合的な相互作用で複合体を形成するであろう。

”白血病阻害因子受容体”　（Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒ）は、単球マクロファージおよび 巨核球を含むいろいろな造血細胞の表面、および、遺骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａ ｓｔｓ）、胎盤栄養芽層（ｐｌａｃｅｎｔａｌ　ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｓ）、 肝臓柔組織細胞（１１ｖｅｒ　ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ　ｅｅｌ　Ｉｓ）を含む 非造血細胞に存在するタンパク質（サイトカイン受容体）である。Ｌ　Ｉ　Ｆ− Ｒは白血病阻害因子（Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒ）分子と結合することができ、１．ＩＦに よって産生されるシグナルを細胞に伝える役割を果たしている。何の種別の記載 もないときは、ＬＩＦ−Ｒは一般に、それだけに限られるわけではないが、ヒト 、ネズミ、ウシＬＩＦ−Ｒを含むは乳類Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒのことをいう。

ヒトおよびネズミの白血病阻害因子受容体（ＬＩＦ−Ｒ）（どちらも一本位のポ リペプチドであるが）のクローニングは、参考文献で本明細書中に取り入れられ ているＥｌｉＢＯＪ、　１０：２８３９（１９９１）において、ギアリング（Ｇ ｅａｒｉｎｇ）らによって報告されている。ヒトＬＩＦ−ＲｃＤＮＡクローンの ＤＮＡ配列およびそれにコードされるアミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５お よびＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ。

：６に示されている。このクローニングされたヒトｃＤＮＡは、（Ｎ末端からＣ 末端にかけて）４４アミノ酸のシグナル配列（アミノ酸−４４から−１まで）、 細胞外部位全体、膜貫通領域（最初のアミノ酸はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５の７９ ０番目のアミノ酸）および細胞内ドメインの一部を含むヒトＬ　Ｉ　Ｆ−ＲのＮ 端断片をコードする。断片のＣ端は、上述のギアリングらで記載されているよう に、ポリＡ１およびベクターの作製に利用されたリンカ−によってコードされる アミノ酸を含んでいる。本明細書中で使われている”膜貫通領域”という言葉は タンパク質の細胞外ドメインと細胞内ドメインの間に位置する、一連の疎水性ア ミノ酸を指す。上に記載したクローニングされたヒトＬＩＦ−ＲｃＤＮＡを含む プラスミドベクターはｐＨＬＩＦＲ−６５と呼ばれ、大腸菌宿主細胞内において 、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに１９９０年１２月１１日（ ＡＴＣＣ受託番号第６８４９１号）に寄託しである。全長ヒトＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒの ＤＮＡおよびアミノ酸配列（ｃＤＮＡと染色体クローンとを比較して決定された ）は上述のギアリングによって報告され、本明細書中、図５で示されている。

クローニングされたｃＤＮＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６）でコードされるＬＩＦ −ＲはＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒの細胞外領域全長（ＬｒＦ結合活性を担っていると信じら れているドメイン）を含み、ＬＩＦと結合するが、ある普通の細胞でみられるＬ ＩＦ受容体に天然に起こっているものより親和性が低い。さらにオンコスタチン Ｍは、ある細胞型天然に起こっている高親和性ＬＩＦ受容体との結合を、ＬＩＦ と競合している（ギアリングら、Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、４：６１．１９ ９２）が、ＣＯＳ細胞で発現させた上述のクローン化されたＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒとは 結合しない。

クローン化された一末鎖ポリペプチドＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒに対する高親和性の変化す るサブユニットの存在する可能性を研究するために、宿主細胞をＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒ をコードするプラスミドｐＨＬＩＦＲ−６５およびヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリ ー（これらも発現ベクターの中に含まれている）からのプールとを同時にトラン スフェクトした。コトランスフェクトされた（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ） 細胞の、放射ラベルしたオンコスタチンＭとの結合能をアッセイした。

陽性ｃＤＮＡブールをさらに分け、上述の工種を繰り返し、プラスミドｐＨＬＩ ＦＲ−６５をコードするＬＩＦ−Ｒ共にコトランスフエクトされた場合に、細胞 上のオンコスタチンＭに結合する能力を与える、ＢＩＯＧと名付けられた単一の ｃＤＮＡクローンを単離した。コトランスフェクトされた細胞はまた、ｐＨＬＩ ＦＲ−６５のみでトランスフェクトされた細胞より高い親和性でＬＩＦに結合す ることが分かった。ＢＩＯＧのみでトランスフェクトされた宿主細胞は低い親和 性のオンコスタチン間結合部位を示した。ＢＩＯＧクローン化ｃＤＮＡの塩基配 列を決定し、ｇｐｉａｏとして知られるタンパク質であることが分かった。

Ｒポリペプチドのみの場合よりも高い親和性でＬＩＦに結合するということが、 今や分かった。ｇｐｉａｏと組合わされたＬＩＦ−ＲのＬＩＦに対する結合の増 加は下記の実施例１に記載されており、図１に表されている。

ＬＩＦは高い親和性でも低い親和性でもオンコスタチン間受容体に結合しないが 、オンコスタチンＭがＬＩＦ−Ｒおよびｇｐｉａｏからなる本発明の受容体に結 合することが分かった。オンコスタチンＭの結合は実施例２に記載されており、 図２に表されている。

ｇｐｉａｏとして知られているタンパク質を、胎盤組織および骨髄腫細胞系列Ｕ ２６６を含む細胞源より精製した。Ｃｅ１ｌ　６３：１１４９　（１９９０）で ヒビ（Ｈｉｂｉ）らによって報告されているように、さらなる多くの細胞型がｇ ｐｉａｏ　ｍＲＮＡを発現していることが分かった。ｇｐｉａｏは高親和性イン ターロイキン−６結合部位の形成およびＩＬ−６シグナル伝達に関与していると 報告されている（上述のヒビら）。ｇｐ１３０タンパク質全長をコードするｃＤ ＮＡのクローニングおよび発現は上述のヒビらによって報告されており、それは 、全部が本明細書中に参考として取り入れられている。ヒビらによりて報告され たｇｐｉａｏのＤＮＡ配列および予想されるアミノ酸配列はここで図６に示され ている。ｇｐ１３０アミノ酸配列はヒビらによって報告されたものと異なる。例 えば単一配列中の８番目のロインンンはバリンに置き換えられている（番号は図 ６に示しているとおりである）。アミノ酸の置換は遺伝的多形性（ｐｏｌｙｍｏ ｒｐｈｉｓｍ）（タンパク質を産する個体のアレリックな多様性）に帰すること ができ、２２番目のヌクレオチドがＧではな（Ｃであることによる。

ここで用いたように、Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒという用語は、所望されるＬＩＦ結合活性 またはシグナル伝達活性を有する天然のＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒタンパク質の変種および 短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｆｏｒｍ）を含む。同様に、ここで用いるｇｐ１ ３０という用語は、所望の生物学的活性を保持する天然のｇｐ１３０タンパク質 の変種および短縮型を含む。ｇｐ１３０の所望の生物学的活性は、オンコスタチ ンＭの結合すること：本発明の受容体にオンコスタチンＭに結合する能力を与え ること：および単一鎖Ｌ　Ｉ　Ｆ−ＲポリペプチドのみのＬ（Ｆ結合親和性と比 較して、Ｌ［Ｆに対する本発明の受容体の親和性を高めることからなる。以下に 記載したように、Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒおよびｇｐ１３０の短縮型、可溶性型、または 融合型が特に含まれる。天然の配列にアミノ酸を加えたり、置換したり、減らし たりすることにより産せられる変種については以下でもっと詳しく論する。

使用されるＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒポリペプチドの１つの例は、上述のギアリング（Ｇｅ ａｒｔｎｇ）らによって記載されたように、および以下の実施例３に記載しであ るように、ｐＨＬＩＦ−Ｒ−６５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）と名付けられたｃ ＤＮＡクローンによりコードされたものである。または、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： ５の１から９４５のアミノ酸からなる断片が用いられる。９４５番目のアミノ酸 は、クローンｐＨＬＩＦ−Ｒ−６５によりコードされるポリペプチドの、ｈＬＩ Ｆ−ＲｃＤＮＡの調製中にｍＲＮＡの内部にオリゴ（ｄ　Ｔ）をつけたため生じ たと思われるポリ式ヌクレオチド部分の前の、最後のＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒ特異的なア ミノ酸である（ギアリングら、ＥＭＢＯＪ、上述の２８４０頁、欄１参照）。

本発明の受容体で用いられるＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒポリペプチドのその他の例は、タン パク質の膜貫通領域または細胞質部分のすべてまたは一部を欠いたものからなる 。

従って、適当なＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒポリペプチドは、図５に描かれた全長Ｌ　Ｉ　Ｆ −Ｒ配列の、１番目からＸ番目のアミノ酸、または、シグナル配列が望まれない 場合は４５番目からＸ％目のアミノ酸であるものを含む。ここでＸは８３３から １０９６の整数を表す。８３３番目のアミノ酸は細胞外部分の最後のアミノ酸で ある（即ち膜貫通領域の始まりである）。■・０９６番目のアミノ酸で終わるポ リペプチドは全長タンパク質のＣ端末アミノ酸を欠いている。シグナル配列を含 むことが好ましいかどうかは、以下で論するように、融合タンパク質中でのＬ　 Ｉ　Ｆ−Ｒの位置、および受容体が組換えＤＮＡ技術により作製される場合、意 図された宿主細胞といった因子に依存している。図５のアミノ酸の番号（上述の ギアリングらより取られた）がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５の番号と異なっているこ とに注意を要する。なぜなら、図５ではシグナル配列の最初のアミノ酸が１番か ら数えられているが、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ二５では一４４番から数えられている からである。他のポリペプチドはへマトポエチン受容体ファミリーで保存された 配列に関連して選ばれる（即ち図５で示されている囲まれた配列を含むように選 ばれる）。

適当なｇｐ１３０ポリペプチドの１つの例はＢＩＯＧと名付けられたプラスミド をつくるためにベクターｐＤｃ３０３にクローン化されたｃＤＮＡによってコー ドされたものである。ｃＤＮＡをつくる時に用いたｍＲＮＡの源はヒト胎盤組織 である。Ｅ、ｃｏｌｉ株ＤＨ５（！宿主中のプラスミドＢＩＯＧは、Ａｍｅｒｉ ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、マリーランド州ａ −）クビルに１９９１年１１月１４日に寄託されており、ＡＴＣＣ受託番号６８ ８２７を与えられている。

プラスミドＢＩＯＧに含まれるｇｐ１３０　ｃＤＮＡのＤＮＡ配列およびクロー ン化されたｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１および ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に表されている。タンパク質は（Ｎ末端からＣ末端の順 番で）２２アミノ酸のシグナル配列、完全な細胞外部分（アミノ酸１−５９７） 、膜貫通領域（アミノ酸５９８から始まる）、および部分的な細胞質部分（アミ ノ酸６２１−６８６）からなる。この短縮型ｇｐ１３０ポリペプチドはシグナル 配列中の８個のアミノ酸が上で論じたようにバリンではなくロイシンとなってい る点で、ヒビらのタンパク質の相当する部分と異なっている。

適当なｇｐ１３０ポリヌクレオチドのもう１つの例はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の １から４９６のアミノ酸からなる。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１はタンパク質の細胞 外部分で見られる全てのシスティン残基を含み、完全なフィブロネクチン領域を もつ。ｇｐ１３０ポリペプチドの別の例はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のアミノ酸１ −２９８または９８−２９８を含むものである。

すべてのまたは１部の膜貫通領域、および／または細胞質領域を欠（他のｇｐ１ ３０ポリペプチドを用いることもできる。従って、適当なｇｐ１３０ポリペプチ ドは、図６の配列の１番目のからＸ番目のアミノ酸、または、シグナル配列が望 まれない場合は２３番目からＸ番目のアミノ酸であるものを含む。ここでＸは６ １９から９１７の整数を表す。膜貫通領域の最初のアミノ酸は図６の６２０番の アラニン残基である。アミノ酸９１７で終わっているポリペプチドは図６に示し た全長のタンパク質のＣ端末のアミノ酸を欠いている。図６のアミノ酸の番号付 け（上述のヒビらから取られた）がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１およびＮｏ：　２に 示されるものと異なっていることに注意を要する。これはシグナル配列の最初の アミノ酸が図６ではアミノ酸１番とされているが、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１では 一２２番となっているからである。ある種の受容体で保存されている領域に相当 するｇｐ１３０タンパク質の領域は上述のヒビらによって１１５０頁欄２右上び １１５１頁ｌ！ｌ１１で論ぜられている。これらの保存された領域を含むように 選択されたその池の短縮型ｇｐ１３０ポリペプチドが用いることもできる。

好ましいＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒおよびｇｐ１３０ブリペプチドというのは可溶性のもの である。本発明の１つの態様では、受容体は可溶性ｇｐ１３０に共有結合されて いる可溶性ＩｊＦ−Ｒからなっている。本発明の文脈で用いられるような”可溶 性Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒ’は、アミノ酸配列において天然のＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒの細胞外領 域のすべてまたは１部に実質的に類似しているポリペプチド、および、ポリペプ チドを細胞膜上に保持させるような膜貫通領域の欠如のために分泌されて発現さ れるポリペプチドを指している。用いられる可溶性ＬＩＦ−ＲポリペプチドはＬ ＩＦに結合する能力を保持しており、またＬＩＦに競合的に結合することによっ て細胞表面に結合したＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒタンパク質を介するＬＩＦシグナル伝達活 性を阻害する。

可溶性Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒが分泌されうる限り、可溶性Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒはまた、膜貫 通領域の１部または細胞質領域の１部またはその他の配列を含み得る。同様に、 ここで用いられる”可溶性ｇｐ１３０”という用語は、アミノ酸配列において天 然のｇｐ１３０の細胞外領域のすべてまたは１部に実質的に類似しており、発現 に際し分泌されるが望まれる生物学的活性は保持しているタンパク質を指してい る。可溶性ｇｐ１３０は、ポリペプチドが分泌される限り膜貫通領域、細胞質領 域、その他の配列の１部を含む。

可溶性Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒおよび可溶性ｇｐ１３０は、所望のタンパク質を発現する 天然の細胞を培養培地から例えば遠心によって分離し、培地中（上清中）の所望 のタンパク質の存在をアッセイすることによって、検出することができる（およ び、非可溶性膜結合型から区別することができる）。培養培地は以下の実施例に 記載されたものと同様のまたは同一の方法を用いてアッセイされる。培地中にＬ ＩＦ−Ｒまたはｇｐ１３０が存在するということは、タンパク質が細胞から分泌 されており、所望のタンパク質の可溶性型であるを示している。可溶性Ｌ　Ｉ　 Ｆ−Ｒおよびｇｐ１３０はこれらのタンパク質の自然に生じる形である。天然型 可溶性ネズミＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒのクローニングは上述のギアリングらにより報告さ れている。または、Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒおよびｇｐ１３０タンパク質の可溶性断片は 組換えＤＮＡ技術似よって作製するか、またはそうでなければ以下に記載されて いるようにして単離することもできる。

ＬＩＦ−Ｒおよびｇｐ１３０の可溶性型の使用は、ある種の応用法にとって有利 になる。組換え宿主細胞からのタンパク質の精製は、可溶性タンパク質が細胞か ら分泌されるので、容易になった。さらに可溶性タンパク質は一般に静脈投与に 適しており、血流中での治療上の効果（ＬＩＦおよびオンコスタチンＭへの結合 ）を発揮する。

可溶性Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒポリペプチドは、シグナル配列および完全な細胞外領域（ ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５のアミノ酸−４４から７８９）からなるもの、またはシ グナル配列を欠くが完全な細胞外領域（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋５のアミノ酸１か ら７８９）をもつものを含む。可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドは、シグナル配列 および完全な細胞外領域（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のアミノ酸−２２から５９７ ）からなるもの、またはシグナル配列を欠くが完全な細胞外領域（ＳＥＱ　ＩＤ Ｎ０：１のアミノ酸１から５９７）をもつものを含む。本発明の受容体中のこれ らの可溶性ポリペプチドの調製および使用は実施例３−５に記載されている。

池の可溶性Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒは膜貫通領域上流で短縮されているが、好ましくは、 ヘマトボエチン受容体ファミリーで保存された残基（図５中で囲って示している ）、即ちＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６のアミノ酸１１〜４７９をもつタンパク質の部 分を含む。そのような可溶性ＬＩＦ−ＲのＮ端末はアミノ酸１−１１　（天然の シグナル配列が含まれる場合−４４）のどれかであり、タンパク質はアミノ酸４ ７９から７８９のどれかから選択されたＣ端末まで伸びている。２つのそのよう な可溶性タンパク質はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６のアミノ酸−４４〜７０２．１〜 ７０２、−４４〜７７５、または１〜７５５からなる。これらのタンパク質をコ ードするコンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は、上記のクローンｐＨＬＩＦ Ｒ−６５（ＡＴＣＣ６８４９１）のヒトＬＩＦ−ＲｃＤＮＡのエンドヌクレアー ゼＡｓｐ７１８およびＸｍｎＩ、またはＡｓｐ４１８およびＢｓｐ１２８６１で 切断することを含む技術で調製される。Ａｓｐ７１８は挿入されたＬ　Ｔ　Ｆ− ＲをコードするｃＤＮＡの上流でベクターを切断する。Ｘｍｎ　Ｉは７０２番の Ａｓｐのコドンを切断しく平滑末端となる）、Ｂｓｐ１２８６１ＳＥＱ　ＴＤ　 ＮＯ：５の７７５番のＶａｌのコドンの３°末端を切断する。所望により、オリ ゴヌクレオチドをＡｓｐ７１８／Ｂｓｐ１２８６Ｔ断片の３°末端にライゲイジ ョンし、ＬＩＦ−Ｒ配列が、例えばアミノ酸７８９まで、延ばすことができる。

オリゴヌクレオチドをまた、Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒ断片の３゛末端にライゲイジョンし 、実施例５に記載されるＦｃポリペプチドの最初の２つのアミノ酸、およびＬ　 Ｉ　Ｆ−Ｒ配列の下流に残りのＦｃ配列を結合するのに有用なりｇ１１１部位が 加えることもできる。

さらなる可溶性Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒは、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６のアミノ酸１−６７ ８または１−６８０からなる。上述のギアリングら、ＥＭＢＯＪ、で表されたヒ トおよびネズＥＬＩＦ−Ｒアミノ酸配列を（間隙を２つの配列での同一性を最大 にするようにして）並べるとき、ヒトの配列のアミノ酸６８０はネズミのタンノ くり質の最後のアミノ酸と並べられ、アミノ酸６７８は、ネズミの配列の相当す るアミノ酸と同一のヒトの配列の最後のアミノ酸である。ネズミのタンノくり質 はＬＩＦに結合するので、ネズミのＬ　Ｉ　Ｆ−ＲはＬＩＦ結合に必要なタンノ くり質の部分をもつ。

可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドの追加例はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のアミノ酸− ２２〜５８２からなる。そのようなタンパク質をコードする発現ベクターは実施 例７で作製された。可溶性Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒおよびｇｐｉａｏポリペブトはまた、 フィブロネクチンタイプＩＩＩ　（ＦＮＩＩ［）領域が欠失しているようなもの が含まれる。１つからすべてのＦＮｍ領域を除くことができ、タンパク質のサイ ズを減らすのに有利に働いている。そのようなＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒおよびｇｐ１３０ タンパク質の調製は実施例８に記載されている。

可溶性ポリペプチド含む、短縮型Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒおよびｇｐｉａｏは多くの従来 の技術のいずれかによって調製することができる。組換えタンパク質の場合、所 望の断片をコードするＤＮＡ断片を発現ベクターにサブクローン化することがで きる。また、望まれるＤＮＡ配列を既知の技術を用いて化学的に合成することも できる。また、クローン化された全長ＤＮＡ配列の制限エンドヌクレアーゼ消化 によってＤＮＡ断片を作製し、アガロースゲル電気泳動によって単離することも できる。制限エンドヌクレアーゼ切断部位をもつリンカ−を用いて、所望のＤＮ Ａ断片を発現ベクターに挿入するか、または最初から存在する切断部位で断片を 消化することもできる。または、タンパク質を、例えばタンパク質分解酵素を用 いて断片化し、逆相ＨＰＬＣを用いて消化混合物から所望の短縮型ポリペプチド を単離することもできる。

よ（知られたポリメラーゼ連鎖反応法もまた、所望のタンパク質断片をコードす るＤＮＡ配列を単離するのに用いられる。この技術は以下の実施例３−５に表さ れている。

もう１つの方法では、（例えばＢａ１３１エクソヌクレアーゼを用いる）酵素処 理を用いてＤＮＡ断片から末端ヌクレオチドを除き、特定の望まれる末端をもつ 断片を得ることができる。商品化されているリンカ−のうち、Ｂａ１３１によっ てつくられた平滑末端にライゲイジョンでき制限エンドヌクレアーゼ切断部位を 有するものがある。または、所望の部位にＤＮＡ断片のＮ末端またはＣ末端を再 構成したオリゴヌクレオチドが合成することもできる。オリゴヌクレオチドは望 まれるコーディング配列の上流に制限エンドヌクレアーゼ切断部位をもち、開始 コドン（ＡＴＧ）をコーディング配列のＮ末端にもつことができる。

ｇ　ｐ　］、　３０ポリペプチドは共有結合または非共有結合でＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒ ポリペプチドに結合している。共有結合は、例えばｉｎ　ｖｉｖｏでの使用のよ うなある種の応用法において、非共有結合とは対照的に、共有結合によって一般 的に与えれる安定性の上昇という点で、好まれる。本発明の受容体の作製時には 、共有結合はクロス−リンキング試薬、ポリペプチドリンカ−１または他の適当 な技術により行うことができる。

１つのタンパク質分子をもう１つにクロス−リンクするのに有用な多くの試薬が 知られている。例えばＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、イリ ノイ州ロックフォードのへテロ２反応性リンカ−およびホモ２反応性リンカ−が この目的で利用できる。そのようなリンカ−は、アミノ酸の側鎖上の官能基と反 応する２つの官能基（例えば、エステルおよび／またはマレイミド）をもち、そ れで１つのポリペプチドをもう１つに結合する。試薬と反応条件は、クロス−リ ンキングがオンコスタチンＭおよびＬＩＦの受容体に対する結合を阻害しないよ うに選択されるべきである。

本発明で用いることのできる一つの型のポリペプチドリンカ−は、ｇｐ１３０領 域およびＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒ領域が所望の生物学的活性に必要な２次および３次構造 に適切に折りたたまれるのに十分な距離で分ける。そのリンカ−はまた、ｇｐｉ ａｏおよびＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒの細胞外領域がオンコスタチンＭおよびＬＩＦに対す る結合部位を形成するのに適切な空間配置を取るようにする。適切なポリペプチ ドリンカ−は（１）柔軟な伸びた構造を取り、（２）ｇｐｉａｏおよびＬＩＦ− Ｒの機能領域と相互作用する整った２次構造を取るような性質を示さず、（３） タン＜り質の機能領域との相互作用を促進させるような疎水性または電荷を最小 限しかもたない性質をもつものが好まれる。柔軟なタンパク質領域中の典型的な 表面アミノ酸はＧａｙＳＡｓｎおよびＳｅｒからなる。実際、Ｇｌｙ、Ａｓｎお よびＳｅｔをもつアミノ酸配列の置換はペプチドリンカ−配列の上記の基準を満 たすと思われる。ＴｈｒおよびＡｌａのような他の中性に近いアミノ酸もリンカ −配列で用いることができる。そのようなポリペプチドリンカ−の例は以下に示 す。

使用可能な別のタイプのポリペプチドリンカ−は抗体のＦｃ領域を含む。Ｆｃポ リペプチドをＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒ若しくはＩ、　Ｉ　Ｆ−Ｒ断片のＣ−末端に接着す る。別のＦｃポリペプチドをｇｐｉａｏもしくはｇｐ１３０断片のＣ−末端に接 着する。

生じた２つのポリペプチド鎖を緩衝溶液中で混合して、その際２つのＦｃポリペ プチドの間で（例、抗体分子において鏡開ジスルフィド結合が通常存在する、い わゆるヒンジ部において）ジスルフィド結合を形成させることができる。２つの ポリペプチドが宿主細胞で共発現され鏡開ジスルフィド結合が形成されるように 、宿主細胞を両方のポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換するのが望まし い。

この様にして、Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒは受容体のリンカ一部のジスルフィド結合によっ てｇｐｉａｏに共有結合により連結される。抗体のＦｃ領域を分離する操作はよ く知られており、パパインでの蛋白質分解消化を含む。または、組み換え細胞も しくは化学的に合成することにより、Ｆｃポリペプチドを産生ずることもできる 。ヒンジ部におけるジスルフィド結合形成に必要なシスティン残基を含む、抗体 ＦＣ領域のＮ−末端断片も有用である。Ｆｃポリペプチドリンカ−を含む受容体 のある例は、以下の実施例５に例示される。その受容体は図４に描かれている。

ジスルフィド結合の数および位置は図４に示されたものから変わってもよい。

本発明の受容体を調製するのに有用なＬＩＦ−Ｒ／Ｆｃおよびｇ　ｐ　１３０／ ＦＣのさらに別の例は、実施例７および８に記載される。有利なことに、宿主細 胞は２つの異なる発現ベクター（一方は可溶性ＬＩＦ−Ｒ／Ｆｃを、他方は可溶 性ｇｌ）１３０／Ｆｃをコードする）でコトランスフエクト（ｃｏｔｒａｎｓｆ ｅｃｔ）される。ヘテロダイマーが細胞内で若しくは分泌の際に形成されると考 えられる。

ジスルフィド結合により連結された２つのＬＩＦ−Ｒ／Ｆｃポリペプチドもしく は２つのｇｌ）１３０／Ｆｃポリペプチドを含むホモダイマーも、本明細書中で 開示されるトランスフェクトされた宿主細胞のいくつかによって生産される。Ｌ ＩＦ−Ｒ／ＦＣホモダイマーはＬＩＦの結合に有用であり、ｇｌ）１３０／Ｆｃ ホモダイマーはオンコスタチンＭを結合することに用途を見出だす。ホモダイマ ーは、互いに、そしてヘテロダイマーから、サイズの違いによって（例、ゲル電 気泳動によって）分離することができる。ヘテロダイマーも、逐次的な免疫アフ イニティークロマトグラフィ−（以下に記載）によって精製することができる。

別の態様では、抗体軽鎖（若しくはその断片）の上流にｇｐ１３０　（若しくは その断片）を含む第１の融合ポリペプチドが調製される。第２の融合ポリペプチ ドは、抗体重鎮（若しくは１１鎮断片、そのＮ−末端は少な（ともＣ，１領域に 渡る）の上流にＬ　Ｔ　Ｆ−Ｒを含む。ｇｐ１３０−軽鎖融合ポリペプチドとＬ ＩＦ−Ｒ−重鎮融合ポリペプチドの間にジスルフィド結合が形成され、従ってポ リペプチドを含む本発明の受容体を産生ずる。所望により、第３の融合体（Ｌ　 Ｉ　Ｆ−Ｒ−抗体軽鎖融合ポリペプチド）を調製し、抗体重鎮と融合されたｇｐ １３０を含む第４の融合体と（ジスルフィド結合により）組み合わせる。２つの ジスルフィド結合した分子を組み合わせると、２つのＦｃ領域の間にさらにジス ルフィド結合が形成される。４つの融合ポリペプチドを含む、生じた本発明の受 容体は構造上、抗体に似ており、２価的なオンコスタチンＭ／Ｌｌ結合部位を示 す。

ポリペプチドリンカ−は、あるポリペプチドを別のポリペプチドに接着させるの に用いられる慣例的な操作のいずれかによって、ｇり１３０およびＬＩＦ−Ｒに 接着することができる。上記のピアース　ケミカル　カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ 　Ｃｈｅｗｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）から入手可能な架橋剤は、利用可能なも のの一つである。そのような試薬と反応する側鎖を持つアミノ酸を、ポリペプチ ドリンカ−中、例えば、その末端に含ませることができる。

ｇｐ１３０およびＩ、　Ｉ　Ｆ−Ｒポリペプチドは、細胞ソースから独立に精製 され、それから−緒に架橋してもよい。また、本発明の受容体は組み換えＤＮＡ 技術を用いて生産してもよい。ｇｐ１３０およびＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒポリペプチドは 、形質転換された宿主細胞から独立に生産され、精製されてから、以降の共有結 合架橋に用いてもよい。本発明のある態様では、宿主細胞は、ｇｐ１３０および Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒを別々のポリペプチドとしてコードする外来ＤＮＡで形質転換／ トランスフェクトされる。該２つのポリペプチドは、２つの遺伝子の各々に対し て開始および終止コドンを有す同一の発現ベクターによりコードされてもよいし 、または組み換え細胞を２つの別々の発現ベクターでコトランスフエクトしても よい。また、別の態様では受容体は組換え細胞中で融合タンパク質として産生さ れる。

本発明のある態様では、受容体蛋白質は、ＲＩ　Ｌ　Ｒ１もしくはＲ，−Ｌ−Ｒ １ここでＲ１はｇｐ１３０もしくはｇｐ１３０断片；Ｒ２はＬＩＦ−Ｒもしくは ＬＩＦ−Ｒ断片；およびＬはポリペプチドリンカ−を表す：という化学式の組み 換え融合蛋白質である。

本発明の融合蛋白質は、ｇｐ１３０のＣ端部分を、Ｌ　Ｉ　Ｆ−ＲのＮ端部分に 融合されたリンカ−に融合させたコンストラクトを含み、Ｌ　Ｉ　Ｆ−ＲのＣ端 部分を、ｇｐ１３０のＮ端部分に融合されたリンカ−に融合させたフンストラク トも含む。

ｇｐ１３０は、ｇｐ１３０およびＬ　Ｔ　Ｆ−Ｒの所望の生物学的活性を保持す る単一の蛋白質を生産するような様式で、Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒに共有結合で架橋され る。融合蛋白質の構成要素は作られる順に挙げられている（即ち、Ｎ端のポリペ プチドが先ず挙げられ、次にリンカ−１それからＣ端のポリペプチドが挙げられ ている）。

融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、ｇｐ１３０およびＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒをコー ドする別々のＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに挿入する組み換えＤＮＡ技術を 用いて構築される。ｇｐ１３０をコードするＤＮＡ断片の３′端をＬＩＦ−Ｒを コードするＤＮＡ断片の５′端に（リンカ−を通じて）ｍＲＮＡが生物学的に活 性のある一つの融合蛋白質に翻訳されるように配列の読み枠を合わせて連結する 。

または、Ｌ　Ｉ　Ｆ−ＲをコードするＤＮＡ断片の３′端をｇｐｔ３ｏをコード するＤＮＡ断片の５′端に（リンカ−を通じて）ｍＲＮＡが生物学的に活性のあ る一つの融合蛋白質に翻訳されるように配列の読み枠を合わせて連結する。Ｎ末 端のシグナル配列をコードするＤＮＡ配列をＮ末端のポリペプチドをコードする ＤＮＡ配列に残しておいてもよく、一方、第２の（Ｃ末端側の）ＤＮＡ配列への 読み通しを妨げるような終止コドンは除去される。逆に、翻訳を終わらせるのに 要求される終止コドンは、第２のＤＮＡ配列中に残される。シグナル配列をコー ドするＤＮＡは、Ｃ末端のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列から除かれるの が望ましい。

適したポリペプチドリンカ−は、好適には２０から１００アミノ酸の長さ、そし て最も好適には３０から６０アミノ酸の長さのアミノ酸の鎖から成る。上述のよ うに、リンカ−は、グリシン、アスパラギン、セリン、スレオニン、およびアラ ニンから成るグループから選択されるアミノ酸を含むのが都合がよい。適したポ リペプチドリンカ−の例には、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）、、（ここでｎは４−１２、 好適には８）、および（Ｇｌｙ、５ｅｒＧｌｙ、５ｅｒ）２が含まれるがこれら だけに限られるわけではない。

所望のポリペプチドリンカ−をコードするＤＮＡ配列を、適当な慣例技術のいず れかを用いて、ｇｐ１３０をコードするＤＮＡ配列およびＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒをコー ドするＤＮＡ配列の間に、且つ同じ読み枠になるように、挿入することができる 。

例えば、リンカ−をコードし適当な制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む、化 学合成されたオリゴヌクレオチドを、ｇｐｉ３ｏをコードする配列およびＬＩＦ −Ｒをコードする配列の間に連結することができる。

また、化学合成されたＤＮＡ配列は、ｇｐ１３０若しくはＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒの一方 の３′末端に相補的な配列（終止コドンは含まない）、次いでリンカ−をコード する配列、さらに続いてｇｐ１３０若しくはＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒの他方の５′末端に 相補的な配列を含んでいてもよい。それからオリゴヌクレオチドによる変異導入 を用いて、ｇｐ１３０およびＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒを直接融合させたものを含むベクタ ーにリンカ−をコードする配列を挿入する。

本発明は、ｇｐ１３０、Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒおよびポリペプチドリンカ−から成る上 記の融合蛋白質をコードする分離されたＤＮＡ配列を提供し、該分離されたＤＮ Ａ配列を含む組み換え発現ベクターも提供する。“発現ベクター“は請求める蛋 白質をコードするＤＮＡを発現するのに使われ、一式の（１）遺伝子発現に調節 的な役割を持つ遺伝子因子（例えばプロモーター、オペレーター、若しくはエン ハンサー）、請求める蛋白質（この場合、本発明の受容体）をコードし、ｍＲＮ Ａに転写され蛋白質に翻訳されるＤＮＡ配列（（１）は（２）に機能的にリンク （連結）している）、並びに（３）適当な転写および翻訳開始および終結配列か ら成る転写ユニットを含む、複製可能なりＮＡコンストラクトに関する。プロモ ーターおよび他の調節因子の選択は、一般的に、意図する宿主細胞に従って変化 する。

酵母発現系で生産される蛋白質には、酵母宿主細胞により翻訳された蛋白質の細 胞外への分泌を可能にするリーダー配列が含まれるのが望ましい。または、組み 換え蛋白質がリーダー配列も輸送配列（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　５ｅｑｕｅｎｃｅ ）もなく発現される場合、それはＮ末端のメチオニン残基を含んでいてもよい。

この残基は、後に、発現された組み換え蛋白質から切断され、最終産物を提供す ることができる。

本発現ベクターにおいて、転写もしくは翻訳を制御する調節因子は、哺乳動物、 微生物、ウィルス、若しくは昆虫遺伝子に由来するのが一般的である。宿主中で 複製する能力は、複製起点により付与されるのが普通で、形質転換体の認識を容 易にする選択遺伝子を付加的に取り入れてもよい。レトロウィルスに由来するベ クターも使用することができる。

様々なりＮＡ領域は、互いに機能的に関連していれば、実行可能に（有効に）（ ｏｐｅｒａｂｌｙ）リンクしているといえる。例えば、シグナルペプチド（分泌 リーダー）をコードするＤＮＡは、ポリペプチドが宿主細胞膜を通して分泌され る前駆体として発現されるならば、ポリペプチドをコードするＤＮＡと有効にリ ンクしており：プロモーターは、コード配列の転写を制御するならば、その配列 と有効にリンクしており；または、リポソーム結合部位は、コード配列が翻訳さ れるように配置されていれば、その配列と有効にリンクしている。一般的に、“ 有効にリンクしている（ｏｐｅｒａｂｌｙ　１ｉｎｋ）″ことは、連続して接し ている、そして分泌リーダーの場合は連続して且つ読み枠があっていることを意 味する。

形質転換された宿主細胞は、組み換えＤＮＡ技術を用いて外来ＤＮＡで形質転換 された若しくはトランスフェクトされた細胞である。本発明の文脈では、外来Ｄ ＮＡには、本発明の受容体をコードする配列が含まれる。宿主細胞は、外来ＤＮ Ａをクローン化もしくは増幅するために形質転換することもできるし、または、 受容体蛋白質の生産のために発現ベクターで形質転換することもできる。受容体 発現に関して適した宿主細胞には、適当なプロモーターでの制御の下にある原核 細胞、酵母もしくは高等真核細胞が含まれる。原核生物には、グラム陽性もしく はグラム陽性微生物、例えば、大腸菌もしくは桿菌（ｂａｃ　ｉ　Ｉ　１　ｉ） が含まれる。原核発現ベクターは、一般的に、１つ若しくは複数の表現型による 選択可能なマーカー、例えば、抗生物質耐性を付与する蛋白質をコードする遺伝 子もしくは栄養要求性を補う遺伝子、および宿主内での増幅を保証する、宿主に より認識される復製起点を含む。形質転換に適した原核生物の宿主の例としては 、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｊｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉ１ｉｉｓ） 、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ＋ａｕｒｉｕｍ）並びに プソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐ ｔｏｍｙｃｅｓ）属およびスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ）属の中の様々な種が含まれるが、その他のものも選択により使ってもよい。高 等真核細胞には、哺乳動物を起源とする確立された細胞系列が含まれる。無細胞 翻訳系も、本発明のＤＮＡコンストラクトに由来するＲＮＡを用いて融合蛋白質 を生産するのに使うことができよう。

細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞の宿主に用いられる適当なりローニングお よび発現ベクターは、バラエル（Ｐｏｕｖｅｉｓ）ら、（Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅ ｃｔｏｒｓ：Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　、　 ＝、−ヨーク、１９８５）　（これに関連する開示は本明細書に参考事項として 取り入れられている）によって記載されている。

細菌利用に関する有用な発現ベクターは、よく知られたクローニングベクターｐ ＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１，７）の遺伝子因子を含む市販のプラスミドに由 来する、選択可能なマーカーおよび細菌の複製起点から構成することができる。

このような市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３　（ファルマシア　フ ァイン　ケミカル（ＰｈａｒＩＩｌａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ） 、ウプサラ、スウェーデン）およびｐＧＥＭｌ　（プロメガ　バイオチック（Ｐ ｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）、マジソン、ウィスコンシン州、ＵＳＡ）が含ま れる。これらのｐＢＲ３２２を“骨格とした（ｂａｃｋｂｏｎｅ）”断片は適当 なプロモーターおよび発現される構造配列と組み合わせられる。大腸菌は典型的 には、ある大腸菌種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２（ポリバー（Ｂｏ ｌｉｖａｒ）ら、Ｇｅｎｅ　２：９５．１９７７）の誘導体を用いて形質転換す る。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、 これにより形質転換された細胞を同定するための簡単な手段が提供される。

微生物の組み換え発現ベクターに広く用いられるプロモーターは、β−ラクタマ ーゼ（ベニンリナーゼ）とラクトースプロモーター系（チャン（Ｃｈａｎｇ）ら 、Ｎａｔｕｒｅ　２７５：６１５．１９７８；およびゴーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　２８１：５４４．１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ） プロモーター系（ゴーデルら、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ、　Ｒｅｓ、　８：４０５ ７．１９８０：およびＥＰＡ第３６，７７６号）並びにｔａｃプロモーター（マ ニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：＾Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　 kａｂｏｒａｔ ｏｒｙ、　ｐ、　４１２．１９８２）が含まれる。特に有用な細菌発現系は、λ フアージＰｔ、プロモーターおよびＣｌ８５７ｔｓ温度誘導性レプレッサーを用 いる。λＰＬプロモーターの誘導体を取り込んだ、アメリカンタイプカルチャー コレクションから入手可能なプラスミドベクターは、大腸菌株ＪＭＢ９に居るｐ ＨＵＢ２　（ＡＴＣＣ３７０９２）および大腸菌ＲＲ１に居るｐＰＬｃ２８　（ ＡＴＣＣ５３０８２）を含む。

組み換え受容体蛋白質は、好適にはパン酵母（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）な どのサツカロミセス種からの酵母宿主でも発現させてもよい。ピキア（Ｐｉｃｈ ｉａ）もしくはフリユベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）などの池の属 の酵母も使うことができる。酵母ベクターは一般的には２μｍ酵母プラスミドか らの複製起点もしくは自立複製配列（ＡＲ３）　、プロモーター、受容体融合蛋 白質をコードするＤＮＡ、ポリアデニル化および転写終結のための配列、並びに 選択遺伝子を含むであろう。望ましくは、酵母ベクターは、酵母と大腸菌の両方 の形質転換を可能にする複製起点および選択可能なマーカー、例えば大腸菌のア ンピシリン耐性遺伝子およびパン酵母ｔｒｐｌ遺伝子（トリプトファンなしで増 殖する能力を欠く酵母の変異株に対する選択マーカーを提供する）、並びに下流 の構造遺伝子の転写を誘導するための高度に発現される酵母遺伝子に由来するプ ロモーターを含むであろう。それから、酵母宿主細胞のゲノムにおけるｔ　ｒｐ ｌ欠損の存在は、トリプトファンの非存在下での増殖によって形質転換を検出す るための効果的な環境を提供する。

酵母ベクターの適したプロモーター配列には、メタロチオネイン、３−ホスホグ リセリン酸キナーゼ（ヒッツエマン（ＨｉｔｚｅＩＩｌａｎ）ら、Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５５　：２０７３．１９８０）または、エノラーゼ、グリ セルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デ カルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラ ーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン 酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなどの他 の解糖系酵素（ヘス（Ｈｅｓｓ）ら、Ｊ、＾ｄｖ、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ。

７：１４９．１９６８；およびホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、　１７＋４９００．１９７８）のプロモーターが含まれる。酵母発現に使われ る適したベクターおよびプロモーターは、Ｒ。

ヒッツェマンら、ＥＰＡ第７３，６５７号にさらに記載されている。

好適な酵母ベクターは、大腸菌における選択および復製のためのｐＢＲ３２２か らのＤＮＡ配列（Ａｍｐ’遺伝子および複製起点）、並びにグルコース抑制可能 なＡＤＨ２プロモーターおよびαファクター分泌リーダーを含む酵母ＤＮＡ配列 を用いて組み立てることができる。ＡＤＨ２プロモーターはラッセル（Ｒｕｓｓ ｅｌｌ）ら（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、　２５８：２６７４．１９８２）および バイアー（Ｂｅｉｅｒ）ら（Ｎａｔｕｒｅ　３００ニア２４．１９８２）により 記載されている。酵母αファクターリーダー（異種蛋白質を分泌するように仕向 ける）を、プロモーターと発現される構造遺伝子の間に挿入することができる。

例えば、カージャン（Ｋｕｒｊａｎ）ら、Ｃｅ１ｌ　３０：９２２．１９８２； およびビック−（Ｂｉ　ｔｔｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ　８１　：５３３０．１９８４を参照していただきたい。

リーダー配列を改変して、その３′端付近に、リーダー配列の外来遺伝子への融 合を容易にする有用な制限部位を１つ若しくは複数含ませることもできる。

適した酵母形質転換プロトコールは当業者に知られている。代表的な技術はヒン ネン（Ｈｉｎｎ６ｎ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｊ、　ＩＪ Ｓ＾７５：１９２９．（１９７ｇ）　（０，６７％　酵母窒素源ベース、０．５ ％　カサアミノ酸、２％　グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニンおよび２０μｇ ／ｍｌ　ウラシルから成る選択培地でＴｒｐ”形質転換体を選択する）により記 載されている。

ＡＤＨ２プロモーターを含むベクターにより形質転換された宿主株を、発現のた めに、８０μｇ／ｍｌ　アデニンおよび８０μｇ／ｍ＋　ウラシルを加えた、１ ％　酵母エキストラクト、２％　ペプトンおよび１％　グルコースから成る富栄 養培地中で増殖させることができる。ＡＤＨ２プロモーターの脱抑制は、培地の グルコースを使い果たすと起こる。酵母粗上清を濾過により回収し、さらに精製 するまで４°Ｃに保つ。

種々の哺乳動物もしくは昆虫細胞培養系を用いて組み換え蛋白質を発現させるこ とができる。昆虫細胞での異種蛋白質の生産のためのバキュロウィルス系は、ル ッコフ（Ｌｕｃｋｏｗ）とサマーズ（Ｓｕｍｍｅｒｓ）、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙ　６：４７　（１９８８）によるレビューがある。適した哺乳動物宿 主細胞系列の例としては、サル腎臓細胞のＣＯ５−７細胞（グルラマン（Ｇｌｕ ｚｍａｎＸＣｅｌｌ　２３：１７５．１９８１）により記載）、並びに、例えば Ｌ細胞、Ｃ１２７，３Ｔ３、チャイニーズ　ハムスター卵巣（ＣＨＯ）　、Ｈｅ ＬａおよびＢＨＫ細胞系列を含む、適当なベクターを発現する能力を持つ他の細 胞系列が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、発現される遺伝子に繋 げられたプロモーターおよびエンハンサ−１並びに他の５′若しくは３−に隣接 する非転写配列などの非転写因子、並びに、必須なリポソーム結合部位、ポリア デニル化部位、スプライス供与および受容部位、並びに転写終結配列などの５′ 若しくは３′非非翻訳列を含むこともできる。

形質転換を椎動物細胞で使われる発現ベクター中の転写および翻訳制御配列は、 ウィルスソースにより提供されることができる。例えば、広く使われているプロ モーターおよびエンハンサ−は、ポリオーマ、アデノウィルス２、シミアンウィ ルス４０　（ＳＶ４０）およびヒト　サイトメガロウィルスに由来する。ＳＶ４ ０ウィルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０オリジン、初期およ び後期プロモーター、エンハンサ−、スプライスおよびポリアデニル化部位は、 異種ＤＮＡ配列の発現１°こ要求されるその他の遺伝子因子を提供するのに用い られる。

初期および後期プロモーターは、共にＳＶ４０ウィルス複製起点も含む断片とし てウィルスから容易に得られるので、特に有用である（フィアーズ（Ｆｉｅｒｓ ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　２７３：１１３．１９７８　）、ウィルス複製起点に含ま れるＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇ１１部位までの約２５０ｂｐの配列が含まれる 限り、より小さな若しくは大きなＳＶ４０断片も利用され得る。代表的なベクタ ーは、オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）とバーブ（ＢｅｒｇＸＭｏｌ、　Ｃｅ１１． 　Ｂｉｏｌ、　３：２８０．１９８３）により開示されたようにして構築される 。

Ｃ１２７マウス乳上皮細胞における、哺乳動物受容体ｃＤＮＡの安定かつ高レベ ルな発現に有用な系は、実質的にコスマン（Ｃｏｓｍａｎ）ら（Ｍａｔ、　Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、　２３：９３５．１９８６）により記載されたようにして構築され る。

本発明の受容体を融合蛋白質として発現するのに特に望ましいベクターは、以下 の実施例で記載される。先の考察は、勿論、ｇｐ１３０の断片および／もしくは Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒの断片を含む組み換え融合蛋白質の生産に適用可能である。適し た断片は上述の通りであり、そのような断片をコードするＤＮＡ配列を上記の発 現ベクターに挿入することができる。

本発明は、該受容体をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換され た宿主細胞を、発現を促す条件下で培養することを含む、本発明の組み換え受容 体を調製するプロセスを提供する。それから受容体は、培養培地もしくは細胞抽 出物から精製される。

例えば、組み換え蛋白質を培養培地に分泌する系からの上清を、先ず、市販の蛋 白質濃縮フィルター、例えば、アミコン（Ａ■１ｃｏｎ）もしくはミリポアベリ コン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｐｅ１ｌｉｃｏｎ）限外濾過ユニットを用いて濃縮 することができる。濃縮工程に続き、濃縮液を適当な精製マトリクスに適用する ことができる。例えば、適した親和性マトリクスは、ＬＩＦもしくは０３Ｍを含 んでいてもよい。ＬＩＦ親和性マトリクスは１１組み換えヒトＬＩＦを、製造元 の勧めに従って、ブロムシアン活性化セファロース（ファルマシア社）もしくは ヒドラジド　アフィゲル（バイオラド社）に結合させることによって調製するこ とができる。適した支持体に結合した抗体を用いた逐次的免疫精製が望ましい。

Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｈに特異的な抗体に結合する蛋白質を回収し、不溶性支持体上のｇ ｐ１３０特異的な抗体と接触させる。

このようにして両方の抗体に免疫反応する蛋白質を同定し分離することができる 。

または、陰イオン交換樹脂、例えば、突き出たジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ ）基を持つマトリクスもしくは基質を使うことができる。マトリクスは、アクリ ルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースもしくはタンパク質精製に広 く使われている他のタイプであってもよい。または、陽イオン交換工程を使うこ とができる。適した陽イオン交換体には、スルホプロピルもしくはカルボキシメ チル基を含む種々の不溶性マトリクスが含まれる。スルホプロピル基が望ましい 。

疎水性の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）媒体、例えば突き 出たメチル基もしくは他の脂肪族基を持つシリカゲルを使った、１回もしくは複 数回のＲＰ−ＨＰＬＣ工程を用いて融合蛋白質構成物をさらに精製することがで きる。

先のいくつかの若しくは全ての精製工種は、様々に組み合わせて使つて、本質的 に均一な組み換え蛋白質を提供することができる。組み換え細胞培養は、それぞ れの種類の起源、例えば細胞、細胞滲出物もしくは体液において本来見出だされ るような、通常ｇｐｉ３ｏ若しくはＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒに結合し得る混入蛋白質を含 まない融合蛋白質の生産を可能にする。

前記の精製操作は、本発明の非組み換え受容体を精製するのにも使うことのでき るものである。ホモダイマー（ｇｐ１３０−リンカー−ｇｐ１３０およびＬＩＦ −Ｒ−リンカー−Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒ）を生じ得る架橋操作を用いた場合、そのよう なホモダイマーからめるヘテロダイマーを分離する精製操作が使われる。そのよ うな操作の例は、上述の逐次的免疫精製である。

細菌培養で生産される組み換え蛋白質は、細胞ベレットからの最初の抽出、１つ 若しくは複数の濃縮操作、脱塩、水性イオン交換もしくはサイズでふるい分ける クロマトグラフィ一工程によって分離されるのが普通である。最終的に、高速液 体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて最終精製工程を行ってもよい。組み 換え融合蛋白質の発現に使われる微生物細胞は、凍結−融解サイクル、音波処理 、機械的破壊もしくは細胞溶解剤の使用を含む、慣例的な方法のいずれかによっ て破壊することができる。

融合蛋白質を分泌蛋白質として発現する酵母の発酵は、精製を大いに簡略化する 。大規模発酵から得られる分泌組み換え蛋白質は、アーダル（Ｕｒｄａｌ）ら（ Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ、　２９６：１７１．１９８４）により開示された、 調製ＨＰＬＣカラム上での組み換え蛋白質の精製に２つの逐次的な逆相ＨＰＬＣ を要する方法と類似の方法によって精製することができる。

本発明はまた、生理学的に許容可能な担体もしくは希釈剤を伴う本発明の受容体 蛋白質を含む薬剤組成物も提供する。そのような担体もしくは希釈剤は、使われ る薬量および濃度において受容者に毒とならないであろう。そのような組成物は 、例えば、緩衝溶液中に受容体蛋白質を含み、該溶液にはアスコルビン酸などの 抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、蛋白質、アミノ酸、グ ルコース、ショ糖もしくはデキストリンを含む炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレー ト剤、グルタチオン並びに他の安定剤および助剤が添加されてもよい。本発明の 受容体は、静脈注射、点滴、インブラントからの持続的な放出などの、徴候に適 した様式で適当な方法のいずれかによって投与することができる。

ｇｐ１３０およびＬ　Ｉ　Ｆ−ＲのＤＮＡおよび／もしくはアミノ酸配列は、Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１およびＳＥＱ　［）ＮＯ：５に提示されたものから変化し てもよい。既知の遺伝子暗号の縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により、同じアミ ノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にかなりの変動が可能である。ＳＥＱ［ ＤＮＯ：１若しくはＳＥｏ　１０　ＮＯ：５のネイティブなりＮＡ配列にある程 度厳しい条件下（５０℃、２ＸＳＳＣ）でハイブリダイズできるＤＮＡ配列で、 生物学的に活性のあるｇｐ１３０若しくはＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒポリペプチドをコード するものも、本発明の文脈においては、それぞれ、ｇｐ１３０若しくはＬＩＦ− ＲをコードするＤＮＡ配列と考えられる。さらに、Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒもしくはｇｐ １３０をコードするヌクレオチド配列中のある変異は、最終的な蛋白質産物には 発現されないであろう。例えば、主に転写されたｍＲＮＡの２次構造ループを避 けて発現を昂進するためにヌクレオチド置換を行うこともできる（ＥＰＡ第７５ ，４４４Ａ号、本明細書中に参考文献として入れられている）。選択された宿主 により容易に翻訳されるコドン、例えば大腸菌での発現に関して大腸菌に好まれ るよ（知られたコドンを提供するために、ヌクレオチド配列の他の変更も可能で ある。

天然のｇｐ１３０若しくはＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒのアミノ酸配列を、１つ若しくは複数 のアミノ酸を置換、欠失、添加、もしくは挿入によって変えることで、ｇｐ１３ ０若しくはＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒ変異体を産生ずることができる。天然のｇｐ１３０お よびＬｆＦ−Ｒ蛋白質のめる生物学的活性を有す変異体を本発明の受容体に用い ることができる。変異蛋白質の生物学的活性を分析することのできるアッセイを 後述の実施例に記す。

天然のアミノ酸配列に対する変更は、多くの既知の技術のいずれかによって達成 できる。例えば、天然の配列の断片に連結できるような制限酵素部位が隣接した 変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の遺伝子座位に 変異を導入することができる。連結反応後、得られた再構築された配列は、所望 のアミノ酸挿入、置換、もしくは欠失を持つ類似体をコードする。

または、オリゴヌクレオチドによる部位特異的変異導入操作を用いて、要求され る置換、欠失、若しくは挿入に従って変更された特定のコドンを持つ変更遺伝子 を提供することができる。上に挙げた変更を作製する代表的な方法は、ワルダ− （Ｗａｌｄｅｒ）ら（Ｇｅｎｅ　４２：１３３．１９８６）；バウアー（Ｂａｕ ｅｒ）ら（Ｇｅｎｅ　３７：７３．１９８５）；フレイブ（Ｃｌａｉｇ）（Ｂｉ ｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　１９８５年１月、　１２−１９）　ニスミス（Ｓ＋ ｌ１ｉｔｈ）ら（Ｇｅｎｅｔｉｃ@Ｅｎｇ ｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　Ｐｌｅ ｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８１）　；米国特許第４，５１W゜ ５８４号および米国特許第４，７３７，４６２号（本明細書中に参考文献として 入れられている）によって開示されている。

Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒおよびｇｐ１３０と生物学的に等価な変異体は、例えば、生物学 的活性に必要ない種々のアミノ酸残基の置換または末端もしくは内部のアミノ酸 の欠失を作ることによって構築することができる。本発明のある態様では、変異 アミノ酸配列は、天然の配列に少なくとも８０％、好適には９０％同一である。

百分率による類似性は、例えば、ＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン ６゜０（ウィスコンンン大学遺伝子コンピューターグループ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉ ｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒ ｏｕｐ；　Ｕ’ＷＧ　ＣＧ）より入手可能）を用いて配列情報を比較することに よって決定できる。ＧＡＰプログラムは、スミスとウォーターマン（Ａｄｖ、＾ ｐｐ１．　Ｍａｔｈ、　２：４ｇ２．１９８１）により改良された、ニードルｖ 　ン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）とブンシュ（ｌｆｕｎｓｃｈ）　（Ｊ、　Ｍｏ１． 　Ｂｉｏｌ、　４８　：４４３．１９７０）のアライメント法を利用している。

簡単に述べると、ＧＡＰプログラムは、似ているとアラインされた記号（即ち、 ヌクレオチド若しくはアミノ酸）の数を、２つの配列のうち短いほうの記号の総 数で割った数として類似性を定義している。ＧＡＰプログラムに好適なデフォル トパラメーターは、（１）ヌクレオチドに関して単一要素からなる比較マトリク ス（同一であれば１の値を、同一でなければ０の値を含む）、およびシュワルツ （Ｓｃｈｗａｒｔｚ）とデイホフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）編、Ａｔ１ａｓ　ｏｆ　Ｐ ｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕ窒■B Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｔｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔ ｉｏｎ、　ｐｐ、　３５３−３５８．１９７９により記載さ黷■A グリブスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ）およびバーゲス（Ｂｕｒｇｅｓｓ）、　Ｎｕ ｃｌ、＾ｃｉｄｓ、　Ｒｅｓ、　１４：６７４５．１９８６の加重比較マトリク ス；　（２）各ギャップに関する３、０のペナルティおよび各ギャップにおける 各記号に関する０、１０の付加的なペナルティ：並びに（３）末端ギャップに関 する０のペナルティを含む。

一般的に、置換は保存的になされるべきである；即ち、最も好適なアミノ酸は、 置き換えられる残基と似た物理化学的特性をもつものである。保存的置換の例と しては、Ｉｌｅ、Ｖａ　１ＳＬｅｕ、もしくはＡｌａを互いに置換するなどの、 ある脂肪族残基を別のものに置換する、または、ＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓ ｐ：若しくはＧｉｎとＡｓｎ間などの、ある極性残基を別のものに置換すること が含まれる。池のそのような保存的置換は、例えば、同様の疎水特性を持つ領域 全体を置換することがよ（知られている。さらに、ヒト、ネズミおよび他の哺乳 動物のＬＩＦ−Ｒの間で特定のアミノ酸の相違は、Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒの本質的な生 物学的特性を変えることなくできる、さらに別の置換を示唆する。

再生の際に不要な若しくは誤った分子内ジスルフィド結合が形成されるのを防ぐ ために、システィン残基を欠失もしくは他のアミノ酸に置き換えることができる 。隣接した二塩基性アミノ酸残基を改変して、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性のある 酵母系での発現を高めることもできる。

ＥＰ第２１２．９１４Ｍは、蛋白質におけるＫＥＸ２プロテアーゼによるプロセ ッノング部位を不活化する部位特異的変異導入の利用を開示している。ＫＥＸ２ ブロテアーゼブロッセシング部位は、残基の欠失、付加もしくは置換によりＡｒ ｇ−ＡｒｇＳＡｒｇ−ＬｙｓおよびＬｙｓ−Ａｒｇの組を変えることで不活化さ れる。Ｌｙｓ−Ｌｙｓの組はＫＥＸ２切断をかなり受けにくく、Ａｒｇ−Ｌｙｓ 若しくはＬｙｓ−ＡｒｇからＬｙｓ−Ｌｙｓへの変換は、保存的で且っＫＥＸ２ 部位を不活化する好適なアプローチを表す。

親水性アミノ酸を、ｇｐ１３０およびＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒの膜貫通領域および／若し くは細胞内ドメイン中の疎水性アミノ酸と置換して、蛋白質の水溶性を高めるこ ともできる。天然の配列へのアミノ酸の付加は、クローニングもしくは発現ベク ターの構築に用いられるリンカ−に存在する読み枠の合ったコドンの翻訳による 。

ｐＨＩ　ＬＩ　Ｆ−Ｒ−６５にコードされるＬＩＦ−Ｒは、ギアリングら、上記 に記載されたように、Ｃ末端にそのようなリンカ−にコードされたアミノ酸を含 む。

本発明には、関連のある天然のパターンの糖鎖付加を受けた若しくは受けない蛋 白質も含まれる。融合蛋白質をコードするＤＮＡの大腸菌などの細菌における発 現は、糖鎖を付加されていない分子を提供する。不活化されたＮ−グリコジル化 部位を持つ機能的な変異類似体を、オリゴヌクレオチド合成および連結反応によ り、若しくは部位特異的変異導入技術によって産生ずることができる。これらの 類似蛋白質は、酵母発現系において均一な炭水化物の少ない形で、高い収率で生 産することができる。真核蛋白質のＮ−グリコジル化部位は、アミノ酸トリブレ ットＡｓｎ−Ａｌ’−Ｚ　（ＡｌはＰｒｏ以外のアミノ酸、ＺはＳｅｔもしくは Ｔｈｒ）という特徴がある。この配列において、アスパラギンは炭水化物の共有 接着のための側鎖アミノ基を提供する。そのような部位を、Ａｓｎ若しくはＺの 代わりに別のアミノ酸に置換する、Ａｓｎ若しくはＺを欠失させる、またはＡ１ とＺの間にＺでないアミノ酸を、もしくはＡｓｎＩ！：Ａ１の間にＡｓｎ以外の アミノ酸を挿入することによって除くことができる。蛋白質中のＮ−グリコジル 化部位を不活化する既知の操作には、米国特許第５．０７１，９７２号およびＥ Ｐ第２７６．８４６号に記載されているものが含まれる。

本発明の受容対蛋白質の変異体には、生物学的活性を保持した、１次的な蛋白質 の種々の構造形態も含まれる。例えば、イオン化し得るアミノ基およびカルボキ シル基の存在によって、受容体蛋白質は、酸性塩もしくは塩基性塩の形をとるこ とも、中性の形をとることもできる。個々のアミノ酸残基は、酸化もしくは還元 によっても改変できる。

１次アミノ酸構造も、グリコジル基、脂質、リン酸塩、アセチル基などの他の化 学的モ１′エティーとの共有結合若しくは凝集による複合体を形成することによ って改変できる。共有結合による誘導体は、特定の官能基をアミノ酸側鎖または Ｎ−若しくはＣ−末端に結合させることによって調製される。本発明の範囲に入 る受容体蛋白質の他の誘導体は、Ｎ−若しくはＣ−末端融合体として組み換え培 養で合成するなどして、受容体蛋白質の他の蛋白質若しくはポリペプチドとの共 有結合若しくは凝集による複合体を含む。例えば、繋げられるポリペプチドは、 蛋白質のＮ−末端部にあるシグナル（若しべはリーダー）ポリペプチド（翻訳と 同時に若しくは翻訳後に、合成の場から細胞膜もしくは細胞壁の内側もしくは外 側の機能する場への蛋白質の運搬を指示する：例えば、酵母ａ−ファクターのリ ーダー）であってもよい。ペプチドはまた、融合蛋白質の精製若しくは同定を容 易にするために付加されてもよい（例、ポリＨｉｓ）。融合蛋白質のアミノ酸配 列は、ペプチドＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌ ｙｓ　（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）に繋げられることもできる（ホップ（Ｈｏｐｐ）ら 、１３ｉ０／ＴｅｃｈｎｏＬｏｇｙ　６・１２０４．１９８１１１）。後者の配 列は抗原性が高く、特異的なモノクローナル抗体により可逆的に結合されるエピ トープを提供し、発現された組み換え蛋白質の迅速なアッセイおよび容易な精製 を可能にする。この配列はまた、ウシ粘膜エンテロキナーゼによってＡｓｐ−Ｌ ｙｓの組の直後の残基で特異的に切断される。

このペプチドを頭に付けた受容体蛋白質は、大腸菌での細胞内分解に耐性でもあ り得る。

本発明の受容体は、主としてオンコスタチン間結合試薬として有用であり、ｉｎ 　ｖｉｖｏ投与してオンコスタチンＭの生物学的活性を（情報伝達を含めて）阻 害することができる。本発明の受容体はＬＩＦ結合試薬としての用途も持つ。

オンコスタチンＭもしくはＬ　Ｉ　Ｆにより媒介される疾患は、そのような疾患 に苦しむヒトもしくは哺乳動物患者に、治療上有効量の本発明の受容体を投与す ることによって治療することができる。生物学的に活性のあるオンコスタチンＭ 若しくはＬＩＦが（直接若しくは間接的に）疾患を起こし、または悪化させてい る場合、その疾壱はオンコスタチンＭもしくはＬＩＦにより媒介されていると言 われる。可溶性受容体蛋白質はＬＩＦおよびオンコスタチンＭに競合的に結合す るよう用いることができ、それによりＬ　Ｉ　ＦおよびオンコスタチンＭの細胞 表面の受容体への結合を阻害することができる。

実施例２で論じるように、ｇｐ１３０とＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒの両方を含む本発明の状 態に比べて親和性が低いものの、ｇｐ１３０は今やオンコスタチンＭに結合する ことが見出だされている。ｇｐ１３０は、オンコスタチンＭにより媒介される病 状の治療に投与することができる（もっとも、本発明のｇｐ１３０／ＬＩＦ−Ｒ 受容体の方がそのような目的には望ましいが）。

オンコスタチンＭは、造血を刺激し、上皮細胞増殖を刺激し、プラスミン活性を 増加させ（それによって繊維素溶解が誘導される）、血管形成を阻害し、そして 上皮細胞上の主要組織適合抗原複合体の発現を抑制することが報告されている。

ＰＣＴ出願ｗｏ　９１０９０５７および欧州特許出願第４２２，１８６号を参照 していただきたい。オンコスタチンＭのこれらの若しくは池の生物学的効果が望 ましくない場合、本発明の受容体を投与してオンコスタチンＭを結合させること ができる。

オンコスタチンＭは、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１ ４７：２１７５　（１９９１）　ｌこより報告されたように、サイトカイン　イ ンターロイキン６　（ＩＬ−６）の生産を刺激すると考えられる。それ故、オン コスタチンＭは、ＩＬ−６の存在に関連した疾患を間接的に媒介する。！Ｌ−６ はＡＩＤＳに関連したカボシ肉腫の病原に関与していると報告されている（デウ ィット（ｄｅｂｉｔ）ら、Ｊ、　Ｉｎｔｅｒ、　Ｍｅｄ、　［Ｅｎｇｌａｎｄ］ ２２９：５３９［１９９１］　）。従って、本発明の受容体によるオンコスタチ ンＭの結合は、カポン肉腫の治療に有用であろう。または、それほど望ましくは ないが、ｇｐ１３０はカポシ肉腫の治療に投与することができる。

ＬＩＦにより媒介される疾患には、骨およびカルシウム代謝の疾患またはＬＩ濾 過剰発現に伴う肝細胞、ニューロン、もしくは白血球を冒す疾患以外に、アテロ ーム性動脈硬化および肥満などのリボ蛋白質代謝欠損がある。ＬＩＦにょる胚幹 細胞および造血幹細胞の調節も本受容体により操作することができる。可溶型の 受容体も、ＬＴＦによる増殖刺激に応答した白血病細胞を治療するのに用いるこ とができる。ＬｒＦはまた、癌もしくはＡＩＤＳ患者におけるカヘキシー（Ｃａ ｃｈｅｘｊａ）の誘導にも働くことができる。その受容体もしくはそれに対する 抗体は、異常なＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒの存在を特徴とする疾病を検出する診断試薬とし ても有用であるだろう。

オンコスタチンＭおよびＬＩＦは異なる蛋白質だが、ある構造特性および生物学 的特性を共有している。オンコスタチンＭおよびＬＩＦにより共有される生物学 的活性の阻害がめられている場合、本発明の受容体は特殊な生物学的活性を示す これらの蛋白質の両方に結合するという利益を提供する。これらの蛋白質の一方 にしかジスルフィド結合しない受容体は、他方の蛋白質を活性のあるままにして おき、疾患を媒介させ続けるであろう。

受容体蛋白質もしくはその誘導体は、受容体をベースとした免疫アッセイにおけ る試薬、オンコスタチンＭもしくはＬＩＦのアッセイにおける試薬、またはオン コスタチンＭもしくはＬＩＦのアフィニティー精製のための結合試薬としても利 用できる。本発明の受容体は、ポリクローナル若しくはモノクローナル抗体の産 生に関する慣例的な操作において免疫原として使うことができる。そのような抗 体は、受容体の精製のための免疫アフィニティーカラムに、または診断もしくは 研究上のアッセイの構成要素として使用することができる。誘導体は、例えば、 システィンおよびリジン残基と反応するＮ−マレイミドベンゾイルスクシニミド エステルなどの架橋剤を用いて、付加的なポリペプチドを攻撃することによって も得ることができる。受容体蛋白質は、反応性の側鎖基を通じて、ブロムシアン 活性化、ビスオキシラン活性化、カルボニルジイミダゾール活性化もしくはトシ ル活性化アガロース構造などの種々の不溶性基質に共有結合により繋げられ、ま たは吸着によりポリオレフィンの表面に（グルタルアルデヒド架橋を用いて若し くは用いないで）繋げられることができる。

以下の実施例は本発明のある態様を例示するために提供される、本発明の範囲を 制限するよう解釈されるべきではない。

黒臭珂 実施例Ｉ Ｌｌの結合を検出するためのアッセイ 本質的にホップ（Ｈｏｐｐ）等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ　Ｉｏｇｙ６　：１２０ ４　（１９８８）が述べているように、組換え体ヒトＬＩＦを酵母で発現させ、 均質になるまで精製した。精製したタンパク質を商業的に入手可能なエンザイモ ビーズ放射性ヨウ素化試薬（ＢｉｏＲａｄ）を用いて放射性標識した。この操作 において、０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，２）５０μｍ中のＬＩＦ　１０ μｇにエンザイモビーズ試薬５０μｌと、領　０５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７ ，０）２０μｌ中のヨウ化ナトリウム２ｍｃｉと２．５％β−Ｄ−グルコース１ ０μｍとを配合する。２５℃における１０分間後に、アジ化ナトリウム（５０ｍ Ｍを２０μｌ）とメタ亜硫酸水素ナトリウム（５ｍｇ／ｍｌを１０μｌ）とを加 え、２５℃においてインキュベーションを５分間続ける。この反応混合物をウシ 血清アルブミ：／　（ＢＳＡ）２．５％（ｗ／　ｖ　）と、アジ化ナトリウム０ ．２％（Ｗ／Ｖ）と、２０ｍＭへベスｐＨ７，４（結合培地）とを含むローズウ ェル　パーク　メモリアル　インスチチｘ　−ｔ・（Ｒｏｓｅｖｅｌｌ　Ｐａｒ ｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）　（ＲＰＭ　Ｉ　）　１６４０培 地中にて平衡させたセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）（登録商標）Ｇ−２５ （シグマ（Ｓｉｇｍａ））の２ｍｌｍｌ土量上ゲル濾過によって分画する。”Ｉ −Ｌ［Ｆの最終プールを結合培地中３　ｘ　１０−’Ｍの作用ストック溶液まで 希釈して、受容体結合活性の検出されうる損失なく、４℃において１力月まで貯 蔵する。比活性はルーチンに６〜８Ｘ１０”ｃｐｍ／ミリモルＬＩＦの範囲内で ある。

放射性標識ＬＩＦは特定のタンパク質又は細胞がＬＩＦと結合するかどうかを決 定するための幾つかの通常の分析方法のいずれにも使用可能である。このような アッセイの例は、細胞表面にＬＩＦ結合タンパク質を発現する、細胞への放射性 標識ＬＩＦの結合を検出するアッセイである。放射性標識ＬＩＦは細胞培養培地 中のＬＩＦ結合タンパク質（例えば、組換え体細胞によって分泌されるＬＩＦ結 合タンパク質）の存在の分析にも使用可能である。細胞抽出物（例えば、組換え 体細胞から）中のタンパク質も放射性標識ＬＩＦとの結合能に関して分析する二 とができる。

１つの分析方法では、ＬＩＦとの結合能に関して検査すべきタンパク質をコード する発現系によりて形質転換及び／又はトランスフェクションした細胞を２Ｘ１ ０５細胞／孔の密度で６孔皿（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））又は単孔チャンノ く−ド（ａｈａｍｂｅｒｅｄ）スライド（ＬａｂＴｅｋ）に接種する。皿とスラ イドの両方をヒトフィブロネクチン（ＰＢＳ中１０ｕｇ／ｍｌ）１ｍｌで３０分 間前処理した後１こ、ＰＢＳによって１回洗浄する。４８〜７２時間後に、下記 オートラジオグラフィ一方法を用いて放射性標識ＬＩＦの結合によって、Ｌ４Ｆ 結合タンノくり質の発現番二関して細胞を分析する。トランスフェクションした 細胞を結合培地（ウシ血清アルブミ：／　（ＢＳＡ）２５ｍｇ／ｍｌ、アジ化ナ トリウム２ｍｇ／ｍｌと、２０ｍＭへペスｐＨ７，２と、脱脂ドライミルク（Ｎ ＦＤＭ）５０ｍｇ／ｍ＋とを含むＲＰＭ１１６４０培地）によって１回洗浄し、 １．２５ｘｌＯ−”Ｍの１２５１　１゜ＩＦを含む、結合培地＋ＮＦＤＭ　１ｍ ｌと共に４℃において２時間インキュベートする０インキユベーシヨン後に、チ ャンノく一トスライド中の細胞を結合緩衝液＋ＮＦＤＭによって３回洗浄し、次 にＰＢＳ　（ｐＨ７，３）Ｔ、こよって２回洗浄して、非結合”Ｊ−ＬＩＦを除 去する。細胞をＰＢＳ　（ｐＨ７，３）中の１０％グルタルアルデヒド中で室温 において３０分間インキュベートすること１こよって固定し、ＰＢＳ中で２回洗 浄し、風乾させる。スライドをコダ・ツク（Ｋｏｄａｋ）　ＮＴＢ−２写真乳剤 （水中で５倍に希釈）中に浸漬し、遮光ボツクスに入れて４℃において１２時間 〜７日間暗所で暴露させる。スライドを次基こコダックＤ１９現像液（４０ｇ／ 水５００ｍ１）中で約５分間現像し、水中ですすぎ洗０シ、Ａｇｆａ　Ｇ４３３ Ｃ固定液中で固定する。スライドを個別に２５〜４０ｘ倍率の顕微鏡によって検 査し、ＬＩＦと結合する陽性細胞を明色背景６二対するオートラジオグラフィー 銀粒子の存在によって確認する。

６孔プレート中の細胞を結合４１衝液＋ＮＦＤＭによって１回洗浄し、次善二Ｐ ＢＳ　（ｐＨ７，３）によって３回洗浄して、非結合”１−ＬＩＦを除去する。

細胞を次にトリプシン処理して、それらをプレートから除去し、結合１２５１　 ＬＩＦをガンマカウンター（ｇａｍｍａ　ｃｏｕｎｔｅｒ）で計数する。

陽性の結果を得たトランスフェクトント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）プール中 の細胞をｔｊｚブールに分け、ＬＩＦ結合タンパク質を発現する単一のクローン が単離されるまで、検査プロセスを繰り返す（必要に応じてプールをさらに分割 する）。２００倍以上に過剰な非標識ＬＩＦの存在下では、Ｉ！５ｔ−ＬＩＦの 非特異的結合（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂｉｎｄｉｎｇ）が測定されること がある。対照として、Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒコード配列を有さないベクターによってト ランスフェクトした同じ宿主細胞を分析して、この宿主細胞中にバックグラウン ド内因性ＬＩＦ受容体が存在するか否か調べるべきである。

他の分析方法では、細胞から培養培地中に放出される、溶解性ＬＩＦ結合タンパ ク質を確認する。培養ブロス（ｂｒｏｔｈ）から遠心分離によって細胞を回収す る。

上澄み液（培養培地）を１０倍に濃縮し、１μｌアリコートをニトロセルロース フィルター上にスポットし、風乾させる。３％脱脂ドライミルクを含む上記結合 培地（ＢＭＮＦＤＭ）中で４℃において一晩インキユベートすることによって付 加的な結合部位をブロックする。フィルターを２００ｎＭ非標識ＬＩＦの存在下 又は不存在下のＩｎＭ”’！−ＬＩＦ含有ＢＭＮ含有８中ＮＦＤにおいて２時間 インキュベートし、次にＰＢＳ中で洗浄する（３ｘ５分間）。フィルターを室温 において写真フィルムに４８時間暴露させる。

下記方法によって実施するＬＩＦ結合分析１回の結果を図１に示す。以下に述べ るようにＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒ又はｇｐ１３０をコードするベクターによってトランス フェクトした宿主細胞をＬＩＦ結合能に関して分析した。宿主細胞はグルラマン （Ｇｌｕｔｚｍａｎ）、Ｃｅ　Ｉ　ｌ　２３　二１７５　（１９８１）が述べて いるサル腎臓細胞ライン（ＣＯ５−７と呼ばれる）であった。別々のトランスフ ェクションにおいて、Ｃ０８−７細胞を下記ベクター組合せによってトランスフ ェクトした。種々な型のトランスフェクト（ｔｒＢ１５ｆｅｃｔｅｄ）細胞（及 び非トランスフェクト対照細胞）を以下に示すようにＡ−Ｆと名付け、各トラン スフェクト細胞又は対照細胞型のＬＩＦ結合分析データを表す曲線も図１におい てＡ−Ｆと表示する。

（Ａ）Ｂ１０ｃ　（実施例３に述べるｇｐ１３０コードベクター）とｐＨＬＩＦ Ｒ−６５（実施例３に述べるＬＩＦ−Ｒコードベクター）（Ｂ）ｐＨＬｆＦＲ− ６５と対照ベクターＣＡＶ　（ＬＩＦ−Ｒ又はｇｐ１３０をコードしない対照ベ クター：ｇｐ１３０コードベクターとＬＩＦ−Ｒコードベフターの両方によって 同時にトランスフェクトしたＣ　ＯＳ　−７細胞の結果とより正確に結果を比較 するためのプラス２ド希釈に関する対照）（Ｃ）ＢＩＯＧとｐＨＬ　ＩＦＲ−６ ５；　トランスフェクト細胞を１２Ｊ　（、ＩＦとのインキュベーション前に非 放射性標識オンコスタチンＭと共にインキュベートした。

（Ｄ）ｐＨＬＩＦＲ−６５とＣＡＶ：　ｔ−ラ：ｚスフｘクトＩ［Ｉ胞を１２ｓ Ｉ−ＬＩＦとのインキュベーション前に非放射性標識オンコスタチンＭと共にイ ンキュベートした。

（Ｅ）非トランスフェクトＣＯＳ−７細胞（対照）（Ｆ）ＢＩＯＧとＣＡＶ 本質的にダウェル（Ｄｏｗｅｒ）等、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ＋、１．３２ニア５１　 （１９８４）及びパーク（Ｐａｒｋ）等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１：４ １７７　（１９８６）が述べているように、フタレート油分離方法によって分析 を実施した。簡単に説明すると、トランスフエクシヨンから２日間後に、非酵素 式細胞解離緩衝液（シグマ）中での３７℃における３０〜６０分間のインキュベ ーションによりＣ０８−７宿主細胞を１０ｃｍ組織培養プレートから分離させた 。次に、細胞を上記結合培地によって洗浄し、結合培地中に５ｘｌＯ’細胞／ｍ ｌで再懸濁させた。

細胞の５０μｍアリコートを”’Ｉ−ＬＩＦの連続希釈物と共に、総量１５０μ ｍ中で（２００倍以上に過剰な非標識ＬＩＦの存在下又は不存在下で）、室温に おいて撹拌しながら１時間インキュベートした。非標ｍＬ　Ｉ　ＦはＬＩＦの非 特異的バックグラウンド結合の算出を可能にした。各インキュベーション混合物 の２通りのアリフート（６０μｍ）を次に、ビス（Ｓ−エチルヘギンル）フタレ ート１部に対してジブチルフタレート１５部を含むフタ１ノート油混合物を含む ポリエチレン遠心管に移した。

エノペンドルフ　マイクロフコージ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ ）中での１５．　００Ｑｘｇにおける５分間の遠心によって、細胞を非結合’２ ３１−ＬＩＦがら分離した。遠心管をカプトして、非結合ｌ２Ｊ−ＬＩＦを含む 上澄み液から細胞ベレット（結合１２Ｊ−ＬＩＦを含む）を分離した。画部分に おける放射能をガンマカウンターで測定した。２種類の６０μｍアリコートから の細胞結合放射能と細胞１Ｆ結合放射能との測定値を次に計算して平均化した。

結果は生物学的データの標準スキャッチャード変換（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ　ｔｒ ａｎｓｆｏｒ艶ａｔｉ。

ｎ）として図１に示す。データは結合”１ｆ−ＬＩＦ分子数／細胞：遊離ＩＨｉ 　ｌ。

ＩＦ分子の比（ｙ軸）対結合”’Ｉ−ＬＩＦ分子数／細胞（Ｘ軸）として報告す る。解離定数（Ｋ、）を図１に、ＬＩＦ結合部位数／細胞と共に示す。飽和量の 放射性ｔｌＩｌｌ識Ｌ［Ｆが提供されたので、結合した放射性標識ＬＩＦ分子数 ／細胞はＬＩＦ結合部位数／細胞に等しいと考えられる。

図１の曲線Ａが示すように、ｇｐ１３０コ−ドベク９−　（ＢＩＯＧ）とＬＩＦ −Ｒコードベクター（ｐＨＬ　ＩＦＲ−６５）とによって同時トランスフェクト した（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）　ＣＯＳ　−７細胞は高アフィニティＬ ＩＦ結合を実証した（Ｋ−＝　９　ｘ　ｉ　Ｏ−”Ｍ）。これらと同じ同時トラ ンスフェクトＣＯ３−７細胞を１２５１−ＬＩＦとのインキュベーション前に非 放射性標識オンコスタチンＭと共にブレインキュベートすると（曲線Ｃ）、ＬＩ Ｆの結合は非常に減少した（Ｋｏ＝４゜２ｘｌＯ−’Ｍ）。従って、オンコスタ チンＭはこれらのトランスフェクト細胞の結合部位に関してＬＩＦと競合する。

単一ポリペプチド鎖ＬＩＦ−Ｒをコードするベクター（ｐＨＬＩ　ＦＲ−６５） と対照ベクターＣＡＶとによってトランスフェクトしたＣＯ３−７細胞はＬＩＦ と結合した、但しｇｐ１３０とＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒとを産生ずる細胞よりも低いアフ ィニティテあツタ（曲線Ｂ：に一＝２．４ｘｌＯ−’Ｍ）、ＣＯ３−７細胞は内 因性の高アフィニチイのサルＬＩＦ受容体を示す（曲線Ｅ：Ｋｏ＝約３Ｘ１０− ’！Ｍ）。

ｐＨＬ　Ｉ　ＦＲ−６５（単一ポリペプチド鎖Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒをコードする）に よるトランスフェクションは、サルのＬＩＦ受容体（ＫＯ＝３．３Ｘ１０−１１ Ｍ；曲線Ｂ。

部位１）と同様に、付加的な低アフィニティＬＩＦ受容体（Ｋ、＝２．４ｘｌＯ −９Ｍ、曲線Ｂ１部位２）の表示を生ずる。

ｐＨＬＩＦＲ−６５とＣＡＶとによってトランスフェクトしたＣ０８−７細胞を ”５Ｉ−ＩｊＦとのインキュベーション前に非放射性標識オンコスタチンＭと共 にブレインキュベートすると（曲線Ｄ）　、ｐＨＬＩＦＲ−６５によって発現さ れるＬ　Ｉ　Ｆ−Ｈに対するＬＩＦの結合は、オンコスタチンＭと共にブレイン キュベートしない同じトランスフェクト細胞に比べて、本質的に変化がない。従 って、オンコスタチンＭは単一ポリペプチド鎖ＬＩＦ−Ｒへの結合に関してＩｊ Ｆと競合しない。しかし、ＣＯ５−７細胞上の内因性サル高アフィニティＬ　Ｉ 　Ｆ−Ｒに対するＬＩＦ結合は競合した。

ｇｐ１３０コードベクターとＣＡＶ対照ベクターとによって同時トランスフェク トしたＣＯ３−７（曲線Ｆ）は、非トラスフェクトＣＯ３−７細胞への結合量を 越える量てはＬＩＦに結合しなかった（曲線Ｅ）。

実施例２ オンコスタチンＭの結合を検出する分析オンコスタチンＭはこのタンパク質が天 然に検出される細胞から、又はオンコスタチンＭをコードする発現ベクターによ って形質転換した細胞から精製することができる。オンコスタチンＭの供給源の １つは、ツアーリング（Ｚａｒｌｉｎｇ）等。

ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８３・９７３９　（１９８６）が述べているように、ホルボ ールエステル処理Ｕ９３７細胞である。組換え体オンコスタチンＭの精製は、リ ンスレイ（Ｌｉｎｓｌｅｙ）等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６４＋４２８２〜 ４２８９（１９８９）（この全体が参考文献としてここに含まれる）が述べてい る。

好ましくは、オンコスタチンＭを適当な発現ベクターによって形質転換した酵母 細胞中で産生する。シグナル配列（例えば、酵母α因子リーダー配列）をコード するＤＮＡ配列は、オンコスタチンＭをコードするＤＮＡ配列のＮ末端に融合し て、宿主細胞からのこのタンパク質の分泌を促進することができる。タンパク質 は、最初に製造されたときには、ホップ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６・ １２０４　（１９８８）が述べているように、Ｎ−末端確認リーダー（例えば、 Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ４−Ｌｙｓのような“フラグ配列）を含むこと もできる。このフラグ配列は非常に抗原的であり、特定のモノクローナル抗体に よって可逆的に結合されるエピトープを提供し、発現された組換え体タンパク質 の容易な精製を可能にする。この配列はまた、Ａｓｐ−Ｌｙｓベアリングの直後 の残基においてラン粘膜エンテロキナーゼによって特異的に開裂される。

処理された最終的オンコスタチン間生成物にはシグナル配列もフラグ配列も検出 されない。

オンコスタチンＭは、例えば実施例１においてＬＩＦの放射性標識するために用 いられた放射性ヨウ素化方法のような、適当な通常の方法で放射性標識すること ができる。オンコスタチンＭの放射性標識は、前記リンスレイら（ｌｔｎｓｌｅ ｙ　ｅｔ　ａｌ、）に記載されている。

得られた放射性標識オンコスタチンＭを実施例１に述べた分析方法において、オ ンコスタチンＭと結合するタンパク質及び細胞を検出するために、放射性標識Ｌ ＩＦの代わりに用いることができる。細胞への１２５Ｉ−オンコスタチンＭの結 合の分析もリンスレイ等の上記文献に述べられている。

オンコスタチン間結合分析の１回の結果を図２に示す。ｇｐ１３０又はＬＩＦ− ＲをコードするベクターによってトランスフェクトしたＣＯ３−７細胞を、オン コスタチンＭとの結合能に関して分析した。別々のトランスフェクションにおい て、ＣＯ３−７細胞を下記ベクター組合せによってトランスフェクトした。種々 な型のトランスフェクト細胞（及び非トランスフェクト対照細胞）を以下に示す ようにＡ−Ｅと名付け、各細胞型のオンコスタチン間結合分析データを表す対応 曲線も図２においてＡ−Ｅと標識する。

（Ａ）ＢＩＯＧ　（実施例３に述べるｇｐ１３０コードベクター）とｐＨＬＩＦ Ｒ−６５（実施例３に述べるＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒコードベクター）（Ｂ）ＢＩＯＧと ｐＨＬＩＦＲ−６５：　ｌ−ランスフエクト細胞を１２５■−オンコスタチンＭ とのインキュベーション前に非放射性標識ＬＩＦと共にインキュベートした。

（Ｃ）ｐＨＬＩＦＲ−６５とＣＡＶ：　（ＬＩＦ−Ｒ又はｇ＋）１３０をコード しない対照ベクター＋ｇｐ１３０コード化ベクターとＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒコード化ベ クターの両方によって同時にトランスフェクトしたＣＯ３−７細胞の結果とより 正確に結果を比較するためのプラスミド希釈に関する対照）（Ｄ）非トランスフ ェクトＣＯ５−７細胞（対照）（Ｅ）ＢＩＯＧとＣＡＶ 実施例１に述べたフタレート油分離方法によって分析を実施した（但し、ＬＩＦ の代わりにオンコスタチンＭを使用）。結果は生物学的データの標準スキャッチ ャード変換として図２に示す。データは結合１２５■−オンコスタチンＭ分子数 ／細胞：遊離＋２５１−オンコスタヂンＭ分子の比（ｙ軸）対結合１２５■−オ ンコスタチンＭ分子数／細胞（Ｘ輪）として報告する。解離定数（Ｋ、ｏ）を図 ２に、オンコスタチン間結合部位数／細胞と共に示す。飽和量の放射性標識オン コスタチンＭが提供されたので、結合した放射性標識オンコスタチン間分子数／ 細胞はオンコスタチン間結合部位数／細胞に等しいと考えられる。

図２の曲１ｍＡが示すように、ｇｐ１３０コード化ベクター（ＢＩＯＧ）とＬＩ Ｆ’　−Ｒコード化ベクター（ｐＨＬＩＦＲ−６５）とによって同時トランスフ ェクトしたＣＯ３−７細胞は高アフィニティでのオンコスタチン〜１との結合可 能性を実証した（Ｋｏ＝　２．　４　ｘ　１０−’°Ｍ）。

単一ポリペプチド鎖Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒをコードするベクター（ｐＨＬＩＦＲ−６５ ）と対照ベクターＣＡＶとによって同時トランスフェクトしたＣＯ３−７細胞（ 曲線Ｃ）は、非トランスフェクトＣＯ５−７細胞による結合量（曲線Ｄ）を越え る有意な量ではオンコスタチンＭを結合しなかった。

ｐＨＬＩＦＲ−６５とＢＩＯＧとによって同時トランスフェクトし、ｌ！ＩＩ■ −オンコスタチンＭとのインキュベーション前に非放射性標識Ｌｌと共にブレイ ンキュベートしたＣＯ３−７細胞（曲線Ｂ）は、非トランスフェクトＣＯ３−７ 細胞による結合量を越える測定可能な量ではオンコスタチンＭを結合しなかった 。

従って、ＬＩＦは組換え体細胞の結合部位に関してオンコスタチンＭと競合する 。

この分析（この結果は図２に示す）の実験条件は、低アフィニテイオンコスタチ ンＭ受容体の正確な検出のために適当ではなかった。従って、別の実験（フタレ ート油分離方法）を実施して、ＢＩＯＧのみ（ＣＡＶ対照ベクターなしに）でト ランスフェクトしたＣＯ５−７細胞によるオンコスタチン間結合を非トランスフ ェクトＣＯ３−７細胞によるオンコスタチン間結合と比較した。対照として分析 した非トランスフェクトＣＯ５−７細胞は高アフィニテイオンコスタチンＭ受容 体数が少ないことを実証した（ＫＯ＝　３．　６　ｘ　１０−”Ｍ）。ＢＩＯＧ でトランスフェクトした細胞はオンコスタチンＭの付加的な低アフィニティ結合 を示した（Ｋｏ＝７．７ｘｌＯ−’Ｍ）。このオンコスクチンＭ結合分析の結果 は生物学的データの標準スキャッチャード変換として図３に示す。データは結合 ＋２５■−オンコスタチン間分子数／細胞：遊離１２５！−オンコスタチン間分 子の比（ｙ軸）対結合＋２３７−オンコスタチンＭ’ｙ）子数／細胞（Ｘ軸）と して報告する。対照細胞に比べてｇｐｉａｏ産生細胞によるオンコスタチン間結 合の差異がより容易に目視できるように、図３のスケールは図１及び２とは異な る。

このようにオンコスタチンＭによって仲介される障害はｇｐ１３０又はそのフラ グメン］・を投与することによって治療することができる。しかし、オンコスタ チンＭに対するｇｐ１３０のみのアフィニティに比べてこのような受容体のアフ ィニティが大きいことを考慮すると、このような状態の治療にｇｐｉ３ｏとＬＩ Ｆ−Ｒの両方を含む受容体を用いることが好ましい。ｇｐ１３０は診断分析及び 研究分析にオンコスタチン間結合試薬として用いることもできる。

実施例３ Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒリンカー−ｇｐ１３０と名付けた組換え体融合タンパク質の製造 本発明の組換え体受容体タンパク質を下記方法で製造する。この受容体はポリペ プチドリンカ−を介してｇｐ１３０フラグメントに結合した、Ｎ末端のＩ、ＩＦ −Ｒフラグメントを含む。ポリペプチドリンカ−は式（Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）ｓを有 する。リンカ−配列の一部、すなわち配列Ｓｅｒ　（ＧＩｙ、５ｅｔ）、ＧＩｙ をコードするオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチド合成の通常の公知方法に よって合成する。二本鎖オリゴヌクレオチドのＤＮＡとコードアミノ酸配列は次 の通りである： ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、７ Ｓ＠ｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＧＬｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ＧＬｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｙ　Ｓ＠ｔ　Ｇｌｙ　ＧＬｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＳｅｒＢｓｐＭＸ工　Ｘｂ ａＩ ベクター構成中に以下に述べるように、リンカ−の残りの部分を加える。このオ リゴヌクレオチド及び以下で考察するオリゴヌクレオチドは、例えばバイオサー チ社（Ｂｉｏｓｅａｃｈ、　Ｉｎｃ、　）　（カリホルニア州サンラフアニル） 又はアプライド　バイオシステム（＾ｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅＩｌｌ） から入手可能であるような自動化ＤＮＡ合成装置によって合成することができる 。

リンカ−をコードするオリゴヌクレオチドを、リンカ−をコードする配列のいず れかの側に、この配列と同じ読み取りフレーム（ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ） において、ＬＩＦ−Ｒとｇｐ１３０とをコードする配列を挿入するために用いる ことができる、多重の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を好ましく含むベクター 中に、クローン化する。このようなベクターの１種はｐＢＬＵＥｓｃＲＩＰＴ　 ＳＫ（登録商標）と名付けられ、ストブタジーン　クローニング　システム（Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅ　ＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ）　（カリホルニア州う　 ホヤ）から入手可能である。このプラスミドベクターは大腸ｍ　（Ｅ、ｃｏ　ｌ 　ｉ）において複製可能であり、独特の２１制限部位を含むポリリンカーセグメ ントを含む。このプラスミドは制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａｌによって消化され 、リンカ−をコードするオリゴヌクレオチドを通常の方法を用いてこのベクター にライゲートすることができる。挿入されたオリゴヌクレオチド配列を含む組換 え体ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ分析と、ゲル電気泳動によるサイジン グ（ｓｉｚｉｎｇ）とによって確認される。Ｌ　Ｉ　Ｆ−ＲをコードするＤＮＡ 配列をｐＢＬＵＥＳＣＲ［’Ｔ　ＳＫ（登録商標）中にリンカ−コードオリゴヌ クレオチドの上流に挿入し、ｇｐ１３０コードＤＮＡ配列をリンカ−配列の下流 に挿入する。ＬＩＦ−Ｒとｇｐ１３０の可溶性フラグメントをコードするｃＤＮ Ａ分子を単離して、周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法を用いて増幅す ることができる。ＰＣＲ方法に用いるために下記オリゴヌクレオチドを合成した ： ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８（オリゴヌクレオチドＮｏ、１）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： ９（オリゴヌクレオチドＮｏ、２）３’　ＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＣＣＡＣＴＧＴ ＴＴＣＣＴＴＴＴＡＡＧＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＡＧＧＴＡＣＧ　５’ａｍ ＨＩ ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０（オリゴヌクレオチドＮｏ、３）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：１１（オリゴヌクレオチドＮｏ、４）３°　Ｃ＾＾＾ＣＧＡＧＴＴＣＣＴＣＴ ＴＴＡＡＣＴＴＡＴＣＣＧＣＣＧＧＣＧＴＡＣＧ　３’オリゴヌクレオチド１と ２をＰＣＲ反応に用いて、Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒの可溶性フラグメントを単離する。こ の反応に用いた鋳型（ｔ　ｅｍｐ　Ｉ　ａ　ｔ　ｅ）は、ギアーリング等の上記 文献に述べられたようにクローン化したヒトＬＩＦ−ＲｃＤＮＡである。ｃＤＮ ＡクローンのＤＮＡとコード化アミノ酸はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５に示す。この ヒトＬＩＦ−ＲｃＤＮＡクローンを含む、このクローン化ベクターを大腸菌宿主 細胞に含めて、１９９０年１２月１１日に名称ｐＨＬＩＦＲ−６５でアメリカン 　タイプ　カルチャー　コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（米国、メリーランド州、ロックヴイル）に寄 託した（ＡＴＣＣ受は入れ番号６８４９１）。この寄託はブタペスト条約の条件 下で実施された。５゛プライマーはオリゴヌクレオチドＮ０９１であり、ＬＩＦ −Ｒのシグナル配列の最初の８アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含み、Ｓａｌ 制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を導入する上流配列をも含む。オリゴヌクレオ チドＮ０１１はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５のヌクレオチド１７９〜２０２に相補的 である（−）鎖にアニーリングすることができる。３゛プライマーはオリゴヌク レオチドＮｏ、２であり、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５のヌクレオチド２６５１〜２ ６７７に相補的である配列を含む（すなわち、Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒの細胞外ドメイン の最後の９アミノ酸をコードするアンチ−センス（ａｎｔ　ｉ−ｓｅｎｓｅ）ヌ クレオチドを含む）。Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒコード化配列の直接下流で、オリゴヌクレ オチドＮＯ１２は（Ｇｌｙ）４ｓｃｒをコードする配列を含み、ＢａｍＨＩ制限 エンドヌクレアーゼ開裂部位をも導入する。

従って、オリゴヌクレオチドＮｏ、ｌと２を用いるＰＣＲ反応は、全シグナル配 列と全細胞外ドメインを含むが、トランスメンブラン領域と細胞外ドメインとを 欠いたＬ　Ｉ　Ｆ−ＲフラグメントをコードするＤＮＡ配列を単離し、増幅する 。

このＬＩＦ−Ｒフラグメントの３′末端に結合した（Ｇｌｙ）＋Ｓｅｒ配列は最 終構造のポリペプチドリンカ−の一部である。

適当なＰＣＲ方法を用・いることができる。このような方法の１つはサルキ（Ｓ ａｒｋｉ）等、５ｃｉｅｎｃｅ２３９：４８７　（１９８８）に述べられている 。他の方法はＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ、ウー （ｌｌｕ）等編集、アカデミツク　プレス社（＾ｃａｄｅｅｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、 　Ｉｎｃ、　）、サンジエゴ（１９８９）。

１８９〜１９６頁に述べられている。−役に、ＰＣＲ反応は、適当な緩衝化溶液 中で５°と３゛　ヌクレオチドを鋳型ＤＮＡ及び４種の１オキシヌクレオシドト リホスフエートの各々と一緒にすることを含む。この溶液を加熱しく例えば、９ ５〜１００℃）、二本鎖ＤＮＡ鋳型を変性させ、次に冷却してから、ＤＮＡポリ メラーゼ酵素を添加する。所望のＤＮＡフラグメントを増幅するために反応を多 数サイクル実施する。

適当なＩ）　ＣＲ方法の例を以下に述べる。全ての温度は摂氏度である。下記Ｐ ＣＲ試薬を１５ｍ１エツペンドルフ　マイクロフユージ管に加える：　ｌ０ＸＰ ＣＲ緩衝液（５００ｍＭ　ＫＣｌ、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８，３ （２５℃）、２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び１ｍｇ／ｍｌゼラチン）（バーキンーエ ルマーノークス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）、コネチカソト州、 ノルウオーク）１０μｍ；３ｄＮＴＰを含む２ｍＭ溶液（２ｍＭ　ｄＡＴＰ、２ ｍＭ　ｄＣＴＰ、２ｍＭ　ｄＧＴＰ及び２ｍＭ　ｄＴＴＰ）１０μｌ　；Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（パーキンーエルマーノークス）２．５単位（標準５０００ 単位／ｍｌ溶液０，５μＩ）：鋳型ＤＮＡ５０ｎｇ：オリゴヌクレオチドブライ マ−１と２の各々の２０μＭ溶液５μｌ：及び１００μｍの最終量にするための 水７４．５Ｉｚ’ｌ。次に、最終混合物にパラフィン油１００μｌを重層する。

ＰＣＲをＤＮＡサーマルサイクラ−（ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ）　（エリ コンブ（Ｅｒｉｃｏｍｐ）、カリホルニア州、サンジエゴ）を用いて、最初に鋳 型を９４°において９０秒間変性させ、５５°において７５秒間再アニーリング し、７２°において１５０秒間ｃＤＮＡを伸長させる（ｅｘｔｅｎｄ）ことによ って実施する。ＰＣＲをステップ　プログラム（９４＠、２５秒間変性、５５° 、４５秒間アニーリングニア２°、１５０秒間伸長）を用いて、さらに２０サイ クルの増幅のために実施し、次に７２°において５分間伸長させる。

サンプルをパラフィン油から取り出し、ＤＮＡをフェノールクロロホルム抽出に よって抽出し、カラムクロマトグラフィーによってＧ−５０（ベーリンガー（Ｂ ｅｈｒｉｎｇｅｒ）、マンハイム）上に展開させる。抽出ＤＮＡの１０μｌアリ コートを１％シーケム（Ｓｅａｋｅａ＋）　（登録商標）アガロース（ＦＭＣバ イオプロダクツ（阻０Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、メイン州、ロックランド）上での電 気泳動によって分離させ、臭化エチジウムによって染色して、ＤＮＡフラグメン トサイズが予想生成物に一致することを確認する。

ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡ生成物を次に５ａｌｌとＢａｍＨＩ制限酵素によって標準方 法を用いて消化させる。次に、Ｓａ　Ｉ　Ｉ／ＢａｍＨＩ制限フラグメントを例 えば１，２％ジ−プラーク（Ｓｅａｐｌａｑｕｅ）　（登録商標）低ゲル化温度 （ＬＧＴ）アガロース上でのゲル電気泳動によって分離し、所望のフラグメント を表す帯を単離する。このフラグメントを所望の融合タンパク質をコードするベ クター中に下記のように挿入する。

ヒトｇｐ１３０ｃＤＮＡを含むプラスミドベクターを大腸菌株ＤＨ５α宿主細胞 に含めて、１．９９１年１１月１４日に名称ＢＩＯＧ／ｐＤｃ３０３　（ＤＨ５ α）でアメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（米国、メリーランド州 、ロックヴイル）に寄託した（ＡＴＣＣ受は入れ番号６８８２７）。この寄託は ブタペスト条約の条件下で実施された。このクローン化ｃＤＮＡのＤＮＡとコー ド化アミノ酸配列とをＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に示す。

オリゴヌクレオチド３と４をポリメラーゼ連鎖反応方法に用いて、５ｅｔ（Ｇｌ ｙ）４Ｓｅｒをコードし、その後にＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のアミノ酸１〜５９ ７（成熟ｇｐ１３０タンパク質の全細胞外ドメイン）が続＜ＤＮＡフラグメント を増幅させ、単離させる。５′プライマー、オリゴヌクレオチドＮｏ、３はＳＥ Ｑ　ＴＤ　ＮＯ：１のヌクレオチド３１０〜３３６を含む、これらのヌクレオチ ドは成熟ｇｐ１３０タンパク質の最初の９アミノ酸をコードする。このヌクレオ チド配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のヌクレオチド３１０〜３３６に相補的であ る（−）鎖にアニーリングすることができる。オリゴヌクレオチドＮＯ６３はｇ ｐｔ３ｏ配列の直接上流（及び同じ読み取り範囲内）において５ｅｔ（Ｇｌｙ） 、Ｓｅｒ配列をもコードし、さらにＢｓｐＭＩＩ制限エンドヌクレアーゼ開裂部 位をＳｅｒ　（Ｇｌｙ）４　Ｓｅｒコード配列の５゛末端近くに位置付ける。

３°プライマー、オリゴヌクレオチドＮｏ、４は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌのヌ クレオチド２０８０〜２１００に相補的である配列を含む、すなわち、ｇｐ１３ ０細胞外ドメインの最後の７アミノ酸をコードするアンチ−センス　ヌクレオチ ドを含む。オリゴヌクレオチドＮｏ、４はｇｐ１３０配列の直後に終止コドンを 位置付け、Ｎｏｔｌ制限部位をも下流に挿入する。ＰＣＲによるｇｐ１３０フラ グメントの増幅後に、ＰＣＲ反応生成物をＢｓｑＭＩＩとＮｏｔｌによって消化 させ、所望のフラグメントを単離する。

上記１ｊＦ−Ｒ，Ｓｅｒ　（Ｇｌｙ＊５ｅｒ）ｓＧＩｙリンカ−１及びｇｐ１３ ０フードフラグメントを下記のように一本鎖ＤＮＡ配列に組み立てる。５ｅｒ（ Ｇｌｙ、５ｅｒ）ｓＧＩｙリンカ−をｐＢＬＵＥｓｃＲＩＰＴ　ＳＫ（登録商標 ）ベクターからＢａｍＨＩとＢｓｐＭＴＩによる消化によって切断する。このリ ンカ−フラグメントを次にＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒフラグメントの３′末端に結合させる （ＢａｍＨＴによって、ＧＩｙ、Ｓｅｒ配列後のその３°末端において開裂）。

この結合は通常の条件下で実施する。リンカ−フラグメントの３°末端をｇｐ１ ３０フラグメントのＢｓｐＭＩＩ開裂５°末端に結合させる。得られるＤＮＡフ ラグメントは、（５゛から３°にかけて）ＬＩＦ−Ｒのシグナル配列と細胞外ド メインとそれに結合する（ＧＩｙ４Ｓｅｒ）ｓポリペプチドリンカ−とそれに結 合するｇｐ１３０細胞外ドメインの成熟コード配列を含む本発明の受容体をコー ドする。

このＤＮＡフラグメントは適当なりローコンブ及び／又は表現ベクター中に挿入 することができる。例えば、ｐＢＬＵＥｓｃＲＩＰＴ　ＳＫ（登録商標）ベクタ ーを５ａｌＩとＮｏｔＩによって消化させ、これに結合（ｌｉｇａｔｅｄ）ＤＮ Ａ７ラグメントを挿入する。次に、大腸菌細胞をこの組換えベクターを用いて通 常の方法によって形質転換させる。

代替え方法では、Ｓｅｒ　（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｓＧｌｙリンカ−配列を含むｐＢ ＬｔＴＥｓｃＲＩＰＴ　ＳＫ（登録商標）ベクターを５ａｌｌとＢａｍ）（Ｉに よって消化させ、これに上記Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒコードフラグメントを挿入する。得 られるベクターを次にＢｓｐＭＩＩとＮｏｔ［によって消化させ、これにｇｐ１ ３０コード化フラグメントを挿入して、本発明の受容体をコードするＤＮＡ配列 を形成する。

クローン化受容体をコードするＤＮＡフラグメントを通常の方法を用いて、切断 して、適当な発現ベクター（所望の宿主細胞の種類に応じて選択される）中に挿 入することができる。組換え体表現ベクターによって形質転換した宿主細胞を培 養して、受容体タンパク質を製造する。本発明の組換え受容体融合タンパク質の 製造には、哺乳動物宿主細胞が一般に好ましい。

受容体コード化構造を５ａｌｌとＮｏｔＴ消化によって切断し、哺乳動物宿主細 胞への使用に適したベクター中に挿入することができる。適当なベクターの１種 はｐＤｃ４０６と名付けられる。このベクターの５ａｌＩ部位に挿入されたＣＤ ＮＡ分子はＨＩＶ及びアデノウィルスに由来する制御要素を用いて転写及び翻訳 する。ｐＤｃ４０６はＳＶ４０、エプスタイン−バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａ ｒｒ）ウィルス及びｐＢＲ３２２に由来する複製起点を含む。インターロイキン −１受容体ＣＤＮＡをクローン化したｐＤｃ４０６はアメリカン　タイプ　カル チャー　コレクション（米国、メリーランド州、ロツクヴイル）に、受は入れ番 号ＣＲＬ１０４７８で、寄託されている。インターロイキン−１受容体ｃＤＮＡ をこのベクターから通常の方法によって切断し、上記で製造した本発明の受容体 コードＤＮＡと置換することができる。ｐｃＤ４０６はダワー（［）□ｗｅｒ） 等、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１４２：４３１４　（１９８９）が述べているＨＡＶ−ＥＯの誘導体である。ｐ ＣＤ４０６はＨＡＶ−ＥＯとは、ＨＡＶ−ＥＯ中のアデノウィルス２の三分節系 リーダー配列中に存在するイントロンが欠失することで異なる。

受容体融合タンパク質を表現するための適当な哺乳動物細胞の例には、両方とも サル腎臓に由来するｃｖ−１細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）とＣＯ３−７細胞（Ａ ＴＣＣＣＲＬ１６５１）がある、他ノサルＷｔ臓細胞ライ：／ＣＶ−１／ＥＢＮ Ａ（ＡＴＣＣＣＲＬ１０４７８）はエプスタイン−バール　ウィルス核抗原−１ （ＥＢＮＡ−１）をコードする遺伝子とＣＭＶ制御配列を含むベクターとによる ＣＶ−１細胞ラインのトランスフェクションによって導出された。マクマハン（ ＭｃＭａｈａｎ）等、ＥＭＢＯＪ、１０：２８２１　（１９９１）を参照のこと 。ＥＢＮＡ−１遺伝子はＥＢＶ複製起点を含む、例えばＨＡＶ−ＥＯ又はｐＤＣ ４０６のような、表現ベクターのエビソーマル複製を可能にする。

本発明のこの受容体は実施例３の受容体とは、Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒポリペプチド（実 施例３の受容体では５′ポリペプチドである）がこの場合には３″ポリペプチド であることで異なる。融合タンパク質の製造に用いるために下記オリゴヌクレオ チドを合成した： ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２ ５　’　ＧＡＴＡＴＧＴＣＧＡＣＡＡＧＡＴＧＴＴＧＡＣＧＴＴＧＣＡＧＡＣＴ ＴＧＧ　３　’（オリゴヌクレオチドＮｏ、５） ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３ ３°　ＣＡＡＡＣＧＡＧＴＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣ ＴＡＧＧＴＡＣＧ　５゜（オリゴヌクレオチドＮｏ、６） ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４ ５　’　ＣＧＣＧＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＡＧＣＣＡＧＡＡＡ＾＾ＧＧ ＧＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＧ　３’（オリゴヌクレオチドＮｏ、７） ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１５ オリゴヌクレオチド５と６をポリメラーゼ連鎖反応方法に用いて、ｇｐ１３０の フラグメントを単離する。５′プライマー（オリゴヌクレオチドＮｏ、５）は、 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のヌクレオチド２４４〜２６４　（ｇｐ１３０シグナル 配列の最初の７アミノ酸をコードする配列）を含む。オリゴヌクレオチドＮ０９ ５は上流５ａｉ１部位を導入する配列をも含む。このヌクレオチド配列は５ＥＱ Ｈ）　ＮＯ：１のヌクレオチド２４４〜２６４に相補的である（−）鎖にアニー リングすることができる。３°プライマー（オリゴヌクレオチドＮｏ、６）は、 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のヌクレオチド２０８０〜２１００に相補的である配列 を含む、すなわち、ｇｐ１３０細胞外ドメインの最後の７アミノ酸をコードする アンチ−センス　ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドＮｏ、６はｃｒ７４ Ｓｅｔ配列をｇｐ１３０配列に対して（及び同調して）直ぐ３′にコードし、下 流ＢａｍＨ１部位をも挿入する。

ＰＣＲ反応を実施例３に述べたように、但しオリゴヌクレオチド５と６をｇｐ１ ３０ｃＤＮＡ鋳型上で用いて、実施する。５゛　シグナル配列と全細胞外ドメイ ンを含むが、トランスメンブラン領域と細胞質ドメインとを含まないｇｐ１３０ フラグメントをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲ反応によって単離する。Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ配列をｇｐ１３０断片の３゛末端に融合する。ＰＣＲ反応生成物を５ａｔ ＩとＢａｍＨＩとによって消化させ、所望のフラグメントを単離する。

Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒフラグメントを単離し、オリゴヌクレオチド７と８を用いるＰＣ Ｒ反応によって増幅する。５°プライマー（オリゴヌクレオチドＮｏ、７）は成 熟Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒタンパク質の最初の７アミノ酸をコードするＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：５のヌクレオチド３１１〜３３１を含む。このヌクレオチド配列はＳＥＱ　 ＩＤＮ０＝５のヌクレオチド３１１〜３３１に相補的である（−）鎖にアニーリ ングすることができる。オリゴヌクレオチドＮＯ３７はＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒ配列の５ ゛末端に融合したＧｌｙ＜Ｓｅｔをもコードし、上流ＢｓｐＭ１１部位を挿入す る。３゜プライマー（オリゴヌクレオチドＮｏ、８）はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５ のヌクレオチド２６５１〜２６７７　（Ｌｌ−Ｒ細胞外ドメインの最後の９アミ ノ酸をコードする）に相補的である。オリゴヌクレオチドＮｏ、８はまたＬ　Ｉ 　Ｆ−Ｒ配列の３゛末端に終止コドンを加え、ＮｏｔＩ部位を下流に挿入する。

ＰＣＲ反応生成物をＢｓｐＭＩＩとＮｏｔＩとによって消化させ、所望のフラグ メントを単離する。

上記で製造したｇｐ１３０フラグメントのＢａｍＨＩ部位を実施例３で述べたリ ンカ−フラグメントの５゛末端のＢａｍＨＩ部位に結合させることによって、所 望の受容体タンパク質をコードするＤＮＡ配列を製造する。同様に、リンカ−を コードするフラグメントのＣ末端を上記で製造したＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒコード化フラ グメントの相補的部位に対してＢｓｐＭ１１部位に結合させる。得られるＤＮＡ フラグメントを実施例３に述べた方法を用いて、表現ベクターにクローン化する 。

単離ＤＮＡフラグメントによってコードされる受容体は（Ｎ末端からＣ末端まで の）シグナル配列と、ＬＩＦ−Ｒの細胞外ドメインの成熟コード化配列に結合す る（Ｇｌ　ｙ４ｓｅ　ｒ）ｓポリペプチドリンカ−に結合したｇｐ１３０の細胞 外ドメインとを含む。

実施例５ Ｆｃポリペプチドリンカ−によりｇｐ−１３０に結合したＬＩＦ−Ｒを含むレセ プター融合蛋白 以下の方法に従って製造したレセプターを図４に表した。該レセプター融合蛋白 の製造に使用するために以下のオリゴヌクレオチド類を合成した：ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：１６ ３−　ＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＣＣＡＣＴＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴ＾＾ＧＡＣＴＣＧ ＧＧＴＣＴＡＧＡＴＡＣＧ　５−　（オリゴヌクレオチドｎｏ、　９） ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７ ３−　ＣＡＡＡＣＧＡＧＴＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＣＴＴＣＴＣＧＧＧＴＣＴＡＧ ＡＴＡＣＧ　５−　（オリゴヌクレオチドｎｏ、　１０）ＬＩＦ−１？をコード するＤＮＡ配列を単離し、オリゴヌクレオチド１及び９を用いたＰＣＩ？反応に より増幅させる。オリゴヌクレオチドｎｏ、１（５−プライマー）は上流に５ａ ｌＩ部位を挿入するもので、実施例３に述べられている。３′プライマーはＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：５のヌクレオチド２６５１から２６７７に相補的な配列を含み 、すなわちＬＩＦ−Ｈの細胞外ドメインの最後の９アミノ酸をコードするアンチ センスヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドｎｏ、９である。オリゴヌクレオ チドｎｏ、９は同様に下流にＢｇＬＩＩ部位を挿入する。該ＰＣＲ反応生成物を ５ａｌＩ及びＢｇｌＩＩで切断し、ＬＩＦ−Ｒをコードする望ましいＤＮＡ配列 を通常の方法を用いたゲル電気泳動により単離する。ＬＩＦ−Ｒ配列中に内部Ｂ ｇｌＩＩ部位が存在するために、ＢｇｌＩＩ切断は部分的切断をもたらす条件下 で行う必要がある。

ｇｐ　１３０をコードするＤＮＡ断片を単離し、オリゴヌクレオチド５及び１０ を用いたＰＣＲ反応により増幅させる。５−プライマー（オリゴヌクレオチドｎ ｏ、５）は上流に５ａｌＩ部位を挿入するもので、先の実施例４に述べられてい る。３′プライマーはＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：１のヌクレオチド２０８０から２１ ００に相補的な配列を含み、すなわちｇｐ　１３０の細胞外ドメインの最後の７ アミノ酸をコードするアンチセンスヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドｎｏ 、　１０である。オリゴヌクレオチドｎｏ、　１０は同様に下流にＢｇｌＩＩ部 位を挿入する。該ＰＣＲ反応生成物を５ａｌＩ及びＢｇｌＩＩで切断し、ｇｐ　 １３０をコードする望ましいＤＮＡ断片を通常の方法を用いたゲル電気泳動によ り単離する。

ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に由来する一末鎖ポリペプチドをコードするｃＤＮ Ａを上記のｐＢＬＵＥｓｃＲＩＰＴ　ＳＫ　（登録商Ｉりベクター中にクローニ ングして、ｈＩｇＧＩＦｃと呼ばれる組み換えベクターを製造した。唯一のＢｇ ｌ、ＩＩ部位が、挿入されたＦｃコード配列の５−末端の近くに位置する。５ｐ ｅＩ部位は停止コドンのすぐ下流にある。クローニングされたＦｃ　ｃＤＮＡの 開＾配列及びコードされているアミノ酸配列をＳＥＱ　ＩＤＮ０：３及びＳＥＱ 　ＩＤ　ＮＯ＋４４ｍ示す。

該ｃＤＮ＾によりコードされるＦｃポリペプチドはＮ末端ヒンジ領域から天然の Ｃ末端までに渡り、すなわち本質的に抗体Ｆｃ領域の全長である。Ｆｃ断片類、 例えばＣ末端が切り取られたものも、使用できる。該断片は複数のシスティン残 基（少な（ともヒンジ反応に係るシスティン残基）を含む必要がある。Ｆｃポリ ペプチドが由来する抗体は、それから製造される融合蛋白で治療される患者と同 じ種のものであることが好ましい。

プラスミドｈＩｇＧＩＦｃをＢｇｌＩＩ及び５ａｌＩで切断し、上記のように製 造されたＢｇｌＩＩ／５ａｌＩ　ＬＩＦ−Ｒ断片を通常の手法により該ベクター 中に結合させる。Ｆｃコード配列はＬＩＦ−Ｒ配列の下流であってＬＩＦ−Ｒ配 列と同じ読み取り枠内に位置する。別の反応でｇｐ　１３０の上記の５ａｌＩ／ ＢｇｌＩＩ断片を同様に同じベクター中に挿入する。望ましいＤＩＪ＾インサー トを含むプラスミドベクターを、通常の手法を用いた制限酵素切断分析により同 定する。

ＬＩＦ−Ｒ−Ｆｃ融合ポリペプチドをコードするクローニングされたＤＮＡセグ メントは、５ａｉｌ及びＮｏｔＩで切断することによりｐＢＬＵＥｓｃＲＩＰＴ 　ＳＫ　（登録商標）ベクターから切り出してもよい。同様に、ｇｐ　１３０− Ｆｃ融合ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、５ａｌＩ／Ｎｏｔｌで 切断することにより切り出してもよい。切り出された各ＤＮＡセグメントを、望 ましい宿主細胞のタイプに応じて適当な発現ベクター中に挿入する。適当な発現 ベクターのひとつに、実施例３に述べたように哺乳動物宿主細胞中に形質転換す ることができるプラスミドｐＤｃ４０６がある。

本発明の一態様では、ＬＩＦ−Ｒ−Ｆｃ融合体をコードする発現ベクター及びｇ ｐ　１３０−Ｆｃ融合体をコードする第二の発現ベクターを望ましい宿主細胞中 に共トランスフェクトさせる。それにより二個の別個の組み換えポリペプチドが 宿主細胞中に作られる。第一のポリペプチドはｇｐ　１３０断片のＣ末端に枠内 融合されたＦｃポリペプチドを含む。第二のポリペプチドはしＩＦ−Ｒ断片のＣ 末端に枠内融合されたＦｃポリペプチドを含む。二個のＦｃ領域間に形成される ジスルフィド結合は二個の別個の融合ポリペプチドを本発明のレセプター蛋白中 に共有結合させる。

或いは、ＬＩＦ−Ｒ−Ｆｃポリペプチド及びｇｐ　１３０−Ｆｃポリペプチドを （同じ宿主細胞中に共トランスフェクトさせるのとは対照的に）宿主細胞中に別 々に形質転換してもよい。これらの二個のポリペプチドを宿主細胞から精製した 後に適当なバッファー溶液中で合わせて、それにより銀白ジスルフィド結合が二 個のＦｃ領域間に形成される。

該レセプター蛋白はいくつかある通常の蛋白精製法のいずれを用いて精製しても よい。抗体Ｆｃ領域はプロティンＡ及びプロティンＧに結合するため、不溶性担 体物質に結合させたプロティンＡ又はプロティンＧを用いたアフィニティークロ マトグラフィーを精製工程に用いてもよい。ひとつの方法として、該レセプター を含む１リツトルの培養上清を固体相プロティンＧカラムに通し、その後カラム をリン酸緩衛化食塩水（ＰＢＳ）でよく洗浄する。吸着したＦｃ含有融合蛋白を ５軸誠グリシンバツフアー、ｐＨ３で溶出し、’ｌ　Ｍ　Ｔｒｉｓバッファー、 ｐＨ９でｐＨ７にする。

さらに、免疫アフィニティーカラム、例えばＬＩＦ又は０３Ｍが結合したアフィ ニティーカラムを含む精製を行ってもよい。

実施例６ レセプターに対するモノクローナル抗体の製造精製された本発明のレセプター蛋 白、又は高濃度の該レセプターを発現するトランスフェクトされたＣＯ８細胞の 調製品を、例えば米国特許第４．４１１．９９３号に開示されている通常の手法 を用いて、該レセプターに対するモノクローナル抗体を生成するのに使用する。

マウスを免疫するために、レセプター免疫原をフロイント完全アジュバント中に 乳化し、ｔｏ−ｔｏｏμｇの範囲の量でＢａ１ｂ／ｃマウスに皮下注射する。１ ０ないし１２日後に、免疫されている動物をフロイント不完全アジュノくシト中 に乳化した免疫原をさらに追加投与し、その後工ないし２週間毎の免疫スケジュ ールで定期的に追加投与する。血清サンプルは眼窩後採血又は足先端切除により 定期的に採取し、トントープロットアッセイ（抗体サンドイッチ）又はＥＬ■Ｓ ＾（酵素結合型免疫吸着剤アッセイ）によって試験する。他のアッセイ方法でも よい。適当な抗体力価が検出された後、陽性の動物に食塩水に溶解した抗原を静 注する。３ないし４日後、動物を屠殺して牌臓細胞を採収し、ネズミ骨髄腫細胞 株ＮＳＩに融合させる。この方法により生成されたハイブリドーマ細胞株を、非 融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び牌臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するた めにＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）中でマ ルチ微量滴定プレート中に接種する。

このように生成されたハイブリドーマのクローンを、例えば、エングバルら（Ｅ ｎｇｖａｌｌ　ｅｔａｌ、　）、　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅａ＋、　８巻、８７１頁 、１９７１年及び米国特許第４．７０４．　（１０４号に開示されている手法の 適用により、該レセプター蛋白との反応性についてＥＬＩＳ＾によりスクリーニ ングすることができる。陽性のクローンをその後同系Ｂａ１ｂ／ｃマウスの腹膜 腔内に注射し、高濃度（１ｍｇ／ｍｌより高い濃度）の抗レセプター・モノクロ ーナル抗体を含む腹水を作らせる。できたモノクローナル抗体は硫酸アンモニウ ム沈澱、並びにそれに続くゲル排除クロマトグラフィー及び／又はスタフィロコ ッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）のプロテ ィンＡに抗体を結合させることに基づくアフィニティークロマトグラフィーによ り精製することができる。

実施例７ ヘテロダイマー型レセプター 抗体のＦｃ領域に由来するポリペプチドに融合したヒトＬＩＦ−Ｒ細胞外ドメイ ンの断片をコードする発現ベクターを以下のように作成した。Ｆｃポリペプチド に融合したヒトｇｐ　１３０細胞外ドメインの断片をコードする第二の発現ベク ターも作成した。

実施例３に述べたように発現ベクターｐＤｃ３０３中にヒトＬＩＰ−ＲｃＤＮＡ を含むプラスミドｐＨＬＩＦ−Ｒ−６５（＾ＴＣＣ６８４９１）を制限酵素Ａｓ ｐ７Ｌｇ及びＸｍｎＩで切断した。＾５ｐ７Ｌ８は該ベクターをＬＩＦ−ＲｃＤ Ｎ＾ＤＮＡ−トの上流で開裂させる。ＸｍｎＩは縁膜領域の上流でＳＥＱ　ｒＤ 　ＮＯ：５のアミノ酸Ｎｏ、７０２（＾ｓｐ）に対するコドン中で開裂させて平 滑末端化させる。望ましい＾５ｐ７１８／ＸｍｎＩ断片（長さが約　２，４４４ 　ｂｐ）をアガロースゲル電気泳動により分離し、エルチップ（Ｅｌｕｔｉｐ） カラムを用いた通常の方法により精製した。

ｐＢＬＵＥｓｃＲＩＰＴ　ＳＫ　（登録商標）ベクター中にヒトＩｇＧ１抗体の Ｆｃ領域に由来する一末鎖ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む、ｈＩｇＧ ＩＦｃと呼ばれる組み換えベクターは実施例５に述べた。クローニングされたＦ ｃ　ｃＤＮＡのＤＮＡ配列及びコードされるアミノ酸配列をＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ ・３及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４に示す。いくつかの制限部位を含むポリリンカ ー領域は該Ｆｃ　ｃＤＮＡに直ぐ上流に位置する。

プラスミドｈＩｇＧＩＦｃを、該Ｆｃ配列の上流のポリリンカー中で開裂させる ＾５ｐ７１８及び５ｔｕＩで切断した。上記のように製造した＾５ｐ７１８／Ｘ ｍｎＩ　ＬＩＦ−Ｒ断片を開裂したｈＩｇＧＩＦｃベクター中に通常の手法によ り結合させた。３ｔｕＩ及びＸｍｎＩは両方とも平滑末端を作り、それらの末端 はライゲートしてつながり合う。できた組み換えベクターにおいて、Ｆｃコード 配列はＬＩＦ−Ｒ配列の下流であってＬＩＦ−Ｒ配列と同じ読み取り枠内に位置 する。コードされたＬＩＦ−Ｒ／Ｆｃ融合蛋白はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５（ＬＩ Ｆ−Ｒ）の−４４から７０２のアミノ酸を含み、これらのアミノ酸にプラスミド ｈＩｇＧＩＦｃのポリリンカーセグメントによりフードされるペプチドリンカ− を構成する６アミノ酸が続き、さらにそれにＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３（Ｆｃ）の １−２３２アミノ酸が続く。イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）細胞をライゲイジョ ン（ｌｉｇａｔｉｏｎ）混合物で形質転換させ、標準的方法によりそれからプラ スミドを単離した。望ましいＤＮ＾インサートを含むプラスミドベクターを制限 酵素切断分析法により同定した。

ＬＩＦ−Ｒ／Ｆｃ融合ポリペプチドをコードするクローニングされたＤＮＡセグ メントを組み換えベクターから＾５ｐ７１８及びＮｏｔＩでの切断により切り出 した。ＮｏｔＩ酵素は該Ｆｃ　ｃＤＮ＾ＤＮＡ−トの直ぐ下流のポリリンカー領 域で該ベクターを開裂させる。切り出されたＤＮＡセグメント（３，２ｋｂ）を 望ましい宿主細胞のタイプに応じて適当な発現ベクター中に挿入する。適当な発 現ベクターのひとつに、ＰＣＴ出願Ｗ０９０１０５１８３に述べられている哺乳 動物発現ベクターであるｐｃＡＶ／ＮＯＴがある。

ｐＣＡＶ／ＮＯＴを、両方ともマルチクローニング部位を開裂させる、Ａｓｐ７ １８及びＮｏｔＩにより開裂させた。ＬＩＦ−Ｒ／Ｆｃをコードする上記のよう に製造された＾ｓｐ７１ｇ／ＮｏｔＩＤＮ＾断片を該ベクター中に結合させた。

可溶性ｇｌ）１３０／Ｆｃ融合蛋白をコードする発現ベクターを以下のように作 成した。

ヒトｇｐ１３０　ｃＤＮＡ　（実施例３に記載）を含む組み換えベクターＢＩＯ Ｇ／ｐＤｃ３０３　（ＡＴＣＣＧ３８２７）をＥｃｏＲｌで切断し、できた５゛ 突出をＴ４　ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化した。ＥｃｏＲｌに対する 認識部位はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１のヌクレオチド２０５６−２０６１を含む。

ＥｃｏＲｌで切断したベクターをそのＬ　ｇｌ）１３０　ｃＤＮ＾ＤＮＡ−トの 上流で該ベクターを開裂させるＸｈｏＩで開裂させた。

Ｆｃポリペプチドをコードする上記のｃＤＮＡを含むプラスミドｈＩｇＧＩＦｃ を、挿入されたＦｃ　ｃＤＮＡの上流及び下流でそれぞれ開裂させる５ｔｕｌ（ 平滑末端化酵素）及びＮｏｔｌで切断した。上記のように単離された（ＥｃｏＲ ｌ）／ＸｈｏＩ　ｇｐ１３０断片を、このＦｃを含む断片及びＸｈｏＩ／Ｎｏｔ ｌで切断したベクターＳＦ　ＣＡＶ／ＮＯＴに結合させた。哺乳動物発現ベクタ ーＳＦ　ＣＡＶ／ＮＯＴはＮｏｔＩ部位を含むことを除いて本質的１：ｓＦ　Ｃ ＡＶ（ＡＴＣＣ６８９２２）ト同等テある。ＳＦ　ＣＡＶ／ＮＯＴは、バクテリ アにおいて機能する“隠れた′プロモーターを含むアデノウィルス−２三分割リ ーダー（ＴＰＬ）のセグメントが削除されていることを除けば、ＰＣＴ出願ｗ０ ９０１０５１８３に記載されているｐｃＡＶ／ＮＯＴとも本質的に同等である。

該”隠れた”プロモーターからの蛋白発現は、バクテリア細胞において望ましい 組み換えプラスミドを製造及び単離するには不利であろう。

Ｅ、　ｃａｌ　ｉ細胞をライゲーション混合物で形質転換し、通常の方法により それからプラスミドを単離して、望ましい組み換えプラスミドを制限分析によっ て同定した。望ましい組み換えベクターによってコードされるｇｐ１３０／Ｆｃ 融合蛋白は（Ｎ末端からＣ末端へ）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２（ｇｐ１３０）（ ７）７　ミ／酸−２２かう５８２を含み、これらのアミノ酸にプラスミドｈＩｇ ＧＩＦｃのポリリンカーセグメントによりコードされるペプチドリンカ−を構成 する７アミノ酸が続き、さらにそれにＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４（Ｆｃ）の１−２ ３２アミノ酸が続く。

ＣＯ５−７細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５１）を、上記のように製造したＬＩＦ −Ｒ／Ｆｃをコードする組み換え発現ベクター或いはｇｌ）１３０／Ｆｃをコー ドする発現ベクターのいずれか、又は両方の発現ベクターでトランスフェクトし た。該細胞を培養して可溶性融合蛋白を発現させた。発現された蛋白を、培養液 上清をプロティンＧセファロースビーズ（ファルマシアより入手）と共に４℃で 一晩インキユベートした後、遠心によってビーズをベレット化させることにより 回収した。ビーズに結合させた蛋白による＋ｔｑ〜ラベル化ヒト・オンコスタチ ンＭ及びｌ　２６Ｉ−ラベル化ヒトＬＩＦの結合を分析した。

結合アフィニティーを標準スカチャード分析変法により決定した。結合アッセイ 方法は、蛋白が可溶性であって、トランスフェクトした細胞の表面にあるのでは なくプロティンＧセファロースビーズに結合していることを除けば、モスレイら （Ｍｏｓｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、　、Ｃｅ１ｌ　５９巻、３３５頁、１９８９年） に述べられているものと同様であった。簡単に言うと、９６穴の微量滴定プレー ト中で”Ｉ−ＬＩＦ又は＋　２３Ｉ−オンコスタチンＭのｌＯ段階のｌ：２希釈 系列それぞれを、２．５％ウシ血清アルブミン、０゜２％（Ｖ／Ｖ）　アジ化ナ トリウム及び２０１１１Ｍ　Ｈｅｐｅｓ、　ｐＨ７，４，を含むＲＰＭＩ　１６ ４０中に再懸濁させた（ビーズに結合した）発現蛋白を含むサンプルと共に、４ ℃で２時間、攪拌しながらインキュベートした。コールドの標準競合ウェルも二 個ずつインキュベートした。子ウシ血清の入った遠心管を、ダウアーら（Ｄｏｗ ｅｒ　ｅｔ　ａｔ、　、　Ｊ、　Ｉｍａｕｎｏｌ、　１３２巻、７５１頁、　１ ９８４年）及びパークら（Ｐａｒｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　８ｉｏ１．　Ｃｈ ｅＩｌ、、　２６１巻、４１７７頁、　１９８６年）、並びに上記の実施例１に 述べられている分離方法におけるフタル酸オイル混合液の入った管の代わりに使 用した。各インキュベージジン混合液の一定量を該遠心管に移した。遠心後、遠 心管を切断して、放射能活性を測定し標準スカチャ・−ド分析で処理した。

図７は、ｇｐ１３０／Ｆｃベクター単独でトランスフェクトした細胞により作ら れたｇｌ：１１３０／ＦｃホモダイマーによるＩ　２５■−オンコスタチン間結 合のスカチャード分析（左上）及び、共トランスフェクトした細胞により発現さ れた蛋白による＋２５Ｉ−オンコスタチンＭの結合スカチャード分析（左下）を 表す。ＬＩＦ−Ｒ／Ｆｃベクター単独でトランスフェクトした細胞により作られ たＬＩＦ−Ｒ／Ｆｃホモダイマーによる１　１３１−ＬＩＦ結合のスカチャード 分析（右上）及び、共トランスフェクトした細胞により発現された蛋白によるｌ 　”５Ｉ−ＬＩＦ結合のスカチャード分析（右下）を同様に図７に表す。ｇ９Ｌ ３０／Ｆｃホモダイマーに比べて共トランスフェクトした細胞から回収された蛋 白による方がオンコスタチンＭの結合が高アフィニティー側にシフトしているの が図７から明らかである。同様に、図７のデータからＬＩＦ−Ｒ／Ｆｃホモダイ マーに比べて共トランスフェクトした細胞から回収された蛋白による方がＬＩＦ の結合が高アフィニティー側にシフトしていることが示されている。結合の高ア フィニティー側へのノットは、ＬＩＦ−Ｒ／Ｆｃ及びｇｌ１１３０／Ｆｃを含む ヘテロダイマーの存在を示しており、さらにＬＩＦ−Ｒ及びｇｐ１３０部分がオ ンコスタチンＭ及びＬＩＦの結合において共同作用、即ち相互作用していること を示して°いる。対照からＬＩＦ−ＲホモダイマーによるオンコスタチンＭの結 合が無いこと、及びｇｐ１３０ホモダイマーによるＬＴＦ結合が無いことが示さ れている。

実施例８ ＦＮＩＩＩ　ドメインを欠＜　ＬＩＦ−Ｒ及びｇｐ１３０ポリペプチドを含むレ セプターフィブロネクチンＨＩ型（ＦＮＩＩＩ）　ドメインを欠く可溶性ＬＩＦ −Ｒ及びｇｐ１３０１白をコードするＤＮＡ配列を単離し、Ｆｃコード配列に融 合させた。ＦＮＩＩＩ　ドメインの欠失には、ＬＩＦ−Ｒ／ＦＣ及びｇｌ）１３ ０／Ｆｃ融合蛋白のサイズを減少させるという利点がある。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：６のＩＪＦ−Ｒ蛋白は細胞外ドメインにＩＩＩ型フィブロネクチン様のモジュ ールを３回反復して含んでいる。ＦＮＩｉＩモジュールを含む３ドメインはＳＥ Ｑ　ＩＤＮ０：６の、それぞれ、アミノ酸４８７　（Ｔｈｒ）から５８４（＾ｓ ｎ）、５８５　（Ａｓｐ）から６７９　（Ａｌａ）、及び６８０　（Ｐｒｏ）か ら７８９　（Ｓｅｔ）を含む。ｇｐ１３０も同様に、ＳＥＱ　ＩＤＮ０：２の、 それぞれ、アミノ酸３００　（Ｔｙｒ）から３９９　（Ｐｈｅ）、４００　（Ｇ ｉｎ）から４９６（Ｐｒｏ）、及び４９７　（Ｐｒｏ）から５９７　（Ｇｌｕ） を含む３個のＦＮＩＩＩ　ドメインを含む。１個ないし３１１１全てのＦＮＩＩ Ｉ　ドメインをｇｐ１３０又はＬＩＦ−Ｒから除去して該蛋白のサイズを減少さ せてもよい。

ＬＩＦ−Ｒ／Ｆｃをコードする実施例７で製造した発現ベクターを制限酵素Ｅｃ ｏ　０１０９Ｉ（Ｄｒａ　ＩＩのイソシゾマー）で切断し、できた突出部を７４ 　ＤＮＡポリメラーゼを用いて通常の方法により充填することにより、ヒトＬＩ Ｆ−ＲのＦＮＩＩＩドメインを除去した。Ｅｃｏ　Ｏ１０９Ｉに対する認識部位 は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５（ＩＪＦ−Ｒ）のヌクレオチド１７８９−１．７９ ５に渡っており、ＬＩＦ−Ｒの第−ＦＮＩＩＩドメインのアミノ酸８−９に対す るコドン中で開裂する。開裂したベクターをその後ＢｓｔＸｌ及びＥｃｏＲ５で 切断した。

ＢｓｔＸｌに対する認識部位は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５のヌクレオチド１０４ ８−１０５９に渡っており、（平滑末端を作る）ＥｃｏＲ５は該Ｆｃ配列の上流 のポリリンカー中で開裂させる。

（ＩＪＦ−！？の５′末端、該ベクター、全Ｆｃ配列、及び該ポリリンカ一部分 を含む）ＢｓｔＸ１／ＥｃｏＲ５断片及び、ＢｓｔＸ１／（Ｅｃｏ　Ｏ１０９Ｉ ）　ＬＩＦ−Ｒ断片を単離し、つなぎ合わせた。Ｅ、ｃｏｌｉ細胞をライゲーシ ョン混合物で形質転換し、それよりプラスミドを単離して、望ましい組み換えプ ラスミドを制限分析によって同定した。できた構造物は（Ｎ末端からＣ末端へ） 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５（ＬＩＦ−Ｒ）のアミノ酸−４４から４９４、該ポリ リンカーセグメントによってコードされる４アミノ酸スペーサーペプチド−Ｈｌ ｓ−＾ｒｇ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−、及びＳＥＱ　ＴＤ　ＮＯ：３　（Ｆｃ）のアミ ノ酸１−２３２を含む融合蛋白をコードする。該ＬＩＦ−Ｒポリペプチド部分は 第−ＦＮＩＩＩドメインの最初の８アミノ酸を含むが、第−ＦＮＩＩＩドメイン の残りの部分並びに第二及び第三ＦＮＩＩＩドメインの全てを欠いている。

ｇｐ１３０のＦＮＩＩＩドメインを、実施例７で製造したｇｐ１３０／Ｆｃをコ ードする組み換え発現ベクターをＢｓｔＸｌで切断した後に７４　ＤＮＡポリメ ラーゼを用いて通常の方法により突出部を平滑末端化することにより除去した。

ＢｓｔＸｌに対する認識部位は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１（ｇｐ１３０）　ノヌ クＬ／オチド１２３１−１２４２１．１ｍｍラッテり、ｇｔ１１３０　（７）第 −ＦＮＩＩＩドメインのアミノ酸１０−１１に対するコドン中で開裂する。開裂 したベクターをその後、該Ｆｃ配列の上流のポリリンカー中で開裂させて平滑末 端を作るＥｃｏＲ５で切断した。（ＦＮＩＩＩドメインを欠＜　）　’ｇｐ１３ ０の５′末端を含む（ＢｓｔＸｌ）／ＥｃｏＲ５断片、該ベクター配列、該Ｆｃ 配列、及び該ポリリンカ一部分をつなぎ合わせた。Ｅ、ｃｏｌｉ細胞をライゲー ション混合物で形質転換し、それよりプラスミドを単離して、望ましい組み換え プラスミドを制限分析によって同定した。該構造物によりコードされる融合蛋白 は、（Ｎ末端からＣ末端へ）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２（ｇｐ１３０）のアミノ 酸−２２から３０８、該ポリリンカーセグメントによってコードされる４アミノ 酸スペーサーペプチド−＾ｓｎ−＾ｒｇ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−、及びＳＥＱ　ＩＩ Ｉ　ＮＯＯ２０（Ｆｃ）のアミノ酸１−２３２を含む。該ｇｌ）１３０ポリペプ チド部分は、第−ＦＮＩＩＩドメインの最初の９アミノ酸を含むが、第−ＦＮＩ ＩＩドメインの残りの部分並びに第二及び第三ＦＮＩＩＩドメインの全てを欠い ている。

ＦＮＩＩＩ　ドメインは、本発明のレセプターのｇｐ１３０成分、ＬＩＦ−Ｒ成 分、又はその両方から欠失させてもよい。本発明の一態様において、実施例７で 製造した可溶性ＬＩＦ−Ｒ／Ｆｃをコードする哺乳動物発現ベクター及び、上記 のように製造したＦＮＩＩＩドメインを欠く可溶性ｇ＋）１３０／Ｆｃ蛋白をコ ードする哺乳動物発現ベクターによリＣＯ３’？細胞を共トランスフェクトした 。発現された蛋白の５Ｏ３−ＰＡＧＥによる分析から、２個のホモダイマーと考 えられる分子量のものを含むバンドと共に、ヘテロダイマーと考えられる分子量 のバンドが明らかにされた。実施例７に述べた方法により行ったスカチャード分 析から、共トランスフェクトした細胞により発現された蛋白に対しての方が、対 応するホモダイマーに比べてＬＩＦ及びオンコスタチンＭの結合が高アフィニテ ィー側にシフトしていることが示されてた。この結果は、ＬＩＦ−Ｒ／Ｆｃ及び ｇｔ１１３０／Ｆｃを含むヘテロダイマーの存在を示しており、さらにＬＩＰ− １？及びｇｐＬ３０部分がオンコスタチンＭ及びＬＩＦの結合において共同作用 、即ち相互作用していることを示している。

配列表の簡単な説明 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２は、ｇｐ１３０のＮ末端断 片をコードするクローニングされたｃＤＮＡにおけるＤＮＡ配列及びコードされ るアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４は、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領 域に対応するポリペプチドをコードするクローニングされたｃＤＮＡにおけるＤ ＮＡ配列及びコードされるアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６は、ＬＩＦ−ＲのＮ末端断 片をコードするクローニングされたｃＤＮＡにおけるＤＮＡ配列及びコードされ るアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニアは、本発明のいずれかのレセプターを作成するのに用い られるポリペプチドリンカ−をコードする化学合成されたＤＮＡ分子のコーディ ング鎖のＤＮＡ配列を示す。

ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８−３ＥＱ　ｒｏ　ＮＯ：１７は、本発明のいずれかのレ セプターを作成するポリメラーゼ連鎖反応に用いられる種々の一重鎖オリゴヌク レオチドブライマーのＩ）ＨＡ配列を示す。

」烈！ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：　２３６９塩基対 （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　一本線 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｕ）配列の種類：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｍ）ハイボセティカル：Ｎ。

（ｆｖ）アンチセンス＝　Ｎ。

（ｖ）フラグメント型：　Ｎ末端フラグメント（＠）起源： （Ｆ）組織の種類：　ｈｕｍａｎ　ｐｌａｃｅｎｔａ（ｖｉ）　Ｉ！接の起源： （Ｂ）クローン名：　Ｂ１０Ｇ／ｐＤｃ３ｏ３（ｆｔ）配列の特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置二　２４４．、．２３６９（ｉｔ）配列の特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　成熟タンパク質（Ｂ）存在位置：　３１０．、．２ ３６９（ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　シグナルタンパク質（Ｂ）存在位置：　２４４．、 ．３０９（ＸＩ）配列：　配列番号：１ ＧＣＣＡＣＡ　ＡＡＡ　Ｃ１′Ｇ　ＡＣＡ　ＧＴＡ　入ＡＴ　ＣＴＣＡＣＡ　ｋ ＡＴ　ＧＡＴ　ＣＧＣＴＡＴ　ＣＴＡ　ＧＣＡ　ＡＣｃ　１S４０ ＾１１τｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａ ｓｎ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　ＡｌａτｈｚＣＴＡ　Ａ（Ｊ　ＧＴＡ 　ＡＣＡ　入＾Ｔ　ＣＴＴ　ＧＴＴ　ＧＧＣＡＡＡ　ＴＣＪ　ＣＡＴ　ＧＣＡ　 ＧＣＴ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　八Ｃτ　P鴫８８ Ｌ４ｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　 Ｓａｔ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　丁ｈｘＡＴＣＣＣＴ　ＧＣ ＣＴＧＴ　ＧＡＣτττ　Ｃ入八　ＧＣＴ　ｋｃＴ　ＣＡＣＣＣＴ　ＧＴＡ　λ ＴＧＧ八ＴＣへτ　入λ入　１５３６エｌ＠　Ｐｒｏ　ＡＬａ　Ｃｙｓ　入ｓｐ 　Ｐｈ＠　Ｇｉｎ　八ｌａ　ＴｈＫ　Ｈｌｍ　ＰｆｆｉＯＶａｌ　Ｍａｔ　Ａｓ ｐ　Ｌｓｕ　Ｌｙ■ ＧＣ入　ＴＴＣＣＣＣλ大入　ＧＡＴ　へへ〇　入ＴＧ　ＣＴｒ　丁ＣＯＧ↑Ｇ Ｇ入Ａ　ＴＧＣＡＣＴ　ＡＣＴ　ＣＣλ　＾ＧＧ　１５１１S Ａｉｍ　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　Ｌｙコ　入ｓｐ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　 Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　ＴｈＩ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　ＡｚｇＧＡＡ　ＴＣＴ　Ｃ ＴＡ　入ＡＧ　入ＡＡ　ＴＡＴ　ＡＴＡ　ＣＴＴ　ＧＡＧ　ＴＧＧ　丁ＧＴ　Ｇ ＴＧ　ＴＴＡ　ＴＣＡ　ＧＡＴ　入ＡＡ@１６３２ Ｇｌｕ　５ｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　丁ｙｚ　Ｈｌｍ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　 Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　５ｅｒ　Ａｓｐ　ＬｙｓＧＣＡ　ＣＣＣ丁Ｇ Ｔ　ＡＴＣＡＣＡ　ＧＡＣＴＧＧ　ＣＡＡ　ＣへＡＧ入Ａ　ＧＡＴ　ＧＧＴ　Ａ ＣＣＧ丁ＧＣＡτ　ＣＧＣ１６１１０八ｌａ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　ＴｈＩ 　Ａｓｐ　丁ｒｐ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ 　Ｈｉｓ　ＡｒｇＣＣＴ　ＧＴＴ　ＴＧＣＴＴＡ　ＧＣＡ　ＴＴＣｃ’ｒｘ　Ｔ ＴＧ　Ａｌｌ：Ａ　ＡＣＴ　ＣＴＴ　ＣＴＧ　ＧＧＡ　ＧＴＧ　ＣＴＧ　ＴＴb ２１６０ Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｃｙａ　Ｌａｕ　Ａｌａ　ｔｈ＠Ｌ＠ｕ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｔ ｈＩ　Ｌａｕ　ｈｅｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　ｒｘｕ　ＰｈｅＴＧＣＴＴＴ　入ＡＴ 　ｋＡＧ　ＣＧＡ　ＧＡＣＣＴＡ　ＡＴＴ　ｋｋｋ　ＰＩＡＡ　ＣＡＣＡＴＣＴ ＧＧ　ＣＣＴ　ＡＡＴ　ＧＴＴ　２２O１１ Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｘ１＠　Ｌｙｓ　 Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｉｌｅ　丁ｒｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｖａ１６２０　６２５　Ｇ ３０ ＣＣＡ　ＧＮＴ　ＣＣＴ　ＴＣＡ　ＭＧ　ＡＧＴ　ＣＡＴ　）ＩＴＴ　ＧＣＣＣ ＡＧ　ＴＧＯＴＣＡ　ＣＣＴ　ＣＡＣＡＣＴ　ＣＣＴ　２２T６ Ｐｚｏ　Ａｓｐ　Ｐｒ口　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　５ｅｒ　ＨＬｓ　工１＠　Ａｌａ　 Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｓｉｒ　Ｐｒｏ　Ｈｌｓ　丁ｈｒ　Ｐｚ。

ＣＣＡ　ＡＧＧ　ＣＡＣＭＴ　ＴＴＴ　ＡＡＴ　ＴＣＡ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＣＡ Ａ　ＡＴＧ　ＴＡＴ　ＴＣＡ　ＧＡＴ　ＧＧＣ入Ａτ　２３O４ Ｐｚｏ　八ｒｇ　Ｈｉｓ　Ａａｎ　Ｐｈ＠　入ｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　 Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｓａｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　＾５ｎＴＴＣＡＣＴ　ＧＡ Ｔ　ＧＴＡ　ＡＧＴ　ＧＴＴ　ＧＴＧ　ＧＡＡ　ＡＴＡ　ＧＡＡ　ＧＣＡ　ＡＡ Ｔ　ＧＡＣＡＡＡ　ＡＡＧ　ＣＣＴ　２R５２ Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　５ｅｒ　Ｖａｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　 Ｇｌｕ　Ａｌａ　入３ｎ　入５ｐ　Ｌｙａ　Ｌｙａ　Ｐｒ。

６７０　６７５　６日０ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：　７０８アミノ酸残基（Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ム）配列の種類：　タンパク質 （Ｘｉ）配列：　配列番号：２ Ｍａｔ　Ｌａｕτｈｒ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒτｔｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｉ ｎ　Ａｉａ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｉｌ＠Ｐｈｅ　ＬａｕＴｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　 Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＡＳＰ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　 Ｇｕｙ　Ｔｙｒ　Ｘｌｅ　５ｅｒＰｒｏ　Ｇｌｕ　ＳＩＩ：　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　 Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　ＨＬｓ　Ｓ七λｓｎ　Ｐｈ＠τｈｒ　Ａｌａ　ＶａＬ 　ＣｙｓＶａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　 Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｉ（ｉｓ　Ｖａｌ　八ｓｎ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｔｙ■ ｒｙｅ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　ＨＬｓ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　 Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　ＴｈＩ４５　．５０　５５ ！ｌｅ　Ｉｌｅ　入ｓｎ　Ａｒｇ　Ｔｈｔ　Ａｌａ　Ｓｅｘ　５ａｒ　Ｖａｌ　 Ｔｈｒ　Ｐｈａ　ＴｈＩ　Ａｓｐ　ＸＬｅ　ＡＬａ　５ｅｒＬｅｕ入ｓｎ　工ｉ ＠Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｔ？＋ｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｉｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈ、ｗ　Ｐ ｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　ＧＬｕＧｉｎ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌ ｙ　ｒｌｅ　ＴｈＩ：　Ｘｉｓ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐｚｏ　Ｐ ｒｏ　ＧＬｕ　Ｌｙ■ Ｐｒｏ　Ｌｙｓλｓ＊　Ｌｅｕ　Ｓｅｔ　Ｃｙａ　Ｘｉｓ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｇ ｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ＾ｒｑ　Ｃｙｓｌｌｏ　１１５　１２０ Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　ＧＬｕ　Ｔｈｒ　ＨｉＳ　 Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｚ　ｘ！ｎ　ｆ’ｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌａ■ Ｌｙｓ　Ｓｓｒ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ＨＬｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈ＠Ａ ｌａ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｚ、ｙｓ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　八ｔｇＡｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐ ｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｔ　Ｃｙｓ　Ｔｈｉ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｔ ｈｒ　Ｖａｌ　丁ｙｒ　Ｐｈａ　Ｖａ１Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｒ ｐ　ｖａＬ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｇｕｙ　Ｌｙ ｓ　Ｖａ１τｈｉＳ＠ｉ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｘ１＊　Ａａｎ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　 Ｐｒｏ　ＶａＬ　Ｔｙｒ　Ｌｙａ　Ｖａｌ　Ｌ＋ｙ３　ｆ’ｒｏ　Ａｓｎ　Ｐ煤 B Ｐｒｏ　）ｌｉｓ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　ＸＬ＠Ａｓｎ　Ｓｅｒ　 Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｔ　Ｓｅｒ　ＩＬｅ　Ｌａｕ２（Ｉｓ　２１０　 ２１５ Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐτ？＋＋ｅ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　５ｅｒ　ＸＬｅ 　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　ｒｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙ■ ？ｙｔ　Ａｓｎ　Ｘｌｓ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ａｒｇτｈｒ　Ｌｙｓ　Ａ！ＩＰ　 Ａｌａ　Ｓ＠ｒ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｓｅｅ　Ｇｉｎ　ＨｅＰｒｏ　Ｐｚｏ　Ｇｌ ｕ　Ａｓｐ　丁ｈｒ　ＡＬａ　Ｓｓｒ　Ｔｈｅ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｓｅｘ　Ｐｈ ｅ　ＴｈＩ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　ＭｐＬｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐｈ＠　Ｔｈｉ　 Ｇ工Ｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ａｔｇ　ＺＬｅ　Ａｅｇ　Ｃｙｓ　にａｔ　 Ｌｙｓ　ＧＬｕ２’０　２７５　２８０ Ａｓｐ　ＧＬｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　丁ｒｐ　 Ｓｅｘ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　ＧＬｙ　ＸＬ＠Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｇ Ｌｕ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｓｅｔ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐ ｈｅ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　ＸＬｅＡｓｐＰｒｏＳｅｒＨ１ｓＴｈｚＧｉｎ ＧｌｙＴｙｔＡｔｇＴｈｒＶａｌＧｉｎＬ＠ｕＶａ工τｚｐＬｙｓＴｈｒ　Ｌｅ ｑ　Ｐｒｏ　Ｐｚｏ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　八ｌａ　Ａａｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　ｒｌ ｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｖａ１τｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｔ　Ａｒｇ 　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ 　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｌａτｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　 Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｈｚ　 ＬｅｕＴｈｒ　Ｖａｌ　Ａｔｇ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓ ｅｘ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｌａ　ＶａＬ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｘ１ｓ３１ｉ０　３ ８５　３９０ ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ＨＬｓ　 Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　ＡｌａＳｅｔ　ＶａＬ　Ｌ ｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｃ　工ｉｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　ＶａＬＩａ ｕ　Ｓｅｔ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　八１８Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　Ｔｈｔ　Ａｓｐ 　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　ｖａｘ　ＨＡｓ 　入ｚｇ　でｈｃＴｙｔ　Ｌｅｕ　ｋＫｑ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　！、ｅｕ　Ａｈａ 　ＧＬｕ　Ｓｅｘ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　τｙｒＬ・Ｕ　工１・　丁ｈｒ　Ｖａ工τ ｈｒ　ｆ’ｒｏ　Ｖａｎ　丁ｙｒ　入ｉｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　ＰＩ：ａ　ＧＬｙ 　Ｓ＠ｒ　Ｐｒ：ｏ　Ｇｌｕ　Ｓａｒ　工Ｌｅ　Ｌ＋ｙｓ@＾１轟 ４７５　４１１＋１　４１１５　４９０〒ｙ１　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　ＧＬｎ　Ａｌ ａ　ｆｌｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓ酊ＬＹＳ　ＧｌｙＰｔ６τｈｒ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｔ ｈｒ　Ｌｙｓ４９５　５００　５Ｑ５ Ｌｙｓ　ＶａＬ　ＧＬｙ　Ｌｙｓ　入ｓｎ　Ｇｌｕ　入１ａ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　 Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　ｋｓｐ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｖａ１Ａｓｐ　ＶａＩ　Ｇ ｉｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｐｈａ　Ｚｌ＠　Ａｉｇ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｔｈｃ　Ｚ ｌｅ　Ｐｈｅ　τｙｆ　Ａｒｇ　Ｔｈ【１１ａ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　ＡｓｎＧｌｕ 　Ｔｈｒ＾ｌａ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｉ　）Ｉｉｓ τｈｔ　Ｇｌｕ５４０　５４５　５ＳＱ Ｔｙｒ　Ｔｈ【　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｅ　Ｌａｕ　ＴｈＥ　Ｓａｔ　入ｓｐ　 Ｔｈｅ　ｔａｕ　Ｔｙｔ　Ｍｅｔ　ｖａＬ　八ｘｑ　Ｍｅｔ＾１１　＾１１　Ｔ ｙｃ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　ＧＬｙ　Ｐ ｔｏ　Ｇｌｕ　Ｐｈａ　Ｔｈａｗ　ＰｈE ５７５　５Ｂ０　５＠５ Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒ：ｏ　Ｌｙｓ　Ｐｈａ　入Ｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　ＧＬｕ 　工ｉ＠　ＧＬｕ　入λ畠　工１＠　Ｖｌｌｌ　Ｖａｎ　Ｐ秩B Ｖａｌ　ｃｙｓ　ｔ、ｅｕ＾１ａ　Ｐｈａ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｆ　 Ｌａｕ　Ｌａｕ　ＧＬｙ　Ｖａｉ　Ｌｓｕ　ｆ’ｈｅ　Ｃｙr Ｐｈｅ＾ｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ＾ｓｐ　Ｌｅｕ　エエｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｈｌ ｓ　ｒｌ＠Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｐｘ。

Ａｓｐ　１ｌｒｏ　５ｅｒ　Ｌｙｓ　Ｓｓｔ　ＨＬｓ　ｒｌｅ　Ａｌａ　Ｇｉｎ 　Ｔｒｐ　Ｓｅｔ　Ｐｒ６　ＨＬｓ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐ（O １ｉ３Ｓ　６４０　６４５　６５０ ＾ｔｑ　Ｈｉ、ｓ　Ａｓｎ　Ｐｈ＠Ａｓｎ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　 Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｓｓｒ　八ｓｐ　ＧＩｙ　Ａｓｎ　Ｐｈｅτｈｒ：　八ｓｐ　 Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　ｖａｌ　Ｇｌｕ　ｔｉ＠　ＧＬｕ　Ａｈａ　Ａｓｎ　 ）＋ｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐ■■ ６７０　、　６７５　６８０ （２）配列番号：３ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ；　７０５塩基対 （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数−一本舗 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（Ｕハイボセティカル二　Ｎ Ｏ （汁）アンチセンス＝　ＮＯ （報）ｉｌ！接の起源： （Ｂ’）クローン名：　ｈＩｇＧＩＦｃ（ｆ）配列の特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　ＣＤ５ Ｃ８＞存在位置：　１．、．６９９ （ｘｉ）配列：　配列番号：３ （２）配列番号：４ （Ｄ配列の特性 （Ａ）配列の長さ：　２３２アミノ酸残基（Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （■）配列の種類：　タンパク質 （尤）配列：　配列番号＝４ Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｓ＠ｔ　Ｃｙｓ＾ｓｐ　Ｌｙｓ　ＴｈｔＨＬｓ〒ｈｒ 　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　ｐｒロＡ工１Ｌ　５　１０　１５ （２）配列番号＝５ （１）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：　３１８２塩基対 （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数−一本線 （Ｄ）トポロジー：　直鎮状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（出）ハイポセティカル：Ｎ ０ （ｔｖ）アンチセンス：　Ｎｏ （Ｗ）フラグメント型：　Ｎ末端フラグメント（＠）起源： ＣＦ）組織の種類：　ｈｕｍａｎ　ｐｌａｃｅｎｔａ（ｎ）直接の起源： （Ｂ）クローン名：　ｐＨＬＩＦＲ−６５（ｉｘ）配列の特Ｗ！、： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　成熟タンパク質（Ｂ）存在位ＩＥ：　３１．１．、 ．３１８２（ｉｔ）配列の特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：　１７９．、．３１８２（ｉＸ）配列の特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　シグナルタンパク質（Ｂ）存在位置：　１７９．、 ．３１０（江）配列の特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　成熟タンパク質（Ｂ）存在位置：　３１１．、．３ １８２ＣＡＧＡＡＡＧＧＧＡ　ＧＣＣ丁ＣＴＧＣＧＡ　ＣＴＣＡττＣ＾τＣＧ ＣＣＣＴＣＣＡＧＧ　ＡＣＴＧＡＣτＧＣＡ　ＴＴＧＣＡ（ＡＧ　P７１１ （２）配列番号＝６ （ｆ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：　１００１アミノ酸残基（Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｌ）配列の種類：　タンパク質 （ｘｌ）配列・　配列番号＝６ Ｔｈｆ　Ｌ４＊　八ｓｎ　Ｇｌｙ　ｒａｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｓｕ　Ｈｉｓ 　ＨＬｓ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ａｌ轟　５ｅｒ　入３■ １５０　Ａｓｓ　１６Ｏ Ｎｅｔ　ｉ’ｒｃｌ　Ｌｅｕ　ＧＬｕ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｅｌ＠　＋４１ｓ　Ｐ ｈａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　H１ｅ １６５　１７０　１フ５　１８０ Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｈｌｓ　Ｐｈａ　Ｓｉｒ　Ｇｌｙ　Ｌｓｕ　Ｇｌｕ　 Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｓａｒ　入５ｐ　Ｔｒｐ　５ｅｒ　Ｐに０Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａ ｓｎ　Ｉｌａ　５ｅｒ　丁ｒｐ　Ｘｋａ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｓｅｔ　Ｇｉｎ　Ｔ ｈｅ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｐｈｓ　Ｐｒ。

２００　２０５　２１Ｇ Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　ｖａｌ　Ｘ１ｅ　Ｌｅｕ　ＶａＬ　ＧＬｙ　Ｓｅｒ　 入ｓｐ　工１＊　Ｔｈｔ　１Ｆｈｅ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｖａk Ｓ＠ｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　ＸＡｕ　 Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　＋４ｉｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　ＰｒB Ｌ４ｕ　ＩＬｅ　Ｈｉｓ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　 入１ａ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　ｒｌｅ　Ａｒｇ　Ａｇｎ　Ｉｌ・Ｓ＠ｔ　Ｖａｌ　５ ａｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｆ　Ａｓｎ　ＶａＩ　ＶａＬ　Ｐ ｈｅ　Ｔｈｒ　丁ｈｒ　Ｇｌｕ　八３ｐ八ｓｎＺ工＠　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ 　Ｖａｌ　１Ｌｅ　Ｐｈａ　八ｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ 　Ｔｈｅ　ＰｚＯＧｉｎ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ａｇｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　 ＨＬｓ　八ｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　ＧＬｕ　ＩＬｅ　ＺＬｅ　Ｃｙｓ　５ｅｅＴ ｒｐ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　八Ｌａ　Ｌｅｕ　Ｖ ａｌ　Ｇｌｙ　ｐｒｏ　Ａｒｇ　ＡＬａ　Ｔｈｒ　５ｓｒ３１０　１に５　３２ Ｇ Ｔｙｚ　Ｔｈｔ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　ＧＬｕ　Ｓａｔ　ｐｈ＠Ｓｅｔ　Ｇｌｙ　Ｌ ｙｓ　Ｔｙｒ　ｖａｌＡｌａ　Ｌａｕ　ＬｙＢ　ｋｔｑＧｌｙ　Ａｒｇ　Ｓａｒ 　Ｇｉｎ　Ｓｅｔ　Ｔｈｒ　ＩＬｅ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　入３ｎ　１１ｅ　Ｔｈｆ 　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　丁ｙｒ３７５　３！１０　３８５ Ｐｔｏ　Ｈｉｓ　Ｔｈｆ　Ｐｚｏ　Ｔｈｒ　Ｓｓｒ　Ｐｈａ　Ｌｙｓ　ＶａＬ　 Ｌｙｓ　Ａ５ｐ　ｆｆ１ｓ　入ｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｌ■ Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌ舒ｕ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　）ｌｉｓ　Ｌｅｕ　Ｐｔａ　ＧＬｙ 　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　ＡＬａ　Ｌｙｓ　ＸＬｅ　八ｓｎ　ｔ’■■ Ｌａｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　ＩＬｅ　Ｇｌｕ　Ｉｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙ３　Ｓｅｒ　 八ｓｎ　５ｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　八【９４２５　４３０　Ｑ ３Ｓ 八ｓｎ　ＶａＬ　Ｔｈｆ　ＩＬｅ　Ｌｙｓ　Ｇａｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　入ｓｒ＋ 　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　丁ｙｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　八λδ　Ｌｌ撃■ Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　丁ｙｒ　Ｔｈｉ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　 Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　ＸＬｅ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　５ｅｃ４５５　４ｇ０　４ ６５ Ｔｈｔ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓτｒｐ　Ｓａｔ　Ｌｙｓτ１ Ｓ＠ｔ　Ａｌｌ’ｌ　１−ｙ５　！、ｙｓ　Ｇｌｒ＋−１４Pｇ 鴫７ｏ４フ５４８０ Ｘａｕ　τｈｆＴｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｓａｒ　Ｐｔｏ　Ｓａｔ　Ｌｙｓ　Ｇ ｉｙ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　でｈｒ　丁ｘｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ４１１５　４９０　４ ９５　ＳｏＯ τｒｐ　Ｓｉｒ　５＠ｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｅｌｓ　 １１−　τ７ｆ　テｒｐ　Ｌｙａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

５０５　５ＬＯ！５１５ 工論　入ｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｅｌｓ　Ｌ４１Ｊ　 Ｓａｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ｃｙｓ　５ｅｒＳｅｒ　Ａｓｐ　Ｇ Ｌｕ　ＧＬｕ　Ｔｈｅ　Ｇｉｎ　Ｓａｔ　Ｌｅｕ　Ｓｅ＋：　Ｇｌｕ　Ｘｌｅ　 Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｈ１■ Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｘｉ＠＾ｒｑ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ７７ ５　Ｔｙｒ　ＸＬｍ　Ｉｌｅ　Ｓｅｔ　Ｖａ工Ｖａｌｓｓｏ　５５５　５６０ 人１ｍ　Ｌｙｓ　入ｓｎ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｘ　Ｐｆｏ　 Ｐｒｏ　Ｓｉｒ　Ｌｙｓ　Ｘｉｓ　Ａｌａ　Ｓａｒ　Ｍ＊ｅＧｌｕＸｉ＠Ｐｒｏ ＡｓｎＡｓｐＡｓｐＬ自ｕＬｙｓＩｌｅＧｌｕＧｉｎＶａｌＶａｌＧｌｙＭｅｔ ＧｌｙＬｙｓ　Ｇｌｙ　ｒｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒτｒｐ　）ｌｉｓ　Ｔ ｙｒ＾ｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｇｎ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　ｋｓｐ６００　ＧＯ５ ６１０ 丁ｙｒ　Ｖａｌ　Ｚｌｅ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｓｅ＋：　Ｓａｒ 　入ｔ９　Ｓｅｔ　ＧＬｕ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　ｔａｕ　Ｍａ■ Ａ５Ｐ　丁ｒｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｖａｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｔ　入ｓｎ　Ｓａｒ　 Ｔｈｒ　ＧＬｕ　丁ｈｒ　Ｖａｌ　工ｉｓ　Ｇｌｕ　５ｅｘｋｓｐ　ＧＬｕ　！ ’ｈ＠　八ｒ：ｑ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｌｅ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ 　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔｙｔ：　Ｇｌｙ　bｙｓ ６４５　６５０　Ｇ５５　６６０ Ａｔｇ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　 ＳｅｆｆＭａｔ　Ｘｉｅ　Ｇｌｙ　Ｔｙｔ　ｒｌｅ　Ｇｌｕ６６５　６７０　６ フ５ Ｑｌｕ　Ｌａｕ　入１ａ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　ＡＬａ　Ｐｔｏ　Ａｓｎ　 Ｐｈａ　Ｔｈｆ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　丁ｈｒ５・にＡｌｌｌ　Ａｓｐ　Ｓ ｅｔ　ＸＬａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓτｒｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｉｌａ　Ｐｔ ｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ八ｒｑ　Ｇｌｙ　Ｐｈａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ 　Ｇｌｙ　Ｔｙｅ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ 　Ｇｌｕ　ＡｒｇＡｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｍａｊ　Ａｅｑ　Ｖａｌ　 Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｅ　Ｇｌｙ　入ｒ：ｑ　Ｓｅｅ　入ｓｐ　ＩＬｅ　Ｌソr フ２５　７３０　７３５　７４０ Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　丁ｈｒ　Ａｓｐ　Ｅｌｓ　Ｓａｒ　Ｇｉｎ　 Ｌｙｓ　Ｔｈｆ　Ｌｅｕ　Ａｚｇ　ＸＬｅ　八ｌａ　ＡｓｎＬ＠ｕ　Ｇｉｎ　Ｇ Ｌｙ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｔｙｅ　１（ｉｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　 八ｘｑ　入Ｌ＆　ＴＶτ　丁ｈｚ　）ＩrＰ ７６０　７６５　７７Ｇ Ｇｌｙ　Ｇｕｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｍａｃ　 丁ｙｒ　Ｖａｌ　Ｖａｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ７７５　フ１１０　 ７１１５ Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｕｌｅ　Ｉｌｅ　八Ｌａ　Ｈｅ　Ｌａｕ　Ｉ Ｌｅ　１ｉｔｏ　ＶａＬ　へ１晶　Ｖａｌ　八ｌａ　ＶａｔＸｌ＠　Ｖａｔ　Ｇ ｌｙ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｈｆ　Ｓｓｒ　工１ａ　Ｌａｕ　Ｃｙｓ　Ｔｙｅ　Ａ ｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｚｇ　Ｇｌｕ　丁ｒｐ８０５１！１０　８１５　Ｂ２０ （２）配列番号ニア （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：　１００塩基対 （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数−−末鎖 （Ｄ）トポロジー・　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （：ｄ）配列：　配列番号ニア ＧへτＣＡＧＧＴＧＧ　ＡＧＧＡＧＧττＣＴ　ＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧ　ＧＴＴ ＣＣＧＧλＡτ　１００（２）配列番号：８ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ＝　３６塩基対 （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （■）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列：　配列番号二８ Ｇ＾ＴＡＴＧＴＣＧＡ　ＣＧＡＴＧＡＴＧＧＡ　ＴＡＴＴＴＡＣＧＴＡ　ＴＧＴ ＴＴＧ（２）配列番号：９ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：　４８塩基対 （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー；　直鎖状 （ｉｆ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列：　配列番号：９ ３６　ＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣｋ　Ｇ八人ででττＣＣＴ　τ τＧτＣ八ＣＣＡへ　入Ｔ入Ｃ八ＴＡＣ（２）配列番号：１２ （１）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：　３５塩基対 （Ｂ）配列の型；　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｆ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｄ）配列：　配列番号：１２ ＬａＴＡ？ＣＸＣＧＡ　ＣＡＡＧｋＴＧＴＴＧ　ＡＣＧＴＴＧＣＡＧＡ　ＣＴＴ ＧＧ　３５（２）配列番号：１３ （Ｄ配列の特性 （Ａ）配列の長さ：　４１塩基対 （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎮状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｘｌ）配列：　配列番号：１３ ＧＣ八へＧＧＡＴＣＣ八ＣＣＴＣＣτＣＣＴ　Ｔ（入ＡＴＴＴＣ丁ＣＣＴＴＧＡ ＧＣｋＡＡ　Ｃ４１（２）配列番号：１４ （ｉ）配列の特性 （Δ）配列の長さ＝　４４塩基刻 ＣＢ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｆ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｘｏｌ）配列：　配列番号＝１４ ＣＧＣＧＴＣＣＧＧＡ　ＧＧＡＧＧＴＧＧＴＡ　ＧＣＣＡＧＡＡＡＡＡ　ＧＧＧ ＧＧＣＴＣＣＴ　ＣＡＴＧ　”（２）配列番号＝１５ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：　４３塩基対 ＣＢ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−重鎖 （Ｄ）トポロジー・　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列：　配列番号＝１５ ＧＣ八へＧＣＧＧＣＣＧＣτ八入へ入Ａττ　ＴＴＣＣτ丁ＴＧＴＣＡＣＣＡＣ λτＡＣＡ　ＴＡＣ４３（２）配列番号＝１６ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ二　４５塩基対 （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鏑の数：　−末鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （■）配列の種ｇｉ：　ｃＤＮＡ （ｘｔ）配列：　配列番号；１６ ＧＣＡＴＡＧＡ丁ＣＴ　ＧＧＧＣＴＣＡＧ入Ａ　τ↑τＴＣＣＴＴＴＧ　ＴＣＡ ＣＣＡＣＡＴＡ　ＣＡＴＡＣ（２）配列番号：１７ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ−３８塩基対 （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−末鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｆ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （対）配列：　配列番号；１７ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧＵＲＥ４ …１ｗ−−Ｐ＋１Ｆｆｖ−−炉一虐ｆツー管帽慴−−雫ｒ−断−−ｎ−−−−− 門？−１書１１４’＃ａｎｍｌ＋１＋−１＋＋＋ｍｍｌ１＋Ｔ＋ｌ＋１＋＋ｌ＋ Ｉｎｌ＋ｔ＋修−＋＋ｋｌ＋ｌｒ＋に＋１＋ａｌｌＩｎｓ＋＋？神ｋＨP＋に＋ １＋＋ 丑、　Ｅ：ｉヨ＝＝＝ミＥ：：ミ：＝巨！百讐二百：；　：！　ｉｌ　：；　巨 ！星＝二：工真ミｆｉ、　：、　：Ｉ１１雇／ダ薯 りｕＯり／」 手続補正書

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．オンコスタチンＭ及び白血病抑制因子に結合することができるレセプターで あって、ＬＩＦ−Ｒに共有結合しているｇｐ１３０を含むレセプター。
2. ２．請求項１記載のレセプターであって、当該レセプターが可溶性ＬＩＦ−Ｒポ リペプチドに共有結合している可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドを含むレセプター 。
3. ３．請求項１記載のレセプターであって、当該レセプターがポリペプチドリンカ ーによってＬＩＦ−Ｒに共有結合しているｇｐ１３０を含むレセプター。
4. ４．請求項３記載のレセプターであって、当該レセプターが以下の式Ｒ１−Ｌ− Ｒ２又はＲ２−Ｌ−Ｒ１ （式中、Ｒ１はｇｐ１３０を表し；Ｒ２はＬＩＦ−Ｒを表し；Ｌはポリペプチド リンカーを表す）の組み換え融合蛋白であるレセプター。
5. ５．請求項４記載のレセプターであって、該ポリペプチドリンカーがグリシン、 アスパラギン、セリン、スレオニン、及びアラニンから成る群から選択される２ ０ないし１００アミノ酸を含むレセプター。
6. ６．請求項５記載のレセプターであって、該ポリペプチドリンカーが、式中ｎが ４−１２を示す（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ５−Ｓｅｒ）２及び（Ｇｌｙ４−Ｓ ｅｒ）■から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むレセプター。
7. ７．請求項４記載のレセプターをコードする単離されたＤＮＡ。
8. ８．請求項７記載のＤＮＡ配列を含む組み換え発現ベクター。
9. ９．請求項８記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
10. １０．請求項３記載のレセプターであって、ｇｐ１３０のＣ末端に結合した抗体 Ｆｃ領域ポリペプチドを含む第一の融合ポリペプチド及びＬＩＦ−ＲのＣ末端に 結合した抗体Ｆｃ領域ポリペプチドを含む第二の融合ポリペプチドを含み、当該 第一の融合ポリペプチドが当該第二の融合ポリペプチドに該Ｆｃ領域ポリペプチ ド間のジスルフィド結合により結合しているレセプター。
11. １１．請求項１、４、又は１０に記載のレセプターであって、ａ）ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：１のヌクレオチド２４４−２３６９を含む第一のＤＮＡ配列、ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：１のヌクレオチド３１０−２３６９を含む第二のＤＮＡ配列、及び 緩和にストリンジェントな条件下で当該第二のＤＮＡ配列にハイブリダイズする 第三のＤＮＡ配列から成る群から選択される単離ＤＮＡによって、当該ｇｐ１３ ０がコードされ；且つｂ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５のヌクレオチド１７９−３１ ８２を含む第一のＤＮＡ配列、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５のヌクレオチド３１１− ３１８２を含む第二のＤＮＡ配列、及び緩和にストリンジェントな条件下で当該 第二のＤＮＡ配列にハイブリダイズする第三のＤＮＡ配列から成る群から選択さ れる単離ＤＮＡによって、当該ＬＩＦ−Ｒがコードされるレセプター。
12. １２．請求項１０記載のレセプターであって、当該ｇｐ１３０が可溶性ｇｐ１３ ０ポリペプチドであり、当該ＬＩＦ−Ｒが可溶性ＬＩＦ−Ｒポリペプチドである レセプター。
13. １３．可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドのＣ末端に結合した抗体Ｆｃ領域ポリペプ チドを含む融合蛋白。
14. １４．請求項１３記載の融合蛋白をコードする単離されているＤＮＡ配列。
15. １５．可溶性ＬＩＦ−ＲポリペプチドのＣ末端に結合した抗体Ｆｃ領域ポリペプ チドを含む融合蛋白。
16. １６．請求項１５記載の融合蛋白をコードする単離されているＤＮＡ配列。
17. １７．Ｆｃ領域ポリペプチド間のジスルフィド結合により結合している、請求項 １５記載の二個の融合蛋白を含むホモダイマー型レセプター。
18. １８．請求項４記載のレセプターを製造する方法であって、当該融合蛋白をコー ドするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を当該融合蛋白 の発現を促進させる条件下で培養すること、及び当該融合蛋白を回収することを 含む方法。
19. １９．請求項１０記載のレセプターを製造する方法であって、当該第一の融合ポ リペプチドをコードする第一の発現ベクター及び当該第二の融合ポリペプチドを コードする第二の発現ベクターで共トランスフェクトした宿主細胞を当該第一及 び第二融合ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養すること、及び当該レセ プターを回収することを含む方法。
20. ２０．オンコスタチンＭ又はＬＩＦが介在する疾患を治療するための、請求項１ 、４、１０、又は１２に記載のレセプター及び適当な希釈剤又は担体を含む、医 薬用組成物。