JP5432113B2 - 中枢神経系障害を治療するための組成物および方法 - Google Patents

Description

本出願は、２００３年５月１６日に出願された米国仮出願第６０／４１７，２３６号明細書に対して優先権を主張した出願であり、その内容は本明細書にこの参照により完全に組み込まれる。

本発明は一般的に、中枢神経系（ＣＮＳ）障害または疾患後の神経機能の回復を促進する方法に関連している。特に、本発明は脊髄における障害または脊髄に対する障害の後の自律神経系の神経機能の回復を促進するために、コンドロイチン分解酵素を利用する方法を対象とする。この方法で有益な組成物は、許容されるコンドロイチン分解酵素製剤を含み、さらにとりわけコンドロイチン分解酵素の持続性放出製剤を含む。本発明は、脊髄に対する挫傷障害後の神経機能の回復を促進する方法も対象とする。

脊髄は身体における最大の神経であり、神経線維で構成されている。これらの神経線維は、感覚、運動、自律神経系の機能を含む身体の情報伝達系に関与している。感覚神経系機能は痛みなどの感覚を感知する能力を含む。運動機能は身体を随意的に動かす能力を含む。自律神経系機能は、例えば発汗および呼吸能力のような不随意性の身体機能を含む。

中枢神経系は脳および脊髄を含む。前記脊髄は末梢神経系（ＰＮＳ）と脳をつなぐ。前記脊髄の後根に入る感覚神経は、身体の感覚受容器からの感覚情報を脳に伝達する。様々な種類の感覚が様々な感覚経路で送信される。例えば、脊髄視床路が痛みと温度の感覚を伝え、脊柱路が体位と接触の感覚を伝える。前記脊髄の前根から出る運動神経は、脳からの随意的な運動情報を身体に伝達する。

自律神経系（ＡＮＳ）は、心臓筋肉およびホルモンを放出する腺を含む不随意性筋肉の活動に影響を及ぼす。特に、前記ＡＮＳは安定な体内環境を維持するために、心臓血管、消化器、および呼吸器系を制御する。前記ＡＮＳは、血管収縮と心拍数の上昇を引き起す交感神経、および血管拡張と心拍数の低下によって交感神経と反対の方法で作用する副交感神経を含む。

脊髄を含む中枢神経系の損傷は機能の喪失をもたらす。中枢神経系に対する障害の種類によっては、前記機能の喪失によって、感覚神経系、運動神経系、または自律神経系の機能の喪失、またはそれらの組み合わせの喪失を示す可能性がある。

最も一般的な脊髄障害（ＳＣＩ）の種類は、挫傷（脊髄の打撲）および圧迫障害（脊髄に圧力をかけることよって引き起される）を含む。挫傷障害において、最も一般的な損傷の種類は、脊髄の中央において形成されることが多い空洞または穴である。神経細胞、またはＰＮＳの神経細胞とは異なり、ＣＮＳの神経細胞は障害後再生しない。軸索の再生不能によって、感覚神経系機能、運動神経系機能、および自律神経系機能の損失ばかりではなく、永続的な麻痺に至る可能性がある。神経細胞が再生できない１つの理由は、それらが脊髄障害の後に発現するグリア性瘢痕を横断する能力がなくなることである可能性がある。病変をもたらす障害は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧｓ）を含む細胞外マトリックス分子を含有したグリア性瘢痕を発現する。ＣＳＰＧｓは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて神経組織の成長を抑制し、およびｉｎ ｖｉｖｏにおいてＣＳＰＧｓが豊富な領域における神経組織の再生を抑制する。

多数の分子、およびそれらの特定領域は、神経細胞からの神経突起の発芽を支持する能力に関っており、この工程は神経突起の伸長とも呼ばれる。神経突起という用語は、軸索および樹状突起構造の両方を言及する。この神経突起の発芽工程は、特に身体的な障害または疾病が神経細胞に損傷を与えた後、神経の発達および再生において必須である。全ての動物種の中枢および末梢の両方の神経系の発達期間において、神経突起は盛んに伸長する。この現象は、軸索と樹状突起の両方に関連する。

種々のポリペプチド、特に細胞接着分子（ＣＡＭｓ）は、神経細胞の増殖を促進することで知られている。この分野における初期の試みは、接着促進細胞外マトリックス蛋白質フィブロネクチン（ＦＮ）に集中したものであったが、他のポリペプチドが神経増殖を促進することも見出された。例えば、米国特許第５，７９２，７４３号公報は、可溶性神経ＣＡＭ、それらの断片、またはそれらのＦｃ−融合生成物の投与によって、哺乳類の中枢神経系における神経増殖を促進する新規なポリペプチドとその方法を開示している。米国特許第６，３１３，２６５号公報は、ＣＡＭｓの薬理学的に活性な領域を含む合成ポリペプチドが、中枢神経系における末梢神経障害と病変の両方において神経の再生と修復を促進するのに使用され得ることを公開している。有益ではあるが、再生蛋白質単独の使用によって、神経系の損傷の修復が十分にもたらされるものではない可能性がある。

過去およそ２０年間、分子レベルで細胞外マトリックス（ＥＣＭｓ）における細胞粘着および遊走に対する基本的な知識が急速に拡大してきた。前記細胞外マトリックスおよび基底膜の成分を分解する酵素および他のポリペプチドの作用は、結合サイトカインの放出を含む種々の機構と前記基質の透過性の増加によって神経修復の現象を促進する可能性があり、その結果、媒介分子、成長因子、および走化性物質に加えて、治療工程に関与する細胞の移動性が増進する。例えば、米国特許第５，９９７，８６３号公報は、細胞増殖を操作して損傷の治癒を促進するグリコサミノグリカンの使用を公開している。

ＥＣＭ分子は抑制性ＣＳＰＧｓを含む。前記ＣＳＰＧｓの成分は、グリコサミノグリカン、コンドロイチン硫酸（ＣＳ），およびデルマタン硫酸（ＤＳ）として同定されている。これらの抑制性分子の除去は、身体的な障害または疾病後、ある領域において神経突起が再生し神経再支配することを可能にすると同時に、感覚神経系、運動神経系、および自律神経系の機能回復を可能にする。

今までの研究は、コンドロイチナーゼがＣＳおよびＤＳを含むＣＳＰＧｓを溶解および分解できることを見出した。ある研究は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるラットＣＮＳの病変領域の中およびその周囲において、コンドロイチナーゼＡＢＣがグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖を除去することを見出した。前記ＧＡＧｓの分解は、増殖関連蛋白質、ＧＡＰ−４３の発現を促進し、処置細胞において増進された再生傾向を示した。しかしながら、この増殖関連蛋白質は末梢神経障害における再生に関連しており、中枢神経障害には関連していない。別の研究は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてラット脊髄のコンドロイチナーゼＡＢＣ処置が、組織切片基層上の神経細胞を再生することを見出した。この研究は、ＣＳＰＧｓの分解がラミニンの神経刺激効果を促進する可能性に観察した（Ｚｕｏ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｎｅｕｒｉｔｅ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｔｉｓｓｕｅ，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１５４（２）：６５４〜６２（１９９８））。前記と同じ第一研究者によるその後の研究において、神経損傷部位におけるコンドロイチナーゼＡＢＣの注入によって、ＣＳＰＧｓが分解し、末端神経断片の基底層中への軸索の発芽の進入が増進することが報告されており、これは接合神経の接点における許容範囲の拡大を可能にする可能性がある（Ｚｕｏ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｘｏｎｓ ａｆｔｅｒ ｎｅｒｖｅ ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ｉｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｅ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１７６（１）：２２１〜８（２００２））。前記と同じグループの研究者らは、コンドロイチナーゼＡＢＣの処理によって軸索が無細胞移植片の中に対照移植片より速い速度で再生することを見出した（Ｋｒｅｋｏｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｘｏｎａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ａｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｅｒｖｅ ｇｒａｆｔｓ ｉｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：２１（１６）：６２０６〜１３（２００１））。障害皮質脊髄路、特に脊柱の障害に対するコンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩ}の適用は、患部領域からの軸索の退縮を阻止し、さらに軸索線維の増殖を対照より促進し、灰白質中に樹状になった軸索をいくつか伴った。再生ＣＳＴ軸索は機能的結合が確立していた（Ｂｒａｄｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎａｓｅ ＡＢＣ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｆｔｅｒ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ ４１６：６３６〜６４０（２００２））。

しかしながら、脊柱断面病変動物モデルにおけるコンドロイチナーゼ−誘導による神経学的機能回復は、自律神経系機能、特に脊髄の打撲障害による自律神経系機能の回復に関連した限られた適用性または予測力を有する。２００２年にＢｒａｄｂｕｒｙらにより記述された脊柱切断病変において、ナイフで神経路を切ることにより脊柱線維が損傷されている。この方法によって、脊髄の実質を維持するために側枝の損傷を最小限にして神経線維を切断する局所的または「きれいな"ｃｌｅａｎ"」病変が実現する。灰白質組織および他の白質路は最小限の損傷を受け、従ってこのモデルは運動神経細胞を供給する前記脊柱神経細胞の再生能力を研究するのに有用なものである。

本発明は一般的に、神経学的な自律神経系機能の回復程度の増加をもたらす、ＣＮＳに対する障害の治療を対象とする。コンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩ}、コンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩＩ}、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＢ、または例えば、ヒアルロニダーゼ１（Ｈｙａｌ１）、ヒアルロニダーゼ２（Ｈｙａｌ２）、ヒアルロニダーゼ３（Ｈｙａｌ３）、ヒアルロニダーゼ４（Ｈｙａｌ４）などのコンドロイチナーゼ様活性を有する哺乳類の酵素、それらの断片、またはそれらの混合物の使用は、これらのコンドロイチナーゼが、再生を抑制するＣＮＳ細胞外マトリックスの成分を分解するために、哺乳類における前記ＣＮＳに対する障害後の神経学的な機能の回復を促進する。

前記損傷が即時であろうと長期であろうと、様々な種類のコンドロイチナーゼがＣＮＳ障害で苦しむ哺乳類に対して投与され得る。前記コンドロイチナーゼは、ＣＳＰＧｓを分解するのに有効な量で投与され、従って自律神経系神経学的機能の回復を促進する。

好ましくは、前記コンドロイチナーゼは適切な薬学的キャリアと共に投与されてもよい。前記投与は局所または全身性であってもよく、経口、非経口、腹腔内、くも膜下腔内、局所適用を含む。そのような製剤の放出特性は、短時間放出、即時放出、制御放出、または持続放出であってもよい。例えば前記製剤は、持続放出性基質と、グリコサミノグリカン分解酵素の治療的に有効な量とを含んでもよい。あるいは、ＣＮＳ障害部位またはその近辺において、コンドロイチナーゼが、遊離型またはカプセルで、移植された一様に修飾された細胞から分泌されても良い。

本開示に従った前記コンドロイチナーゼの投与、およびその結果生じる前記神経学的機能回復の促進は、中枢神経系に対する挫傷または非挫傷障害の後の各個人の反応性によって様々な程度に、運動神経系、感覚神経系、および自律神経系機能を修復する。

本発明の本質および利点をより十分に理解するために、添付図面に関連して以下の詳細な説明を参照する。
図１は、挫傷性脊髄障害後の残尿容量の図説である。 図２は、持続放出性基質からのコンドロイチナーゼの放出速度のグラフである。 図３は、挫傷性脊髄障害後のコンドロイチナーゼＡＢＣ_{Ｔｙｐｅ１}、ペニシリナーゼ、または対照による処置後のラットのＢＢＢスコアのグラフである。 図４は、挫傷性脊髄障害後のコンドロイチナーゼＡＢＣ_{Ｔｙｐｅ１}、ペニシリナーゼによる処置後のラットのＢＢＢスコアのグラフである。 図５は、コンドロイチナーゼの種々投与量の投与後の平均体重変化のグラフである。 図６は、コンドロイチナーゼＡＢＣ_{Ｔｙｐｅ１}の種々投与量における投与による平均体重変化の図説である。 図７は、コンドロイチナーゼＡＢＣ_{Ｔｙｐｅ１}の種々投与量における平均温度変化の図説である。 図８は、コンドロイチナーゼＡＢＣ_{Ｔｙｐｅ１}の反復および増量投与における体重変化の図説である。 図９は、コンドロイチナーゼＡＢＣ_{Ｔｙｐｅ１}の反復および増量投与における温度変化の図説である。

本発明の組成物および方法を記載する前に、本発明は、記載された特定の工程、組成物、または手順に限定されず、それらは変化してもよいことが理解される。この記載において使用された専門用語は、特定の見解または実施形態のみを説明する目的で、この記載に使用されたものであり、添付の請求項によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを目的とするものではないことも理解される。

本明細書および添付の請求項において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のものを指示していない限り、複数の参照が含まれることも言及されるべきである。従って、例えば、「酵素」への言及は、１若しくはそれ以上の酵素、および当業者に知られているそれらと同等のものとその他に言及する。別に定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解される同様の意味を有するものである。本明細書で記載されたものと類似若しくは同等の任意の方法および物質はすべて、本発明の実施形態の実行または試験において使用されてもよく、好ましい方法、装置、および物質はこれから記載される。本明細書で述べられるすべての文献は、この参照により完全に組み込まれる。本明細書は、本発明が先願発明の長所によってそのような公開を予期する権利がないことを承認するものとして解釈されるものではない。

本開示は、外傷または疾病により引き起こされる哺乳類のＣＮＳ障害の処置方法を対象とする。特に、コンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩ}、コンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩＩ}、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＢ、および例えばＨｙａｌ１、Ｈｙａｌ２、Ｈｙａｌ３、Ｈｙａｌ４などのコンドロイチン様活性を伴った哺乳類の酵素およびそれらの組み合わせ、またはそれらの断片は、脊髄障害の治療的処置を提供する。本明細書で使用される「中枢神経系障害」および「脊髄障害」および「挫傷障害」という用語は、例えば交通事故、墜落、または射創に加えてその他の障害などの外傷性障害、または非外傷性障害、または内部的または外部的原因によってもたらされる可能性がある圧迫などによってもたらされる神経の分裂、挫傷、または圧壊を招く可能性がある疾病および外傷性障害を含む。本発明の方法の実行は、処置された哺乳類に対して臨床的有用性を与え、対象者の運動神経系機能、感覚認知、または自律神経系機能の少なくとも１つにおいて臨床上適切な改善を提供する。臨床上適切な改善は、検出可能な改善から障害性または喪失したＣＮＳの機能の完全回復までに及ぶ。

Ｂｒａｄｂｕｒｙによって記載された「きれいな（ｃｌｅａｎ）」病変とは対照的に、脊髄障害の挫傷モデルは、次々と起こる反応機構を通じて組織の無差別な破壊を引き起こす。挫傷障害は実験的には、露出した脊髄および標準的なヒト障害のより正確な模倣体に対して鈍力を適用することによってもたらされ、第一および第二の病態生理学的工程の両方の研究のためにより適切な状態を提供する（Ｂｌｉｇｈｔ ＡＲ．２０００ Ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ．Ｔｏｐ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｉｎｊ Ｒｅｈａｂｉｌ ６（２）：１〜１３；Ｋｗｏｎ ＢＫ，Ｏｘｌａｎｄ ＴＲ，Ｔｅｔｚｌａｆｆ Ｗ．（２００２）Ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｓｐｉｎｅ２７（１４）：１５０４〜１０））。白質における軸索を伸長および分裂することが可能である、組織に対する即時的な機械的損傷の後、前記組織のより深刻かつ一般的な破壊が続いて起こる。血液脳関門において障害が引き起こされ、さらに脊髄において広範囲におよぶ第二の細胞および組織の損傷をもたらす炎症性および生化学的カスケードを誘発する中心灰白質出血性壊死を受ける。数日から数週間の間、反応性グリア細胞、残留軸作、血管新生および細胞外マトリックス分子の沈着によって満たされる障害部位において空洞化した病変が形成される。感覚、運動、および自律神経系機能において障害が起きる可能性がある。比較的「きれいな」脊柱切断病巣の特性と比較して、挫傷障害は、脊髄組織の応答および修復機構のレパートリーが関与し、急性および慢性の両方の段階を対象とした可能な治療法を評価するのに適切である。さらに挫傷障害は、実質欠損、瘢痕、空洞形成、および同種のものなどを招く第二の影響を引き起こす。障害および修復に重大な影響を及ぼす可能性がある切断と比較して、挫傷障害はより丈夫な免疫応答を引き出す（Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ ＤＬ，Ｙｏｌｅｓ Ｅ，Ｂｅｌｋｉｎ Ｍ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｍ．１９９４）。

ＳＣＩの潜在的な治療法を評価する実験的パラダイムは、結果を他の脊髄障害モデルに置き換える状況に置かれなければならない。前記脊柱切断障害と挫傷モデルの解剖学と病態生理学の対比は広域に及ぶ。脊柱切断障害は、感覚路内において再生し特異的な機能を有する傾向がよりある神経細胞に対して損傷を引き起こす。さらに、切断障害は最小の第二組織損傷を導く。一方、挫傷障害は、感覚および運動神経路の両方、感情的感覚、運動および自律神経系機能に損傷を与える。皮質脊髄路は脊柱で見出される神経細胞よりはるかに再生的ではない。挫傷障害は、脊柱病変よりかなり大きい病変を引き起こす広範囲な第二組織の損傷も導く。

成体哺乳類におけるＣＮＳの脊髄障害後、軸索の再生不能は永久麻痺を導く可能性がある。前記ＣＮＳ障害の部位は、障害部位における星状細胞および乏突起膠細胞による細胞外マトリックス分子の沈着の増加によって病変またはグリア性瘢痕が発展する。これらの細胞外マトリックス分子は、瘢痕領域において高く発現されるＣＳＰＧｓを含む。ＣＳＰＧｓはｉｎ ｖｉｔｒｏで神経組織の増殖を抑制し、さらにｉｎ ｖｉｖｏでＣＳＰＧｓ豊富範囲における神経組織の再生を抑制する。コンドロイチン硫酸Ａ、ＢおよびＣは、哺乳類において見出される優勢型である。これらのコンドロイチンは、細胞分化、接着、酵素経路、およびホルモン相互作用を含む様々な生物学的活性の調節に関与されている可能性がある。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの存在は、組織および血管損傷に応答した細胞増殖の後期において高められる。

グリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、およびデルマタン硫酸（ＤＳ）はＣＳＰＧの重要成分である。これらは、軸索および神経細胞の増殖を妨害することによって、成体哺乳類における前記ＣＮＳの再生の欠乏の原因となる抑制分子である。しかしながら、ＣＳＰＧｓは、発達期間、抑制よりむしろ神経細胞の誘導およびパターン化において重要である。

グリコサミノグリカンは、異なる部位で硫酸基を運搬する交互性ヘキソサミンとヘキスロン残基から成る非分枝多糖類である。前記ＧＡＧｓは一般的に二糖骨格の構成に従って３つのファミリーに分けられる。それらは、ヘパリン／ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびケラタン硫酸である。前記コンドロイチン硫酸ファミリーは、非硫酸化コンドロイチン硫酸、過硫酸化コンドロイチン硫酸、およびコンドロイチン硫酸Ａ〜Ｅに指定された７つの亜型を含み、それらの硫酸エステル官能基の数と位置は変化する。コンドロイチン硫酸Ｂはデルマタン硫酸ともよばれ、交互性ヘキスロン酸位においてイズロン酸が優性残基であるという点が異なる。

例えばコンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩ}、コンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩＩ}、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＢ、またはＨｙａｌ１、Ｈｙａｌ２、Ｈｙａｌ３、およびＨｙａｌ４を含むヒアルロノグルコサミニダーゼなどのようなコンドロイチナーゼ様活性を伴う哺乳類の酵素などのＣＳＰＧ分解酵素は、コンドロイチン硫酸の効果を制御および／または抑制するのに有用であり、さらに病状を処置するための治療法の開発において有用であることが今回見出された。本明細書に記載したこの発見は、脊髄の挫傷障害後、神経学的な機能、特に自律神経系機能の回復において改善をもたらす挫傷障害のコンドロイチナーゼ処置を初めて記載したものである。

コンドロイチナーゼＡＣおよびコンドロイチナーゼＢは、種々の発生源から導かれる可能性があるコンドロイチンリアーゼ酵素である。本開示において使用されるコンドロイチナーゼＡＣまたはＢはすべて、コンドロイチナーゼＡＣ（フラボバクテリウム属ヘパリン由来；Ｔ．Ｙａｍａｇａｔａ，Ｈ．Ｓａｉｔｏ，Ｏ．Ｈａｂｕｃｈｉ，Ｓ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３，１５２３（１９６８））、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ（アルスロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）由来；Ｋ．Ｈｉｙａｍａ，Ｓ．Ｏｋａｄａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５０，１８２４（１９７５），Ｋ．Ｈｉｙａｍａ，Ｓ．Ｏｋａｄａ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），８０，１２０１（１９７６））、コンドロイチナーゼＡＣＩＩＩ（フラボバクテリウム種Ｈｐ１０２由来；Ｈ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ，Ｈ．Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｋ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｋ．Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｋ．Ｔｏｋｕｙａｓｕ，Ｓｅｉｋａｇａｋｕ，６１，１０２３（１９８９））、コンドロイチナーゼＢ（フラボバクテリウム属ヘパリン由来；Ｙ．Ｍ．Ｍｉｃｈｅｌａａｃｉ，Ｃ．Ｐ．Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，５６，９７３（１９７４）、Ｖ．Ｍ．Ｍｉｃｈｅｌａａｃｉ，Ｃ．Ｐ．Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１５１，１２１（１９７５）、Ｋ．Ｍａｅｙａｍａ，Ａ．Ｔａｗａｄａ，Ａ．Ｕｅｎｏ，Ｋ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｓｅｉｋａｇａｋｕ，５７，１１８９（１９８５））、およびコンドロイチナーゼＢ（フラボバクテリウム種Ｈｐ１０２由来；Ｈ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ，Ｈ．Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｋ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｋ．Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｋ．Ｔｏｋｕｙａｓｕ，Ｓｅｉｋａｇａｋｕ，６１，１０２３（１９８９））を含むがこれらに限らない。好ましいコンドロイチナーゼＡＣおよびコンドロイチナーゼＢは、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ａｍｅｒｉｃａ（Ｆａｌｍｏｕｔｈ，マサチューセッツ州、米国）にて市販されている。さらに、前記酵素は、Ｂｅｎｎｅｔｔらによる米国特許第６，０９３，５６３号公報において公開されている方法によって生産されても良く、この公開は本明細書に組み込まれる。コンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩ}およびコンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩＩ}はそれぞれ、コンドロイチンおよびデルマタン硫酸の両方を開裂するエキソおよびエンドリアーゼ作用する（Ｈａｍｅｉ ｅｔ ａｌ １９９７）。コンドロイチナーゼ様活性を伴う哺乳類の酵素は同定されている。例えば、Ｈｙａｌ１、Ｈｙａｌ２、Ｈｙａｌ３、およびＨｙａｌ４などの一部のヒアルロニダーゼはＣＳＰＧｓも分解し、さらに本発明において使用されることができる。

コンドロイチナーゼ酵素活性は賦形剤の添加または凍結乾燥によって安定化させることができる。安定剤は炭化水素、アミノ酸、脂肪酸、および界面活性剤および当業者によって知られているものを含む。実施例は、例えばショ糖、乳糖、マンニトール、およびデキストランなどの炭化水素、アルブミンおよびプロタミンなどの蛋白質、アルギニン、グリシン、およびトレオニンなどのアミノ酸、例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）およびＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）などの界面活性剤、塩化カルシウムおよび硫酸ナトリウムなどの塩、脂肪酸、リン脂質、および胆汁酸などの脂質などを含む。前記安定剤は一般的に、蛋白質に対する炭化水素、蛋白質に対するアミノ酸、蛋白質に対する蛋白質安定剤、および蛋白質に対する塩の割合が１：１０〜４：１の比で蛋白質に対して添加され、蛋白質に対する界面活性剤の割合が１：１０００〜１：２０の比で添加され、さらに蛋白質に対する脂質の割合が１：２０〜４：１の比で添加される。他の安定剤は高濃度の硫酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、または硫酸ナトリウムを含み、へパリナーゼ活性による比較研究に基づく。前記安定化剤は、前記硫酸アンモニウムまたは他の類似の塩が、１Ｕ酵素あたり０．１〜４．０ｍｇの硫酸アンモニウムの割合で酵素に対して添加されるのが好ましい。

コンドロイチナーゼは局所または全身に投与されてもよい。そのような投与は、経口、非経口、腸内、腹腔内、くも膜下腔内、吸入、または局所性投与を含む。前記投与の好ましい形態は、静脈内、皮下、くも膜下腔内、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）、筋肉内、節間、皮内（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、または経皮を含む。局所または局部投与は、適用を大いに制御することが好ましくてもよい。

前記コンドロイチナーゼは、単独または組み合わせで、投与前に適切な薬学的キャリアと混合してもよい。薬学的キャリアおよび添加剤を使用した一般的な実施例は、従来の希釈剤、結合剤、滑剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、等張化脂肪酸、等張化剤、防腐剤、麻酔剤、界面活性剤、および類似のもの、および当業者によって知られているものなどである。使用されても良い具体的な薬学的キャリアは、デキストラン、ショ糖、乳糖、マルトース、キシロース、トレハロース、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、イノシトール、血清アルブミン、ゼラチン、クレアチニン、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤（例えばポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール）、および類似の化合物などである。薬学的キャリアは、例えばポリエチレングリコールおよび／またはショ糖、またはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなどの組み合わせで用いられてもよく、特にポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸（２０Ｅ．０．）が好ましい。

そのような製剤の放出特性は、短時間放出、即時放出、制御放出、または持続放出であってもよい。特に、コンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩ}、コンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩＩ}、コンドロイチナーゼＡＣ、およびコンドロイチナーゼＢ、または例えばＨｙａｌ１、Ｈｙａｌ２、Ｈｙａｌ３、Ｈｙａｌ４のようなコンドロイチナーゼ様活性を伴う哺乳類の酵素の持続放出製剤は、自律神経系機能を含む神経学的な機能を改善または回復するために使用されてもよい。そのような製剤は、ＣＳＣＰＧｓが分解されるようなシステム中への酵素の制御、持続放出をもたらす。ＣＳＰＧｓの分解は、損傷のＣＮＳ上流または下流内において、障害、空洞、または病変部位において起こってもよい。

本発明に従った処置の処方計画は、コンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩ}、コンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩＩ}、コンドロイチナーゼＡＣ、およびコンドロイチナーゼＢ、または例えばＨｙａｌ１、Ｈｙａｌ２、Ｈｙａｌ３、Ｈｙａｌ４、などのコンドロイチナーゼ様活性を伴う哺乳類の酵素の投与方法によって実行されてもよく、好ましくはＣＮＳに対して、さらにより好ましくはＣＮＳの障害領域の病変に対して実行されてもよい。前記投与方法、投与時期、および投与量は、神経突起の伸長の促進によって前記ＣＮＳの機能障害が機能的に回復するように実行される。本公開の前記処置は、ＣＮＳまたはＣＮＳの障害部位に対して、コンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩ}、コンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩＩ}、コンドロイチナーゼＡＣ、およびコンドロイチナーゼＢ、または例えばＨｙａｌ１、Ｈｙａｌ２、Ｈｙａｌ３、Ｈｙａｌ４などのコンドロイチナーゼ様活性を伴う哺乳類の酵素の有効な量を供給する。「有効な量」という用語は、ＣＮＳ内または脊髄の病変領域のＣＳＰＧｓを分解するのに十分な量、または哺乳類の運動、感覚、または自律神経系機能を全部または部分的に修復するのに十分な量という意味である。例えば、酵素の有効な量は、患者の体重１ｋｇあたりおよそ０．０００１ｍｇ〜およそ１００ｍｇであってもよい。コンドロイチナーゼの有効な量は、単回投与、２回投与、または複数投与で投与されてもよい。前記投与量はいつでも投与されてもよいことが理解されるが、ある実施形態において、前記投与量は障害後１２時間内にされるか、または実現可能な限りすぐに投与される。別の実施形態において、前記投与量は１つの損傷した哺乳類に対し、１回、２回、または複数回の投与量で投与され、そのような投与量は前記損傷の重傷度、及びグリア性瘢痕に存在すＣＳＰＧｓの量によって決まる。複数の投与量が投与される場合、それらは毎日、毎週、または隔週で供給されてもよい。前記投与量の供給は、カテーテルまたはシリンジの手段によるものであってもよい。あるいは、前記処置は、前記グリア性瘢痕への直接的な適用を許容するために、外科処置の期間に投与されてもよい。

一旦、コンドロイチナーゼが投与されると、前記ＣＳＰＧｓの分解は神経突起の伸長を阻止する抑制分子を除去し、患部領域への神経突起の再生を許容する。コンドロイチナーゼの投与は、前記損傷の上流または下流を含む前記患部領域から遠いＣＮＳにおけるＣＳＰＧｓも分解する可能性がある。前記コンドロイチナーゼＡＣおよびコンドロイチナーゼＢはＣＳおよびＤＳをそれぞれ分解し、不飽和硫酸化二糖類をもたらす。コンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩ}、コンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩＩ}は、エキソ−およびエンド−リアーゼ作用し、ＣＳおよびＤＳの両方を開裂する。前記グリア性瘢痕からのＣＳおよびＤＳの除去は、前記障害部位への神経突起の伸長の再生を可能にする。

前記患部ＣＮＳ領域における神経細胞の再生は、運動、感覚、および自律神経系機能の回復を可能にする。臨床的に関連する改善は、検出可能な改善から障害または喪失した神経機能の完全回復までに及び、個々の患者および障害によって変化する。

本発明の実行は、それらの更なる好ましい観点および実施形態を含み、以下の実施例によってより完全に理解され、それらは実例のみを提示したものであり、決して本発明を限定すると解釈されるべきものではない。

コンドロイチナーゼによるげっ歯類における脊髄障害後の自律神経系機能の改善
コンドロイチナーゼの使用を伴ったラットにおける脊髄の挫傷障害後の自律神経系機能の研究は、Ａｃｏｒｄａ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて完了した。動物（ｎ＝３８）は確立されたＳＣＩモデルにさらされた（Ｇｒｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９６）。前記ＳＣＩの後、直ちに開始し、１９体の動物は、コンドロイチナーゼＡＢＣ１（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ；カタログ番号１００３３２，ロット番号Ｅ０２２０１）をくも膜下腔内（ｉ．ｔ．）に、各投与量、各ラットにつき人工脳脊髄液中０．０６ユニットで、１日おきに２週間処理した。他の１９体の動物は、賦型剤中の酵素蛋白質（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎａｓｅ−Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｐ４５２４）で処理した。

前記動物は、医療グレード空気（９５％酸素、５％二酸化炭素）混合物中に供給される１．５％イソフルランを用いた外科麻酔法の状態に導入し維持した。セファゾリン（５０ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）は術前に与えた。外科処置期間、前記動物は体温および心拍数の維持を補助するために加温パッド上に置き、ＳｐＯ２と前記動物の体温を観察した。Ｔ９およびＴ１０脊髄の脊椎の椎弓切除術を実施した。Ｔ１３／Ｌ１接合部における部分的な椎弓切除術は、髄空内カテーテルを配置するために行なった。硬膜における切開は皮下注射の針を用いて行なった。Ａ３２ゲージカテーテル（ＲｅＣａｔｈＣｏ．，ＬＬＣ，ＣＳ１３２Ｇ，ロット番号２０４２２）は、前記硬膜切開を通して挿入し、前記Ｔ９／Ｔ１０椎弓切除術のすぐ尾方に位置するために吻方に送りこんだ。前記カテーテルはシアノアクリレート接着剤および縫合によって骨と筋肉に固定した。カバースリップピンセットを改良した刃物（４ｍｍ幅×０．５ｍｍ厚）は、前記脊髄の外側面と前記椎弓切除の吻側の脊椎との間の脊柱管内に挿入した。ＳＣＩはピンセットの刃物の間の脊髄を１５秒間圧迫することによって誘導した。前記障害の重症度のレベルは、脊髄から０．３ｍｍの距離で圧迫するピンセットを用いることによって誘導した（適度な障害）。前記障害を覆う硬膜は無傷のままであった。前記ピンセットを除去し、前記障害部位を生理食塩水で洗い流した。被さった筋肉層を一緒に縫合し、皮膚の創傷をホッチキスで閉じた。手術後、前記動物に直ちに乳酸リンガー生理食塩水の５ｍｌのボーラスを与え、続いて２時間後に５ｍｌの乳酸リンガー生理食塩水の第二回目の投与を行った。

手術の直後およびその後１日おきに２週間、動物はイソフルレンで麻酔し、以下に記載した実験試薬（コンドロイチナーゼＡＢＣＩ）または対照試薬（ペニシリナーゼ）をくも膜下腔内カテーテル中に注入した。前記注入容量は３マイクロリットルでおこない、続いて４マイクロリットルの人工脳脊髄液で洗浄した。

処置法
１．コンドロイチナーゼ（Ｃｈａｓｅ）ＡＢＣ１−コンドロイチナーゼＡＢＣ１（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ）、０．０６Ｕ／投与量、くも膜下腔内投与、ａＣＳＦ３マイクロリットル中。
２．ペニシリナーゼ−ペニシリナーゼ（Ｓｉｇｍａ）、３マイクロリットル、くも膜下腔内投与、２２８マイクログラム／１ミリリットル。

分析および結果
膀胱は少なくとも１日２回手動で絞り出し、尿量を記録した。全てのグループの尿量は障害後最初の４日間はおよそ２．７ミリリットルであった。ペニシリナーゼ処置グループの尿量は１１ミリリットルのピーク容量に達し、障害後およそ３週間までに１日あたり６〜８ミリリットルの間に戻った。コンドロイチナーゼ処置グループの尿量は１日あたり６ミリリットルの最大容量に達し、３週間までにおよそ２ミリリットルに戻った。図１のコンドロイチナーゼおよびペニシリナーゼ処置ラットの適度な障害グループの平均残留尿量のプロットを参照。このシステムは、ラットにおける脊髄障害後の自律神経系機能回復を評価する分野において十分に許容されるものである。

これらの結果は、脊髄障害後の自律神経系機能の回復に対してコンドロイチナーゼ酵素が利用できる可能性を実証するものである。前記脊髄障害モデルおよび行動解析システムは、前記分野において十分に許容されるものであり、何よりもヒトの脊髄障害に対して最も関連性があると考えられる。

コンドロイチナーゼの持続放出製剤
持続放出コンドロイチナーゼ酵素供給技術の発展によって、存続期間を与えるために、コンドロイチナーゼがＳＣＩの後のいずれの時点においても投与されることが可能になった。コンドロイチナーゼの理想的な持続放出システムは、活性物質の放出の延長を提供するだけでなく、ＳＣＩの状況において使用するのに実用的なものある。最小限な設計基準は、ＣＮＳにおける前記装置の生態適合性、コンドロイチナーゼ触媒活性の滞留、および適切なコンドロイチナーゼ放出反応速度を含む。好ましくは、前記システムは、前記ＳＣＩの部位に適用される薄膜の形態、または前記部位に適用される重合システムにおいて、脊髄に接触して重合し、その後前記処置期間の過程全体にわたって適所に留まるものである。前記システムは、前記ＳＣＩへの導入によって圧縮形態における更なる外傷を導くことがないように、曲がりやすいものである。

生体分解性薬剤供給システムにおける過去数年間にわたる進歩は、様々な実行可能な基質候補をもたらしてきた。理想的なシステムの選択は、生化学的で実行可能な特性の評価によって決まる。一般的に、これらのシステムは、共有架橋結合の形成を通じて均一層中に一緒に保持される基質、結晶化基質、乳濁液、または相転移における前記活性物質が捉えられる。前記基質物質は、生物学的システムまたは合成ポリマーのどちらかである。前記候補システムの実施例は、フィブリン接着剤、コラーゲン、およびアルギン酸のような生物学的基質を含み、合成基質の実施例は、ポリ乳酸／ポリグリコール酸、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）およびエチレン酢酸ビニルを含む。本明細書の持続放出製剤は、ＣＮＳに対する挫傷障害の処置における使用に適しているだけでなく、他のＣＮＳ障害および疾病の処置における使用にも適していることが理解される。

発展した組み換えコンドロイチナーゼ酵素は、種々のＳＲ基質に取り込まれてもよく、フィブリン接着剤、コラーゲン、アルギン酸、ポリ乳酸／ポリグリコール酸、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）およびエチレン酢酸ビニルを含むがこれに限らない。天然および合成ポリマーの両方を使用してもよい。合成ポリマーは正確な製剤で予測可能な放出特性であるという利点を有しているが、一方天然ポリマー製剤は増強された生体適合性を有する可能性がある。それぞれのポリマーシステムタイプは、コンドロイチナーゼ含浸膜またはゲルを作り出すために特有の特性と方法を有しており、各タイプは以下に記載した。

コラーゲンゲル：コラーゲンは、その調整の容易さと生体適合性のために数十年もの間医療装置における生体材料として使用されてきた。コラーゲンは、例えば止血剤、組織増強ゲル、骨移植代替物、封止剤、および様々な創傷治療製品などの承認医療装置において見受けられる。前記生体医学の目的で使用されるコラーゲンは、一般的にウシの腱から単離される原線維タイプＩコラーゲンである。コラーゲンゲルはげっ歯類タイプＩコラーゲンから形成されたものであってもよい。コラーゲンゲルの形成方法は数年間日常的に使用されてきた。希酸中のコラーゲンは生理学的ｐＨで緩衝剤中、コンドロイチナーゼ溶液と結合している。中和および温めた場合、前記タイプＩコラーゲン原線維はゲルを作るために障害配列に融合する。得られるゲルの架橋結合密度は前記コラーゲンの濃度変化によって制御されてもよい。

フィブリン接着剤：フィブリン接着剤は、止血剤または封止剤としてヨーロッパにおいて数年間臨床的に使用されてきた血液由来製品である。フィブリン接着剤はゲルを形成するために結合された２つの成分から成る。前記第一の構成物質は凝固に関与する主要プロテインであるフィブリノゲンである。フィブリノゲンはトロンビンと結合して凝固カスケードにおける最終段階を再現する。トロンビンは、フィブリンと呼ばれる線維網にフィブリノゲンの重合を追い込む反応性末端を暴露するためにフィブリノゲンにおいて作用するセリンタンパク分解酵素である。コンドロイチナーゼは前記フィブリノゲン溶液と結合されてもよく、その後トロンビンの添加によって重合される。

アルギン酸：アルギン酸は海の昆布から単離される大きな分子量の糖質である。それは食品および化粧品において添加剤として最も頻繁に使用される。その安全性と生体適合性は、創傷治療製品におけるその使用をもたらしてきた。それは細胞または膵島のマイクロカプセル化の実験的製剤においても使用される。アルギン酸は、カルシウムのような二価カチオンと共にイオン的な架橋を経て様々な形および形態に形成することができるために、特に用途が広いものである。架橋密度はカルシウムおよびアルギン酸の濃度によって制御することができ、得られるゲルはｉｎ ｖｉｖｏで長期間安定である。コンドロイチナーゼとアルギン酸の溶液はカルシウム添加によりフィルムを形成するために使用されてもよい。

ＰＬＡ／ＰＧＡ：ポリ乳酸およびポリグリコール酸の重合体または共重合体は、縫合および他の生体分解性移植可能医療装置において使用される加水分解的に不安定なポリエステルである。ＰＬＡ／ＰＧＡは薬剤供給のためのマイクロカプセルを作るためにも使用されてきた。これらのポリマーを用いた持続放出システムを作り出すために利用可能な方法が幾つかある。例えば、溶媒交換システムはＰＬＡ／ＰＧＡ重合体がｎ−メチルピリドンに溶解するために使用されてもよい。

プルロニック：プルロニックは逆層転移を受ける親水性重合体である。プルロニック溶液は低温で粘性溶液であり、さらにその後より温かい温度に変えた場合、溶液から固体層への転移を受ける。プルロニックは、液体を組織に注入またはスプレーして前記液体がフィルム中で凝固することが望ましい場合、様々な生物医学的な用途において使用されてきた。プルロニックはコンドロイチナーゼを含む緩衝水溶液に溶解されてもよい。フィルムは、逆層転移およびフィルム形成を促進するためにインキュベータにおいて温められた組織培養プレートにおける鋳型ゲルによって形成されてもよい。

エチレン酢酸ビニル：エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）は、非分解性、生体適合性移植を作るために使用される重合体の代表的なものである。ＥＶＡは塩化メチレンのような一部の有機溶媒に可溶である。緩衝水溶液におけるコンドロイチナーゼは乳化剤を作るために撹拌下でＥＶＡ溶液に添加されてもよい。前記有機溶媒はその後コンドロイチナーゼが含浸された半結晶化重合体基質の形成を促進する溶液から、その後エバポレートされてもよい。この方法は架橋結合密度範囲を作るために使用されてもよい。

コンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩ}の持続放出製剤
この研究において、コンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩ}は３つ持続放出基質中で処方した。：Ｄｕｒａｓｅａｌ（商標）Ｉ（Ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ Ｓｕｒｇｉｃａｌにて市販）、Ｄｕｒａｓｅａｌ（商標）ＩＩ（Ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ Ｓｕｒｇｉｃａｌにて市販）、およびＳｐｒａｙ Ｇｅｌ．Ｄｕｒａｓｅａｌ（商標）は増大ヒドロゲルである。前記Ｓｐｒａｙ Ｇｅｌはゲル発泡体に基づくコラーゲンである。放出は、長時間にわたって基質から放出されるコンドロイチナーゼ活性を測定することによって観察した。結果は図２に図説した。前記結果は、コンドロイチナーゼが長時間にわたって持続放出基質から放出され、持続放出製剤中で処方された可能性を実証していた。

げっ歯類における脊髄挫傷障害後のコンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩ}の神経学的機能回復
ラットにおける挫傷障害のコンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩ}処置の研究は、Ａｃｏｒｄａ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて達成した。動物（ｎ＝３０）は確立されたＳＣＩモデルに曝された（Ｇｒｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９６）。前記ＳＣＩの直後、１０体の動物は、コンドロイチナーゼＡＢＣＩ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ；カタログ番号１００３３２、ロット番号Ｅ０２２０１）を髄空内（ｉ．ｔ．）中、投与量あたり１ラットあたり人工脳髄液中０．０６ユニットの投与量で処理し、その後１週間毎日、さらにその後１週間１日おきに処理した。別の１０体の動物は酵素蛋白（ペニシリナーゼ−Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ ｎｕｍｂｅｒＰ４５２４）を受け、他の１０体の動物は賦形剤対照（人工脳髄液−Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ；Ｃａｔ Ｎｕｍｂｅｒ５９−７３１６）を受けた。動物は１２〜１６週間、オープンフィールド行動試験によって評価した。

前記動物は、医療グレード空気（９５％酸素、５％ＣＯ_２）混合物中において運ばれる１．５％イソフランを用いた外科麻酔法の状態に導入し維持した。バイトリル（２５ｍｇ／ｋｇ）は術前に与えた。外科手術の間、前記動物は動物の体温、心拍数、ＳｐＯ２、および動物の温度維持を補助するために加温パッド上に置いた。Ｔ９およびＴ１０脊髄の脊椎の椎弓切除を実施した。Ｔ１３／Ｌ１接合における部分的な椎弓切除を脊髄内カテーテルの設置のために実施した。硬膜における切開は皮下注射の針を用いて行なった。カテーテル（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）は、前記硬膜切開を通して挿入し、前記Ｔ９／Ｔ１０椎弓切除術のすぐ尾方に位置するために吻方に送り込んだ。前記カテーテルはシアノアクリレート接着剤および縫合によって骨と筋肉に固定した。カバースリップピンセットを改良した刃物（４ｍｍ幅×０．５ｍｍ厚）は、前記脊髄の外側面と前記椎弓切除の吻側の脊椎との間の脊柱管内に挿入した。ＳＣＩはピンセットの刃物の間の脊髄を１５秒間圧迫することによって誘導した。前記ピンセットは脊髄から０．９ｍｍの距離を圧迫するために設計された。前記ピンセットは除去し、前記障害部位は生理食塩水で洗浄した。付加筋肉層は一緒に縫合し、前記皮膚創傷はホッチキスで閉じた。外科手術後、前記動物に直ちに乳酸リンガー生理食塩水の５ｍｌのボーラスを与え、続いて数時間後に５ｍｌの乳酸リンガー生理食塩水の第二回目の投与を行った。

外科手術の直後、およびその後１週間毎日、およびその後１日おきに１週間、動物はイソフルランで麻酔し、以下に記載した実験試薬および対照試薬（コンドロイチナーゼＡＢＣ１、ペニシリナーゼ、またはａＣＳＦ）を髄空内カテーテル中に注入した。前記注入容量は６マイクロリットルで行い、続いて人工脳髄液６マイクロリットルの洗浄をおこなった。

処置法
１．コンドロイチナーゼＡＢＣ１−コンドロイチナーゼＡＢＣ１（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ）、０．０６ユニット／投与量、くも膜下腔内投与、ａＣＳＦ６マイクロリットル中。
２．ペニシリナーゼ−ペニシリナーゼ（Ｓｉｇｍａ）、６マイクロリットル、くも膜下腔内投与、１２４マイクログラム／１ミリリットル。
３．ａＣＳＦ−人工脳髄液（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）、６マイクロリットル、くも膜下腔内投与。

行動分析
４８時間後およびその後障害後毎週、Ｂａｓｓｏ、Ｂｅａｔｔｉｅ ａｎ Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）記録システム（Ｂａｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５）に従って、オープンフィールド自発運動を観察および記録した。このシステムはラットにおける脊髄障害後の運動神経系機能回復の評価の分野において十分に許容されるものである。

結果：死亡率は処置グループ全域にわたって均等に分布して４０％であり、障害の重篤度に関連したカテーテル法および有害事象によるものであった。ペニシリナーゼまたはａＣＳＦで処理した動物はおよそ４の平均ＢＢＢスコア（ｎ＝１１）で機能回復した。コンドロイチナーゼＡＢＣ１処置動物は（ｎ＝７）はおよそ８のＢＢＢスコアで運動神経系機能回復した。前記コンドロイチナーゼＡＢＣ１処置グループはＡＮＯＶＡおよびｐｏｓｔ−ｈｏｃＴｕｒｋｅｙ分析（Ｐ<０．０１）によると他のグループ両方とは有意に異なっていた。挫傷脊髄障害後、ａＣＳＦ、ペニシリナーゼ、またはコンドロイチナーゼＡＢＣ１投与を伴った脊髄挫傷障害後のラットのＢＢＢスコアを図説した図３を参照。

これらの結果は、挫傷脊髄障害の処置のためにコンドロイチナーゼ酵素が使用できる可能性を実証している。前記脊髄障害モデルおよび行動分析システムは、前記分野において十分に許容されるものであり、さらにほとんどのヒト脊髄障害に対して関連すると考えられる。これらの結果は公開されているｉｎ ｖｉｔｒｏのコンドロイチナーゼの結果または脊髄の処理障害モデルから予期されるものではない。

コンドロイチナーゼＡＢＣ_{Ｔｙｐｅ１}によるげっ歯類における脊髄挫傷障害後の神経学的機能の改善
ラットにおける挫傷障害のコンドロイチナーゼ_{Ｔｙｐｅ１}処置の研究は、Ａｃｏｒｄａ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて完了した。動物（ｎ＝３８）は確立されたＳＣＩモデル（Ｇｒｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９６）にさらした。前記ＳＣＩの直後、１９体の動物は、コンドロイチナーゼＡＢＣ１（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ；Ｃａｔ ｎｕｍｂｅｒ １００３３２、ロット番号Ｅ０２２０１）を人工脳髄液中、１ラット、１回投与量あたり０．０６ユニットでくも膜下腔内（ｉ．ｔ．）投与し、２週間１日おきに処理した。別の１９体の動物は、賦形剤中の酵素蛋白質（ペニシリナーゼ−Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ ｎｕｍｂｅｒ Ｐ４５２４）で処理した。動物は１０週間、オープンフィールド行動試験によって評価した。

前記動物は、医療グレード空気（９５％酸素、５％ＣＯ２）混合物中において運ばれる１．５％イソフランを用いた外科麻酔法の状態に導入し維持した。セファゾリン（５０ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）の初回投与量は術前に与えた。外科手術期間中、前記動物は、体温、および心拍数、ＳｐＯ２および動物の温度維持を補助するために加温パッド上に置いた。Ｔ９およびＴ１０脊髄の脊椎の椎弓切除を実施した。くも膜下腔内カテーテルの設置のためにＴ１３／Ｌ１接合部における部分的な椎弓切除を行った。皮下注射針を用いて硬膜切開を行った。前記硬膜切開を通してＡ３２ゲージカテーテル（ＲｅＣａｔｈＣｏ．，ＬＬＣ，ＣＳ１３２Ｇ，Ｌｏｔ ｎｕｍｂｅｒ ２０４２２）を挿入し、前記Ｔ９／Ｔ１０椎弓切除術のすぐ尾方に位置するために吻方に送り込んだ。前記カテーテルはシアノアクリレート接着剤および縫合によって骨と筋肉に固定した。カバースリップピンセットを改良した刃物（４ｍｍ幅×０．５ｍｍ厚）は、脊髄の外側面と椎弓切除の吻側における脊椎との間の脊柱管内に挿入された。ＳＣＩは脊髄をピンセットの刃物の間に１５秒間圧迫することによって誘導した。前記障害の重症度は、脊髄から０．９ｍｍの距離を圧迫するピンセットを用いることによって誘導した（適度な障害）。前記障害を覆う硬膜は無傷のままであった。前記ピンセットを除去し、前記障害部位を生理食塩水で洗い流した。覆い被さった筋肉層は一緒に縫合し、皮膚創傷はホッチキスで閉じた。外科手術後、前記動物に直ちに乳酸リンガー生理食塩水の５ｍｌのボーラスを与え、続いて数時間後に５ｍｌの乳酸リンガー生理食塩水の第二回目の投与を行った。

外科手術の直後およびその後１日おきに２週間、動物はイソフルランで麻酔し、以下に記載した実験試薬（コンドロイチナーゼＡＢＣ１）および対照試薬（ペニシリナーゼ）を髄空内カテーテル中に注入した。前記注入容量は３マイクロリットルで行い、続いて人工脳髄液４マイクロリットルの洗浄を行った。

処置法
１．コンドロイチナーゼＡＢＣ１−コンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ）、０．０６ユニット／投与量、くも膜下腔内投与（ｉ．ｔ．）、３マイクロリットルのａＣＳＦ中。
２．ペニシリナーゼ−ペニシリナーゼ（Ｓｉｇｍａ）、３マイクロリットル、くも膜下腔内投与（ｉ．ｔ．）、２２８マイクログラム／１ミリリットル。

行動分析：４８時間および障害後１週間毎に、Ｂａｓｓｏ，Ｂｅａｔｔｉｅ ａｎ Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）スコアシステム（Ｂａｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５）によるオープンフィールド自発運動を観察し記録した。このシステムはラットの脊髄障害後の運動機能の回復を評価する分野において十分に許容されるものである。

結果：３７体の動物を登録し、０．９ｍｍピンセット障害において処置グループあたり１９体であった。動物の死亡は全ての処置グループにおいておおよそ同等であった。死亡した動物の９０％以上が尿路感染していた。ペニシリナーゼ処置した０．９ｍｍピンセット障害動物は、３のＢＢＢより回復しないスコアのため、またはかなり異常であったため除去した。付加した４体の動物は（２ペニシリナーゼおよび２−コンドロイチナーゼ処置）震えとジスキネジーのために除去した。これらの動物の除去は各０．９ｍｍグループにおける動物数を１２にした。

０．９ｍｍピンセット（適度な障害）。ペニシリナーゼ対照で処置した動物は障害１０週間後、７．１±０．３６（平均±ＳＥＭ）（ｎ＝１２）のＢＢＢスコアで機能回復した。コンドロイチナーゼＡＢＣＩ（ｎ＝１２）で処置した動物の平均ＢＢＢスコアは１０週後、９．１±０．６４の平均スコアで有意に高かった（ｐ<０．０１）。４週の安定期に達した後の各グループのスコアはＡＮＯＶＡによっても有意に異なった（ｐ<０．００１）。適度な挫傷ＳＣＩ後のコンドロイチナーゼおよび対照動物のＢＢＢスコアを図説した図４を参照。

コンドロイチナーゼは、ＳＣＩの背側面片側切断および重症ピンセット圧迫モデルにおいて、機能を改善しさらに再生を促進することを示した。この研究はピンセット圧迫研究の結果を確認すると同時に、コンドロイチナーゼが適度な障害レベルにおける運動神経系機能の回復に効果的であることを実証している。前記適度な障害研究は、コンドロイチナーゼ処置を用いたオープンフィールド自発運動の有意な改善を示した。

コンドロイチナーゼＡＢＣ_{Ｔｙｐｅ１}の急性分布および毒性
およそ２１０グラムの体重のＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのメスＬｏｎｇ ＥｖａｎｓラットをＡｃｏｒｄａ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて、健康および体重安定性を確認するために障害前５日間保管した。ラットはイソフルランで麻酔し、アコーダコンドロイチナーゼＡＢＣＩ（ＡＢＣＩ−バッチ３）を尾静脈から静脈内に注射した。動物は表１に示したように、それぞれハンクス液１ｍｌあたり０、０．２、０．７７５、および７．７７５ｍｇを含む溶液を用いて１ｋｇあたり０．０．２、０．７７５．または７．７７５ｍｇで注射した。

動物はそれぞれのホームケージに戻し、痛みと苦痛を監視した。体重は毎日入手した。

前記動物の半分は障害後２４時間で犠牲にした。酵素分布評価および組織病理学のために、脳、脊髄、心臓、肝臓、腎臓、および血液を取り除き、−４０℃に冷却したイソペンタン中で速やかに凍結した。残った動物は７日間観察し、その後犠牲にし、前記２４時間生存グループと同様に処理した。

組織は固定し２０μｍで低温切開した。切片は０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で簡単に洗浄し、その後エタノール、ホルマリン、酢酸固定剤中（それぞれ６６、４、５％容量）で１０分間固定した。組織はｐＨ７．４の０．１Ｍ ＰＢＳ１０％正常血清（２％正常ラット血清および８％正常ロバ血清を含む）含有溶液中で洗浄し固定した。切片は抗コンドロイチナーゼＡＢＣＩ抗体（＃８４２９）中、一晩インキュベートした。組織は、抗コンドロイチナーゼとコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを認識する抗体を用いて、免疫組織化学および組織ホモジネートをウエスタンブロットすることにより評価した。

結果：障害期間または直後に顕在的な反応は観察されなかった。障害部位において、腫張、炎症、打撲、壊死は観察されなかった。摂食行動、身づくろい、または発声の変化は観察されなかった。動物はオープンプールにおいて運動行動を評価した。動物飼育係または行動専門家によって観察される異常はなかった。動物は関節の圧痛または腫脹の兆候を見せた。

動物は障害の前後毎日体重を量った。体重の平均変化を図５に示した。処置グループの間に体重変化の有意な相違はなかった。全てのグループは、障害後２４時間後、０〜６．６６７グラム体重が減った。賦形剤対照グループは２４時間で最も体重が減った。全ての処置グループは連日体重が増えた。

コンドロイチナーゼＡＢＣ_{Ｔｙｐｅ１}単回投与くも膜下腔内毒性
くも膜下腔内カテーテルは、コンドロイチナーゼを供給するために、１６体の正常無注射メスラットのおよそＴ１３／Ｌ１脊髄接合のところに置いた。カテーテルは、今までのコンドロイチナーゼ研究を模擬試験するためにＴ９／Ｔ１０レベルに置くために吻方においた。くも膜下腔内カテーテル設置後２４時間、動物は、人工脳髄液２０マイクロリットル中、アコーダコンドロイチナーゼＡＢＣＩ（１ミリグラムあたり１００ユニット）を０、０．００６、０．６、または６．０ユニットで２０分もの間投与した。これらの投与量は、実施例１、４、および５で使用した投与量の０、１、１０、および１００倍から選択した。動物は２４時間または７日間観察し、それらの体重および温度を追跡した。

いずれのラットにおいても明らかな反応は見られなかった。図６および７に図説したように、体重または温度の群間それぞれの有意な相違はみられなかった。コンドロイチナーゼは、今までの研究で使用した投与量の１００倍の投与量まで単回くも膜下腔内投与は安全に思われる。

コンドロイチナーゼＡＢＣ_{Ｔｙｐｅ１}反復および段階的投与のくも膜下腔内毒性研究
くも膜下腔内カテーテルは５匹のメス成人Ｌｏｎｇ Ｅｖａｎｓラットに設置した。ラットは麻酔し、筋肉は脊椎から取り除き、およそＴ１３／Ｌ１接合において小さな椎弓切除を行った。１．４ｍｍの長さのくも膜下腔内カテーテルは、その末口がおよそＴ９／Ｔ１０レベルになるように設置した。ラットはイソフルランで麻酔し、賦形剤（ａＣＳＦ）、コンドロイチナーゼＡＢＣＩの反復または段階投与のいずれかを投与した。反復投与は０．６ユニットまたは今までの研究の有効投与量の１０倍であった。段階投与は、０．６、１．２、２．４、４．８、９．６、１９．２ユニットであった。ラットは体重と温度変化、明らかな毒性と行動変化を記録した。

コンドロイチナーゼＡＢＣＩを反復または段階投与のどちらかで処理したラットは、賦形剤のものよりもわずかに体重が増加した。有害事象は、賦形剤、反復および段階投与ラットの間に一様に分布した。有害事象は昏睡状態および尻尾降下を含み、通常麻酔および投薬の日に起こった。投薬処方計画の期間の体重変化の散乱プロットは図８に示し、温度変化は図９に示した。いずれの図においても、１日に２回の体重を初回投与と比較してプロットしている。投与時期は矢印で示している。

コンドロイチナーゼによる慢性脊髄挫傷障害における神経学的機能の改善
ある程度の神経学的機能が回復したＣＮＳに対する障害を有する個人は、その後限られた改善しか起こらない障害の慢性期に入る。本明細書の実施例の例外を伴うが、全てのコンドロイチナーゼを用いた研究は、脊髄障害処理の直後の動物において実施されてきた。実施例において、コンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩ}、コンドロイチナーゼ_{ＴｙｐｅＩＩ}、コンドロイチナーゼＡＣ、およびコンドロイチナーゼＢ、または例えばＨｙａｌ１、Ｈｙａｌ２、Ｈｙａｌ３、およびＨｙａｌ４などのコンドロイチナーゼ様活性を伴う哺乳類酵素は、ＣＮＳの挫傷障害後の障害慢性期における哺乳類を処置するために使用した。この実施例において、ラットは脊髄の挫傷障害にさらされており、少なくとも６週間で回復することが認められている。前記動物はこの段階において、実施例１において記載したＢＢＢスコア方法によって評価されるようなオープンフィールド運動に対して停滞期の値に達した。前記動物はコンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩ}、コンドロイチナーゼ_{ＴｙｐｅＩＩ}、コンドロイチナーゼＡＣ、およびコンドロイチナーゼＢ、または例えばＨｙａｌ１、Ｈｙａｌ２、Ｈｙａｌ３、およびＨｙａｌ４などのコンドロイチナーゼ様活性を伴う哺乳類酵素で処置した。

フラボバクテリウム属ｈｅｐａｒｉｎｉｕｍからのコンドロイチナーゼＡＣのクローニング
フラボバクテリウム属ｈｅｐａｒｉｎｉｕｍ（ＡＴＣＣ）は、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ ｂｒｏｔｈ）中２５℃で４日間培養した。前記バクテリアは遠心分離で沈降させ、ゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によって分離した。成熟蛋白質を合成するために、５'−ＣＡＴＡＴＧＣＡＧＣＡＧＡＣＣＧＧＴＡＣＴＧＣＡ−３'、および５'−ＧＧＡＴＴＣＴＣＡＧＴＧＣＴＣＴＴＴＡＴＴＴＣＴ−３'配列をそれぞれ有する５'末端におけるＮｄｅｌ制限酵素認識部位および３'末端におけるＢａｍＨＩ部位を用いてＰＣＲプライマーを合成した。１マイクログラムのゲノムＤＮＡは、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ）をそれぞれ１０ｍＭ、前方および後方プライマーをそれぞれ５０ｐｍｏｌ、ＭｇＳＯ_４を１ｍＭ、およびＴｆｌＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）５ユニットを含む５０マイクロリットルのＰＣＲ反応中で用いた。前記ＰＣＲ反応の加温開始は、９５℃で２分間変性することによって開始し、その後９４℃で３０秒の別の変性サイクルが続き、５８℃で８分間のアニーリングおよび伸展を３０サイクル続けた。前記最終伸展は、４℃での冷却前に７２℃８分間で行った。前記２．０ｋｂのＰＣＲ生成物は、ｐＣＲ２．１ベクター（ＴＯＰＯクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲーションさせて、単発構成細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換させた。プラスミドＤＮＡは、ＥｃｏＲ１制限酵素の消化によって選別された多数のクローンから単離し、陽性クローンは２．０ｋｂ挿入断片を有するものとして選択した。前記遺伝子の整合性はＤＮＡ配列によって確認し、公開されている配列に対して１００％の同一性を示した（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｕ２７５８３）。コンドロイチナーゼＡＣのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１であった。

フラボバクテリウム属ｈｅｐａｒｉｎｉｕｍからのコンドロイチナーゼＢのクローニング
コンドロイチナーゼＢは、成熟蛋白質を合成するために５'−ＣＡＴＡＴＧＣＡＧＧＴＴＧＴＴＧＣＴＴＣＡＡＡＴ−３'および５'−ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＧＣＴＣＴＴＴＡＴＴ−ＴＣＴ−３'配列を有する５末端Ｎｄｅｌ制限酵素認識部位および３末端ＢａｍＨＩ部位を用いた実施例２と同様の方法によってクローンを作成した。１マイクログラムのゲノムＤＮＡは、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ）をそれぞれ１０ｍＭ、前方および後方プライマーをそれぞれ５０ｐｍｏｌ、ＭｇＳＯ_４を１ｍＭ、およびＴｆｌＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を５ユニット含む５０マイクロリットルのＰＣＲ反応中で用いた。前記ＰＣＲ反応の加温開始は、９５℃２分間における変性によって開始し、その後９４℃で３０秒の第２の変性サイクルが続き、５８℃で５分間のアニーリングおよび伸展を３０サイクル続けた。前記最終伸展は、４℃における冷却前に７２℃で８分間行った。前記１．６ｋｂのＰＣＲ生成物は、ｐＣＲ２．１ベクター（ＴＯＰＯクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲーションさせて、単発構成細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換させた。プラスミドＤＮＡは、ＥｃｏＲ１制限酵素の消化によって選別された多数のクローンから単離し、陽性クローンは１．６ｋｂ挿入断片を有するものとして選択した。前記遺伝子の整合性はＤＮＡ配列によって確認し、公開されている配列に対して１００％の同一性を示した（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｕ２７５８４）。コンドロイチナーゼＢのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２であった。

コンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩ}のクローンニング
ゲノムＤＮＡは、Ｄｎｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプロテウス・ブルガリスから単離した。ＰＣＲプライマーは５'−ＣＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴＣＣＴＧＣＡＴＴＴＧ−３'（Ｆ２）および５'―ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＧＡＧＡＧ−３'（Ｒ）をそれぞれ有するＮｄｅｌ制限酵素認識部位５'末端およびＢａｍＨＩ部位３'末端を用いて合成し、成熟蛋白質を合成した（２）。前記３．０ｋｂのＰＣＲ生成物は、ｐＣＲ２．１ベクターにライゲーションさせて（ＴＯＰＯクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤＨ５α構成細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換させた。プラスミドＤＮＡは、ＥｃｏＲ１制限酵素の消化によって選別された多数のクローンから単離した。前記遺伝子の整合性は繰返しＤＮＡ配列によって確認し、公開されている配列と比較してヌクレオチドとアミノ酸レベルそれぞれ９９．７％および９９．５％の同一性を示した。前記コンドロイチナーゼＡＢＣ１のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３であった。前記アミノ酸レベルにおける配列の同一性はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４であった。

コンドロイチナーゼＡＢＣ_{ＴｙｐｅＩＩ}のクローニング
コンドロイチナーゼＡＢＣＩＩはＰ．ブルガリスのゲノムＤＮＡからクローン化した。前方および後方プライマーは、５'ＴＴＡＣＣＣＡＣＴＣＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＡＧＣＴＴＴＣ３'および５'ＴＴＡＣＴＴＡＡＣＴＡＡＡＴＴＡＡＴＡＡＣＡＧＴＡＧＧ３'の配列をそれぞれ有するよう設計した。３．０ｋｂのｍｏｌ．ｗｔ．ＰＣＴ単一生成物は、Ｐ．ブルガリスのゲノムＤＮＡを増幅した３０循環後に単離した。前記ＰＣＲ生成物は、ｐＣＲ２．１ベクターにおいてクローン化し、制限消化によって確認した。前記遺伝子の整合性はＤＮＡ配列によって確認し、公開されている配列に対して９９％の同一性を示した。前記コンドロイチナーゼＡＢＣＩＩのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５であった。

前記ヌクレオチドレベル矛盾は、アミノ酸レベルにおける９８．３％の同一性もたらした。前記コンドロイチナーゼＡＢＣＩＩのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６であった。

コンドロイチナーゼＡＣおよびＢが引き起こしたｉｎ ｖｉｔｒｏにおける神経突起の伸長
抑制性ＣＳＰＧ基質を超えて神経突起の伸長を促進するコンドロイチナーゼＡＣおよびＢの能力を試験した。ＣＳＰＧ混合物（１ｍｌあたり０．５ｍｇ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を、ポリ−１−リジンコーティング組織培養プラスチック上に染み付けた。組み換えコンドロイチナーゼＡＣまたはＢは、無血清培地のプレートに、１ｍｌあたり０．５または０．１ｇ、３７℃で３時間加えた。胎児時からの１８匹のラット仔の皮質ニューロンは、前記染み上にプレートした。プレート後４８時間、接触面の顕微鏡写真を取得し、前記細胞の神経突起伸長を評価した。図２に見られるように、クローン化したコンドロイチナーゼＡＣおよびＢ酵素のどちらも、非処置対照と比較すると、ＣＳＰＧ基質を超えた神経突起の伸長を促進した。神経突起の促進は、同等のモル濃度で市販のコンドロイチナーゼ酵素と類似であった。

コンドロイチナーゼの融合蛋白質およびＴＡＴ細胞形質導入
本明細書の使用に適したコンドロイチナーゼのＴＡＴ融合蛋白質は、これと共に同時に出願されている一般的に所有されている同時継続出願の米国特許出願第［未指定］において記載されており、それはこの参照により本明細書に組み込まれる。ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）の前記ＴＡＴ蛋白質形態は、細胞へのＨＩＶの形質導入に関る蛋白質形質導入範囲（ＰＴＤ）を含む。前記ＰＴＤは、前記ＰＴＤの活性にかかわる１１のアミノ酸範囲（ＴＡＴペプチド）を含む。前記ＴＡＴペプチドは蛋白質と結合し、前記蛋白質の細胞への形質導入を促進する。前記形質導入の機構は、前記ＴＡＴペプチドに結合した蛋白質の分子量または化学的特性からは独立している。従って、前記ＴＡＴペプチドは、細胞の細胞質に任意の蛋白質を輸送する方法を提供する。ｉｎ ｖｉｔｒｏの研究は、１２０ｋｄ酵素に結合した前記ＴＡＴペプチド、ベータ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）から成る融合蛋白質をマウスに注入した場合、多岐にわたる細胞へのβ−Ｇａｌの着実な輸送が観察された。特に、β−ＧａｌはＣＮＳにおいて観察された。ＴＡＴペプチドβ−ＧａｌがないことはＣＮＳにおいて観察されなかった。従って、ＴＡＴペプチド融合蛋白質は血液脳関門を渡り、細胞へ形質導入した。脳関門を越えた輸送は一般的に、特定の疎水性小分子、および特定の低分子量脂溶性ペプチドに限定されていた。β−Ｇａｌと同じくらい大きな蛋白質の輸送は血液脳関門の実質的な分断なしでは不可能であるが、前記ＴＡＴペプチドは血液脳関門が無傷のまま放置されている間輸送された。

本発明はＴＡＴペプチド（ＴＡＴ−コンドロイチナーゼ）に機能的に結合したコンドロイチナーゼ酵素である。第一の利点は、ＴＡＴ−コンドロイチナーゼ血液脳関門を横切ることであり、脊髄障害を組織的に処置するために使用されてもよく、ＣＮＳ疾患に関連してもよい。第二の利点は、ＴＡＴ−コンドロイチナーゼが細胞に形質導入され、その後細胞内ＣＳＰＧｓ貯蔵に分解されることである。従って、ＴＡＴ−コンドロイチナーゼは細胞外および細胞内両方のＣＳＰＧｓを分解する。

コンドロイチナーゼを放出するカプセル化細胞
コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＢ、コンドロイチナーゼＡＢＣＴｙｐｅＩ、コンドロイチナーゼＡＢＣＴｙｐｅＩＩ、または例えばＨｙａｌ１、Ｈｙａｌ２、Ｈｙａｌ３、およびＨｙａｌ４などのコンドロイチナーゼ様活性を伴う他の酵素をコード化した遺伝子は、例えばＣＨＯ株などの適切な哺乳類の細胞に形質導入される。触媒的なコンドロイチナーゼ活性を発現する細胞は、クローン化され拡大する。コンドロイチナーゼ発現細胞株は例えば栄養素および期待を拡散することが可能なポリアクリルニトリル、ポリ塩化ビニル（ＰＡＮ−ＰＶＣ）などのポリマーシステムを用いてカプセル化するが、宿主細胞の形質移入は妨げた。前記カプセルが移植される場合、コンドロイチナーゼ産生細胞株は生存し絶え間なくコンドロイチナーゼを分泌するが、前記細胞はポリマーカプセル中、免疫隔離（ｉｍｍｕｎｏｉｓｏｌａｔｅｄ）されているため免疫拒絶にさらされていなかった。このシステムの利点はカテーテルまたはポンプを通じてコンドロイチナーゼを供給する代わりに、前記コンドロイチナーゼは継続的に分泌した。その上、処置がもはや必要でなくなった場合には、前記カプセルは前記処置間隔を終結させるために回収することができた。本明細書における前記カプセル化された細胞基準システムは、ＣＮＳに対する挫傷障害の処置における利用に適切であるだけでなく、他のＣＮＳ障害および疾患の処置における使用にも適していることが理解される。

生物学的に活性なコンドロイチナーゼの突然変異体の削除
本明細書の使用に適したコンドロイチナーゼの突然変異体の削除は、一般に所有されており同時継続の米国特許出願第［未指定］において記載されており、それはこれと共に出願され、参照により本明細書に組み込まれる。組み換えにより生産されたコンドロイチナーゼＡＣおよびＢは、例えばアグリカンなどの阻害基質境界の障壁を乗り越えることによってｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて効果を示し、さらに皮質神経細胞の比率のために神経突起の伸長をもたらす。しかし、上記酵素の障害部位に対する効果的な輸送を促進するために、得られる結晶構造に基づく系統的な欠失解析がＣＳＰＧｓを分解することができる最小サイズのポリペプチドを測定するために実施される。これら全ての突然変異体の開裂活性は、アグリカンを基質として用いた酵素電気泳動によってｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて選別した。今まで、全長蛋白質の７５ｋＤａと比較して３８ｋＤａの分子量をそれぞれ有するアミノおよびカルボキシ末端から５０および２７５アミノ酸が欠損したコンドロイチナーゼＡＣ（ｎΔ５０−ｃΔ２７５）の切断ポリペプチドが、酵素電気泳動アッセイによって試験したように活性を保有した最小サイズであることが見出された。しかしながら、全長蛋白質の５２ｋＤａと比較して２６ｋＤａの分子量を有し、アミノおよびカルボキシ末端からそれぞれ１２０アミノ酸が欠損した前記コンドロイチナーゼＢ（ｎΔ１２０−ｃΔ１２０）の突然変異体の削除は、酵素電気泳動において同様に活性を保有していることが示された。均一的に精製し切断した前記酵素はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて特性を示し、脊髄障害の治療的可能性を評価するために、全長分子と同時にｉｎ ｖｉｔｒｏでさらに試験する。本明細書の突然変異体はＣＮＳに対する挫傷障害の処置における使用に対して適しているだけでなく、他のＣＮＳ障害および疾患の処置における使用にも適していることが理解される。

本明細書において記載し図解したことは、幾つかの変化を伴う本発明の実施形態である。本明細書で使用した用語、説明、および図は、図解のみの方法によって説明したものであり、限定を意味するものではない。当業者であれば、本発明の精神および範囲内において色々な変化が可能であり、本発明は請求項によって定義されることを意図しており、他を示していない限り、全ての用語においてそれらの対応する言葉幅広く妥当な意味を意味するものである。

Claims (46)

1. 中枢神経系の挫傷障害後の哺乳類における自律神経機能の改善に使用するための、グリコサミノグリカン分解酵素を有する薬学的組成物。
2. 請求項１記載の薬学的組成物において、前記グリコサミノグリカン分解酵素は、治療的に有効な量を含むものである、薬学的組成物。
3. 請求項２記載の薬学的組成物において、前記グリコサミノグリカン分解酵素の治療的に有効な量は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを分解するのに十分な量を含むものである、薬学的組成物。
4. 請求項３記載の薬学的組成物において、前記コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解は、前記挫傷障害部位で起こるものである、薬学的組成物。
5. 請求項３記載の薬学的組成物において、前記コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解は、前記挫傷障害部位の外側で起こるものである、薬学的組成物。
6. 請求項２記載の薬学的組成物において、前記グリコサミノグリカン分解酵素の治療的に有効な量は、最大およそ１００ｍｇ／ｋｇのコンドロイチナーゼを含むものである、薬学的組成物。
7. 請求項１記載の薬学的組成物において、前記グリコサミノグリカン分解酵素は、コンドロイチナーゼＡＢＣタイプＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＢ、ヒアルロニダーゼ１、ヒアルロニダーゼ２、ヒアルロニダーゼ３、ヒアルロニダーゼ４、それらの断片、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるものである、薬学的組成物。
8. 請求項１記載の薬学的組成物において、前記グリコサミノグリカン分解酵素は、コンドロイチナーゼＡＢＣタイプＩである、薬学的組成物。
9. 請求項１記載の薬学的組成物において、前記薬学的組成物は、局所投与のためのものである、薬学的組成物。
10. 請求項１記載の薬学的組成物において、前記薬学的組成物は、髄腔内投与のためのものである、薬学的組成物。
11. 請求項１記載の薬学的組成物において、前記薬学的組成物は、外用投与のためのものである、薬学的組成物。
12. 請求項１記載の薬学的組成物において、前記グルコサミノグリカン分解酵素は、持続放出製剤中に含まれるものである、薬学的組成物。
13. 中枢神経系の挫傷障害後の自律神経機能回復の改善に使用するための、グリコサミノグリカン分解酵素及び持続放出基質を含む、徐放性組成物。
14. 請求項１３記載の組成物において、前記グリコサミノグリカン分解酵素は、コンドロイチナーゼＡＢＣタイプＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＢ、ヒアルロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ２、ヒアルロニダーゼ３、ヒアルロニダーゼ４、それらの断片、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるものである、組成物。
15. 請求項１３記載の組成物において、前記グリコサミノグリカン分解酵素は、コンドロイチナーゼＡＢＣタイプＩである、組成物。
16. 請求項１３記載の組成物において、前記持続放出基質は、フィブリン接着剤、コラーゲン、アルギン酸塩、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、プルロニック、およびエチレン酢酸ビニルからなる群から選択されるものである、組成物。
17. 中枢神経系の挫傷障害後の機能回復の改善に使用するための、グリコサミノグリカン分解酵素の治療的に有効な量を有する薬学的組成物。
18. 請求項１７記載の薬学的組成物において、前記グリコサミノグリカン分解酵素の治療的に有効な量は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを分解するのに十分な量を含むものである、薬学的組成物。
19. 請求項１８記載の薬学的組成物において、前記コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解は、挫傷障害部位で生じるものである、薬学的組成物。
20. 請求項１８記載の薬学的組成物において、前記コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解は、挫傷障害部位の外部で生じるものである、薬学的組成物。
21. 請求項１７記載の薬学的組成物において、前記グリコサミノグリカン分解酵素の治療的有効量は、運動機能、感覚機能、自律神経機能、又はそれらの組み合わせを改善するのに十分な量を含むものである、薬学的組成物。
22. 請求項１７記載の薬学的組成物において、前記グリコサミノグリカン分解酵素は、コンドロイチナーゼＡＢＣタイプＩである、薬学的組成物。
23. 請求項１７記載の薬学的組成物において、前記グリコサミノグリカン分解酵素は、コンドロイチナーゼＡＢＣタイプＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＢ、ヒアルロニダーゼ１、ヒアルロニダーゼ２、ヒアルロニダーゼ３、ヒアルロニダーゼ４、それらの断片、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるものである、薬学的組成物。
24. 請求項１７記載の薬学的組成物において、前記挫傷障害は、外傷性脳障害を含むものである、薬学的組成物。
25. 請求項１７記載の薬学的組成物において、前記挫傷障害は、脊髄損傷を含むものである、薬学的組成物。
26. 請求項２５記載の薬学的組成物において、前記脊髄損傷は、脊髄の鈍器損傷を含むものである、薬学的組成物。
27. 請求項２５記載の薬学的組成物において、前記脊髄の肉眼的形態は、維持されているものである、薬学的組成物。
28. 請求項２５記載の薬学的組成物において、前記脊髄損傷は、単麻痺、両麻痺、対麻痺、片麻痺、四肢麻痺から成る群から選択される症状をもたらす損傷を有するものである、薬学的組成物。
29. 請求項１７記載の薬学的組成物において、前記挫傷障害は、断裂しているか、或いは部分的に切断された神経を有するものである、薬学的組成物。
30. 請求項１７記載の薬学的組成物において、前記挫傷障害は、破砕された神経を含むものである、薬学的組成物。
31. 請求項１７記載の薬学的組成物において、前記挫傷障害は、中枢神経系の圧迫を含むものである、薬学的組成物。
32. 請求項３１記載の薬学的組成物において、前記圧迫は、前記脊髄への外傷性の力によって引き起こされるものである、薬学的組成物。
33. 請求項３１記載の薬学的組成物において、前記圧迫は、腫瘍、出血、不完全骨折、感染工程、狭窄又は虚血によって引き起こされるものである、薬学的組成物。
34. 中枢神経系の挫傷障害後の神経機能を改善するために使用される、コンドロイチナーゼＡＢＣタイプＩ、コンドロイチナーゼタイプＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＢ、ヒアルロニダーゼ１、ヒアルロニダーゼ２、ヒアルロニダーゼ３、ヒアルロニダーゼ４、及び組み合わせから成る群から選択されるグリコサミノグリカン分解酵素を含む組成物。
35. 請求項３４記載の組成物において、前記グリコサミノグリカン分解酵素は、コンドロイチナーゼＡＢＣタイプＩである、組成物。
36. 請求項３４記載の組成物において、前記グリコサミノグリカン分解酵素は、コンドロイチナーゼＡＢＣタイプＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＢ、ヒアルロニダーゼ１、ヒアルロニダーゼ２、ヒアルロニダーゼ３、ヒアルロニダーゼ４、それらの断片、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるものである、組成物。
37. 請求項３４記載の組成物において、前記挫傷障害は、外傷性脳障害を含むものである、組成物。
38. 請求項３４記載の組成物において、前記挫傷障害は、脊髄損傷を含むものである、組成物。
39. 請求項３８記載の組成物において、前記脊髄損傷は、脊髄の鈍器損傷を含むものである、組成物。
40. 請求項３８記載の組成物において、前記脊髄の肉眼的形態は、前記脊髄損傷において維持されているものである、組成物。
41. 請求項３８記載の組成物において、前記脊髄損傷は、単麻痺、両麻痺、対麻痺、片麻痺、四肢麻痺から成る群から選択される症状をもたらす損傷を有するものである、組成物。
42. 請求項３４記載の組成物において、前記挫傷障害は、断裂しているか、或いは部分的に切断された神経を有するものである、組成物。
43. 請求項３４記載の組成物において、前記挫傷障害は、破砕された神経を有するものである、組成物。
44. 請求項３４記載の組成物において、前記挫傷障害は、中枢神経系の圧迫を有するものである、組成物。
45. 請求項４４記載の組成物において、前記圧迫は、前記脊髄への外傷性の力によって引き起こされるものである、組成物。
46. 請求項４４記載の組成物において、前記圧迫は、腫瘍、出血、不完全骨折、感染工程、狭窄又は虚血によって引き起こされるものである、組成物。

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