CN102952806B - 多角体基因前120bp片段及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多角体基因前120bp片段及其应用，属于生物技术领域。本发明主要是在常用的表达载体中利用多角体基因前120bp片段和外源基因EGFP进行融合表达，同时与全长多角体融合表达方法比对。本发明中的融合表达方法在具有全长多角体性质的同时，还降低了溶解融合蛋白所需溶液的pH值，使融合蛋白在中性缓冲液中即可溶解，并适用于蛋白酶等酶切反应的进行。
Description
技术领域
本发明涉及对一种多角体基因前120bp片段及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
大肠杆菌表达系统目前是应用最广泛的蛋白表达系统之一，其具有成本低廉、生产率高、操作简单等优点。该系统主要有表达载体、表达宿主菌、表达条件等组成。目前，越来越多的研究人员关注于融合表达载体的应用，研究成功的融合表达载体主要有：GST (谷光甘肽-S-转移酶) 系统、半乳糖苷酶系统、麦芽糖结合蛋白(MBP) 系统、蛋白A系统、纯化标签融合系统等。
家蚕(Bombyx mori)多角体蛋白(Polyhedrin，Polh)基因共有738个核苷酸，编码由245个氨基酸组成的大小为29 kD的多肽。它是多角体的主要结构成份；多角体蛋白构成的蛋白质晶体对包埋在其中的病毒体具有保护作用，它使病毒体在自然环境中保持稳定和侵染能力。多角体蛋白基因polh是一个超表达极晚期基因。在病毒感染的晚期，当其它病毒基因和宿主基因关闭后，此基因能持续高水平表达，在受感染细胞内产生的多角体蛋白的量可达细胞蛋白质总量的25％-50％。近20年来，人们都致力于研究多角体蛋白基因的高效表达机制，并且利用它的这种特性使许多外源基因得到了高效表达，尤其是一些难以表达的蛋白例如膜蛋白。家蚕核型多角体病毒的多角体蛋白具有它独特的性质，在大肠杆菌中表达的多角体蛋白在中性pH条件下以包涵体的形式存在，只有在碱性条件(pH 10.8及以上)下可溶，并且这种多角体蛋白具有与天然多角体蛋白晶体相同的性质。因此，可将目的蛋白基因与其融合表达，一方面能提高目的蛋白的表达量，另一方面，通过简单的pH梯度洗脱和差速离心的方法就可以获得较纯的融合蛋白，再经过特异性蛋白酶酶切消化，回收得到较纯的目的蛋白。张耀洲等在纯化标签融合系统上进行改造，将具有高效表达的能力多角体蛋白作为一种标签，将不表达或者难表达的蛋白基因融合上去，从而使其表达或者提高其表达量。同时，利用多角体的溶解特性，通过简单的pH调节和差速离心的方法得到比较纯的融合蛋白，之后进行蛋白酶切得到纯的目的蛋白。但是，蛋白酶的最佳作用pH范围在7.0-8.5，而多角体蛋白只有在pH10.8时才会溶解，所以在这一条件下进行酶切时，蛋白酶丧失活性或者无法达到最大活性，所得到的目的蛋白的量也受到限制。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种多角体基因前120bp片段及其应用。本发明通过在常用载体的基础上，插入该多角体蛋白基因前120bp片段，后面可继续克隆上外源基因，用于融合表达；表达出来的融合蛋白，可用调节PH值的方法等进行快速纯化该目的蛋白，还能在低pH值(pH7.6)下溶解，所溶解的pH值符合一般蛋白酶反应需要的条件。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种多角体基因前120bp片段，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供上述多角体基因前120bp片段在表达融合蛋白及降低其溶解性中的应用。
本发明还提供上述多角体基因前120bp片段与蛋白酶酶切位点连接而成的重组基因，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步地，其中所述蛋白酶为凝血酶。
本发明还提供一种含上述多角体基因前120bp片段的重组载体。
进一步地，其中所述重组载体由多角体基因前120bp片段与转移载体构建而成。
进一步地，其中所述转移载体为 pET22b、pET28a、pET28b、pET28c、pET32a、pcDNA3或pFastBac TM。
进一步地，其中所述转移载体为pET28a。
本发明进一步提供一种含上述多角体基因前120bp片段的基因工程菌。
进一步地，其中所述基因工程菌为大肠杆菌。
本发明主要是在常用的表达载体中利用多角体基因前120bp片段(polh120)和外源基因EGFP进行融合表达，同时与全长多角体融合方式比对。本发明中的融合方式在具有全长多角体性质的同时，还降低了溶解融合蛋白所需溶液的pH值，使融合蛋白在中性缓冲液中即可溶解，并适用于蛋白酶等酶切反应的进行。
附图说明
图1是本发明构建的重组表达载体的质粒图；
图2是本发明多角体基因前120bp片段的PCR产物电泳图；其中，M:核酸分子量标准；1：目的基因PCR产物；
图3是本发明的重组表达载体鉴定图；其中，M:核酸分子量标准；1：EGFP基因PCR产物； 2：重组质粒EcoR I和Xho I的酶切产物；
图4是本发明的融合蛋白表达图；M：蛋白分子量标准；1: E.coli BL21 pET28a-polh120-EGFP未诱导；2: E.coli BL21 pET28a-polh120-EGFP诱导；3：E.coli BL21 pET28a-polh-EGFP诱导；4: E.coli BL21 pET28a- -EGFP诱导；
图5是本发明的融合蛋白溶解性分析图；其中，1、3、5、7、9、11、13是溶液pH为8.0、8.4、9.2、9.6、10.、10.4、10.8时的上清；2、4、6、8、10、12、14是溶液pH为8.0、8.4、9.2、9.6、10.、10.4、10.8时的沉淀；
图6是本发明使用Gly回调pH值至7.6时的电泳图；其中，M:蛋白分子量标准；1:pH7.6时的上清蛋白样品；2：pH7.6时的沉淀中蛋白样品；
图7是本发明的凝血酶酶切效果图；其中，M:蛋白分子量标准；1:pH7.6时的上清原样；2：pH7.6时凝血酶酶切后的样品。
具体实施方式
应该指出，以下具体说明都是事例性的，旨在对本发明提供进一步说明，除非另有说明，本文中使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。以下实施例中使用的生物材料如家蚕核型多角体病毒、载体pET-28a、质粒pGEX-4T-1-EGFP、质粒pET28a-polh和E.coli TG1、E.coli BL21（DE3）均购自特菲（天津）生物医药科技有限公司；所使用的反应试剂如无特殊说明，均为Fermentas公司产品。
实施例1：构建重组载体pET28a-polh120
1)以质粒pET28a-polh为模板扩增多角体基因前120bp片段，引物设计如下：
上游引物F1：
5'-CGGGATCCATGGCCAATTATTCATAC-3'(斜体表示BamH I酶切位点)
下游引物R1：
5'- GGCGAATTC CTCGTTCCTCGTGGTTCTATGTTCGACTAGGTGC-3'
(斜体表示EcoR I酶切位点,下划线部分为凝血酶酶切位点)。
2) PCR反应参数设计为，94℃预变性5min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃复性延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。
在100μL的离心管中，加入下列组分：
| 双蒸水 | 33 μL |
| 10×Taq Buffer I | 5 μL |
| 2 mM dNTPs | 5 μL |
| F1(10 μM) | 1.5 μL |
| R1(10 μM) | 1.5 μL |
| 质粒pET28a-polh | 2.5 μL |
| Taq DNA polymerase | 1.5 μL |
| Total | 50 μL |
各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收目的片段。
3)上述步骤2)得到的PCR产物经BamH I和EcoR I双酶切后的基因片段克隆至经BamH I和EcoR I双酶切的载体pET28a中，使PCR扩增的基因连接到载体pET28a上，构建成重组载体pET28a-polh120，经酶切分析鉴定基因序列完全正确。
实例2：融合表达EGFP(绿色荧光蛋白)
1)以质粒pEGX-4T-1-EGFP为模板，以下列引物进行扩增EGFP基因片段。
F2：5'- GCCGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA -3'(方框内为EcoR I酶切位点)
R2：5'-CCGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3'(方框内为Xho I酶切位点)
PCR反应参数设计为，94℃预变性5min，94℃变性45s，56℃退火30s，72℃复性延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。
PCR反应体系为：
| 双蒸水 | 33 μL |
| 10×Taq Buffer I | 5 μL |
| 2 mM dNTPs | 5 μL |
| F2(10 μM) | 1.5 μL |
| R2(10 μM) | 1.5 μL |
| pEGX-4T-1-EGFP | 2.5 μL |
| Taq DNA polymerase | 1.5 μL |
| Total | 50 μL |
各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片段(见图2)，同时切胶回收目的片段。
2)上述步骤1)得到的PCR产物经EcoR I和Xho I双酶切后的基因片段克隆至经EcoR I和Xho I双酶切的上述重组载体pET28a-polh120中，使PCR扩增的基因连接到重组载体pET28a-polh120上，构建成重组表达载体pET28a-polh120-EGFP(见图1)，经酶切分析鉴定连接完全正确(见图3)。
3)将步骤2)构建好的重组表达载体转化BL21(DE3)感受态细胞，涂布平板并挑取长出来的单菌落，即得到重组的基因工程菌E.coli BL21 pET28a-polh120-EGFP。
4)将E.coli BL21 pET28a-polh120-EGFP转接到LB培养基中，37℃摇床培养至OD值在0.4-0.6，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，诱导继续培养4小时后，离心收集菌体。同时，用常用载体pET28a构建的工程菌E.coli BL21 pET28a-EGFP、E.coli BL21 pET28a-polh-EGFP作对照。将部分离心收集到的菌体进行全菌SDS-PAGE电泳，结果如图4所示，重组工程菌E.coli BL21 pET28a-polh120-EGFP在约36kDa处有一明显的蛋白条带，与理论上该载体上表达出的融合蛋白Polh120-EGFP大小相符合。且与两种对照相比，本发明中的载体表达出的外源蛋白量不亚于对照组的量。
实例3：融合蛋白Polh120-EGFP的溶解性分析
1) 将离心收集的菌体进行超声破碎后，收集超声后的沉淀，用pH 8.0的甘氨酸-氢氧化钠（Gly-NaOH）缓冲液20毫升重悬，4℃下搅拌30 min，12,000 rpm离心10 min，取上清，作为pH 8.0的上清；收集的沉淀用pH 8.4的缓冲液20毫升重悬，在4℃下搅拌30 min，取此重悬液作为pH 8.0的沉淀组分，12,000 rpm离心10 min，取上清作为pH 8.4的上清；同样，向上一步的沉淀加入20毫升的pH 8.8的甘氨酸-氢氧化钠（Gly-NaOH）缓冲液，4℃搅拌混匀30 min，重悬液作为pH 8.4的沉淀组分，12,000 rpm离心10 min，取上清作为pH 8.8的上清；以此类推，得到不同pH条件下的融合蛋白Polh120-EGFP的上清和沉淀组分。取等量不同组分的样品，进行SDS-PAGE电泳分析(见图5)，检测融合蛋白Polh120-EGFP随pH的溶解性变化。缓冲液配方见表1。
表1 不同pH缓冲液的配方
| pH | 0.2 M Gly(mL) | 0.2 M NaOH(mL) | ddH2O(mL) | 总体积(mL) |
| 8.0 | 15 | 0.45 | 44.55 | 60 |
| 8.4 | 15 | 1.06 | 43.94 | 60 |
| 8.8 | 15 | 1.8 | 43.2 | 60 |
| 9.2 | 15 | 3.6 | 41.4 | 60 |
| 9.6 | 15 | 6.72 | 38.28 | 60 |
| 10.0 | 15 | 9.6 | 35.4 | 60 |
| 10.4 | 15 | 11.58 | 33.42 | 60 |
| 10.8 | 15 | 13.65 | 31.35 | 60 |
图5的电泳结果显示，在PH为10.8时融合蛋白有大部分溶解在上清液中，还有少部分在沉淀中，这与对照组中的 Polh1200-EGFP的溶解PH值基本一致。
2)取上述 Polh120-EGFP蛋白PH为10.8时的上清，向其中边搅拌边滴加0.2 M的 Gly，同时随时检测溶液的PH值。同时，用 Polh120-EGFP蛋白PH为10.8的上清作为对照同时进行实验。发现 Polh120-EGFP蛋白溶液回调直到PH为7.6时仍然未出现浑浊现象，12000rpm离心10min，只看到离心管底部有少许沉淀；而 Polh120-EGFP蛋白溶液在PH为10.8时即可发现溶液出现浑浊现象，12000rpm离心10min，看到离心管底部有大量沉淀；分别取上清和沉淀与蛋白上样缓冲液（Loading Buffer）等比例(体积比)混合后，100℃煮10分钟，5000rpm，离心5分钟，进行电泳检测。图6中显示，在回调至pH为7.6时，上清中的目的蛋白多于沉淀中的目的蛋白，这足以达到降低溶解pH值的要求，这一pH值可以算是中性的缓冲液的pH。
实例4：凝血酶酶切目的蛋白EGFP
将实例3中回调至pH7.6的融合蛋白溶液，用BCA蛋白定量试剂盒检测样品蛋白浓度后，按照Novagen公司THROMBIN产品说明将融合蛋白在1.5mL离心管中进行酶切反应。反应体系如下：
| 融合蛋白（Fusion protein） | 120μL |
| 10×凝血酶酶切缓冲液（Thrombin cleavage Buffer） | 20μL |
| 凝血酶,, Restriction Grade | 8μL |
| ddH2O | 52μL |
| 总体积 | 200μL |
混匀后，21℃反应2h后，取样电泳。结果显示(见图7)，经过酶切后的蛋白大小和理论上的EGFP大小基本一致，且融合蛋白的条带很淡，可以说是凝血酶基本上能将融合蛋白中的EGFP酶切下来。
综上所述，以上实施例仅为本发明的优选实施例，在各个实施例可以证明本发明可以和全长多角体基因融合外源基因一样，具有全长多角体基因融合外源基因的高效表达性质，同时所需溶解融合蛋白的pH值明显比全长多角体融合的方式低很多，处于中性，可适用于蛋白酶切且酶切效率很高。此外，对于本发明中的技术来说，在不脱离本发明的核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些润饰和改进也应属于本发明的专利保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津耀宇生物技术有限公司
<120> 多角体基因前120bp片段及其应用
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atgccgaatt attcatacac ccccaccatc gggcgtactt acgtgtacga
caataaatat 60
tacaaaaact tgggctgtct tatcaaaaac gccaagcgca agaagcacct
agtcgaacat 120
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctcgttcctc gtggttct
18
Claims (5)
1.一种多角体基因前120bp片段，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的多角体基因前120bp片段在表达融合蛋白及降低其溶解性中的应用。
3.一种重组载体，其特征在于，由权利要求1所述的多角体基因前120bp片段与转移载体构建而成。
4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述转移载体可以为 pET22b、pET28a、pET28b、pET28c或pET32a。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述转移载体为pET28a。
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