ES2373039T3 - Composiciones y métodos para el tratamiento de lesiones del cns. - Google Patents

Composiciones y métodos para el tratamiento de lesiones del cns. Download PDF

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Abstract

Una enzima condroitinasa ABC para usar en mejorar la recuperación funcional tras una lesión por contusión del sistema nervioso central, enzima que se administra en una cantidad terapéuticamente efectiva.

Description

Composiciones y métodos para el tratamiento de lesiones del CNS.
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a métodos para promover la recuperación neurológica funcional después de una lesión o enfermedad del sistema nervioso central (“CNS”). En particular, la presente invención se dirige a un método para utilizar la condroitinasa para promover la recuperación neurológica funcional tras una lesión en o a la médula espinal. Las composiciones útiles en este método incluyen formulaciones aceptables de condroitinasa, más particularmente formulaciones de condroitinasa de liberación sostenida. La presente invención también se dirige a un método de promover la recuperación neurológica funcional después de una lesión a la médula espinal por contusión.
Descripción de la técnica relacionada
La médula espinal es el nervio más grande del cuerpo y está constituido por fibras nerviosas. Estas fibras nerviosas son responsables de los sistemas de comunicación del cuerpo, los cuales incluyen las funciones sensoriales, motoras y autonómicas. Las funciones sensoriales incluyen la capacidad para sentir sensaciones, como el dolor. La función motora incluye la capacidad para mover voluntariamente el cuerpo. Las funciones autonómicas incluyen las funciones corporales involuntarias, por ejemplo, la capacidad para sudar y respirar.
El sistema nervioso central incluye el cerebro y la médula espinal. La médula espinal conecta el sistema nervioso periférico (“PNS”) con el cerebro. Los nervios sensoriales, que entran en la raíz dorsal de la médula espinal, transmiten información sensorial desde los receptores sensoriales del cuerpo al cerebro. Diferentes tipos de sensaciones se envían por rutas sensoriales diferentes. Por ejemplo, el tracto espinotalámico porta sensaciones de dolor y temperatura y el tracto de la columna dorsal porta sensaciones de posición y tacto. Los nervios motores, que salen de los nervios de las raíces ventrales de la médula espinal, transmiten información motora voluntaria desde el cerebro al cuerpo.
El sistema nervioso autonómico (ANS) influye en las actividades de los músculos involuntarios, incluido el músculo del corazón, y de las glándulas que liberan hormonas. En particular, el ANS controla los sistemas cardiovascular, digestivo y respiratorio para mantener un ambiente estable dentro del cuerpo. El ANS incluye los nervios simpáticos, que provocan la constricción de los vasos sanguíneos y incrementan el ritmo cardiaco, y los nervios parasimpáticos, que actúan de manera opuesta a los nervios simpáticos dilatando los vasos sanguíneos y disminuyendo el ritmo cardiaco.
El daño al sistema nervioso central, incluyendo la médula espinal, da lugar a una pérdida de funciones. Dependiendo del tipo de lesión al sistema nervioso central, la pérdida de funciones puede manifestarse en sí misma en una pérdida de la función sensorial, motora o autonómica o en una de sus combinaciones.
Los tipos más comunes de lesiones de la médula espinal (SCI) incluyen contusiones (moretones de la médula espinal) y lesiones por compresión (provocadas por presión sobre la médula espinal). En las lesiones por contusiones, el tipo de lesión más común, con frecuencia se forma una cavidad o agujero en el centro de la médula espinal. Al contrario que las células de los nervios, o neuronas del PNS, las neuronas del CNS no se regeneran después de una lesión. La incapacidad de los axones para regenerarse puede conducir a la pérdida de sensación, función motora y función autonómica, así como a la parálisis permanente. Una razón por la que las neuronas no se regeneran puede ser su incapacidad para atravesar la cicatriz glial que se desarrolla tras una lesión en la médula espinal. El daño causado por la lesión desarrollará una cicatriz glial, la cual contiene moléculas de la matriz extracelular que incluyen proteoglicanos de sufato de condroitina (CSPGs). Los CSPGs inhiben el crecimiento del tejido nervioso in vitro y la regeneración del tejido nervioso en las regiones ricas en CSPGs in vivo.
Varias moléculas, y regiones especificadas de las mismas, han sido implicadas en la capacidad para apoyar el brote de las neuritas en una célula neuronal, un proceso también denominado extensión de las neuritas. El término neurita se refiere tanto a las estructuras de los axones como de las dendritas. Este proceso de brote de las neuritas es esencial en el desarrollo y regeneración neural, especialmente después de que la lesión o la enfermedad hayan dañado a las células neuronales. Las neuritas se alargan profusamente durante el desarrollo tanto en el sistema nervioso central como en el periférico de todas las especies animales. Este fenómeno es propio tanto de los axones como de las dendritas.
Se sabe que varios polipéptidos, especialmente las moléculas de adhesión celular (CAMs), promueven el crecimiento de las células neurales. Aunque los esfuerzos iniciales en esta área de investigación se concentraron en la proteína fibronectina (FN) que promueve la adhesión sobre la matriz extracelular, también se ha encontrado que otros polipéptidos promueven el crecimiento neural. Por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.792.743 describe nuevos polipéptidos y métodos para promover el crecimiento neural en el sistema nervioso central de un mamífero administrando una CAM neural soluble, uno de sus fragmentos, o uno de sus productos de fusión Fc. La patente de EE.UU. nº 6.313.265 describe polipéptidos sintéticos que contienen las regiones farmacológicamente activas de CAMs que pueden usarse para promover la regeneración y reparación de los nervios tanto en lesiones de los nervios periféricos como en lesiones en el sistema nervioso central. Aunque útiles, el uso único de proteínas regenerativas puede no ser suficiente para efectuar la reparación de un sistema nervioso dañado. El documento WO/03/04080 describe el uso de enzimas que degradan a los glicosaminoglicanos para tratar el tracto corticoespinal dañado, pero no hace referencia a lesiones por contusiones.
Durante aproximadamente las pasadas dos décadas, el conocimiento base de la adhesión y migración celular en matrices extracelulares (ECMs) a nivel molecular se ha expandido rápidamente. La acción de las enzimas y otros polipéptidos que degradan a los componentes de la matriz extracelular y las membranas basales puede facilitar los sucesos de reparación neural mediante una diversidad de mecanismos, que incluyen la liberación de citoquinas enlazantes, y mediante el aumento de la permeabilidad de la matriz, potenciando de este modo la movilidad de las moléculas mediadoras, los factores de crecimiento y los agentes quimiotácticos, así como las células implicadas en el proceso de curación. Por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.997.863 describe el uso de glicoaminoglicanos para manipular la proliferación celular y promover la curación de las heridas.
Las moléculas ECM incluyen los CSPGs inhibidores. Se han identificado componentes de CSPGs como glicoaminoglicanos, sulfato de condroitina (CS) y sulfato de dermatano (DS). La separación de estas moléculas inhibidoras permitiría regenerar y reinervar un área después de una enfermedad o lesión física, así como recuperar las funciones sensoriales, motora y autonómica.
Estudios previos han encontrado que las condroitinasas pueden lisar y degradar a los CSPGs incluyendo a CS y a DS. Un estudio encontró que la condroitinasa ABC separó cadenas de glicoaminoglicanos (GAG) en y alrededor de áreas lesionadas de SNC de rata in vivo. La degradación de GAGs promovió la expresión de una proteína asociada al crecimiento, GAP-43, indicando una propensión regeneradora acrecentada en las células tratadas. Sin embargo, esta proteína asociada al crecimiento está asociada con la regeneración de lesiones en nervios periféricos, pero no centrales. Otro estudió encontró que el tratamiento con condroitinasa ABC de médula espinal de rata regeneró in vitro neuronas en un sustrato de una sección de tejido. Este estudio observó que la degradación de CSPGs puede promover los efectos neuroestimuladores de la laminita (Zuo et al., Degradation of chondroitin sulfate proteoglycan enhances the neurite-promoting potential of spinal cord tissue, Exp. Neurol. 154(2): 654-62 (1998)). En un estudio posterior del mismo investigador principal se informó que la inyección de condroitinasa ABC en el sitio del daño al nervio degradó CSPGs e incrementó el ingreso de brotes axonales en las láminas basales del segmento distal del nervio (Zuo et al., Regeneration of axons after nerve transaction repair is enhanced by degradation of chondroitin sulfate proteoglycan. Exp. Neurol. 176(1): 221-8 (2002)). El mismo grupo de investigadores también encontró que los tratamientos con condroitinasa ABC regeneraban axones en injertos acelulares a una velocidad mucho mayor que en los injertos testigo (Krekoski et al., Axonal regeneration into acellular nerve grafts is enhanced by degradation of chondroitin sulfate proteoglycan. J. Neurosci. 15:21(16): 6206-13 (2001)). Aplicaciones de condroitinasa ABCTipoI a un tracto corticoespinal lesionado, en particular una lesión en la columna dorsal, impidieron la retracción de los axones del área afectada y promovieron un mayor crecimiento de las fibras axonales que el testigo, con parte de los axones arborizándose en materia gris. Los axones CST regenerados establecieron conexiones funcionales (Bradbury et al., Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury, Nature 416: 636-649 (2002)).
Sin embargo, la recuperación funcional neurológica inducida por la condroitinasa en un modelo animal de lesión por transección de la columna dorsal ha limitado la aplicabilidad o el poder de predicción relativo a la recuperación de la función autonómica y, en particular, como resultado de una lesión por contusión en la médula espinal. En la lesión por transección de la columna dorsal descrita por Bradbury et al 2002, se lesionan fibras de las columna dorsal cortando los tractos nerviosos con una cuchilla. Este método produce una lesión localizada o “limpia” con un daño colateral mínimo al parénquima restante de la médula espinal. Los tractos de tejido de la materia gris y otra materia blanca sustentan un daño mínimo y, por tanto, este modelo es útil para estudiar la capacidad regeneradora de las neuronas de la columna dorsal, las cuales portan neuronas sensoriales.
Sumario de la invención
La presente invención se dirige en general a las condroitinasas ABC para usar en la mejora de la recuperación funcional tras una lesión por contusión del CNS, porque estas condroitinasas degradan a los componentes de la matriz extracelular del CNS que son inhibidores de la regeneración.
Las condroitinasas pueden administrarse a un mamífero afligido por una lesión del CNS, tanto si la lesión es inmediata como producida hace mucho tiempo. La condroitinasa se administra en una cantidad efectiva para degradar a los CSPGs y de este modo promover la recuperación de la función neurológica funcional.
Las condroitinasas pueden administrarse óptimamente con un vehículo farmacéutico adecuado. La administración puede ser local o sistémica, incluyendo la aplicación oral, parenteral, intraperitoneal, intratecal o tópica. Los perfiles de liberación de tales formulaciones pueden ser de liberación rápida, liberación inmediata, liberación controlada o liberación sostenida. Por ejemplo, la formulación puede comprender una matriz de liberación sostenida y una cantidad terapéuticamente efectiva de una enzima que degrade a los glicosaminoglicanos. Alternativamente, las condroitinasas pueden ser secretadas por células genéticamente modificadas que se implantan, como tales o en una cápsula, en o cerca del sitio de la lesión del CNS.
La administración de condroitinasas y la promoción resultante de la recuperación funcional neurológica según esta descripción restaura las funciones motora, sensorial y autonómica, en grados variables, dependiendo de la respuesta de cada individuo tras una lesión contusiva o no en el sistema nervioso central.
Breve descripción de los dibujos
Para una comprensión más completa de la naturaleza y ventajas de la presente invención, debe hacerse referencia a la siguiente descripción detallada tomada en conexión con los dibujos que la acompañan, en los cuales:
La figura 1 es una ilustración gráfica de los volúmenes residuales de orina tras una lesión por contusión en la médula espinal.
La figura 2 es un gráfico de la velocidad de liberación de condroitinasa desde matrices de liberación sostenida.
La figura 3 es un gráfico de las puntuaciones BBB de ratas tras el tratamiento con condroitinasa ABCTipoI o penicilinasa o testigo tras una lesión por contusión en la médula espinal.
La figura 4 es un gráfico de las puntuaciones BBB de ratas tras el tratamiento con condroitinasa ABCTipoI o penicilinasa tras una lesión por contusión en la médula espinal.
La figura 5 es un gráfico de los cambios medios en el peso corporal tras la administración de dosis variables de condroitinasa.
La figura 6 es una ilustración gráfica del cambio medio en el peso por dosis en dosis variables de condroitinasa ABCTipoI.
La figura 7 es una ilustración gráfica del cambio medio en la temperatura por dosis en dosis variables de condroitinasa ABCTipoI.
La figura 8 es una ilustración gráfica del cambio en el peso en dosis repetidas y crecientes de condroitinasa ABCTipoI.
La figura 9 es una ilustración gráfica del cambio medio en la temperatura por dosis en dosis repetidas y crecientes de condroitinasa ABCTipoI.
Descripción detallada
Antes de describir las presentes composiciones y métodos se ha de entender que esta invención no está limitada a los procedimientos, composiciones o metodologías particulares descritas, ya que éstas pueden variar. También se ha de entender que la terminología usada en la descripción es sólo con el fin de describir las versiones o realizaciones particulares, y no se pretende que limite el alcance de la presente invención el cual estará sólo limitado por las reivindicaciones adjuntas.
También tiene que advertirse que cuando en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas se usan las formas singulares, uno(a)” y “el(la)” incluyen referencia al plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, referencia a “una enzima” es una referencia a una o más enzimas y sus equivalentes conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente. A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen los mismos significados que normalmente entiende un experto en la técnica. Aunque en la práctica o ensayo de las realizaciones de la presente invención puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria, ahora se describen los métodos, dispositivos y materiales preferidos. Nada en la presente memoria debe interpretarse como una admisión de que la invención no tiene derecho a preceder tal descripción en virtud de una invención anterior.
La presente descripción se dirige a una enzima tipo condroitinasa ABC para usar en la mejora de la recuperación funcional tras una lesión del CNS por contusión, típicamente provocada por un trauma o una enfermedad. En particular, la condroitinasa ABCTipoI o la condroitinasa ABCTipoII individualmente o en combinación, proporcionan un tratamiento terapéutico para las lesiones de la médula espinal. La frase “lesión por contusión” incluye, cuando se usa en la presente memoria, lesiones por enfermedad y traumáticas que pueden proceder de desgarros, moretones o aplastamiento de neuronas producidos por una lesión traumática, tal como un accidente de tráfico, una caída, o una herida de bala, así como otras lesiones traumáticas, o una lesión no traumática, o una compresión que puede ser provocada por fuentes internas o externas. La práctica de los métodos presentes conferirá beneficios clínicos al mamífero tratado, proporcionando mejoras clínicamente relevantes en al menos una de las funciones de coordinación motora, percepción sensorial, o autonómicas del sujeto. Las mejoras clínicamente relevantes pueden variar de una mejora detectable a una restauración completa de una función deteriorada o perdida del CNS.
En contraste con las lesiones “limpias” descritas por Bradbury, el modelo de lesión de la médula espinal por contusión produce una destrucción indiscriminada del tejido a través de una cascada de mecanismos de respuesta. Se produce experimentalmente una lesión por contusión aplicando una fuerza contundente a la médula espinal expuesta y se mimetiza lo más exactamente la lesión típica en un ser humano, proporcionando un estado más adecuado para el estudio de los procesos patofisiológicos tanto primarios como secundarios (Blight AR, 2000 Animal models of spinal cord injury. Top Spinal Cord Inj rehabil 6(2): 1-13; Kwon BK, Oxland TR, Tetzlaff W. (2002) Animal models used in spinal cord regeneration research. Spine 27(14):1504-10)). Tras el daño mecánico inmediato del tejido, el cual puede estirar y desgarrar axones de la materia blanca, sobreviene una destrucción más profunda y general del tejido. La barrera sangre-cerebro está comprometida y la médula espinal sufre una necrosis hemorrágica de la materia gris central que dispara cascadas inflamatorias y bioquímicas que dan lugar a un extenso daño secundario al tejido y a las células. En un período de días a semanas se forma una lesión cavitada en el lugar de la lesión que puede llenarse con células gliales reactivas, axones residuales, neovasculatura y una deposición de moléculas de la matriz extracelular. Las funciones sensorial, motora y autonómica pueden estar comprometidas. En comparación con la naturaleza relativamente “limpia” de una lesión por transección de la columna dorsal, una lesión por contusión produce una lesión mucho más complicada que implica el repertorio de mecanismos de respuesta y de reparación del tejido de la médula espinal y es apropiada para evaluar potenciales terapias que tengan como diana tanto la fase aguda como crónica de la lesión. Adicionalmente, las lesiones por contusión dan lugar a efectos secundarios que producen pérdida de tejido, cicatrices, formación de cavidades y semejantes. La lesión por contusión dispara una respuesta inmune más robusta en comparación con la lesión por transección, lo cual puede ser de consecuencias significativas para la lesión y la reparación (Hirschberg DL, Yoles E, Belkin M, Schwartz M. 1994).
El paradigma experimental en el cual evaluar una terapia potencial para la SCI tiene que situarse en el contexto cuando los resultados se trasponen a otros modelos de lesión de la médula espinal. El contraste entre anatomía y patofisiología de la lesión por transección de la columna dorsal y el modelo de contusión está extendido. Las lesiones por transección de la columna dorsal provocan daño a las neuronas que son más propensas a regenerarse y tienen funciones específicas dentro de los tractos sensoriales. Además, la lesión por transección conduce a un daño secundario mínimo del tejido. En contraste, la lesión por contusión daña los tractos tanto de los nervios sensoriales como motores, y las funciones sensoriales afectivas, motoras y autonómicas. Los tractos corticoespinales son bastante menos regenerables que las neuronas encontradas en las columnas dorsales. La lesión por contusión también conduce a daño secundario extenso del tejido que crea una lesión sustancialmente mayor que una lesión en la columna dorsal.
Después de una lesión de la médula espinal del CNS de un mamífero adulto, la incapacidad de los axones para regenerarse puede conducir a una parálisis permanente. El sitio de la lesión del CNS desarrolla una lesión o cicatriz glial por un aumento de la deposición de moléculas de la matriz extracelular por astrocitos y oligodendrocitos en el sitio de la lesión. Estas moléculas de la matriz extracelular incluyen CSPGs, las cuales se expresan mucho en áreas de cicatrización. Las CSPGs inhiben el crecimiento del tejido nervioso in vitro, y la regeneración del tejido nervioso en regiones ricas en CSPGs in vivo. Los sulfatos de condroitina A, B y C son las formas predominantes encontradas en mamíferos. Estas condroitinas pueden estar implicadas en la modulación de varias actividades biológicas que incluyen la diferenciación, adhesión, rutas enzimáticas e interacciones hormonales celulares. La presencia de proteoglicanos de sulfatos de condroitina es elevada en las etapas tardías del crecimiento celular en respuesta al daño en los tejidos y los vasos sanguíneos.
Los glicosaminoglicanos (GAGs), el sulfato de condroitina (CS) y el sulfato de dermatano (DS), son importantes componentes de los CSPGs. Son moléculas inhibidoras que contribuyen a la falta de regeneración del CNS en los mamíferos adultos, impidiendo el crecimiento axonal y neurítico. Sin embargo, los CSPGs son importantes en la guía y el patrón neuronal durante el desarrollo, más que durante la inhibición.
Los glicosaminoglicanos son polisacáridos no ramificados que constan de residuos alternantes de hexosamina y ácido hexurónico los cuales portan grupos sulfato en diferentes posiciones. Los GAGs se dividen típicamente en tres familias según la composición de la cadena principal de disacárido. Estos son: sulfato de heparina/heparano; sulfato de condroitina y sulfato de queratano. La familia de sulfatos de condroitina incluye varios subtipos designados sulfato de condroitina no sulfatado, sulfato de condroitina supersulfatado y sulfatos de condroitina A-E, los cuales varían en el número y posición de sus grupos funcionales sulfato. El sulfato de condroitina B también se denomina sulfato de dermatano y difiere en que el residuo predominante es el ácido idurónico en la posición alternativa del ácido hexurónico.
Ahora se ha encontrado que las enzimas que degradan a los CSPGs, tales como la condroitinasa ABCTipoI o la condroitinasa ABCTipoII son útiles para controlar y/o inhibir los efectos de los sulfatos de condroitina y para desarrollar terapias para el tratamiento de enfermedades. Los hallazgos descritos en la presente memoria son la primera descripción del tratamiento con condroitinasas de las lesiones por contusión que causa una mejora en la recuperación de la función neurológica, en particular de la función autonómica, tras una lesión por contusión de la médula espinal.
La condroitinasa AC y la condroitinasa B son enzimas tipo condroitina liasa, las cuales pueden derivarse de varias fuentes. En la descripción puede usarse cualquier condroitinasa AC o B, incluyendo, pero no limitándose a, condroitinasa AC (derivada de Flavobacterium heparinum; T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi, S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523 (1968)); condroitinasa AC II (derivada de Arthobacter aurescens; K. Hiyama, S. Okada, J. Biol. Chem., 250, 1824 (1975), K. Hiyama, S. Okada, J. Biochem. (Tokio, 80, 1201 (1976)); condroitinasa ACIII (derivada de Flavobacterium sp. Hp102; H. Miyazono, H. Kikuchi, K. Yoshida, K. Morikawa, K. Tokuyasu, Seikagaku, 61, 1023 (1989)); condroitinasa B (derivada de Flavobacterium heparinum; Y.M. Michelaaci, C.P. Dietrich, Biochem. Biophys. Res. Commun., 56, 973 (1974), V.M. Michelaaci, C.P. Dietrich, Biochem. J., 151, 121 (1975), K. Maeyama, A. Tawada, A. Ueno, K. Yoshida, Seikagaku, 57, 1189 (1985)); y condroitinasa B (derivada de Flavobacterium sp. Hp102; H. Miyazono, H. Kikuchi, K. Yoshida, K. Morikawa, K. Tokuyasu, Seikagaku, 61, 1023 (1989)). La condroitinasa AC y la condroitinasa B están comercialmente disponibles en Seikagaku America, Falmouth, Massachussets, EE.UU. Adicionalmente, las enzimas pueden producirse por los métodos descritos en la patente de EE.UU. nº 6.093.563 de Bennett et al. La condroitinasa ABCtipo I y la condroitinasa ABCTipoII son exo y endo-lipasas, respectivamente, las cuales escinden tanto al sulfato de condroitina como al de dermatano (Hamei et al., 1997). Se han identificado enzimas de mamíferos con actividad semejante a la condroitinasa.
La actividad de las enzimas condroitinasas puede estabilizarse mediante la adición de excipientes o por liofilización. Los agentes estabilizantes incluyen carbohidratos, aminoácidos, ácidos grasos y tensioactivos y son conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos incluyen carbohidratos tales como sacarosa, lactosa, manitol y dextrano; proteínas tales como albúmina y protamina; aminoácidos tales como arginina, glicina y treonina; tensioactivos tales como TWEEN® y PLURONIC®; sales tales como cloruro de calcio y fosfato de sodio; y lípidos tales como ácidos grasos, fosfolípidos y sales biliares. Los agentes estabilizantes se añaden en general a la proteína en una relación de 1:20 a 4:1, carbohidratos a proteína, aminoácidos a proteína, proteína estabilizante a proteína y sales a proteína; 1:1000 a 1:20, tensioactivo a proteína; y 1:20 a 4:1, lípidos a proteína. Otros agentes estabilizantes incluyen altas concentraciones de sulfato de amonio, acetato de sodio o sulfato de sodio, basados en estudios comparativos con actividad heparinasa. Los agentes estabilizantes, preferiblemente el sulfato de amonio u otra sal similar, se añaden a la enzima en una relación de 0,1 a 4,0 mg de sulfato de amonio/IU de enzima.
La condroitinasa puede administrarse local o sistémicamente. Tal administración incluye la administración oral, parenteral, entérica, intraperitoneal, intratecal, por inhalación o tópica. Las formas preferidas de administración incluyen la intravenosa, subcutánea, intratecalmente, intradérmica, intramuscular, internodal, intracutánea o percutánea. Para un mayor control de la aplicación puede ser preferible la administración tópica o local.
Las condroitinasas, solas o en combinación, pueden mezclarse con un vehículo farmacéutico apropiado antes de la administración. Ejemplos de vehículos y aditivos farmacéuticos usados en general son diluyentes, ligantes, lubricantes, agentes colorantes, agentes desintegrantes, agentes amortiguadores del pH, ácidos grasos isotonizantes, agentes isotonizantes, conservantes, anestésicos, tensioactivos y semejantes, y son conocidos por los expertos en la técnica. Vehículos específicamente farmacéuticos que pueden usarse son dextrano, sacarosa, lactosa, maltosa, xilosa, trehalosa, manitol, xilitol, sorbitol, inositol, albúmina de suero, gelatina, creatinina, polietilenglicol, tensioactivos no iónicos (por ejemplo, ésteres polioxietilenados de ácidos grasos y sorbitán, aceite de ricino polioxietilenado endurecido, ésteres de ácidos grasos de sacarosa, polipropilenglicol polioxietilenado) y compuestos similares. Los vehículos farmacéuticos también pueden usarse en combinación, tal como polietilenglicol y/o sacarosa, o ésteres de ácidos grasos y sorbitán polioxietilenados, monooleato de sorbitán polioxietilenado (20 moles de óxido de etileno) son particularmente preferidos.
Los perfiles de liberación de tales formulaciones pueden ser de liberación rápida, inmediata, controlada o sostenida. En particular, las formulaciones de condroitinasa ABCTipoI o ABCTipoII pueden usarse para mejorar o recuperar la función neurológica, incluyendo la función autonómica. Tal formulación da lugar a una liberación sostenida y controlada de la enzima en el sistema tal que los CSPGs son degradados. La degradación de los CSPGs puede ocurrir en el sitio del daño, cavidad o lesión o puede ocurrir en sitios dentro del CNS aguas arriba o aguas debajo de la lesión.
El régimen de tratamiento según la invención puede llevarse a cabo mediante un medio de administrar condroitinasa ABCTipoI o ABCTipoII al CNS, y más preferiblemente a las lesiones del área lesionada del CNS. El modo y la cadencia de administración, y la dosificación se llevan a cabo tal que la recuperación funcional de la discapacidad del CNS se potencie mediante la promoción de la extensión de las neuritas. Los tratamientos de la presente descripción suministran una cantidad efectiva de condroitinasa ABCTipoI o ABCTipoII. La expresión “cantidad efectiva” quiere decir una cantidad suficiente para degradar a los CSPGs del área lesionada de la médula espinal o dentro del CNS o una cantidad suficiente para restaurar, totalmente o en parte, la función motora, sensorial o autonómica del mamífero. Por ejemplo, una cantidad efectiva de enzima puede ser de aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del paciente. La cantidad efectiva de condroitinasa puede administrarse en una dosis única, en dos dosis o en una pluralidad de dosificaciones. Aunque se ha de entender que la dosificación puede administrarse en cualquier momento, en una realización la dosificación se administra antes de 12 horas después de la lesión, o tan pronto como sea factible. En otra realización, la dosificación se administra a un mamífero lesionado en una, dos o en una pluralidad de dosificaciones; tales dosificaciones dependerían de la gravedad de la lesión y de la cantidad de CSPGs presente en la cicatrización glial. Cuando se administran una pluralidad de dosificaciones, pueden administrarse diaria, semanal o quincenalmente. El suministro de las dosificaciones puede ser por medio de un catéter o de una jeringa. Alternativamente, el tratamiento puede administrarse durante una cirugía para permitir la aplicación directa a la cicatriz glial.
Una vez que se han aplicado las condroitinasas, la degradación de los CSPGs elimina las moléculas inhibidoras que bloquean la extensión de las neuritas y permite la regeneración de las neuritas en el área afectada. La administración de condroitinasas también puede degradar los CSPGs en el CNS distante del área afectada, incluyendo aguas arriba y debajo de la lesión. La condroitinasa ABCTipoI o ABCTipoII son exo- y endo-liasas que escinden tanto a CS como a DS. La eliminación de CS y DS de la cicatriz glial permite la regeneración de extensiones de neuritas en el área lesionada.
La regeneración de las células nerviosas en el área del CNS afectada permite el retorno de la función motora, sensorial y autonómica. La mejora clínicamente relevante variará de una mejora detectable a una restauración completa de una función nerviosa perdida o deteriorada, variando con los pacientes y lesiones individuales.
La práctica de la invención, que incluye sus aspectos y realizaciones preferidas adicionales, se entenderá más completamente a partir de los siguientes ejemplos, los cuales se presentan sólo a modo de ilustración y no debe interpretarse que limiten la invención de ninguna forma.
Ejemplo 1
La condroitinasa mejora las funciones autonómicas tras una lesión de la médula espinal en roedores
Se completó un estudio de la función autonómica tras una lesión por contusión de la médula espinal en ratas con el uso de condroitinasa en el centro de modelos animales Acorda. Los animales (n = 38) se sometieron a un modelo establecido de SCI (Gruner et al., 1996). Comenzando inmediatamente tras la SCI, 19 animales se trataron con condroitinasa ABC 1 (Seikagaku; número de catálogo 100332, número de lote E02201) intratecalmente (i.t.) con 0,06 unidades por rata por dosis en fluido cerebroespinal artificial, un día sí y otro no durante dos semanas. Los otros 19 animales se trataron con una proteína enzimática (penicilinasa – Sigma; número de catálogo P4524) en un vehículo.
A los animales se les indujo, y se les mantuvo en él, un estado de anestesia quirúrgica con isoflurano al 1,5% portado en una mezcla de aire calidad médica (oxígeno 95%, CO2 5%). Antes de la operación se dio una dosis inicial de cefazolina (50 mg/kg, s.c.). Durante la cirugía, los animales fueron colocados en una almohadilla calefactora para mantener la temperatura corporal, y se monitorizaron el pulso, SpO2 y la temperatura. Se realizó una laminectomía de las vértebras espinales T9 y T10. Se hizo una laminectomía parcial en la articulación T13/L1 para la colocación de un catéter intratecal. Se hizo una incisión en la duramadre con una aguja hipodérmica. Se insertó un catéter de calibre 32 (ReCathCo., LLC, CS132G, número de lote 20422) a través de la incisión dural y se alimentó rostralmente para que se posicionara inmediatamente caudal a la laminectomía T9/T10. El catéter se aseguró al hueso y al músculo con pegamento de cianoacrilato y suturas. Las paletas de un fórceps modificado articulado por deslizamiento (4 mm de anchura x 0,5 mm de espesor) se insertaron en el canal espinal entre los aspectos laterales de la médula espinal y las vértebras en la laminectomía rostral. Se indujo una SCI comprimiendo la médula espinal entre las paletas del fórceps durante un período de 15 segundos. El grado de gravedad de la lesión se indujo usando un fórceps que comprime la médula espinal hasta una distancia de 0,3 mm (lesión moderada). La duramadre sobre la lesión permaneció intacta. Los fórceps se separaron y el sitio de la lesión se lavó con disolución salina. Las capas musculares superpuestas se suturaron conjuntamente y la herida de la piel se cerró con grapas. Después de la operación, a los animales se les dio un bolo inmediato de 5 mL de disolución salina de Ringer lactada seguido por una segunda administración de 5 mL de disolución salina de Ringer lactada después de unas pocas horas.
Inmediatamente después de la cirugía y uno de cada dos días, los animales fueron anestesiados con isoflurano y se inyectaron en el catéter intratecal el agente experimental (condroitinasa ABC I) o el testigo (Penicilinasa) como se describe a continuación. El volumen inyectado fue 3 microlitros, seguido por un lavado con 4 microlitros de fluido cerebroespinal artificial (aCSF).
Regímenes de tratamiento:
1.
Chase ABC I - Condroitinasa ABC I (Seikagaku) 0,06 U/dosis, i.t. en 3 microlitros de aCSF.
2.
Penicilinasa – Penicilinasa (Sigma), 3 microlitros, i.t. a razón de 228 microgramos por mililitro.
Análisis de los resultados:
Las vejigas urinarias se exprimieron manualmente al menos dos veces por día y se registraron los volúmenes urinarios. Los volúmenes urinarios fueron en todos los grupos aproximadamente 2,7 mililitros durante los primeros 4 días tras la lesión. Los volúmenes urinarios en el grupo tratado con penicilinasa alcanzaron volúmenes máximos de 11 mililitros retornando a entre 6 y 8 mililitros por día en aproximadamente 3 semanas después de la lesión. Los volúmenes urinarios en el grupo tratado con condroitinasa alcanzaron volúmenes diarios máximos de 6 mililitros retornando a aproximadamente 2 mililitros en 3 semanas. Véase la figura 1 para una representación gráfica de los volúmenes urinarios medios residuales del grupo con lesión moderada en ratas tratadas con condroitinasa y penicilinasa. Este sistema está bien aceptado en el campo para la evaluación de la recuperación de la función autonómica tras una lesión de la médula espinal en rata.
Estos resultados demuestran el uso potencial de una enzima tipo condroitinasa para la recuperación de la función autonómica tras una lesión de la médula espinal. El modelo de lesión de la médula espinal y el sistema de análisis conductual están bien aceptados en el campo y se cree que son los más relevantes para la mayoría de las lesiones de la médula espinal en el ser humano.
Ejemplo 2
Formulaciones de condroitinasa de liberación sostenida
El desarrollo de una tecnología de suministro de la enzima condroitinasa mediante liberación sostenida permite que la condroitinasa se administre en cualquier momento tras una SCI, durante una duración dada. Un sistema ideal de liberación sostenida de la condroitinasa es uno que no sólo permite una liberación prolongada del ingrediente activo, sino uno que es práctico para usar en el contexto de una SCI. Como mínimo, los criterios de diseño incluyen la biocompatibilidad del dispositivo en el CNS, la retención de la actividad catalítica de la condroitinasa y una cinética apropiada de liberación de la condroitinasa. Preferiblemente, el sistema está en forma de una película fina que se aplica al sitio de la SCI o en forma de un sistema de polimerización que se aplica al sitio, polimeriza en contacto con la médula espinal y luego permanece en el lugar a lo largo del curso del período de tratamiento. El sistema es flexible para que la introducción en la SCI no conduzca a un trauma adicional en forma de compresión.
Durante los últimos años los avances en los sistemas biodegradables de liberación de fármacos han dado lugar a una variedad de candidatos con matrices viables. La selección del sistema ideal depende de una evaluación bioquímica y práctica. En general, estos sistemas capturan el agente activo en una matriz que se mantiene junta en una fase uniforme por medio de la formación de reticulaciones covalentes, una matriz cristalina, una emulsión o una transición de fase. El material de la matriz es un sistema biológico o un polímero sintético. Ejemplos de los sistemas candidatos incluyen matrices biológicas como pegamento de fibrina, colágeno y alginato y ejemplos de matrices sintéticas incluyen poli(ácido láctico/ácido glicólico), pluronic y etileno vinil acetato. Se ha de entender que las formulaciones de liberación sostenida de la presente memoria no son sólo adecuadas para usar en el tratamiento de las lesiones del CNS por contusiones sino que también son adecuadas para usar en el tratamiento de otras lesiones y trastornos del CNS.
Las enzimas Chase recombinantes desarrolladas pueden cargarse en una variedad de matrices SR, que incluyen, pero no se limitan a, pegamento de fibrina, colágeno, alginato, poli(ácido láctico/ácido glicólico), pluronic y etileno vinil acetato. Pueden usarse polímeros tanto naturales como sintéticos. Los polímeros sintéticos tienen la ventaja de una formulación precisa y propiedades de liberación predecibles, mientras que las preparaciones con polímeros naturales pueden tener una mayor biocompatibilidad. Cada tipo de sistema basado en polímeros tiene propiedades únicas y los métodos para generar películas o geles impregnados con Chase para cada tipo se describen a continuación.
Geles de colágeno: el colágeno ha sido usado como biomaterial en dispositivos médicos durante décadas debido a su facilidad de preparación y su biocompatibilidad. El colágeno se encuentra en dispositivos médicos aprobados tales como hemostatos, geles para aumentar los tejidos, sustitutos de los huesos para injertos, sellantes y una variedad de productos para la curación de las heridas. El colágeno usado con fines biomédicos es típicamente colágeno fibrilar tipo I aislado de tendones de bovino. Se puede conformar en una variedad de formas que incluyen geles, películas y fibras. Los geles de colágeno pueden formarse a partir de colágeno tipo I de roedores. Los métodos de formación de geles de colágeno han sido usados rutinariamente durante muchos años. El colágeno en un ácido diluido se combina con una disolución de Chase en un tampón a pH fisiológico. Cuando se neutraliza y se calienta, las fibrillas de colágeno tipo I coalescen en conjuntos desordenados para crear un gel. La densidad de reticulación de los geles resultantes puede controlarse variando la concentración de colágeno.
Pegamento de fibrina: el pegamento de fibrina es un producto derivado de la sangre que ha sido usado clínicamente en Europa durante muchos años como hemostato o sellante. El pegamento de fibrina consiste en dos componentes que se combinan para formar un gel. El primer constituyente es fibrinógeno el cual es la proteína principal implicada en la coagulación. El fibrinógeno se combina con la trombina para recapitular la etapa final de la cascada de la coagulación. La trombina es una serina proteasa que actúa sobre el fibrinógeno para exponer sus terminales reactivos que impulsan la polimerización del fibrinógeno para dar una red fibrosa llamada fibrina. Chase puede combinarse con una disolución de fibrinógeno y a continuación polimerizarse mediante la adición de trombina.
Alginato: el alginato es un carbohidrato de gran peso molecular aislado de algas marinas. En su mayor parte se usa con frecuencia como aditivo en alimentos y cosméticos. Su seguridad y biocompatibilidad han dado lugar a su uso en productos para la curación de las heridas. También se usa en preparaciones experimentales para la microencapsulación de células o isletas pancreáticas. El alginato es particularmente versátil porque puede formarse en una variedad de formas y se conforma vía reticulación iónica con cationes divalentes tales como el calcio. La densidad de reticulación puede controlarse pro la concentración de calcio y alginato y los geles resultantes son estables durante largos períodos de tiempo in vivo. Puede usarse una disolución de Chase y alginato para formar películas tras la adición de calcio.
PLA/PLG: los polímeros o copolímeros de poli(ácido láctico) y poli(ácido glicólico) son poliésteres hidrolíticamente inestables usados en suturas y otros dispositivos médicos biodegradables implantables. PLA/PLG también han sido usados para crear microcápsulas para la administración de fármacos. Hay varios métodos disponibles para crear sistemas de liberación sostenida con estos polímeros. Por ejemplo, puede usarse un sistema de intercambio de disolventes en el que los polímeros de PSA/PLG están disueltos en N-metil-pirrolidona.
Pluronic: Los Pluronics son polímeros hidrófilos que experimentan una transición de fase reversible. Las disoluciones de Pluronic son líquidos viscosos a bajas temperaturas y luego experimentan una transición de fase líquida a sólida cuando se desplazan a temperaturas más calientes. Los Pluronics han sido usados en una variedad de aplicaciones biomédicas en las que es deseable inyectar o pulverizar un líquido en un tejido y que luego el líquido solidifique para dar una película. Los Pluronics pueden disolverse en los tampones acuosos que contengan Chase. Pueden crearse películas moldeando geles en placas de cultivo de tejidos que se calientan en un incubador para promover la transición de fases inversa y la formación de la película.
Etileno vinil acetato: el etileno vinil acetato (EVA) es representativo de polímeros usados para fabricar implantes biocompatibles no degradables. EVA es soluble en ciertos disolventes orgánicos tales como cloruro de metileno. Puede añadirse Chase en un tampón acuoso ala disolución de EVA con agitación para crear una emulsión. El disolvente orgánico puede evaporarse a continuación de la disolución lo cual impulsa la formación de una matriz semicristalina de polímero impregnada con Chase. Este método puede usarse para fabricar una gama de densidades de reticulación.
Ejemplo 3
Formulaciones de condroitinasa ABCTipoI de liberación sostenida
En un estudio, la condroitinasa ABCTipoI se formuló en tres matrices de liberación sostenida: DurasealTM I (disponible en Confluent Surgical), DurasealTM II (disponible en Confluent Surgical) y Spray Gel. DurasealTM es un hidrogel magnificado. Spay Gel es una espuma de gel basada en colágeno. La liberación se monitorizó midiendo la liberación de condroitinasa de las matrices con el tiempo. Los resultados se ilustran en la figura 2. Los resultados demuestran que la condroitinasa se libera de una matriz de liberación sostenida con el tiempo y puede formularse en una formulación de liberación sostenida.
Ejemplo 4
La condroitinasa ABCTipoI mejora la función neurológica tras una lesión por contusión de la médula espinal en roedores
Se completó un estudio del tratamiento con condroitinasa ABCTipoI de una lesión por contusión en ratas en el centro de modelos animales Acorda. Los animales (n = 30) se sometieron a un modelo establecido de SCI (Gruner et al., 1996). Comenzando inmediatamente tras la SCI, diez animales se trataron con condroitinasa ABC 1 (Seikagaku; número de catálogo 100332, número de lote E02201) intratecalmente (i.t.) con 0,06 unidades por rata por dosis en fluido cerebroespinal artificial, cada día durante una semana y luego en días alternos durante una semana. Otros diez animales recibieron proteína enzimática (penicilinasa – Sigma; número de catálogo P4524) y otros diez animales recibieron un vehículo como testigo (fluido cerebroespinal artificial – Harvard Apparatus; número de catálogo 59-7316). Los animales fueron evaluados mediante el ensayo conductual de campo abierto durante un período de 12 a 16 semanas.
A los animales se les indujo, y se les mantuvo en él, un estado de anestesia quirúrgica con isoflurano al 1,5% portado en una mezcla de aire calidad médica (oxígeno 95%, CO2 5%). Antes de la operación se dio una dosis inicial de Baytril (25 mg/kg). Durante la cirugía, los animales fueron colocados en una almohadilla calefactora para ayudar a mantener la temperatura corporal, y se monitorizaron el pulso, SpO2 y la temperatura de los animales. Se realizó una laminectomía de las vértebras espinales T9 y T10. Se hizo una laminectomía parcial en la articulación T13/L1 para la colocación de un catéter intratecal. Se hizo una incisión en la duramadre con una aguja hipodérmica. Se insertó un catéter (Harvard Apparatus) a través de la incisión dural y se alimentó rostralmente para que se posicionara inmediatamente caudal a la laminectomía T9/T10. El catéter se aseguró al hueso y al músculo con pegamento de cianoacrilato y suturas. Las paletas de un fórceps modificado articulado por deslizamiento (4 mm de anchura x 0,5 mm de espesor) se insertaron en el canal espinal entre los aspectos laterales de la médula espinal y las vértebras en la laminectomía rostral. Se indujo una SCI comprimiendo la médula espinal entre las paletas del fórceps durante un período de 15 segundos. Los fórceps se diseñaron para comprimir la médula espinal hasta una distancia de 0,9 mm. Los fórceps se separaron y el sitio de la lesión se lavó con disolución salina. Las capas musculares superpuestas se suturaron conjuntamente y la herida de la piel se cerró con grapas. Después de la operación, a los animales se les dio un bolo inmediato de 5 mL de disolución salina de Ringer lactada seguido por una segunda administración de 5 mL de disolución salina de Ringer lactada después de unas pocas horas.
Inmediatamente después de la cirugía y luego cada día durante 1 semana y después en días alternos durante una semana, los animales fueron anestesiados con isoflurano y se inyectaron en el catéter intratecal el agente experimental o el testigo ((condroitinasa ABC I, penicilinasa o aCSF) como se describe a continuación. El volumen inyectado fue 6 microlitros, seguido por un lavado con 6 microlitros de fluido cerebroespinal artificial.
Regímenes de tratamiento:
1.
Chase ABC I - Condroitinasa ABC I (Seikagaku) 0,06 U/dosis, i.t. en 6 microlitros de aCSF.
2.
Penicilinasa – Penicilinasa (Sigma), 6 microlitros, i.t. a razón de 124 microgramos por mililitro.
3.
aCSF – Fluido cerebroespinal artificial (Harvard Apparatus), 6 microlitros, i.t.
Análisis conductual:
A las 48 horas y luego semanalmente después de la lesión se observó y se puntuó la actividad locomotora en campo abierto según el sistema de puntuación de Basso, Beattie y Bresnahan (BBB) (Basso et al., 1995). Este sistema está bien aceptado en el campo para la evaluación de la recuperación de la función locomotora tras una lesión de la médula espinal en ratas.
Resultados: hubo una tasa de mortalidad de 40% uniformemente distribuida a lo largo de todos los grupos de tratamiento que fue debida a la caracterización y a sucesos adversos asociados con la gravedad de la lesión. Los animales que fueron tratados con penicilinasa o con aCSF recuperaron la función con una puntuación BBB promedio de aproximadamente 4 (n = 11). Los animales que fueron tratados con condroitinasa ABC I (n = 7) recuperaron la función con una puntuación BBB promedio de aproximadamente 8. El grupo tratado con condroitinasa ABC I fue significativamente diferente de ambos grupos según un análisis ANOVA y post-hoc de Tukey (p < 0,01). Véase la figura 3 que ilustra las puntuaciones BBB de ratas tras una lesión contusiva en la médula espinal con administración de aCSF, penicilinasa o condroitinasa ABC I.
Estos resultados demuestran el uso potencial de una enzima tipo condroitinasa para el tratamiento de una lesión contusiva en la médula espinal. El modelo de lesión de la médula espinal y el sistema de análisis conductual están bien aceptados en el campo y se cree que son los más relevantes para la mayoría de las lesiones de la médula espinal en el ser humano. Estos resultados no podrían haber sido anticipados por los resultados publicados de condroitinasa in vitro o por los resultados de modelos de lesión por transección de la médula espinal.
Ejemplo 5
La condroitinasa ABCTipoI mejora la función neurológica tras una lesión por contusión de la médula espinal en roedores
Se completó un estudio de tratamiento con condroitinasa ABCTipoI de una lesión por contusión en ratas en el centro de modelos animales Acorda. Los animales (n = 38) se sometieron a un modelo establecido de SCI (Gruner et al., 1996). Comenzando inmediatamente tras la SCI, 19 animales se trataron con condroitinasa ABC I (Seikagaku; número de catálogo 100332, número de lote E02201) intratecalmente (i.t.) con 0,06 unidades por rata por dosis en fluido cerebroespinal artificial, una día sí y otro no durante dos semanas. Los otros 19 animales se trataron con proteína enzimática (penicilinasa – Sigma; número de catálogo P4524) en un vehículo. Los animales fueron evaluados mediante el ensayo conductual de campo abierto durante un período de 10 semanas.
A los animales se les indujo, y se les mantuvo en él, un estado de anestesia quirúrgica con isoflurano al 1,5% portado en una mezcla de aire calidad médica (oxígeno 95%, CO2 5%). Antes de la operación se dio una dosis inicial de cefazolina (50 mg/kg, s.c.). Durante la cirugía, los animales fueron colocados en una almohadilla calefactora para mantener la temperatura corporal, y se monitorizaron el pulso, SpO2 y la temperatura. Se realizó una laminectomía de las vértebras espinales T9 y T10. Se hizo una laminectomía parcial en la articulación T13/L1 para la colocación de un catéter intratecal. Se hizo una incisión en la duramadre con una aguja hipodérmica. Se insertó un catéter de calibre 32 (ReCathCo., LLC, CS132G, número de lote 20422) a través de la incisión dural y se alimentó rostralmente para que se posicionara inmediatamente caudal a la laminectomía T9/T10. El catéter se aseguró al hueso y al músculo con pegamento de cianoacrilato y suturas. Las paletas de un fórceps modificado articulado por deslizamiento (4 mm de anchura x 0,5 mm de espesor) se insertaron en el canal espinal entre los aspectos laterales de la médula espinal y las vértebras en la laminectomía rostral. Se indujo una SCI comprimiendo la médula espinal entre las paletas del fórceps durante un período de 15 segundos. El grado de gravedad de la lesión se indujo usando
un fórceps que comprime la médula espinal hasta una distancia de 0,9 mm (lesión moderada). La duramadre sobre la lesión permaneció intacta. Los fórceps se separaron y el sitio de la lesión se lavó con disolución salina. Las capas musculares superpuestas se suturaron conjuntamente y la herida de la piel se cerró con grapas. Después de la operación, a los animales se les dio un bolo inmediato de 5 mL de disolución salina de Ringer lactada seguido por una segunda administración de 5 mL de disolución salina de Ringer lactada después de unas pocas horas.
Inmediatamente después de la cirugía y luego uno de cada dos días durante 2 semanas, los animales fueron anestesiados con isoflurano y se inyectaron en el catéter intratecal el agente experimental (condroitinasa ABC I) o el testigo (Penicilinasa) como se describe a continuación. El volumen inyectado fue 3 microlitros, seguido por un lavado con 4 microlitros de fluido cerebroespinal artificial.
Regímenes de tratamiento:
1.
Chase ABC I - Condroitinasa ABC I (Seikagaku) 0,06 U/dosis, i.t. en 3 microlitros de aCSF.
2.
Penicilinasa – Penicilinasa (Sigma), 3 microlitros, i.t. a razón de 228 microgramos por mililitro.
Análisis conductual: a las 48 horas y luego semanalmente después de la lesión se observó y se puntuó la actividad locomotora en campo abierto según el sistema de puntuación de Basso, Beattie y Bresnahan (BBB) (Basso et al., 1995). Este sistema está bien aceptado en el campo para la evaluación de la recuperación de la función locomotora tras una lesión de la médula espinal en ratas.
Resultados: se enrolaron 37 animales, 19 por grupo de tratamiento en la lesión de 0,9 mm con fórceps. La muerte de animales fue aproximadamente igual entre todos los grupos de tratamiento. De los animales que murieron, más que el 190% tuvieron infecciones en el tracto urinario. Un animal con lesión de 0,9 mm con fórceps tratado con penicilinasa se separó de las puntuaciones ya que no se recuperó por encima de un BBB de 3 o fue extremadamente errático. 4 animales adicionales (2 tratados con penicilinasa y 2 con condroitinasa) se separaron debido a temblores y disquinesias. La separación de estos animales dio lugar a un número de animales en cada grupo de 0,9 mm de 12.
Fórceps de 0,9 mm (lesión moderada). Los animales que fueron tratados con penicilinasa como testigo recuperaron la función hasta una puntuación BBB de 7,1 ± 0,36 (media ± SEM) (n = 12= a las diez semanas tras la operación. Las puntuaciones BBB media de los animales tratados con condroitinasa ABC I (n = 12) fueron significativamente mayores a las 10 semanas con una puntuación media de 0,1 ± 0,64 (p < 0,01). Las puntuaciones de cada grupo después de alcanzar la mesera a las 4 semanas fueron también significativamente diferentes por ANOVA (p < 0,001). Véase la figura 4 que ilustra las puntuaciones BBB de los animales tratados con condroitinasa y con testigo tras una SCI contusiva moderada.
Se ha mostrado que la condroitinasa mejora la función y promueve la regeneración en la hemisección dorsal en un modelo de DCI de grave compresión con fórceps. El presente estudio confirma el resultado del estudio de compresión con fórceps así como demuestra que la condroitinasa es efectiva para mejorar la función locomotora hasta niveles de lesión más moderados. El estudio de lesión moderada mostró una mejora significativa en la actividad locomotora en campo abierto con el tratamiento con condroitinasa.
Ejemplo 6
Distribución y toxicidad aguda de condroitinasa ABCTipoI
Ratas Long Evans hembra de Charles River Laboratories, que pesaban aproximadamente 210 gramos se enjaularon en el centro de cuidado de animales Acorda durante 5 días antes de la inyección para asegurar su salud y la estabilidad de su peso. Las ratas se anestesiaron con isoflurano y se les inyectó i.v. condroitinasa ABC I de Acorda (ABC I lote 3) vía las venas de la cola. A los animales se les inyectó 0, 0,2, 0,775 ó 7,775 mg/kg con disoluciones que contenían 0, 0,2, 0,775 y 7,775 mg/mL, respectivamente, en una disolución salina equilibrada de Hank como se muestra en la tabla 1.
Animal
mg/kg Peso Dosis Volumen Supervivencia Fecha del sacrificio
2
0 242 0 0,25 24 Miércoles 3/9/2003
9
0 243 0 0,25 24 Miércoles 3/9/2003
10
0 238 0 0,25 24 Miércoles 3/9/2003
12
0 252 0 0,25 7D Martes 9/9/2003
14
0 247 0 0,25 7D Martes 9/9/2003
18
0 244 0 0,25 7D Martes 9/9/2003
5
0,2 237 0,0474 0,275581 24 Miércoles 3/9/2003
8
0,2 225 0,045 0,261628 24 Miércoles 3/9/2003
11
0,2 237 0,0474 0,275581 24 Miércoles 3/9/2003
13
0,2 235 0,047 0,273256 7D Martes 9/9/2003
16
0,2 237 0,0474 0,275581 7D Martes 9/9/2003
19
0,2 237 0,0474 0,275581 7D Martes 9/9/2003
3
0,75 221 0,16575 0,221 24 Miércoles 3/9/2003
4
0,75 223 0,16575 0,223 24 Miércoles 3/9/2003
17
0,75 225 0,16875 0,225 24 Miércoles 3/9/2003
20
0,75 223 0,16825 0,223 7D Martes 9/9/2003
21
0,75 225 0,16875 0,225 7D Martes 9/9/2003
24
0,75 225 0,16875 0,225 7D Martes 9/9/2003
11
7,75 219 1,69725 0,219 24 Miércoles 3/9/2003
6
7,75 218 1,6895 0,218 24 Miércoles 3/9/2003
7
7,75 203 1,57325 0,203 24 Miércoles 3/9/2003
15
7,75 212 1,643 0,212 7D Martes 9/9/2003
22
7,75 216 1,674 0,216 7D Martes 9/9/2003
23
7,75 218 1,6895 0,218 7D Martes 9/9/2003
Los animales fueron devueltos a sus jaulas y se monitorizaron respecto al dolor y a la angustia. Los pesos de tomaron diariamente.
La mitad de los animales fueron sacrificados a las 24 horas después de la inyección. El cerebro, la médula espinal,
5 el corazón, el hígado, los riñones y la sangre se separaron y se congelaron rápidamente en isopentano a -40ºC para la evaluación de la distribución enzimática y para histopatología. Los animales restantes se observaron durante 7 días y luego se sacrificaron y procesaron como con el grupo que sobrevivió 24 horas.
Los tejidos se bloquearon y crioseccionaron en porciones de 20 !m de espesor. Las secciones se lavaron brevemente en disolución salina tamponada con fosfatos 0,1 M (PBS) y luego se fijaron durante 10 minutos en una 10 disolución fijadora de etanol, formalina y ácido acético (66, 4 y 5% en volumen, respectivamente). Los tejidos se lavaron y bloquearon en una disolución de suero normal al 10% (que contenía suero de rata normal al 2% y suero de burro normal al 8%) en PBS 0,1 M pH 7,4. Las secciones se incubaron durante toda la noche en un anticuerpo anticondroitinasa ABC I (nº 8429). El tejido se evaluó por inmunohistoquímica y manchas western de homogeneizados de tejido con un anticuerpo anti-condroitinasa y uno que reconocía a los condroitina sulfato proteoglicanos digeridos.
15 Resultados: no se observó ninguna reacción evidente durante o inmediatamente después de la inyección. No se advirtió hinchamiento, inflamación, moretones o necrosis en el sitio de la inyección. No se advirtió ninguna alteración en la alimentación, aseo o vocalizaciones. Los animales fueron evaluados respecto a su comportamiento motor en una piscina abierta. Los cuidadores de los animales o los especialistas de la conducta no advirtieron ninguna anormalidad. Los animales mostraron signos de sensibilidad o hinchamiento de las articulaciones.
20 Los animales se pesaron cada día antes y después de las inyecciones. Los cambios medios de peso corporal se ilustran en la figura 5. No hubo diferencias significativas en el cambio de peso entre los grupos de tratamiento. Todos los grupos perdieron entre 0 y 6,667 gramos en las 24 horas siguientes a la inyección. El grupo testigo con vehículo perdió peso a las 24 horas. Todos los grupos de tratamiento ganaron peso en cada día sucesivo.
Ejemplo 7
Toxicidad intratecal con una única dosis de condroitinasa ABCTipoI
Se colocaron catéteres intratecales en 16 ratas hembra normales no lesionadas en aproximadamente la articulación vertebral T13/L1 para administrar condroitinasa. Los catéteres se introdujeron rostralmente para que descansaran en el nivel T9/T10 para simular los estudios previos con condroitinasa. Veinticuatro horas después de la colocación de los catéteres intratecales, se administró a los animales 0, 0,06, 0,6 ó 6 unidades de condroitinasa ABC I de Acorda (100 unidades/miligramo) en 20 microlitros de fluido cerebroespinal artificial en un período de 20 minutos. Estas dosis se escogieron de 0, 1, 10 y 100 veces la dosis usada en los ejemplos 1, 4 y 5. Se observó a los animales durante 24 horas ó 7 días y se siguieron sus pesos y temperaturas.
No se vio ninguna reacción evidente en ninguna rata. Como se ilustra en las figuras 6 y 7, no se advirtió ninguna diferencia significativa en el peso o la temperatura entre los grupos, respectivamente. La condroitinasa parece segura en dosis intratecales (I.T.) únicas de hasta 100 veces las dosis usadas en los estudios previos.
Ejemplo 8
Estudio de toxicidad intratecal con dosis repetidas y crecientes de condroitinasa ABCTipoI
Se colocaron catéteres intratecales en cinco ratas hembra adultas Long Evans. Las ratas fueron anestesiadas, los músculos se separaron de las vértebras y se realizó una pequeña laminectomía en aproximadamente la articulación T13/L1. Se colocaron catéteres intratecales de 1,4 mm de longitud para que sus puntas finalizaran en el nivel T9/T10. Las ratas fueron anestesiadas con isoflurano y se les administró vehículo (aCSF), y dosis repetidas o crecientes de condroitinasa ABC I. Las dosis repetidas fueron 0,6 unidades ó 10 veces la dosis eficaz de los estudios previos. Las dosis crecientes fueron: 0,6, 1,2, 2,4, 4,8, 9,6 y 19,2 unidades. Se monitorizaron los cambios de peso y de temperatura, la toxicidad evidente y los cambios conductuales de las ratas.
Las ratas tratadas con dosis repetidas o crecientes de condroitinasa ABC I ganaron ligeramente más peso que las tratadas con vehículo. Los efectos adversos estuvieron uniformemente distribuidos entre las ratas tratadas con vehículo, dosis repetidas y dosis crecientes. Los sucesos adversos incluyeron letargia y caída de la cola y usualmente ocurrieron en el día de la anestesia o administración. En la figura 8 se muestra un gráfico de dispersión del cambio de peso y en la figura 9 se muestra el cambio de temperatura durante el régimen de dosificación. En ambas figuras, dos pesos diarios se representan con relación a la primera dosis. La cadencia de dosis está indicada con las flechas.
Ejemplo 9
La condroitinasa mejora la función neurológica en una lesión crónica por contusión de la médula espinal
Los individuos que tienen lesiones en el CNS recuperan cierto grado de función neurológica y entonces entran en una fase crónica de la lesión en la que se produce una mejora limitada. Con la excepción de los ejemplos de la presente memoria descriptiva, todos los estudios hasta la fecha con condroitinasa han sido realizados en animales inmediatamente después de lesiones de transección de la médula espinal. En el ejemplo, la condroitinasa ABCTipoI, la condroitinasa ABCTipoII, la condroitinasa AC y la condroitinasa B o enzimas de mamíferos con actividad semejante a las condroitinasas tales como Hyal 1, Hyal 2, Hyal 3 y Hyal 4 se usan para tratar animales en la fase crónica de la lesión tras una lesión por contusión del CNS. En este ejemplo, las ratas se sometieron a una lesión por contusión de la médula espinal y se dejó que se recuperaran durante al menos semanas. En esta etapa, todos los animales han alcanzado un valor meseta respecto a la locomoción en campo abierto como se evaluó mediante el método de puntuación BBB descrito en el ejemplo 1. Los animales se trataron con condroitinasa ABCTipoI, condroitinasa ABCTipoII, condroitinasa AC y condroitinasa B o enzimas de mamíferos con actividad semejante a las condroitinasas tales como Hyal 1, Hyal 2, Hyal 3 y Hyal 4.
Ejemplo 10
Clonación de condroitinasa AC en Flavobacterium heparinum
Se hizo crecer Flavobacterium heparinium (ATCC) en LB (cultivo de Luria) a 25ºC durante 4 días. Las bacterias se decantaron por centrifugación y el DNA genómico se aisló mediante el kit DNeasy Tissue (Qiagen). Se sintetizaron cebadores de PRC con un sitio de restricción NdeI en el extremo 5´ y un sitio BamH1 en el extremo 3´ que tenían secuencias 5´-CATATGCAGCAGACCGGTACTGCA-3´ y 5´-GGATTCTCAGTGCTCTTTATTTCT-3´, respectivamente, para sintetizar la proteína madura. Se usó un microgramo de DNA genómico en una reacción PCR de 50 !L que contenía 10 mM de cada dNTP (dATP, dTTP, dCTP y dGTP), 50 pmoles de cada uno de los cebadores hacia adelante y reverso, 1 mM de MgSO4, y 5 unidades de DNA polimerasa Tfl (Promega). La reacción PCR de arranque en caliente se inició por desnaturalización a 95ºC durante 2 min seguido por otro ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 30 s, recocido y extensión a 58ºC durante 8 min durante 30 ciclos. La extensión final se llevó a cabo a 72ºC durante 8 min antes de enfriar a 4ºC. El producto PCR de 2,0 kb se ligó en el vector pCR 2.1 (kit de clonación TOPO, Invitrogen) y se transformó en células competentes OneShot (Invitrogen). El DNA plásmido se aisló de varios clones explorados por digestión con la enzima de restricción EcoR1 y se seleccionaron los clones positivos que tenían el inserto de 2,0 kb. La integridad del gen se confirma por secuenciación del DNA y muestra una identidad del 100% con la secuencia publicada (nº de acceso al Genbank U27583). La secuencia de nucleótidos de la condroitinasa AC es SEQ ID No. 1.
Ejemplo 11
Clonación de condroitinasa B en Flavobacterium heparinum
La condroitinasa B se clonó por el mismo método que en el ejemplo 2 usando cebadores con un sitio de restricción NdeI en el extremo 5´ y un sitio BamH1 en el extremo 3´ que tenían secuencias 5´-CATATGCAGGTTGTTGCTTCAAAT -3´ y 5´-GGATCCTCAGTGCTCTTTATTTCT-3´, respectivamente, para sintetizar la proteína madura. Se usó un microgramo de DNA genómico en una reacción PCR de 50 !L que contenía 10 mM de cada dNTP (dATP, dTTP, dCTP y dGTP), 50 pmoles de cada uno de los cebadores hacia adelante y reverso, 1 mM de MgSO4, y 5 unidades de DNA polimerasa Tfl (Promega). La reacción PCR de arranque en caliente se inició por desnaturalización a 95ºC durante 2 min seguido por un segundo ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 30 s, recocido y extensión a 58ºC durante 8 min durante 30 ciclos. La extensión final se llevó a cabo a 72ºC durante 8 min antes de enfriar a 4ºC. El producto PCR de 1,6 kb se ligó en el vector pCR 2.1 (kit de clonación TOPO, Invitrogen) y se transformó en células competentes OneShot (Invitrogen). El DNA plásmido se aisló de varios clones explorados por digestión con la enzima de restricción EcoR1 y se seleccionaron los clones positivos que tenían el inserto de 1,6 kb. La integridad del gen se confirma por secuenciación del DNA y muestra una identidad del 100% con la secuencia publicada (nº de acceso al Genbank U27584). La secuencia de nucleótidos de la condroitinasa B es SEQ ID No. 2.
Ejemplo 12
Clonación de condroitinasa ABCTipoI
Se aisló DNA genómico de Proteus vulgaris usando el kit DNeasy Tissue (Qiagen). Se sintetizaron cebadores de PCR con un sitio de restricción NdeI en el extremo 5´ y un sitio BamH1 en el extremo 3´ que tenían secuencias 5´-CAT ATG GCC ACC AGC AAT CCT GCA TTT G-3´ (F2) y 5´-GGA TCC TCA AGG GAG TGG CGA GAG-3´ (R), respectivamente, para sintetizar la proteína madura (2). Los productos PCR de 3,0 kb se ligaron en un vector pCR
2.1 (kit de clonación TOPO, Invitrogen) y se transformaron en células competentes DH5a (Invitrogen). El DNA plásmido se aisló de varios clones explorados por digestión con la enzima de restricción EcoR1. La integridad del gen se confirma por secuenciación repetida del DNA y muestra una identidad del 99,7% y 99,5% en la secuencia. La secuencia de nucleótidos de condroitinasa ABC I es SEQ ID No. 3. La identidad de la secuencia al nivel de aminoácidos es SEQ ID No. 4.
Ejemplo 13
Clonación de condroitinasa ABCTipoII
La condroitinasa ABCTipoII ha sido clonada a partir de DNA genómico de Proteus vulgaris. Se diseñaron cebadores hacia delante y reversos que tenían secuencias 5´-TTA CCC ACT CTG TCT CAT GAA GCT TTC3-3´ y 5´-TTA CTT AAC TAA ATT AAT AAC AGT AGG-3´, respectivamente. Se aisló un producto PCR de peso molecular de 3,0 kb después de 30 ciclos de amplificación del DNA genómico de Proteus vulgaris. El producto PCR ha sido clonado en el vector pCR 2.1 y se confirmó mediante digestión con enzimas de restricción. La integridad del gen se confirmó por secuenciación del DNA y muestra una identidad del 99% con la secuencia publicada. La secuencia de nucleótidos de condroitinasa ABC II es SEQ ID No. 5.
Las discrepancias anteriores a nivel de nucleótidos dieron lugar a una identidad del 98,3% al nivel de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de condroitinasa ABC II es SEQ ID No. 6.
Ejemplo 14
Las condroitinasas AC y B causan extensión de las neuritas in vitro
Se ensayaron Chase AC y B respecto a su capacidad para promover la extensión de las neuritas sobre un sustrato CSPG inhibidor. Se extendió en motas una mezcla CSPG (0,5 mg/mL; Chemicon) sobre un plástico de cultivo de tejido revestido con poli-L-lisina. Se añadió Chase AC o B recombinante al la placa en medio exento de suero en concentraciones de 0,5 ó 0,1 mg/mL, respectivamente, durante 3 horas a 37ºC. Se extendieron sobre las motas neuronas cortinales de crías de rata embriónicas de 18 días. Se tomaron fotomicrografías de contacto de fases 48 horas después de la extensión en las placas y se evaluó la extensión de las neuritas en las células. Como se ve en la figura 2, tanto la enzima Chase AC como la B promovieron la extensión de las neuritas sobre el sustrato CSPG cuando se comparan con testigos no tratados. La promoción de las neuritas fue similar a las enzimas Chase comercialmente disponibles a iguales concentraciones molares.
Ejemplo 15
Una proteína de fusión de condroitinasa y péptido de transducción celular TAT
La proteína de fusión TAT de la condroitinasa adecuada para usar en la presente memoria se describe en la solicitud copendiente de patente serial de EE.UU. No (aún no asignado) presentada concurrentemente con la presente memoria e incorporada a la misma por referencia. La proteína TAT forma el virus de inmunodeficiencia de ser humano (HIV) y contiene un dominio de transducción proteico (PTD) que está implicado en la transducción de HIV en las células. El PTD contiene un dominio de 11 aminoácidos (péptido TAT) que es responsable de la actividad del PTD. El péptido TAT puede estar unido a proteínas y facilitar la transducción de las proteínas en las células. El mecanismo de transducción es independiente del peso molecular o de las propiedades químicas de las proteínas que están unidas al péptido TAT. Por lo tanto, el péptido TAT proporciona un método para administrar cualquier proteína en el citoplasma celular. Estudios in vivo muestran que si una proteína de fusión que consiste en el péptido TAT unido a la enzima de 120 kd, beta-galactosidasa (�-Gal), se inyecta en ratones, se observa un robusto suministro de �-Gal en una amplia variedad de células. En particular, se observó �-Gal en el CNS.
Sin el péptido TAT no se observó �-Gal en el CNS. Así, las proteínas de fusión del péptido TAT cruzan la barrera sangre – cerebro y también son transducidas en las células. Normalmente, el trasporte a través de la barrera sangre
– cerebro está restringido a ciertas pequeñas moléculas hidrófobas y péptidos lipófilos particulares de bajo peso molecular. El trasporte de proteínas tan grandes como �-Gal no es posible sin una ruptura de la barrera sangre – cerebro, pero el péptido TAT facilita el transporte a la vez que deja intacta la barrera sangre – cerebro.
La presente invención es una enzima tipo condroitinasa funcionalmente unida al péptido TAT (TAT-Chase). La primera ventaja es que TAT-Chase cruzará la barrera sangre – cerebro y allí TAT-Chase puede usarse sistémicamente para tratar una lesión de la médula espinal y trastornos relacionados del CNS. La segunda ventaja es que TAT-Chase será transducida en las células y a continuación degradará los almacenes de CSPGs intracelulares. Por lo tanto, TAT-Chase degradará CPPS tanto extra como intracelulares.
Ejemplo 16
Células encapsuladas que liberan condroitinasa
Los genes que codifican a la condroitinasa AC, la condroitinasa B, la condroitinasa ABCTipoI, la condroitinasa ABCTipoII, o a otros enzimas con actividad semejante a las condroitinasas tales como Hyal 1, Hyal 2, Hyal 3 y Hyal 4 se transfectan en una célula apropiada de mamífero tal como la línea CHO. Las células que expresan condroitinasa catalíticamente activa se clonan y expanden. La línea celular que expresa la condroitinasa se encapsula usando sistemas poliméricos tales como poliacrilonitrilo, poli(cloruro de vinilo) (PAN-PVC) que permiten la difusión de nutrientes y gases, pero impiden la intrusión de células huésped. Cuando la cápsula se implanta las líneas celulares que producen condroitinasa sobreviven y secretan continuamente condroitinasa. Sin embargo, las células no están sometidas a rechazo inmune porque están inmunoaisladas en la cápsula polimérica. La ventaja de este sistema es que en lugar de suministrar la condroitinasa a través de catéteres o bombas, la condroitinasa es continuamente secretada. Además, cuando no se requiere un tratamiento más largo, la cápsula puede recuperarse al final del intervalo de tratamiento. Se ha de entender que el sistema de la presente memoria basado en células encapsuladas no es sólo adecuado para usar en el tratamiento de lesiones del CNS por contusiones, sino que también es adecuado para usar en el tratamiento de otras lesiones y trastornos del CNS.
Ejemplo 17
Mutantes de supresión de condroitinasa que son biológicamente activos
Los mutantes de supresión de condroitinasa adecuados para usar en la presente memoria se describen en la solicitud copendiente comúnmente otorgada de patente serial de EE.UU. No. (aún no asignado) presentada concurrentemente con la presente memoria e incorporada a la misma por referencia. Las condroitinasas AC y B producidas recombinantemente han mostrado eficacia in vitro para superar la berrera de una frontera de un sustrato inhibidor, tal como agrecano, y dan lugar a la extensión de las neuritas en neuronas corticales de ratas. Sin embargo, con el fin de facilitar el transporte efectivo de las enzimas anteriores al sitio de la lesión se llevó a cabo un análisis sistemático de supresión basado en las estructuras cristalinas disponibles con el fin de determinar el tamaño mínimo de polipéptidos capaz de degradar CSPGs. La actividad de escisión de todos estos mutantes ha sido explorada in vitro mediante un ensayo zimográfico usando agrecano como sustrato. Hasta la fecha, se encontró que un polipéptido truncado de condroitinasa AC (nL50-cL275) que carecía de 50 y 275 aminoácidos desde los terminales amino y carboxi, respectivamente, y que tenía un peso molecular de 38 kDa comparado con el de 75kDa de la proteína de longitud completa era el tamaño mínimo que retenía actividad como se probó mediante el ensayó zimográfico. Sin embargo, el mutante de supresión de condroitinasa B (nL120-cL120) que carecía de 120 aminoácidos desde cada uno de los terminales amino y carboxi y que tenía un peso molecular de 26 kDa comparado con el de 52kDa de la proteína de longitud completa también ha mostrado retener actividad en el ensayó zimográfico. Las enzimas truncadas homogéneamente purificadas se caracterizarán in vitro y se ensayarán adicionalmente in vivo en paralelo con las moléculas de longitud completa para evaluar su potencia como agentes terapéuticos en lesiones de la médula espinal. Se ha de entender que los mutantes de supresión de la presente memoria son no sólo adecuados para usar en el tratamiento de lesiones del CNS por contusiones, sino que también son adecuados para usar en el tratamiento de otras lesiones y trastornos del CNS.
Lo que se ha descrito e ilustrado en la presente memoria son realizaciones de la invención junto con algunas de sus variaciones. Los términos, descripciones y figuras usados en la presente memoria se establecen sólo a modo de ilustración y no significa que sean limitantes. Los expertos en la técnica reconocerán que dentro de la invención son posibles muchas variaciones.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Acorda Therapeutics, Inc. Gruskin, Elliott A. Caggiano, Anthony O. Zimber, Michael P. Blight, Andrew R.
<120> COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO DE LESIONES DEL CNS
<130> 127304.02301
<140> Aún no designado
<141> 17-05-2004
<150> 60/417.236
<151> 16-05-2003
<160> 6
<170> PatentIn versión 3.2
<210> 1
<211> 2037
<212> DNA
<213> Flavobacterium heparinum
<400> 1
<210> 2
<211> 1446
<212> DNA
<213> Flavobacterium heparinum
<400> 2
<210> 3
<211> 2994
<212> DNA 5 <213> Proteus vulgaris
<220>
<221> característica miscelánea
<222> (1086)..(1086) 10 <223> n es a, c, g, o t
<400> 3
<210> 4
<211> 997
<212> PRT
<213> Proteus Vulgaris
<400> 4
<210> 5
<211> 2973
<212> DNA
<213> Proteus vulgaris
<400> 5
<210> 6
<211> 990
<212> PRT
<213> Proteus vulgaris
<400> 6

Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una enzima condroitinasa ABC para usar en mejorar la recuperación funcional tras una lesión por contusión del sistema nervioso central, enzima que se administra en una cantidad terapéuticamente efectiva.
  2. 2.
    La enzima según la reivindicación 1, en la que la cantidad terapéuticamente efectiva de la enzima condroitinasa ABC comprende una cantidad suficiente para degradar condroitina sulfato proteoglicanos.
  3. 3.
    La enzima según la reivindicación 2, en la que la degradación de los condroitina sulfato proteoglicanos se produce en el sitio de la lesión por contusión.
  4. 4.
    La enzima según la reivindicación 2, en la que la degradación de los condroitina sulfato proteoglicanos se produce fuera del sitio de la lesión por contusión.
  5. 5.
    La enzima según la reivindicación 1, en la que la cantidad terapéuticamente efectiva de la enzima condroitinasa ABC comprende una cantidad suficiente para mejorar la función motora, la función sensorial, la función autonómica o una de sus combinaciones.
  6. 6.
    La enzima según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la condroitinasa es condroitinasa ABCTipoI.
  7. 7.
    La enzima según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la condroitinasa es condroitinasa ABCTipoII.
  8. 8.
    La enzima según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la lesión por contusión comprende una lesión traumática del cerebro.
  9. 9.
    La enzima según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la lesión por contusión comprende una lesión de la médula espinal.
  10. 10.
    La enzima según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la lesión por contusión comprende una lesión de la médula espinal mediante un objeto contundente.
  11. 11.
    La enzima según una cualquiera de las reivindicaciones 9 y 7, en la que se mantiene la morfología gruesa de la médula espinal.
  12. 12.
    La enzima según la reivindicación 9, en la que la lesión de la médula espinal comprende una lesión que da lugar a una afección seleccionada del grupo que consiste de monoplejía, diplejía, paraplejía, hemiplejía y cuadriplejía.
  13. 13.
    La enzima según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la lesión por contusión comprende neuronas rotas o parcialmente cortadas.
  14. 14.
    La enzima según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la lesión por contusión comprende neuronas aplastadas.
  15. 15.
    La enzima según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la lesión por contusión comprende la compresión del sistema nervioso central.
  16. 16.
    La enzima según la reivindicación 15, en la que la compresión es causada por una fuerza traumática en la médula espinal.
  17. 17.
    La enzima según la reivindicación 15, en la que la compresión es causada por un tumor, hemorragia, infarto, proceso infeccioso, estenosis o isquemia.
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